ES2341335T3

ES2341335T3 - Vacuna anti-turmor que utiliza celulas tumorales alogenicas que codifica alfa(1,3)-galactosil trnsfersa.

Info

Publication number: ES2341335T3
Application number: ES03779090T
Authority: ES
Inventors: Charles J. Link, Jr.; Tatiana Seregina; Gabriela Rossi
Original assignee: Central Iowa Health System
Current assignee: Central Iowa Health System
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2010-06-18
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: EP1549353A2; US20110250233A1; US20070014775A1; WO2004032865A2; US9474801B2; US20040191229A1; JP2006507267A; DK1549353T3; US20140037692A1; CN1756568A; EP1549353B1; US7763461B2; CN104911210A; WO2004032865A3; US8535658B2; CA2501744C; AU2003285863A8; AU2003285863A1; MXPA05003705A; US20070014774A1

Abstract

Una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de un tumor preestablecido en un animal que sintetice anti-αGal que comprende: una mezcla de células tumorales vacuna atenuadas alogénicas para dicho animal, conteniendo dichas células una secuencia que codifica α(1,3)-galactosiltransferasa y una pluralidad de glicoproteínas o glicolípidos en la superficie celular sobre las cuales está presente un epítopo αGal, y un vehículo.

Description

Vacuna anti-tumor que utiliza células tumorales alogénicas que codifica \alpha(1,3)-galactosiltransferasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones para el tratamiento del cáncer mediante la estimulación de las respuestas inmunes humoral y celular contra las células tumorales. En particular, esta invención está dirigida a métodos para estimular la destrucción de células tumorales mediada por la estimulación del complemento y la estimulación simultánea de la producción de anticuerpos específicos contra el tumor y de células citotóxicas específicas contra el tumor.

Antecedentes de la invención

Una barrera primaria para el xenotrasplante ha sido el reconocimiento esencialmente inmediato de epítopos carbohidratados presentes en el tejido foráneo que causa un rechazo hiperagudo del xenotrasplante (HAR). La reacción comienza inmediatamente después de la reperfusión y, una vez iniciada, destruye el tejido foráneo en un periodo que va desde minutos hasta unas cuantas horas. Se ha postulado que la presencia de HAR en ciertas combinaciones donante/receptor, aunque no otras, está relacionada con dos factores primarios, a) la unión de anticuerpos naturales xenorreactivos del receptor a antígenos o células endoteliales del injerto y b) la incompatibilidad de proteínas reguladoras del complemento en el trasplante con el sistema del complemento del receptor, permitiendo una activación incontrolada del complemento. Más del 1% de los anticuerpos naturales que fijan el complemento en el suero humano reconocen una sola estructura Gal\alpha(1-3)Gal\beta(1,4)GlcNAc-R. La síntesis de Gal\alpha(1-3)Gal\beta(1,4)GlcNAc-R está catalizada por el enzima \alpha(1,3)-galactosiltransferasa (\alphaGT).

Este enzima cataliza la síntesis de epítopos \alpha-galactosilo (\alphaGal) en el aparato de Golgi de células de diferentes mamíferos no primates mediante la reacción siguiente:

Gal\beta(1,4)GlcNAc-R + UDP-Gal \rightarrow Gal\alpha(1-3)Gal\beta(1,4)GlcNAc-R

Se encontró que este enzima era activo en los monos del nuevo mundo pero no en los monos del viejo mundo ni en humanos. El ADNc de la \alphaGT ha sido clonado a partir de bibliotecas de ADNc bovino y murino. Larson, R.D. y col. (1989) "Isolation of a cDNA Encoding Murine UDP galactose; \beta-D-galactosyl-(1,4)-N Acetyl-D-Glucosamine \alpha-(1,3)Galactosyl Transferase: Expression Cloning by Gene Transfer", PNAS, USA 86:8227; y Joziasse, D.H. y col. (1989) "Bovine \alpha-(1,3) Galactosyl Transferase: Isolation and Characterization of a cDNA Clone, Identification of Homologous Sequences in Human Genomic DNA", J. Biol. Chem. 264:14290.

El gen está presente en el genoma humano, aunque no se ha detectado transcripción. En lugar de ello, se encontraron dos mutaciones por desplazamiento del marco (deleciones que generan codones de parada prematuros) en los exones humanos que codifican el enzima. Ver en general, Galili, Uri, "Evolution in Pathophysiology of the Human Natural anti-\alpha-Galactosyl IgG (anti-\alphaGal) Antibody", Springer Semin. Immunopathol. (1993) 15:155-171.

El anti-\alphaGal, un anticuerpo existente de forma natural presente en todos los humanos, interacciona específicamente con el epítopo carbohidratado Gal\alpha(1-3)Gal\beta(1,4)GlcNAc-R (epítopo \alphaGal). Este anticuerpo no interacciona con ningún otro epítopo carbohidratado conocido producido por células de mamífero (Galili, 1993, Springer Seminar. Immunopathology 15:153). El anti-\alphaGal constituye el 1% aproximadamente de la IgG circulante (Galili y col., 1984, J. Exp. Med. 160:1519) y se encuentra también en forma de IgA e IgM (Davine y col., 1987, Kidney Int. 31:1132; Sandrin y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11391). Es producido por el 1% de los linfocitos B circulantes (Galili y col., 1993, Blood 82:2485). La producción de este Ab anti-\alphaGal natural en humanos está estimulada constantemente por la presencia de residuos carbohidratados \alphaGal presentes en la flora bacteriana intestinal y pulmonar. En humanos, el anti-\alphaGal reacciona a la presencia de este epítopo en el rechazo hiperagudo de xenotrasplantes y el complemento es rápido y seguro, teniendo como resultado la destrucción de los tejidos foráneos en un periodo de minutos a horas. Galili y col. [J. Haematol. & Stem. Cell Res. - (2001) 10:501-511] describen la preparación de vacunas autólogas contra la leucemia y el linfoma que expresan epítopos \alphaGal.

Es un objeto de esta invención desarrollar una vacuna terapéutica contra el cáncer mediante la introducción en las células tumorales del gen que codifica \alphaGT, manejar la adición de epítopos \alphaGal a tales células tumorales de la vacuna con el fin de permitir la opsonización incrementada de las células de la vacuna por los anticuerpos anti-\alphaGal naturales y estimular la presentación de los antígenos tumorales con el fin de inducir una respuesta inmune humoral y celular hacia los antígenos específicos del tumor.

Es un objeto adicional de esta invención proporcionar una composición farmacéutica terapéutica conteniendo células tumorales recombinantes que expresen y procesen \alphaGT con el fin de construir epítopos \alphaGal en las células.

Es un objeto más de la invención proporcionar composiciones y métodos para el tratamiento de tumores, virus, células neoplásicas u otras células, que crecen y eluden la respuesta inmune celular y tumoral.

Otros objetos de la invención resultarán obvios a partir de la descripción de la invención que sigue a continuación.

Resumen de la invención

La invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de un tumor preestablecido en un animal que sintetice un anti-\alphaGal que comprende: una mezcla de células tumorales atenuadas vacuna alogénicas para dicho animal, conteniendo dichas células una secuencia que codifica \alpha(1,3)-galactosiltransferasa y una pluralidad de glicoproteínas o glicolípidos en la superficie celular sobre los cuales está presente un epítopo \alphaGal, y un vehículo.

La invención proporciona además una composición farmacéutica para estimular una respuesta inmune hacia una pluralidad de antígenos tumorales simultáneamente, independientemente de su estado de glicosilación, en un animal que sintetice anti-\alphaGal portador de un tumor preestablecido, que comprende: una mezcla de células tumorales completas vacuna atenuadas alogénicas para dicho animal, codificando dichas células una proteína \alpha(1,3)-galactosiltransferasa y una pluralidad de glicoproteínas o glicolípidos de la superficie celular sobre los cuales está presente un epítopo \alphaGal, de tal manera que los antígenos de la célula tumoral completa puedan ser presentados al sistema inmune, y un vehículo adecuado.

La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune contra células tumorales en un animal que sintetice un anti-alfa gal portador de un tumor preestablecido, que comprende: una mezcla de células tumorales atenuadas alogénicas para dicho animal, conteniendo dichas células una secuencia que codifica \alpha(1,3)-galactosiltransferasa y una pluralidad de glicoproteínas o glicolípidos en la superficie celular en los cuales está presente un epítopo \alpha-galactosilo, donde dichas células tumorales derivan del grupo de células A549, NCI-H460, NCI-H520, MCF-7, BT-20, HPAF-II, PANC-1, ASPC-1, BxPC3, IGROV, ES-2, NIH:OVCAR3, PA-1, A375, COLO829, G-361, HCT-116, COLO205, LoVo, WiDr, DLD-1, HCT-15, SW620, SW480, SW1116, HT-29, FHC, CCD841CoN, PC-3, LNCaPFGC, MDAPca2b o DU145; y un vehículo.

En otro aspecto, la invención proporciona la utilización de una mezcla de células tumorales atenuadas alogénicas para un paciente con células tumorales preestablecidas, expresando dichas células el gen de la \alpha(1,3)-galactosiltransferasa y conteniendo una pluralidad de glicoproteínas en la superficie celular sobre las cuales está presente un epítopo \alphaGal, en la producción de un medicamento para inducir en dicho paciente la destrucción de las células tumorales mediada por el sistema inmune, donde dicho paciente es un animal que sintetice anti-\alphaGal.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona la utilización de una composición que contiene una mezcla de células tumorales atenuadas alogénicas para un animal que sintetice anti-\alphaGal con un tumor preestablecido, y modificadas genéticamente con un polinucleótido que codifica una proteína \alpha(1,3)-galactosiltransferasa, en la fabricación de un medicamento para tratar a dicho animal.

Está proporcionada además por la invención la utilización de células tumorales irradiadas letalmente alogénicas para un animal que sintetice anti-\alphaGal con células tumorales preestablecidas, y que expresan el gen de la \alpha(1,3)-galactosiltransferasa, en la fabricación de un medicamento para tratar a dicho animal.

