CN112522310B - Crispr系统及其在构建lrp5基因突变的骨质疏松症克隆猪核供体细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas9系统及其在构建LRP5基因突变的骨质疏松症克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪LRP5基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪LRP5基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.1所示的pU6gRNA‑eEF1a‑mNLS‑hSpCas9‑EGFP‑PURO。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。本发明为骨质疏松症猪模型的制备奠定了坚实的基础，将有助于该病的治疗及发病机制研究。

Description

CRISPR系统及其在构建LRP5基因突变的骨质疏松症克隆猪核供体细胞中的应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及CRISPR/cas9系统及其在构建LRP5基因突变的骨质疏松症克隆猪核供体细胞中的应用。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由于骨吸收与骨形成不平衡导致的，一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢性疾病。现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原发性骨质疏松症是因年龄所致的体内性激素突然减少及生理性退行性改变，分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症和Ⅱ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症，由疾病或药物因素诱发，疾病如内分泌代谢病(糖尿病、甲状腺功能亢进症)、肾脏疾病、肝脏疾病等，药物诱发如长期大剂量的肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素的应用。而特发性骨质疏松症，一般伴有遗传疾病史，女性多见，妇女哺乳期和妊娠期的骨质疏松症往往也列为此类。
骨骼是动态的不断变化的组织，每年约有10％的骨骼被更新，即循环重复着骨吸收、骨重建之间的动态平衡。我国大规模流行病学调查研究显示，国内骨质疏松症总患病率为12.4％，总人数已超过1.6亿。医学专家通过对骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征家族遗传信息的研究发现，该综合征家族中携带突变的LRP5基因但未发病个体的骨密度较正常人显著降低。LRP5(低密度脂蛋白受体相关蛋白5，low-density lipoprotein receptor-related protein 5)，属于低密度脂蛋白受体家族，在Wnt/β-catenin信号通路中起着重要作用，而Wnt/β-catenin信号通路与骨重建密切相关。进一步研究发现，LRP5通过参与调控成骨细胞的生长和分化，调节骨代谢，进而影响骨密度。已有研究结果表明，LRP5基因突变与骨质疏松的发生密切相关。因此，基于LRP5基因突变构建骨质疏松症动物模型将为研究及治疗人类骨质疏松症提供有力的实验工具。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。
基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的胚胎干细胞注射到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。如在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供猪LRP5基因的gRNA，及gRNA表达载体。
本发明的另一目的是提供一种用于猪LRP5基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
本发明的又一目的是提供该CRISPR/Cas9系统在构建LRP5基因突变的猪重组细胞中的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于猪LRP5基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪LRP5基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO：1所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)。
为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：
1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；
2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；
3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；
4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；
5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：1所示；pKG-GE3的主要元件有：
1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；
2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；
3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；
5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；
6)转录终止信号：bGH polyA signal；
7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。
质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。
质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。
自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
特异融合基因具体如SEQ ID NO：1中第911-6706位核苷酸所示。
CMV增强子如SEQ ID NO：1中第395-680位核苷酸所示。
EF1a启动子如SEQ ID NO：1中第682-890位核苷酸所示。
WPRE序列元件如SEQ ID NO：1中第6722-7310位核苷酸所示。
3’LTR序列元件如SEQ ID NO：1中第7382-7615位核苷酸所示。
bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：1中第7647-7871位核苷酸所示。
作为本发明的优选，针对猪LRP5基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO：3所示。
作为本发明的优选，该表达载体表达SEQ ID NO：28所示的gRNA，其靶点如SEQ IDNO：16所示。
作为本发明的进一步优选，所述的针对猪LRP5基因的gRNA表达载体中含有针对gRNA靶标位点的插入序列，所述的插入序列由SEQ ID NO：20所示的单链DNA和SEQ ID NO：21所示的单链DNA退火而成。
作为本发明的进一步优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。
所述的CRISPR/Cas9系统在构建LRP5基因突变的猪重组细胞中的应用。
一种重组细胞，由本发明所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
本发明所述的重组细胞在构建LRP5基因敲除的克隆猪中的应用；即在构建LRP5基因敲除的骨质疏松症模型猪重组细胞中的应用。
针对猪LRP5基因gRNA靶标位点的合成引物，由SEQ ID NO：20所示的单链DNA和SEQID NO：21所示的单链DNA退火而成。
一种针对猪LRP5基因的gRNA表达载体，该表达载体表达SEQ ID NO：28所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO：3所示。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本也高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。
而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、营养代谢、疾病发病机制方面等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本较灵长类低得多；而且猪作为人类长期以来的肉食性动物，用猪作为疾病模型动物不存在动物保护和伦理等问题。
(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。
(3)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型(纯合突变包括双等位基因相同突变和双等位基因不同突变、杂合突变或野生型)，获得纯合突变的概率为30％～50％，优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。
(4)利用本发明所得到的纯合突变单克隆细胞株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单克隆细胞的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。进一步的，开发出基于LRP5基因突变的骨质疏松症猪模型可用于相关药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，更进一步的能够为临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类骨质疏松症提供有力的实验手段。
附图说明
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。
图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。
图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。
图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。
图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。
图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。
图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。
