CN111471635B

CN111471635B - 一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法

Info

Publication number: CN111471635B
Application number: CN202010284509.9A
Authority: CN
Inventors: 刘延峰; 刘龙; 宿安琪; 堵国成; 李江华; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-04-13
Also published as: CN111471635A

Abstract

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法，属于基因工程领域。本发明通过敲除ATP结合蛋白基因oppD、鞭毛钩帽组件蛋白基因flgD和鞭毛蛋白基因Hag，并结合在特定筛选压力下的适应性进化方法，获得比生长速率提高的菌株，使枯草芽孢杆菌的生长速率提高24.18～75.05％甚至更高，并使核酸含量提高10.31～37.56％甚至更高。本发明的方法可缩短菌株的发酵周期，提高核糖核酸的生产力，并有助于提高市场竞争力。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性细菌的典型代表，它不产生细胞壁内毒素，所生产的产品被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为食品级安全。另外，枯草芽孢杆菌作为一种非致病性微生物，具有生长速度快(20min增殖一代)、培养时间短、培养要求低、遗传背景清晰利于改造、嘌呤合成能力强等优点，因此，在科学研究与工业生产中枯草芽孢杆菌的应用十分广泛。核糖核酸简称RNA，普遍存在于动植物体中，是生命的最基本物质之一，对生物的生长、遗传、变异等现象都起着重要的作用。RNA在医药、保健品、食品加工业等方面应用前景广泛，特别是在婴儿奶粉中作为关键功能营养因子，具有重要的应用。

目前，工业核糖核酸生产方法主要是从假丝酵母或酿酒酵母中提取。然而使用酵母生产核糖核酸核酸存在着一些问题：首先，假丝酵母不安全，它可能侵入皮肤、粘膜和内脏，引起炎症；另外，使用酿酒酵母，生产周期较长(一般需要1.5h～2h增殖一代)，同时细胞壁较厚，对破壁工艺要求较高。因此，为简化核糖核酸的生产工艺、提高生产效率，亟待开发新的食品安全微生物。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法，通过敲除可以提高菌株比生长速率的ATP结合蛋白基因oppD，以及胞内表达量较高但功能上非必需的鞭毛钩帽组件蛋白基因flgD和鞭毛蛋白基因Hag，将核糖核酸含量的提高与枯草芽孢杆菌比生长速率相关联，并结合在特定筛选压力下的适应性进化方法，所述筛选压力为有限的碳氮源，以获得比生长速率提高的菌株，达到提高菌株RNA含量的目的。

本发明的第一个目的是提供一种核酸含量提高的枯草芽孢杆菌，敲除或沉默了ATP结合蛋白、鞭毛钩帽组件蛋白、鞭毛蛋白中的至少一个蛋白。

在一种实施方式中，所述ATP结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述鞭毛钩帽组件蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌168为出发菌株。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌168经过适应性进化。

在一种实施方式中，所述适应性进化是将枯草芽孢杆菌在特定配方的培养基中生长扩增，通过分批培养结合反复转接培养，使能够适应培养基环境的枯草芽孢杆菌逐渐富集成为优势菌株；其中，转接培养的次数不低于4次。

在一种实施方式中，所述适应性进化包括如下步骤：控制培养基中的葡萄糖处于低浓度，将枯草芽孢杆菌在多个容器进行平行培养，初始转接时间间隔控制为10～14小时，控制每一批次的起始OD₆₀₀均在0.03-0.05之间，根据每一批次终末的OD₆₀₀值选择生长最快(即OD₆₀₀值最大)的容器中的菌液转接至下一批次的容器中，逐渐缩短转接时长，以此获得将有益突变积累的进化菌株。

在一种实施方式中，所述适应性进化包括如下步骤：控制M9培养基中的葡萄糖始终保持4g/L的低浓度，在每一培养批次使用六个摇瓶进行平行培养，初始转接时间间隔控制为12小时，控制每一批次的起始OD₆₀₀均在0.03-0.05之间；根据终末OD₆₀₀的大小选择生长最快的摇瓶中的菌液转接至下一批次的六个平行摇瓶，逐渐缩短转接时长，转接培养至比生长速率提高至少25％，获得进化菌株。