Esta invención se refiere a composiciones para producir una respuesta inmune a protocolos terapéuticos con el fin de expresar un epítopo \alphaGal. Las células son posteriormente destruidas (mediante irradiación gamma o ultravioleta, calor, formaldehído, etcétera) y administradas a un paciente. El epítopo \alphaGal produce la opsonización de la célula tumoral que incrementa la presentación de antígenos específicos del tumor presentes en la célula tumoral completa. Una característica importante de la invención contempla la utilización de células completas en las composiciones farmacéuticas para ser utilizadas de acuerdo con la invención. Esto proporciona el procesamiento de los antígenos asociados al tumor presentes en la célula tumoral completa, independientemente de si esas proteínas han sido o no afectadas por la adición de epítopos \alphaGal. Como las modificaciones de \alphaGal afectan a múltiples glicoproteínas y glicolípidos de la superficie celular, el sistema inmune del animal tendrá una mayor oportunidad para detectar, procesar y generar anticuerpos y una respuesta inmune celular hacia los antígenos específicos del tumor. El sistema inmune del animal es por tanto estimulado para que produzca anticuerpos y células inmunes específicos para el tumor, los cuales atacarán y destruirán las células tumorales negativas para \alphaGal presentes en el animal que lleva los antígenos asociados al tumor que son comunes con los proporcionados por la vacuna de células completas producida.

Una composición farmacéutica para ser utilizada de acuerdo con la invención es generada introduciendo una secuencia polinucleotídica, que codifica tras la expresión la \alphaGT murina, en células tumorales completas ex vivo. Las células tumorales receptoras son alogénicas, pero se describe también la utilización de células tumorales singénicas o autólogas. La secuencia es introducida mediante cualquier vehículo para la transferencia de nucleótidos que puede comprender un vector vírico o no vírico, un plásmido o células productoras de vectores que produzcan partículas víricas activas. Estos vehículos para la transferencia de genes transforman las células tumorales y producen la expresión del material genético foráneo insertado en las mismas. El producto génico resultante cataliza la síntesis del epítopo \alphaGal en las glicoproteínas y glicolípidos de la superficie celular presentes en dichas células. La invención contempla la utilización de células tumorales completas con múltiples glicoproteínas en la superficie celular para maximizar la unión de los epítopos \alphaGal a los anticuerpos anti-\alphaGal preexistentes, incrementando así la unión de estos complejos a los receptores Fc presentes en las células presentadoras de antígeno y desencadenando de este modo la presentación de antígenos de una pluralidad de antígenos asociados al tumor presentes en dicha célula tumoral vacuna. En una realización más preferida, múltiples tipos de células transformadas pueden ser administradas procedentes del mismo tipo de tejido o del mismo tipo de cáncer, incrementando así adicionalmente el número de epítopos diferentes proporcionados con el fin de incrementar la probabilidad de una mejora completa de las células tumorales presentes en el individuo.

Se describe en la presente una composición farmacéutica, y un método para producir la misma, que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una mezcla de células tumorales atenuadas, comprendiendo dicha mezcla una pluralidad de glicoproteínas de la superficie celular que incluyen un epítopo \alphaGal y un vehículo. Las células son preferiblemente células completas. Los métodos para producir las composiciones incluyen la obtención de una colección de células tumorales vivas, la transformación de dichas células con una secuencia de nucleótidos que codifica tras la expresión una \alphaGT, de tal manera que un epítopo \alphaGal es presentado en las glicoproteínas de la superficie celular de dichas células. Las células son posteriormente destruidas y combinadas con un vehículo farmacéutico para la administración.

Definiciones

Diferentes términos relacionados con las composiciones y métodos de la presente invención son utilizados en la presente anteriormente y también a lo largo de la especificación y las reivindicaciones.

Las unidades, prefijos y símbolos pueden estar indicados en su forma aceptada del SI. A no ser que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango e incluyen cada número entero dentro del rango definido. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por su símbolo comúnmente conocido de tres letras o por el símbolo de una letra recomendado por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, de igual modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. A no ser que se proporcionen de otro modo, los términos de los programas de ordenador, eléctricos y electrónicos, según se utilizan en la presente, son según están definidos en The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5ª edición, 1993). Los términos definidos posteriormente están definidos con todo detalle tomando como referencia a la especificación como un todo.

El término "secuencia que codifica la \alpha-(1,3)-Galactosil Transferasa", o "secuencia que codifica \alphaGT", significa cualquier secuencia polinucleótida que codifica una proteína que forma epítopos \alpha-galactosilo (\alphaGal) mediante la reacción siguiente:

Gal\beta(1,4)GlcNAc-R + UDP-Gal \rightarrow Gal\alpha(1-3)Gal\beta(1,4)GlcNAc-R

Ésta puede incluir variantes, modificaciones, truncamientos, etcétera, así como secuencias murinas, bovinas o secuencias de cualquier otro origen conocidas por los expertos en la técnica y disponibles en Genbank, en otras publicaciones o bases de datos, que conserven la función de la reacción anteriormente mencionada. Típicamente, tales secuencias serán al menos un 80% homólogas o más a las secuencias de \alphaGT de ratón o bovinas descritas en la presente.

Por "amplificada" se indica la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o de múltiples copias complementarias a la secuencia de ácido nucleico utilizando al menos una de las secuencias de ácido nucleico como molde. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, Canteen, Mississauga, Ontario), los sistemas de la Replicasa Q-Beta, los sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS) y la amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA). Ver, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D.H. Persing y col., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). El producto de la amplificación es denominado amplicón.

El término "animal", según se utiliza en la presente, debe ser considerado para que incluya todos los animales que sinteticen anti-\alphaGal, incluyendo aquéllos que no se sabe todavía que sintetizan anti-\alphaGal. Por ejemplo, se sabe que ciertos animales tales como los de la especie aviar, no sintetizan epítopos \alphaGal. Debido a la relación recíproca única entre los animales que sintetizan anti-\alphaGal o epítopos \alphaGal, se cree que muchos animales no analizados hasta ahora en los cuales están ausentes epítopos \alphaGal pueden demostrar ser animales que sinteticen anti-\alphaGal. La invención incluye también estos animales.

El término "anticuerpo" incluye la referencia a las formas de los anticuerpos que se unen al antígeno (por ejemplo, Fab, F(ab)_{2}). El termino "anticuerpo" se refiere frecuentemente a un polipéptido codificado sustancialmente por el gen de una inmunoglobulina o por genes de inmunoglobulinas, o a fragmentos del mismo que se unen a, y reconocen, específicamente un analito (antígeno). Sin embargo, aunque varios fragmentos de anticuerpos pueden ser definidos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, una persona con experiencia apreciará que tales fragmentos pueden ser sintetizados de novo ya sea químicamente o mediante la utilización de la metodología del ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, según se utiliza en la presente, incluye también fragmentos de anticuerpo tales como Fv de cadena individual, anticuerpos quiméricos (esto es, que contienen regiones constantes y variables de diferentes especies), anticuerpos humanizados (esto es, que contienen una región determinante de la complementariedad (CDR) de origen no humano) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos).

El término "anti-\alphaGal" incluye cualquier tipo o subtipo de inmunoglobulina que reconozca el epítopo \alphaGal, tal como un anticuerpo IgG, IgA, IgE o IgM anti-\alphaGal.

Según se utiliza en la presente, el término "antígeno" indica cualquier molécula biológica (proteínas, péptidos, lípidos, glucanos, glicoproteínas, glicolípidos, etc.) que sea capaz de inducir una respuesta inmune contra sí misma o contra porciones de la misma, incluyendo pero sin limitarse a, antígenos asociados a tumores y antígenos víricos, bacterianos, de parásitos y fúngicos.

Según se utiliza en la presente, el término "presentación del antígeno" indica el mecanismo biológico mediante el cual los macrófagos, las células dendríticas, las células B y otros tipos de células presentadoras de antígeno procesan antígenos internos o externos para dar subfragmentos de esas moléculas y presentar los mismos formando complejos con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I o de clase II o con moléculas CD1 en la superficie celular. Este proceso da lugar a la estimulación del crecimiento de otros tipos de células del sistema inmune (tales como células CD4^{+}, CD8^{+}, B y NK), que son capaces de reconocer específicamente esos complejos y mediar una respuesta inmune contra esos antígenos o contra las células que presentan esos antígenos.

El término "variantes modificadas de manera conservadora" aplica a secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos y tiene la intención de que las mismas sean incluidas siempre que se haga referencia a una secuencia específica. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de manera conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes de las secuencias de aminoácidos idénticas o modificadas de manera conservadora. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos ellos el aminoácido alanina. Por tanto, en cualquier posición en la que una alanina esté especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de los ácidos nucleicos son "variaciones silentes" y representan una especie de variación modificada de manera conservadora. Todas las secuencias de ácidos nucleicos de la presente que codifican un polipéptido, describen también, tomando como referencia el código genético, todas las variaciones silentes posibles del ácido nucleico. Una persona con experiencia habitual reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina; y UGG, que es normalmente el único codón para triptófano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención está implícita en cada secuencia polipeptídica descrita y está dentro del ámbito de la presente invención.

En lo que se refiere a las secuencias de aminoácidos, una persona con experiencia reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales en un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteínas que alteren, añadan o eliminen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada, constituyen una "variante modificada de manera conservadora" en la que la alteración tiene como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Los seis grupos siguientes contienen cada uno de ellos aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D); Ácido glutámico (E);

3) Asparragina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Ver también, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company.

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Definimos el "porcentaje de identidad de secuencias" de dos secuencias de aminoácidos, como el número de aminoácidos idénticos compartidos por estas dos secuencias de aminoácidos, después de alinear el par de secuencias, dividido por la longitud total de la secuencia más corta del par.

Definimos el "porcentaje de similitud de secuencias" de dos secuencias de aminoácidos, como el número de aminoácidos idénticos más las sustituciones de aminoácidos conservadoras compartidos por estas dos secuencias después de alinear el par de secuencias, dividido por la longitud total de la secuencia más corta del par.

Por "codificando" o "codificaba", "codifica", con respecto a un ácido nucleico especificado, se quiere indicar que contiene la información para su traducción en la proteína especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede contener secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias intermedias no traducidas (por ejemplo, como en el caso del ADNc). La información mediante la cual una proteína es codificada está especificada por la utilización de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal".

Cuando el ácido nucleico es preparado o alterado sintéticamente, pueden aprovecharse las preferencias de codones conocidas del huésped deseado en el cual el ácido nucleico va a ser expresado.

