CN112522313A

CN112522313A - 用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统

Info

Publication number: CN112522313A
Application number: CN202011343904.6A
Authority: CN
Inventors: 牛冬; 汪滔; 陶裴裴; 刘璐; 曾为俊; 王磊; 程锐; 赵泽英; 马翔; 黄彩云
Original assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: CN112522313B

Abstract

本发明公开了用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统。该系统包含Cas9表达载体和针对猪TPH2基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，所述的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.33所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG‑U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

Description

用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的 CRISPR/Cas9系统

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及靶点gRNA和CRISPR/Cas9系统在构建TPH2基因敲除的抑郁症克隆猪核供体细胞中的应用。

背景技术

抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。

世界卫生组织数据显示，截至目前，全球抑郁症患病人群累计超过3.5亿人，中国是抑郁症疾病负担较为严重的国家之一，约有5400多万人患有抑郁症。但中国青年报有关报道显示，中国约八成抑郁症患者没有被“发现”，九成没有得到规范专业治疗。抑郁症目前主要以抗抑郁药物治疗为主，辅以心理治疗或是物理治疗。由于近年抗抑郁药的发展，不同药物间有相互作用问题，规范化的治疗流程尤为重要。因此，开发出合适的动物模型以探讨既有药物的配伍和开发新的药物就尤为重要。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因敲入到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑手段，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。如在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)又名血清素,是哺乳动物体内一类重要的抑制性神经递质,广泛存在于哺乳动物组织中,特别在大脑皮层及神经突触内含量很高,对于情绪、认知等大脑功能有重要作用,被广泛认为是抑郁症发病的关键因素,且是调节抗抑郁药物疗效的重要介导者。中枢内的5-羟色胺是脑源性的，其前体是色氨酸，色氨酸经羟化和脱羧两步酶促反应生成5-羟色胺，其中色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)是5-羟色胺合成的限速酶。TPH分为TPH1及TPH2两种类型，TPH2对中枢5-羟色胺的合成具有重要作用，是与5-羟色胺功能紊乱相关的精神疾病遗传学研究中的一个重要候选基因。已有研究发现TPH2基因与情感性精神障碍、抑郁症、自杀行为、精神分裂症和物质依赖性有关。因此，本发明基于TPH2基因突变开发了抑郁症克隆猪核供体细胞，后期再通过细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，可用于进行抑郁症相关药物筛选、疾病病理等研究，为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类抑郁症提供有力的实验手段。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于猪TPH2基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一目的是提供一种猪TPH2基因突变的猪重组细胞。

本发明的又一目的是提供针对猪TPH2基因的gRNA。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于猪TPH2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪TPH2基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。

为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：

1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；

2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；

3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；

4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；

5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：

1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；

2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；

3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；

4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；

5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；

6)转录终止信号：bGH polyA signal；

7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。

质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；

所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；

质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；

质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。

质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。

所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。

所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。

所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。

自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。

CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。

EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。

WPRE序列元件如SEQ ID NO：2第6722-7310位核苷酸所示。

3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。

bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。

作为本发明的一种优选，针对猪TPH2基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的进一步优选，该表达载体表达SEQ ID NO.33所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.21所示。

作为本发明的进一步优选，所述的针对猪TPH2基因的gRNA表达载体由SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA的限制性内切酶BbsI位点所得。

作为本发明的进一步优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

本发明所述的CRISPR/Cas9系统在构建猪TPH2基因突变的猪重组细胞中的应用。

一种重组细胞，由本发明所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

本发明所述的重组细胞在构建TPH2基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建TPH2基因敲除的抑郁症克隆猪中的应用。

针对猪TPH2基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.33所示。

一种针对猪TPH2基因的gRNA表达载体，该表达载体表达SEQ ID NO.33所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示；所述的gRNA表达载体优选由SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA的限制性内切酶BbsI位点所得。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。

(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。

(3)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型(纯合突变包括双等位基因相同变异的纯合突变和双等位基因不同变异的纯合突变、杂合突变或野生型)，获得纯合突变的概率为20％～50％，优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。

(4)利用本发明所得到的纯合突变单克隆细胞株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。

本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单克隆细胞的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。