本发明的第二目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌核糖核酸含量的方法，是敲除或沉默枯草芽孢杆菌的ATP结合蛋白基因oppD、编码鞭毛钩帽组件蛋白的基因flgD或编码鞭毛蛋白的基因Hag中的至少一个。

在一种实施方式中，所述ATP结合蛋白基因oppD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码鞭毛钩帽组件蛋白的基因flgD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码鞭毛蛋白的基因Hag的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第三个目的是提供一种生产核糖核酸的方法，是将所述枯草芽孢杆菌含葡萄糖的M9培养基中培养，收集菌体，破碎细胞。

在一种实施方式中，所述葡萄糖的浓度为2～5g/L。

在一种实施方式中，所述M9培养基含有Na₂HPO₄·2H₂O、KH₂PO₄、NH₄Cl、NaCl。

在一种实施方式中，所述培养是在在含有色氨酸的M9培养基中，于35-37℃培养。

在一种实施方式中，所述培养是将活化的单菌落至种子液培养基中，于35-37℃、200-240rpm培养2-4小时至OD₆₀₀＝0.5-1.0，转接后的初始OD₆₀₀＝0.03-0.05，于37℃、220rpm进行培养。

有益效果：本发明通过适应性进化菌株，并通过抗性序列同源重组替换出发菌株基因组上的目的基因序列，实现对目标基因的敲除，提高了枯草芽孢杆菌的生长速率及RNA含量，使枯草芽孢杆菌的生长速率提高24.18～75.05％甚至更高，并使核酸含量提高10.31～37.56％甚至更高。本发明的方法可使菌株在相同时间进行更多批次的发酵、获得更多的产物，缩短生产耗时，提高了核糖核酸的生产力，使生产的核糖核酸更有市场竞争力。

附图说明

图1为使用的适应性进化方法示意图。

图2为基因敲除的进化菌株A28ΔHag、A28ΔflgD、A28ΔoppD的核酸含量柱状图。

具体实施方式

表1基因敲除菌株的全部引物序列及验证引物序列。

1、培养基配方：

种子液培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉。

生长曲线测定及RNA含量测定所使用的培养基配方为：

A.M9培养基5×母液：(每升)42.5g Na₂HPO₄·2H₂O，15g KH₂PO₄，5.0g NH₄Cl，2.5gNaCl，使用4M NaOH调节至pH＝7.0；灭菌条件：121℃，高压灭菌20min；M9培养基易染菌，在4℃冰箱保存。

B.微量元素100×母液(每升)：100mg MnCl₂·4H₂O，170mg ZnCl₂，43mg CuCl₂·2H₂O，60mg CoCl₂·6H₂O，60mg Na₂MoO₄·2H₂O，

C.100mM CaCl₂溶液(每100mL)：1.47g CaCl₂·2H₂O，可在高压灭菌时在室温储存(4℃冰箱保存亦可)。

D.1M MgSO₄溶液(每100mL)：24.6g MgSO₄·7H₂O，可在高压灭菌时在室温储存(4℃冰箱保存亦可)。

E.50mM FeCl₃溶液(每100mL)：1.35g FeCl₃·6H₂O，因为FeCl₃是不稳定的，因此过滤灭菌该溶液并在室温下避光保存。

F.50％(w/v)葡萄糖溶液：50g无水葡萄糖，使用去离子水溶解，并定容至100mL，115℃高压灭菌，于室温保存。

G.色氨酸200×母液：1g色氨酸，使用去离子水溶解，并定容至50mL，过滤灭菌,于室温保存。

H.M9(+Trp)1×培养基(每升)：200mL M9基本培养基5×母液，10mL微量元素100×母液，1mL 100mM CaCl₂溶液，1mL 1M MgSO₄溶液，1mL 50mM FeCl₃溶液，8mL 50％(w/v)葡萄糖溶液，5mL色氨酸200×母液，使用4M NaOH调节pH至7.0，使用去离子水定容至1L，在4℃冰箱保存。

