CN1756568A - 使用表达α(1,3)－半乳糖基转移酶的同种异型肿瘤细胞的抗肿瘤免疫 - Google Patents

使用表达α(1,3)－半乳糖基转移酶的同种异型肿瘤细胞的抗肿瘤免疫 Download PDF

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Abstract

本发明涉及引起选择性靶向肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞的方法和组合物。通过离体(ex vivo)基因治疗方案，肿瘤细胞被工程化以表达α(1，3)－半乳糖基表位。然后照射细胞或以别的方式杀死细胞并给予患者。所述α－半乳糖基表位引起肿瘤细胞的调理，增强了通过抗原呈递细胞的调理的肿瘤细胞的摄取，导致肿瘤特异性抗原呈递的增强。因此刺激动物免疫系统产生攻击和杀伤动物肿瘤细胞的肿瘤特异性细胞毒性细胞和抗体。

Description

使用表达α(1，3)-半乳糖基转移酶的同种异型 肿瘤细胞的抗肿瘤免疫
交叉参考相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2002年l0月9日申请的临时申请60/417,343的优先权。
发明领域
本发明涉及通过刺激体液和细胞免疫应答抗肿瘤细胞而治疗癌症的方法和组合物。特别地，本发明涉及刺激补体介导的肿瘤细胞破坏和伴随刺激肿瘤特异性抗体产生和肿瘤特异性细胞毒性细胞的方法。
发明背景
异种移植(xenotransplantation)的主要障碍是引起超急性异种移植排斥(HAR)的外源组织中存在的糖类表位的立即识别。该反应在再灌注时立即开始，而且一旦启动就会在几分钟到几小时之内破坏外源组织。在一些供体/受体(recipient)组合中存在HAR(而在其它组合中不存在)推断与两种主要的因素相关，a)受体的异源反应性(xenoreactive)天然抗体与移植物中抗原或内皮细胞的结合及b)移植体的补体调节蛋白和受体的补体系统的不相容性，使得补体不受控制的激活。人血清中高于1％的补体结合性天然抗体识别单一结构：Galα(1-3)Galβ(1，4)GlcNAc-R。Galα(1-3)Galβ(1，4)GlcNAc-R的合成由酶α(1，3)半乳糖基转移酶(αGT)催化。
这个酶通过如下反应催化多种非灵长类哺乳动物细胞的高尔基体中α半乳糖基(αGal)表位的合成：
Galβ(1，4)GlcNAc-R+UDP-Gal→Galα(1-3)Galβ(1，4)GlcNAc-R
发现这个酶在新世纪猴(new world monkey)中是有活性的，而在旧世纪猴(old world monkey)和人中没有活性。从牛和鼠cDNA文库中克隆了αGT cDNA。Larson，R.D.等(1989)“Isolation of a cDNA EncodingMurine UDP galactose；β-D-galactosyl-(1，4)-N Acetyl-D-Glucosamineα-(1，3)Galactosyl Transferase：Expression Cloning by Gene Transfer”，PNAS，USA86：8227；和Joziasse，D.H.等，(1989)“Bovine α-(1，3)GalactosylTransferase：Isolation and Characterization of a cDNA Clone，Identification ofHomologous Sequences in Human Genomic DNA”，J.Biol Chem 264：14290。
该基因存在于人类基因组中，尽管没有检测到转录。然而，在编码该酶的人外显子中发现了两个移码突变(产生成熟前终止密码子的缺失)。参见Galili，Uri“Evolution in Pathophysiology of the Human Naturalanti-α-Galactosyl IgG(anti-αGal)Antibody”，Springer Semin.Immunopathol.(1993)15：155-171。
抗αGal，是一种存在于所有人中的天然抗体，与糖类表位Galα(1-3)Galβ(1，4)GlcNAc-R(αGal)特异性相互作用。这个抗体不与任何其它已知的哺乳动物细胞产生的糖类表位相互作用(Galili，1993，Springer Seminar Immunopathology 15：153)。抗αGal组成大约为1％的循环IgG(Galili等，1984，J.Exp.Med.160：1519)并且也发现是IgA和IgM的形式(Davine等，1987，Kidney Int.31：1132；Sandrin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11391)。其由1％的循环B淋巴细胞产生(Galili等，1993，Blood 82：2485)。人类这个天然抗αGal Ab的产生通过存在于肠和肺菌群中的αGal糖类残基而持续刺激。人类中，抗αGal在超急性异种移植排斥中与存在的这个表位反应并且补体在几分钟到几小时中迅速及必然导致外源组织的破坏。
本发明的一个目的是通过将编码αGT的基因导入肿瘤细胞中发展一种治疗性癌症疫苗，将αGal表位添加到这种疫苗肿瘤细胞中以便通过天然抗αGal抗体增强疫苗细胞的调理并且刺激肿瘤抗原呈递以诱导对该肿瘤特异抗原的体液和细胞免疫应答。
本发明的另一个目的是提供一种治疗性药物组合物，其包含表达和具有αGT以工程化细胞αGal表位的重组肿瘤细胞。
本发明的另一个目的是提供用于治疗肿瘤的组合物和方法、病毒、赘生性细胞或其它细胞，其生长并逃避细胞和体液免疫应答。
根据如下本发明的说明书，本发明的其它目的将会变得明显。
发明简述
本发明涉及引起免疫应答的方法和组合物以选择性靶向和杀伤肿瘤细胞。通过离体(ex vivo)基因治疗方案，肿瘤细胞被工程化以表达αGal表位。然后细胞被杀死(通过γ或紫外线照射、热、甲醛等)并给予患者。αGal表位引起肿瘤细胞的调理，增强了在全肿瘤细胞中存在的抗原的肿瘤特异性抗原呈递。本发明的一个重要特征是应用全细胞在本发明的药物组合物中。这提供了全肿瘤细胞中存在的肿瘤相关抗原的加工，而无论是否这些蛋白受到添加αGal表位的影响。应为αGal修饰影响了多种细胞表面糖蛋白和糖脂，动物免疫系统将具有更多的机会检测、加工和产生对肿瘤特异性抗原的抗体和细胞免疫应答。因此刺激了动物的免疫系统产生肿瘤特异性抗体和免疫细胞，其攻击和杀伤动物中存在的、具有肿瘤相关抗原的αGal阴性肿瘤细胞，所述抗原与工程化的全细胞疫苗提供的抗原是共同的。
按照本发明，通过导入多核苷酸序列产生药物组合物，所述序列离体(ex vivo)编码表达鼠αGT给全肿瘤细胞。受体肿瘤细胞可以是同系基因、同种异型或自体的。通过任何核苷酸转移载体将所述序列导入，所述载体可以包含病毒或非病毒载体，产生活性病毒颗粒的质粒或载体生产细胞。这些基因转移载体转化肿瘤细胞，并引起插入其中的外源遗传物质的表达。所得基因产物在所述细胞上存在的细胞表面糖蛋白和糖脂上催化αGal表位的合成。本发明应用了具有多种细胞表面糖蛋白的全肿瘤细胞以通过预先存在的抗αGal抗体最大化结合αGal表位，因而增强这个复合物与抗原呈递细胞上存在的Fc受体的结合，并因此引发在所述疫苗肿瘤细胞上存在的多种肿瘤相关抗原的抗原呈递。在一个更优选的实施方案中，可以给予来自相同的组织类型或癌类型的多种类型的转化细胞，因此进一步提高了提供的不同表位的数目以增加在个体中存在的肿瘤细胞的完全改善的可能性。
本发明包含一种药物组合物和制造其的方法，所述药物组合物包括治疗有效量的减毒肿瘤细胞的混合物，所述混合物包含多种包括αGal表位的细胞表面糖蛋白和载体。在一个优选的实施方案中，细胞是全细胞。制造组合物的方法包括获得活肿瘤细胞的收集物，用编码表达αGT的核苷酸序列转化所述细胞以便αGal表位存在于所述细胞的细胞表面糖蛋白上。然后杀伤该细胞并与药物载体组合以给予。
定义
在上文和全部说明书和权利要求书中使用了多个与本发明的组合物和方法相关的术语。
单位、前缀和符号以其SI可接受的形式的给出。除非特别指出，核酸以5’到3’方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基从左到右书写。数字范围包括限定范围的边界数，并包括所限定的范围中的所有数。本文中氨基酸可以引用为其通常已知的3字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号。核苷酸可以引用为其通常接受的单字母编码。除非特别指出，本文所用软件、电学和电子术语如“The New IEEEStandard Dictionary of Electrical and Electronics Terms(5th edition，1993)”所定义。以下限定的术语通过本发明说明书的参考文献更完整地限定。
术语“α(1，3)半乳糖基转移酶编码序列”或“αGT编码序列”指任何编码通过如下反应形成α-半乳糖基(αGal)表位的蛋白质的多核苷酸序列：
Galβ(1，4)GlcNAc-R+UDP-Gal→Galα(1-3)Galβ(1，4)GlcNAc-R
这可以包括变体、修饰、截短等以及鼠序列、牛或来自任何其它本领域技术人员已知的并在Genbank、其它出版物或数据库中可获得的、保留了上述反应功能的序列。典型地，这种序列与本文所揭示的鼠或牛αGT序列具有至少80％或更高的同源性。
“扩增”指使用至少核酸序列之一作为模板，构建核酸序列的多个拷贝或与核酸序列互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Canteen，Mississauga，Ontario)、Q-Beta复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。见例如，Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications，D.H.Persing等，Ed.，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.(1993)。扩增产物称为扩增子。
本文所用术语“动物”应被解释为包括所有合成αGal的动物，包括那些尚不知道合成抗αGal的动物。例如，一些动物如鸟类已知不合成αGal表位。由于合成抗αGal或αGal表位的动物中唯一的倒数关系，相信目前未测试的没有αGal表位的许多动物可能是合成抗αGal的动物。本发明也涵盖这些动物。
术语“抗体”包括抗原结合形式的抗体(例如Fab、F(ab)2)。术语“抗体”经常指基本上由一或多个免疫球蛋白基因编码的、特异结合和识别分析物(抗原)的多肽或其片段。然而，尽管各种抗体片段可以被定义为完整抗体的消化产物，本领域技术人员理解这种片段可以重新通过化学或利用重组DNA方法学合成。因此，本文所用术语抗体还包括抗体片段，如单链Fv、嵌合抗体(即包含来自不同种类的恒定区和可变区)、人源化抗体(即包含来自非人来源的互补决定区(CDR))和异源缀合(heteroconjugate)抗体(例如双特异性抗体)。
术语“抗αGal”包括任何类型或亚型的识别αGal表位的免疫球蛋白，如IgG、IgA、IgE或IgM抗αGal抗体。
如本文所用，术语“抗原”指任何可以引发对其或其部分的免疫应答的生物分子(蛋白质、肽、脂质、多糖、糖蛋白、糖脂等)，包括但不限于肿瘤相关抗原和病毒、细菌、寄生虫和真菌抗原。
如本文所用，术语“抗原呈递”指通过巨噬细胞、树突细胞、B细胞和其它类型的抗原呈递细胞将内源性或外源性抗原加工成这些分子的亚片段并将其呈递与细胞表面上I类或II类重要组织相容性复合物或CD1分子复合的生物学机制。这个过程导致了免疫系统的其它类型细胞(如CD4+、CD8+、B和NK细胞)的生长刺激，其能够特异性识别这些复合物并介导抗这些抗原或展示这些抗原的细胞的疫苗应答。
术语“保守性修饰变体”指氨基酸和核酸序列，并意图包括制备的特异序列。对于特定的核酸序列，保守性修饰变体指编码相同的或氨基酸序列的保守性修饰变体的那些核酸。因为遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质可以由很多功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子是丙氨酸的每一个位置，该密码子可以被变为任何一个相应的所述密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变体是“沉默变体”并代表了一类保守性修饰变体。本文编码多肽的每个核酸序列通过遗传密码描述了核酸的每个可能的沉默变体。本领域技术人员将了解核酸中每一个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和UGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都能被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每个沉默变体都包含在每个所述的多肽序列中并包含在本发明的范围内。
对于氨基酸序列，本领域技术人员将了解对核酸、肽、多肽或蛋白质序列改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小部分氨基酸的各个取代、缺失或添加都是“保守性修饰变体”，其中变化导致一个氨基酸被一个化学相似氨基酸取代。以下六组每一组都含有相互为保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
也参见Creighton(1984)Proteins W.H.Freeman and Company。
定义两个氨基酸序列的“序列相同性百分比”是成对排列对比之后这两个氨基酸序列共有的相同氨基酸数除以该对中最短序列的全长。
定义两个氨基酸序列的“序列相似性百分比”是成对排列对比之后这两个氨基酸序列共有的相同氨基酸加上保守氨基酸取代数除以该对中最短序列的全长。
对于特异的核酸，“编码”指包含翻译成特异蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸在核酸的翻译区域中可以包含非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺少这种间隔非翻译序列(例如cDNA)。编码蛋白质的信息使用密码子表示。典型地，氨基酸序列由使用“通用(universal)”遗传密码子的核酸编码。
当合成制备或改变核酸时，要表达核酸的目的宿主的已知密码子优先是有利的。
对于蛋白质或肽，本文有时使用术语“分离的蛋白质(或肽)”或者“分离纯化的蛋白质(或肽)”。这个术语可以指一种蛋白质，其从与其天然相关的其它蛋白质中充分分离，以便以“基本上纯化”形式存在。或者，这个术语可以指通过表达一种分离核酸分子而产生的蛋白质。
对于核酸分子，有时使用术语“分离的核酸”。当用于DNA时，这个术语指一种DNA分子，其与从其衍生的生物体的天然基因组中与其紧邻(5’和3’方向)的序列分离。例如，“分离的核酸”可以包含插入载体中如质粒或病毒载体或整合进入原核或真核基因组DNA中的DNA分子。“分离的核酸分子”还可以包含cDNA分子。对于RNA分子，术语“分离的核酸”主要指上述分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语指一种RNA分子，其与在天然状态下(即细胞中或组织中)相关的RNA分子充分分离，以便其以“基本上纯化”(术语“基本上纯化”定义如下)形式存在。
如本文所用，“异源”核酸指来源于一个外源种类的核酸，或如果来自相同种类，指通过人类精心干预对在组合物和/或基因组基因座上的其天然形式进行充分修饰。例如，可操纵地连接于一个异源结构基因的启动子来自于不同于结构基因来自的种类，或者，如果来自相同种类，对这两者的一或两个的原始形式进行了充分修饰。异源蛋白质可以来自外源种类，或者如果来自相同种类，通过人类精心干预对其原始形式进行了充分修饰。