附图说明

图1为质粒pX330的结构示意图。

图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。

图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。

图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。

图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。

图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。

图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。

图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。

图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。

图10为实施例3中步骤3.2.3以猪的基因组DNA为模板分别采用TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R383(组1)、TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486(组2)、TPH2-E1g-F2/TPH2-E1g-R383(组3)、TPH2-E1g-F2/TPH2-E1g-R486(组4)组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图11为实施例3中步骤3.2.4以18只猪的基因组DNA为模板采用TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图12为实施例4中步骤4.3.4以基因组DNA为模板采用TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图13为实施例5中步骤5.4.4以基因组DNA为模板采用TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图14为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图15为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位相同突变的示例性测序峰图。

图16为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为杂合突变的示例性测序峰图。

图17为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位不同突变的示例性测序峰图。

具体实施方式

实施例1、质粒的制备

1.1制备质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)

原始质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ IDNO：1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。

质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQID NO：2所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

pKG-GE3质粒构建方法如下：

(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列

质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO：4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图3)。

(2)改造启动子及增强子

对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO：5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图4)。

(3)Cas9基因N端增加NLS序列

将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图5)。

(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signals

以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signals(SEQ ID NO：7)的序列，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图2，核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。

1.2构建pKG-U6gRNA载体

来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO：8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO：3)，SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,在细胞中重组质粒转录得到gRNA。所构建的pKG-U6gRNA载体图谱如图6。

实施例2质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.1靶点gRNA设计及构建

2.1.1使用Benchling对RAG1基因进行靶点gRNA设计

RAG1-gRNA4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.9)

合成针对上述RAG1基因靶点的插入序列互补DNA oligo如下：

RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.10)

RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO.11)

RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。

2.1.2设计用于扩增和检测包含RAG1 gRNA靶点片段的引物

RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA(SEQ ID NO.12)

RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG(SEQ ID NO.13)

2.1.3将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法

1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；

2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；

3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：

95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；

4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

37℃反应60min；

5)转化

按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。

2.1.4gRNA载体构建

1)将合成的RAG1-gRNA4S和RAG1-gRNA4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)将会表达SEQ ID NO.14所示的RAG1-gRNA4。

2.1.5gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认RAG1-gRNA4载体构建成功。

2.2猪原代成纤维细胞制备

2.2.1取初生从江香猪耳组织0.5g，去除外部组织，75﹪酒精浸泡30-40s；

2.2.2用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；

其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。

2.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5mL 0.1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；

2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。

其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基

(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。

2.2.5置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；

2.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，使用1mL完全培养基重悬细胞以备下一步核转染实验。

2.3质粒配比优化

2.3.1共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1.

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.3.2共转染操作方法

使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon)与Neon TM transfection system电转仪进行转染实验。

1)按照上述分组配制电转反应液，混匀过程中注意切勿产生气泡；

2)将步骤一制备得到的细胞悬液使用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；

3)吸取10μL细胞悬液，加入步骤1)中的电转反应液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；

4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL E Buffer；

5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)的完全培养液；

6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；

7)电转后6-12h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

2.3.3基因编辑效率分析

提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。

2.4质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.4.1共转染分组情况

RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330。

RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。

RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.4.2共转染操作方法

同本实施例中2.3.2。

2.4.3基因编辑效率分析

提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。

实施例3 TPH2基因靶点gRNA的设计及构建

3.1基因组DNA的提取

使用Vazyme公司FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(VazymeCat.DC102-01)分别进行18只猪(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组DNA的柱式提取，使用NanoDrop进行定量，-20℃保存备用。

3.2 TPH2基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

3.2.1猪TPH2基因信息

编码色氨酸羟化酶2(Tryptophan hydroxylase 2)；位于5号染色体；GeneID为100627725，Sus scrofa。猪TPH2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。已有研究结果表明TPH2对中枢5-羟色胺的合成具有重要作用，是与5-羟色胺功能紊乱相关的精神疾病遗传学研究中的一个重要候选基因，在猪基因组DNA中，TPH2基因具有11个外显子，其中第1外显子序列，含部分第1内含子序列如SEQ ID NO：16所示。

3.2.2TPH2基因敲除预设靶点外显子及邻近基因组序列PCR扩增引物设计

根据查到的猪TPH2基因组序列

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010447.5？report＝genbank& from＝35917159&to＝36016981)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品TPH2基因外显子1的位点。

使用Oligo7进行引物设计，设计结果如下：

TPH2-E1g-F1：TGAGTTTCTTTCTAATCAGTCCT(SEQ ID NO：17)