2、生长曲线与比生长速率测定：首先挑取活化的单菌落至2mL种子液培养基中，于37℃、220rpm培养2-4小时至OD₆₀₀＝0.5-1.0；然后，梯度接种于5ml M9(+Trp)1×培养基，于37℃、220rpm培养10小时；再转接至18ml M9(+Trp)1×培养基的250ml无挡板摇瓶中，控制转接后的初始OD₆₀₀＝0.03-0.05，于37℃、220rpm进行培养。转接时记为起始(第0小时)，随后每间隔2小时测定一次OD₆₀₀，直至测出的OD₆₀₀长时间维持稳定或下降明显。使用Origin做出生长曲线图并计算比生长速率。

3、核酸含量(RNA％)测定：菌体干重的测定使用105℃高温烘干8小时的方法。破壁处理方法如下：取4ml样品离心去除上清，用50mM PBS缓冲液洗涤两次，取0.8ml溶液加入3.2ml预冷于4℃冰箱的0.25N高氯酸溶液，在4℃条件下反应15min，离心去上清，在沉淀中加入0.5N高氯酸溶液并于70℃反应15min。离心后取上清适当稀释并测定其在260nm处的吸光度。核酸含量(RNA％)使用如下计算公式。

RNA％＝(吸光度×稀释倍数×0.03365)/(样品毫升数×OD₆₀₀为1时的干重×OD₆₀₀)×100％。

实施例1 oppD基因敲除整合框的构建与基因敲除菌株BS168ΔHag的获得

ATP结合蛋白基因oppD(如SEQ ID NO.2所示)的敲除：

设计引物rh_oppD(S)_1F/rh_oppD(S)_1R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框左臂；设计引物rh_oppD(S)_2F/rh_oppD(S)_2R，对抗性质粒p7S6(如SEQ IDNO.7所示)进行PCR，得到抗性扩增片段；设计引物rh_oppD(S)_3F/rh_oppD(S)_3R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框右臂；最后通过融合PCR的方式，将三片段融合后扩增，构建敲除oppD的整合框。

将构建好的整合框转化野生型枯草芽孢杆菌168菌株。采用yz-oppD-750-F：5’-gaatcaggagtatgtgcttgcttca-3’及yz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证基因敲除枯草芽孢杆菌BS168ΔoppD构建成功。

实施例2 flgD基因敲除整合框的构建与基因敲除菌株BS168ΔflgD的获得

按照实施例1相同策略敲除鞭毛钩帽组件蛋白基因flgD(SQE ID NO.4所示)。具体步骤为：设计引物rh_flgD(423+)_1F/rh_flgD(423+)_1R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框左臂；设计引物rh_flgD(423+)_2F/rh_flgD(423+)_2R，对抗性质粒p7S6(如SEQ ID NO.7所示)进行PCR，得到抗性扩增片段；设计引物rh_flgD(423+)_3F/rh_flgD(423+)_3R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框右臂；最后通过融合PCR的方式，将三个片段融合后扩增，构建敲除flgD的整合框。

将构建好的整合框转化野生型枯草芽孢杆菌168菌株。采用yz-flgD-750-F：5’-cctcagctgaagcaatcattgccgaatatgg-3’及yz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证基因敲除枯草芽孢杆菌BS168ΔflgD构建成功。

