CN112442513B - Cas9过表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Cas9过表达载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种Cas9过表达载体及其构建方法和应用，Cas9过表达载体由原始载体pX330‑U6‑Chimeric_BB‑CBh‑hSpCas9改造而成，原始载体具有gRNA骨架序列、CMV增强子和Cas9基因，所述CMV增强子的下游插入EF1a启动子以替换原始载体的chickenβ‑actin启动子；所述Cas9基因的N端及C端各插入一个核定位编码序列NLS。本发明的表达载体采用CMV增强子‑EF1a启动子杂合启动子元件，增加Cas9基因的蛋白表达能力，进一步地，同时在Cas9基因N端及C端各增加一个核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力。同时，本发明在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。另外，去除了原载体gRNA骨架中多余无效的序列，缩小了载体。

Description

Cas9过表达载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种Cas9过表达载体及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)系统是继ZNF和TALENS技术之后的第三代基因编辑技术，被广泛应用于细胞水平和个体水平基因编辑细胞系和模式动物的建立。
CRISPR/Cas相比其它基因组编辑技术，如锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，操作更简单，同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑，该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全，毒性更低的新方法。
到目前为止CRISPR/Cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等，从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变。另一方面，其强大的基因组编辑能力已经用于生物治疗，如HIV、HBV等RNA病毒引起的疾病治疗研究、单基因或多基因遗传病治疗研究、癌症治疗研究等方面。
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9是来源于Feng Zhang Lab的最早运用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现哺乳动物基因编辑的载体，经大量的实验验证，它可以有效地实现哺乳动物细胞的基因编辑。但其Cas9蛋白的表达量及核定位能力较有限，并且没有荧光及抗性筛选标记。
发明内容
本发明提供一种可以提高基因编辑效率的Cas9过表达载体，解决了传统Cas9表达载体表达量及核定位能量较弱的问题。
一种Cas9过表达载体，由原始载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9改造而成，原始载体具有gRNA骨架序列、CMV增强子和Cas9基因，其特征在于，所述CMV增强子的下游插入EF1a启动子以替换原始载体的chickenβ-actin启动子；所述Cas9基因的N端及C端再各插入一个核定位编码序列NLS，所述Cas9基因的C端核定位编码序列NLS的下游依次插入WPRE序列、3’LTR序列和bGH polyA序列。
进一步地，所述Cas9基因C端的核定位编码序列NLS与WPRE序列之间插入序列P2A-EGFP-T2A-PURO。
进一步地，所述gRNA骨架序列替换为如SEQ ID NO：1所示序列，去除原始载体中的无效多余序列。
本发明改造pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体的如下原件：
(1)去除残留的gRNA骨架序列，降低干扰。
(2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin promoter)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力。
(3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力。
(4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力。
(5)插入WPRE和3’LTR等序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
改造后得到的pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体其碱基序列如SEQID NO：70所示，图谱如图13所示。
本发明还提供一种Cas9过表达载体的构建方法，它以载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9为原始载体，原始载体具有gRNA骨架序列、CMV增强子和Cas9基因，其特征在于，包括以下步骤：(1)将所述CMV增强子下游的chickenβ-actin启动子替换为EF1a启动子；(2)在所述Cas9基因的N端和C端各增加一个核定位编码序列NLS，在所述Cas9基因的C端核定位编码序列NLS的下游依次插入WPRE序列、3’LTR序列和bGH polyA序列。
进一步地，包括：将所述gRNA骨架序列替换为如SEQ ID NO：1所示序列，去除原载体中无效多余序列。
进一步地，在所述Cas9基因的C端NLS与WPRE序列之间插入P2A-EGFP-T2A-PURO序列。
本发明的构建方法中包括对原始载体5个位点的改造，对各位点的改造顺序可以以任一顺序进行，更进一步优选地，所述构建方法按如下步骤进行：
(1)将所述gRNA骨架序列改造为如SEQ ID NO：1所示序列；
(2)将所述CMV增强子下游的chickenβ-actin启动子改造为EF1a启动子；
(3)在所述Cas9基因的N端增加至少一个核定位编码序列NLS；
(4)在所述Cas9基因的C端依次插入至少一个核定位编码序列NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO序列、WPRE序列、3’LTR序列和bGH polyA序列。
本发明的表达载体采用CMV增强子-EF1a启动子杂合启动子元件，增加Cas9基因的蛋白表达能力，进一步地，同时在Cas9基因N端及C端各增加数个核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力。另外，本发明在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。
本发明还提供了包含所述Cas9过表达载体的CRISPR/Cas9系统。
本发明还提供了所述的CRISPR/Cas9系统在构建突变型猪细胞系中的应用。
本发明还提供了采用所述CRISPR/Cas9系统构建突变型猪细胞系的方法，包括以下步骤：将所述CRISPR/Cas9系统转入猪成纤维细胞，筛选突变型细胞株。
与现有技术相比，本发明具有至少以下有益效果：
本发明中经过实验验证经过改造的pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。
附图说明
图1为原始载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9的结构图谱。
图2为原始载体经BbsI、XbaI酶切电泳结果图。
图3为全基因合成的gRNAsc1-6插入片段电泳图谱。
图4为重组载体pU6gRNACas9载体的结构图谱。
图5为pU6gRNACas9载体XbaI、AgeI酶切结果胶图。
图6为全基因合成的eEF1a1-14电泳结果图。
图7为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。
图8为pU6gRNA-eEF1a Cas9的AgeI、BglII酶切胶图结果图。
图9为全基因合成的N-NLS 1-12电泳结果。
图10为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。
图11为载体pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS的FseI、SbfI酶切胶图。
图12为拼接的2727bp片段的胶图结果。
图13为改造后载体pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO的图谱。
图14为DNA oligo与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的示意图。
图15为pKG-U6gRNA载体图谱。
图16是MSTN-gRNA1插入序列。
图17是MSTN-gRNA2插入序列。
图18是FNDC5-gRNA1插入序列。
图19是FNDC5-gRNA2插入序列。
图20为MSTN基因编辑效率的对比图。
图21为FNDC5基因编辑效率的对比图。