TPH2-E1g-R486：AGAAGGAAGAGTTAAGGCATACA(SEQ ID NO：18)

TPH2-E1g-F2：AGCCTGGAGAGAGGAGGATTTGC(SEQ ID NO：19)

TPH2-E1g-R383：AGGAGTTGAAGGGTGTGTGTATT(SEQ ID NO：20)

3.2.3 TPH2基因组PCR扩增引物筛选

使用猪(雌性1#)耳朵组织提取的基因组为模板，使用设计的两条上游和两条下游组合，Max酶(Vazyme公司货号：P505)进行PCR，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳以筛选好的扩增引物，结果如图10，组1：TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R383；组2：TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486；组3：TPH2-E1g-F2/TPH2-E1g-R383；组4：TPH2-E1g-F2/TPH2-E1g-R486，优选TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486引物对进行目的片段扩增。

3.2.4 18只猪TPH2基因片段PCR扩增

分别以18个基因组模板(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，引物TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486，Max酶进行TPH2基因组片段的扩增，产物(489bp)进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图11。

3.2.5 TPH2基因序列保守性分析

以上PCR扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的TPH2基因序列进行比对分析。根据比对结果，扩增片段序列相对保守，所设计的引物本身无可能的突变位点。

3.3靶点gRNA设计及构建

3.3.1使用Benchling进行靶点gRNA设计

设计靶点已避开可能的突变位点，使用Benchling进行靶点gRNA设计：

https://benchling.com/

TPH2基因敲除靶点设计如下：

TPH2-E1-g1：GTAAATACTGGGCAAGGAGA(SEQ ID NO：21)

TPH2-E1-g2：TTTCTAGTAAATACTGGGCA(SEQ ID NO：22)

TPH2-E1-g3：CCTGAAGAGCATCAGCTGCT(SEQ ID NO：23)

TPH2-E1-g4：GATGTTTTCTAGTAAATACT(SEQ ID NO：24)

合成的TPH2基因共4个靶点的插入序列互补DNA oligo如下：

TPH2-E1-g1S：caccGTAAATACTGGGCAAGGAGA(SEQ ID NO：25)

TPH2-E1-g1A：aaacTCTCCTTGCCCAGTATTTAC(SEQ ID NO：26)

TPH2-E1-g2S：caccgTTTCTAGTAAATACTGGGCA(SEQ ID NO：27)

TPH2-E1-g2A：aaacTGCCCAGTATTTACTAGAAAc(SEQ ID NO：28)

TPH2-E1-g3S：caccgCCTGAAGAGCATCAGCTGCT(SEQ ID NO：29)

TPH2-E1-g3A：aaacAGCAGCTGATGCTCTTCAGGc(SEQ ID NO：30)

TPH2-E1-g4S：caccGATGTTTTCTAGTAAATACT(SEQ ID NO：31)

TPH2-E1-g4A：aaacAGTATTTACTAGAAAACATC(SEQ ID NO：32)

TPH2-E1-g1S、TPH2-E1-g1A、TPH2-E1-g2S、TPH2-E1-g2A、TPH2-E1-g3S、TPH2-E1-g3A、TPH2-E1-g4S、TPH2-E1-g4A均为单链DNA分子。

3.3.2将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法

同实施例2中2.1.3。

3.3.3gRNA载体构建

1)将合成的TPH2-E1-g1S和TPH2-E1-g1A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g1)。质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g1)将会表达SEQ ID NO：33所示的TPH2-E1-gRNA1。

2)将合成的TPH2-E1-g2S和TPH2-E1-g2A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g2)。质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g2)将会表达SEQ ID NO：34所示的TPH2-E1-gRNA2。

3)将合成的TPH2-E1-g3S和TPH2-E1-g3A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g3)。质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g3)将会表达SEQ ID NO：35所示的TPH2-E1-gRNA3。

4)将合成的TPH2-E1-g4S和TPH2-E1-g4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g4)。质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g4)将会表达SEQ ID NO：36所示的TPH2-E1-gRNA4。

3.3.3gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g1)、pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g2)、pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g3)、pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g4)载体均构建成功。