Con respecto a las proteínas o péptidos, el término "proteína (o péptido) aislada" o "proteína (o péptido) aislada y purificada" es a veces utilizado en la presente. Este término puede referirse a una proteína que haya sido separada suficientemente de otras proteínas con las cuales estaría asociada de forma natural, a fin de que exista en forma "sustancialmente pura". Alternativamente, este término puede referirse a una proteína producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico aislada.

Con referencia a las moléculas de ácido nucleico, se utiliza a veces el término "ácido nucleico aislado". Este término, cuando es aplicado al ADN, se refiere a una molécula de ADN que está separada de las secuencias con las cuales está inmediatamente contigua (en las direcciones 5' y 3') en el genoma existente en la naturaleza del organismo del cual deriva. Por ejemplo, el "ácido nucleico aislado" puede contener una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un vector plasmídico o vírico, o integrada en el ADN genómico de un procariota o de un eucariota. Una "molécula de ácido nucleico aislada" puede comprender también una molécula de ADNc. Con respecto a las moléculas de ARN, el término "ácido nucleico aislado" se refiere principalmente a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada según se definió anteriormente. Alternativamente, el término puede referirse a una molécula de ARN que ha sido separada suficientemente de las moléculas de ARN con las cuales estaría asociada en su estado natural (esto es, en células o tejidos), de tal manera que existe en forma "sustancialmente pura" (el término "sustancialmente pura" es definido posteriormente).

Según se utiliza en la presente, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico, es un ácido nucleico que procede de una especie foránea o que, si procede de la misma especie, está sustancialmente modificado con respecto a su forma nativa en la composición y/o en un locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de la que deriva el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados con respecto a su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse de una especie foránea o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada con respecto a su forma original por intervención humana deliberada.

Por "célula huésped" se indica una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o la expresión del vector. Las células huésped pueden ser células procarióticas tales como E. coli o células eucarióticas tales como células de levaduras, insectos, anfibios o mamíferos.

El término "introducido" en el contexto de la inserción de un ácido nucleico en una célula, indica "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye una referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica, en la cual el ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plastídico o mitocondrial), convertido en un replicón autónomo o expresado de manera transitoria (por ejemplo ARNm transfectado).

Según se utiliza en la presente, "marcador" incluye la referencia a un locus en un cromosoma que sirve para identificar una posición única en el cromosoma. Un "marcador polimórfico" incluye la referencia a un marcador que aparece en múltiples formas (alelos), de tal manera que las diferentes formas del marcador, cuando están presentes en un par homólogo, permiten seguir la transmisión de cada uno de los cromosomas de ese par. Un genotipo puede ser definido por la utilización de uno o de una pluralidad de marcadores.

Según se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma monocatenaria o bicatenaria, y a no ser que se limite de otro modo, incluye análogos conocidos que tengan la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en cuanto a que hibriden con ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a los nucleótidos existentes en la naturaleza (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

El término "opsonización" de un antígeno o de una célula tumoral indica la unión de los epítopos \alphaGal presentes en el antígeno o en la superficie de una célula tumoral a los anticuerpos anti-\alphaGal, intensificando de este modo la fagocitosis del antígeno opsonizado o de la célula tumoral opsonizada por macrófagos, células dendríticas, células B u otros tipos de células presentadoras de antígeno a través de la unión de la porción Fc de los anticuerpos a los receptores de Fc presentes en la superficie de las células presentadoras de antígeno.

Según se utiliza en la presente, "polinucleótido" incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribonucleótido o análogos de los mismos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en cuanto a que hibridan, bajo condiciones de hibridación rigurosas, con sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que los nucleótidos existentes en la naturaleza y/o permiten la traducción al(los) mismo(s) aminoácido(s) que el(los) nucleótido(s) existente(s) en la naturaleza. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. A no ser que se indique de otro modo, el término incluye la referencia a la secuencia especificada así como a la secuencia complementaria de la misma. Por tanto, ADNs o ARNs con esqueletos modificados por razones de estabilidad o por otras razones son considerados como "polinucleótidos" según ese término es deseado en la presente.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", son utilizados indistintamente en la presente para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial del aminoácido correspondiente existente en la naturaleza, así como a polímeros de aminoácidos existentes de forma natural. La naturaleza esencial de tales análogos de los aminoácidos existentes en la naturaleza es que, cuando son incorporados a una proteína, esa proteína es reactiva específicamente con anticuerpos producidos hacia la misma proteína pero que consta totalmente de aminoácidos existentes en la naturaleza. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", comprenden también modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, fosforilación, glucosilación, unión de lípidos, sulfación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación.

Según se utiliza en la presente, "recombinante" incluye la referencia a una célula o a un vector que ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos que son por lo demás expresados anormalmente, subexpresados o no expresados, como resultado de una intervención humana deliberada. El término "recombinante", según se utiliza en la presente, no incluye la alteración de la célula o del vector por acontecimientos que ocurren de forma natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) tales como los que tienen lugar sin una intervención humana deliberada.

Según se utiliza en la presente, un "casete de expresión recombinante" es una construcción de ácido nucleico, generada recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos de ácidos nucleicos especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El casete de expresión recombinante puede ser incorporado a un plásmido, a un cromosoma, a ADN mitocondrial, a ADN plastídico, a un virus o a un fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico que va a ser transcrito y un promotor.

Los términos "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido", son utilizados indistintamente en la presente para referirse a un aminoácido que está incorporado en una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido existente en la naturaleza y, a no ser que se limite de otro modo, puede incluir análogos no naturales de los aminoácidos naturales que puedan funcionar de manera similar a la de los aminoácidos existentes en la naturaleza.

El término "sustancialmente la misma" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos que tienen una variación de la secuencia que no afecta materialmente a la naturaleza de la proteína (esto es, a la estructura, a las características de estabilidad, a la especificidad de sustrato y/o a la actividad biológica de la proteína). Con referencia particular a las secuencias de ácidos nucleicos, el término "sustancialmente la misma" tiene la intención de referirse a la región codificadora y a las secuencias conservadas que dirigen la expresión, y se refiere principalmente a los codones degenerados que codifican el mismo aminoácido, o a codones alternativos que codifican aminoácidos sustitutos conservadores en el polipéptido codificado. Con referencia a las secuencias de aminoácidos, el término "sustancialmente la misma" se refiere en general a sustituciones y/o variaciones conservadoras en regiones del polipéptido no implicadas en la determinación de la estructura o de la función.

Con respecto a los anticuerpos, el término "inmunológicamente específico" se refiere a anticuerpos que se unen a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no reconocen ni se unen sustancialmente a otras moléculas de una muestra que contenga una población mixta de moléculas biológicas antigénicas.

Una "secuencia codificadora" o "región codificadora", se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene información en la secuencia necesaria para producir un producto génico cuando la secuencia es expresada.

El término "unida operativamente" o "insertada operativamente" significa que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia codificadora están situadas en una molécula de ácido nucleico en las posiciones apropiadas respecto a la secuencia codificadora a fin de permitir la expresión de la secuencia codificadora. Esta misma definición es a veces aplicada a la disposición de otros elementos para el control de la transcripción (por ejemplo, intensificadores) en un vector de expresión.

Las secuencias para el control transcripcional y traduccional son secuencias reguladoras de ADN tales como promotores, intensificadores, señales de poliadenilación, terminadores, etcétera, que proporcionan la expresión de una secuencia codificadora en una célula huésped.

Los términos "promotor", "región promotora" o "secuencia promotora", se refieren en general a regiones reguladoras de la transcripción de un gen que pueden encontrarse en el lado 5' o 3' de la región codificadora o dentro de la región codificadora, o en los intrones. Típicamente, un promotor es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora corriente abajo (dirección 3'). La secuencia promotora 5' típica está unida en su extremo 3' al sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora está un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente mediante mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

\newpage

El termino "cantidad terapéuticamente eficaz" indica una cantidad de la composición para el tratamiento suficiente para producir una disminución medible del número, la calidad o la replicación de células tumorales previamente existentes, medible mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la presente.

El término "célula tumoral" indica una célula que es un componente de un tumor en un animal, o una célula que se ha determinado que va a ser destinada a convertirse en un componente de un tumor, esto es, una célula que es un componente de una lesión precancerosa en un animal. Están incluidas dentro de esta definición células malignas del sistema hematopoyético que no forman tumores sólidos tales como leucemias, linfomas y mielomas.

El término "tumor" se define como una o más células tumorales capaces de formar una masa invasiva que puede desplazar o destruir progresivamente los tejidos normales.

El término "tumor maligno" se define como aquellos tumores formados por células tumorales que pueden desarrollar la propiedad de diseminación más allá de su lugar de aparición original.

Un "vector" es un replicón tal como un plásmido, un fago, un cósmido o un virus en el cual puede insertarse operativamente otro segmento de ácido nucleico con el fin de ocasionar la replicación o la expresión del segmento.

El término "construcción de ácido nucleico" o "construcción de ADN" es utilizado algunas veces para hacer referencia a una secuencia codificadora o a secuencias unidas operativamente a secuencias reguladoras apropiadas e insertadas en un vector para la transformación de una célula. Este término puede ser utilizado indistintamente con el término "ADN transformante". Tal construcción de ácido nucleico puede contener una secuencia codificadora de un producto génico de interés, junto con un gen marcador seleccionable y/o un gen informador.

El término "gen marcador seleccionable" se refiere a un gen que codifica un producto que, cuando es expresado, confiere un fenotipo seleccionable a una célula transformada tal como resistencia a antibióticos.

El término "gen informador" se refiere a un gen que codifica un producto que es fácilmente detectable mediante métodos estándar, ya sea directamente o indirectamente.

Una célula ha sido "transformada" o "transfectada" por ADN exógeno o heterólogo cuando tal ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede ser o no integrado (unido covalentemente) en el genoma de la célula. En procariotas, en levaduras y en células de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede ser mantenido en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada de manera estable es una en la cual el ADN transformante ha sido integrado en un cromosoma, de tal manera que es heredado por las células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de las células eucarióticas para establecer líneas celulares o clones compuestos por una población de células hijas que contienen el ADN transformante.

Un "clon" es una población de células derivadas de una única célula o de un ancestro común mediante mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

El término "tratar" o "tratamiento", con respecto a las células tumorales, se refiere a la parada de la progresión de dichas células, al enlentecimiento del crecimiento, a la inducción de regresión o a la mejora de los síntomas asociados con la presencia de dichas células.