具体实施方式
本发明所用原始载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9的结构如图1所示，购自addgene(Plasmid#42230，from Feng Zhang lab)。
实施例
一、载体改造
1、去除gRNA骨架中多余无效的序列
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(图1)用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，全基因合成插入片段175bp(SEQ ID NO：1)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图4)。
构建具体步骤如下：
(1)用限制性内切酶BbsI、XbaI酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒(酶切体系如表1，37℃反应2h。
表1
组份 量
ddH<sub>2</sub>O To 50ul
pX330质粒 2ug
10XFD buffer 5ul
FD BbsI 1.5ul
FD XbaI 1.5ul
总量 50
(2)酶切的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒跑琼脂糖胶分离，结果如图2所示，用胶回收试剂盒(诺唯赞FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit#DC301)纯化回收载体大片段，目的片段溶解在50ul ddH2O中，-20℃备用。
(3)使用DNAworks设计，全基因合成175bp插入片段，全基因合成引物如表2所示：
表2
gRNAsc-1 TGTGGAAAGGACGAAACACC(SEQ ID NO：2)
gRNAsc-2 TGCTATTTCTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA(SEQ ID NO：3)
gRNAsc-3 CCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAA(SEQ ID NO：4)
gRNAsc-4 CACGCGCTAGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGC(SEQ ID NO：5)
gRNAsc-5 GTGCTTTTTTCTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCCGTT(SEQ ID NO：6)
gRNAsc-6 TTATGTAACGGGTACCTCTAGAGCC(SEQ ID NO：7)
全基因合成PCR使用Phanta Max(诺唯赞P505)，按表3所示体系混合：
表3
Figure BDA0002188173020000031
Figure BDA0002188173020000041
PCR条件：95℃3min(95℃15s 58℃15s 72℃20s)循环32次72℃5min；4℃保存。通过全基因合成得到175bp插入片段(SEQ ID NO：1)，完成PCR后，PCR产物跑1％的琼脂糖电泳，进行分离，结果如图3所示，用胶回收试剂盒(诺唯赞FastPure Gel DNAExtractionMini Kit#DC301)回收目的片段，目的片段溶解在50ul ddH2O中，-20℃备用。
(4)使用克隆重组试剂盒(诺唯赞ClonExpress II One Step Cloning Kit#C112)进行载体和175bp插入片段的重组。按表4所示体系加入各组份，混合，37℃反应30min，反应完成立即至于冰上，并用于转化。
表4
组份 体积ul
线性化载体 150ng
插入片段 0.04Xbp数ng
5x CE II Buffer 2ul
Exnase II 1ul
ddH<sub>2</sub>O To 10ul
(5)转化，克隆送测并质粒小抽
1)取100μL DH5α化学感受态细胞(Vazyme#C502)置于冰浴中；
2)向装有感受态细胞的离心管中加入10μL步骤(4)中得到的重组反应产物，混匀后在冰浴中静置30min；
3)将冰浴30min的感受态细胞置于42℃水浴中90s，然后迅速转移到冰浴中，使细胞冷却3min；
4)向离心管中加入300μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床220rpm振荡培养60min；
5)将100uL的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将感受态细胞涂布均匀；将涂布有感受态细胞的LB固体琼脂培养基倒置于37℃培养箱中培养12～16h。
(6)挑取克隆，培养，菌液送测，正确克隆小抽。
构建的平板挑取4个克隆，分别置于含300ul的含Amp抗性的LB培养基中，37℃培养过夜，第二天分出100ul分别用通用引物LKO1_5进行测序，测序结果正确的克隆，分别取菌液20ul到含3ml Amp LB的试管中过夜培养，第二天使用质粒小抽试剂盒进行质粒抽提，质粒-20℃保存备用。得到的重组载体pU6gRNACas9载体如图4。
2、改造启动子及增强子
对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(CMV增强子)及增强子序列(chickenβ-actin)，回收线性载体序列约7650bp，并合成554bp包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(，SEQ ID NO：8)，与酶切载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1aCas9载体(图7)。
构建具体步骤如下：
(1)用限制性内切酶XbaI、AgeI酶切改造的pU6gRNACas9质粒
具体实验方法，参看如前所述pU6gRNACas9载体的改造过程中载体线性化部分。
pU6gRNACas9载体XbaI、AgeI酶切胶图结果如图5所示，回收载体大片段。
(2)全基因合成554bp插入片段，全基因合成引物如表5所示：
表5
Figure BDA0002188173020000042
Figure BDA0002188173020000051
全基因合成方法参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中全基因合成部分。
(3)线性化载体和合成插入片段的重组参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中克隆重组部分。eEF1a1-14全基因合成电泳结果如图6所示，胶回收目的片段554bp。
(4)挑取克隆、培养、菌液送测、正确克隆小抽
参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中挑取克隆、培养、菌液送测(同样使用通用引物LKO1_5进行测序)及正确克隆小抽部分。得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体如图7所示。
3、Cas9基因N端增加NLS序列
构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，合成以下序列447bp包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：23)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体。
构建具体步骤如下：
(1)用限制性内切酶AgeI、BglII酶切改造的pU6gRNA-eEF1a Cas9质粒
具体实验方法，参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中载体线性化部分。
pU6gRNA-eEF1a Cas9的AgeI、BglII酶切胶图结果如图8所示，回收载体大片段
(2)全基因合成447bp插入片段，全基因合成引物如表6所示：
表6
N-NLS-1 CCAGAACACAGGTTGGACCGGTGC(SEQ ID NO：24)
N-NLS-2 GATCCTTGTAGTCTCCGTCGTGGTCCTTATAGTCCATGGTGGCACCGGTCCAACCTGTG(SEQ ID NO：25)
N-NLS-3 CGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCC(SEQ ID NO：26)
N-NLS-4 TCTTCTTTGGGGACCCACCCACCTTTCGTTTCTTTTTGGGGGCCATCTTATCGTCATCG(SEQ ID NO：27)
N-NLS-5 GGTGGGTCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAA(SEQ ID NO：28)
N-NLS-6 CCCACAGAGTTGGTGCCGATGTCCAGGCCGATGCTGTACTTCTTGTCGGCTGCTGGGAC(SEQ ID NO：29)
N-NLS-7 CGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGA(SEQ ID NO：30)