“宿主细胞”指含有载体并支持该载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。
将核酸插入细胞的文中的术语“导入”指“转染”或“转化”或“转导”并包括掺入核酸到真核或原核细胞中，其中核酸可以掺入细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制，或者瞬时表达(例如转染的mRNA)。
如本文所用，“标记”包括用于鉴定染色体上唯一位置的染色体上的基因座。“多态性标记”包括以多种形式(等位基因)出现的标记，所以当不同形式的标记以同源对存在时，其能够使得该对染色体中每一条的传递均可被追踪。基因型可以使用一或多个标记限定。
如本文所用，“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非特别指出，其涵盖了具有天然核苷酸的必需性质的已知类似物，只要其与单链核酸以类似于天然核苷酸的方式杂交(例如肽核酸)。
术语抗原或肿瘤细胞的“调理”指存在于抗原或肿瘤细胞表面的抗αGal表位通过抗αGal抗体的结合，因而通过抗体Fc部分与抗原呈递细胞表面存在的Fc受体的结合增强由巨噬细胞、树突细胞、B细胞或其它类型的抗原呈递细胞调理的抗原或肿瘤细胞的吞噬作用。
如本文所用，“多核苷酸”包括脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其具有天然核糖核苷酸的必需性质的类似物，只要其在严格杂交条件下，与天然核苷酸一样和基本上相同的核苷酸序列杂交和/或与天然核苷酸一样可以翻译成相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构或调节基因的全长或亚序列。除非特别指出，该术语包括特异的序列以及其互补序列。因此，本文中术语“多核苷酸”包含具有为了稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA或RNA。
本文中使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物。该术语用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人造化学类似物，以及用于天然氨基酸聚合物。这种天然氨基酸的类似物的必需性质是当其掺入蛋白质中时，该蛋白质特异与由相同的但是完全由天然氨基酸组成的蛋白质引发的抗体反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，包括但不限于磷酸化、糖基化、脂质附着、硫化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。
如本文所用，“重组”包括细胞或载体，其通过导入异源核酸被修饰或者细胞来自于如此修饰的细胞。因此，例如，作为人类有目的的干预的结果，重组细胞表达与天然(非重组)形式的细胞中形式不完全相同的基因，或者其表达的是天然基因，但所述天然基因在其他情况下是异常表达的、低表达的或根本不表达的。如本文所用，术语“重组”不涵盖由天然事件(例如，自发突变、天然转化/转导/转座)改变的细胞或载体，例如那些未通过人类有目的的干预而发生的天然事件。
如本文所用，“重组表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列可使特定核酸在宿主细胞中转录的特异核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒、或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除了其它序列包括要被转录的核酸及启动子。
如本文所用，术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”指掺入蛋白质、多肽或肽(总称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸，除非特别指出，可以涵盖天然氨基酸的非天然类似物，其可以与天然氨基酸相似的方式执行功能。
术语“基本上相同”指具有序列变化但不实质上影响蛋白质性质(即蛋白质的结构、稳定性特征、底物特异性和/或生物学活性)的核酸或氨基酸序列。对于核酸序列，术语“基本上相同”意图指负责表达的编码区和保守序列，并主要指编码被编码的多肽中相同氨基酸的简并密码子，或者编码保守取代氨基酸的其它密码子。对于氨基酸序列，术语“基本上相同”通常指不参与确定结构或功能的多肽区域中保守性取代和/或变体。
对于抗体，术语“免疫特异”指结合感兴趣的蛋白质的一或多个表位的抗体，但是其基本上不识别和结合含有抗原性生物分子混合物的样品中的其它分子。
“编码序列”或“编码区”指当表达序列时，具有产生基因产物必需序列信息的核酸分子。
术语“可操纵连接”或“可操纵插入”指将编码序列表达必需的调节序列在相对于编码序列的适当位置置于核酸分子中，以便表达编码序列。这个相同定义有时用于在表达载体中其它转录控制元件(例如增强子)的排列。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等，其提供了编码序列在宿主细胞中的表达。
术语“启动子”、“启动子区”或者“启动子序列”通常指基因的转录调节区，其可以在编码区的5’或3’侧发现，或者位于编码区内，或者位于内含子内。典型地，启动子是DNA调节区，能够结合细胞中的RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列的转录。典型的5’启动子序列在其3’末端由转录起始位点结合并向上游延伸(5’方向)以在高于背景的可检测水平上包括起始转录必需的最小数目的碱基或元件。启动子序列内是转录起始位点(通过核酸酶S1作图限定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
术语“治疗有效量”指足够引起预先存在的肿瘤细胞的数目、质量或复制的可测量的降低的治疗组合物的量，其通过包括但非限于本文所述的技术进行测量。
术语“肿瘤细胞”指动物中肿瘤成分的细胞，或者确定命运是成为肿瘤成分的细胞，即是动物中癌变前病灶成分的细胞。包括在这个定义中的是造血系统的恶性细胞，其不形成实体瘤如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
术语“肿瘤”定义为一或多种能够形成可以进行性替代或破坏正常组织的侵袭性物质的肿瘤细胞。
术语“恶性肿瘤”定义为在其发生的原始位点外可以发展弥散性质的肿瘤细胞形成的那些肿瘤。
“载体”是复制子，如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，另一种核酸片段可以可操纵插入其中以便复制或表达所述片段。
术语“核酸构建体”或“DNA构建体”有时用于指可操纵连接到适当调节序列并插入载体中以转化细胞的编码序列或序列。这个术语可以与术语“转化DNA”相互使用。这样的核酸构建体可以含有感兴趣的基因产物的编码序列，以及选择性标记和/或报道基因。
术语“选择性标记基因”指编码一种产物的基因，当表达时，产生了已知可选择的表型，如转化细胞的抗生素抗性。
术语“报道基因”指编码一种易于通过标准方法直接或间接检测的产物的基因。
用外源或异源DNA当这种DNA被导入细胞中时来“转化”或“转染”细胞。转化DNA可以是或可以不是掺入(共价连接)到细胞的基因组中。例如在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以保持在一个附加型元件如质粒上。对于真核细胞，稳定转化细胞是其中转化DNA已经掺入染色体中以便通过染色体复制遗传给子代细胞的细胞。这种稳定性通过真核细胞建立包括含有转化DNA的子代细胞群的细胞系或克隆的能力证明。
“克隆”是一群通过有丝分裂来自单个细胞或共同祖先的细胞。“细胞系”是原代细胞的克隆，其能够在体外稳定生长多代。
对于肿瘤细胞术语“治疗”指停止所述细胞的进展、减慢生长、诱导退化或改善与所述细胞存在相关的症状。
术语“异种细胞(xenogeneic cell)”指在移植或免疫程序中来自与作为受体动物宿主的动物种类不同的动物种类的细胞。
术语“同种异型细胞(allogeneic cell)”指来自与“受体宿主”动物相同的动物种类但是在一或多个遗传基因座上遗传不同的细胞。这通常用于从一个动物移植细胞到相同种类的另一个不同动物中。
术语“同系基因细胞(syngeneic cell)”指在移植或免疫过程中来自与细胞系的受体宿主动物相同动物种类并且对于大多数基因型和表型标记而言具有相同的遗传组合物的细胞。这通常用于相同的双胞胎移植的细胞或可以用于在高度杂交动物之间移植的细胞。
附图简述
图1示出了可以用于本发明的pLNC-KG质粒。
图2是图1所示的pLNC-KG质粒的序列，SEQ ID NO：1。
图3示出了在α(1，3)半乳糖基转移酶敲除(αGT KO)小鼠中通过免疫兔红细胞诱导抗αGal抗体。
为诱导抗αGal抗体(Ab)，小鼠腹膜内注射108兔红细胞(RRBC)两次，间隔两周。最后一次免疫一周后，获取血液样品并通过ELISA确定抗αGal抗体效价。所有用于本研究的小鼠都产生了高效价的抗αGal Ab。
图4示出了皮下注射致死剂量的未照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞的存活测试。本研究中使用了雌性和雄性8-14周龄H-2 b/b单元型(haplotype)αGT KO小鼠。所有小鼠用RRBC免疫，如图3所示。最后一次免疫一周后，小鼠接受致死的皮下(皮下)1×105的如下三种细胞系任一种的攻击：a)野生型B16.BL6黑色素瘤细胞系(αGal(-))，b)用表达Neo-R基因的载体逆转录病毒转导的B16细胞(B16.LNL，模拟对照αGal(-))或者用表达Neo-R基因及αGT的载体逆转录病毒转导的B16细胞(B16.αGal(+))，pLNCKG)。攻击后，以双盲方式测量肿瘤，一周两次。
图5a和5b示出了在αGT敲除小鼠中皮下注射(5a-攻击15天后，5b-攻击30天后)致死剂量的未照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞后的肿瘤大小。在三个垂直轴线用测径器测量明显的皮下肿瘤，以mm3计算和表示体积。该图描述了分别用图4所述的B16细胞系皮下注射后15和30天的肿瘤大小。条形图代表平均数和误差SEM。
图6示出了在αGT KO小鼠中皮下注射致死剂量的未照射αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞后的肿瘤生长动力学。
用野生型B16(αGal(-))、B16.LNL(对照αGal(-))和αGal(+)B16攻击后15、23和29天如图5测量肿瘤大小。
图7a和7b示出了致死注射未照射αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞的αGT KO小鼠的存活分析。研究图4所述处理的小鼠90天。使用统计软件进行Kaplan-Meier存活分析和long-rank存活曲线对比。
图8示出了在致死注射未照射的αGal(+)B16黑色素瘤细胞存活的小鼠中致死皮下注射未照射的αGal(-)B16黑色素瘤细胞后的存活测试的实验设计。
图9示出了敲除小鼠的存活分析。图7的用αGal(+)B16细胞第一次攻击存活的小鼠随后攻击第二次皮下剂量的天然αGal(-)B16(图8)。注射αGal(-)B16后进行Kaplan-Meier分析60天。使用接受皮下αGal(-)B16的首次用于实验的小鼠( mice)作为对照。
图10示出了在致死剂量注射未照射的αGal(+)细胞存活的小鼠中诱导黑色素瘤特异性胞毒性T细胞。来自图7的用αGal(+)B16细胞第一次攻击存活的小鼠的脾细胞用于体外产生胞毒性T淋巴细胞(CTL)。注射αGal(+)B16的90天后从没有肿瘤的小鼠中收集脾细胞并且通过在没有IL-2存在的情况下培养脾细胞和照射的αGal(-)B16细胞5天产生黑色素瘤特异性培养物。收集CTL并测试特异性靶αGal(-)B16和非特异性同系基因细胞系结肠癌MC38和T细胞淋巴瘤EL-4。将CTL和特异性和非特异性靶孵育4h后通过测量培养上清中LDH释放确定特异性胞毒性。
图11示出了在图10所示的致死剂量注射未照射的αGal(+)细胞存活的小鼠中诱导B16黑色素瘤特异性胞毒性T细胞。
图12示出了在αGT敲除小鼠中通过静脉注射致死剂量的未照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞的弥散性黑色素瘤转移模型的实验设计。如图3用RRBC免疫雌性和雄性αGT KO小鼠以提高抗αGal Ab效价。最后一次免疫一周后，小鼠在尾静脉静脉内注射αGal(-)B16或αGal(+)B16。注射后3周，收集肺并计数肺黑色素瘤转移。
图13示出了图12实验的统计学结果。
图14示出了在αGT敲除小鼠中在用照射的αGal(+)B16黑色素瘤细胞免疫后防止皮下αGal(-)B16黑色素瘤肿瘤发展的实验设计。使用前述实验中的B16衍生细胞系制备细胞疫苗，其是：天然αGal(-)、用对照载体转导的αGal(-)B16.LNL和用编码鼠αGT基因的载体转导的αGal(+)B16细胞。通过γ-照射(250Gy)制备细胞疫苗以防止细胞增殖并储存在冷冻培养基中直至使用。注射前融化细胞疫苗，洗涤计数并悬浮在Hanks’Balanced盐溶液(HBSS)中皮下注射。如图3，所有使用的αGT KO小鼠用RRBC注射。最后一次RRBC注射一周后，小鼠接受第一次剂量的细胞疫苗。两周后重复细胞免疫。每次疫苗的剂量是106细胞/小鼠，最后一次细胞疫苗后两周皮下给予，小鼠用105未照射天然αGal(-)B16细胞皮下注射并观察肿瘤发展，每周两次，90天。
图15示出了图14所述实验的Kaplan-Meier存活分析。
图16示出了识别TNF-α的FACS分析结果。在用照射的αGal(+)B16细胞免疫的小鼠中在体外识别αGal(-)B16黑色素瘤细胞后通过诱导的黑色素瘤特异性T细胞检测胞内TNF-α。在注射了αGal(-)B16黑色素瘤90天后从用αGal(+)B16疫苗免疫的小鼠(图15存活的小鼠)中收集没有肿瘤小鼠的脾细胞。为体外测量αGal(-)B16的识别，通过FACS检测胞内TNF-α。T细胞在存在或不存在布雷菲德菌素(Brefeldin)A的情况下培养6小时以阻断细胞因子的分泌。为最大化激活，使用了PMA/Ca++离子载体。细胞和105照射的B16培养以测量特异性识别或和105作为非黑色素瘤同系基因阴性对照细胞系的CA320M培养。孵育后，收集细胞，渗透固定(permeabilized fixed)并且使用PE-标记的抗TNF-α单克隆Ab染色胞内TNF-α。使用Coulter流式细胞仪分析细胞，获得至少10.000门控(gated)淋巴细胞。
图17示出了通过用照射的黑色素瘤细胞免疫治疗性治疗已经存在(pre-established)的皮下肿瘤的实验设计。通过用照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞免疫治疗性治疗已经存在的皮下αGal(-)黑色素瘤肿瘤。如图3所示，用RRBC注射小鼠。最后一次RRBC注射一周后，小鼠皮下注射105未照射αGal(-)B16黑色素瘤细胞并随机化。在实验#1中，在皮下注射αGal(-)B16后第3天和第6天给予两个剂量的细胞疫苗。在实验#2中，小鼠在用活的αGal(-)B16细胞皮下注射后第4、11和18天接受了三个剂量的照射的细胞疫苗。在这些实验中，使用了两个细胞疫苗：用对照载体或照射的αGal(+)B16细胞转导的照射的αGal(-)B16。