El término "célula xenogénica" se refiere a una célula que deriva de una especie animal diferente de la especie animal que es el huésped animal receptor en un procedimiento de trasplante o de vacunación.

El término "célula alogénica" se refiere a una célula que es de la misma especie animal, pero genéticamente diferente en uno o más loci genéticos, que el animal que es el "huésped receptor". Esto aplica normalmente a células trasplantadas de un animal o otro animal no idéntico de la misma especie.

El término "célula singénica" se refiere a una célula que es de la misma especie animal y tiene la misma composición genética para la mayoría de los marcadores genotípicos y fenotípicos que el animal que es el huésped receptor de esa línea celular en un procedimiento de trasplante o de vacunación. Esto aplica normalmente a células trasplantadas procedentes de mellizos idénticos o puede aplicarse a células trasplantadas entre animales altamente consanguíneos.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación del plásmido pLNC-KG que puede ser utilizado de acuerdo con la invención.

La Figura 2, SEC ID Nº: 1, es la secuencia del plásmido pLNC-KG representado en la Figura 1.

La Figura 3 es un esquema de la inducción de anticuerpos anti-\alphaGal en ratones desprovistos ("knockout") de \alpha(1,3)-galactosiltransferasa (\alphaGT KO) mediante inmunización con glóbulos rojos sanguíneos de conejo.

Para inducir anticuerpos (Ab) anti-\alphaGal, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 10^{8} glóbulos rojos de conejo (RRBC), dos veces separadas dos semanas. Una semana después de la última inmunización, se obtuvieron muestras de sangre y se determinaron mediante ELISA los títulos de anticuerpos anti-\alphaGal. Todos los ratones utilizados en este estudio desarrollaron un título elevado de Ab anti-\alphaGal.

La Figura 4 es un esquema que muestra un test de supervivencia después de la inyección subcutánea de una dosis letal de células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} no irradiadas. Ratones \alphaGT KO de haplotipo H-2 b/b, hembras y machos de 8 a 14 semanas de edad, fueron utilizados en este estudio. Todos los ratones fueron inmunizados con RRBC según se muestra en la Figura 3. Una semana después de la última inmunización, los ratones recibieron un desafío subcutáneo (subcutáneo) letal con 1x10^{5} de una de estas tres líneas celulares: a) la línea celular de melanoma B16.BL6 de tipo salvaje (\alphaGal^{(-)}), b) células B16 transducidas retrovíricamente con un vector que expresaba el gen Neo-R (B16.LNL, control ficticio \alphaGal^{(-)}) o c) células B16 transducidas retrovíricamente con un vector que expresaba el gen NeoR y \alphaGT (B16 \alphaGal^{(+)}, pLNCKG). Después del desafío, los tumores fueron medidos dos veces a la semana de manera ciega.

Las Figuras 5a y 5b son gráficas que muestran el tamaño del tumor después de la inyección subcutánea (5a -15 días después del desafío, 5b -30 días después del desafío) de dosis letales de células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} no irradiadas en ratones \alphaGT KO. Los tumores subcutáneos palpables fueron medidos con un calibre en tres ejes perpendiculares, se calculó el volumen y se expresó en mm^{3}. La figura representa los tamaños de los tumores 15 y 30 días después de la inyección subcutánea con la línea celular B16 respectiva descrita en la Figura 4. Las barras representan la media y las barras de errores el SEM.

La Figura 6 es una gráfica que muestra la cinética del crecimiento tumoral después de la inyección subcutánea de una dosis letal de células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} no irradiadas en ratones \alphaGT KO.

Los tamaños de los tumores fueron medidos igual que en la Figura 5, 15, 23 y 29 días después del desafío con: B16 de tipo salvaje (\alphaGal^{(-)}), B16.LNL (control \alphaGal^{(-)}) y B16 \alphaGal^{(+)}.

Las Figuras 7a y 7b son gráficas que muestran el análisis de supervivencia de ratones \alphaGT KO inyectados letalmente con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} no irradiadas. Los ratones tratados según se describió en la Figura 4 fueron estudiados durante 90 días. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y las comparaciones de las curvas de supervivencia mediante el test de rangos logarítmicos se llevaron a cabo utilizando un programa de estadística.

La Figura 8 es un esquema que representa el diseño experimental del test de supervivencia después de la inyección subcutánea letal de células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas en los ratones que sobrevivieron a una inyección letal de células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} no irradiadas.

La Figura 9 es una gráfica que muestra el análisis de supervivencia de los ratones "knockout". Los ratones que sobrevivieron al primer desafío con células B16 \alphaGal^{(+)} de la Figura 7, fueron desafiados posteriormente con una segunda dosis subcutánea de células B16 \alphaGal^{(-)} nativas (Fig. 8). Se llevó a cabo el análisis de Kaplan-Meier durante un periodo de 60 días después de la inyección de las células B16 \alphaGal^{(-)}. Se utilizaron como controles ratones no tratados que recibieron subcutáneamente B16 \alphaGal^{(-)}.

La Figura 10 es un esquema que muestra la inducción de células T citotóxicas específicas para melanoma en ratones que sobrevivieron a la inyección de una dosis letal de células \alphaGal^{(+)} no irradiadas. Esplenocitos procedentes de dos ratones que sobrevivieron al primer desafío con las células B16 \alphaGal^{(+)} de la Figura 7, fueron utilizados para generar Linfocitos T Citotóxicos (CTL) in vitro. Se recogieron esplenocitos 90 días después de la inyección de B16 \alphaGal^{(+)} de ratones sin tumores y se generaron cultivos específicos para melanoma mediante el cultivo de esplenocitos con células B16 \alphaGal^{(-)} irradiadas durante 5 días en ausencia de IL-2. Se recogieron los CTLs y se ensayaron frente a la diana específica B16 \alphaGal^{(-)} y frente a las líneas celulares singénicas no específicas MC38 de carcinoma de colon y EL-4 de linfoma de células T. Se determinó la citotoxicidad específica después de 4 horas de incubación de los CTLs con las dianas específicas y no específicas mediante la medida de la liberación de LDH en el sobrenadante del cultivo.

La Figura 11 es una gráfica que muestra los resultados de la inducción de células T citotóxicas específicas para el melanoma B16 en ratones que sobrevivieron a la inyección de una dosis letal de células \alphaGal^{(+)} no irradiadas según está representado en la Figura 10.

La Figura 12 es un esquema que muestra el diseño experimental de un modelo de metástasis de melanoma diseminadas en los ratones \alphaGT KO por inyección intravenosa de una dosis letal de células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} no irradiadas. Ratones \alphaGT KO hembras y machos fueron inmunizados con RRBC para incrementar el título de Ab anti-\alphaGal como en la Figura 3. Una semana después de la última inmunización, los ratones fueron inyectados intravenosamente en la vena de la cola con B16 \alphaGal^{(-)} o \alphaGal^{(+)}. Tres semanas después de la inyección, se recogieron los pulmones y se contaron las metástasis de melanoma en los pulmones.

La Figura 13 es una gráfica que muestra los resultados estadísticos del experimento de la Figura 12.

La Figura 14 es un esquema que muestra el diseño experimental para la prevención del desarrollo de un tumor de melanoma \alphaGal^{(-)} subcutáneo en ratones \alphaGT KO después de la vacunación con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas. Las vacunas de células fueron preparadas utilizando las líneas celulares derivadas de B16 descritas en los experimentos previos, que son: B16 \alphaGal^{(-)} nativas, B16.LNL \alphaGal^{(-)} transducidas con el vector control y células B16 \alphaGal^{(+)} transducidas con el vector que codifica el gen de la \alphaGT murina. Las vacunas de células fueron preparadas mediante irradiación \gamma (250 Gy) para impedir la proliferación celular y almacenadas en medio de congelación hasta su utilización. Antes de la inyección las vacunas de células fueron descongeladas, lavadas, contadas e inyectadas subcutáneamente suspendidas en Solución de Sales Equilibrada de Hanks (HBSS). Todos los ratones \alphaGT KO utilizados fueron inyectados con RRBC como en la Figura 3. Una semana después de la última inyección de RRBC, los ratones recibieron la primera dosis de la vacuna de células. Dos semanas después, se repitió la vacunación con las células. La dosis de cada vacuna fue de 10^{6} células por ratón administradas subcutáneamente. Dos semanas después de la última vacuna de células, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 10^{5} células B16 \alphaGal^{(-)} nativas no irradiadas y se observaron para detectar el desarrollo de tumores dos veces a la semana durante 90 días.

La Figura 15 es una gráfica que representa el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier del experimento descrito en la Fig. 14.

La Figura 16 muestra los resultados del análisis de reconocimiento de TNF-\alpha mediante FACS. Detección de TNF-\alpha intracelular por células T específicas para melanoma inducidas en ratones vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas tras el reconocimiento in vitro de células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)}. Se recogieron esplenocitos de ratones sin tumores procedentes de ratones vacunados con las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} 90 días después de la inyección de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} (ratones que sobrevivieron de la Figura 15). Para medir in vitro el reconocimiento de B16 \alphaGal^{(-)}, se detectó el TNF-\alpha intracelular mediante FACS. Se cultivaron células T durante 6 horas en presencia o ausencia de estimulación con Brefeldina A para bloquear la secreción de citoquinas. Para una activación máxima se utilizó PMA/ionóforo de Ca^{++}. Las células fueron cultivadas con 10^{5} B16 irradiadas para medir el reconocimiento específico o con 10^{5} CA320M como línea celular singénica no melanoma control negativo. Después de la incubación se recogieron las células, se fijaron permeabilizadas y se tiñeron para detectar TNF-\alpha intracelular utilizando un Ab monoclonal anti-TNF-\alpha marcado con PE. Las células fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo Coulter adquiriendo al menos 10.000 linfocitos acotados ("gated").

