CN102112150A - 用于生产具有末端α-1,3-连接的半乳糖的蛋白质的酵母菌株 - Google Patents

Abstract

低等真核宿主细胞已工程化用于生产具有至少一个末端α-半乳糖基表位的糖蛋白。该糖蛋白对于生产高度抗原性的糖蛋白组合物有用，所述组合物具有用于生产疫苗的优点。

Description

用于生产具有末端α-1,3-连接的半乳糖的蛋白质的酵母菌株

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，特别地本发明涉及经基因工程化从而生产具有占优势的末端糖结构Gal-α1,3-Gal-β1,4-GlcNAc-R的N-聚糖的酵母菌株。

发明背景

除人和某些其他灵长类外的所有哺乳动物都包含具有末端α-1,3-半乳糖基(α-gal)聚糖结构的糖蛋白，所述聚糖结构来自于酶α-1,3-半乳糖基转移酶的活性(Galili等人，J Biol Chem，263:33，1988)。该酶将半乳糖残基加入末端定位的β-1,4-连接的半乳糖残基中。β-1,4-连接的半乳糖残基在哺乳动物的许多N-聚糖包括人的N-聚糖的末端上发现。

人免疫系统已采用天然免疫以快速响应末端α-gal残基的存在。约百分之一的循环IgGs针对α-1,3-半乳糖表位(Galili等人，Blood，82:8，1993)。显示出这个表位的抗原由循环抗体识别，导致补体激活，和经由Fcγ受体介导的途径的抗原呈递细胞有效激活以及细胞毒性T细胞应答的刺激。使免疫复合物靶向抗原呈递细胞已显示减少引发T细胞应答所需的抗原量。

目前的重组疫苗一般遭受特异性免疫应答的缺乏。此外，目前的疫苗通常需要称为佐剂的一般免疫刺激物，以引发持续的细胞毒性T细胞应答。在有限的证实中，已报道具有包含末端α-1,3-半乳糖的N-聚糖的基于蛋白质的疫苗改善此类分子的免疫原性。(Abdel-Motal等人，J Virology，80:14，2006；Abdel- Motal等人，J Virology，81:17，2007.)这可能是因为人具有针对α-1,3-半乳糖残基的高水平的循环抗体。此外，因为这些蛋白质可能能够经由抗体指导的Fc-γ介导的信号传递来刺激抗原呈递，所以它们可以减少对于非特异性佐剂的需要。目前本领域的状况仅允许通过以下方法生产此类疫苗：生产具有末端唾液酸结构(例如，NANA)的蛋白质，随后在体外通过酶消化去除NANA残基，以暴露β-1,4-连接的半乳糖残基，并且随后通过酶促添加加入末端α-1,3-半乳糖(参见，Galili，美国专利6,361,775)。这个过程是昂贵、繁琐且不容易放大的。已进行尝试以在病毒蛋白质例如流感病毒血凝素上；Henion等人，Vaccine，15:1174-1182(1997)；gp120；Abdel-Motal等人，J. Virology，80:6943-6951(2006)；和在癌细胞上生产α-gal表位；Unfer等人，Cancer Res.，63:987-993(2003)。

发明概述

因此，本发明的一个目的是基于改善的载体和宿主细胞系，开发用于酵母和丝状真菌例如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的另外的蛋白质表达系统，用于生产具有增加的免疫原性的有效的基于蛋白质的疫苗。

本发明提供了使用基因工程化的酵母和丝状真菌的宿主菌株、用于生产此类疫苗的改善的方法和材料。宿主菌株已进行基因修饰，用于生产具有人样N-糖基化的蛋白质。

本发明可以用于改善基于蛋白质的疫苗的本领域目前的状况。在本文描述的基因工程化菌株中生产的糖基化蛋白质疫苗可以预期通过与具有末端β-1,4-半乳糖、末端唾液酸或末端甘露糖的疫苗相比改善的抗原呈递而引发升高的免疫应答。这种技术可应用于任何数目的疫苗，其可以开发为基于重组蛋白质的分子。

近期的发展允许在低等真核生物宿主生物，即酵母和丝状真菌例如巴斯德毕赤氏酵母中生产完全人源化的治疗剂。Gerngross，美国专利7,029,872，其公开内容通过引用的方式并入本文。本发明人已开发了生产可以用于疫苗的商业规模生产的宿主生物的进一步修饰，其中所生产的蛋白质包含至少一种末端α-1,3-半乳糖糖形。

本发明人已发现通过修饰细胞中存在的糖基化机制，可以由重组宿主细胞获得具有末端α-1,3-半乳糖的疫苗糖蛋白。本发明人惊奇地发现通过用编码糖基化酶的异源基因替换宿主细胞的编码糖基化蛋白质的内源基因获得有益结果，从而使得具有末端α-1,3-半乳糖残基的N-聚糖存在于由宿主细胞生产的抗原性糖蛋白上。

在本发明的优选实施方案中，可以修饰低等真核细胞(例如酵母和丝状真菌，例如巴斯德毕赤氏酵母)的基因组。所得到的转化的低等真核宿主细胞能够生产在足够高比例的N-聚糖上具有末端α-1,3-半乳糖残基的抗原性疫苗糖蛋白，从而使得所得到的疫苗糖蛋白的抗原性/免疫原性得到改善。本发明具有另外的优点，因为低等真核宿主细胞例如巴斯德毕赤氏酵母能够以高收率生产疫苗糖蛋白，其中占优势的糖蛋白种类具有末端α-1,3-半乳糖残基，所述糖蛋白与在保留内源糖基化机制的低等真核宿主细胞或其他标准蛋白质生产宿主例如昆虫细胞或哺乳动物细胞系如CHO或NSO中生产的疫苗蛋白质比较，具有改善的抗原性。

在一个特定实施方案中，将密码子优化的(用于巴斯德毕赤氏酵母)编码野猪(S. scrofa)α-1,3-半乳糖基转移酶(Genebank：P50127)的可读框工程化到巴斯德毕赤氏酵母菌株内。在一个优选实施方案中，酶进行工程化以特异性定位至酵母高尔基体以优化其活性。通过筛选融合蛋白构建体得到最有活性的融合蛋白，可以选择特定靶向序列。在一个示例性实施方案中，使野猪α-1,3-半乳糖基转移酶与ScMnn2p跨膜高尔基体靶向定位结构域融合。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，它们已工程化以生产具有包括末端α-半乳糖基表位的占优势N-聚糖的糖蛋白。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中宿主细胞生产具有包括末端α-半乳糖基表位的N-聚糖的糖蛋白，其中占优势的N-聚糖选自(α-Gal)(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2；(α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和(α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中宿主细胞已工程化以生产疫苗蛋白质。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中疫苗糖蛋白衍生自抗病毒疫苗蛋白质、抗细菌疫苗蛋白质或抗癌疫苗蛋白质。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中抗病毒疫苗蛋白质来自流感病毒。更优选地，流感蛋白质是血凝素(HA)或神经酰胺酶(NA)糖蛋白。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中抗病毒疫苗蛋白质来自单纯疱疹病毒。更优选地，使用疱疹包膜糖蛋白gB、gC和gD。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中抗病毒疫苗蛋白质来自呼吸道合胞病毒(RSV)。更优选地，病毒疫苗糖蛋白选自RSV血凝素糖蛋白(H)；和融合糖蛋白F。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中抗细菌疫苗糖蛋白衍生自细菌疫苗蛋白质。更优选地，细菌疫苗蛋白质是膜内在蛋白质，或外膜蛋白质，或外表面蛋白质，或来自分枝杆菌属(Mycobacterium)，或来自沙门氏菌属(Salmonella)，或来自疏螺旋体属(Borrelia)，或来自嗜血杆菌属(Haemophilus)。

本发明的实施方案包括低等真核宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞，其中抗癌疫苗糖蛋白衍生自表位肽(例如Her-2表位、neu表位或前列腺干细胞抗原(PSCA)表位)，所述表位肽衍生自癌细胞。

附图简述

图1。酵母和哺乳动物的N-糖基化机制的比较。两者在蛋白质折叠和ER成熟后都生产Man₈GlcNAc₂前体。N-糖基化途径在高尔基体中不同，其中哺乳动物剪切掉甘露糖且加入另外的糖例如GlcNAc和半乳糖，以生产复合N-聚糖。相反，酵母加入具有各种键包括外部链的另外的甘露糖，所述外部链可以包括数打甘露糖残基。

图2。在人和大多数其他哺乳动物N-聚糖上发现的末端糖的比较。大多数哺乳动物显示出较小百分比的末端α-1,3-连接的半乳糖，这是人N-聚糖完全缺乏的结构。

图3。酵母N-糖基化机制的逐步修饰。酵母N-连接的聚糖的人源化得到能够生产人/哺乳动物中间体N-聚糖结构的一系列酵母菌株。通过在不存在唾液酸转移酶的情况下对活性的、适当定位的α-GalT进行工程化，可以修饰能够生产此类GS5.0中间体N-聚糖，即(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2的酵母菌株，以生产一致的GS5.9 N-聚糖，即(α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图4A和4B。表达α-GalT的GFI5.0糖工程化的(glycoengineered)酵母菌株产生具有末端α-gal的N-聚糖。此处将非优化的小鼠α-1,3-GalT工程化到非优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内。这种菌株在强诱导型AOX1启动子的控制下表达人纤溶酶原的Kringle 3结构域。通过在含甲醇培养基中诱导，产生分泌的K3蛋白质，通过Ni++亲和层析纯化，并且通过PNG酶 F消化释放N-聚糖且进行MALDI-TOF MS。α-GalT活性可以通过在MALDI-TOF MS中含α-Gal峰(GS5.8和GS5.9)的出现进行观察。2.0 Man5GlcNAc2；5.0, (β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.8, (α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图5A和5B。在表达α-GalT的GFI5.0糖工程化的酵母菌株中上游糖基化机制的优化增加N-聚糖的一致性。此处将非密码子优化或定位优化的小鼠α-1,3-GalT工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内。这种菌株在强AOX1启动子的控制下表达大鼠重组EPO。通过在含甲醇培养基中诱导，产生分泌的His-标记的rrEPO蛋白质，通过Ni++亲和层析纯化，并且通过PNG酶 F消化释放N-聚糖且进行MALDI-TOF MS。活性α-GalT可以通过在MALDI-TOF MS中含α-Gal峰(GS5.8和GS5.9)的出现进行观察。2.0，Man5GlcNAc2；5.0, (β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2； 5.8, (α-Gal)(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2； 5.9, (α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图6A和6B。α-1,3-半乳糖基转移酶蛋白质的比较揭示高度相似性。通过执行ClustalV分析使用Lasergene (DNAstar，Madison，WI)比较原牛(Bos taurus)、野猪、小鼠(Mus musculus)、家犬(Canis familiaris) α-GalT蛋白质序列。