实施例3 Hag基因敲除整合框的构建与基因敲除菌株BS168ΔHag的获得

按照实施例1或2相同策略敲除鞭毛蛋白基因Hag(SEQ ID NO.6所示)，具体步骤为：用引物rh_Hag(915+)_1F/rh_Hag(915+)_1R对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框左臂；用引物rh_Hag(915+)_2F/rh_Hag(915+)_2R，对抗性质粒p7S6(如SEQ ID NO.7所示)进行PCR，得到抗性扩增片段；用引物rh_Hag(915+)_3F/rh_Hag(915+)_3R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框右臂；最后通过融合PCR的方式，将三片段融合后扩增，构建敲除Hag的整合框。将构建好的整合框转化野生型枯草芽孢杆菌168菌株。采用引物yz-Hag-750-F:5’-cagcaagattggtatatgaaacttgatgaacaggaacct-3’及yz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证基因敲除枯草芽孢杆菌BS168ΔHag构建成功。

实施例4适应性实验室进化菌株的获得

适应性进化的过程如图1所示。以碳氮源为限制性的筛选条件，控制培养基中葡萄糖始终保持4g/L的低浓度。在每一培养批次使用六个摇瓶进行平行培养，初始转接时间间隔控制为12小时，控制每一批次的起始OD₆₀₀均在0.03-0.05之间，因此可以根据终末OD₆₀₀的大小选择生长最快的摇瓶中的菌液进行下一次的转接，从终末OD₆₀₀最大的那一摇瓶转接至下一批次的六个平行摇瓶，逐渐缩短转接时长，将每一批次可能出现的有益突变积累起来，以比生长速率提高超过30％视为明显提高，以此获得了进化28批次后的进化菌株ALE-28。经计算ALE-28的比生长速率较出发菌株提高了39.88％。

实施例5基因敲除的进化菌株的获得

分别将实施例1构建的oppD基因敲除整合框、实施例2构建的flgD基因敲除整合框、实施例3构建的Hag基因敲除整合框转化至实施例4获得的适应性实验室进化菌株ALE-28。采用ALEyz-oppD-750-F：5’-gaatcaggagtatgtgcttgcttca-3’及ALEyz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证oppD基因敲除的枯草芽孢杆菌A28ΔoppD构建成功。

其余基因敲除的进化菌株，其敲除框的构建和验证方法同理。采用ALEyz-flgD-750-F：5’-cctcagctgaagcaatcattgccgaatatgg-3’及ALEyz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证flgD基因敲除的枯草芽孢杆菌A28ΔflgD构建成功。采用ALEyz-Hag-750-F：5’-cagcaagattggtatatgaaacttgatgaacaggaacct-3’及ALEyz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证Hag基因敲除的枯草芽孢杆菌A28ΔHag构建成功。使用的引物序列同见表1。

实施例6菌株比生长速率的改变对菌株RNA含量的影响

测定实施例1～5构建的各菌株的生长曲线并计算比生长速率，测定OD₆₀₀、菌体干重以及破壁处理后的样品在260nm处的吸光度，计算核酸含量RNA％。相同测定条件下，未经改造的野生型菌株BS168作为对照菌株。

挑取活化的单菌落接种至2mL种子液培养基中，于37℃、220rpm培养2～4小时至OD₆₀₀＝0.5-1.0。然后，以1‰接种于10ml M9(+Trp)1×培养基，于37℃、220rpm培养10小时。转接至装有50ml M9(+Trp)1×培养基的250ml无挡板摇瓶中，控制转接后的培养基中初始OD₆₀₀＝0.03-0.05，于37℃、220rpm进行培养。转接时记为起始(第0小时)，在第6小时、8小时、10小时、12小时取样，测定OD₆₀₀、菌体干重以及破壁处理后的样品在260nm处的吸光度，用于计算核酸含量RNA％。