图10为实施例3中步骤3.2.3以猪的基因组DNA为模板分别采用LRP5-E6g-F1/LRP5-E6g-R826(组1)、LRP5-E6g-F7/LRP5-E6g-R732(组2)组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图11为实施例3中步骤3.2.4以18只猪的基因组DNA为模板采用LRP5-E6g-F1/LRP5-E6g-R826组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图12为实施例4中步骤4.3.4以基因组DNA为模板采用LRP5-E6g-F1/LRP5-E6g-R826组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图13为实施例5中步骤5.4.4以基因组DNA为模板采用LRP5-E6g-F1/LRP5-E6g-R826组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图14为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。
图15为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位相同突变的示例性测序峰图。
图16为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为杂合突变的示例性测序峰图。
图17为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位不同突变的示例性测序峰图。
具体实施方式
实施例1 Cas9高效表达载体的构建及pKG-U6gRNA载体的构建
1.1 pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(Cas9高效表达载体)的构建
(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称pX330，图1)用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO：31)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。
(2)改造启动子及增强子
对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO：32)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。
(3)Cas9基因N端增加NLS序列
将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：33)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。
(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signals
以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signals(SEQ ID NO：34)的序列，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，碱基序列(SEQ ID NO：1)。
改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO主要元件：
1)gRNA表达元件：U6-gRNA scaffold。
2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子。
3)含多个NLS的cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因。
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO。
5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR，增强cas9及筛选标记基因的翻译。
6)转录终止信号：bGH polyA signal。
7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。
1.2构建pKG-U6gRNA载体
来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO：2所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO：3)，所构建的pKG-U6gRNA载体图谱如图6。
实施例2质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
2.1 gRNA靶点设计及构建
2.1.1使用Benchling对RAG1基因进行gRNA靶点设计
RAG1-gRNA4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO：4)
合成的RAG1基因的插入序列互补DNA oligo如下：
RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO：5)
RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO：6)
RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。
2.1.2设计用于扩增包含RAG1 gRNA靶点片段的引物
RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA(SEQ ID NO：7)
RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG(SEQ ID NO：8)
2.1.3将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法
1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；
2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；
3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：
95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；
4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min
Figure GDA0003068242150000081
37℃反应60min；
5)转化
按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。
2.1.4gRNA载体构建
1)将合成的RAG1-gRNA4S和RAG1-gRNA4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)将会表达SEQ ID NO：9所示的RAG1-gRNA4。
2.1.5gRNA载体鉴定
从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认RAG1-gRNA4载体构建成功。
2.2猪原代成纤维细胞制备
2.2.1取初生从江香猪耳组织0.5g，去除外部组织，75﹪酒精浸泡30-40s；
2.2.2用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；
其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。
2.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5mL1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；
2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。
其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基
(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。
2.2.5置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；
2.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，使用1mL完全培养基重悬细胞以备下一步核转染实验。
2.3质粒配比优化
2.3.1共转染分组情况
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1.
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染至猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
2.3.2共转染操作方法
使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon)与Neon TM transfection system电转仪进行转染实验。
1)按照上述分组配制电转反应液，混匀过程中注意切勿产生气泡；
2)将步骤一制备得到的细胞悬液使用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；
3)吸取10μL细胞悬液，加入步骤1)中的电转反应液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；
4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL E Buffer；
5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)的完全培养液；
6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；
7)电转后6-12h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。
2.3.3基因编辑效率分析
提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。
2.4质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
2.4.1共转染分组情况
RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330。
RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。
RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
2.4.2共转染操作方法
同本实施例中2.3.2。
2.4.3基因编辑效率分析
提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
实施例3 LRP5基因靶点的设计及构建
3.1基因组DNA的提取
使用Vazyme公司FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(VazymeCat.DC102-01)分别进行18只猪(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组DNA的柱式提取，使用NanoDrop进行定量，-20℃保存备用。