图7A-7C。α-GalTs文库的表达和为巴斯德毕赤氏酵母密码子优化，改善了α-Gal转移。此处将密码子优化但并非定位优化的小鼠α-1,3-GalT、野猪α-1,3-GalT、家犬α-1,3-GalT工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内。这种菌株在强诱导型AOX1启动子的控制下表达rrEPO。通过在含甲醇培养基中诱导，产生分泌的His-标记的rrEPO蛋白质，通过Ni++亲和层析纯化，并且通过PNG酶 F消化释放N-聚糖且进行MALDI-TOF MS。α-GalT活性可以通过在MALDI-TOF MS中含α-Gal峰(GS5.8和GS5.9)的出现进行观察。2.0，Man5GlcNAc2；5.0, (β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.8, (α-Gal)(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图8A和8B。在具有用ScMntl 1-58定位的野猪α-1,3-GalT的菌株中表达Kringle 3，产生与用rrEPO观察到的N-聚糖相似的N-聚糖。此处将密码子优化但并非定位优化的绵羊α-1,3-GalT工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内。这种菌株在强诱导型AOX1启动子的控制下表达人纤溶酶原的Kringle 3结构域。通过在含甲醇培养基中诱导，产生分泌的His-标记的K3蛋白质，通过Ni++亲和层析纯化，并且通过PNG酶 F消化释放N-聚糖且进行MALDI-TOF MS。α-GalT活性可以通过在MALDI-TOF MS中含α-Gal峰(GS5.8和GS5.9)的出现进行观察。2.0，Man5GlcNAc2；5.0, (β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.8, (α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图9。引入GFI5.0菌株内的α-GalT的前导区定位的优化增加转移至N-聚糖的末端α-gal量。此处将密码子优化且用ScMnn21-36定位优化的绵羊α-1,3-GalT工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内。这种菌株在强AOX1启动子的控制下表达人纤溶酶原的Kringle 3结构域。通过在含甲醇培养基中诱导，产生分泌的His-标记的K3蛋白质，通过Ni++亲和层析纯化，并且通过PNG酶 F消化释放N-聚糖且进行MALDI-TOF MS。α-GalT活性可以通过在MALDI-TOF MS中含α-Gal峰(GS5.9)的出现进行观察。在这种成熟GFI5.9菌株中，GS5.9可以作为占优势的N-聚糖观察到。2.0，Man5GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图10。流感HA胞外域蛋白质在GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株中的表达。这种菌株包含工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内的密码子优化但并非定位优化的绵羊α-1,3-GalT。通过培养上清液的蛋白质印迹分析证实His-标记的流感HA(A/Hong Kong/ 1/58变体)胞外域的表达，随后对Ni++亲和层析纯化的蛋白质进行PNG酶 F消化和MALDI-TOF MS分析。2.0，Man5GlcNAc2；5.0, (β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.8, (α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图11。流感HA胞外域蛋白质在GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株中的表达。这种菌株包含工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内的密码子优化且定位优化的绵羊α-1,3-GalT。通过培养上清液的蛋白质印迹分析证实His-标记的流感HA(A/South Carolina/1/18变体)胞外域的表达，随后对Ni++亲和层析纯化的蛋白质进行PNG酶 F消化和MALDI-TOF MS分析。2.0，Man5GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图12。HSV-2 gD胞外域蛋白质在优化的GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株中的表达。这种菌株包含工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内的密码子优化且定位优化的绵羊α-1,3-GalT。通过培养上清液的蛋白质印迹分析证实His-标记的HSV-2 gD胞外域的表达，随后对Ni++亲和层析纯化的蛋白质进行PNG酶 F消化和MALDI-TOF MS分析。2.0，Man5GlcNAc2；5.0, (β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.8, (α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

图13。HSV-2 gC胞外域蛋白质在优化的GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株中的表达。这种菌株包含工程化到优化的GFI5.0人源化的巴斯德毕赤氏酵母菌株内的密码子优化且定位优化的绵羊α-1,3-GalT。通过培养上清液的蛋白质印迹分析证实His-标记的HSV-2 gC胞外域的表达，随后对Ni++亲和层析纯化的蛋白质进行PNG酶 F消化和MALDI-TOF MS分析。2.0，Man5GlcNAc2；5.0, (β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.8, (α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；5.9, (α-Gal)2(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

序列描述

序列ID NOs：1和2是RCD446和RCD447的核苷酸序列，RCD446和RCD447是用于克隆缺乏推定的跨膜高尔基体定位结构域的鼠α-1,3-半乳糖基转移酶(MmαGalT)的引物。

序列ID NO. 1 RCD446引物

序列ID NO. 2 RCD447引物

序列ID NO：3是来自甲型流感(Hong Kong)的H3型HA蛋白质的胞外域(即，缺乏C末端跨膜结构域)的氨基酸序列。

序列ID NO. 3

序列ID NO：4是来自甲型流感(A/South Carolina/1/18)的H1型HA蛋白质的核苷酸胞外域(即，缺乏C末端跨膜结构域)的氨基酸序列。

序列ID NO. 4

序列ID NOS：5和6是两种不同形式的HSV-2 G菌株gD蛋白质胞外域的氨基酸序列。

序列ID NO. 5 HSV-2 G菌株gD 339蛋白质胞外域

序列ID NO. 6 HSV-2 G菌株gD 306NQ蛋白质胞外域

序列ID NO：7是HSV-2 G菌株gC蛋白质胞外域的氨基酸序列。

序列ID NO. 7 HSV-2 G菌株gC蛋白质胞外域

发明详述

除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语和短语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般地，与本文描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的术语及本文描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域众所周知且通常使用的那些。除非另有说明，否则用于制备本发明的基础遗传构建体的方法和技术一般根据本领域众所周知且如本说明书引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法执行。参见例如，Sambrook等人 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y.(1989)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992和2002增刊)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y.(1990)；Taylor和Drickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ. Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，第I卷，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，第II卷，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)。

本文提及的所有出版物、专利和其他参考文献在此整体通过引用并入本文。

除非另有说明，否则下述术语应理解为具有下述含义：

如本文使用的，术语“N-聚糖”和“糖形”可互换使用且指N-连接的寡糖，例如通过寡糖的N-乙酰葡糖胺残基和多肽的天冬酰胺残基之间的天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键连接的寡糖。在糖蛋白上发现的占优势糖是葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰-神经氨酸(NGNA))。糖基团的加工在ER腔内共翻译地发生，并且对于N-连接的糖蛋白在高尔基体中继续。

N-聚糖具有共同的五糖核心Man₃GlcNAc₂。N-聚糖在包括外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(触角)数目方面不同，所述外周糖加入Man3GlcNAc2("Man3")核心结构中，该核心结构也被称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖(paucimannose)核心”。 N-聚糖根据其分支的组成成分进行分类(例如，高甘露糖、复合或杂合)。“高甘露糖”型N-聚糖具有5个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖典型地具有连接于“三甘露糖”核心的α-1,3-甘露糖臂的至少一个GlcNAc和连接于α-1,6-甘露糖臂的至少一个GlcNAc。复合N-聚糖还可以具有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基，其任选由唾液酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指神经氨酸并且“Ac”指乙酰基)修饰。“α-Gal”指α-1,3-连接的半乳糖，并且“β-Gal”指β-1,4-连接的半乳糖。复合N-聚糖还可以具有包括“二等分（bisecting）”GlcNAc和核心岩藻糖的链内取代。复合N-聚糖还可以具有在“三甘露糖核心”上的多个触角，通常被称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖具有连接于三甘露糖核心的α-1,3甘露糖臂的非还原端的至少一个β-GlcNAc和在三甘露糖核心的α-1,6甘露糖臂上的零个或更多个甘露糖。各种N-聚糖也被称为“糖形”。

本文使用的缩写具有本领域的通常用法，参见例如，上文糖的缩写。其他常见缩写包括“PNG酶”或“聚糖酶”，这全都指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。

术语“标记序列”或“标记基因”指能够表达活性的核酸序列，所述活性允许关于序列在宿主细胞内的存在或不存在的阳性或阴性选择。例如，巴斯德毕赤氏酵母URA5基因是标记基因，因为它的存在可以通过包含该基因的细胞在不存在尿嘧啶的情况下生长的能力进行选择。它的存在还可以通过针对包含该基因的细胞不能在5-FOA的存在下生长进行选择。标记序列或基因不一定需要既展示阳性可选择性又展示阴性可选择性。来自巴斯德毕赤氏酵母的标记序列或基因的非限制性例子包括ADE1、ARG4、HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记基因，卡那霉素、新霉素、遗传霉素(或G418)、巴龙霉素和潮霉素抗性基因通常用于允许在这些抗生素的存在下生长。

“操作性连接的”表达控制序列指一种连接（其中表达控制序列与感兴趣的基因邻接以控制感兴趣的基因）以及反式或在一段距离处作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。

术语“表达控制序列”或“调节序列”可互换使用并且如本文使用的，指多核苷酸序列，其是影响与它们操作性连接的编码序列表达所需的。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；和需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”最低限度意欲包括其存在是表达所必需的所有组分，并且还可以包括其存在有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

如本文使用的，术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或仅“宿主细胞”)意指在其中引入了重组载体的细胞。应当理解此类术语不仅意指特定主题细胞，还意指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，特定修饰可能在后续世代中发生，所以此类后代可能事实上不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是分离的细胞或在培养物中生长的细胞系，或可以是位于活组织或生物中的细胞。

术语“真核的”指有核细胞或生物，并且包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。

术语“低等真核细胞”包括酵母、真菌、collar-flagellates、微孢子虫、alveolates(例如，沟鞭藻类)、stramenopiles(例如，褐藻、原生动物)、红藻门(例如，红藻)、植物(例如，绿藻、植物细胞、苔藓)和其他原生生物。酵母和丝状真菌包括但不限于：巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）、Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母（Pichia trehalophila）、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤氏酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤氏酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母（Pichia pijperi）、具柄毕赤氏酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤氏酵母(Pichia methanolica)、毕赤氏酵母属物种(Pichia sp.)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维氏酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种(Fusarium sp.)、禾谷镰孢(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、毕赤氏酵母属物种、任何糖酵母属物种、多形汉逊氏酵母、任何克鲁维氏酵母属物种、白色假丝酵母、任何曲霉属物种(Aspergillus sp.)、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、任何镰孢属物种和粗糙链孢霉。

如本文使用的，术语“肽”指短多肽，例如典型地长度小于约50个氨基酸且更典型地长度小于约30个氨基酸的短多肽。如本文使用的，该术语包括模拟结构且因此模拟生物功能的类似物和模拟物。

如用途的上下文所指出的，术语“多肽”包括天然存在和非天然存在的蛋白质，以及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体或聚合的。此外，多肽可以包括许多不同的结构域，其各自具有一种或多种独特活性。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是这样的蛋白质或多肽：其由于其起源或衍生来源，(1)不与在其天然状态中伴随其的天然缔合的组分缔合，(2)以自然界中未发现的纯度存在，其中纯度可以针对其他细胞材料的存在进行判定(例如，不含来自相同物种的其他蛋白质)，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在(例如，它是在自然界中发现的多肽的片段，或它包括在自然界中未发现的氨基酸类似物或衍生物或除标准肽键外的键)。因此，化学合成或在与它所天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将是与其天然缔合的组分“分离的”。多肽或蛋白质还可以通过分离致使基本上不含天然缔合的组分，所述分离使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。如因此定义的，“分离的”不一定要求所述的蛋白质、多肽、肽或寡肽从其天然环境中物理取出。

如本文使用的，术语“多肽片段”指与全长多肽比较，具有缺失例如氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在一个优选实施方案中，多肽片段是其中片段的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置等同的连续序列。片段的长度典型地是至少5、6、7、8、9或10个氨基酸，优选长度是至少12、14、16或18个氨基酸，更优选长度是至少20个氨基酸，更优选长度是至少25、30、35、40或45个氨基酸，甚至更加优选长度是至少50或60个氨基酸，且甚至更加优选长度是至少70个氨基酸。片段可以包括具有不同活性的结构域。