La Figura 17 es un esquema que muestra el diseño experimental para el tratamiento terapéutico de tumores subcutáneos preestablecidos mediante vacunación con células de melanoma irradiadas. Tratamiento terapéutico de tumores de melanoma \alphaGal^{(-)} subcutáneos preestablecidos mediante vacunación con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} irradiadas. Se inyectaron ratones con RRBC según se explicó en la Figura 3. Una semana después de la última inyección de RRBC, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 10^{5} células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas y se distribuyeron aleatoriamente. En el Experimento #1, se administraron dos dosis de las vacunas de células 3 y 6 días después de la inyección subcutánea de B16 \alphaGal^{(-)}. En el Experimento #2, los ratones recibieron tres dosis de las vacunas de células irradiadas 4, 11 y 18 días después de la inyección subcutánea de células B16 \alphaGal^{(-)} vivas. En estos experimentos, se utilizaron dos vacunas de células: B16 \alphaGal^{(-)} irradiadas transducidas con un vector control o células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas.

Las Figuras 18a y 18b muestran gráficas de los resultados de dos experimentos diferentes de cinética del crecimiento tumoral en ratones con tumores de melanoma \alphaGal^{(-)} subcutáneos preestablecidos que recibieron una vacunación con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} irradiadas. Se midió el tamaño de los tumores a puntos de tiempo tempranos en los ratones que recibieron o no las vacunas de células. Los valores representan la media del tamaño del tumor de todos los ratones de cada grupo.

La Figura 19 es una gráfica que muestra el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones con tumores de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} subcutáneos preestablecidos que recibieron una vacunación terapéutica con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} irradiadas. Se evaluó la supervivencia de los ratones inyectados con B16 \alphaGal^{(-)} y tratados o no con las vacunas de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} durante 75 días (EXP #1).

La Figura 20 es una gráfica que muestra el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones con tumores de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} subcutáneos preestablecidos que recibieron una vacunación terapéutica con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} irradiadas. Se evaluó la supervivencia de los ratones inyectados con B16 \alphaGal^{(-)} y tratados o no con las vacunas de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} durante 70 días (EXP #2).

La Figura 21 es un diagrama que muestra el diseño experimental para el tratamiento terapéutico de tumores metastásicos pulmonares preestablecidos. Tratamiento de tumores de melanoma \alphaGal^{(-)} metastásicos pulmonares diseminados preestablecidos mediante vacunación con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} irradiadas. Los ratones fueron inyectados con RRBC según se explicó en la Figura 3. Una semana después de la última inyección de RRBC, los ratones fueron inyectados intravenosamente (i.v.) con células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas y distribuidos aleatoriamente. Posteriormente fueron vacunados con las células vacuna B16 \alphaGal^{(-)} o B16 \alphaGal^{(+)} los días 4, 11 y 21 después del establecimiento de las metástasis diseminadas. El día 30 los animales fueron sacrificados y se evaluó su carga tumoral en los pulmones.

La Figura 22 es una gráfica que muestra la carga tumoral en el Experimento #1 del protocolo mostrado en la Figura 21. En el Experimento #1, los ratones recibieron 10^{5} células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)}. Treinta días después de la inyección i.v. de células de melanoma no irradiadas, los ratones fueron sacrificados y se contaron las metástasis de melanoma en los pulmones.

La Figura 23 es un diagrama que muestra un segundo diseño experimental para el tratamiento terapéutico de tumores de melanoma metastásicos diseminados preestablecidos. En el Experimento #2, los ratones recibieron 5 x 10^{5} células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)}. Después de esto, los ratones fueron tratados subcutáneamente con las vacunas de células de melanoma. Recibieron tres dosis de 2 x 10^{5} B16 \alphaGal^{(-)} irradiadas transducidas con el vector control o células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas los días 4, 11 y 21 después de la inyección i.v. de B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas.

Las Figuras 24a y 24b son gráficas que muestran los resultados del experimento descrito en la Fig. 23, expresados como el peso medio de los pulmones (24A) o como la carga tumoral media en los pulmones (24B).

La Figura 25 es un diagrama que muestra el diseño experimental para demostrar la inducción in vitro de inmunidad de células T específica para melanoma B16 \alphaGal^{(-)} después de la vacunación con células B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)}. Los ratones fueron inyectados con RRBC igual que en la Figura 3. Dos semanas después de la última inyección de RRBC, los ratones recibieron tres inyecciones subcutáneas de 2 x 10^{5} células B16 \alphaGal^{(-)} irradiadas transducidas con el vector control o vacunas de células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas. Dos semanas después de la última vacuna de células, se recogieron esplenocitos y se llevaron a cabo estudios de células T. Con el fin de determinar el reconocimiento específico de B16 \alphaGal^{(-)}, se midieron el TNF-\alpha intracelular y el aumento regulado de los marcadores de activación CD25 y CD69.

La Figura 26 es una gráfica que muestra la inducción específica de TNF-\alpha en precursores de células T de animales vacunados que reconocen específicamente antígenos de B16 (Fig. 25). Para detectar TNF-\alpha, se cultivaron células T durante 6 horas en presencia o ausencia de estimulación con Brefeldina A para bloquear la secreción de citoquinas. Para una estimulación máxima, se utilizó PMA/ionóforo de Ca^{++} como control positivo. Las células fueron cultivadas con B16 \alphaGal^{(-)} para medir el reconocimiento específico o con CA320M, una línea celular de intestino delgado singénica (H-2 b/b), no melanoma, como control negativo. Después de la incubación se recogieron las células y se tiñeron para detectar TNF-\alpha intracelular. Las células positivas fueron detectadas por FACS, acotando los linfocitos en la gráfica de Dispersión Frontal tras la adquisición de al menos 10.000 eventos acotados. La gráfica representa la Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) de las células TNF-\alpha^{(+)}.

Las Figuras 27a y 27b son gráficas que muestran el aumento regulado de los marcadores de activación CD25 y CD69 en precursores de células T procedentes de animales vacunados con células \alphaGal^{(+)}, que reconocen específicamente antígenos de B16. Se llevaron a cabo medidas después de un día de cultivo bajo condiciones similares a las descritas en la Figura 26, en ausencia de Brefeldina A. Después de la incubación, las células fueron recogidas y teñidas con Ab monoclonales anti-CD25 o anti-CD69 marcados con PE. La adquisición se llevó a cabo utilizando un citómetro de flujo Coulter. Las gráficas representan el porcentaje de células CD25 o CD69 positivas.

La Figura 28 muestra un esquema de la demostración in vivo de inmunidad específica mediada por células T con efecto terapéutico contra metástasis diseminadas preestablecidas de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} mediante transferencia adoptiva de células T procedentes de ratones donantes vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} irradiadas. Los ratones donantes fueron inyectados con RRBC igual que en la Figura 3. Dos semanas después de la última inyección de RRBC, los ratones recibieron tres inyecciones subcutáneas de 2 x 10^{5} B16 \alphaGal^{(-)} irradiadas transducidas con el vector control o de vacunas de células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas. Dos semanas después de la última vacuna de células, se recogieron esplenocitos y se transfirieron a receptores del mismo sexo. Cuatro días antes de la transferencia de células, los receptores fueron inyectados i.v. con B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas para establecer las metástasis de melanoma en los pulmones, y distribuidos aleatoriamente. Treinta días después de la transferencia de las células T, los receptores fueron eutanasiados y se determinó la carga de metástasis de melanoma en los pulmones pesando los pulmones y contando los tumores de melanoma.

Las Figuras 29a y 29b son gráficas que representan los resultados del experimento descrito en la Figura 28. Las barras representan la media y las barras de error el SEM. Se realizaron dos experimentos independientes y se muestran ambos.

La Figura 30 es una gráfica que muestra el análisis de supervivencia de ratones \alphaGT KO vacunados con células de sarcoma CA320M irradiadas \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} después de la inyección subcutánea de una dosis letal de células de sarcoma CA320M \alphaGal^{(-)} no irradiadas. Los ratones fueron inyectados con RRBC igual que en la Figura 3. Dos semanas después de la última inyección de RRBC fueron vacunados subcutáneamente con 1 x 10^{3} CA320M transducidas con 10 MOI de HDKgal\DeltasalI [vector \alphaGal^{(-)}] o de HDKgal1 [vector \alphaGal^{(+)}], seguido por irradiación de 25 Gy. Veintiún días después, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 1 x 10^{7} células CD320M no irradiadas. "Ninguna" consistía en no vacunación. Se llevó a cabo el análisis de supervivencia durante un periodo de observación de 60 días.

Descripción detallada de la invención

El fundamento básico de la terapia inmune contra tumores es la inducción de una respuesta inmune eficaz contra los antígenos asociados al tumor (TAA), lo cual a su vez tiene como resultado la destrucción mediada por el sistema inmune de las células tumorales que proliferan y expresan estos antígenos. Para que una respuesta inmune sea eficaz contra la proteína que contiene los TAAs, estos antígenos deben ser primeramente endocitados por células presentadoras de antígeno (APC) tales como macrófagos, células dendríticas y células B. Dentro de las APCs, los TAAs son degradados en el compartimento lisosómico y los péptidos resultantes son expresados en la superficie de la membrana celular del macrófago en su mayoría en asociación con moléculas del MHC de Clase II, pero también en asociación con moléculas del MHC de Clase I. Esta expresión media el reconocimiento por células T cooperadoras CD4^{+} específicas y la activación posterior de estas células para llevar a cabo la respuesta inmune (Stevenson, 1991, FASEB J. 5:2250; Lanzavecchia, 1993, Science 260:937; Pardoll, 1993, Immunol. Today 14:310). La mayoría de las moléculas de TAAs humanas no han sido definidas en términos moleculares, impidiendo la utilización de éstas como dianas para terapia farmacológica o como vacunas antitumorales.

La utilización de epítopos \alphaGal en la inducción de una respuesta específica contra el tumor en un tipo de protocolo de vacunación profiláctica, ha sido propuesta por otras personas de este campo y ha demostrado que genera protección frente a un desafío posterior por las mismas células tumorales. Sin embargo, no existe garantía de que los TAAs específicos sean eficaces contra células tumorales desarrolladas posteriormente después de que se haya generado la respuesta inmune preventiva. El epítopo particular de un TAA para el cual se genera una respuesta inmune profiláctica mediante la vacunación preventiva, podría ser específico únicamente para ese tumor, únicamente para ese tipo de cáncer, únicamente para ese paciente o únicamente para ese tejido, etc. La identificación de un TAA universal expresado por todos los cánceres ha permanecido difícil de conseguir y ello ha impedido el uso extendido de estrategias de vacunación profiláctica para la prevención del cáncer.