N-NLS-8 CTTGATGCTGTGCCGGTCGGTGTTGCCCAGCACCTTGAATTTCTTGCTGGGCACCTTGT(SEQ ID NO：31)
N-NLS-9 GACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAAC(SEQ ID NO：32)
N-NLS-10 TATCTTCTTCTGGCGGTTCTCTTCAGCCGGGTGGCCTCGGCTGTTTCGCCGCTGTCGAA(SEQ ID NO：33)
N-NLS-11 GAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGA(SEQ ID NO：34)
N-NLS-12 GCCATCTCGTTGCTGAAGATCTCTTGCAGATAGCAGATCC(SEQ ID NO：35)
全基因合成方法参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中全基因合成部分。N-NLS1-12全基因合成电泳结果如图9所示，胶回收447bp目的片段
(3)线性化载体和合成插入片段的重组
参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中克隆重组部分。
(4)挑取克隆、培养、菌液送测、正确克隆小抽
参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中挑取克隆、培养、菌液送测(使用合成引物gRNA-F：ttttagagctaGAAAtagcaag进行测序)以及正确克隆小抽部分。得到pU6gRNA-eEF1aCas9+nNLS载体图谱如图10所示。
4、Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signals
以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，合成序列2727bp包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyAsignals(SEQ ID NO：36)的序列，与载体片段重组得到载体pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO。
构建具体步骤如下：
(1)用限制性内切酶FseI、SbfI酶切改造的pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS质粒，回收7781bp线性载体片段
具体实验方法，参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中载体线性化部分。载体pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS的FseI、SbfI酶切胶图如图11所示，回收载体大片段。
(2)全基因合成2727bp插入片段
全基因合成方法参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中全基因合成部分。2727bp合成片段来源于3段片段重叠延伸PCR，具体包括
片段一：合成含核定位信号编码序列及P2A，EGFP重叠序列192bp(SEQ ID NO：37)，合成引物序列见表7，通过全基因合成得到(方法参看pU6gRNACas9载体的改造过程中全基因合成部分)。
表7
C-NLS-1 CGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAG(SEQ ID NO：38)
C-NLS-2 AGGCCGCTTGGAGCCGCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTTTTCGTGGCCGCCG(SEQ ID NO：39)
C-NLS-3 GGCTCCAAGCGGCCTGCCGCGACGAAGAAAGCGGGACAGGCCAAGAAAAAGAAAGGATC(SEQ ID NO：40)
C-NLS-4 TCCGGCTTGTTTCAGCAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCCTTTCTTTTTCTTGGCCT(SEQ ID NO：41)
C-NLS-5 CTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGGTGAGCAAGGGCGAGGA(SEQ ID NO：42)
C-NLS-6 CGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCAC(SEQ ID NO：43)
片段二：EGFP片段744bp(SEQ ID NO：68)，模板为商业化载体EGFP-N1，引物为表8，常规PCR得到：
表8
EGFP-F GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGG(SEQ ID NO：44)
EGFP-R TAGAAGACTTCCCCTGCCCTCGCCGGAGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG(SEQ ID NO：45)
片段三：T2A-PURO-WPRE-3’LTR-polyA signals序列1840bp(SEQ ID NO：69)，模板为LentiCRISPRV2(addgene Plasmid#52961)，引物如表9，用LentiCRISPRV2为模板V2-F/V2-R引物PCR，再以前步PCR产物为模板，T2A-F和V2-R PCR得到目的片段1840bp。
表9
T2A-F GAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA(SEQ ID NO：46)
V2-F TGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCG(SEQ ID NO：47)
V2-R taccgcatcaggcgcccctgcaggccatagagcccaccgcatccccagcatgcctg(SEQ ID NO：48)
上述三个片段为模板、使用引物C-NLS-1/V2-R PCR得到全长2727bp目的片段(SEQID NO：36)，最终拼接的2727bp片段胶图结果如图12所示。
(3)线性化载体和合成插入片段的重组
线性化载体pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS 7781bp和2727bp插入片段重组，方法参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中克隆重组部分。
(4)挑取克隆，培养，菌液送测，正确克隆小抽
参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中挑取克隆，培养，菌液送测(使用合成引物Cas9-5-F:CCACCAGAGCATCACCGGCCTG(SEQ ID NO：49)和f1ori-R:cacacccgccgcgcttaatgcg(SEQ ID NO：50)进行测通)，正确克隆小抽部分。得到的最终改造载体pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO图谱如图14，碱基序列(SEQ ID NO：70)。
改造后载体pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO主要原件：
1)gRNA表达原件：U6-gRNA scaffold。
2)启动子：CMV增强子和EF1a杂合启动子。
3)含多个NLS的cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因。
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记原件P2A-EGFP-T2A-PURO。
5)增强翻译的元件：WPRE和3‘LTR，增强cas9及筛选标记基因的翻译。
6)转录终止信号：bGH polyA signal。
7)载体骨架：包括Amp抗性原件和ori复制子等。
二、基因编辑效果测试
为了检测改造后的pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对于改造前的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体基因编辑效率。本发明构建了猪MSTN基因和FNDC5基因各两个gRNA靶点载体，并通过电转猪原代成纤维细胞，PCR检测各基因发生的缺失突变效率来确定载体的基因编辑效率。
具体步骤：
1、构建猪MSTN(Gene ID：399534)和FNDC5(Gene ID：100622587)基因gRNA靶点载体
设计MSTN两个gRNA靶点(理论造成MSTN第一编码外显子缺失127bp)：
MSTN-gRNA1:GCTGATTGTTGCTGGTCCCG(SEQ ID NO：51)和MSTN-gRNA2:TTTCCAGGCGAAGTTTACTG(SEQ ID NO：52)。
FNDC5两个gRNA靶点(理论造成FNDC5第三编码外显子缺失89bp)：
FNDC5gRNA1：TGTACTCAGTGTCCTCCTCC(SEQ ID NO：53)和FNDC5gRNA2：GCTCTTCAAGACGCCTCGCG(SEQ ID NO：54)