“修饰的衍生物”指多肽或其片段，它们的一级结构序列基本上同源，但包括例如在体内或体外的化学和生物化学修饰或掺入了在天然多肽中未发现的氨基酸。如本领域技术人员容易理解的，此类修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化、标记例如用放射性核素标记、和各种酶促修饰。用于标记多肽的各种方法和用于此目的的取代基或标记是本领域众所周知的，并且包括放射性同位素例如¹²⁵I、³²P、³⁵S和³H，与标记的抗配体(例如，抗体)结合的配体，荧光团，化学发光试剂，酶和可以充当标记的配体的特异性结合对成员的抗配体。标记的选择依赖于所需敏感性、与引物缀合的容易性、稳定性需要和可用的仪器。用于标记多肽的方法是本领域众所周知的。参见例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，和2002的增刊)(在此通过引用并入本文)。

术语“嵌合基因”或“嵌合核苷酸序列”指包括与一个或多个异源核苷酸序列偶联的核苷酸序列或片段的核苷酸序列。嵌合序列可用于表达融合蛋白。嵌合基因或嵌合核苷酸序列还可以包括一个或多个片段或结构域，其对于预期宿主细胞是异源的，并且可以具有对于异源重组蛋白质生产有利的性质。一般地，嵌合核苷酸序列包括来自基因的至少30个邻接核苷酸，更优选至少60或90个或更多个核苷酸。具有对于预期宿主细胞异源的至少一个片段或结构域，但对于预期重组蛋白质同源的嵌合核苷酸序列，在本发明中特别有用。例如，预期在使用巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞表达重组人糖蛋白的表达系统中使用的嵌合基因将优选具有来源于人的至少一个片段或结构域，而嵌合基因的其余部分将优选来源于巴斯德毕赤氏酵母。

术语“融合蛋白”指包括与异源氨基酸序列偶联的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为它们可以构建为包含来自两种或更多种不同蛋白质的两个或更多个所需功能元件。融合蛋白包括来自感兴趣的多肽的至少10个邻接氨基酸，更优选至少20或30个氨基酸，甚至更优选至少40、50或60个氨基酸，更加优选至少75、100或125个氨基酸。包括本发明的蛋白质整体的融合物具有特定用途。在本发明的融合蛋白内包括的异源多肽长度是至少6个氨基酸，通常长度是至少8个氨基酸，且有用地长度是至少15、20和25个氨基酸。融合物还包括更大多肽，或甚至完整蛋白质，例如具有特定用途的含绿色荧光蛋白(“GFP”)生色团的蛋白质。融合蛋白可以通过以下方法重组生产：构建编码多肽或其片段的核酸序列，所述核酸序列符合编码不同蛋白质或肽的核酸序列的读框，随后表达融合蛋白。或者，融合蛋白可以通过使多肽或其片段与另一种蛋白质交联而化学生产。

如本文使用的，20种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology - A Synthesis(Golub和Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，第2版1991)，其通过引用并入本文。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、和其他非常规氨基酸也可以是用于本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、N-甲基精氨酸和其他相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽命名中，依照标准用法和常规，左手末端与氨基末端对应，并且右手末端与羧基末端对应。

如本文使用的，术语“区域”指生物分子的一级结构的物理上邻接的部分。在蛋白质的情况下，区域通过那种蛋白质的氨基酸序列的邻接部分限定。

如本文使用的，术语“结构域”指导致生物分子的已知或怀疑功能的生物分子的结构。结构域可以与区域或其部分具有同样的范围；结构域还可以包括生物分子的独特非邻接区域。

如本文使用的，术语“分子”意指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂质等，并且所述化合物可以是天然或合成的。

如本文使用的，术语“包括”或其变化形式“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。

如本文使用的，术语“占优势地”或其变化例如“占优势的”或“其是占优势的”应理解为意指具有总N-聚糖的最高摩尔百分比(％)的聚糖种类，这可以在糖蛋白已用PNG酶处理，并且所释放的聚糖通过质谱法例如MALDI-TOF MS进行分析后进行鉴定。换言之，术语“占优势的”定义为以比任何其他单个实体更大的摩尔百分存在的单个实体，例如特定糖形。例如，如果组合物由40摩尔％的种类A、35摩尔％的种类B和25摩尔％的种类C组成，那么种类A是“占优势的”，组合物“占优势地”包括种类A。

如本文使用的，术语“疫苗蛋白质”或“疫苗糖蛋白”应理解为意指“疫苗蛋白质”或“疫苗糖蛋白”意欲用作疫苗，所述疫苗可以施用于人，并且预期引发针对用作“疫苗蛋白质”或“疫苗糖蛋白”的蛋白质或糖蛋白的免疫应答。疫苗蛋白质或疫苗糖蛋白可以包括全长天然蛋白质或糖蛋白，或它可以包括从天然蛋白质或糖蛋白中分离的一个或多个结构域。疫苗蛋白质或疫苗糖蛋白可以在疫苗中连同其他疫苗蛋白质或疫苗糖蛋白一起利用，以及用于包括另外的活性剂和/或药物载体的制剂中。术语“疫苗蛋白质”或“疫苗糖蛋白”还可以与术语“靶蛋白质”或“靶糖蛋白”互换使用。

如本文使用的，术语“表位”指能够引发免疫应答或能够由抗体识别的抗原的部分。表位通常由多个氨基酸的连接、碳水化合物部分或这两者组成。被称为线性的表位通常不依赖于蛋白质的正确折叠。依赖于蛋白质的正确折叠的表位被称为构象表位，因为表位仅在蛋白质处于其正确折叠的构象时才存在。

如本文使用的，术语“α-半乳糖基表位”意指与第二个半乳糖残基α-1,3-连接的末端半乳糖残基，所述第二个半乳糖残基与N-乙酰葡糖胺残基β-1,4-连接。具有α-半乳糖基表位的聚糖的例子包括下述分支的聚糖结构(α-Gal)(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2；(α-Gal)(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和(α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。还参见图3中的GS5.7、GS5.8和GS5.9。如本文使用的，术语“佐剂”指能够增加对于疫苗或疫苗蛋白质的免疫应答而其自身没有任何特定抗原作用的化合物或物质。佐剂可以包括细菌脂多糖、脂质体、铝盐和油。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管在下文描述了示例性方法和材料，但与本文描述的那些相似或等同的方法和材料也可以在本发明的实施中使用，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。本文提及的所有出版物和其他参考文献通过整体引用并入本文。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。材料、方法和实施例仅是举例说明性的，并且不意欲以任何方式限制。

I. 一般说明

本发明提供了用于由重组宿主细胞表达具有α-连接的半乳糖的疫苗糖蛋白的方法和材料，所述重组宿主细胞已用编码疫苗蛋白质的载体转化。疫苗糖蛋白导致由宿主细胞生产的重组糖蛋白质量改善，特别是获自在用这些载体转化的重组宿主细胞中生产的疫苗糖蛋白的免疫应答增加。

尽管针对在低等真核生物特别是酵母中的表达示例了方法，但它们也可以在高等真核生物和细菌中进行实施。该方法涉及用核酸分子转化宿主细胞，所述核酸分子编码改善的疫苗蛋白质，特别是疫苗糖蛋白，并且从而当宿主细胞用编码分泌的糖蛋白的表达载体转化时，α-连接的半乳糖可以导致重组的分泌的糖蛋白的质量改善，特别是针对所生产的抗原性糖蛋白的免疫应答增加。

因此，在优选实施方案中，本发明的方法可以用于重组表达系统中，该系统使用已工程化用于生产改善的分泌的疫苗糖蛋白的细胞。

II. 疫苗蛋白质的表达

编码疫苗蛋白质或糖蛋白的核酸

上述糖蛋白由核酸编码。核酸可以是DNA或RNA，一般是DNA。编码糖蛋白的核酸与调节序列可操作地连接，所述调节序列允许糖蛋白的表达和分泌。此类调节序列包括位于编码蛋白质的核酸上游或5'的启动子和任选的增强子，和位于编码糖蛋白的核酸3'或下游的转录终止位点。糖蛋白可以是融合蛋白。对于分泌的糖蛋白，核酸典型地包括编码前导区或信号肽的前导序列。前导区或信号肽负责将蛋白质靶向分泌途径的合适细胞区室用于糖基化和分泌，所述细胞区室典型地是内质网或高尔基体。核酸典型地还编码具有核糖体结合位点的5'非翻译区和3'非翻译区。核酸通常是在表达糖蛋白的细胞中可复制的载体的组分。载体还可以包含标记以允许识别转化的细胞。然而，某些细胞类型，特别是酵母可以用缺乏外源载体序列的核酸成功转化。

编码所需糖蛋白的核酸可以得自几个来源。可以使用针对保守区域的引物，由已知表达糖蛋白的细胞系扩增cDNA序列(参见例如，Marks等人，J. Mol. Biol. 581-596(1991))。核酸还可以基于科学文献中的序列从头合成。核酸还可以通过延伸跨所需序列的重叠寡核苷酸进行合成(参见例如，Caldas等人，Protein Engineering，13，353-360(2000))。如果需要，核酸序列可以根据优选密码子选择表进行密码子优化，以改善在本发明的宿主细胞中的表达(参见例如，Chang等人，J.Agric. Food Chem. 54:815-822(2006)。当由细胞生产且分泌时，活性糖蛋白的生产可能需要蛋白质的正确折叠。然而，此类折叠可能不是使用蛋白质作为疫苗蛋白质必需的，例如当感兴趣的表位是线性时。末端α-1,3-半乳糖残基的存在可能是疫苗糖蛋白的免疫原性所需的，或可能增强待生产的疫苗糖蛋白的免疫原性。

III. 病毒和其他疫苗靶

对于本发明可能合适的疫苗靶包括以下那些：针对其的抗原应答可以通过α-gal部分与抗原末端的连接得到加强。在优选实施方案中，疫苗蛋白质将包括衍生自靶的肽或蛋白质。靶优选是疾病载体，例如病毒、真菌、细菌或其他微生物。在其他实施方案中，靶可以是特定类型细胞，例如癌细胞，其表达可以用作靶蛋白质的已知表位肽。例如，优选表位肽可以选自Her-2表位、neu表位或前列腺干细胞抗原(PSCA)表位。

优选的病毒靶包括已知在人和/或动物中引起疾病的那些病毒，例如流感病毒(例如，甲型、乙型或HN51型流感)；单纯疱疹病毒(HSV，例如HSV-1和HSV-2，其与生殖器疱疹相关)；肝炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV，例如PIV III型)、人乳头瘤病毒(HPV，例如HPV-16，其可能与宫颈癌相关)、EB病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV，其与AIDS相关)、和人巨细胞病毒(CMV)、副粘病毒(例如，与腮腺炎和麻疹相关的那些)、痘病毒、呼肠孤病毒科(包括轮状病毒、呼肠孤病毒和科罗拉多蜱热病毒)和脊髓灰质炎病毒。

用于病毒的优选靶蛋白质包括衣壳蛋白质、表面外壳蛋白质、结构蛋白质和免疫系统可能易接近的其他蛋白质，特别是天然糖基化的那些蛋白质。一个或多个另外的糖基化位点可以工程化到编码靶蛋白质的DNA序列内。当不存在天然糖基化位点时，一个或多个人工糖基化位点可以工程化到编码靶蛋白质的DNA序列内。编码靶蛋白质的DNA序列可以进行克隆或合成，并且可以为在本发明的宿主细胞中表达而进行优化。

在本发明中有用的疫苗蛋白质可以包括下述病毒蛋白质中的一种或多种的全部或片段。通过参考不断扩大的病毒基因组数据库，本领域技术人员可以定位或鉴定另外的合适的病毒蛋白质，例如国际病毒分类学委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses）的网站：通用病毒数据库（The Universal Virus Database），版本 3；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/和http://www.virology.net/garryfavwebindex.html#specific。