En lugar de un procedimiento profiláctico general, el tratamiento inmune de un individuo con un tumor recurrente o un tumor diagnosticado proporcionará un método vectorizado más directamente, sin embargo no existe una expectativa consistente de que la metodología con las vacunas sea eficaz como tratamiento para células tumorales ya presentes. Varios informes han mostrado eficacia en modelos profilácticos, mostrando, sin embargo, los mismos tratamientos una menor o ninguna eficacia en los procedimientos terapéuticos. Por ejemplo, la vacunación preventiva con virus vaccinia recombinante que codificaba TRP-1 de ratón tuvo éxito para proteger frente a un desafío subcutáneo posterior con células tumorales B16 vivas. Este tratamiento fue sólo parcialmente eficaz en la prevención de metástasis de melanoma en pulmón y no fue eficaz en el tratamiento de un melanoma subcutáneo preestablecido [Overwijk y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 2982-2987].

En un estudio similar, utilizando un adyuvante oligodesoxinucleotídico (ODN) sintético que contenía motivos de citosina-guanina no metilados (CpG-ODN) y bloqueo de CTLA-4, se evaluó la eficacia de vacunas peptídicas en tratamiento profiláctico, terapéutico y en una combinación de ambos tratamientos. La conclusión del estudio fue que ningún tratamiento, ni de modo preventivo ni de modo profiláctico, fue eficaz para el melanoma B16. Los autores demostraron que se observó un tratamiento eficaz y una supervivencia prolongada de los ratones cuando los ratones fueron vacunados, desafiados con B16 y recibieron posteriormente una dosis terapéutica adicional de la vacuna. En este estudio, sin embargo, la vacunación fue sólo parcialmente eficaz para el tratamiento de la enfermedad preestablecida, ya que todos los ratones murieron de melanoma en el procedimiento profiláctico y en el procedimiento terapéutico [Davila, Kennedy and Celis, Cancer Research (2003), 63: 3281-3288].

Otros muchos estudios se han centrado únicamente en el tratamiento preventivo del melanoma subcutáneo, pero solamente unos cuantos de los mismos han demostrado un efecto terapéutico significativo y eficaz sobre la tasa de crecimiento tumoral, aunque una reducción de la tasa de crecimiento tumoral no se vio reflejada en la supervivencia de los animales [Wang y col., Cancer Research (2003) 63: 2553-2560; Current Protocols of Immunology, Capítulo 20, "B16 as a Model for Human Melanoma"].

Para complicar más el tema, se ha demostrado que la presencia de linfocitos específicos para el tumor es insuficiente para inducir la destrucción del tumor. De hecho, se ha demostrado recientemente que la presencia de grandes cantidades de células T específicas para el tumor no era suficiente para prolongar la supervivencia de ratones portadores de tumores [Overwijk y col., Journal of Experimental Medicine (2003) 198: 569-580]. Los autores demostraron que la estimulación de células T a través de vacunación específica para el antígeno con un ligando peptídico alterado, en lugar del propio péptido nativo, y la coadministración de un factor de crecimiento y activación de células T, eran tres elementos estrictamente necesarios para inducir la regresión del tumor.

La mayoría de las células tumorales tienen perfiles de expresión únicos de TAA, pero en muchos casos estos TAA son desconocidos o son muy difíciles de determinar o aislar para tumores individuales. Además, para la mayoría de tumores que se escapan de la vigilancia inmune, el sistema inmune no reconoce estos TAA como antígenos foráneos, ya sea porque no están presentados en el contexto de una señal de "peligro" celular o porque el sistema inmune se ha hecho tolerante a esos antígenos y los reconoce como antígenos "propios". La utilización de vacunas de células completas alivia la primera dificultad, ya que proporciona un repertorio completo de TAA sin la necesidad de aislar o caracterizar esos antígenos. La utilización de vacunas de células alogénicas completas proporciona TAA que podrían presentar diferencias alélicas entre individuos y podrían por tanto romper la tolerancia del sistema inmune a esos TAA. Las vacunas contra el cáncer de células completas han sido también modificadas genéticamente para que expresen moléculas que incrementan la respuesta inmune tales como GM-CSF [Dranoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:3539]. Las vacunas contra el cáncer de células alogénicas completas modificadas o no modificadas genéticamente están mostrando actividad antitumoral y beneficios de supervivencia en ensayos clínicos, validando de este modo la hipótesis de que el rechazo inmune de líneas celulares de cáncer humano producidas en el laboratorio puede inducir la destrucción de las células malignas del paciente. Estas vacunas funcionan mediante estimulación directa de los efectores inmunes celulares por presentación directa de los TAA en el contexto del MHC de Clase I de la vacuna tumoral, lo cual da lugar a la activación directa de linfocitos T citotóxicos y de las células destructoras naturales [van Elsas y col., J. Exp. Medicine (1999) 190: 355-366)]. La estimulación de respuestas antitumorales utilizando los abordajes previamente mencionados ha sido asociada frecuentemente con el desencadenamiento de una enfermedad autoinmune contra el tejido normal del mismo tipo celular que el del tejido tumoral. Además, estas vacunas no aprovechan los mecanismos de la rama humoral del sistema inmune para reconocer los TAA y para incrementar la presentación del antígeno y la destrucción de las células tumorales mediada por el complemento. Existen varias razones por las cuales una respuesta inmune humoral potente produciría una respuesta antitumoral más eficaz: I) Los anticuerpos que opsonizan las células de la vacuna uniéndose a antígenos específicos en la superficie celular estimularán su fagocitosis por los macrófagos mediante la unión de la porción Fc de los anticuerpos a los receptores Fc presentes en las células presentadoras de antígeno. II) La vectorización hacia el receptor Fc realiza varias funciones importantes para el funcionamiento eficaz de la vacuna, incluyendo: la estimulación de la captación eficaz del antígeno para la presentación antigénica al MHC de Clase I y de Clase II; la estimulación de la activación de las APCs y la estimulación de la maduración de las células dendríticas. III) La captación de las células opsonizadas por las células presentadoras de antígeno a través de endocitosis mediada por el receptor Fc puede ser crítica para generar una respuesta de CTLs antitumoral eficaz, ya que estimula la activación de las respuestas restringidas por el MHC de Clase I por las células T CD8^{+} a través de una ruta de presentación cruzada. IV) Las vacunas que no pueden estimular una respuesta inmune humoral están limitadas en su capacidad para inducir inmunidad celular mediante restricción por el HLA. Los CTLs están restringidos por el HLA y destruirán únicamente las células de la vacuna que presenten antígenos tumorales en sus propias moléculas del MHC de Clase I. Las células NK destruirán las células de la vacuna contra el tumor si la interacción del MHC es débil produciendo una pobre respuesta inmune. V) Las señales que activan las APCs proceden directamente o indirectamente de la respuesta inmune adquirida de forma natural. Las APCs que ingieren las células de la vacuna contra el tumor deben ser activadas antes de que puedan presentar el antígeno eficazmente. Además, la presentación de antígenos a APCs inmaduras, sin las señales de activación requeridas, puede suprimir la respuesta inmune. Además, las APCs activadas pueden activar CTLs que no pueden destruir sin activación, incluso si reconocen su antígeno cognado en las células tumorales de igual HLA.

A partir de la discusión anterior, está claro que se necesitan vacunas tumorales innovadoras en el campo de las vacunas tumorales, en el cual las necesidades específicas son: I) desarrollar vacunas contra tumores que puedan producir la regresión de tumores preexistentes y diseminados o al menos que puedan reducir las tasas de crecimiento tumoral en marcos terapéuticos sin necesidad de regímenes de vacunación preventiva, II) desarrollar vacunas que estimulen las ramas celular y humoral del sistema inmune, y III) desarrollar vacunas que no tengan efectos secundarios no deseados tales como el desencadenamiento de una enfermedad autoinmune.

La invención de los solicitantes proporciona la utilización de formulaciones de vacunas tumorales terapéuticas que satisfacen esos requerimientos. Se describe en la presente la utilización de una técnica de transferencia génica con el fin de producir células tumorales para sintetizar epítopos \alpha(1,3)-galactosilo in vitro. La utilización de la propia maquinaria celular y la utilización de una mezcla de varias células tumorales alogénicas que hayan sido así producidas, proporcionan epítopos que van a ser generados en múltiples glicoproteínas y glicolípidos de la superficie celular para proporcionar múltiples oportunidades para que se generen anticuerpos hacia los TAAs en células individuales o separadas. Se estima que las células utilizadas en estas vacunas contienen entre un millón y dos millones de epítopos \alphaGal. Este gran número de sitios de unión para Ab anti-\alphaGal preexistentes de forma natural, tiene como resultado una elevada densidad de opsonización seguida por la destrucción del complemento que desencadena una variedad de procesos que activan las ramas humoral y celular del sistema inmune. La presencia de tal elevada densidad de residuos \alphaGal en la superficie de las células tumorales alogénicas, induce una respuesta hiperinmune análoga al rechazo hiperagudo de xenotrasplantes en el lugar de la inyección de las células tumorales modificadas. Además, estas vacunas contra el cáncer son polivalentes, significando que presentan múltiples antígenos tumorales diana para el sistema inmune. Esto tendrá como resultado un tratamiento más eficaz en cuanto a que se presentarán varios TAAs y un tratamiento más ampliamente eficaz, ya que con el número incrementado de TAAs presentados es más probable que existan solapamientos en epítopos de diferentes tumores individuales. Las células opsonizadas son fácilmente ingeridas por los fagocitos, proporcionando un mecanismo mediante el cual la mayor parte de los antígenos tumorales pueden ser presentados simultáneamente al sistema inmune adoptivo. En estas células, las proteínas procedentes de las células de la vacuna contra el cáncer serán digeridas y serán sometidas a presentación al MHC de Clase II, exponiendo de este modo los epítopos de las proteínas mutantes de la célula cancerosa a vigilancia por las células T. Además, la captación de células opsonizadas por las células presentadoras de antígeno (APCs) a través de endocitosis mediada por el receptor Fc puede facilitar la activación de las respuestas restringidas por el MHC de Clase I por las células CD8^{+} a través de una ruta de presentación cruzada. La cascada del sistema inmune puesta en movimiento por este proceso, proporciona el estímulo para inducir una respuesta de células T específicas para destruir las células tumorales nativas procedentes de una enfermedad maligna humana establecida. Además, el entorno inflamatorio inducido por la respuesta inmune primaria tiene como resultado un efecto de amplificación mediado por citoquinas, histaminas y otras moléculas incrementadas de forma regulada que refuerzan la respuesta de las células T. Las células T activadas de esta manera son capaces directamente de destruir las células cancerosas. Una observación importante es que la adición de epítopos \alphaGal a glicoproteínas y glicolípidos presentes en la vacuna tumoral no limitará el desarrollo de una respuesta inmune únicamente hacia aquellos antígenos que están glicosilados, sino hacia cualquier antígeno presente en la célula tumoral, esté o no afectado por glicosilación.