图18a和18b示出了接受了照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞免疫的具有已经存在的皮下αGal(-)B16黑色素瘤的小鼠中肿瘤生长动力学的两个不同实验的结果。在接受或未接受细胞疫苗的小鼠中在早期时间点(early time point)测量肿瘤大小。数值代表了每组中所有小鼠肿瘤大小的平均值。
图19示出了接受了照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞免疫的具有已经存在的皮下αGal(-)B16黑色素瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。在75天中评估注射了αGal(-)B16和用或未用αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤疫苗处理的小鼠的存活(实验#1)。
图20示出了接受了用照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞治疗性免疫的具有已经存在的皮下αGal(-)B16黑色素瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。在70天中评估注射了αGal(-)B16和用或未用αGal(+)或αGal(-)
图21示出了治疗性治疗已经存在的肺转移肿瘤的实验设计。通过用照射的αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞免疫治疗已经存在的弥散性肺转移αGal(-)黑色素瘤。如图3所示用RRBC注射小鼠。最后一次RRBC注射一周后，小鼠静脉内(i.v.)注射未照射的αGal(-)B16黑色素瘤细胞并随机化。随后其在建立弥散性转移后的第4、11和21天用αGal(-)B16或αGal(+)B16疫苗细胞免疫。在第30天处死动物并评估它们的肺肿瘤负载(burden)。
图22示出了图21所示方案的实验1的肿瘤负载。实验#1中，小鼠接受了105的αGal(-)B16黑色素瘤细胞。静脉注射未照射的黑色素瘤细胞30天后，处死小鼠并计数肺黑色素瘤转移。
图23示出了治疗性治疗已经存在的弥散性转移黑色素瘤的第二个实验设计。在实验#2中，小鼠接受5×105的αGal(-)B16黑色素瘤细胞。之后，用黑色素瘤细胞疫苗皮下处理小鼠。其在静脉注射未照射的αGal(-)B16后第4、11和21天接受了3个剂量的2×105用对照载体转导的照射的αGal(-)B16细胞或照射的αGal(+)B16细胞。
图24a和24b示出了图23所述实验的结果，表示为肺的平均重量(24A)或平均肺重量负载(24B)。
图25示出了证明在用αGal(+)或αGal(-)B16细胞免疫后体外诱导了特异于αGal(-)B16黑色素瘤的T细胞免疫的实验设计。如图3用RRBC注射小鼠。最后一次RRBC注射两周后，小鼠接受了三次皮下注射2×105用对照载体转导的照射的αGal(-)B16细胞或照射αGal(+)B16细胞疫苗。最后一次细胞疫苗两周后，收集脾细胞并进行T细胞研究。为确定αGal(-)B16的特异性识别，测量了胞内TNF-α和激活标记CD25和CD69的上调。
图26示出了特异性识别B16抗原(图25)的免疫动物的T细胞前体中的TNF-α的特异性诱导。为检测TNF-α，T细胞在存在或不存在布雷菲德菌素A的情况下培养以阻断细胞因子的分泌。为最大化刺激，使用PMA/Ca++离子载体作为阳性对照。细胞和αGal(-)B16培养以测量特异性识别或者和作为阴性对照的CA320M培养，其是一种非黑色素瘤同系基因(H-2b/b)小肠细胞系。孵育后，收集细胞，并染色胞内TNF-α。在收集至少10000个门控事件后，在正向散射图中的淋巴细胞中通过FACS门控检测阳性细胞。该图描绘了TNF-α(+)细胞的平均荧光强度(MFI)。
图27a和27b示出了用αGal(+)细胞免疫的动物的T细胞前体中激活标记CD25和CD69的上调，这些标记分别识别B16抗原。在如图26所述相似的条件下在没有布雷菲德菌素A下培养一天后进行测量。孵育后，收集细胞并用PE标记的单克隆Ab抗CD25或抗CD69染色。使用Coulter流式细胞仪进行。该图描绘了阳性CD25或CD69细胞的百分比。
图28示出了通过从用照射的αGal(+)或αGal(-)B16细胞免疫的供体小鼠中采用T细胞转移体内证明了对已经存在的弥散性转移αGal(-)B16黑色素瘤具有治疗效果的特异性T细胞介导的免疫。如图3用RRBC注射供体小鼠。最后一次RRBC注射两周后，小鼠接受了三次皮下注射2×105的用对照载体转导的照射的αGal(-)B16或照射的αGal(+)B16细胞疫苗。最后一次细胞疫苗两周后，收集脾细胞并转移至性别匹配的受体。细胞转移4天前，受体静脉注射未照射的αGal(-)B16以建立肺黑色素瘤转移并随机化。T细胞转移30天后，受体进行安乐死并通过称重肺和通过计数黑色素瘤确定肺黑色素瘤转移负载。
图29a和29b示出了图28所述实验的结果。条形图代表平均值和误差，SEM。进行了两个独立的实验并示出。
图30示出了皮下注射致死剂量的未照射的αGal(-)CA320M肉瘤细胞后用αGal(+)或αGal(-)照射的CA320M肉瘤细胞免疫的αGT KO小鼠的存活分析。如图3用RRBC注射小鼠。最后一次RRBC注射两周后，其用1×103的用10MOI HDKgalΔSalI〔αGal(-)载体〕或者HDKgall〔αGal(+)载体〕转导并随后进行了25Gy照射的CA320M进行皮下免疫。21天后，用1×107的未照射的CA320M细胞皮下注射小鼠。无效没有疫苗。在60天的观察期间进行存活分析。
发明详述
抗肿瘤免疫治疗的基本原理是诱导抗肿瘤相关抗原(TAA)的有效免疫应答，其依次导致表达这些抗原的增殖肿瘤细胞的免疫介导的破坏。对于有效抗包含蛋白质的TAA的免疫应答，这些抗原必须首先被抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突细胞和B细胞内吞。在APC中，TAA在溶酶体分隔中被降解并且所得肽在巨噬细胞细胞膜表面表达，大多和II类MHC分子相关但也和I类MHC分子相关。这个表达介导了特异性CD4+辅助T细胞的识别并随后激活这些细胞以有效产生免疫应答(Stevenson，1991，FASEB J.5：2250；Lanzavecchia，1993，Science 260：937；Pardoll，1993，Immunol.Today 14：310)。大多数人类TAA分子还未被在分子水平限定，阻止了这些用作药物治疗或抗肿瘤疫苗的靶。
本领域中已经提出在预防免疫类型的方案中应用αGal表位诱导肿瘤特异性应答并且示出产生抗相同肿瘤细胞的晚期攻击的保护。然而不能保证对其产生预防性免疫应答的特异性TAA对随后发展的肿瘤细胞是有效的。通过预防性免疫对其产生预防免疫应答的TAA的特定表位可能只对那个肿瘤，只对那个癌类型，只对那个患者或只对那个组织等是特异性的。鉴定一个被所有癌表达的通用TAA还是一个问题并且这阻止了广泛应用癌症预防的预防疫苗策略。
不同于通常的预防方法，免疫治疗具有复发或诊断肿瘤的个体将提供更直接的靶向方法，然而对于疫苗方法学对于治疗已经存在的肿瘤细胞的效力存在不一致的预期。几个报道示出在预防模型中的效力，然而在治疗方法中应用相同的治疗示出更低或没有效力。例如，用编码鼠TRP-1的重组疫苗病毒预防免疫成功地对随后用活的肿瘤B16细胞皮下攻击进行保护。这个治疗在预防肺黑色素瘤转移中只是部分有效而在治疗已经存在的皮下黑色素瘤中无效(Overwijk等，Proc.Natl，Acad.Sci.USA(1999)96：2982-2987)。
在相似的研究中，使用含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤基序(CpG-ODN)的合成寡脱氧核苷酸(ODN)佐剂和CTLA-4封闭，在预防、治疗和两种治疗的组合中评估了肽疫苗的效力。研究结论是在预防模式中每种治疗对于B16黑色素瘤都不是有效的。作者证明当小鼠用B16免疫、攻击并随后接受额外治疗剂量的疫苗时，观察到小鼠的有效治疗和存活延长。然而在这个研究中，免疫对治疗已经存在的疾病只是部分有效的因为所有小鼠在预防和治疗方法中都死于黑色素瘤(Davila，Kennedy and Celis，Cancer Research(2003)，63：3281-3288)。
很多其它研究只关注于预防性治疗皮下黑色素瘤但是仅仅很少证明了对肿瘤生长速度的显著和有效治疗效果尽管在动物存活中没有反映出肿瘤生长速度的降低(Wang等，Cancer Research(2003)63：2553-2560；Current Protocols of Immunology，Chapter 20，″B16 as a Model for HumanMelanoma″)。
为进一步使这个问题复杂化，肿瘤特异性淋巴细胞的存在示出不能充分地诱导肿瘤破坏。事实上，最近已证明大量的肿瘤特异性T细胞的存在不能充分地延长具有肿瘤小鼠的存活(Overwijk等，Journal ofExperimental Medicine，(2003)198：569-580)。作者证明通过用改变的肽配体而不是天然肽自身的抗原特异性免疫的T细胞刺激和T细胞生长和激活因子的共同给予是诱导肿瘤退化所严格必需的三个元件。
大多数肿瘤细胞具有唯一的TAA表达谱，但是很多情况中对于各个肿瘤这些TAA是未知的或者非常难于确定或分离。而且，对于逃避免疫监视的大多数肿瘤而言，免疫系统不将这些TAA识别为外源抗原因为它们或者不存在于细胞“危险”信号中或者因为免疫系统对这些抗原耐受而将其识别为“自身”抗原。应用全细胞疫苗首先减轻了困难，因为其提供了完全的TAA而不需要分离或定性这些抗原。应用同种异型全细胞疫苗提供了可以在个体中存在等位基因差异的TAA并因此破坏了对这些TAA的免疫系统的耐受。全癌疫苗(whole cancer vaccine)还被遗传修饰以表达增强免疫应答的分子，如GM-CSF(Dranoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：3539)。遗传修饰或未修饰的全细胞同种异型癌疫苗在临床试验中示出抗肿瘤活性和存活益处，因而证实了实验室产生了人类癌细胞系的免疫排斥可以破坏患者恶性肿瘤的假设。这些疫苗功能通过肿瘤疫苗I类MHC中TAA的直接呈递直接刺激细胞免疫效应子进行，其导致胞毒性T淋巴细胞和天然杀伤细胞的直接激活(van Elsas等，J.Exp.Medicine(1999)190：355-366)。使用前述方法刺激抗肿瘤应答经常与引发抗与肿瘤组织相同的细胞类型的正常组织的自身免疫疾病相关。而且，这些疫苗不利用免疫系统的体液免疫机制识别TAA并提高可以呈递和补体介导的肿瘤细胞破坏。有几个原因是为什么强体液免疫应答应该产生更有效的抗肿瘤应答：I)通过结合细胞表面的特异性抗原调理疫苗细胞的抗体将促进通过抗体Fc部分与抗原呈递细胞上的Fc受体结合的巨噬细胞的吞噬。II)Fc受体靶向完成了几个对有效疫苗功能的重要功能，包括：促进对I类MHC和II类MHC抗原呈递的抗原的有效吸收；促进APC激活和促进树突细胞的成熟。III)通过Fc受体介导的内吞由抗原呈递细胞调理的细胞的吸收对产生有效的抗肿瘤CTL应答十分重要，因为其促进了通过交叉呈递途径(cross-presentation pathway)通过CD8+T细胞的I类MHC限制应答的激活。IV)不能刺激体液免疫应答的疫苗在通过HLA限制性诱导细胞免疫方面的能力是有限的。CTL是HLA限制的并且只破坏呈递自身I类MHC分子上的肿瘤抗原的疫苗细胞。如果MHC相互作用不足，那么NK细胞将破坏肿瘤疫苗细胞，导致产生不足的免疫应答。V)激活APC的信号直接或间接来自天然获得的免疫应答。吸收肿瘤免疫细胞的APC在有效呈递抗原前必须被激活。而且，没有必需的激活信号，将抗原呈递给未成熟APC可能抑制免疫应答。而且，激活的APC可以激活不能不通过激活杀伤的CTL，即使其识别其在HLA匹配的肿瘤细胞上的同源抗原(cognate antigen)。
根据以上讨论，很清楚在肿瘤疫苗领域需要新的肿瘤疫苗，其中特别需要：I)发展可以引起已经存在和弥散的肿瘤退化或至少能在治疗参数下降低肿瘤生长速度而不需要预防免疫方案的肿瘤疫苗，II)发展刺激免疫系统的细胞和体液分支的疫苗，和III)发展没有继发的非所需作用如引发自身免疫疾病的疫苗。
本发明提供了满足这些要求的治疗性肿瘤疫苗制剂。本发明包含应用基因转移技术工程化肿瘤细胞以体外合成α(1，3)半乳糖基表位。应用细胞自身机制和应用被如此工程化的多种同种异型或同系基因肿瘤细胞的混合物在多种细胞表面糖蛋白和糖脂上提供了要产生的表位以提供要产生的抗体与在各个或分离的细胞上的TAA多种机会。用于这些疫苗中的细胞估计含有在一和两百万个之间的αGal表位。这个对于天然预先存在的抗αGal Ab的大量结合位点导致高密度的调理，及随后引起多种激活免疫系统的体液和细胞免疫分支的过程的补体破坏。同种异型肿瘤细胞表面上的这种高密度的αGal残基的存在在修饰的肿瘤细胞注射位点诱导了类似异种移植物超急性排斥的超免疫应答。而且，这些癌疫苗是多价的，意味着它们呈递多种肿瘤抗原靶给免疫系统。这导致更有效的治疗，因为呈递几个TAA并且在更广泛有效的治疗中随呈递的TAA的数量增加，更可能存在不同个体肿瘤表位间的重叠。调理的细胞易于被巨噬细胞吸收，因而提供了大多数肿瘤抗原可以被同时呈递给适应的免疫系统的机制。在这些细胞中，来自癌疫苗细胞的蛋白质被消化被给予II类MHC呈递，因而暴露癌细胞的突变蛋白质表位给T细胞监视。另外，通过Fc受体介导的内吞有抗原呈递细胞(APC)调理的细胞的吸收可以促进通过交叉呈递途径通过CD8+细胞的I类MHC限制应答的激活。由这个过程起始的免疫系统级联提供了刺激以诱导特异性T细胞应答以破坏建立的人类恶性肿瘤的天然肿瘤细胞。而且，初级免疫应答诱导的炎症环境导致增强T细胞应答的细胞因子、组胺和其它上调分子介导的放大效果。以这种方式激活的T细胞直接能够杀伤癌细胞。一个重要的标志是添加αGal表位到肿瘤疫苗上存在的糖蛋白和糖脂上不但限制只对已经糖基化的那些抗原而且限制对存在于肿瘤细胞中的任何抗原产生免疫应答，无论其是否受糖基化影响。
在使用敲除(KO)小鼠的动物模型中证实了这种全细胞疫苗在诱导治疗性肿瘤免疫中的效力。产生缺乏功能性αGT基因的KO小鼠以提供小动物模型在肿瘤细胞系中研究抗αGal表位的体内免疫应答。这些小时可以用兔红细胞(rRBC)免疫以刺激如在人血清中发现的高效价的抗αGal Ab。使用这些小鼠，申请人证明了免疫系统排斥αGal阳性肿瘤细胞并且这种排斥导致T细胞免疫延伸到αGal阴性肿瘤细胞。这个动物模型也用来模拟临床应用，其中在用疫苗治疗前将αGal阴性肿瘤细胞给予动物以模拟已经存在的人类恶性肿瘤。通过这类实验，申请人示出用根据本发明工程化的细胞免疫治疗的小鼠中诱导的细胞介导的免疫能够有效治疗皮下和肺已经存在的局部和弥散性肿瘤，不仅导致肿瘤生长速度降低而且更重要的是治疗小鼠的长期存活。采用的细胞转移实验最后示出了在已经存在的肿瘤排斥中的细胞依赖性成分。在进行这种治疗的小鼠中从未观察到使用其它方法所述的与全细胞肿瘤免疫相关的典型自身免疫除色素作用表明不同免疫刺激方法对免疫应答的最终结果可能具有重要性。
因此本发明涉及引起选择性靶向和杀伤已经存在的肿瘤细胞的方法和组合物。通过离体(ex vivo)基因治疗方案，肿瘤细胞被工程化表达αGal表位。然后照射或者杀伤细胞并给予患者。通过天然预先存在的抗αGal抗体的结合αGal表位引起肿瘤细胞的调理并增强肿瘤特异性抗原呈递。本发明的一个重要特征是在本发明的药物组合物中应用全细胞，和多种转导细胞的混合物。因为αGal修饰影响细胞表面的多种糖蛋白，动物的免疫系统对检测、加工和产生肿瘤特异性抗原的抗体将具有更高的机会。