在优选实施方案中，一种或多种病毒蛋白质或糖蛋白可以一起用作复合疫苗的部分。复合疫苗可以包括来自相同靶病毒的多种疫苗蛋白质，以及来自不同靶病毒的多种疫苗蛋白质。下述是可以充当本发明中的疫苗蛋白质的靶病毒和病毒蛋白质的非限制性例子：

流感病毒(血凝素(HA)糖蛋白；神经氨酸酶(NA)糖蛋白；基质蛋白质；M1蛋白质；M2蛋白质；M3蛋白质；核蛋白(NP)肽；PA蛋白质；PB1蛋白质和PB2蛋白质；Rev蛋白质。参见McCauley和Mahy，Biochem. J.，211:281-294(1983)；Lamb等人，ProcNatl Acad Sci USA.,78:4170-4174(1981))。

疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒和巨细胞病毒)：包膜糖蛋白：糖蛋白B(也称为VP7)；糖蛋白C/VP7.5；糖蛋白D/VP17/18；包膜糖蛋白E；包膜糖蛋白G；包膜糖蛋白H；包膜糖蛋白I；包膜糖蛋白J；包膜糖蛋白K；包膜糖蛋白L；包膜糖蛋白M；包膜糖蛋白N；小衣壳蛋白质；间层蛋白质：VP11/12；VP13/14；VP22；和VP-5/ICP5；VP19c；VP23；VP26；ICP1-2；ICP35；ICP47。参见，Roizman，Proc Natl Acad Sci USA 93：11307- 11312(1996)；Whitley和Roizman，J. Clin. Invest. 110(2)：145-151(2002)；Dunn等人，Proc Natl Acad Sci USA，100:14223-14228(2003)。疱疹病毒还包括水痘带状疱疹(禽痘的原因)；和EB病毒。

黄病毒(其可以包括登革病毒；西尼罗河病毒；肝炎病毒和GB病毒)；登革：蛋白质C；蛋白质M；蛋白质E。参见，Chambers等人，Annual Review of Microbiology；44：649-688(1990)。肝炎病毒：(包括GB病毒)表面抗原，例如HBsAg；p17e/HBeAg；HBe1；HBe2；p21c/HBcAg；P39/GP42；p24/GP27；GP33/GP36；前S1；前-S2；S蛋白质；p74(NS3)；p68(NS5B)；p20(核心蛋白质)；HDAg-p24；HDAg-p27。参见Sells等人，PNAS USA 84:1005-1009(1987)；Heermann等人，J. Virology 52:396- 402(1984)；Svitkin等人，J. Virology；79:6868-6881(2005)；Salfeld等人，J. Virology 63:798- 808(1989)；Grottola等人，Liver Transpl. 8:443-448(2002)；Casey等人，PNAS，USA；90:9016- 9020(1993). GB病毒：包膜蛋白质：E1糖蛋白；E2. 参见：Muerhoff等人，J. Virology 71 :6501-6508；Bukh等人，WO2000/075337。

副粘病毒科/副粘病毒；包括：副流感病毒(PIV)，例如人PIV-1(呼吸道病毒)和人PIV-2和-4(Rubulavirus)；肺病毒例如呼吸道合胞病毒(RSV)；麻疹病毒，例如腮腺炎病毒和麻疹病毒；亨尼帕病毒(Henipavirus)，例如亨德拉病毒(Hendravirus)和尼帕病毒(Nipahvirus)；和Metapneumoviruses。典型地，基因组包括编码核壳(N)蛋白质；和核壳磷蛋白(P)的基因，这两者都可以充当病毒疫苗蛋白质。参见，Collins，美国专利6,264,957；特定副粘病毒也包含神经氨酸酶(NA)蛋白质，其可以充当本发明中的病毒疫苗蛋白质。该病毒通常还在其表面上携带血凝素(H)和融合物(F)糖蛋白，这可以包括病毒疫苗蛋白质。

人副粘病毒(HPV，例如HPV-16，其可能与宫颈癌相关)，由L1和L2编码的衣壳蛋白质；E7抗原肽。参见Carter等人，J. Virol. 80：4664-72(2006)；Pastrana等人，Virology 337：365-72(2005)。

线状病毒(包括埃博拉病毒)。VP30；VP35；聚合酶L蛋白质；VP40；VP24；和GP/SGP糖蛋白。参见Folks，Nature Medicine 4:16-17(1998)；和Feldmann，Virus Research 24：1-19(1992)。

腺病毒：蛋白质II(六邻体单体S)；衣壳蛋白质S(III)和IIIa(五邻体基蛋白质)；纤维蛋白质IV；蛋白质VI、VIII和IX(六邻体小多肽)。参见，Russell，J. General Virology 81:2573-2604(2000)；Roulston等人，Annu Rev Microbiol 53:577-628(1999)；和Yewdell和Bennink；Annu Rev Cell Dev Biol. 15:579-606(1999)。

慢病毒，例如人免疫缺陷病毒(与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关)；包膜糖蛋白(GP120和GP41)；病毒衣壳蛋白质(p24)；核壳蛋白质(p6和p7)；和基质蛋白质(p17)；HIV调节蛋白质(Tat、Rev、Nef)。参见，Wain-Hobson，S.，1989. HIV genome variability in vivo. AIDS 3：supp 1；13-9(1989)；和Ratner等人，Nature 313:277-84(1985)。

布尼病毒科(包括汉坦病毒)包膜糖蛋白(糖蛋白GP1；GP2)；核壳蛋白质(蛋白质N)。参见Schmaljohn等人，J. Gen. Virol. 69:1949-1955(1988)。

Nidoviruses(冠状病毒和动脉炎病毒)：(包括与严重急性呼吸综合征(SARS)相关的病毒)。S(刺突糖蛋白)；E(包膜蛋白质)；M(膜糖蛋白)；和HE(血凝素-酯酶)；N(磷蛋白)。参见，Pyrc等人，Virology J.，http://www.virologyj.com/content/1/1/7(2004)。

呼肠孤病毒科(包括轮状病毒、呼肠孤病毒和科罗拉多蜱热病毒)：σ1、σ2和σ3；μ1c ；VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7)。参见，Joklik，Microbiological Reviews，45:483-501(1981)。

细小RNA病毒科，包括脊髓灰质炎病毒：病毒衣壳蛋白质：VP1、VP2；VP3和VP4。参见，Koch和Koch，The Molecular Biology of Poliovirus. Springer-Verlag/Wein(NY，1985)。

IV. 细菌和其他疫苗靶

在本发明中的优选细菌靶包括已知在人和/或动物中引起疾病的那些，例如分枝杆菌属(结核；麻风病；慢性感染)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(呼吸道感染；脑膜炎；结膜炎；软下疳)；枝原体属(Mycoplasma)(非典型肺炎；泌尿生殖道感染)；芽孢杆菌属(Bacillus)(炭疽；食物中毒)；沙门氏菌属(Salmonella)(伤寒；肠炎；食物中毒)；梭菌属(Clostridium)(破伤风；肉毒中毒；气性坏疽；菌血症)；密螺旋体属(Treponema)(梅毒)；疏螺旋体属(回归热；莱姆病)；尿枝原体属(Ureaplasma)(机会性泌尿生殖道感染)；葡萄球菌属(Staphylococcus)(皮肤脓肿；机会性感染)；链球菌属(Streptococcus)(脓毒性咽喉炎和其他呼吸道感染；皮肤和其他脓肿；产褥热；机会性感染)；钩端螺旋体属(Leptospira)(钩端螺旋体病)；弯曲杆菌属(Campylobacter)(泌尿生殖/消化道感染)；螺杆菌属(Heliobacter)(消化性溃疡)；假单胞菌属(Pseudomonas)(泌尿道感染；烧伤；创伤)；军团菌属(Legionella)(肺炎；呼吸道感染)；奈瑟氏球菌属(Neisseria)(淋病；脑膜炎；鼻咽感染)；莫拉氏菌属(Moraxella)(结膜炎)；布鲁氏菌属(Brucella)(布鲁氏菌病)；博德特氏菌属(Bordetella)(百日咳)；弗朗西斯氏菌属(Francisella)(兔热病)；埃希氏杆菌属(Escherichia)(结肠和其他部位的机会性感染)；志贺氏菌属(Shigella)(细菌性痢疾)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)(呼吸道和泌尿道感染)；肠杆菌属(Enterobacter)(机会性感染)；沙雷氏菌属(Serratia)(机会性感染)；变形菌属(Proteus)(泌尿道感染)；普罗威登斯菌属(Providencia)(创伤和烧伤感染；泌尿道感染)；摩根氏菌属(Morganella)(夏季腹泻；机会性感染)；耶尔森氏菌属(Yersinia)(瘟疫；肠系膜淋巴腺炎；败血病)；弧菌属(Vibrio)(霍乱；急性肠胃炎)；巴斯德氏菌属(Pasteurella)(与猫和犬咬伤相关的感染)；鞘杆菌属(Calymmatobacterium)(腹股沟肉芽肿)；加德纳氏菌属(Gardnerella)(阴道炎)；艾肯氏菌属(Eikenella)(伤口感染)；链杆菌属(Streptobacillus)(与鼠咬伤相关的感染)：拟杆菌属(Bacteroides)/梭杆菌属(fusobacterium)(口腔、消化道、呼吸道和泌尿生殖道感染；创伤和脓肿)；韦荣氏球菌属(Veillonella)(口腔微生物群（microbiota）和脓肿)；立克次氏体属(Rickettsia)(斑疹伤寒；落矶山斑疹热；立克次氏体痘)；罗卡利马氏体属(Rochalimaea)(战壕热)；柯克斯体属(Coxiella)(Q型热)；巴斯通体属(Bartonella)(奥罗亚热)；衣原体属(Chlamydia)(沙眼；包涵体性结膜炎；非淋菌性尿道炎；鹦鹉热)；消化球菌属(Peptococcus)(产后败血病；内脏病变)；消化链球菌属(Peptostreptococcus)(产褥热；化脓性感染)；乳杆菌属(Lactobacillus)(消化道和阴道的微生物丛(microflora))；李斯特菌属(Listeria)(李斯特菌病)；丹毒丝菌属（Erysipolothrix）(类丹毒)；棒杆菌属(Corynebacterium)(白喉和皮肤机会性感染)；丙酸杆菌属(Propionibacterium)(伤口感染和疾病)；真细菌属(Eubacterium)(口腔和其他感染)；放线菌属(Actinomyces)(放线菌病)；诺卡氏菌属(Nocardia)(诺卡氏菌病；足分枝菌病；脓肿)；和嗜皮菌属(Dermatophilus)(皮肤病变)。

用于细菌的优选靶蛋白质包括膜蛋白质、结构蛋白质和免疫系统可以接近的其他蛋白质，特别是天然糖基化的那些蛋白质。一个或多个另外的糖基化位点可以工程化到编码靶蛋白质的DNA序列内。当不存在天然糖基化位点时，一个或多个人工糖基化位点可以工程化到编码靶蛋白质的DNA序列内。靶还可以包括与多糖或脂质融合的肽，其中多糖或脂质可以最佳地衍生自天然围绕或包围靶细菌的多糖或脂质。编码靶蛋白质的DNA序列可以进行克隆或合成，并且可以为在本发明的宿主细胞中表达进行优化。

在本发明中有用的疫苗蛋白质可以包括一种或多种靶细菌蛋白质的全部或片段。通过参考不断扩大的细菌基因组数据库，本领域技术人员可以定位或鉴定另外合适的细菌蛋白质，所述数据库例如在Sanger Center的网站(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/)上可获得的那些。