并分别在靶点两侧设计用于后期基因编辑效率检测的引物：
MSTN检测引物：
MSTN-F896 TCTCTCAGACAGTGCAGGCATTA(SEQ ID NO：55)
MSTN-R1351 CGTTTCCGTCGTAGCGTGATAAT(SEQ ID NO：56)
FNDC5检测引物：
FNDC5-F209 CAGTTCTCACTTGATGGCCTTGG(SEQ ID NO：57)
FNDC5-R718 AGGGGTCTGGGGAGGAATGG(SEQ ID NO：58)
根据四个靶点分别合成以下双链：
Figure BDA0002188173020000071
pKG-U6gRNA载体：来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，即SEQ ID NO：8)，pKG-U6gRNA插入序列反向插入到pUC57载体的克隆得到，pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO：71)，pKG-U6gRNA载体图谱如图15所示。
pKG-U6gRNA插入序列(第一段下划线部分为U6启动子序列，大写碱基字母段为两个BbsI酶切位点所在序列，第二段下划线部分为sgRNA骨架序列)：
gataaacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttaga gagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttc ttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcga tttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGGGTCTTCGAGAAGACCTgttttagagctagaaata gcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttctagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccatag(SEQ ID NO：67)。
每个靶点合成2对互补的DNA oligo，通过退火可以形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链(如图14)。
合成的MSTN基因靶点和FNDC5基因靶点的插入序列互补DNA oligo如下：
MSTN-gRNA1插入序列如图16；MSTN-gRNA2插入序列如图17；FNDC5-gRNA1插入序列如图18；FNDC5-gRNA2插入序列如图19。
(1)将gRNA靶点序列克隆到pKG-U6gRNA载体骨架上，具体步骤如下：
用限制性内切酶BbsI(Thermofisher：FD1014)消化1ug pKG-U6gRNA质粒，37℃反应2h，酶切体系：
Figure BDA0002188173020000081
(2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖胶分离，用胶回收试剂盒纯化回收酶切产物；
(3)公司合成的寡核苷酸链gRNA-S和gRNA-A序列按照以下程序退火：
Figure BDA0002188173020000082
95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃。
(4)按照以下体系进行连接反应，37℃反应60min。
Figure BDA0002188173020000083
(5)转化
具体方法参看以上pU6gRNACas9载体的改造过程中转化，挑取克隆，培养，菌液送测。测序使用通用引物M13F或M13R。
正确克隆分别命名为pKG-U6gRNA(MSTN-1)，pKG-U6gRNA(MSTN-2)，pKG-U6gRNA(FNDC5-1)，pKG-U6gRNA(FNDC5-2)质粒小抽，-20℃保存备用。
2、电转猪原代细胞
分别将Cas9表达载体pX330或改造的pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO与gRNA表达载体pKG-U6gRNA(MSTN-1)和pKG-U6gRNA(MSTN-2)或pKG-U6gRNA(FNDC5-1)和pKG-U6gRNA(FNDC5-2)共转染猪原代成纤维细胞。
使用哺乳动物核转染试剂盒(Neon)与Neon TM transfection system电转仪进行电转实验。
MSTN组B：pKG-U6gRNA(MSTN-1)和pKG-U6gRNA(MSTN-2)
MSTN组330：pX330+pKG-U6gRNA(MSTN-1)和pKG-U6gRNA(MSTN-2)
MSTN组KG：pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO+pKG-U6gRNA(MSTN-1)和pKG-U6gRNA(MSTN-2)
FNDC5组B：pKG-U6gRNA(FNDC5-1)和pKG-U6gRNA(FNDC5-2)
FNDC5组330：pX330+pKG-U6gRNA(FNDC5-1)和pKG-U6gRNA(FNDC5-2)
FNDC5组KG：pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO+pKG-U6gRNA(FNDC5-1)和pKG-U6gRNA(FNDC5-2)
1)配制电转反应液，体系如下：
Figure BDA0002188173020000091
混匀过程中注意切勿产生气泡；
2)将步骤一制备得到的细胞悬液使用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用7uL电转基本溶液R重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；
3)吸取7uL细胞悬液，加入步骤1)中的电转反应液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；
4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL E Buffer；
5)用电转枪吸取10uL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含2mL15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)的完全培养液；
6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养。
7)电转6-12h换液，电转48h使用胰蛋白酶消化并收集细胞到1.5ml EP管中，后期进行突变效率PCR检测。
3、PCR检测MSTN和FNDC5基因突变效率
1)向上步收集在1.5mL离心管中的细胞中(根据细胞量，细胞过多需要适当稀释后取部分裂解)加入10uL配置的KAPA2G(Kapabiosystems:Kapa hotstart mouse genotypingkit,货号KK7352))裂解液裂解细胞粗提细胞基因组DNA。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10X extract Buffer 1uL
Kapa Express extract enzyme 0.2uL
ddH2O 8.8uL
裂解过程：75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；
2)MSTN组使用MSTN-F896/MSTN-R1351引物进行PCR检测，FNDC5组使用FNDC5-F209/FNDC5-R718引物进行检测，PCR反应体系如下：
Figure BDA0002188173020000092
反应条件如下
Figure BDA0002188173020000093
3)取PCR产物3ul，进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析结果如图20和图21所示。图20为MSTN基因编辑效率的对比，KG组比330组突变条带(MT,329bp)/野生型条带(WT,456bp)占比更多，说明KG基因编辑效率比330更高。图21为FNDC5基因编辑效率的对比，KG组比330组突变条带(MT,421bp)/野生型条带(WT,510bp)占比更多，说明KG基因编辑效率比330更高。
根据公式：基因缺失突变效率＝100*(MT灰度/MT条带bp数)/(WT灰度/WT条带bp数+MT灰度/MT条带bp数)％，分别计算得到MSTN-330组基因缺失突变效率为27.6％，MSTN-KG组基因缺失突变效率为86.5％，FNDC5-330组基因缺失突变效率为18.6％，FNDC5-KG组基因缺失突变效率为81.7％，改造后载体pU6gRNAeEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO基因编辑效率提高明显(约3～4倍)。
综上所述，经过实验验证经过改造的pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前pX330载体具有更高的基因编辑效率。其原因是更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力。同时，本发明在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> Cas9过表达载体及其构建方法和应用