对实施例1～3构建的基因敲除菌株、实施例4的适应性进化菌株ALE-28、实施例5构建的基因敲除的进化菌株的比生长速率、核酸含量进行测定，结果见表2。基因敲除获得三个菌株，BS168ΔoppD的比生长速率增加8.94％，核酸含量提高23.10％；BS168ΔHag的比生长速率增加24.18％，核酸含量提高17.27％；BS168ΔflgD的比生长速率增加36.46％，核酸含量提高6.43％。它们的核酸含量都随着比生长速率的提高而增加。适应性实验室进化菌株ALE-28的比生长速率提高了39.88％，核酸含量都随着比生长速率的提高而增加10.31％。基因敲除的进化菌株A28ΔHag、A28ΔflgD、A28ΔoppD它们的核酸含量也分别随菌株的比生长速率提高而增加20.98％、27.64％、37.56％，它们核酸含量的增加更为直观的表现于表2中。

表2不同菌株的比生长速率、核酸含量

注：核酸含量为第6小时、8小时、10小时、12小时取样的最大核酸含量。

发明人还尝试在菌株ALE-28的基础上对Hag、flgD、oppD三个基因同时进行敲除，结果显示，比生长速率的增益可达80％以上，核酸含量的增益可达40～45％甚至更高。

对比例

使用实施例1～3相同的策略分别敲除基因comA、CspD，结果显示，这两个基因的敲除对菌株比生长速率的提高没有增益效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

Met Ile Arg Val Thr Arg Leu Leu Glu Val Lys Asp Leu Ala Ile Ser

1 5 10 15

Phe Lys Thr Tyr Gly Gly Glu Val Gln Ala Ile Arg Gly Val Asn Phe

20 25 30

His Leu Asp Lys Gly Glu Thr Leu Ala Ile Val Gly Glu Ser Gly Ser

35 40 45

Gly Lys Ser Val Thr Ser Gln Ala Ile Met Lys Leu Ile Pro Met Pro

50 55 60

Pro Gly Tyr Phe Lys Arg Gly Glu Ile Leu Phe Glu Gly Lys Asp Leu

65 70 75 80

Val Pro Leu Ser Glu Lys Glu Met Gln Asn Val Arg Gly Lys Glu Ile

85 90 95

Gly Met Ile Phe Gln Asp Pro Met Thr Ser Leu Asn Pro Thr Met Lys

100 105 110

Val Gly Lys Gln Ile Thr Glu Val Leu Phe Lys His Glu Lys Ile Ser

115 120 125

Lys Glu Ala Ala Lys Lys Arg Ala Val Glu Leu Leu Glu Leu Val Gly

130 135 140

Ile Pro Met Pro Glu Lys Arg Val Asn Gln Phe Pro His Glu Phe Ser

145 150 155 160

Gly Gly Met Arg Gln Arg Val Val Ile Ala Met Ala Leu Ala Ala Asn

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Ala Asp Glu Pro Thr Thr Ala Leu Asp Val Thr

180 185 190

Ile Gln Ala Gln Ile Leu Glu Leu Met Lys Asp Leu Gln Lys Lys Ile

195 200 205

Asp Thr Ser Ile Ile Phe Ile Thr His Asp Leu Gly Val Val Ala Asn

210 215 220

Val Ala Asp Arg Val Ala Val Met Tyr Ala Gly Gln Ile Val Glu Thr

225 230 235 240

Gly Thr Val Asp Glu Ile Phe Tyr Asp Pro Arg His Pro Tyr Thr Trp

245 250 255

Gly Leu Leu Ala Ser Met Pro Thr Leu Glu Ser Ser Gly Glu Glu Glu

260 265 270

Leu Thr Ala Ile Pro Gly Thr Pro Pro Asp Leu Thr Asn Pro Pro Lys

275 280 285

Gly Asp Ala Phe Ala Leu Arg Ser Ser Tyr Ala Met Lys Ile Asp Phe

290 295 300

Glu Gln Glu Pro Pro Met Phe Lys Val Ser Asp Thr His Tyr Val Lys

305 310 315 320

Ser Trp Leu Leu His Pro Asp Ala Pro Lys Val Glu Pro Pro Glu Ala

325 330 335

Val Lys Ala Lys Met Arg Lys Leu Ala Asn Thr Phe Glu Lys Pro Val

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Leu Val Arg Glu Val Glu

355

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<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