3.2 LRP5基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
3.2.1猪LRP5基因信息
编码LDL受体相关蛋白5；位于2号染色体；GeneID为100524299，Sus scrofa。猪LRP5基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。已有研究结果表明LRP5在骨量调节过程中起核心作用，在猪基因组DNA中，LRP5基因具有25个外显子，其中第6外显子在所有转录本中均占据重要位置(猪LRP5基因第6外显子序列，含部分第5和部分第6内含子序列如SEQ IDNO：11所示)。
3.2.2LRP5基因敲除预设靶点外显子及邻近基因组序列PCR扩增引物设计
根据查到的猪LRP5基因组序列
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010444.4？report＝genbank& from＝4533721&to＝4653997&strand＝true)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品LRP5基因外显子6的位点。
使用Oligo7进行引物设计，设计结果如下：
LRP5-E6g-F1：AGCGCGAGGCGCTTCTTACAC(SEQ ID NO：12)
LRP5-E6g-R826：CCTTCAGGCCCACCCGGTCTC(SEQ ID NO：13)
LRP5-E6g-F7：GAGGGAGATCACAGCAAGCG(SEQ ID NO：14)
LRP5-E6g-R732：TGGAAATGCAAGATCGGAACG(SEQ ID NO：15)
3.2.3LRP5基因组PCR扩增引物筛选
使用猪(雌性1)耳朵组织提取的基因组为模板，使用设计的两条上游和两条下游组合，Max酶(Vazyme公司货号：P505)进行PCR，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳以筛选好的扩增引物，结果如图10，组1为：引物LRP5-E6g-F1/LRP5-E6g-R826；组2为：引物LRP5-E6g-F7/LRP5-E6g-R732，两对引物均可对目的片段进行扩增。
3.2.4 18只猪LRP5基因片段PCR扩增
分别以18个基因组模板(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，引物LRP5-E6g-F1/LRP5-E6g-R826，Max酶进行LRP5基因组片段的扩增，产物(767bp)进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图11。
3.2.5LRP5基因序列保守性分析
以上PCR扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的LRP5基因序列进行比对分析。根据比对结果，扩增片段序列相对保守，所设计的引物本身无可能的突变位点。
3.3gRNA靶点设计及构建
3.3.1使用Benchling进行靶点gRNA设计
设计靶点已避开可能的突变位点，使用Benchling进行靶点gRNA设计：
https://benchling.com/
LRP5基因敲除靶点设计如下：
LRP5-E6-g1：GGAGGGCTACGTGTACTGGA(SEQ ID NO：16)
LRP5-E6-g2：CGTGTACTGGACGGACGACG(SEQ ID NO：17)
LRP5-E6-g3：CAACGACCCGGACGGCATCG(SEQ ID NO：18)
LRP5-E6-g4：ACCCGTCCAGGTACGCCCTG(SEQ ID NO：19)
合成的LRP5基因共4个靶点的插入序列互补DNA oligo如下：
LRP5-E6-gRNA1-S：caccGGAGGGCTACGTGTACTGGA(SEQ ID NO：20)
LRP5-E6-gRNA1-A：aaacTCCAGTACACGTAGCCCTCC(SEQ ID NO：21)
LRP5-E6-gRNA2-S：caccgCGTGTACTGGACGGACGACG(SEQ ID NO：22)
LRP5-E6-gRNA2-A：aaacCGTCGTCCGTCCAGTACACGc(SEQ ID NO：23)
LRP5-E6-gRNA3-S：caccgCAACGACCCGGACGGCATCG(SEQ ID NO：24)
LRP5-E6-gRNA3-A：aaacCGATGCCGTCCGGGTCGTTGc(SEQ ID NO：25)
LRP5-E6-gRNA4-S：caccgACCCGTCCAGGTACGCCCTG(SEQ ID NO：26)
LRP5-E6-gRNA4-A：aaacCAGGGCGTACCTGGACGGGTc(SEQ ID NO：27)
LRP5-E6-gRNA1-S、LRP5-E6-gRNA1-A、LRP5-E6-gRNA2-S、LRP5-E6-gRNA2-A、LRP5-E6-gRNA3-S、LRP5-E6-gRNA3-A、LRP5-E6-gRNA4-S、LRP5-E6-gRNA4-A均为单链DNA分子。
3.3.2将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法
同实施例2中2.1.3。
3.3.3gRNA载体构建
1)将合成的LRP5-E6-gRNA1-S和LRP5-E6-gRNA1-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA1)。质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA1)将会表达SEQ ID NO：28所示的LRP5-E6-gRNA1。
2)将合成的LRP5-E6-gRNA2-S和LRP5-E6-gRNA2-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA2)。质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA2)将会表达SEQ ID NO：29所示的LRP5-E6-gRNA2。
3)将合成的LRP5-E6-gRNA3-S和LRP5-E6-gRNA3-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA3)。质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA3)将会表达SEQ ID NO：30所示的LRP5-E6-gRNA3。
4)将合成的LRP5-E6-gRNA4-S和LRP5-E6-gRNA4-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA4)将会表达SEQ ID NO：31所示的LRP5-E6-gRNA4。
3.3.3gRNA载体鉴定
从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA1)、pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA2)、pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA3)和pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA4)载体均构建成功。
实施例4 LRP5基因不同gRNA靶点的编辑效率比较
4.1猪原代成纤维细胞制备
同实施例2中2.2。
4.2使用构建好的gRNA质粒、CRISPR/Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞。
4.2.1共转染分组情况
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA1)：1.08μg质粒pKG-GE3；其中，质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA1)与质粒pKG-GE3的摩尔比为3:1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA2)：1.08μg质粒pKG-GE3；其中，质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA2)与质粒pKG-GE3的摩尔比为3:1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA3)：1.08μg质粒pKG-GE3；其中，质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA3)与质粒pKG-GE3的摩尔比为3:1。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3；其中，质粒pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA4)与质粒pKG-GE3的摩尔比为3:1。
第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。
4.2.2共转染操作方法
同实施例2中2.3.2。
4.3LRP5基因不同gRNA靶点的编辑效率分析
4.3.1分别向步骤4.2中收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10X extract Buffer          1μL
Enzyme                      0.2μL
ddH2O                       8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；
4.3.2采用前述针对LRP5基因E6引物LRP5-E6g-F7/LRP5-E6g-R732进行检测突变，PCR目的产物长度为725bp；
4.3.3使用常规PCR反应扩增LRP5靶点基因；
4.3.4将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图12，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出LRP5-E6-gRNA1、LRP5-E6-gRNA2、LRP5-E6-gRNA3、LRP5-E6-gRNA4不同靶点的编辑效率依次为24％、1％、10％、12％。结果表明，LRP5-E6-gRNA1编辑效率最高，为最优靶点。
实施例5利用体细胞克隆的方法创制LRP5基因敲除的从江香猪细胞
5.1猪原代成纤维细胞制备
同实施例2中2.2。
5.2使用构建好的pKG-U6gRNA(LRP5-E6-gRNA1)质粒、pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞
同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。
5.3LRP5基因敲除单克隆细胞株的筛选
5.3.1将步骤5.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单克隆转移到100μL完全培养基的96孔板中；
5.3.2 37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单克隆细胞的孔；
5.3.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5mL离心管中；
5.3.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
5.4LRP5基因敲除的重组细胞鉴定