La eficacia de este tipo de vacuna de células completas para inducir inmunidad terapéutica tumoral ha sido verificada en modelos animales utilizando ratones "knockout" (KO). Se generaron ratones KO que carecían de un gen de \alphaGT funcional con el fin de proporcionar un modelo en animales pequeños para estudiar la respuesta inmune in vivo contra los epítopos \alphaGal en líneas de células tumorales. Estos ratones pueden ser inmunizados con glóbulos rojos sanguíneos de conejo (rRBC) para estimular un título elevado de Ab anti-\alphaGal como se encuentra en el suero humano. Utilizando estos ratones, los solicitantes han demostrado que el sistema inmune rechaza las células tumorales positivas para \alphaGal y que este rechazo da lugar al desarrollo de inmunidad de células T que se extiende hacia las células tumorales negativas para \alphaGal. Este modelo animal fue utilizado también para simular una aplicación clínica en la cual células tumorales negativas para \alphaGal fueron administradas al animal antes del tratamiento con la vacuna para simular una enfermedad maligna humana preestablecida. Mediante este tipo de experimentos los solicitantes han demostrado que la inmunidad mediada por células inducida en los ratones inmunotratados con células producidas de acuerdo con la invención era capaz de tratar de manera eficaz tumores locales y diseminados preestablecidos subcutáneos y pulmonares, teniendo como resultado no sólo tasas de crecimiento tumoral reducidas sino, lo que es más importante, la supervivencia de los ratones tratados a largo plazo. Experimentos de transferencia celular adoptiva mostraron de manera concluyente el componente dependiente de células en el rechazo de los tumores preestablecidos. La despigmentación autoinmune típica asociada con la vacunación con células tumorales completas descrita utilizando otros procedimientos, no se observó nunca en los ratones sometidos a este tratamiento, enfatizando la importancia que pueden tener diferentes métodos de inmunoestimulación en el resultado final de la respuesta inmune.

Por tanto, la invención de los solicitantes se refiere a composiciones para producir la vectorización y la destrucción selectivas de células tumorales preestablecidas. Las células tumorales contenidas en las composiciones para ser utilizadas de acuerdo con la invención son manipuladas mediante protocolos de terapia génica ex vivo para que expresen epítopos \alphaGal. Las células son posteriormente irradiadas o destruidas de otro modo y administradas a un paciente. La unión del epítopo \alphaGal a los anticuerpos anti-\alphaGal preexistentes de forma natural produce la opsonización de las células tumorales e incrementa la presentación de los antígenos específicos del tumor. Una característica importante de la invención contempla la utilización de células completa y de una mezcla de una pluralidad de células transducidas en las composiciones farmacéuticas para ser utilizadas de acuerdo con la invención. Como las modificaciones con \alphaGal afectan a múltiples glicoproteínas en la superficie celular, el sistema inmune del animal tendrá una oportunidad incrementada para detectar, procesar y generar anticuerpos hacia los antígenos específicos del tumor.

Una composición farmacéutica para ser utilizada de acuerdo con la invención es generada introduciendo en células tumorales una secuencia polinucleotídica que codifica tras la expresión un enzima \alphaGT. La secuencia es introducida mediante cualquier vehículo de transferencia de nucleótidos, que puede comprender un vector vírico o no vírico. Estos vehículos de transferencia de genes transforman las células tumorales y producen la expresión del material genético foráneo insertado en las mismas. El producto génico resultante cataliza la síntesis de un epítopo \alphaGal en las glicoproteínas de la superficie celular presentes en dichas células. La invención contempla la utilización de células tumorales completas con múltiples glicoproteínas en la superficie celular con el fin de maximizar la unión de los epítopos \alphaGal a los anticuerpos anti-\alphaGal preexistentes, incrementando así la unión de estos complejos a los receptores Fc presentes en las células presentadoras de antígeno y desencadenando de este modo la presentación antigénica de una pluralidad de antígenos asociados al tumor presentes en dicha célula tumoral de la vacuna.

Se describe también en la presente una composición farmacéutica y un método para producir la misma, que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una mezcla de células tumorales alogénicas atenuadas, comprendiendo dicha mezcla una pluralidad de glicoproteínas de la superficie celular que incluyen epítopos \alphaGal, y un vehículo. Las células son preferiblemente células completas. Los métodos para producir las composiciones incluyen la obtención de una colección de células tumorales vivas, la transformación de dichas células con una secuencia de nucleótidos que codifique tras la expresión una \alphaGT, de tal manera que un epítopo \alphaGal sea presentado en las glicoproteínas de la superficie celular de dichas células. Las células son posteriormente destruidas, preferiblemente por irradiación, y combinadas con un vehículo farmacéutico para su administración.

Adicionalmente, se describe en la presente la transformación de células tumorales con un polinucleótido que creará en las células tumorales un epítopo \alphaGal. Por ejemplo, las células tumorales pueden ser transformadas con una secuencia de nucleótidos que codifique tras la expresión el enzima \alpha(1,3)-galactosil transferasa (\alphaGT). El ADNc de la \alphaGT ha sido clonado a partir de bibliotecas de ADNc bovino y murino. Larson, R.D. y col. (1989) "Isolation of a cDNA Encoding Murine UDP galactose; \beta-D-galactosyl-1,4-N Acetol-D-Glucosamine \alpha1-3 Galactosyl Transferase: Expression Cloning by Gene Transfer", PNAS, USA 86: 8227; y Joziasse, D.H. y col. (1989) "Bovine \alpha(1-3)-Galactosyl Transferase: Isolation and Characterization of a cDNA Clone, Identification of Homologous Sequences in Human Genomic DNA", J. Biol. Chem. 264: 14290. Puede utilizarse cualquier otra secuencia de nucleótidos que tenga como resultado de manera similar la expresión por las células tumorales de un epítopo \alphaGal en la superficie celular, por ejemplo otros enzimas que catalicen esta reacción o quizás el acontecimiento de manipulación de las células para que tengan glicoproteínas adicionales presentes en la superficie celular, por tanto la creación artificial de un TAA que pueda ser presentado al sistema inmune.

Las células tumorales utilizadas en la composición farmacéutica para ser utilizada de acuerdo con la invención son alogénicas, pero se describe también la utilización de células tumorales singénicas o autólogas. Las células transformadas y las células tumorales que van a ser tratadas deben tener al menos un epítopo en común, pero preferiblemente tendrán muchos. Hasta el grado de que existen entre diferentes cánceres epítopos o TAAs universales o solapantes, las composiciones farmacéuticas pueden ser bastante ampliamente aplicables.

Se describe también en la presente la utilización de cualquier célula que contenga glicoproteínas en la superficie celular o de cualquier componente celular que tenga un sitio para un epítopo \alphaGal. Esto puede incluir ciertos virus, células neoplásicas, etcétera.

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La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que genera el epítopo \alphaGal está contenida en un vehículo de expresión apropiado que transduce las células tumorales. Tales vehículos de expresión incluyen, pero no se limitan a, vectores eucarióticos, vectores procarióticos (tales como, por ejemplo, vectores bacterianos) y vectores
víricos.

El vector de expresión puede ser un vector vírico. Los vectores víricos que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovíricos, vectores adenovíricos, vectores virus Herpes y vectores víricos adenoasociados, o conjugados de ADN.

Una línea celular de empaquetamiento de vectores víricos es preferiblemente transducida con un vector vírico conteniendo la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente que induce la destrucción de las células tumorales mediante la unión a los anticuerpos y la activación del complemento. Las partículas víricas producidas por la línea celular de empaquetamiento son recogidas y utilizadas para transducir las células tumorales que serán administradas como vacuna antitumoral.

Tradicionalmente, el vector vírico es un vector retrovírico o adenovírico. Ejemplos de vectores retrovíricos que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, el Virus de la Leucemia Murina de Moloney, el virus de la necrosis esplénica y vectores derivados de retrovirus tales como el Virus del Sarcoma de Rous, el Virus del Sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus del sarcoma mieloproliferativo y el virus del tumor mamario.

Los vectores retrovíricos son útiles como agentes para mediar la transferencia génica mediada por retrovirus en células eucarióticas. Los vectores retrovíricos son construidos generalmente de tal manera que la mayoría de las secuencias que codifican los genes estructurales del virus son eliminadas y sustituidas por el(los) gen(es) de interés. Muy a menudo, los genes estructurales (esto es, gag, pol y env) son eliminados del esqueleto del retrovirus utilizando técnicas de ingeniería genética conocidas en este campo.

Estos nuevos genes han sido incorporados en el esqueleto provírico de varias formas generales. Las construcciones más sencillas son aquellas en las cuales los genes estructurales del retrovirus están sustituidos por un único gen que posteriormente es transcrito bajo el control de las secuencias reguladoras víricas que están en la repetición terminal larga (LTR). Se han construido también vectores retrovíricos que pueden introducir más de un gen en las células diana. Normalmente, en tales vectores un gen está bajo el control regulador de la LTR vírica, mientras que el segundo gen es expresado a partir de un mensaje ayustado o está bajo la regulación de su propio promotor interno.

Se han dirigido esfuerzos para minimizar el componente vírico del esqueleto vírico, principalmente en un esfuerzo para reducir la posibilidad de recombinación entre el vector y el virus cooperador defectuoso en empaquetamiento dentro de las células de empaquetamiento. Un virus cooperador defectuoso en empaquetamiento es necesario para proporcionar los genes estructurales de un retrovirus que han sido eliminados del propio vector.