根据本发明，通过导入肿瘤细胞一种多核苷酸序列产生一种药物组合物，所述序列编码表达αGT酶。通过任何核苷酸转移载体导入该序列，所述载体可以包含病毒或非病毒载体。这些基因转移载体转化肿瘤细胞，并引起插入其中的外源遗传物质的表达。所得基因产物催化在所述细胞上存在的细胞表面糖蛋白上的αGal表位的合成。本发明包括应用具有多种细胞表面糖蛋白的全肿瘤细胞以最大化通过预先存在的抗αGal抗体的αGal表位的结合因此增强这个复合物与存在于抗原呈递细胞上的Fc受体的结合并因此引发在所述疫苗肿瘤细胞上存在的多种肿瘤相关抗原的抗原呈递。
本发明还包含一种药物组合物及生产其的方法，其包括治疗有效量的减毒肿瘤细胞的混合物和载体，所述混合物包含多种包括αGal表位的细胞表面糖蛋白。在优选的实施方案中，细胞是全细胞。生产该组合物的方法包括获得活的肿瘤细胞的收集物，用编码表达αGT的核苷酸序列转化所述细胞以便在所述细胞的细胞表面糖蛋白上存在αGal表位。然后杀伤细胞，优选通过照射并和一种药物载体组合给予。
本发明的另一个实施方案包含用多核苷酸转化肿瘤细胞，所述多核苷酸在肿瘤细胞上产生一个αGal表位。本发明的一个实施方案包含用编码表达酶α(1，3)半乳糖基转移酶(αGT)的核苷酸序列转化肿瘤细胞。αGTcDNA从牛和鼠cDNA文库中克隆。Larson，R.D.等(1989)″Isolation of acDNA Encoding Murine UDP galactose；β-D-galactosyl-1，4-NAcetol-D-Glucosamineα1-3 Galactosyl Transferase：Expression Cloning byGene Transfer″，PNAS，USA 86：8227；和Joziasse，D.H.等，(1989)″Bovineα1-3 Galactosyl Transferase：Isolation and Characterization of a cDNA Clone，Identification of Homologous Sequences in Human Genomic DNA″，J.BiolChem 264：14290。根据本发明可以使用任何其它类似能在肿瘤细胞中在细胞表面表达αGal表位的核苷酸序列，例如催化这个反应或可能的事件的其它酶，工程化细胞以在细胞表面具有额外的糖蛋白因此人工产生可以被呈递给免疫系统的TAA。
用于本发明药物组合物的肿瘤细胞可以是自体的，或者在一个优选的实施方案中可以是同种异型或同系基因的。要治疗的转化细胞和肿瘤细胞必须具有至少一个共同表位，但是优选具有很多。在不同癌症间存在通用或者重叠表位或TAA这发面来说，所述药物组合物可以非常广泛地应用。
本发明还不需要限制癌细胞并且可以包括任何含有细胞表面糖蛋白的细胞，或者具有αGal表位位点的细胞成分。这可以包括某些病毒、赘生性细胞等。
编码αGal表位产生蛋白质的核酸序列包含在适当的表达载体中，其转导肿瘤细胞。这种表达载体包括但非限于真核载体、原核载体(例如细菌载体)和病毒载体。
在一个实施方案中，表达载体是病毒载体。可以应用的病毒载体包括但非限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体和腺伴随病毒载体或DNA缀合物。
在一个优选的实施方案中，用含有编码通过抗体结合和补体激活诱导肿瘤细胞破坏的介质(agent)的核酸序列的病毒载体转导病毒载体包装细胞系。收集通过包装细胞系产生的病毒颗粒并用于转导作为抗肿瘤疫苗给予的肿瘤细胞。
传统上，病毒载体是逆转录病毒或腺病毒载体。可以应用的逆转录病毒的例子包括但非限于莫洛尼(Moloney)鼠类白血病毒、脾脏坏死病毒、和来自逆转录病毒如劳斯(Rous)肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖(myeloproliferative)肉瘤病毒和乳癌病毒的载体。
逆转录病毒载体用作介质(agent)介导逆转录病毒介导的基因转移到真核细胞。通常构建逆转录病毒载体以便大多数编码病毒结构基因的序列被缺失并被感兴趣对其基因替代。最常见地，结构基因(例如gag、pol和env)从逆转录病毒主链中使用本领域已知的遗传工程化技术移除。
将这些新的基因以几种常用方式掺入原病毒主链。最简单的构建是其中逆转录病毒的结构基因被单一基因替代，其然后在长末端重复序列(LTR)中的病毒调节序列的控制下转录。还构建可以导入一个以上的基因到靶细胞中的逆转录病毒载体。通常，在这种载体中，一个基因在病毒LTR的调节控制之下，而第二个基因在剪接信息后表达或者在其自己的，内部启动子调节下表达。
对于最小化病毒主链病毒成分进行了努力，大部分努力是减少在包装细胞中载体和包装缺陷辅助病毒间的重组机会，包装缺陷辅助病毒需要提供在载体自身中缺失的逆转录病毒的结构基因。
在一个实施方案中，逆转录病毒可以是一系列Bender等，J.Virol.61：1639-1649(1987)所述载体之一，其基于含有一系列缺失和取代的N2载体(Armentano等，J.Virol.，61：1647-1650)以减少到载体和包装系统间的绝对最小化同源性。这些变化还降低了病毒蛋白质表达的可能性。这些载体的第一个，LNL-XHC，通过定点诱变改变，gag的天然ATG起始密码子变为TAG，因而消除了该点非所需的蛋白质合成。
在莫洛尼鼠类白血病毒(MoMuLV)中，真正gag起始的5’端，存在允许另一个糖基化蛋白质(pPr80.sup.gag)表达的可读框。莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMuSV)在其5’区具有变化，包括移框和丢失糖基化位点，其消除了pPr80.sup.gag的氨基端的潜在表达。因此，制备了载体LNL6，其掺入了LNL-XHC的改变的ATG和MoMuSV的5’部分。LN载体系列的5’结构因此消除了表达逆转录病毒阅读框的可能性，随后在遗传转导的靶细胞中产生病毒抗原。在降低和包装缺陷辅助病毒重叠的最终改变中，Miller消除了在LN载体中紧接3’LTR前的额外env序列(Miller等，Biotechniques，7：980-990，1989)。可以用于本发明的载体的一个例子示于图1，其序列示于图2，SEQ ID NO：1。
用于基因治疗必须满足任何基因转移系统的极为重要的需要是安全性。安全性来自载体基因组结构和用于生产感染性载体的包装系统的组合。Miller等发展了用于表达逆转录病毒结构蛋白质的pPAM3质粒和制备载体包装系统的LN载体系列的组合，其中通过消除几乎所有的载体基因组和包装缺陷辅助基因组间(即LN和pPAM3)的重组位点将重组野生型逆转录病毒的产生降低至最小。
在一个实施方案中，逆转录病毒可以是载体LN系列的莫洛尼鼠类白血病毒，如上述的那些，和在Bender等(1987)和Miller等(1989)中进一步描述的。这种载体具有来自鼠肉瘤病毒的部分包装信号和突变gag起始密码子。本文所用术语“突变”指缺失或改变gag起始密码子以便不表达gag蛋白或其片段或截短部分。
载体包括一或多个启动子。可以应用的适当的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和人类巨细胞病毒(CMV)启动子，如Meller等，Biotechniques，Vol.7，No.9，980-990(1989)所述，或者其它启动子(例如细胞启动子如真核细胞启动子包括但非限于组蛋白、pol III、和β肌动蛋白启动子)。可以应用的其它病毒启动子包括非限于腺病毒启动子、TK启动子和B19细小病毒启动子。
在另一个实施方案中，本发明包含一个可诱导的启动子。一个这种启动子是四环素控制的反式激活蛋白(tTA)响应启动子(tet系统)，这是一种已经适应用于哺乳动物细胞的原核可诱导启动子系统。tet系统在逆转录病毒载体中组织以便高水平的组成型产生的tTA mRNA功能不但是生产tTA蛋白而且还通过反义抑制降低反应单位的基础表达。见Paulus，W.等，″Self-Contained，Tetracycline-Regulated Retroviral Vector System forGene Delivery to Mammalian Cells″，J of Virology，January.1996，Vol.70，No.1，pp.62-67。通过本文的教导选择适当的启动子对于本领域技术人员是显而易见的。
然后应用载体转导包装细胞系形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但非限于PE501、PA317、.psi.2、.psi.-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、.psi.CRE、.psi.CRIP、GP+E-86、GP+envAM12、DAN和AMIZ细胞系。含有编码一种介质的核酸序列的载体可以通过本领域已知的任何手段转导包装细胞，所述介质能够提供在表达编码该介质的核酸序列时破坏肿瘤细胞，并激活补体级联。这种手段包括但非限于电穿孔、应用脂质体和CaPO4沉淀。
在一个优选的实施方案中，本发明包含通常感染人类和基于人类的包装细胞系的病毒载体。例如，可以使用来自通常感染人类的病毒如疱疹病毒、Epstein Barr病毒的载体。
根据本发明可以治疗的肿瘤包括恶性和非恶性肿瘤。可以治疗的恶性(包括原发和转移)肿瘤包括但非限于发生在如下部位的肿瘤：肾上腺、膀胱、骨、乳腺、子宫颈、内分泌腺(包括甲状腺、脑垂体和胰)、结肠、直肠、心脏、造血组织、肾、肝、肺、肌肉、神经系统、脑、眼、口腔、咽、喉、卵巢、阴茎、前列腺、皮肤(包括黑色素瘤)、睾丸、胸腺和子宫。这种肿瘤的例子包括胺前体摄取脱羧细胞瘤、迷芽瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、类癌心脏病、癌(例如瓦尔克癌、基底细胞癌、基底鳞状癌、布-皮二氏瘤、导管癌、欧利希瘤、原位癌、克雷布斯2癌、Merkel细胞癌、粘液癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头癌、硬癌、肺泡细胞癌、肺癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、浆细胞瘤、黑色素瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂瘤、脂肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、间叶瘤、中肾瘤(mesonephroma)、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋养层肿瘤、腺癌、腺瘤、胆管瘤、珠光瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤(gynandroblastoma)、肝癌、汗腺腺瘤、胰岛细胞瘤、莱迪希细胞瘤、乳头瘤、塞尔托利细胞瘤、泡膜细胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管膜细胞瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤、神经瘤、神经节细胞瘤、非嗜铬性副神经节瘤、血管角质瘤、嗜曙红性血管淋巴样增生、致硬化血管瘤、血管瘤病、血管球瘤(glomangioma)、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果体瘤、癌肉瘤、软骨肉瘤、叶状囊性肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白细胞肉瘤(leukosarcoma)、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、肉瘤(例如尤因实验肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、瘤和对于其它这种细胞的肿瘤。
药物制品
根据本发明，减毒的αGal表达肿瘤细胞用作预防或治疗疫苗治疗肿瘤。因此本发明还包括用于包含这些转基因肿瘤细胞(表达为HA1、HA2等，见表1)人类和动物的药物制品。本领域技术人员很容易地知道根据人类和动物的年龄、健康、性别、大小和重量变化药物组合物的剂量和方案。可以通过已经建立的方法和分析，例如I、II和III期临床试验和通过本文提供的实施例所述对每个系统确定这些参数。
对于给药，减毒的肿瘤细胞可以组合药物可接受的载体如适当的液体载体或赋形剂和任选辅助添加剂。液体载体和赋形剂是常规的并且可商业获得。其例子是蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液等。
用于肠胃外、皮下、皮内、肌内、口服或腹膜内给药的适当制剂包括水可溶或水分散形式的活性化合物的水溶液。另外，可以给予适当的油状注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。适当的亲脂溶剂或载体包括例如脂肪油、芝麻油、或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖，任选悬浮液还可以含有稳定剂。而且，肿瘤疫苗细胞可以和本领域熟知的免疫佐剂如弗氏完全佐剂、无机盐如氯化锌、磷酸钙、氢氧化铝、磷酸铝、皂角苷、聚合物、脂质或脂质级分(脂质A、一磷酸酰脂质A)、修饰的寡核苷酸混合。
除了用常规载体给予，活性组分可以通过本领域技术人员已知的多种专门输送药物技术给予。以下实施例仅是为了说明的目的而不试图以任何方式限制本发明。
本发明将用以下实施例描述；然而，其不试图限制本发明的范围。所有引用的专利和期刊文献在此并入参考。
实施例1
产生表达αGT的逆转录病毒载体，pLNCKG
使用正向引物5′-ACAAAAGCTTGACATGGATGTCAAGGGAAAAGTAAT-3′和反向引物5′-AATTATCGATTCAGACATTATTTCTAAC-3′，通过PCR扩增鼠αGT基因的1077bp片段，其含有增强αGT翻译的Kozak序列，然后将其克隆到pLNCX的ClaI和HindIII位点以产生pLNCKG逆转录病毒载体(图1)。将这个载体转染到包装细胞系293.AMIZ〔Young and Link″Chimericretroviral helper virus and picornavirns IRES sequence to eliminate DNAmethylation for improved retroviral packaging cells″J.Virol.(2000)74：5242-5249〕产生载体生产细胞系293.AMIZ/LNCKG。在存在G418和ZeocinTM的情况下选择转染的细胞两周。通过限制稀释亚克隆混合的选择细胞群。筛选单细胞衍生的VPC有效转导不同组织建立的人上皮癌细胞系的能力。鉴定上清在一组人上皮癌细胞系上稳定产生最高转导效率和αGT表达的克隆并命名为293Z.CKG VPC。产生源自一管种子库(seedbank)的293Z.CKG VPC的母细胞库(master cell bank)、工作细胞库(working cell bank)和生产库(production lot)，并在5％-1％CO2下在37℃±1℃下在培养瓶中扩增。培养基是补充了10％胎牛血清(FBS)和2mmL-谷氨酰胺的RPMI-1640。当293Z.CKG VPC到达足够密度时，收集培养液(上清)、过滤并混合到无菌容器中。混合物完全混合然后无菌过滤到有标签的、无菌塑料瓶中(标签含有产品名称、批号和装填日期)。冷冻装填的瓶并在-60℃或以下贮存。等份进行安全测试。来自293Z.CKG VPC的含有逆转录病毒的上清用于转导不同的人癌细胞系(以下实施例所述)以建立αGal(+)全细胞疫苗。
实施例2