5.4.1将步骤5.3收集在1.5mL离心管中得到的细胞，然后在细胞中加入10μLKAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10X extract Buffer         1μL
Enzyme                     0.2μL
ddH2O                      8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；
5.4.2采用前述针对LRP5基因E6引物LRP5-E6g-F7/LRP5-E6g-R732进行检测突变，PCR目的产物长度为725bp；
5.4.3使用PCR常规反应扩增LRP5靶点基因；
5.4.4将PCR反应产物进行电泳，电泳结果如图13，泳道编号与单克隆细胞编号一致。回收PCR扩增产物并测序。
5.4.5将测序结果与LRP5靶点信息进行比对，从而判断该重组细胞是否为LRP5基因敲除。
编号为1、3、10、11、12、13的单克隆细胞的基因型为双等位相同突变型。编号为6、15的单克隆细胞的基因型为双等位不同突变型。编号为5、9、17、18的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为2、4、7、8、14、16、19、20的单克隆细胞的基因型为纯合野生型。得到的LRP5基因编辑单克隆细胞的比率为60％。
示例性的测序比对结果如图14至图17，其中图14是克隆号为LRP5-2的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为野生型；图15是克隆号为LRP5-1的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为双等位相同突变；图16是克隆号为LRP5-5的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为杂合突变；图17是克隆号为LRP5-6的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为双等位不同突变。
通过具体序列的分析，LRP5各单细胞克隆基因型如表1：
表1 LRP5基因敲除从江香猪成纤维细胞的单细胞克隆基因鉴定
Figure GDA0003068242150000161
Figure GDA0003068242150000171
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
                         序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> CRISPR系统及其在构建LRP5基因突变的骨质疏松症克隆猪核供体细胞中的应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980
gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040
ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100
agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160
ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220
actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340
tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400
cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600
ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900
gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140
aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200
cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260
aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320
catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620
agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680
cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740
gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800
ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860
gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920
caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980
tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040
caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160
caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220
gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280
aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820
gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060
caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120
gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180
cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240
ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300
ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360
ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420
gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480
ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540
ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600
ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660
cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380
ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860
gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920
atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 8040
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160
aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280
tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 8340
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400
ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580
caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640
tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000
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ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300
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cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410
<210> 3
<211> 3120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
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ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<211> 100
<212> RNA
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<400> 9
aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 10
<211> 1614
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 10
Met Glu Ala Ala Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Ala Leu Cys Cys Ser Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ser Pro
            20                  25                  30
Leu Leu Leu Phe Ala Asn Arg Arg Asp Val Arg Leu Val Asp Ala Gly
        35                  40                  45
Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Ile Val Val Ser Gly Leu Glu Asp Ala
    50                  55                  60
Ala Ala Val Asp Phe Gln Phe Ser Lys Gly Ala Val Tyr Trp Thr Asp
65                  70                  75                  80