实施例4 TPH2基因不同靶点gRNA的编辑效率比较

4.1猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

4.2使用构建好的gRNA质粒、CRISPR/Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞

4.2.1共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

4.2.2共转染操作方法

同实施例2中2.3.2。

4.3 TPH2基因不同靶点gRNA的编辑效率分析

4.3.1分别向步骤4.2中收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；

4.3.2采用前述针对TPH2基因E1引物TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486进行检测突变，PCR目的产物长度为489bp；

4.3.3使用常规PCR反应扩增TPH2靶点基因；

4.3.4将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图12，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出TPH2-E1-g1、TPH2-E1-g2、TPH2-E1-g3、TPH2-E1-g4不同靶点的编辑效率依次为52％、25％、20％、13％。结果表明，TPH2-E1-g1编辑效率最高，为最优靶点。

实施例5构建TPH2基因敲除的从江香猪单克隆细胞株

5.1猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

5.2使用构建好的pKG-U6gRNA(TPH2-E1-g1)质粒、pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞

同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

5.3 TPH2基因敲除单克隆细胞株的筛选

5.3.1将步骤5.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到100μL完全培养基的96孔板中；

5.3.2 37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单克隆细胞的孔；

5.3.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5mL离心管中；

5.3.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

5.4 TPH2基因敲除的重组细胞鉴定

5.4.1将步骤5.3收集在1.5mL离心管中得到的细胞用10μL KAPA2G裂解液裂解，提取细胞基因组DNA。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；

5.4.2采用前述针对TPH2基因E1引物TPH2-E1g-F1/TPH2-E1g-R486进行检测突变，PCR目的产物长度为489bp；

5.4.3使用PCR常规反应扩增TPH2靶点基因；

5.4.4将PCR反应产物进行电泳，电泳结果如图13，泳道编号与单克隆细胞编号一致。回收PCR扩增产物并测序。

5.4.5将测序结果与TPH2靶点信息进行比对，从而判断该重组细胞是否为TPH2基因敲除。

编号为3、4、15、19的单克隆细胞的基因型为双等位相同变异的纯合突变型。编号为6、9的单克隆细胞的基因型为双等位不同变异的纯合突变型。编号为1、8、12、16的单克隆细胞的基因型为杂合突变型。编号为2、5、7、10、11、13、14、17、18、20的单克隆细胞的基因型为纯合野生型。得到的TPH2基因编辑单克隆细胞的比率为45％。

示例性的测序比对结果如图14至图17，其中图14是克隆号为TPH2-2的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为野生型；图15是克隆号为TPH2-3的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为双等位相同变异的纯合突变型；图16是克隆号为TPH2-8的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为杂合突变型；图17是克隆号为TPH2-6的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为双等位不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，TPH2各单细胞克隆基因型如表1：

表1 TPH2基因敲除从江香猪成纤维细胞单克隆基因鉴定

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> 用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280

caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

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cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

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gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

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caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

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aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

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agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

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cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

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gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

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caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

<210> 2

<211> 10476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360

gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600

ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660

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gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260

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cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860

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cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100

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cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180

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gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360

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caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540

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cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840

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gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140

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cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800

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gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920

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aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580

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cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700

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gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880

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cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200

caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260

tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380

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atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980

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gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476

<210> 3

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280

ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520

gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700

ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

<210> 4

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175

<210> 5

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240

gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300

tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360

gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420

tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480

tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540

caccatggac tata 554

<210> 6

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120

ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180

caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240

cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300

catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360

ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420

gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447

<210> 7

<211> 2727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60

ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120

ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900

gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960

tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020

ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080

agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140

acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200

tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320

tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380

tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440

tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500

cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220

gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460

cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700

tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

<210> 8

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agttatggca gaactcagtg 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccgagtta tggcagaact cagtg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaccactga gttctgccat aactc 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccccatccaa agtttttaaa gga 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtggcagat gtcacagttt agg 23

<210> 14

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 15

<211> 491

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 15

Met Gln Pro Ala Met Met Met Phe Ser Ser Lys Tyr Trp Ala Arg Arg

1 5 10 15

Gly Leu Ser Leu Asp Ser Ala Val Pro Glu Glu His Gln Leu Leu Gly

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asn Lys Ser Asn Ser Gly Lys Asn Asp Asp Lys Lys