用LNCKG逆转录病毒载体转导B16.BL6黑色素瘤细胞
为产生αGal(+)B16细胞，用2mL含有2×106tu/mL感染效价的LNCKG逆转录病毒的上清转导2×106细胞。在补充了G418 1mg/mL的培养基中通过两周的选择来选择细胞对新霉素的抗性。这个选择之后，细胞用鸡抗αGal多克隆抗体对表达的αGal表位染色并通过荧光激活的细胞分选进行分选。
实施例3
通过用兔红细胞免疫在α(1，3)半乳糖基转移酶敲除(αGT KO)小鼠中诱导抗αGal抗体。
雌性和雄性8-14周龄的α(1，3)半乳糖基转移酶(αGT)敲除(KO)小鼠用于本研究。小鼠起始是混合单元型(mixed haplotype)(H-2 b/d)并通过育种和选择在H-2 b/b单元型的F4杂交世代中获得αGT KO小鼠的当前群(current colony)。这些动物生产低效价的天然抗αGal表位的抗体。为提高抗αGal Ab的效价，小鼠用1×108兔红细胞腹膜内免疫两次，间隔两周。最后一次RRBC注射后一周检测抗αGal Ab的效价以证实本研究中所有的小鼠都具有高效价的抗αGal Ab。通过ELISA测量，用于本研究中的所有小鼠都具有高于1∶500稀释度的高抗αGal Ab。代表性实验示于图3。
实施例4
皮下注射致死剂量的未照射αGal(+)或αGal(-)B16黑色素瘤细胞后的存活测试。
本实验的目的是确定是否在癌细胞中αGal表位的表达将导致其在具有预先存在抗αGal Ab的宿主中的体内超急性排斥。因此RRBC注射的αGT KO小鼠用表达或不表达αGal表位的未照射105B16黑色素瘤细胞攻击并测量肿瘤发展(图4)。
图5示出攻击后15天的肿瘤大小。如期，攻击后两周接受天然αGal(-)B16的19只小鼠中的11只发展了可测量的肿瘤。同样，接受B16.LNLαGal(-)B16细胞的20只小鼠中10只发展了肿瘤(分别是57％和50％。Chi squarep＞0.05，不显著)。然而，当小鼠接受了αGal(+)B16细胞，显著更少的动物发展了肿瘤。20只动物中只有5只(25％)发展了明显的肿瘤(Chisquare，p＝0.03，与对照显著不同)。另外，在用对照和模拟转导的细胞攻击的动物中的肿瘤比接受表达αGal细胞的小鼠中发展的肿瘤大很多。在两组对照组中观察到平均大小为200mm3的肿瘤，组之间差异统计学不显著(F test p＝0.38)。然而，在接受B16.αGal(+)细胞的组中的肿瘤大小观察到显著差异。测试组的平均肿瘤大小是36mm3，其表示与对照动物相比肿瘤大小大约降低80％(F test p＝0.002)。
这个结果证明当用表达αGal的B16细胞攻击时更少的动物发展了较小的肿瘤，表明抗αGal、预先敏化(pre-sensitized)的小鼠与天然或模拟转导的αGal阴性B16对照相比能够介导更有效的表达αGal细胞的体内清除。
当攻击后30天测量肿瘤时，观察到类似的结果。接受B16野生型的组中17只小鼠中13只具有肿瘤(76％)。同样在接受用模拟载体转导的细胞的组中18只小鼠中13只发展了大肿瘤(72％)。然而，在接受表达αGal细胞的组中只有50％的小鼠具有可测量的肿瘤。更重要地，在每组对照组中两只，总共四只动物因为发展了大肿瘤而不得不被安乐死。接受了表达αGal细胞的动物中没有一只在肿瘤植入30天死亡，表明用表达αGal细胞攻击的动物存活提高。
图6示出用对照、模拟和表达αGal的B16细胞攻击后肿瘤发展的动力学。在两个对照αGal(-)组中肿瘤生长极快，几乎每7天体积加倍。相反，用αGal(+)B16细胞攻击的小鼠的肿瘤在早期时间点生长明显更慢(p＝0.03)。这表明免疫机制可能抑制肿瘤的生长并帮助延长具有肿瘤的小鼠的存活。
用αGal(+)B16细胞致死攻击后小鼠的长期存活
接受对照αGal(-)、模拟转导的αGal(-)B16和αGal(+)B16的组的小鼠在90天中每周观察(图7)。如图所示，接受天然B16的10动物没有一只攻击后存活并且接受模拟转导的αGal(-)B16细胞的11只中只有一只小鼠在皮下注射后存活。两个对照组示出非常类似的存活曲线，表明NeoR基因产物在B16的排斥和/或免疫原性中不诱导显著的变化(Logrank Test p＝0.5，差异统计学不显著)。相反，接受表达αGal的未照射B16细胞的动物中47％在致死攻击后存活。19只小鼠中9只在皮下注射后80天保持没有肿瘤。使用Kaplan-Meier存活分析，与对照组相比，在皮下注射了αGal(+)B16细胞的组中观察到存活比率显著增加(Logrank Test p＜0.02)。
在用αGal(-)B16注射的两组对照组中，攻击后的头30天中几乎60％的动物死亡。相反，注射了αGal(+)B16的实验组只有5只动物(26％)在攻击后的头一个月内不得不被安乐死。
在第二个独立实验中获得了类似的结果。用天然αGal(-)B16皮下注射的19只小鼠只有2只存活。同样，用模拟转导的αGal(-)B16细胞皮下致死攻击的21只小鼠只有4只存活。相反，皮下注射αGal(+)B16的20只小鼠有8只存活并且保持没有肿瘤超过80天。
这个结果一起证明αGT基因的表达和B16糖基化模式的改变诱导了活癌细胞的体内破坏，帮助降低肿瘤生长，延长具有肿瘤的小鼠的存活。更重要地，因为大约40％的受攻击小鼠保持没有肿瘤，注射αGal表达细胞可能导致能够控制高致死性αGal(-)黑色素瘤细胞生长的强免疫应答的诱导。
用未照射αGal(+)B16细胞致死攻击后的存活导致诱导抗野生型αGal(-)B16的记忆保护性免疫
我们假设皮下注射未照射αGal(+)B16细胞的存活动物发展了延及天然αGal(-)B16肿瘤的细胞免疫。为检验这个假设，所有存活的没有肿瘤的小鼠用野生型B16再次攻击(αGal阴性)。年龄匹配的小鼠用作对照并且也注射了αGal(-)B16(图8)。如期，用αGal(-)B16攻击的12只对照小鼠中11只死于发展为大的和色素肿瘤的皮下黑色素瘤(图9)。另一方面，第一次面对未照射αGal(+)B16黑色素瘤存活的小鼠中没有一只发展了肿瘤。所有8只小鼠保持没有肿瘤70天，显著提高了第一次排斥αGal(+)B16细胞的小鼠的存活(logrank test p＜0.001＝。有意思的是，抗B16黑色素瘤的保护与自身免疫去色素化(depigmentation)(vitiligo)不相关，如先前他人所述〔Overwijk等，“Vaccination with a recombinant vaccinia virusencoding a self antigen induces autoimmune vitiligo and tumor celldestruction in mice：requirement for CD4+T lymphocytes″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：2982-2987；Overwijk等″Tumor regression andautoimmunity after reversal of functionally tolerant state of self-reactiveCD8+T cells″J.Exp.Med.(2003)198：569-580；van Elsas et al.″Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-CTLA-4 andGM-CSF-producing vaccines induces rejection of subcutaneous andmetastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation″J.Exp.Med.(1999)190：355-366”〕。
这个结果证明用αGal(+)细胞致死攻击后存活的小鼠发展了抗天然αGal(-)肿瘤的强免疫。这个细胞和可能的体液免疫应答保护了存活小鼠对用肿瘤进行的第二次致死攻击，表明在所有被保护的小鼠中免疫应答已经延及到天然αGal(-)肿瘤B16。
为进一步证明在被保护的小鼠中诱导了T细胞介导的免疫的假设，产生黑色素瘤特异性T细胞培养物并对αGal(-)B16黑色素瘤，以及非特异性细胞系EL-4和MC38进行测试(图10)。
如图11所示，在被保护的小鼠中诱导了能够特异性裂解B16黑色素瘤的强CTL，通过在靶细胞中测量LDH释放证实。
而且，这些结果证明在小鼠中注射αGal(+)细胞提高了存活。而且，注射了αGal(+)B16细胞和存活了起始致死注射的小鼠能够发展延及天然αGal(-)B16黑色素瘤肿瘤的强免疫。这表明在注射能够识别αGal(-)B16肿瘤的αGal(+)B16细胞之后诱导了保护小鼠抗致死肿瘤剂量的记忆性T细胞介导的免疫。
实施例5
通过静脉注射致死剂量的未照射αGal(+)或αGal(+)B16黑色素瘤细胞在αGT敲除小鼠中的弥散性黑色素瘤转移模型。
为进一步证明具有高效价抗αGal Ab的小鼠能够排斥αGal(+)B16黑色素瘤细胞，使用了肺黑色素瘤转移模型。小鼠静脉注射105未照射αGal(-)或αGal(+)B16黑色素瘤细胞。三周后，计数肺黑色素瘤转移(图12)。注射了αGal(-)B16细胞的小鼠具有很多肺转移。相反，注射了αGal(+)B16细胞的小鼠具有减少的非负载(图13)。而且5只小鼠中2只没有肿瘤。这个结果表明预先存在的抗αGal Ab在αGal(+)B16细胞的清除中起了重要作用。
实施例6
通过用αGal(+)细胞预防免疫预防皮下肿瘤发展
这个实施例的目的是确定通过用αGal(+)疫苗免疫是否能够实现预防皮下肿瘤，如前述〔LaTemple等″Increased immunogenicity of tumorvaccines complexed with anti-aGal：studies in knockout mice for α1，3galatosyltransferase″Cancer Res.(1999)59：3417-3423〕。如前述，用RRBC免疫小鼠。最后一次RRBC注射后一周，小鼠接受第一次剂量的照射细胞疫苗。小鼠注射照射的天然αGal(-)B16、用对照载体(pLNL，编码新霉素抗性基因)转导的αGal(-)B16或用αGal(+)B16(用编码新霉素抗性基因和αGT基因的载体转导)。一些小鼠没有接受照射的细胞疫苗。细胞免疫两周后重复。最后一次免疫后两周，小鼠皮下注射105未照射的αGal(-)B16细胞(图14)。测量肿瘤90天，每周两次。如图15所示，未接受B16细胞疫苗的10只小鼠中没有一只攻击后存活并且在攻击后50天内死亡。在用天然αGal(-)B16和αGal(-)B16/NeoR疫苗免疫的小鼠中观察到某些保护。分别是14只小鼠中4只和12只小鼠中5只在B16攻击后存活。在用B16和B16/NeoR免疫的小鼠中没有统计学差异表明在这个条件下NeoR基因产物没有提高B16的免疫原性(p＞0.2，Logrank test)。相反，当小鼠用αGal(+)B16细胞免疫时观察到了更明显的保护，因为20只小鼠中12只攻击后存活并且保持没有肿瘤90天(p＜0.001，ANOVA，p＝0.08 Logranktest)。这个结果证明用照射的αGal(+)细胞免疫在60％的αGal(+)B16免疫的小鼠中防止了皮下黑色素瘤的发展并且显著延长了用αGal(-)B16黑色素瘤攻击的小鼠的存活。
我们假设在用αGal(+)B16疫苗免疫小鼠后诱导了能够识别天然αGal(-)B16细胞的T细胞，其保护小鼠抵抗注射的活αGal(-)B16细胞。为测试这个假设，收集用αGal(+)疫苗免疫的小鼠脾细胞并在存在或不存在刺激的情况下培养6h。为最大化刺激，使用PMA/Ca++离子载体。用105照射的B16细胞培养细胞以测量特异性识别，或者用CA320M，一种具有相同H-2 b/b单元型的非特异性αGal(-)细胞系培养。孵育后，收集细胞并染色胞内TNF-α。通过FACS门控在前向散射图的淋巴细胞中进行检测(图16)。收集自αGal(+)B16免疫的小鼠的T细胞被PMA/Ca++离子载体有效激活。通过这个多克隆激活剂方法激活的淋巴细胞的百分比在这个实验中被认为是检测到的最大激活。静息(为刺激)T细胞和用CA320M刺激的T细胞不能产生TNF-α，表明在B16-αGal(+)免疫后没有诱导能够识别CA320M抗原的T细胞前体。相反，用B16-αGal(+)免疫诱导了体外特异性识别B16-αGal(-)的T细胞前体。这个结果表明这些用αGal(+)B16免疫后诱导的T细胞可能负责大约一半的αGal(+)B16处理的小鼠中的肿瘤预防。
实施例7
通过αGal(+)细胞免疫治疗已经存在的皮下黑色素瘤
因为用天然αGal(-)B16和αGal(-)模拟转达的B16/NeoR免疫导致在上述实验中的相似数据，所以用照射的αGal(-)B16/NeoR单独免疫作为阴性对照进行以下实验，以提高统计学分析能力。
下一个实验的目的是确定通过用αGal(+)B16疫苗免疫能否实现已经存在的皮下黑色素瘤的治疗。有效的预防治疗在治疗已经存在的肿瘤治疗中也是有效的并不是显而易见的。在B16黑色素瘤作为肿瘤模型的特定情况中，几个策略在预防免疫计划中被证明是有效的而在治疗已经存在的皮下黑色素瘤中具有低或没有作用。例如，用编码鼠mTRP-1的重组痘苗病毒免疫防止了皮下黑色素瘤的发展而对已经存在的皮下肿瘤的治疗没有作用〔Overwijk等″Vaccination with a recombinant vaccinia virusencoding a self antigen induces autoimmune vitiligo and tumor celldestruction in mice：requirement for CD4+T lymphocytes″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：2982-2987〕。类似地，肽特异性免疫导致诱导强T细胞免疫但是对治疗已经存在的肿瘤极少有效(Davila等″Generation ofantitumor immunity by cytotoxic T lymphocyte epitope peptide vaccination，CpG oligodeoxynucleotide adjuvant and CTLA-4 blockade″Cancer Research(2003)63：3281-3288)。而且，只存在肿瘤特异性T细胞是必要条件但是不是有效诱导肿瘤根除的充分条件。
我们假设αGal(+)疫苗诱导能够排斥已经存在的αGal(-)肿瘤的强细胞依赖性肿瘤免疫。为测试这个假设，我们进行了设计来治疗已经存在的肿瘤的实验(图17)。
小鼠皮下注射未照射的105 B16细胞并随机化。攻击后三天，其用照射的αGal(-)B16/NeoR或用照射的αGal(+)B16皮下免疫。三天后，用照射的细胞疫苗重复免疫。基线对照小鼠皮下注射接受了未照射的B16并且其没有接受照射细胞疫苗处理(没有疫苗组)。图18a和b示出未免疫小鼠(n＝11)、用αGal(-)B16/NeoR免疫的小鼠(n＝24)和接受αGal(+)B16疫苗的小鼠(n＝23)的肿瘤生长的动力学。数据表示为平均值和误差，SEM。统计学分析表明当对比对照小鼠和接受αGal(+)B16细胞疫苗的小鼠时斜率具有显著性差异。这个结果表明用照射的αGal(+)B16疫苗免疫的小鼠发展了生长更慢的较小肿瘤。
实验#2中，小鼠接受额外剂量的细胞疫苗。仅皮下注射接受未照射αGal(-)B16的小鼠在观察的第一个月中发展了生长非常快速的大肿瘤(n＝15)。类似地，注射了对照αGal(-)B16疫苗的小鼠发展了生长非常快的大肿瘤(n＝29)。这两组斜率的统计学比较表明它们没有显著差异(p＝0.17)。这表明用αGal(-)B16/NeoR免疫对治疗皮下已经存在的黑色素瘤没有作用。相反，接受αGal(+)B16疫苗的小鼠发展了生长更慢的较小肿瘤(n＝33)。这组与对照组存在统计学显著差异(p＜0.03)。