Val Ser Glu Glu Ala Ile Lys Gln Thr Tyr Leu Asn Gln Thr Gly Ala
                85                  90                  95
Ala Val Gln Asn Val Val Ile Ser Gly Leu Val Ser Pro Asp Gly Leu
            100                 105                 110
Ala Cys Asp Trp Val Gly Lys Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Glu Thr
        115                 120                 125
Asn Arg Ile Glu Val Ala Asn Leu Asn Gly Thr Ser Arg Lys Val Leu
    130                 135                 140
Phe Trp Gln Asp Leu Asp Gln Pro Arg Ala Ile Ala Leu Asp Pro Ala
145                 150                 155                 160
His Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Thr Pro Arg Ile Glu
                165                 170                 175
Arg Ala Gly Met Asp Gly Ser Ser Arg Lys Val Ile Val Asp Ser Asp
            180                 185                 190
Ile Tyr Trp Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asp Leu Glu Glu Gln Lys Leu
        195                 200                 205
Tyr Trp Ala Asp Ala Lys Leu Ser Phe Ile His Arg Ala Asn Leu Asp
    210                 215                 220
Gly Ser Phe Arg Gln Lys Val Val Glu Gly Ser Leu Thr His Pro Phe
225                 230                 235                 240
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Asp Thr Leu Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr
                245                 250                 255
Arg Ser Ile His Ala Cys Asn Lys Arg Thr Gly Glu Lys Arg Lys Glu
            260                 265                 270
Ile Leu Ser Ala Leu Tyr Ser Pro Met Asp Ile Gln Val Leu Ser Pro
        275                 280                 285
Glu Arg Gln Pro Tyr Phe His Thr Arg Cys Glu Glu Asp Asn Gly Gly
    290                 295                 300
Cys Ser His Leu Cys Leu Leu Ser Pro Arg Glu Pro Tyr Tyr Ala Cys
305                 310                 315                 320
Ala Cys Pro Thr Gly Val Gln Leu Gln Gly Asn Gly Gln Thr Cys Lys
                325                 330                 335
Ala Gly Ala Glu Glu Val Leu Leu Leu Ala Arg Arg Thr Asp Leu Arg
            340                 345                 350
Arg Ile Ser Leu Asp Thr Pro Asp Phe Thr Asp Ile Val Leu Gln Val
        355                 360                 365
Asp Asp Ile Arg His Ala Ile Ala Ile Asp Tyr Asp Pro Leu Glu Gly
    370                 375                 380
Tyr Val Tyr Trp Thr Asp Asp Glu Val Arg Ala Ile Arg Arg Ala Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Asp Gly Ser Gly Ala Gln Thr Leu Val Asn Thr Glu Ile Asn Asp
                405                 410                 415
Pro Asp Gly Ile Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp Thr
            420                 425                 430
Asp Thr Gly Thr Asp Arg Ile Glu Val Thr Arg Leu Asn Gly Thr Ser
        435                 440                 445
Arg Lys Ile Leu Val Ser Glu Asp Leu Asp Glu Pro Arg Ala Ile Val
    450                 455                 460
Leu His Pro Val Met Gly Leu Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Ser
465                 470                 475                 480
Pro Lys Ile Glu Cys Ala His Leu Asp Gly Gln Glu Arg His Val Leu
                485                 490                 495
Val Asn Thr Ser Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Ala Leu Asp Leu Gln
            500                 505                 510
Glu Gly Gln Leu Tyr Trp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Lys Ile Glu Val
        515                 520                 525
Ile Asn Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Thr Leu Leu Glu Asp Lys Leu
    530                 535                 540
Pro His Ile Phe Gly Phe Thr Leu Leu Gly Asp Phe Ile Tyr Trp Thr
545                 550                 555                 560
Asp Trp Gln Arg Arg Ser Ile Glu Arg Val His Lys Val Lys Ala Ser
                565                 570                 575
Arg Asp Ile Ile Ile Asp Gln Leu Pro Asp Leu Met Gly Leu Lys Ala
            580                 585                 590
Val Asn Val Ala Lys Val Val Gly Thr Asn Pro Cys Ala Asp Arg Asn
        595                 600                 605
Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Phe Phe Thr Pro Arg Ala Thr Lys Cys
    610                 615                 620
Gly Cys Pro Ile Gly Leu Glu Leu Leu Ser Asp Met Lys Thr Cys Ile
625                 630                 635                 640
Val Pro Glu Ala Phe Leu Val Phe Thr Ser Arg Ala Ala Ile His Arg
                645                 650                 655
Ile Ser Leu Asp Thr Asn Asn Asn Asp Val Ala Ile Pro Leu Ala Gly
            660                 665                 670
Val Lys Glu Ala Ser Ala Leu Asp Phe Asp Val Ser Thr Asn His Ile
        675                 680                 685
Tyr Trp Thr Asp Val Ser Leu Lys Thr Ile Ser Arg Ala Phe Met Asn
    690                 695                 700
Gly Ser Ser Val Glu His Val Ile Glu Phe Gly Leu Asp Tyr Pro Glu
705                 710                 715                 720
Gly Met Ala Val Asp Trp Met Gly Lys Asn Leu Tyr Trp Ala Asp Thr
                725                 730                 735
Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Ala Arg Leu Asp Gly Gln Phe Arg Gln
            740                 745                 750
Val Leu Val Trp Arg Asp Leu Asp Asn Pro Arg Ser Leu Ala Leu Asp
        755                 760                 765
Pro Thr Lys Gly Tyr Ile Tyr Trp Thr Glu Trp Gly Gly Lys Pro Arg
    770                 775                 780
Ile Val Arg Ala Phe Met Asp Gly Thr Asn Gly Met Thr Leu Val Asp
785                 790                 795                 800
Lys Val Gly Arg Ala Asn Asp Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Gln Arg
                805                 810                 815
Leu Tyr Trp Thr Asp Leu Asp Thr Asn Met Ile Glu Ser Ser Asn Met
            820                 825                 830
Leu Gly Gln Glu Arg Val Val Ile Ala Asp Asp Leu Pro His Pro Phe
        835                 840                 845
Gly Leu Thr Gln Tyr Ser Asp Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Asn Leu
    850                 855                 860
His Ser Ile Glu Arg Ala Asp Lys Thr Ser Gly Arg Asn Arg Thr Leu
865                 870                 875                 880
Ile Gln Gly His Leu Asp Phe Val Met Asp Ile Leu Val Phe His Ser
                885                 890                 895
Ser Arg Gln Asp Gly Leu Asn Asp Cys Met His Asn Asn Gly Gln Cys
            900                 905                 910
Gly Gln Leu Cys Leu Ala Val Pro Ser Gly His Arg Cys Ser Cys Ala
        915                 920                 925
Ser His Tyr Thr Leu Asp Pro Ser Ser Arg Asn Cys Ser Pro Pro Thr
    930                 935                 940
Thr Phe Leu Leu Phe Ser Gln Lys Cys Ala Val Ser Arg Met Ile Pro
945                 950                 955                 960
Asp Asp Gln His Ser Pro Asp Leu Ile Leu Pro Leu His Gly Leu Arg
                965                 970                 975
Asn Val Arg Ala Ile Asp Tyr Asp Pro Leu Asp Lys Phe Ile Tyr Trp
            980                 985                 990
Val Asp Gly Arg Gln Asn Ile Lys Arg Ala Lys Asp Asp Gly Thr Gln
        995                 1000                1005
Pro Phe Val Leu Thr Ser Pro Gly Gln Ser Gln Ser Pro Asp Arg Gln
    1010                1015                1020
Pro His Asp Leu Ser Ile Asp Val Tyr Gly Arg Thr Leu Phe Trp Thr
1025                1030                1035                1040
Cys Glu Ala Thr Asn Thr Ile Asn Val His Arg Leu Asn Gly Asp Ala
                1045                1050                1055
Met Gly Val Val Leu Arg Gly Asp Arg Asp Lys Pro Arg Ala Ile Val
            1060                1065                1070
Val Asn Ala Glu Arg Gly Tyr Leu Tyr Phe Thr Asn Met Gln Asp Arg
        1075                1080                1085
Ala Ala Lys Ile Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val
    1090                1095                1100
Leu Phe Thr Thr Gly Leu Ile Arg Pro Val Ala Leu Val Val Asp Asn
1105                1110                1115                1120
Ala Leu Gly Lys Leu Phe Trp Val Asp Ala Asp Leu Lys Arg Ile Glu
                1125                1130                1135
Ser Cys Asp Leu Ser Gly Ala Asn Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ala Asn
            1140                1145                1150
Ile Val Gln Pro Val Gly Leu Thr Val Leu Gly Lys His Leu Tyr Trp
        1155                1160                1165
Ile Asp Arg Gln Gln Gln Met Ile Glu Arg Val Asp Lys Thr Thr Gly
    1170                1175                1180
Asp Ser Arg Thr Arg Val Gln Gly Arg Val Ala His Leu Thr Gly Ile
1185                1190                1195                1200
His Ala Val Glu Asp Ile Ser Val Glu Glu Phe Ser Ala His Pro Cys
                1205                1210                1215
Ala Arg Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Ile Cys Ile Ala Lys Gly Asp
            1220                1225                1230
Gly Thr Pro Arg Cys Ser Cys Pro Val His Leu Val Leu Leu Gln Asn
        1235                1240                1245
Leu Leu Thr Cys Gly Glu Pro Pro Thr Cys Ser Pro Asp Gln Phe Ala
    1250                1255                1260
Cys Ala Thr Gly Glu Ile Asp Cys Ile Pro Gly Ala Trp Arg Cys Asp
1265                1270                1275                1280
Gly Phe Pro Glu Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu Glu Gly Cys Pro Val
                1285                1290                1295
Cys Ser Ala Ala Gln Phe Pro Cys Ala Arg Gly Gln Cys Val Asp Leu
            1300                1305                1310
Arg Leu Arg Cys Asp Gly Glu Ala Asp Cys Gln Asp Arg Ser Asp Glu
        1315                1320                1325
Ala Asp Cys Asp Ala Val Cys Leu Pro Asn Gln Phe Arg Cys Ala Ser
    1330                1335                1340
Gly Gln Cys Val Leu Ile Lys Gln Gln Cys Asp Ser Phe Pro Asp Cys
1345                1350                1355                1360
Ile Asp Gly Ser Asp Glu Leu Met Cys Glu Ile Thr Lys Leu Pro Ser
                1365                1370                1375
Asp Asp Ser Pro Ala His Ser Ser Ala Ile Gly Pro Val Ile Gly Ile
            1380                1385                1390
Ile Leu Ser Leu Phe Val Met Gly Gly Val Tyr Phe Val Cys Gln Arg
        1395                1400                1405