在优选实施方案中，一种或多种细菌蛋白质或糖蛋白可以一起用作复合疫苗的部分。复合疫苗可以包括来自相同靶细菌的多种疫苗蛋白质，以及来自不同靶细菌的多种疫苗蛋白质，以及来自靶病毒或其他表位肽的疫苗蛋白质，例如针对癌细胞的表位。下述是可以充当本发明中的疫苗蛋白质的靶细菌和细菌蛋白质的非限制性例子。

沙门氏菌属(伤寒；肠炎；食物中毒)。包膜蛋白质(envA；envD；envZ/ompB/tppA/tppB)外膜蛋白质(ompA；ompC；ompD；ompF；ompH；ompR；pefC；pss；rck；spvA；tctA；tctB)；外膜孔蛋白(nmpC)；外膜蛋白酶E(pgtE)；外膜磷脂酶A(pldA)；磷酸限制可诱导的外膜孔蛋白(phoE)；亚精胺和腐胺转运蛋白(potA)；膜结合的酰基氨基酸酯酶(apeE)；膜结合的传感蛋白(arcB)；膜结合的附着位点(atdA)。参见：Wu等人，J. Bacteriol. 187:4720-4727(2005)；还参见：www.salmonell.org/ genomics/。

分枝杆菌属(结核；麻风病；慢性感染) 膜内在蛋白质(amt；arsA；arsB1；arsB2；arsC；betP；chaA；cysT；cysW；dppB；dppC；drrB；drrC)。参见Camus等人，Microbiology 148:2967-2973(2002；Cole等人 Nature 393:537-544(1998)。

流感嗜血杆菌(呼吸道感染；脑膜炎；结膜炎；软下疳)。外膜蛋白质P1；P2(b/c)；P4(e)；P5(d)；P6(PAL；蛋白质g)；PCP；OMP26；D15；转移结合蛋白质(Tbp)；血红素:血红素结合蛋白结合蛋白(HxuA)。疫苗蛋白质可以与脂寡糖(LOS)连接，以增加疫苗蛋白质的抗原性。参见Foxwell等人，Microbiol Mol Biol Rev，62:294-308(1998)；GTP-结合蛋白(lepA)；外膜受体介导的转运能化蛋白质(outer membrane receptor-mediated transport energizer protein) (TonB)；蛋白质输出膜蛋白质(SecD：SecF)；Hap和HWM1/HMW2粘着蛋白质；IgA1蛋白酶；参见：http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/shared/AllGeneList.cgi?sub_org_val=ghi&feat_type-ORF；Webster等人，J. Histochem Cytochem 54:829-842(2006)；参见Fleischmann和Adams，Science，269:496-512(1995)；Berenson等人，Infection and Immunity，73:2728-2735(2005)；Green等人，Infect Immun 59:3191-3198(1991)。

支原体属(非典型肺炎；泌尿生殖道感染)膜蛋白质p52、p67(pMGA)和p77；Jan等人，Protein Expression and Purification；7:160-166(1996)；脂质相关膜蛋白质(LAMPs)；参见Lo等人，Clinical Infectious Diseases，36:1246-53(2003)。

密螺旋体属(梅毒)：膜蛋白质(tmpA)；Tp33蛋白质；膜抗原，病原体特异性(tpd)；碱性膜蛋白质(tpn39b)；外膜蛋白质(tpn50；tmpB；ompH)；膜脂蛋白(tmpC)；脂蛋白(tpp15；tpp17；tpn32)；鞭毛钩蛋白质flgE；鞭毛钩-基体复合蛋白质fliE；鞭毛基体杆蛋白质flgB；flgC；flgF；flgG；鞭毛基体杆修饰蛋白质flgD；鞭毛P环蛋白质flgI；鞭毛蛋白质fig J；鞭毛钩相关蛋白质flgK和flgL；鞭毛M环蛋白质fliF；鞭毛蛋白质fliJ。参见，McKevitt等人，Infection and Immunity，73:4445-4450(2005)。

疏螺旋体属(回归热；莱姆病)：外表面蛋白质(OspA；OspB；OspC)。参见，Anderton等人，Infection and Immunity，72:2035-2044(2004)。

布鲁氏菌属(布鲁氏菌病)外膜蛋白质31(Omp31)；参见Cassataro等人，Infection and Immunity；73:8079-8088(2005)；主要OMPs Omp25 OMP31和Omp2b；较不丰富的OMPs Omp10、Omp16和Omp19；和平滑脂多糖(S-LPS)。参见Cloeckaert等人，Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology；6:627-629(1999)。酸性pH可诱导的外膜蛋白质(Aop)。参见Brucella：Molecular and Cellular Biology(L?pez-Gońi和Ignacio Moriy?n，编辑)；Horizon Press(2004)。

链球菌属(脓毒性咽喉炎和其他呼吸道感染；皮肤和其他脓肿；产褥热；机会性感染)。M1蛋白质，即一种胶原样表面蛋白质；lepA。参见Zhang等人，Proteomics；7:1379-1390(2007)。

用于细菌的优选靶疫苗蛋白质可以包括已知由细菌生产的肽或蛋白质，特别是可能存在于细菌外膜表面上或附近的那些，从而使得靶肽或蛋白质对于已适应于识别靶肽或靶蛋白质的抗体或细胞毒性T细胞是可接近的。

V. 宿主细胞

低等真核生物例如酵母优选用于糖蛋白表达，因为它们可以经济地培养，给出高收率，并且当适当修饰时能够进行合适的糖基化。酵母特别提供了确定的遗传学，其允许快速转化、经测试的蛋白质定位策略和容易的基因敲除技术。根据需要，合适的载体具有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶、和复制起点、终止序列等。

各种酵母，例如乳克鲁维氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤氏酵母和多形汉逊氏酵母对于细胞培养是优选的，因为它们能够生长至高细胞密度，且分泌大量重组蛋白质。同样地，丝状真菌，例如黑曲霉、镰孢属物种、粗糙链孢霉及其他，可以用于以工业规模生产本发明的糖蛋白。其他合适的宿主包括Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母（Pichia trehalophila）、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia mernbranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuts、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤氏酵母(Pichiiz thermotolerans)、柳毕赤氏酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母（Pichia pijperi）、具柄毕赤氏酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤氏酵母(Pichia methanolica)、毕赤氏酵母属物种(Pichia sp.)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖酵母属物种(Saccharomyces sp.)、汉逊氏酵母属物种(Hansenula sp.)、克鲁维氏酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、白色假丝酵母(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium luchnowense、禾谷镰孢(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum和小立碗藓(Physcomitrella patens)。

低等真核生物特别是酵母和丝状真菌可以进行基因修饰，从而使得它们表达这样的糖蛋白：其中糖基化模式是人样或人源化的。这可以通过消除所选择的内源糖基化酶和/或供应外源酶来达到，如由Gerngross等人，US 20040018590描述的，其公开内容在此通过引用并入本文。例如，宿主细胞可以选择或工程化为：对于糖蛋白上的聚糖，起始α-1,6甘露糖基转移酶活性(外部链起始)方面受损，或多萜醇(dolichy)-P-Man:Man5GIcNAc2-PP-多萜醇(dolichyl)α-1,3甘露糖基转移酶活性（其原本应将甘露糖残基添加到糖蛋白上的N-聚糖上）减少或消除。进一步地，此类宿主细胞，特别是酵母或丝状真菌宿主细胞，应表达或工程化为表达甘露糖苷酶活性，例如α-1,2甘露糖苷酶I活性、甘露糖苷酶II活性、甘露糖苷酶IIx活性和III类甘露糖苷酶活性。宿主细胞特别是酵母和真菌宿主，也工程化为表达N-乙酰葡糖胺转移酶I(GnT)活性，例如GnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI和GnTIX。最后，产生UDP-半乳糖库的酶、合适高尔基体膜转运蛋白和编码β-半乳糖基转移酶的基因(例如，β-GalT)，得到能够转移具有末端β-1,4-半乳糖的复合型人N-聚糖的宿主菌株。(Bobrowicz等人，Glycobiology；14:757-66(2004))。

VI. 将α-GalT引入糖工程化的杂合N-聚糖生产酵母菌株内

通过消除酵母型N-糖基化(例如PpOCH1)的部分且表达适当定位于内质网中的α-1,2-MNS1和GnTI酶，产生分泌具有包含末端GlcNAc的哺乳动物杂合N-聚糖例如PBP3的糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株(Choi等人，PNAS，2003；Bobrowicz等人，Glycobiology；14:757-66(2004))。此外，通过进一步表达hβ-GalTI以及UDP-半乳糖4-差向异构酶，产生分泌具有末端β-1,4-半乳糖的杂合哺乳动物N-聚糖例如RDP39-6的菌株(Davidson等人，美国专利申请2006/0040353，其公开在此通过引用并入本文)。UDP-Gal转运蛋白的表达可以进一步增强β-1,4-半乳糖转移(Davidson等人，美国专利申请2006/0040353)。为了获得末端α-1,3-半乳糖基表位表达菌株，将表达适当靶向内质网的α-1,3-半乳糖基转移酶的另外的质粒转化到这种β-1,4-半乳糖终止的杂合N-聚糖生产菌株内。在标准酵母选择培养基例如包含诺尔丝菌素或潮霉素（质粒包含诺尔丝菌素或潮霉素的抗性基因）的培养基上选择转化体，并且通过酵母细胞裂解物PCR筛选正确的整合体。随后通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)，通过分析由分泌的报道蛋白质例如K3的PNG酶 F消化释放的N-聚糖，筛选重组体的适当靶向的α-1,3-半乳糖基转移酶的功能表达。通过质量鉴定α-1,3-半乳糖向杂合β-1,4-半乳糖终止的受体N-聚糖的正确加入，观察到所述质量与以下一致：单个α-连接的半乳糖残基加入RDP39-6的GFI3.5 N-聚糖(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2，得到GFI5.7(α-Gal)(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖。

VII. 疫苗组合物

本发明的低等真核宿主细胞可以用于表达疫苗蛋白质，并且在优选实施方案中，表达疫苗糖蛋白。疫苗蛋白质或糖蛋白可以用其他药学可接受的活性剂和/或无活性赋形剂配制，以形成疫苗糖蛋白组合物。本发明的疫苗糖蛋白组合物包括包含末端α-半乳糖基残基的N-聚糖。在特定实施方案中，包括末端α-半乳糖基残基的N-聚糖是占优势的N-聚糖。在优选实施方案中，占优势的N-聚糖占组合物中的糖蛋白上存在的N-聚糖的至少30摩尔％、优选至少40摩尔％、且更优选至少50摩尔％。在特别优选的实施方案中，占优势的N-聚糖选自(α-Gal)(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2；(α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和(α-Gal)2(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

本发明的疫苗组合物优选包括病毒或细菌来源的疫苗糖蛋白。疫苗糖蛋白优选是天然糖基化的糖蛋白。或者，疫苗糖蛋白可以包括已合成生产的糖蛋白，并且特别地可以包括已基因工程化以产生原本在天然蛋白质中不存在的一个或多个N-糖基化位点的糖蛋白。在特定实施方案中，疫苗组合物可以包括衍生自癌细胞的表位肽。在这些实施方案中，疫苗组合物可以包括衍生自来自癌细胞或肿瘤细胞抗原的表位肽的表位糖肽序列。在优选实施方案中，表位肽选自Her-2表位、neu表位或前列腺干细胞抗原(PSCA)表位。在特定优选实施方案中，疫苗组合物可以包括复合疫苗组合物，其包括多种疫苗蛋白质或疫苗糖蛋白。在此类情况下，疫苗蛋白质或疫苗糖蛋白可以包括针对相同靶病毒、细菌或其他表位肽的多种疫苗糖蛋白；或可以包括针对多种不同病毒、细菌和/或表位肽，例如针对癌细胞或肿瘤细胞的表位肽的疫苗糖蛋白。