这两个实验表明用αGal(-)B16细胞免疫不能够治疗已经存在的皮下黑色素瘤。另一方面，已经存在的皮下黑色素瘤可以通过用αGal(+)B16疫苗免疫成功治疗。
具有已经存在的皮下肿瘤的小鼠用αGal(+)B16疫苗治疗的存活分析
具有已经存在的αGal(-)B16皮下肿瘤的小鼠用αGal(+)B16照射的细胞免疫与未免疫对照和αGal(-)模拟免疫组相比示出延长的存活(图19)。分别是9只中没有一只和20只未免疫和模拟免疫的动物中1只在皮下攻击后存活，而用表达αGal的B16细胞处理的19只小鼠中5只在攻击后存活超过70天。对于没有疫苗和模拟疫苗组平均存活时间分别是27和26天。相反，接受αGal(+)B16疫苗的小鼠的平均存活时间显著增加(39天)。这个结果证明αGal(+)B16疫苗细胞能够有效治疗已经存在的皮下黑色素瘤，通过存活动物数目的提高(26％对5％)和延长的平均存活时间证明(39对26天)。
在第二个实验中，在用未照射的αGal(-)B16起始皮下注射后的第4、11和18天小鼠接受三个剂量的细胞疫苗(图20)。每次疫苗剂量是3×105细胞。小鼠或者不免疫(n＝12)、用αGal(-)B16免疫(n＝23)或用αGal(+)B16免疫(n＝26)。
图20示出观察70天后的Kaplan-Meier存活分析。存活曲线的logranktest比较表明与对照未免疫和αGal(-)B16免疫小鼠相比，具有皮下黑色素瘤的小鼠用αGal(+)B16疫苗治疗后的存活数目存在显著差异(p＝0.005)。12只未免疫小鼠中没有一只在皮下注射B16后存活。类似地，23只用αGal(-)B16疫苗免疫的小鼠中没有一只在皮下注射B16后存活。相反，26只接受αGal(-)B16疫苗的小鼠中11只(42％)在皮下注射致死的αGal(-)B16黑色素瘤后存活70天。
对照和模拟免疫小鼠的平均存活没有显著差异(分别为38和42天，logrank test p＝0.43，ns)。相反，用αGal(+)B16处理的小鼠的平均存活大于60天。这表示αGal免疫组的平均存活具有显著增加(p＜0.005)。
这个结果进一步证明用αGal(+)B16疫苗治疗已经存在的皮下黑色素瘤与αGal(-)免疫或没有处理相比是显著有效的。
实施例8
通过αGal(-)B16细胞疫苗治疗肺黑色素瘤转移
我们进一步评估了在作为弥散性疾病模型的肺黑色素瘤转移治疗中的效力。这个实验从临床的角度看是非常相关的，因为具有肿瘤的患者很可能死于弥散性疾病，其是不可手术去除的。因此，RRBC免疫小鼠用105未照射αGal(-)B16静脉(i.v.)攻击并随机化。用照射的B16/NeoR疫苗(αGal(-)，n＝6)或用αGal(+)B16疫苗(n＝7)皮下处理小鼠。i.v.注射B16后第4、11和21天皮下给予疫苗(2×105照射细胞)(图21)。攻击后30天处死小鼠并计数黑色素瘤转移数目(图22)。在3只小鼠中肺转移的数目“多得无法计数”(任意值＞250个肿瘤)，在其它小鼠中计数了30个肿瘤，而只有2只小鼠没有肿瘤。而且，这个组中动物之一在腹膜腔示出3个额外的转移瘤，表明疾病弥散到除肺外的其它地方。
相反，用αGal(+)B16疫苗处理的小鼠全部没有肿瘤，表明通过αGal(+)表达疫苗治疗成功治疗了已经存在的肿瘤。
在第二个独立实验中(图23)，使用了提高5倍剂量的未照射αGal(-)B16。小鼠i.v.注射5×105活的B16以已经存在肺黑色素瘤转移。4天后，如前述用对照和αGal(+)B16细胞进行免疫。小鼠接受无疫苗处理(n＝10)、三个剂量的αGal(-)B16(n＝11)或αGal(+)B16疫苗(n＝11)。
用B16i.v.攻击后30天，小鼠被安乐死并计数肺黑色素瘤转移(图23)。而且通过计数肺肿瘤负载和通过称重肺组织评估肿瘤生长(图24)。
在未免疫小鼠以及对照免疫组的肺中发现了大量肺黑色素瘤转移。为进行统计学比较，使用了肺组织的重量。在对照和未免疫组的肺负载之间没有统计学差异(Unpaired t test p＝0.66，ns)。相反，在用表达αGal的B16疫苗免疫的小鼠中观察到显著减少的肺负载(One Way ANOVAp＜0.006)。
与第一次实验的观察类似，对照和没有疫苗组的一些小鼠具有“多得无法计数”的黑色素瘤转移。另外，2只动物具有散布的肺外黑色素瘤，表明除了肺疾病还有弥散性疾病。αGal(+)B16免疫小鼠中没有一只在肺中具有“多得无法计数”的黑色素瘤而且没有一只具有肺外肿瘤。这表明用αGal(+)B16疫苗免疫能够有效治疗弥散转移黑色素瘤。另外，用αGal(+)B16疫苗免疫能够防止系统性疾病的进一步扩散。
实施例9
T细胞研究证明用αGal(+)B16细胞免疫后诱导了αGal(-)B16特异性T细胞前体。
这个技术的一个主要问题是用αGal(+)细胞免疫是否诱导能够与αGal(-)肿瘤反应的T细胞介导的免疫。在上述实验中，我们证明了αGal(+)B16疫苗诱导了能够介导已经存在的αGal(-)肿瘤的清除的强免疫。当用αGal(-)B16疫苗免疫时不诱导这种免疫。为进一步证明用αGal(+)B16疫苗免疫后诱导了特异性于αGal(-)B16肿瘤的T细胞前体，体外进行T细胞研究。这些实验的目的是证明通过T细胞的αGal(-)B16细胞的特异性识别。从用对照疫苗αGal(-)B16组免疫的小鼠或用αGal(+)B16照射细胞免疫的小鼠中收集T细胞(图25)。进行两种研究通过不同手段证明相同的结论，即用照射的αGal(+)B16细胞免疫的小鼠具有增加数目的能够特异性识别αGal(-)B16肿瘤细胞的T细胞前体。
在第一组实验中，胞内细胞因子TNF-α通过FACS检测。在最后一次皮下免疫后两周，从用照射的αGal(-)B16细胞或用αGal(+)B16细胞免疫的小鼠中收集细胞。没有刺激培养的脾细胞作为阴性对照。对于刺激，其用CA320M共同培养(αGal(-)同系基因H-2 b/b单元型)或用αGal(-)B16细胞共同培养。刺激6小时后，收集细胞并对胞内TNF-α染色。在用αGal(+)B16细胞免疫的小鼠脾中发现了百分比增加的TNF-α(+)淋巴细胞，其特异性识别αGal(-)B16细胞(图26)。这些T细胞当与CA320M培养时不产生TNF-α，表明其特异性识别B16并且不特异性识别非相关的同系基因细胞系。除了黑色素瘤特异性T细胞前体数目增加，这些细胞产生的TNF-α的量通过FACS检测的平均荧光密度测量也显著增加(图26)。检测到在TNF-α(+)细胞中MFI增加4倍。当来自模拟免疫的小鼠的脾细胞与αGal(-)B16培养时，用MFI 17检测到只有4％的TNF(+)细胞。相反，当来自接受了αGal(+)B16细胞疫苗的小鼠的T细胞与αGal(-)B16培养时，用MFI 69检测到7％的TNF(+)细胞。这表示脾中存在的T细胞前体的百分比增加两倍。这个实验重复三次并获得了相似结果。
这个结果证明了用αGal(+)B16细胞免疫和不用αGal(-)B16免疫诱导了通过T细胞特异性识别黑色素瘤靶的体外检测的强特异性T细胞免疫。
在不同组的实验中，使用细胞表面激活标记测量αGal(-)B16黑色素瘤细胞系的特异性T细胞识别。已描述在结合T细胞受体(TCR)时，T细胞上调几种细胞表面分子，表明淋巴细胞的激活状态。这些分子之一是IL-2受体α链或CD25。当结合TCR时，CD25上调并且在激活后第1天可以被FACS检测到。类似地，CD69(或非常早期激活抗原(VEA))在T细胞激活时上调。CD69的功能是作为不同细胞中的信号传递受体，其参与淋巴细胞激活的早期事件并通过诱导合成不同细胞因子及其受体而激活T细胞。在静息T细胞中两种激活标记(CD25和CD69)表达水平非常低。为证明用αGal(+)B16细胞免疫诱导了能够识别特异性αGal(-)B16的T细胞前体，使用激活标记的上调作为测量识别和激活的参数。从用αGal(-)B16免疫或用αGal(+)B16免疫的小鼠中收集细胞。其在没有刺激或用阴性对照细胞系(CA320M)或用αGal(-)B16刺激下培养。培养24小时后，收集细胞并染色以检测CD25或CD69。在那些排除活力染料7-AAD的细胞(活细胞)中进行门控收集。如期，静息T细胞(没有刺激)和用同系基因非黑色素瘤细胞系CA320M刺激的细胞表达非常低水平的激活标记(图27a和27b)。当来自接受了αGal(-)B16的小鼠的脾细胞与B16培养时，观察到一些激活标记的上调。这证实了先前的文献报道，其表明当小鼠接受天然αGal(-)B16疫苗时可以观察到低程度的免疫反应性。然而， 这个反应性不足以预防或治疗已经存在的黑色素瘤。另一方面，当T细胞与αGal(-)B16培养时，检测到来自用αGal(+)B16免疫的小鼠的淋巴细胞激活增加，因为测量到CD25(+)和CD69(+)细胞数目的增加。
这个结果再次证明用αGal(+)B16细胞免疫诱导了能够特异性识别αGal(-)B16黑色素瘤细胞的T细胞前体。
实施例10
通过采用来自用αGal(+)或αGal(-)B16细胞疫苗免疫的小鼠的T细胞转移治疗已经存在的转移性黑色素瘤
上述体外实验示出当与接受αGal(-)B16免疫的小鼠相比时，在用αGal(+)B16细胞免疫的小鼠中诱导了更高数量和质量的黑色素瘤特异性T细胞。这些黑色素瘤特异性T细胞数目增加(在脾中发现更多的T细胞)并且其产生更多的TNF-α。而且，当与B16培养时，激活了更多的脾细胞(CD25和CD69上调)。在前述实验中，接受了αGal(+)B16的具有皮下和肺转移的小鼠示出延长的存活和肺肿瘤清除的增加。根据这两组数据，我们可以推断事实上通过αGal(+)B16免疫诱导的T细胞负责治疗已经存在的黑色素瘤。然而，这不是显而易见的，因为已经示出大量黑色素瘤特异性T细胞不足以治疗已经存在的皮下黑色素瘤，因为它们处于耐受状态〔Overwijk等″Tumor regression and autoimmunity after reversal offunctionally tolerant state of self-reactive CD8+T cells″J.Exp.Med.(2003)198：569-580〕。我们假设用αGal(+)B16细胞免疫诱导了强细胞介导的免疫，其在回忆(recall)时能被快速激活并且其负责具有已经存在疾病的小鼠中的肿瘤清除。为证明这个假设，进行采用细胞转移实验(图28)。免疫供体小鼠，如上述接受三个剂量的照射αGal(+)B16或αGal(-)B16疫苗。受体小鼠i.v.注射活的αGal(-)B16以建立肺黑色素瘤转移并随机化。I.v.注射未照射B16的4天后，小鼠接受或不接受来自用αGal(+)或αGal(-)B16细胞免疫的供体的T细胞。4周后，通过计数大体标本(in block)中肺的肿瘤数量及通过对肺进行称重来测量肺黑色素瘤转移负载。进行实验两次并且两次的结果示于图29A和29B。实验#1示出i.v.接受B16、未用T细胞治疗的小鼠(n＝16)、接受来自αGal(-)B16免疫小鼠的T细胞的小鼠(n＝15)和接受来自用αGal(+)B16免疫的小鼠的T细胞的小鼠(n＝17)的平均肺重量。条形图表示平均肺负载和误差，SEM。在对照小鼠和接受来自模拟免疫小鼠的T细胞的小鼠中出现了大肿瘤和明显增加的肺负载。在没有接受T细胞的小鼠(对照)和接受来自模拟免疫小鼠的T细胞的小鼠之间肺黑色素瘤转移没有统计学差异(p＞0.05)。相反，在接受可来自αGal(+)B16免疫小鼠的T细胞的小鼠中观察到了肺黑色素瘤负载的显著减少(One-way ANOVA p＜0.05)。在第二个独立实验中观察到相似的结果。没有接受T细胞的小鼠(n＝7)具有平均64个肺黑色素瘤。接受来自αGal(+)B16免疫小鼠的细胞的小鼠具有很多肺黑色素瘤转移(平均＝90，n＝10，p＝＞0.05)。相反，在接受来自用αGal(+)B16细胞免疫的小鼠的脾细胞的小鼠中观察到平均只有31个肺黑色素瘤。这表示在接受来自αGal(+)B16免疫小鼠的T细胞的小鼠的肺黑色素瘤负载显著减少(Unpaired t Test p＜0.05)。
这仅用来自αGal(+)免疫小鼠的细胞治疗明显成功地减少了已经存在的肺黑色素瘤转移第一次证明通过αGal(+)细胞疫苗而不是用αGal(-)疫苗诱导了强细胞介导的免疫。这个强细胞依赖性肿瘤免疫毫无疑问地负责治疗已经存在的弥散性疾病。
实施例11
用αGal(-)或αGal(+)照射的CA320M肉瘤细胞免疫的αGal(-)敲除小鼠在皮下注射致死剂量的未照射αGal(-)CA320M细胞后的存活
用来自αGal(-)敲除小鼠的且因此与宿主是完全同系基因的不同肿瘤细胞系重复上述用B16黑色素瘤细胞的预防免疫实验。这个细胞系是CA320M并通过间隔两周向αGT敲除小鼠中腹膜内注射溶解在250μl橄榄油中的2mg的9，10-二甲基-1，2-苯蒽和1mg的3-甲基胆蒽(3-MC)而获得。第一次注射后8个月后一只小鼠呈现肿瘤。肿瘤被定位在腹膜腔，大约2cm宽，3cm高及1.5cm深。注意到定位在肠系膜(mesentaries)上的转移瘤。收集两个原发物和肠道用于培养和组织病理学检查。收集自与肿瘤原发位点相关的肠系膜的转移瘤被成功培养并命名为CA320M。原发和移植肿瘤的冷冻和石腊切片的组织病理学检查分别证明了与很少分化的肉瘤一致的形态学。苏木精和伊红染色与免疫组织化学分析一起表明CA320M可被分类为小肠肉瘤的胃肠基质瘤家族。在αGT KO小鼠中诱导的CA320M细胞不能结合特异性检测αGal表位的IB44同工凝集素，表明这个鼠肿瘤如期是没有功能性αGT酶，以及因此没有αGal表位。CA320M细胞易于被基于HSV-1的载体感染并在用HE7αGall转导后表达αGal表位。
通过皮下注射2×107兔全血细胞两次，间隔14天来引发αGT KO小鼠发展抗αGal表位的免疫。分别用10MOI的HDKgal或HDKgalΔsalI转导CA320M细胞8小时以获得CA320MαGal(+)或αGal(-)细胞。简而言之，通过将具有Kozak序列的αGT基因插入pHD1扩增子HSV-1载体中发展HDKgal。因此pHDKgal携带了在CMV启动子控制下的一个真核基因αGT。为构建突变αGT基因，在位于αGT酶的相应催化结构域的一个唯一的SalI限制位点切割并使用Klenow和dNTP补平。所得移码突变产生了多肽的成熟前终止，使酶没有功能。突变αGT基因还克隆至pHD1扩增子中并且两个扩增子都使用没有辅助的疱疹病毒系统包装进感染性HSV毒粒中。转导的CA320M细胞被照射(25Gy)并且1×103细胞注射进15只动物中。21天后，动物用1×107活CA320M细胞攻击，随后进行肿瘤生长和存活分析。与用突变αGal(-)CA320M(33％)和无效(38％)对照相比，93％的αGal(+)CA320M免疫动物在致死肿瘤攻击后存活直至60天(＞400mm3肿瘤)(图30)。这个结果证实用αGal(+)同系基因细胞免疫能够诱导浪相应αGal(-)细胞的保护性免疫应答。
一起考虑，所有这些结果第一次证明在全细胞疫苗中存在的α半乳糖基表位代表了能够诱导T细胞介导的免疫以治疗缺少αGal表位表达的已经存在的肿瘤的强免疫佐剂。这些结果还表明这个疫苗的临床应用可能在人类医药中具有显著作用。另外，目前对癌症患者的预防免疫是不可能的，因此如本文所述的技术的治疗方法具有快速应用和对癌症患者具有可能益处的实际价值。
实施例12
发展人类全细胞癌症疫苗(HyperAcuteTM)
HyperAcuteTM全细胞癌症疫苗由被遗传工程化以表达鼠α(1，3)半乳糖基转移酶基因的同系基因癌细胞系组成。几种来自几种肿瘤组织类型的独立癌细胞系被工程化以在其表面表达αGal表位。治疗性全细胞癌疫苗由照射的各个细胞系或属于相同肿瘤组织类型的几种工程化的癌细胞类型的混合物的注射液组成。表1表明用于产生HyperAcuteTM全细胞癌症疫苗的癌细胞系。
表1.HyperAcuteTM全细胞癌症疫苗
  HyperAcuteTM疫苗   细胞系   ATCC#   肿瘤组织类型   描述
  HAL1   A549   CCL-185   肺   癌