<130>
<160> 71
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
tgtggaaagg acgaaacacc 20
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tgctatttct agctctaaaa caggtcttct cgaagacccg gtgtttcgtc ctttccaca 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
cctgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaa 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
cacgcgctag aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagc 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gtgctttttt ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtt 59
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
ttatgtaacg ggtacctcta gagcc 25
<210> 8
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240
gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300
tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360
gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540
caccatggac tata 554
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg 30
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
ggcggtcagc caggcgggcc atttaccgta agttatgtaa cgggtacctc tagagccat 59
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca atagtaacgc caataggga 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
taccgtaaat actccaccca ttgacgtcaa tggaaagtcc ctattggcgt tactattga 59
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatg 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
taccgtcatt gacgtcaata gggggcgtac ttggcatatg atacacttga tgtactgcc 59
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt gtgcccagta catgacctt 59
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
gactaatacg tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcac 59
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg gggcagagcg cacatcgcc 59
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
ggatcaattg ccgacccctc cccccaactt ctcggggact gtgggcgatg tgcgctctg 59
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ggggtcggca attgatccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtga 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
cccccaccct cgggaaaaag gcggagccag tacacgacat cactttccca gtttacccc 59
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttc 59
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
gttgcgaaaa agaacgttca cggcg 25
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<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120
ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180
caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240
cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300
catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360
ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420
gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447
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<211> 24
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ccagaacaca ggttggaccg gtgc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
gatccttgta gtctccgtcg tggtccttat agtccatggt ggcaccggtc caacctgtg 59
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cgacggagac tacaaggatc atgatattga ttacaaagac gatgacgata agatggccc 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 27
tcttctttgg ggacccaccc acctttcgtt tctttttggg ggccatctta tcgtcatcg 59
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 28
ggtgggtccc caaagaagaa gcggaaggtc ggtatccacg gagtcccagc agccgacaa 59
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<400> 29
cccacagagt tggtgccgat gtccaggccg atgctgtact tcttgtcggc tgctgggac 59
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cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag tacaaggtgc ccagcaaga 59
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<400> 31
cttgatgctg tgccggtcgg tgttgcccag caccttgaat ttcttgctgg gcaccttgt 59
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gaccggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggagccctgc tgttcgacag cggcgaaac 59
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 33
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<210> 34