在下述实施例中，病毒疫苗糖蛋白在物种巴斯德毕赤氏酵母的宿主细胞中表达。这些实施例在本发明的具体优选实施方案方面证实本发明，并且不以任何方式加以限制。已阅读本文公开内容和实施例的技术人员应认识到关于所述方法和材料的众多变化、修饰和改善是可能的，而不背离本发明的实施。

实施例

I. α-1,3-半乳糖转移酶的克隆

使用小鼠肾cDNA(Clontech)作为模板并且使用引物RCD446 (TTGGCGCGCCAACAGCCCAGACGGCTCTTTCTTG)(SEQ ID NO：1)和RCD447(GGTTAATTAATCAGACATTATTTCTAACCAAATT)(SEQ ID NO：2)，通过聚合酶链反应扩增编码小鼠α-1,3-半乳糖基转移酶但缺乏推定的跨膜高尔基体定位结构域的基因(MmαGalT)。将所得到的产物克隆到pCR2.1 Topo载体(Invitrogen)内，测序且命名为pRCD680。使用AscI/PacI，从pRCD680中消化MmαGalT基因，并且克隆到质粒pRCD508内，即一种基于pUC19的质粒，其包含侧接AscI/PacI位点的人β-1,4-半乳糖基转移酶I催化结构域(人结构域在本构建体中切除)，框内编码N末端跨膜高尔基体定位结构域的啤酒糖酵母MNN2基因的5' 108个核苷酸、巴斯德毕赤氏酵母GAPDH启动子和啤酒糖酵母CYC1转录终止子、敲除巴斯德毕赤氏酵母ARG1基因的侧翼区作为整合位点、和巴斯德毕赤氏酵母HIS1基因作为选择标记。这种质粒命名为pRCD683，并且得到包含融合基因的Pparg1:HIS1表达构建体，所述融合基因编码啤酒糖酵母Mnn2p的酵母定位结构域和MmaGalT蛋白质的催化结构域。质粒pRCD683用SfiI消化，以线性化且释放pUC19细菌序列用于转化到巴斯德毕赤氏酵母内。

II. 用于α-GalT的合适接受宿主菌株的产生

包含末端α-1,3-半乳糖的非人N-聚糖是通过将α-1,3-连接的半乳糖残基加入包含末端β-1,4-半乳糖的哺乳动物N-聚糖中间结构产生的复合型N-聚糖。这些聚糖来自于SialT和α-GalT对末端β-1,4-半乳糖的竞争。为了消除此类竞争，选择糖工程化的酵母菌株作为起始菌株。菌株包含产生具有末端β-1,4-半乳糖，但特异性缺乏SialT的复合型人N-聚糖所需的酶。

产生糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株，其中修饰典型的酵母型N-糖基化，从而替代地，生产完全唾液酸化的人N-聚糖。首先，酵母基因OCH1的缺失消除负责‘外部链’糖基化的酶活性(Choi等人，Proc Natl Acad Sci US；100:5022-7(2003))。随后，将甘露糖苷酶I(MNSI)基因和GlcNAc转移酶I(GnTI)基因工程化到这种菌株内，并且适当定位至分泌途径，以有效产生哺乳动物杂合型N-聚糖(Choi等人，2003)。在一个进一步的步骤中，将甘露糖苷酶II(MNSII)基因和GlcNAc转移酶II(GnTII)基因工程化到菌株内，并且适当定位至分泌途径，以有效产生哺乳动物复合型N-聚糖(Hamilton等人，Science；301:1244-6.(2003))。最后，通过将产生UDP-半乳糖库的酶、合适的高尔基体膜转运蛋白和编码β-半乳糖基转移酶的基因(例如，β-GalT)进一步工程化到这种菌株内，产生能够转移具有末端β-1,4-半乳糖的复合型人N-聚糖的宿主菌株。(Bobrowicz等人，Glycobiology；14:757-66(2004))。占优势地生产末端β-1,4-半乳糖的酵母菌株是合适的宿主菌株，以接受适当定位的催化活性的α-GalT。

III. 将α-GalT引入糖工程化的酵母菌株内

RDP109是his1突变型糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株，其分泌具有包含末端β-1,4-半乳糖的哺乳动物复合N-聚糖的蛋白质。通过消除酵母甘露糖基转移酶Och1p以及磷酸甘露糖基转移酶Mnn4bp和Pno1p，并且引入编码哺乳动物酶MNS1、GnTI、MNSII、GnTII、β-GalTI的分泌途径定位的基因融合物，以及编码高尔基体UDP-GlcNAc和UDP-Gal转运蛋白和UDP-半乳糖4-差向异构酶的基因，产生RDP109(参见Gerngross，美国专利7,029,872；Davidson等人，美国专利申请2006/0040353；和Bobrowicz，美国专利申请2006/0211085，其公开内容各自通过引用并入本文)。RDP109还表达人纤溶酶原的Kringle 3结构域(K3)作为分泌的报道蛋白质(Choi等人，Proc Natl Acad Sci US；100:5022-7(2003))。在缺乏组氨酸的培养基上选择转化体，并且通过将转化体复制铺板到缺乏精氨酸的培养基上筛选正确的整合体。随后通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)，通过分析由分泌的报道蛋白质K3的PNG酶 F消化释放的N-聚糖，筛选HIS+/arg-重组体的适当靶向的α-1,3-半乳糖基转移酶的功能表达。鉴定了命名为RDP241和RDP242的两种转化体，其中观察到质量与以下一致：1个和两个α-连接的半乳糖残基加入RDP109的GFI5.0  N-聚糖(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2，以分别得到GFI5.8(α-Gal)(β- Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2和GFI5.9(α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖(参见图4A-4B)。

IV. 经由组合文库对β-1,4-GalT的前导定位序列的优化

由菌株RDP 109、RDP241和RDP242生产的N-聚糖包括显著量的杂合型N-聚糖(参见图1，4A-4B)。因此，制备菌株文库以筛选人β-1,4-半乳糖基转移酶I(hβ-GalTI)的最佳前导区定位序列(类似于Choi等人，2003中采用的策略)。菌株PBP235是经糖工程化而生产具有末端GlcNAc的复合三触角哺乳动物N-聚糖的酵母菌株。通过将定位的mMNS1(m=小鼠)、hGnTI(h-人)、dMNSII(d=果蝇)、hGnTII和hGnTIVb基因融合物引入菌株内产生这种菌株，在所述引入的菌株中消除了酵母N-糖基化机制(PpOCH1(Pp = 巴斯德毕赤氏酵母)、PpPNO1、PpMNN4B和PpPB S2)。用包含与hβGalTI框内融合的不同前导区/定位结构域的融合基因的一系列构建体转化这种菌株。先前(Davidson等人，US 20060040353)，编码啤酒糖酵母Mnn2p的N末端36aa的融合基因用于hβGalTI的定位以及用于hGnTII、dMNSII的定位，并且在此处还用于hGnTIV的定位。这得到显著百分比的杂合型聚糖以及二触角N-聚糖。我们假定这可能是由于hβGalTI与dMNSII、hGnTII和hGnTIV中的任一或全部之间的竞争。hβGalTI构建体文库的筛选揭示了几种，其中杂合N-聚糖和二触角N-聚糖减少。得到减少的杂合和二触角N-聚糖这些构建体之一包含编码与hβGalTI融合的啤酒糖酵母Mntlp的N末端58aa(ScMntI1-58)(Sc=啤酒糖酵母)的融合基因。

使用来自得到hβGalTI前导序列的组合文库筛选的数据，制备菌株RDP699-2，其分泌具有含几乎均质的末端β-1,4-连接的半乳糖的复合哺乳动物N-聚糖的蛋白质(GS5.0，图3，5A)。这种菌株已进行糖工程化，以消除酵母型N-糖基化且表达mMNSI、hGnTI、dMNSII、hGnTII和hβGalTI的定位融合物。基于组合文库筛选，hβGalTI是编码作为定位结构域的ScMntI1-58的融合基因。因为改善的前导区定位，与前代菌株例如RDP 109、RDP241和RDP242比较，这种菌株具有显著减少的杂合型N-聚糖。菌株RDP699-2还生产作为分泌的报道蛋白质的大鼠促红细胞生成素(rEpo)，并且是arg-的，因为PpARG1基因被去除。质粒pGLY1443包含编码与上述mαGalT(来自pRCD680)的催化结构域融合的ScMntI1-58的融合基因，并且包含PpARG1作为选择标记。将质粒pGLY1443转化到菌株RDP699-2内，并且在缺乏精氨酸的培养基上选择转化体，得到菌株RDP1030。通过MALDI-TOF分析通过PNG酶F消化而从RDP1030释放的N-聚糖，揭示经由1个和两个α-1,3-半乳糖残基加入GFI5.0(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构，GFI5.8(α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2和GFI5.9 (α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的存在（图5B）。然而，图4A-4B中存在的杂合N-聚糖几乎无法检测(使图4A-4B与图5A-5B比较)，这起因于hβGalTI的改善的定位且可能起因于hβGalTI与dMNSII和hGnTII对杂合底物的竞争减少。

V. 筛选α-1,3- GalTs文库改善α-Gal转移

制备巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY1169，即一种类似于RDP699-2的菌株，且分泌具有含末端β-1,4-连接的半乳糖的复合哺乳动物N-聚糖的蛋白质((β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2 GS5.0，图3)。这种菌株已进行糖工程化，以消除酵母型N-糖基化且表达mMNSI、hGnTI、dMNSII、hGnTII和hβGalTI的定位的融合物。基于组合文库筛选，hβGalTI是编码作为定位结构域的ScMntI1-58的融合基因。因为改善的前导区定位，与前代菌株例如RDP109比较，这种菌株具有显著减少的杂合型N-聚糖且因此类似于RDP699-2(未显示)。这种菌株也是ura-的，因为PpURA5基因已去除。制备包含基因融合物的质粒，所述基因融合物编码与各种α-GalTs（包括来自小鼠(pGLY1892)、野猪(pGLY1893)和家犬(pGLY1894)的那些）的催化结构域融合的ScMntI1-58(图6A-6B)。这些质粒全都包含PpURA5基因作为选择标记。将质粒pGLY1892、1893和1894转化到菌株YGLY1169内，并且在缺乏尿嘧啶的培养基上选择转化体，分别得到菌株YGLY1783、YGLY1785和YGLY1787。这些菌株各自用质粒pSH692转化，所述质粒pSH692包含作为分泌的报道物的编码rEPO的基因和作为选择标记的shBLE基因。将质粒pSH692转化到菌株YGLY1783、YGLY1785和YGLY1787内，并且通过MALDI-TOF由分泌的rEPO分析通过PNG酶F消化而从所得到的转化体释放的N-聚糖。N-聚糖类似于得自菌株RDP1030的那些(图7A-7C)。然而，如通过与GFI5.0 (β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GFI5.8 (α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2和GFI5.9 (α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2对应的峰的相对强度判断的，与MmαGalT比较，从野猪α-GalT(SsαGalT)的引入观察到α-gal转移的增量改善(图7B)。