  HAL2   NCI-H460   HTB-177   肺   大细胞癌
  HAL3   NCI-H520   HTB-182   肺   鳞状细胞癌
  HAB1   MCF-7   HTB-22   胸   胸腔积液腺癌
  HAB2   BT-20   HTB-19   胸   癌
  HAPA1   HPAF-II   CRL-1997   胰   腹水腺癌
  HAPA2   PANC-1   CRL-1469   胰   原发导管上皮癌
  HAPA3   ASPC-1   CRL-1682   胰   转移腺癌
  HAPA4   BxPC3   CRL-1687   胰   原发腺癌
  HAO1   IGROv   NA   卵巢   癌
  HAO2   ES-2   CRL-1978   卵巢   透明细胞癌
  HAO3   NIH：OVCAR3   HBT-161   卵巢   卵巢腺癌
  HAO4   PA-1   CRL-1572   卵巢   卵巢畸胎癌
  HAM1   A375   CRL-1619   黑色素瘤   恶性黑色素瘤
  HAM2   COLO829   CRL-1974   黑色素瘤   恶性黑色素瘤
  HAM3   G-361   CRL-1424   黑色素瘤   恶性黑色素瘤
  HAC1   HCT-116   CCL-247   结肠   结肠直肠癌
  HAC2   COLO205   CCL-222   结肠   转移腺癌
  HAC3   LoVo   CCL-229   结肠   转移腺癌
  HAC4   WiDr   CCL-218   结肠   结肠直肠腺癌
  HAC5   DLD-1   CCL-221   结肠   结肠直肠腺癌
  HAC6   HCT-15   CCL-225   结肠   结肠直肠腺癌
  HAC7   SW620   CCL-227   结肠   转移腺癌
  HAC8   SW480   CCL-228   结肠   转移腺癌
  HAC9   SW1116   CCL-233   结肠   II级结肠直肠腺癌
  HAC10   HT-29   HTB-38   结肠   II级结肠直肠腺癌
  HAC11   FHC   CRL-1831   结肠   正常粘膜结肠
  HAC12   CCD841CoN   CRL-1790   结肠   正常结肠
  HAPR1   PC-3   CRL-1435   前列腺   转移腺癌
  HAPR2   LNCaPFGC   CRL-1740   前列腺   转移腺癌
  HAPR3   MDAPca2b   CRL-2422   前列腺   转移腺癌
  HAPR4   DU145   HTB-81   前列腺   转移癌
HyperAcuteTM全细胞癌症疫苗通过在存在10μg/mL的硫酸鱼精蛋白的情况下用来自293Z.CKG的逆转录病毒上清转导表1所示的细胞系来建立。使用0-2605抗αGal抗体(NewLink)将转导细胞群对αGal细胞表面表位染色。使用FACS分选仪将在细胞表面具有最大αGal表位表达强度的5％的细胞群分选为分离的亚群。分选的具有最大αGal表位表达的转导细胞亚群如表1所示。扩展这些细胞(分裂比率1∶5)以产生母细胞库(mastercell bank)(MCB)。监测生长模式、形态表现和αGal表位表达的平均强度并在培养的整个增殖期间保持稳定。通过在培养瓶在37℃±1在5％±1％CO2下扩展细胞来发展MCB。培养基是补充了10％胎牛血清(FBS)和2mm L-谷氨酰胺的RPMI-1640。每一代细胞用胰蛋白酶消化，计数并通过胎盘蓝排除分析细胞存活率。增殖细胞以提供10亿个细胞，收集、混合、分装到100个冷冻管中，使用自动控制冷冻室(programmed ratefreezing chamber)冷冻。细胞存储在液氮存储罐的气相中。从MCB发展每个细胞系的工作细胞库(WCB)。WCB扩展、收集、冷冻和存储的条件如对MCB所述的一样。从每个WCB产生每个HyperAcuteTM癌细胞系的生产批次(production lot)。当生产批次的细胞到达足够密度时，收集培养液(上清)，过滤并混合在无菌容器中。充分混合，然后无菌过滤到有标签的、无菌塑料瓶中。(标签含有产品名称、批号和装填日期)。冷冻装填瓶并在-60℃或以下储存。用等份进行安全测试。通过胰蛋白酶消化收集一个生产批次的细胞，混合并重悬在完全培养基中。混合的细胞在150-200Grey下照射。在6MV光子模式下使用Varian Clinic 2100C医学线性加速器照射细胞。机器的照射输出在水中使用AAPM TG-51校准方案进行校准。每天监测输出密度，并且用NIST校准示踪离子室/静电计剂量计每月一次检查输出校准。离心照射的细胞并重悬于由5％甘油和人血清白蛋白组成的最终注射制剂中。然后，将相应于剂量水平I、II、III和IV的0.4ml的密度为1×106/0.2ml、3.5×106/0.2ml、1×107/0.2ml和3.5×107细胞/0.2ml的细胞分装于无菌冷冻管中。HyperAcuteTM细胞MCB、WCB和PL质量控制测试涉及细胞和上清。HyperAcuteTM癌症疫苗MCB、WCB和PL细胞的验收标准存在于裸鼠致瘤性的分析中。
实施例13
用于人类患者的剂量水平和剂量方案
以下数据支持了提出的剂量水平和免疫方案。临床前小鼠毒理学研究示出每只小鼠可以很好地耐受表达αGal的同种异型和同系基因肿瘤直至1×106细胞，其相当于一个70kg的人耐受3.5×109个细胞。用在细胞表面天然表达αGal表位的鼠载体生产细胞(见2.1部分)的I期研究示出鼠VPC在剂量7×109个细胞时患者很好耐受。II期鼠VPC试验中患者经历了三个循环的治疗，每次治疗用7×109个细胞注射。患者非常耐受治疗。鼠VPC注射间隔6周重复。提出的剂量水平在小鼠αGal疫苗的很好耐受剂量的范围内(最大4×108个细胞/患者)。疫苗注射间隔4周可以有足够的时间评估治疗的毒理学和免疫应答成熟。I期鼠VPC研究数据表明抗αGal免疫应答在注射了表达αGal细胞后的14至21天之间达到最大。
实施例14
使用用携带鼠αGT基因的逆转录病毒载体转导的同系基因肿瘤疫苗的毒理学研究
在第一个研究中，小鼠皮下注射αGal(+)B16黑色素瘤细胞，剂量为每只小鼠1 105个细胞。排斥αGal(+)活黑色素瘤细胞的动物再次用αGal(-)B16攻击以证明αGal(+)黑色素瘤细胞的排斥诱导了肿瘤免疫。所有小鼠在用16第二次攻击后都存活。这些黑色素瘤保护动物(在第一次实验中n＝8，在第二次实验中n＝9)随后进行了6个月的长期毒性研究。对一些被保护的小鼠进行了组织学、血液学、临床观察毒性研究。组织病理学检查包括主要的灌流器官：肾、脾和肝，以及潜在的靶组织，皮肤和乳腺。评估安全性的组织学研究表明在检查的所有样品组织(皮肤、乳腺、肾、脾、肝)中没有明显病变。一些动物(包括对照小鼠)示出具有最小炎症细胞浸润的肾血管周炎。在测试组中这个观察的频率与动物对照组中的频率相似。血液学结果示出研究的所有值都在正常值的范围内。正常值来自首次用于实验的小鼠未操纵的αGal KO小鼠的包括行为的临床观察结果，在黑色素瘤保护小鼠(n＝17)的研究期间未观察到作为继发的可能的不利事件的自身免疫去色素化(vitiligo)或者毛皮变化。
在第二个研究中，小鼠皮下注射同种异型αGal(+)EMT-6乳腺细胞，剂量为每只小鼠1×106个细胞。免疫2、4和6周后，取得血液和组织样品进行毒理学研究。进行组织学和血液学毒性研究。组织病理学检查包括主要的灌流器官：肾、脾和肝，以及潜在的靶组织，皮肤和乳腺。评估安全性的组织学研究表明在检查的所有样品组织中(皮肤、乳腺、肾、脾、肝)没有明显的病变。一些动物(包括对照小鼠)示出具有最小炎症细胞浸润的肾血管周炎。在测试组中这个观察的频率与动物对照组的频率相似。血液学结果示出所有研究的值都在正常值的范围内。正常值来自首次用于实验的小鼠未操纵的αGal KO小鼠的结果。同种异型免疫后2周观察到瞬间嗜曙红性。在毒理学研究中使用的最大剂量是1×106细胞/小鼠。基于剂量/kg，假设小鼠是20克，则这个剂量对于人示出是剂量/小鼠相当于在70kg的人中3.5×109个细胞。在考虑小鼠的平均寿命大约为2年，与人平均为70年相比，长期毒性研究(6个月)相当于小鼠寿命的四分之一，大约是17年人的寿命。这些研究支持了目前每个患者4×108治疗时间为16周的剂量方案。
实施例15
HyperAcuteTM癌症疫苗的制备和将其给予患者的计划
这个方法描述了如何制备和给予人类患者所述全细胞癌症疫苗(本发明的药物组合物)。制备后立即将细胞注射给患者。不需要特异的安全考虑因为在冷冻前所给予的细胞已经被致死照射过。首先，从液氮容器中取出每种疫苗细胞系的冷冻管。然后，通过将上述冷冻内容物浸没在37℃水浴中同时融化所有冷冻管。一旦管融化了，用70％酒精冲洗表面。含有所述疫苗的每种细胞系成分的管的等量内容物被组合在一个注射用的注射器中并立即注射给患者。用25号针头使用结核菌素注射器皮内(i.d.)注射疫苗细胞。以旋转方式在臂部和腿部进行注射。在第1、29、57和85天给予HAB疫苗细胞。在门诊所由护理人员在每次注射后监测患者2小时。患者监测包括：温度(T)、脉搏(P)、血压(BP)和呼吸速度(R)，在给予疫苗前的30分钟内，以及在免疫后每15分钟检查一次×4，然后每30分钟一次×2。在离开诊所前检查温度。另外，监测患者的急性反应迹象，包括局部或弥散性皮疹和其它不利反应。经历II级或更严重的急性不利事件的患者可以在诊所中被监测额外1-2小时，直至该事件消退低于II级。如果尽管观察和/或治疗，II级或更严重的AE持续多于4小时，决定是否继续观察、开始或修改治疗，或者允许患者住院。
实施例16
确定最大耐受剂量
在3个合格患者的剂量队列(dose cohort)中进行治疗。最大耐受剂量(MTD)如以下剂量队列所限定，其中可见剂量限制毒性(dose-limitingtoxicity，DLT)。如果在剂量队列中＞33％的患者(即1/3或2/4-6)出现DLT，则确定了MTD并且不允许进一步增加剂量。如果在剂量队列中3个患者中的1个(1/3)出现DLT，则扩大该队列直至总共6个患者。如果观察到另一个DLT，则结束该队列，限定MTD并且不允许进一步增加剂量。如果在队列中没有观察到其它DLT，则增加到下一个更高的剂量队列。在研究的II期部分在MTD治疗患者。
在剂量队列中最后一个患者的进入和下一个更高的剂量队列中第一个患者的进入之间最少需要4周的间隔。
        表2治疗计划
 队列 患者(N＝3) 疫苗HAB细胞
A 3 3×106
B 3 1×107
C 3 3×107
D 3 1×108*
*由于使用细胞的数目/体积，注射位点可能被分开。
在这个研究中使用由实体瘤应答评估标准委员会(ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors Committee，RECIST)提出的新的国际标准评估应答和进展。只将肿瘤病变的最大直径(线性测量)上的变化用于RECIST标准。使用以下提供的标准，病变或者是可测量的或不可测量的。指测量性(measurability)的术语“可评估的”将不使用，因为其不提供额外的意义或准确性。可测量的病变定义为可以在至少一个维度(被记录的最长直径)上被准确测量，如用常规技术(CT、MRI、x-射线)≥20mm或者用螺旋CT扫描≥10mm。所有肿瘤测量必须以毫米记录(或者厘米的小数部分)。所有其它病变(或疾病位点)，包括小的病变(用常规技术最长直径＜20mm或用螺旋CT扫描＜10mm)，被认为是不可测量的疾病。骨病变、柔脑膜疾病、腹水、胸腔或心包渗漏、皮肤淋巴管炎或肺炎、炎症性胸病、腹块(abdominal masses)(不通过CT或MRI)，和囊性病变被认为是不可测量的。每个器官最多5个病变和代表所有涉及器官的总共10个病变的所有可测量的病变应被鉴定为靶病变并记录并在基线测量。基于其大小(具有最大直径的病变)和其对于准确重复测量(通过呈像技术或临床)的适合性选择靶病变。计算对于所有靶病变的最长直径(LD)的总和并作为基线总和LD。基线总和LD被用于定性目标肿瘤应答的参考。所有其它病变(或疾病位点)应被鉴定为非靶病变并还应被在基线记录。非靶病变病变包括超出了每个器官的最大数目或所有涉及的器官的总数的可测量病变以及不可测量病变。不需要测量这些病变，但是在整个实验中应该注意每一种的存在或不存在。所有的测量应该使用尺子或优选测径器以公制进行及记录。所有基线评估应该在尽可能接近治疗开始时进行，并且不多于治疗开始前2周。位于预先照射区域的肿瘤病变不认为是可测量的。临床病变当其是表面病变(例如皮肤瘤和明显的淋巴结)时才被认为是可测量的。在皮肤病变的情况中，推荐使用数字彩色照相文件，包括尺子以估计病变大小。胸x-射线病变当其被清楚限定并被充气的肺包围时可被接受为可测量的病变。然而，优选CT。常规计算机断层摄影术(CT)和磁共振呈像(MRI)应该用10mm或更低的层厚连续进行。螺旋CT应该用5mm连续重组算法进行。这应用于胸部、腹部和骨盆肿瘤。头和颈部肿瘤和四肢的那些通常需要特异的方案。当研究的主要目的是目标应答评估时利用超声(US)。US不应用于测量肿瘤病变。然而，其可能是临床测量表面明显淋巴结、皮下病变和甲状腺结节的替代方法。US还可以用于证实通常通过临床检查评估的表面病变的完全消失。内窥镜检查和腹腔镜检查用于目标肿瘤评估，其尚未被完全和广泛验证。其在本文中的应用需要复杂的设备和高昂的花费，其只能在一些中心获得。因此，这种技术用于目标肿瘤应答的应用被限制在在某些中心中用于验证目的。然而，当进行活组织检查时，这种技术可以用于证实完全的病理学应答。单独的肿瘤标记不能用于评价胸部肿瘤应答。在极少情况下(例如肿瘤类型如生殖细胞瘤中的残余病变，其中已知可能保留有残余良性肿瘤)，细胞学和组织学可以用于区分部分应答(PR)和完全应答(CR)。当可测量肿瘤满足应答或稳定疾病的标准时，任何渗出物的致瘤性起源的细胞病理学证实必须用于区分应答或稳定疾病(渗出物可以是治疗的副作用)和进展性疾病。
根据上文，可以看出本发明至少实现了其所有目的。本文引用的所有参考文献在此以其全文并入参考。
                           序列表
<110>衣阿华中央卫生系统
<120>使用表达a(1，3)-半乳糖基转移酶的同种异型肿瘤细胞的抗肿瘤免疫
<130>P05859WO0
<140>PCT/US03/32036
<141>2003-10-09
<150>US 60/417,343
<151>2002-10-09
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>7703
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Retroviral vector pLNC-KG
<400>1
tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat    60
ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc    120
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cgcgggcttc tgcctcttag accactctac cctattcccc acactcaccg gagccaaagc    7680
cgcggccctt ccgtttcttt gct                                            7703
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Forward primer
<400>2
 acaaaagctt gacatggatg tcaagggaaa agtaat                            36