Val Val Cys Gln Arg Tyr Ala Gly Ala Thr Gly Pro Phe Pro His Glu
    1410                1415                1420
Tyr Val Ser Gly Thr Pro His Val Pro Leu Asn Phe Ile Ala Pro Gly
1425                1430                1435                1440
Gly Ser Gln His Gly Pro Phe Pro Gly Ile Ser Cys Ser Lys Ser Met
                1445                1450                1455
Met Ser Ser Val Ser Leu Met Gly Gly Arg Ala Gly Val Pro Leu Tyr
            1460                1465                1470
Asp Arg Asn His Val Thr Gly Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr
        1475                1480                1485
Lys Ala Thr Leu Tyr Pro Pro Ile Leu Asn Pro Pro Pro Ser Pro Ala
    1490                1495                1500
Thr Asp Pro Ser Leu Tyr Asn Leu Asp Val Phe Tyr Ser Ser Asn Ile
1505                1510                1515                1520
Pro Ala Ala Ala Arg Pro Tyr Arg Pro Tyr Ile Ile Arg Gly Met Ala
                1525                1530                1535
Pro Pro Thr Thr Pro Cys Ser Thr Asp Val Cys Asp Ser Asp Tyr Ser
            1540                1545                1550
Ala Ser Arg Trp Lys Ala Ser Lys Tyr Tyr Leu Asp Leu Asn Ser Asp
        1555                1560                1565
Ser Asp Pro Tyr Pro Pro Pro Pro Thr Pro His Ser Gln Tyr Leu Ser
    1570                1575                1580
Ala Glu Asp Ser Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser Tyr Phe
1585                1590                1595                1600
His Leu Phe Pro Pro Pro Pro Ser Pro Cys Thr Asp Ser Ser
                1605                1610
<210> 11
<211> 3000
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 11
gaacctccat atgccgcagg tgcagccctg gaaaaaaaaa aaaaagtctc ttaataagtc 60
aagaaagaaa gaacatgttt caaaccagtc acatcattgt tccaggctat aaaggctgag 120
gtgtaccttt ctctgagttt gttctctgtg gagtcagttg aagctgggta tcagccgcca 180
gcttccaccc cttgctgccg gcgcacatgc tagtgggtga tggcaccaga gttggtgggg 240
gaggtgaatg tcctcactcc gggggccctt gtaccaccgc ctgcaaggag gagccttgcc 300
aaggcccctc tctcctgaga ctgttgccca ctttcatgcc actgccgacc aggagtggcc 360
tggccccggc aggagcagct ccagaccttt ggagagctgt ttagatcagc aaagagtcac 420
ctggcccagc ccgaacaccc tctgggtgag tcctcctcac agactgggtg tttcaagccc 480
cagcgtccag cgcgtcctgg ctgctattcc gtaatccgca tcgaccagcc cccagcggag 540
cccaggcccg tccccagctg ggcttctcag cgcttaccca cagcaacaga tggtccgtgg 600
tgtcaccctg gcatggcttc ccagtgtaaa cagatcaaaa cagcgtcact taagtcataa 660
acaagggggc tggtagtcac aacaaaccaa tacacagcaa aacgcaaggc caccagggtg 720
acaaagagga agatggggca acggcctcca aggtgctcac ctgtcagtga gatgcccacc 780
tgggcaggac aggacctggg atgatgtgtg tgctcttggg gcctgaagct gccttgctgg 840
gtaggtgtgg ggaggcaacg gtgggcctcg gggaagaagc agcgttcggg ctgagccagg 900
aagggtgagc acgtagaagg tgaggtccgg tgggggctct gaggagtacg gtgggcgagt 960
ggggcctgga gcccagtgcc gggtcgggac tgcagtcgcg gccggtttgt ggccaggaga 1020
ggggcttgca gggaagaagg agttctgagc gcgaggcgct tcttacacag cggttggagc 1080
tggtggctgt gtggctttca gagggctgct taacctctct gtgcttctgt ctgctcgtct 1140
ggacgttggg gacacacata gcgctggcct cagggatctc tttcaggatg aacgagtggc 1200
tgcggaggga gatcacagca agcgttccct gacacgacct gtcatcgcag gggcgtcccc 1260
ggggacccgg cagagccccg ccctgccccc cgcaggccca gctctgacgc ccccgctcct 1320
gtgtccgcag gggccgagga ggtgctgctg ctggcccgga ggacggacct gcggaggatc 1380
tcgctggaca cgccggactt cacggacatc gtgctgcagg tggacgacat ccggcacgcc 1440
atcgccatcg actacgaccc gctggagggc tacgtgtact ggacggacga cgaggtgcgg 1500
gccatccgca gggcgtacct ggacgggtcg ggggcgcaga cgctggtcaa caccgagatc 1560
aacgacccgg acggcatcgc ggtcgactgg gtggcccgca acctctactg gacggacacg 1620
ggcaccgacc gcatcgaggt gacgcgcctc aacggcacct cccgcaagat cctggtgtcc 1680
gaggacctgg acgagccccg cgccatcgtg ctgcaccccg tgatggggta aggctgtggc 1740
gggcgggcca ggagctgggc ggcgcggggc tgggggtccc ggagctctct cccgagaccg 1800
ggtgggcctg aaggctgggc cgggagctgg gcggcgcggg gctgggggtc ccggagctct 1860
ctcccgcgac tgggtgggcc tgaaggctgg gctgtgggct cagtgcccgt tccgatcttg 1920
catttccaac aagctcacag gagatgggcc gatctgggga ccaggctttg agaagctctc 1980
acacaacttg gttacattta tagcaagtcc tggagacctt gggtcagtca tttttctccc 2040
tgggcttcaa tattctcacc tataaaagca gagccaccca ccagggtgac ttctgagctg 2100
atgctggtaa caagagcggc ggccaccgca gcccttactg cacttgagcc gggcctcagc 2160
aggcacgtct gcctcctctc ctcccctgtg gggcgggcgc agggttcaga ggaggaagct 2220
gaagcccaga gaggagaagg gacttgccca agatcacgca gctgggaggt ggggactgga 2280
cctggcggtc tggttccaac ttcccatttt aggatttggt gacaaccgag agcttctccg 2340
tcattgcagg agcctttctg agatgccagc agctcagagg gtagcggctg ggtcccttcc 2400
tacgggctcg tgaccaagaa tgcgaagctg gtggacctga tgggggaggg gtgctgggcg 2460
ttctgggggc tgcagaggaa gccccctggc ctcaatgcag catgagggac caggtcctgg 2520
agaaggtctg gaggagctgg gaggacagag gagggccacc ccggctgctg cccctcaggt 2580
gtcaggagct cttcccatct ccccggggct gaggctcagg tgacgtgacc catcgcggtg 2640
cctggtggcg ggggctgtcc gcctgtggag cccgtgcacc ctgccctggc ccgggactgt 2700
cggacgtgct cttgctgtgg cgctgcttct gtggtagaag cacagccacg ggggcaggtc 2760
tggctgcagc tggaccgctg gactcggctc aggcagccgg ggacggtgcc tgtggagccc 2820
aggccccggt gggcatgtag acagacgctg cttggcgagg tggttgagga gcaggactgt 2880
cccccaagga gggtgggtgg agaagcgggt ccctggggtc tgagggtcaa ggagcatcgc 2940