VI. 经由组合融合文库对SsαGalT进行前导区定位序列优化，改善α-Gal转移

为了改善α-半乳糖转移，基于质粒pGLY2169，制备质粒文库以筛选SsαGalT的最优前导区定位序列。质粒pGLY2169包含编码SsαGalT的催化结构域的基因，不含酵母定位结构域，而是含有一对限制位点NotI和AscI，并且还包含NAT基因(编码对氨基糖苷诺尔丝菌素的抗性)作为选择标记。使用NotI/AscI，将编码酵母定位结构域(编号33-67，745-756)的DNA序列文库克隆到这种载体内，并且将所得到的质粒命名为pGLY2169-33 - pGLY2169-756。将这个质粒文库转化到巴斯德毕赤氏酵母菌株RDP1482内，并且在缺乏尿嘧啶的培养基上选择转化体。菌株RDP1482已进行工程化，以分泌具有含末端β-1,4-连接的半乳糖的复合哺乳动物N-聚糖(GS5.0 (β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2，图3)的蛋白质，并且表达mMNSI、hGnTI、dMNSII、hGnTII和hβGalTI的定位的融合物。再次，基于组合文库筛选，hβGalTI是编码作为定位结构域的ScMntI1-58的融合基因。菌株RDP1482也已进行工程化，以分泌在AOX1启动子控制下的作为报道蛋白质的人纤溶酶原的K3结构域。通过诱导以甲醇作为唯一碳源的培养物产生K3，并且从转化体中纯化上清液蛋白质，并且通过MALDI-TOF分析通过PNG酶消化释放的N-聚糖。结果表明，当ScMntI1-58- SsaGalT融合基因表达时，与菌株YGLY1785的转化体比较，观察到相似比例的GFI5.0、GFI5.8和GFI5.9 N-聚糖(图8A-8B)。然而，如通过观察到的GFI5.0、GFI5.8和GFI5.9质量比判断的，几个前导区/定位结构域-SsaGalT融合物揭示α-gal转移的显著增加。对于单个前导区-SsaGalT融合物，ScMnn21-36-SsaGalT，GFI5.9是观察到的唯一峰，表明α-gal到β-1,4-半乳糖底物的几乎定量的转移(图9)。

VII. 甲型流感HA蛋白质在GFI5.9菌株中的表达

合成且克隆(GeneArt，LLC)编码几种代表性甲型流感H3型HA蛋白质(包括HA Hong Kong(pGLY2766)[SEQ ID NO：3]、HA Panama(pGLY2764)、HA Sydney(pGLY2765)、HA New York(pGLY2762)和HA Moscow(pGLY2763))，和几种代表性H1型HA蛋白质(包括HA Beijing(pGLY2760)、HA New Calcedonia(pGLY2759)、HA Puerto Rico(pGLY2761)和HA South Carolina(pGLY2767)[SEQ ID NO：4])的胞外域(即，缺乏C末端跨膜蛋白质)的DNA序列。将这些质粒各自亚克隆到包含AOX1启动子和ShBLE药物抗性标记的巴斯德毕赤氏酵母表达载体内，并且与分泌信号肽文库包括啤酒糖酵母α-交配因子前原分泌信号(prepro secretion signal)在框内融合。用每种包含流感HA的表达质粒转化GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY2229，并且在包含300mg/L Zeocin的基本培养基上选择菌落。选择几种转化体，并且在96孔深孔平板中在26 C下在具有甘油作为唯一碳源的液体培养基中培养72小时，随后离心且重悬浮于具有甲醇作为唯一碳源的培养基中，并且在26 C下温育24小时。使细胞离心，并且对7ul上清液实施在非还原条件下且用预标记的抗HIS(H3 HIS探针，Santa Cruz)抗体探测的标准蛋白质印迹分析。对于表达的每种HA，观察到合适大小的条带。对约600ul上清液实施Ni-亲和纯化、去除N-聚糖的PNG酶消化，和MALDI-TOF MS分析。对于测试的所有流感HA蛋白质观察到与GS5.0、GS5.8和GS5.9糖形对应的N-聚糖质量。作为例子，显示了在YGLY2229中表达的与啤酒糖酵母α交配因子前原分泌信号(pGLY2922)在框内融合的来自甲型流感HA Hong Kong的N-聚糖(图10)。

类似地，用每个包含流感HA的表达质粒转化进一步优化的GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY3812，并且在包含300mg/L Zeocin的基本培养基上选择菌落。选择几种转化体，并且如上所述培养。在Ni-亲和蛋白质纯化后，PNG酶消化以去除N-聚糖，并进行MALDI-TOF MS分析。对于测试的所有流感HA蛋白质观察到与GS5.0、GS5.8和GS5.9糖形对应的N-聚糖质量，它们以与其他报道蛋白质相似的比例存在。作为例子，显示了在YGLY3812中表达的来自甲型流感HA South Carolina的N-聚糖(图11)。

VIII. HSV-2 gD蛋白质在GFI5.9菌株中的表达

合成且克隆编码两种不同形式的HSV-2 G菌株gD蛋白质胞外域的DNA序列，并且命名为pGLY2757和pGLY2758(Gene Art，LLC)[SEQ ID NOS：5-6]。两种构建体不同之处在于C末端的长度，1种编码整个胞外域，即氨基酸26-339(gD 339，pGLY2757)，并且第二种编码不含C末端结构域的较短形式，即氨基酸26-306，并且包括在Leu 306后与C末端附着的两个异源氨基酸Asn和Gln(gD 306NQ，pGLY2758)。将这些质粒各自亚克隆到包含AOX1启动子和ShBLE药物抗性标记的巴斯德毕赤氏酵母表达载体内，并且与啤酒糖酵母α-交配因子前分泌信号在框内融合，并且分别命名为pGLY2960和pGLY2961。用每种包含HSV-2 gD的表达质粒转化GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY3812，并且在包含300mg/L Zeocin的基本培养基上选择菌落。选择几种转化体，并且在96孔深孔平板中在26 C下在具有甘油作为唯一碳源的液体培养基中培养72小时，随后离心且重悬浮于具有甲醇作为唯一碳源的培养基中，并且在26 C下温育24小时。使细胞离心，并且对7ul上清液实施在非还原条件下且用预标记的抗HIS(H3 HIS探针，Santa Cruz)抗体探测的标准蛋白质印迹分析。对于表达的两种形式的gD均观察到合适大小的条带。对约600ul上清液实施Ni-亲和纯化、去除N-聚糖的PNG酶消化，和MALDI-TOF MS分析。对于两种形式的gD均观察到与GS5.8和GS5.9糖形对应的N-聚糖质量，其中GS5.9糖形作为占优势的形式(图12)。

IX. HSV-2 gC蛋白质在GFI5.9菌株中的表达

合成且克隆编码HSV-2 G菌株gC蛋白质胞外域的DNA序列，并且命名为pGLY3640 [SEQ ID NO：7](GeneArt，Inc.，Toronto，CA)。将来自该质粒的DNA序列亚克隆到包含AOX1启动子和ShBLE药物抗性标记的巴斯德毕赤氏酵母表达载体内，并且与啤酒糖酵母α-交配因子前分泌信号在框内融合，并且命名为pGLY3653。用包含HSV-2 gC的表达质粒转化GFI5.9糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY3812，并且在包含300mg/L Zeocin的基本培养基上选择菌落。选择几种转化体，并且在96孔深孔平板中在26 C下在具有甘油作为唯一碳源的液体培养基中培养72小时，随后离心且重悬浮于具有甲醇作为唯一碳源的培养基中，并且在26 C下温育24小时。使细胞离心，并且对7ul上清液实施在非还原条件下且用预标记的抗HIS(H3 HIS探针，Santa Cruz)抗体探测的标准蛋白质印迹分析。观察到合适大小的条带。对约600ul上清液实施Ni-亲和纯化、去除N-聚糖的PNG酶消化，和MALDI-TOF MS分析。观察到与GS5.8和GS5.9糖形对应的N-聚糖质量，其中GS5.9糖形作为占优势的形式(图13)。

参考文献

 

                                序列表

 

<110> Glycofi, Inc.

      Natarajan Sethuraman

      Robert C. Davidson

      Stefan Wildt

      Terrance A. Stadheim

 

<120> 用于生产具有末端α-1,3-连接的半乳糖的蛋白质的酵母菌株

 

 

<130> GFI-BIO-0029

 

<150> 61/130,422         

<151> 2008-05-30 

 

<160> 7

 

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

 

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 小鼠

 

<400> 1

ttggcgcgcc aacagcccag acggctcttt cttg                             34

 

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 小鼠

 

<400> 2

ggttaattaa tcagacatta tttctaacca aatt                             34

 

<210> 3

<211> 562

<212> PRT

<213> 病毒

 

<400> 3

Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly

 1               5                  10                  15     

His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp

            20                  25                  30         

Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr

        35                  40                  45             

Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu Asp Gly Ile Asp Cys

    50                  55                  60                 

Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln

65                  70                  75                  80 

Asn Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Phe Ser Asn

                85                  90                  95     

Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val

            100                 105                 110        

Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Thr Glu Gly Phe Thr Trp Thr

        115                 120                 125            

Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Asn Ala Cys Lys Arg Gly Pro Gly

    130                 135                 140                

Ser Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Thr

145                 150                 155                 160

Tyr Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asp Asn Phe Asp Lys

                165                 170                 175    

Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asn Gln Glu Gln Thr

            180                 185                 190        

Ser Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Arg Arg

        195                 200                 205            

Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg

    210                 215                 220                

Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly

225                 230                 235                 240

Asp Val Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly

                245                 250                 255    

Tyr Phe Lys Met Arg Thr Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala

            260                 265                 270        

Pro Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile

        275                 280                 285            

Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala

    290                 295                 300                

Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met

305                 310                 315                 320

Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

                325                 330                 335    

Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly

            340                 345                 350        

Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys

        355                 360                 365            

Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val

    370                 375                 380                

Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser

385                 390                 395                 400

Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr

                405                 410                 415    

Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu

            420                 425                 430        

Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe

        435                 440                 445            

Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn

    450                 455                 460                

Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser

465                 470                 475                 480

Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu

                485                 490                 495    

Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys

            500                 505                 510        

Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys

        515                 520                 525            

Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile

    530                 535                 540                

Arg Cys Asn Ile Cys Ile Gly Gly Gly His His His His His His His

545                 550                 555                 560

His His

       

 

 

<210> 4

<211> 525

<212> PRT

<213> 病毒

 

<400> 4

Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val

 1               5                  10                  15     

Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu

            20                  25                  30         

Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile Ala

        35                  40                  45             

Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

    50                  55                  60                  

Pro Glu Cys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val

65                  70                  75                  80 

Glu Thr Ser Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile

                85                  90                  95     

Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu

            100                 105                 110        

Lys Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Glu Thr

        115                 120                 125            

Thr Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser Tyr Ala Gly Ala Ser Ser Phe

    130                 135                 140                

Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Gly Ser Ser Tyr Pro Lys

145                 150                 155                 160

Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu

                165                 170                 175    

Trp Gly Val His His Pro Pro Thr Gly Thr Asp Gln Gln Ser Leu Tyr

            180                 185                 190        

Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser Lys Tyr Asn Arg

        195                 200                 205            

Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Ala Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Ala

    210                 215                 220                

Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile

225                 230                 235                 240

Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala

                245                 250                 255    

Leu Asn Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asp Ala Pro Val

            260                 265                 270        

His Asp Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro His Gly Ala Ile Asn Ser

        275                 280                 285            

Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro

    290                 295                 300                

Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu Arg Asn

305                 310                 315                 320

Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

                325                 330                 335    

Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His

            340                 345                 350        

His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr

        355                 360                 365            

Gln Asn Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu

    370                 375                 380                

Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu

385                 390                 395                 400

Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu

                405                 410                 415    

Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu

            420                 425                 430        

Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Arg Asn Leu Tyr Glu Lys

        435                 440                 445            

Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys

    450                 455                 460                

Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asp Ala Cys Met Glu Ser Val Arg