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Reverse primer
<400>3
aattatcgat tcagacatta tttctaac                                     28

Claims (98)

1.一种抑制在合成抗αGal的动物中存在的肿瘤细胞的药物组合物，其包含：减毒的疫苗肿瘤细胞的混合物及载体，所述细胞包含α(1，3)-半乳糖基转移酶编码序列和多种存在αGal表位的细胞表面糖蛋白和糖脂。
2.一种在合成抗αGal的动物中同时刺激针对多种肿瘤抗原而无论其糖基化状态如何的免疫应答的药物组合物，其包含：减毒的全疫苗肿瘤细胞混合物及适当的载体，所述细胞编码α(1，3)-半乳糖基转移酶蛋白和多种存在αGal表位的细胞表面糖蛋白和糖脂，以便完整肿瘤细胞中的抗原可以被呈递给免疫系统。
3.权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞选自以下细胞组成的组中：大细胞癌、鳞状细胞癌、腹水腺癌、胸腔积液癌、原发导管上皮癌、转移性腺癌、原发腺癌、透明细胞癌、卵巢腺癌、卵巢畸胎癌、恶性黑色素瘤、结肠直肠癌、结肠直肠腺癌和II级结肠直肠腺癌。
4.权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞来自A549细胞。
5.权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞来自NCI-H460细胞。
6.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自NCI-H520细胞。
7.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自MCF-7细胞。
8.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自BT-20细胞。
9.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自HPAF-II细胞。
10.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自PANC-1细胞。
11.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自ASPC-1细胞。
12.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自BxPC3细胞。
13.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自IGROV细胞。
14.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自ES-2细胞。
15.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自NIH:OVCAR3细胞。
16.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自COLO829细胞。
17.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自G-361细胞。
18.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自HCT-116细胞。
19.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自COLO205细胞。
20.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自LoVo细胞。
21.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自WiDr细胞。
22.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自DLD-1细胞。
23.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自HCT-15细胞。
24.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自SW620细胞。
25.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自SW480细胞。
26.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自SW1116细胞。
27.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自HT-29细胞。
28.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自FHC细胞。
29.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自CCD841CoN细胞。
30.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自PC-3细胞。
31.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自LNCaPFGC细胞。
32.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自MDAPca2b细胞。
33.权利要求1的组合物，其中所述疫苗肿瘤细胞来自DU145细胞。
34.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAL1。
35.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAL2。
36.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAL3。
37.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAB1。
38.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAB2。
39.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPA1。
40.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPA2。
41.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPA3。
42.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPA4。
43.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAO1。
44.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAO2。
45.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAO3。
46.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAO4。
47.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAM1。
48.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAM2。
49.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAM3。
50.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC1。
51.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC2。
52.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC3。
53.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC4。
54.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC5。
55.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC6。
56.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC7。
57.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC8。
58.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC9。
59.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC10。
60.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC11。
61.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAC12。
62.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPR1。
63.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPR2。
64.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPR3。
65.权利要求1的组合物，其中所述组合物是HAPR4。
66.权利要求1的组合物，进一步包含佐剂。
67.一种在合成抗αGa1的动物中诱导抗肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物，其包含：减毒的肿瘤细胞混合物及载体，所述细胞包含α(1，3)-半乳糖基转移酶编码序列和多种存在α-半乳糖基表位的细胞表面糖蛋白或糖脂，所述肿瘤细胞选自由如下细胞组成的组中：A549、NCI-H460、NCI-H520、MCF-7、BT-20、HPAF-II、PANC-1、ASPC-1、BxPC3、IGROV、ES-2、NIH:OVCAR3、PA-1、A375、COLO829、G-361、HCT-116、COLO205、LoVo、WiDr、DLD-1、HCT-15、SW620、SW480、SW116、HT-29、FHC、CCD841CoN、PC-3、LNCaPFGC、MDAPca2b和DU145。
68.一种在动物中治疗肺组织肿瘤细胞的药物组合物，其包含一或多种选自HAL1、HAL2或HAL3的细胞系。
69.一种在动物中治疗乳腺组织肿瘤细胞的药物组合物，其包含一或多种选自HAB1或HAB2的细胞系。
70.一种在动物中治疗胰腺组织肿瘤细胞的药物组合物，其包含一或多种选自HAPA1、HAPA2、HAPA3或HAPA4的细胞系。
71.一种在动物中治疗卵巢组织肿瘤细胞的药物组合物，其包含一或多种选自HAO1、HAO2、HAO3或HAO4的细胞系。
72.一种在动物中治疗黑色素瘤肿瘤细胞的药物组合物，其包含一或多种选自HAM1、HAM2或HAM3的细胞系。
73.一种在动物中治疗结肠组织肿瘤细胞的药物组合物，其包含一或多种选自HAC1、HAC2、HAC3、HAC4、HAC5、HAC6、HAC7、HAC8、HAC9、HAC10、HAC11或HAC12的细胞系。
74.一种在动物中治疗前列腺组织肿瘤细胞的药物组合物，其包含一或多种选自HAPR1、HAPR2、HAPR3或HAPR4的细胞系。
75.一种制备治疗性药物组合物的方法，包括：获得活的肿瘤细胞的收集物，用编码表达α(1，3)-半乳糖基转移酶的核苷酸序列转化所述细胞，以便所述α(1，3)-半乳糖基转移酶在所述细胞的多种细胞表面糖蛋白上合成α-半乳糖基表位，收集所述肿瘤细胞以形成具有多种糖蛋白的细胞的混合物，所述糖蛋白具有α-半乳糖基表位，并且杀伤所述细胞。
76.权利要求75的方法，其中所述细胞是同种异型的。
77.权利要求75的方法，其中所述细胞是同系基因的。
78.权利要求75的方法，其中所述细胞是自体的。
79.权利要求75的方法，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶编码序列是鼠源序列。
80.权利要求75的方法，其中所述杀伤所述细胞的步骤是通过γ或紫外线照射。
81.权利要求75的方法，其中所述转化步骤包括通过载体介导导入所述α(1，3)-半乳糖基转移酶编码多核苷酸序列。
82.权利要求81的方法，其中所述载体是质粒载体。
83.权利要求81的方法，其中所述载体是病毒载体。
84.权利要求83的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
85.一种通过权利要求1的方法生产的治疗性药物组合物。
86.一种在动物中诱导免疫介导的肿瘤细胞破坏的方法，包括：给予具有所述细胞的动物减毒的肿瘤细胞的混合物，所述细胞包含多种存在αGal表位的细胞表面糖蛋白。
87.一种治疗具有肿瘤细胞的动物的方法，包括：给予所述动物治疗有效量的组合物，所述组合物包含减毒的肿瘤细胞的混合物，所述肿瘤细胞用编码α(1，3)-半乳糖基转移酶蛋白的多核苷酸遗传修饰，所述细胞选自自体、同系基因和同种异型肿瘤细胞。
88.权利要求87的方法，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶多核苷酸来源于鼠。
89.权利要求87的方法，其中所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2的序列具有至少大约70％氨基酸序列相同性或85％氨基酸序列相似性的α(1，3)-半乳糖基转移酶。
90.权利要求87的方法，其中通过一种载体将α(1，3)-半乳糖基转移酶基因导入细胞中。
91.权利要求90的方法，其中载体是病毒载体。
92.权利要求91的方法，其中病毒载体基于鼠逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
93.一种在动物中治疗已经存在的肿瘤细胞的方法，包括：向所述细胞中导入治疗有效剂量的致死性照射过的表达α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的同种异型、同系基因或自体肿瘤细胞。
94.权利要求93的方法，其中α(1，3)-半乳糖基转移酶多核苷酸来源于鼠。
95.权利要求93的方法，其中所述基因编码与SEQ ID NO：2的序列具有至少大约70％氨基酸序列相同性或85％氨基酸序列相似性的α(1，3)-半乳糖基转移酶。
96.权利要求93的方法，其中通过一种载体将α(1，3)-半乳糖基转移酶基因导入细胞中。
97.权利要求96的方法，其中载体是病毒载体。
98.权利要求97的方法，其中病毒载体基于鼠逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
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