35 40 45

Gly Asn Lys Gly Ser Gly Lys Ser Asp Thr Ala Thr Glu Ser Gly Lys

50 55 60

Thr Ala Val Val Phe Ser Leu Lys Asn Glu Val Gly Gly Leu Val Lys

65 70 75 80

Ala Leu Lys Leu Phe Gln Glu Lys His Val Asn Met Val His Ile Glu

85 90 95

Ser Arg Lys Ser Arg Arg Arg Ser Ser Glu Val Glu Ile Phe Val Asp

100 105 110

Cys Glu Cys Gly Lys Thr Glu Phe Asn Glu Leu Ile Gln Ser Leu Lys

115 120 125

Phe Gln Thr Thr Ile Val Thr Leu Asn Pro Pro Glu Asn Ile Trp Thr

130 135 140

Glu Glu Glu Glu Leu Glu Asp Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Ile Ser

145 150 155 160

Glu Leu Asp Lys Cys Ser His Arg Val Leu Met Tyr Gly Ser Glu Leu

165 170 175

Asp Ala Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Asn Val Tyr Arg Gln Arg Arg

180 185 190

Lys Tyr Phe Val Asp Leu Ala Met Gly Tyr Lys Tyr Gly Gln Pro Ile

195 200 205

Pro Arg Val Glu Tyr Thr Glu Glu Glu Thr Lys Thr Trp Gly Ile Val

210 215 220

Phe Arg Glu Leu Ser Lys Leu Tyr Pro Thr His Ala Cys Arg Glu Tyr

225 230 235 240

Leu Lys Asn Phe Pro Leu Leu Thr Lys Tyr Cys Gly Tyr Arg Glu Asp

245 250 255

Asn Val Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Val Phe Leu Lys Glu Arg Ser

260 265 270

Gly Phe Thr Val Arg Pro Val Ala Gly Tyr Leu Ser Pro Arg Asp Phe

275 280 285

Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Val Arg

290 295 300

His Gly Ser Asp Pro Leu Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Thr Cys His Glu

305 310 315 320

Leu Leu Gly His Val Pro Leu Leu Ala Asp Pro Lys Phe Ala Gln Phe

325 330 335

Ser Gln Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Asp Val

340 345 350

Gln Lys Leu Ala Thr Cys Tyr Phe Phe Thr Ile Glu Phe Gly Leu Cys

355 360 365

Lys Gln Glu Gly Gln Leu Arg Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser

370 375 380

Ile Gly Glu Leu Lys His Ala Leu Ser Asp Lys Ala Cys Val Lys Ala

385 390 395 400

Phe Asp Pro Lys Thr Thr Cys Leu Gln Glu Cys Leu Ile Thr Thr Phe

405 410 415

Gln Glu Ala Tyr Phe Val Ser Glu Ser Phe Glu Glu Ala Lys Glu Lys

420 425 430

Met Arg Asp Phe Ala Lys Ser Ile Thr Arg Pro Phe Ser Val Tyr Phe

435 440 445

Asn Pro Tyr Thr Gln Ser Ile Glu Ile Leu Lys Asp Thr Arg Ser Ile

450 455 460

Glu Asn Val Val Gln Asp Leu Arg Ser Asp Leu Asn Thr Val Cys Asp

465 470 475 480

Ala Leu Asn Lys Met Asn Gln Tyr Leu Gly Ile

485 490

<210> 16

<211> 2000

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 16

acccacatcc tcatggatac ttgttgggtt cttaacctgc tgaaccacaa caggagctcc 60

atacaaattc acttttaaat attcagctca ggcaataccc cctagaagcc tctcttgact 120

accctaaggt aatattgagc actttgtccc ttgtgcttct aatgtcttct gtagaaaagt 180

cagtgtattt tgtttcactt gtttatttgc atgtgtattt cttttggcta gtctatgatt 240

tgcttgaggc taggcattat atctcattta tctttgcatc cccaggactc aggctcaata 300

tataacataa agtgagtgct taacaaatat ttgttgaatt acacatctta aaccctgttc 360

tagctgaaat aatctgtgtg tggtttgttg agcctacttt tgtttccttg tttggaatac 420

tcaaggggct ttaaaatgta atagttgaga gcatggatat tggagccagc ctgcctgagc 480

ttaaatcctg cctcagccac tctttaattg tgtaaacctt tggcaagttg tctaaattct 540

ttgtgcctcc gtttcttaat atgttaagtg aaaataattg ttactgcagt gtaagtgttg 600

tttgactttt ttgacttatt ctagtttcaa gttatcaaag gaatgactga tatataggta 660

tttagtttcc ttttctttcc tgcttagtga ggaagattct agcattagtg tctcaaccat 720

atctacatgt ggataaatca cagccccatg tctcctgtac aatacgaggg ctgcacatca 780

ttgcacagtg gcatcacatg gttgggaagg agtgcctttt atgaacgcca ttacagacac 840

acaagtacat gcacacagtc ctaacacatc agatcagaaa aagtttatga aagtaaaatg 900

gcttagggat tctgcagtgt tgatctttct taagttattt tcctcctttt ggaaaacttt 960

gcatttatag tcaaccccag gctgaggtta acttgccagg agcaggtttg agagatgaga 1020

actaacgtca ggggatagat attttctttt acaaataaca ccctgttatg tattgttctc 1080

caccacccac gcctaagctg ctactcgacc tatgaaacaa ttcgcaccac gaacacagat 1140

aaccccaggc ttcaggtctg taatctgact gtggccatca gcagccagaa atgagtttct 1200

ttctaatcag tcctgcatca gttcccagtc attcatataa aggagcctgg agagaggagg 1260

atttgcattg ctttttcttc agcaccaggg ttctggacag cgcccgcccc aagaggtccg 1320

ctgcttgcaa gcctttgctc tctctatctc tgccgtgctg atattgcccc tctagtcccc 1380

cctgctgcag agaaagaaaa ttacatcggg atccatgcag ccggcaatga tgatgttttc 1440

tagtaaatac tgggcaagga gagggctttc tctggattca gcagtgcctg aagagcatca 1500

gctgcttggc agcttaacag tgagtattga gtagctggca ctctccagag gagagtttac 1560

tagggtagca gtagtcttac ccttgccata tgaacacctg ctgtaaatac acacaccctt 1620

caactccttc ctttttctgt ctgtcctgcc tccctcctgt atgccttaac tcttccttct 1680

ctctccataa agtaaagcgg gtgtactgat ccctgcttgc taaactttct ttcctcaaag 1740

tttataagtt gaatgtagtt tccgaacatt aagaatgttg tatggcctag cgtcttatat 1800

caagaaccaa aaaaaatgtg tagaattttg aaaggctatt tgttatgagt aggagcaagg 1860

agaaaaatta aatatatttc aatggttcct gcaggatttt tgtgttttct atgccccctt 1920

ccatctgcaa agactggtat ttaaccacaa agtaatattt tctatttctg tctacaggtg 1980

ctggttattg cagtaaaaga 2000

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgagtttctt tctaatcagt cct 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agaaggaaga gttaaggcat aca 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agcctggaga gaggaggatt tgc 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aggagttgaa gggtgtgtgt att 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtaaatactg ggcaaggaga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tttctagtaa atactgggca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cctgaagagc atcagctgct 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gatgttttct agtaaatact 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caccgtaaat actgggcaag gaga 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaactctcct tgcccagtat ttac 24

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caccgtttct agtaaatact gggca 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaactgccca gtatttacta gaaac 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caccgcctga agagcatcag ctgct 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aaacagcagc tgatgctctt caggc 25

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caccgatgtt ttctagtaaa tact 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aaacagtatt tactagaaaa catc 24

<210> 33

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

guaaauacug ggcaaggaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 34

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

uuucuaguaa auacugggca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 35

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ccugaagagc aucagcugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 36

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gauguuuucu aguaaauacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims

1.一种用于猪TPH2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和针对猪TPH2基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于针对猪TPH2基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于该表达载体表达SEQ ID NO.33所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.21所示。

4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的针对猪TPH2基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA的限制性内切酶BbsI位点所得。

5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

6.权利要求5所述的CRISPR/Cas9系统在构建猪TPH2基因突变的猪重组细胞中的应用。

7.一种重组细胞，其特征在于由权利要求6所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

8.权利要求7所述的重组细胞在构建TPH2基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建TPH2基因敲除的抑郁症克隆猪中的应用。

9.针对猪TPH2基因的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.33所示。

10.一种针对猪TPH2基因的gRNA表达载体，其特征在于该表达载体表达SEQ ID NO.33所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示；所述的gRNA表达载体优选由SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA的限制性内切酶BbsI位点所得。