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<212> DNA
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<400> 34
gagaaccgcc agaagaagat acaccagacg gaagaaccgg atctgctatc tgcaagaga 59
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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gccatctcgt tgctgaagat ctcttgcaga tagcagatcc 40
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 36
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60
ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120
ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300
tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360
acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600
acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660
agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900
gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960
tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020
ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080
agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140
acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200
tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260
agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320
tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380
tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440
tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500
cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620
cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680
tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740
ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800
gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860
cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920
ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980
ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040
cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100
gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160
gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220
gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280
agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340
ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400
ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700
tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727
<210> 37
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 37
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60
ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120
ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180
agctgttcac cg 192
<210> 38
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 38
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaag 35
<210> 39
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 39
aggccgcttg gagccgccct ttttcttttt tgcctggccg gcctttttcg tggccgccg 59
<210> 40
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 40
ggctccaagc ggcctgccgc gacgaagaaa gcgggacagg ccaagaaaaa gaaaggatc 59
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 41
tccggcttgt ttcagcagag agaagtttgt tgcgccggat cctttctttt tcttggcct 59
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 42
ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa gggcgagga 59
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 43
cggtgaacag ctcctcgccc ttgctcac 28
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 44
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccgg 29
<210> 45
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 45
tagaagactt cccctgccct cgccggagcc cttgtacagc tcgtccatgc cgagagtg 58
<210> 46
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 46
gagggcaggg gaagtcttct aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg ccca 54
<210> 47
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 47
tgcggggacg tggaggaaaa tcccggccca accgagtaca agcccacggt gcgcctcg 58
<210> 48
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 48
taccgcatca ggcgcccctg caggccatag agcccaccgc atccccagca tgcctg 56
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 49
ccaccagagc atcaccggcc tg 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 50
cacacccgcc gcgcttaatg cg 22