465                 470                 475                 480

Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn

                485                 490                 495    

Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln

            500                 505                 510        

Ile Gly Gly Gly His His His His His His His His His

        515                 520                 525

 

 

<210> 5

<211> 326

<212> PRT

<213> 病毒

 

<400> 5

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Pro Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg

 1               5                  10                  15     

Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro

            20                  25                  30         

Gly Val Lys Arg Val Tyr His Ile Gln Pro Ser Leu Glu Asp Pro Phe

        35                  40                  45             

Gln Pro Pro Ser Ile Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg

    50                  55                  60                  

Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu His Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile

65                  70                  75                  80 

Val Arg Gly Ala Ser Asp Glu Ala Arg Lys His Thr Tyr Asn Leu Thr

                85                  90                  95     

Ile Ala Trp Tyr Arg Met Gly Asp Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val

            100                 105                 110        

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Pro Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Val Cys Pro

        115                 120                 125            

Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val

    130                 135                 140                

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr

145                 150                 155                 160

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile

                165                 170                 175    

Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Arg Ala Ser Cys Lys Tyr Ala

            180                 185                 190        

Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ala Ala Cys Leu Thr Ser Lys Ala Tyr

        195                 200                 205            

Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile

    210                 215                 220                

Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Leu Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly

225                 230                 235                 240

Trp His Gly Pro Lys Pro Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu

                245                 250                 255    

Leu Ser Asp Thr Thr Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp

            260                 265                 270        

Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Ala Gly Thr Val Ser Ser

        275                 280                 285            

Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Val Ala Pro

    290                 295                 300                

His His Ala Pro Ala Ala Pro Ser Asn Pro Gly Gly Gly His His His

305                 310                 315                 320

His His His His His His

                325    

 

 

<210> 6

<211> 295

<212> PRT

<213> 病毒

 

<400> 6

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Pro Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg

 1               5                  10                  15     

Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro

            20                  25                  30         

Gly Val Lys Arg Val Tyr His Ile Gln Pro Ser Leu Glu Asp Pro Phe

        35                  40                  45             

Gln Pro Pro Ser Ile Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg

    50                  55                  60                  

Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu His Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile

65                  70                  75                  80 

Val Arg Gly Ala Ser Asp Glu Ala Arg Lys His Thr Tyr Asn Leu Thr

                85                  90                  95     

Ile Ala Trp Tyr Arg Met Gly Asp Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val

            100                 105                 110        

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Pro Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Val Cys Pro

        115                 120                 125            

Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val

    130                 135                 140                

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr

145                 150                 155                 160

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile

                165                 170                 175    

Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Arg Ala Ser Cys Lys Tyr Ala

            180                 185                 190        

Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ala Ala Cys Leu Thr Ser Lys Ala Tyr

        195                 200                 205            

Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile

    210                 215                 220                

Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Leu Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly

225                 230                 235                 240

Trp His Gly Pro Lys Pro Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu

                245                 250                 255    

Leu Ser Asp Thr Thr Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp

            260                 265                 270        

Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Asn Gln Gly Gly Gly His His

        275                 280                 285            

His His His His His His His

    290                 295

 

 

<210> 7

<211> 437

<212> PRT

<213> 病毒

 

<400> 7

Leu Ala Asn Ala Ser Pro Gly Arg Thr Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly

 1               5                  10                  15     

Asn Ala Ser Asn Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Arg Asn Ala Ser Ala

            20                  25                  30         

Pro Arg Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gln Pro Arg Lys Ala Thr Lys Ser

        35                  40                  45              

Lys Ala Ser Thr Ala Lys Pro Ala Pro Pro Pro Lys Thr Gly Pro Pro

    50                  55                  60                 

Lys Thr Ser Ser Glu Pro Val Arg Cys Asn Arg His Asp Pro Leu Ala

65                  70                  75                  80 

Arg Tyr Gly Ser Arg Val Gln Ile Arg Cys Arg Phe Pro Asn Ser Thr

                85                  90                  95     

Arg Thr Glu Phe Arg Leu Gln Ile Trp Arg Tyr Ala Thr Ala Thr Asp

            100                 105                 110        

Ala Glu Ile Gly Thr Ala Pro Ser Leu Glu Glu Val Met Val Asn Val

        115                 120                 125            

Ser Ala Pro Pro Gly Gly Gln Leu Val Tyr Asp Ser Ala Pro Asn Arg

    130                 135                 140                 

Thr Asp Pro His Val Ile Trp Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Ser

145                 150                 155                 160

Pro Arg Leu Tyr Ser Val Val Gly Pro Leu Gly Arg Gln Arg Leu Ile

                165                 170                 175    

Ile Glu Glu Leu Thr Leu Glu Thr Gln Gly Met Tyr Tyr Trp Val Trp

            180                 185                 190        

Gly Arg Thr Asp Arg Pro Ser Ala Tyr Gly Thr Trp Val Arg Val Arg

        195                 200                 205            

Val Phe Arg Pro Pro Ser Leu Thr Ile His Pro His Ala Val Leu Glu

    210                 215                 220                

Gly Gln Pro Phe Lys Ala Thr Cys Thr Ala Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly

225                 230                 235                 240

Asn Arg Ala Glu Phe Val Trp Phe Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Asp

                245                 250                 255    

Pro Ala Gln Ile His Thr Gln Thr Gln Glu Asn Pro Asp Gly Phe Ser

            260                 265                 270        

Thr Val Ser Thr Val Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Gln Gly Pro Pro

        275                 280                 285            

Arg Thr Phe Thr Cys Gln Leu Thr Trp His Arg Asp Ser Val Ser Phe

    290                 295                 300                

Ser Arg Arg Asn Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Leu Pro Arg Pro Thr

305                 310                 315                 320

Ile Thr Met Glu Phe Thr Gly Asp His Ala Val Cys Thr Ala Gly Cys

                325                 330                 335    

Val Pro Glu Gly Val Thr Phe Ala Trp Phe Leu Gly Asp Asp Ser Ser

            340                 345                 350        

Pro Ala Glu Lys Val Ala Val Ala Ser Gln Thr Ser Cys Gly Arg Pro

        355                 360                 365            

Gly Thr Ala Thr Ile Arg Ser Thr Leu Pro Val Ser Tyr Glu Gln Thr

    370                 375                 380                

Glu Tyr Ile Cys Arg Leu Ala Gly Tyr Pro Asp Gly Ile Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Glu His His Gly Ser His Gln Pro Pro Pro Arg Asp Pro Thr Glu Arg

                405                 410                 415    

Gln Val Ile Arg Ala Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly His His His His

            420                 425                 430        

His His His His His

        435        

 

Claims (17)

1.酵母或丝状真菌宿主细胞，其可以生产具有N-聚糖的重组糖蛋白，所述N-聚糖具有至少一个末端α-半乳糖基表位。

2.权利要求1的宿主细胞，其中对于糖蛋白上的聚糖，所述宿主细胞在起始α-1,6甘露糖基转移酶活性方面受损。

3.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞的多萜醇-P-Man:Man5GIcNAc2-PP-多萜醇α-1,3甘露糖基转移酶活性减少或消除。

4.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达选自α-1,2甘露糖苷酶I活性、甘露糖苷酶II活性、甘露糖苷酶IIx活性和III类甘露糖苷酶活性的甘露糖苷酶活性。

5.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达N-乙酰葡糖胺转移酶I(GnT)活性、β-半乳糖基转移酶(β-GalT)活性和UDP-半乳糖-4差向异构酶活性。

6.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）、Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母（Pichia trehalophila）、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia mernbranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuts、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤氏酵母(Pichiiz thermotolerans)、柳毕赤氏酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母（Pichia pijperi）、具柄毕赤氏酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤氏酵母(Pichia methanolica)、毕赤氏酵母属物种(Pichia sp.)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维氏酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium luchnowense、镰孢属物种(Fusarium sp.)、禾谷镰孢(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙链孢霉（Neurospora crassa）。

7.权利要求1的宿主，其中所述宿主表达融合蛋白，所述融合蛋白包括与靶向肽连接的α-半乳糖基转移酶的催化结构域，所述靶向肽将所述融合蛋白靶向到所述宿主细胞的ER或高尔基体。

8.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞生产具有含末端α-半乳糖基表位的N-聚糖的糖蛋白，其中所述占优势的N-聚糖具有选自下述的结构：

(α-Gal)(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2；

(α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和

(α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

9.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞已工程化用于生产疫苗蛋白质。

10.权利要求9的宿主细胞，其中所述疫苗蛋白质选自抗病毒疫苗糖蛋白、抗细菌疫苗糖蛋白和抗癌疫苗糖蛋白。

11.用于生产能够生产N-聚糖的宿主细胞的方法，所述N-聚糖具有末端α-半乳糖基残基，所述方法包括：

(a)提供能够生产N-聚糖的重组酵母或丝状真菌宿主细胞，所述N-聚糖具有在所述N-聚糖的非还原端上的至少一个末端α-半乳糖；和

(b)将编码融合蛋白的核酸引入所述宿主细胞内，以提供生产具有末端α-半乳糖基残基的N-聚糖的宿主细胞，所述融合蛋白包括与靶向肽连接的α-半乳糖基转移酶的催化结构域，所述靶向肽将所述融合蛋白靶向到所述宿主细胞的ER或高尔基体。

12.用于生产具有N-聚糖的多肽的方法，所述N-聚糖具有至少一个末端α-半乳糖基残基，所述方法包括：

(a)提供能够生产N-聚糖的重组酵母或丝状真菌宿主细胞，所述N-聚糖具有在所述N-聚糖的非还原端上的至少一个末端α-半乳糖；和

(b)将编码所述多肽的核酸引入所述宿主细胞内；

(c)在所述宿主细胞中表达所述多肽；和

(d)从所述宿主细胞中回收所述多肽，其中所述多肽在其上具有至少一个N-聚糖，所述N-聚糖具有末端α-半乳糖基残基。

13.生产人样糖蛋白的重组低等真核、酵母或真菌宿主细胞，所述宿主细胞包括编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白能够将α-半乳糖残基转移到N-聚糖的N-连接的寡糖分支的末端β-半乳糖残基上，所述N-聚糖具有由所述宿主细胞生产的糖蛋白的三甘露糖核心，其中所述N-连接的寡糖分支具有选自下述的结构：

Galβ1,4-GlcNAcβ1,2-Manα1,3 ；

Galβ1,4-GlcNAcβ1,4-Manα1,3；

Galβ1,4-GlcNAcβ1,2-Manα1,6；

Galβ1,4-GlcNAcβ1,4Manα1,6；和

Galβ1,4-GlcNacβ1,6-Manα1,6。

14.由酵母或丝状真菌宿主细胞生产的重组糖蛋白，其中所述糖蛋白的N-聚糖包括含末端α-半乳糖基表位的占优势的N-聚糖。

15.权利要求14的重组糖蛋白，其中所述占优势的N-聚糖具有选自下述的结构：

(α-Gal)(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2；

(α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和

(α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

16.包括由酵母或丝状真菌宿主细胞生产的疫苗糖蛋白的疫苗组合物，其中所述糖蛋白包括含末端α-半乳糖基表位的占优势的N-聚糖。

17.权利要求16的疫苗组合物，其中所述占优势的N-聚糖选自下述：

(α-Gal)(β-Gal)GlcNAcMan5GlcNAc2；

(α-Gal)(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和

(α-Gal)2(β-Gal)2GlcNAc2Man3GlcNAc2。

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