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gtgatacggg tgacacgcct attagaagta aaagatttag caatttcatt taaaacatat 60

ggcggagagg tccaggcgat ccgcggagtg aatttccatc tggataaagg ggagacgctg 120

gccattgttg gagaatcagg ttccggaaaa agtgtaacct ctcaagcgat tatgaagctg 180

attccaatgc ctccgggtta tttcaaacgc ggtgagatcc tgtttgaagg aaaggatctg 240

gtgccgctgt ccgaaaaaga aatgcaaaat gtccggggaa aagagatcgg catgatattc 300

caagatccga tgacctcttt aaatccaacg atgaaggtcg gtaaacaaat tacggaagtg 360

ctttttaaac acgaaaagat ctcgaaggaa gcggctaaaa aacgcgcggt tgaactgctg 420

gaattagtcg gtatcccaat gccggaaaag cgggtgaacc aatttccgca tgaattttca 480

ggcgggatga gacagagggt tgtcattgcc atggcgcttg cagcgaatcc gaaacttctg 540

atcgccgatg agccgacaac tgctcttgat gtaacgattc aagcgcaaat tttggaatta 600

atgaaggatt tgcaaaagaa aattgacacg tccatcatct ttatcacaca cgatcttggt 660

gttgtggcta acgttgctga ccgggtcgct gtcatgtacg cgggacagat tgtagaaact 720

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cctgatttga caaacccgcc aaaaggagat gcttttgccc tgcggagctc ttacgcgatg 900

aaaatcgatt ttgaacagga gccgccaatg tttaaggtat ccgatactca ttatgtaaaa 960

tcgtggctgc ttcatcctga cgcgccaaag gtagagccgc ctgaagcggt aaaagcgaaa 1020

atgcgtaaac tggcaaacac gtttgaaaaa cctgtcttag tgagagaagt tgaatga 1077

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acagataaaa caggcacagt aagctctgtt aaacatttta aaggaaatta ttatctcgtt 360

cttgatgatg ggaccgagat cagtcctgcg aatgtcatgt ctgtgggaca atcatctaaa 420

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<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

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Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Ser Ala Ser Gly Glu Asn Leu

245 250 255

Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Lys Glu Met

260 265 270

Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Met

275 280 285

Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln Leu Leu Arg

290 295 300

<210> 6

<211> 915

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 6

ttaacgtaat aattgaagta cgttttgcgg ctgttggttt gcttgagcaa gcatagcttg 60

agaagcctga gaaagaatgt tgttctttgt gaattcgctc atctctttag ccatgtcaac 120

gtcacggata cgagactcag cagctgtcaa gttttcacca gaagcgctta agttgttaat 180

tgtgtgctct agacgatttt gtaccgcacc aagcttagca cgttgagaag aaacttggtt 240

gatcgcttca tcaacaactt tcaattgagc atcgaaaccg atatcagcag tatctgctgc 300

attatctgcg aattttgtta cgtcaagatc attaactgaa tgaagagctg caattgaacc 360

atcagcttct ttaattccaa gagcgtcagc acccatatcc tcaatattta cagagatttg 420

ctgtgtagca tttgctccga tttggaatac caagttcttt tgatttgcag gagtagctgt 480

gtcaactttg taagtgccat cgagcaattt cttaccattg aattctgtac gatttgaaat 540

accatcgatt tcatctgtta aagctgaaat ttcatcttga atagattgca aatcagttgc 600

tttgtcctga gttccagtgt ttccagcttg aacaactagc tcacgaacac gttgaaggat 660

cgcatgagtt tcagttaatg caccctcagc tgtttggata agagagattc cgtcttgaga 720

gtttttagaa gccatttcaa gacctctgat ttgtcctctc attttttcag agatcgcaag 780

acctgctgcg tcatctcccg cacggttgat gcgaagacct gaagaaagtt tctccatgtt 840

cttttggctc gcactgttgt ttgaagacaa acggttcagt gtgttaagcg ctgcaatatt 900

gtggttaatt ctcat 915

<210> 7

<211> 3800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagattgt accgttcgta 2280