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 51
gctgattgtt gctggtcccg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 52
tttccaggcg aagtttactg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 53
tgtactcagt gtcctcctcc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 54
gctcttcaag acgcctcgcg 20
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 55
tctctcagac agtgcaggca tta 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 56
cgtttccgtc gtagcgtgat aat 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 57
cagttctcac ttgatggcct tgg 23
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 58
aggggtctgg ggaggaatgg 20
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 59
caccgctgat tgttgctggt cccg 24
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 60
aaaccgggac cagcaacaat cagc 24
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 61
caccgtttcc aggcgaagtt tactg 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 62
aaaccagtaa acttcgcctg gaaac 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 63
caccgtgtac tcagtgtcct cctcc 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 64
aaacggagga ggacactgag tacac 25
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 65
caccgctctt caagacgcct cgcg 24
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 66
aaaccgcgag gcgtcttgaa gagc 24
<210> 67
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 67
gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410
<210> 68
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 68
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagggctcc 720
ggcgagggca ggggaagtct tcta 744
<210> 69
<211> 1840
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 69
gagggcaggg gaagtcttct aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg cccaaccgag 60
tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc 120
gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc 180
gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag 240
gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa 300
gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg 360
gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg 420
ttcctggcca ccgtcggagt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc 480
gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc 540
gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag 600
gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg aacgcgttaa 660
gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 720
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 780
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 840
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 900
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 960
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 1020
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 1080
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 1140
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 1200
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcgtcga 1260
ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg 1320
ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaga tctgcttttt gcttgtactg 1380
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 1440
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 1500
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 1560
gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 1620
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 1680
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 1740
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 1800
gcggtgggct ctatggcctg caggggcgcc tgatgcggta 1840
<210> 70
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 70
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980
gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040
ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100
agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160
ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220
actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340
tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400
cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600
ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900
gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140
aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200
cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260
aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320
catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620
agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680
cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740
gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800
ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860
gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920
caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980
tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040
caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160
caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220
gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280
aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820
gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060
caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120
gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180
cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240
ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300
ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360
ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420
gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480
ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540
ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600
ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660
cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380
ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860
gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920
atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 8040
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160
aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280
tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 8340
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400
ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580
caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640
tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660
cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720
ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960
taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476
<210> 71
<211> 3120
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 71
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280
ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340
tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400
gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460
ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520
gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640
tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700
ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760
accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880
ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

Claims (5)

1.一种Cas9过表达载体，由原始载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9改造而成，原始载体具有gRNA骨架序列、CMV增强子和Cas9基因，其特征在于，所述CMV增强子的下游插入EF1a启动子以替换原始载体的chicken β-actin启动子；所述 Cas9基因的N端及C端再各插入一个核定位编码序列NLS，所述Cas9基因的C端核定位编码序列NLS的下游依次插入WPRE序列、3’LTR序列和bGH polyA序列；所述Cas9基因的C端核定位编码序列NLS与WPRE序列之间插入P2A-EGFP-T2A-PURO序列；所述gRNA骨架序列替换为如SEQ ID NO：1所示序列，去除原始载体中的无效多余序列；Cas9过表达载体的碱基序列如SEQ ID NO：70所示。
2.一种Cas9过表达载体的构建方法，以载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9为原始载体，原始载体具有gRNA骨架序列、CMV增强子和Cas9基因，其特征在于，包括以下步骤：（1）将所述gRNA骨架序列替换为如SEQ ID NO：1所示序列，去除原载体中无效多余序列；（2）将所述CMV增强子下游的chicken β-actin启动子替换为EF1a启动子；（3）在所述Cas9 基因的N端和C端各增加一个核定位编码序列NLS，在所述Cas9基因的C端核定位编码序列NLS的下游依次插入WPRE序列、3’LTR序列和bGH polyA序列；（4）在所述Cas9 基因的C端NLS与WPRE序列之间插入P2A-EGFP-T2A-PURO序列，构建得到的Cas9过表达载体的碱基序列如SEQID NO：70所示。
3.包含权利要求1所述Cas9过表达载体的CRISPR/Cas9系统。
4.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9系统在构建突变型猪细胞系中的应用。
5.采用权利要求3所述CRISPR/Cas9系统构建突变型猪细胞系的方法，包括以下步骤：将所述CRISPR/Cas9系统转入猪成纤维细胞，筛选突变型细胞株。
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