cagcgtcagt gacgggactg gggctccgag gttggcagag aggccctccc cccacgctgc 3000
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcgcgaggc gcttcttaca c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccttcaggcc cacccggtct c 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagggagatc acagcaagcg 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggaaatgca agatcggaac g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggagggctac gtgtactgga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtgtactgg acggacgacg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caacgacccg gacggcatcg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acccgtccag gtacgccctg 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caccggaggg ctacgtgtac tgga 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaactccagt acacgtagcc ctcc 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caccgcgtgt actggacgga cgacg 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaaccgtcgt ccgtccagta cacgc 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caccgcaacg acccggacgg catcg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aaaccgatgc cgtccgggtc gttgc 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caccgacccg tccaggtacg ccctg 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaaccagggc gtacctggac gggtc 25
<210> 28
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggagggcuac guguacugga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 29
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cguguacugg acggacgacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 30
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caacgacccg gacggcaucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 31
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acccguccag guacgcccug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 32
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175
<210> 33
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240
gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300
tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360
gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540
caccatggac tata 554
<210> 34
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120
ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180
caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240
cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300
catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360
ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420
gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447
<210> 35
<211> 2727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60
ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120
ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300
tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360
acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600
acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660
agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900
gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960
tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020
ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080
agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140
acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200
tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260
agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320
tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380
tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440
tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500
cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620
cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680
tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740
ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800
gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860
cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920
ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980
ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040
cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100
gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160
gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220
gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280
agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340
ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400
ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700
tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

Claims (3)

1.一种用于猪LRP5基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和针对猪LRP5基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.1所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体；针对猪LRP5基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示；所述的针对猪LRP5基因的gRNA表达载体中含有针对靶标位点的gRNA序列，所述的gRNA序列由SEQ ID NO.20所示的单链DNA和SEQID NO.21所示的单链DNA退火而成；该表达载体表达SEQ ID NO.28所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.16所示；所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为3:1。
2.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在构建LRP5基因敲除的猪重组细胞中的应用。
3.一种LRP5基因敲除的猪重组细胞，其特征在于由权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
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