tagcatacat tatacgaagt tatcgatttt cgttcgtgaa tacatgttat aataactata 2340

actaataacg taacgtgact ggcaagagat atttttaaaa caatgaatag gtttacactt 2400

actttagttt tatggaaatg aaagatcata tcatatataa tctagaataa aattaactaa 2460

aataattatt atctagataa aaaatttaga agccaatgaa atctataaat aaactaaatt 2520

aagtttattt aattaacaac tatggatata aaataggtac taatcaaaat agtgaggagg 2580

atatatttga atacatacga acaagttaat aaagtgaaaa aaatacttcg gaaacattta 2640

aaaaataacc ttattggtac ttacatgttt ggatcaggag ttgagagtgg actaaaacca 2700

aatagtgatc ttgacttttt agtcgtcgta tctgaaccat tgacagatca aagtaaagaa 2760

atacttatac aaaaaattag acctatttca aaaaaaatag gagataaaag caacttacga 2820

tatattgaat taacaattat tattcagcaa gaaatggtac cgtggaatca tcctcccaaa 2880

caagaattta tttatggaga atggttacaa gagctttatg aacaaggata cattcctcag 2940

aaggaattaa attcagattt aaccataatg ctttaccaag caaaacgaaa aaataaaaga 3000

atatacggaa attatgactt agaggaatta ctacctgata ttccattttc tgatgtgaga 3060

agagccatta tggattcgtc agaggaatta atagataatt atcaggatga tgaaaccaac 3120

tctatattaa ctttatgccg tatgatttta actatggaca cgggtaaaat cataccaaaa 3180

gatattgcgg gaaatgcagt ggctgaatct tctccattag aacataggga gagaattttg 3240

ttagcagttc gtagttatct tggagagaat attgaatgga ctaatgaaaa tgtaaattta 3300

actataaact atttaaataa cagattaaaa aaattataaa taacttcgta tagcatacat 3360

tatacgaacg gtagaatcgt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt 3420

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 3480

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 3540

gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 3600

tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 3660

ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 3720

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 3780

gtcatcaccg aaacgcgcga 3800

Claims

1.一种核糖核酸含量提高的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其特征在于，敲除了ATP结合蛋白、鞭毛钩帽组件蛋白、鞭毛蛋白中的至少一个蛋白，或沉默了编码ATP结合蛋白、鞭毛钩帽组件蛋白、鞭毛蛋白中的至少一个蛋白的基因；所述ATP结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述鞭毛钩帽组件蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌168为出发菌株。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的出发菌株经过适应性进化。

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述适应性进化是将枯草芽孢杆菌在特定的培养基中生长扩增，通过分批培养结合反复转接培养，使能够适应培养基环境的枯草芽孢杆菌逐渐富集成为优势菌株；其中，转接培养的次数不低于4次；所述特定的培养基为M9培养基。

5.一种提高枯草芽孢杆菌核糖核酸含量的方法，其特征在于，敲除或沉默枯草芽孢杆菌的ATP结合蛋白基因oppD、编码鞭毛钩帽组件蛋白的基因flgD或编码鞭毛蛋白的基因Hag中的至少一个；所述ATP结合蛋白基因oppD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码鞭毛钩帽组件蛋白的基因flgD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码鞭毛蛋白的基因Hag的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.一种生产核糖核酸的方法，其特征在于，将权利要求1~4任一所述的枯草芽孢杆菌在培养基中培养，再收集菌体，破碎细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基为含葡萄糖的M9培养基；所述葡萄糖的浓度为2~5 g/L；所述M9培养基含有Na₂HPO₄·2H₂O、KH₂PO₄、NH₄Cl和NaCl。

8.权利要求1~4任一所述的枯草芽孢杆菌在医药或食品领域制备含核糖核酸的产品方面的应用。