El vector retrovírico puede ser alguno de la serie de vectores descritos en Bender y col., J. Virol. 61: 1639-1649 (1987), basados en el vector N2 (Armentano y col., J. Virol. 61: 1647-1650) que contiene una serie de deleciones y sustituciones para reducir hasta un mínimo absoluto la homología entre el vector y los sistemas de empaquetamiento. Estos cambios han reducido también la probabilidad de que se expresen las proteínas víricas. En el primero de estos vectores, LNL-XHC, se alteró mediante mutagénesis dirigida a un sitio el codón de inicio ATG natural de gag para dar TAG, eliminando de este modo la síntesis de proteínas no deseadas a partir de ese punto.

En el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), existe un marco de lectura abierto 5' respecto al inicio auténtico de gag, que permite la expresión de otra proteína glicosilada (pPr80.sup.gag). El virus del sarcoma murino de Moloney (MoMuSV) tiene alteraciones en esta región 5', incluyendo un desplazamiento del marco y la pérdida de sitios de glicosilación, que obvian la expresión potencial del extremo amino de pPr80.sup.gag. Por tanto, se produjo el vector LNL6, que incorporaba el ATG alterado de LNL-XHC y la porción 5' de MoMuSV. La estructura 5' de la serie de vectores LN elimina así la posibilidad de expresión de los marcos de lectura retrovíricos, con la producción posterior de antígenos víricos en las células diana transducidas genéticamente. En una última alteración para reducir el solapamiento con el virus cooperador defectuoso en empaquetamiento, Miller ha eliminado secuencias extra de env que preceden inmediatamente a la LTR 3' en el vector LN (Miller y col., Biotechniques 7: 980-990, 1989). Un ejemplo de un vector que puede ser utilizado está mostrado en la Figura 1, el cual tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, SEC ID Nº: 1.

La necesidad primordial que debe ser satisfecha por cualquier sistema de transferencia génica para su aplicación en terapia génica es la seguridad. La seguridad deriva de la combinación de la estructura del genoma del vector junto con el sistema de empaquetamiento que es utilizado para la producción del vector infeccioso. Miller y col. han desarrollado la combinación del plásmido pPAM3 (el genoma del cooperador defectuoso en empaquetamiento) para la expresión de proteínas estructurales del retrovirus junto con la serie de vectores LN para producir un sistema de empaquetamiento de vectores en el cual la generación de retrovirus de tipo salvaje recombinantes ha sido reducida a un mínimo mediante la eliminación de casi todos los sitios de recombinación entre el genoma del vector y el genoma del cooperador defectuoso en empaquetamiento (esto es, LN con pPAM3).

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El vector retrovírico puede ser un Virus de la Leucemia Murina de Moloney de la serie de vectores LN, tales como los mencionados anteriormente en la presente, y que se describe además en Bender y col. (1987) y Miller y col. (1989). Tales vectores tienen una porción de la señal de empaquetamiento derivada de un virus de sarcoma de ratón, y un codón de inicio de gag mutado. El término "mutado", según se utiliza en la presente, significa que el codón de inicio de gag ha sido eliminado o alterado, de tal manera que la proteína gag, o fragmentos o truncamientos de la misma, no son expresados.

El vector incluye uno o más promotores. Promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, la LTR de retrovirus; el promotor de SV40 y el promotor de citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller y col., Biotechniques, Vol. 7, Nº9, 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos incluyendo, pero sin limitarse a, los promotores de histonas, pol III y beta-actina). Otros promotores víricos que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de TK y promotores del parvovirus B19.

El vector puede contener un promotor inducible. Uno de tales promotores es el promotor sensible al transactivador (tTA) controlado por tetraciclina (sistema tet), un sistema promotor inducible procariótico que ha sido adaptado para ser utilizado en células de mamífero. El sistema tet fue organizado en un vector retrovírico, de tal manera que niveles elevados de ARNm de tTA producido de manera constitutiva funcionan no sólo para la producción de la proteína tTA sino también para disminuir la expresión basal de la unidad de respuesta mediante inhibición antisentido. Ver, Paulus, W. y col., "Self-Contained, Tetracycline-Regulated Retroviral Vector System for Gene Delivery to Mammalian Cells", J. of Virology, Enero de 1996, Vol. 70, Nº 1, pp. 62-67. La selección de un promotor adecuado será obvia para los expertos en la técnica a partir de las descripciones contenidas en la presente.

El vector es posteriormente empleado para transducir una línea celular de empaquetamiento con el fin de formar una línea celular productora. Ejemplos de células de empaquetamiento que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, las líneas celulares PE501, PA317, psi.2, .psi.-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, .psi.CRE, .psi.CRIP, GP+E-86, GP+envAM12, DAN y AMIZ. El vector que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente que es capaz de proporcionar la destrucción de las células tumorales después de la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente, y la activación de la cascada del complemento, pueden transducir las células de empaquetamiento mediante cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, la utilización de liposomas y la precipitación con CaPO_{4}.

Un vector vírico preferido es uno que infecte comúnmente a los humanos y la línea celular de empaquetamiento que está basada en humanos. Por ejemplo, pueden utilizarse vectores derivados de virus que infectan comúnmente a los humanos, tales como el Virus Herpes, el Virus de Epstein Barr.

Los tumores que pueden ser tratados de acuerdo con la presente invención incluyen tumores malignos y no malignos. Los tumores malignos (incluyendo primarios y metastásicos) que pueden ser tratados incluyen, pero no se limitan a, los que se presentan en las glándulas adrenales; vejiga; hueso; mama; cérvix; glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroideas, la glándula pituitaria y el páncreas); colon; recto; corazón; tejido hematopoyético; riñón; hígado; pulmón; músculo; sistema nervioso; cerebro; ojo; cavidad oral; faringe; laringe; ovarios; pene; próstata; piel (incluyendo melanoma); testículos; timo y útero. Ejemplos de tales tumores incluyen apudoma, coristoma, branquioma, síndrome carcinoide maligno, enfermedad cardíaca carcinoide, carcinoma (por ejemplo de Walker, de células basales, basoescamoso, de Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, in situ, Krebs 2, de células de Merkel, mucinoso, pulmonar de células no pequeñas, de células de avena, papilar, cirroso, bronquiolar, broncogénico, de células escamosas y de células transicionales), plasmacitoma, melanoma, condroblastoma, condroma, condrosarcoma, fibroma, fibrosarcoma, tumores de células gigantes, histiocitoma, lipoma, liposarcoma, mesotelioma, mixoma, mixosarcoma, osteoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, sinovioma, adenofibroma, adenolinfoma, carcinosarcoma, cordoma, mesenquimoma, mesonefroma, miosarcoma, ameloblastoma, cementoma, odontoma, teratoma, timoma, tumor trofoblástico, adenocarcinoma, adenoma, colangioma, colesteatoma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma, tumor de células granulosas, ginandroblastoma, hepatoma, hidradenoma, tumor de células de los islotes, tumor de células de Leydig, papiloma, tumor de células de Sertoli, tumor de células tecales, leiomioma, leiomiosarcoma, mioblastoma, mioma, miosarcoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, ependimoma, ganglioneuroma, glioma, meduloblastoma, meningioma, neurilemoma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, paraganglioma no cromafin, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, angioma esclerosante, angiomatosis, glomangioma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangiopercitoma, hemangiosarcoma, linfangioma, linfangiomioma, linfangiosarcoma, pinealoma, carcinosarcoma, condrosarcoma, cistosarcoma filoides, fibrosarcoma, hemangiosarcoma, leiomiosarcoma, leucosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, miosarcoma, mixosarcoma, carcinoma de ovario, rabdomiosarcoma, sarcoma (por ejemplo experimental de Ewing, de Kaposi y de mastocitos), neoplasmas y de otras células similares.

Preparaciones farmacéuticas

De acuerdo con la invención, se utilizan células tumorales atenuadas que expresan \alphaGal como vacunas terapéuticas para tratar tumores, pero se describe también su uso como vacunas profilácticas. Por tanto, la invención incluye también la utilización de preparaciones farmacéuticas para humanos y animales que implican a estas células tumorales transgénicas (expresadas como HA1, HA2, etc., ver la Tabla 1). Los expertos en la técnica médica apreciarán fácilmente que las dosis y las pautas de la composición farmacéutica variarán dependiendo de la edad, la salud, el sexo, el tamaño y el peso del humano y del animal. Estos parámetros pueden ser determinados para cada sistema mediante procedimientos y análisis bien establecidos, por ejemplo en ensayos clínicos de fase I, II y III y mediante revisión de los ejemplos proporcionados en la presente.

Para la administración, las células tumorales atenuadas pueden ser combinadas con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un vehículo o excipiente líquido adecuado y un aditivo o aditivos auxiliares opcionales. Los vehículos y excipientes líquidos son convencionales y están disponibles comercialmente. Son ilustrativos de los mismos el agua destilada, la solución salina fisiológica, soluciones acuosas de dextrosa, etcétera.

Formulaciones adecuadas para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular, oral o intraperitoneal, incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua o dispersable en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen ácidos grasos, por ejemplo aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, incluyendo por ejemplo carboximetil celulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano; opcionalmente la suspensión puede contener también estabilizantes. Además, las células de la vacuna tumoral pueden ser mezcladas con adyuvantes inmunes bien conocidos en la técnica tales como adyuvante completo de Freund, sales inorgánicas tales como cloruro de zinc, fosfato de calcio, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, saponinas, polímeros, lípidos o fracciones lipídicas (Lípido A, monofosforil lípido A), oligonucleótidos modificados, etc.

Además de la administración con vehículos convencionales, los ingredientes activos pueden ser administrados mediante una variedad de técnicas especializadas para la administración de fármacos que son conocidas por los expertos en la técnica. Los ejemplos siguientes se presentan únicamente con fines ilustrativos y no tienen la intención de limitar en modo alguno la invención.

La invención será ahora descrita con respecto a los ejemplos siguientes; sin embargo, no se desea que el ámbito de la presente invención esté limitado por los mismos.

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Ejemplo 1 Producción del vector retrovírico que expresa \alphaGT, pLNCKG

Un fragmento de 1.077 pb del gen de la \alphaGT murino fue amplificado mediante PCR con un cebador directo, 5'-ACAAAAGCTTGACATGGATGTCAAGGGAAAAGTAAT-3', que contiene una secuencia de Kozak para incrementar la traducción de \alphaGT, y un cebador inverso, 5'-AATTATCGATTCAGACATTATTTCTAAC-3', y posteriormente fue clonado en los sitios de ClaI y HindIII de pLNCX para producir el vector retrovírico pLNCKG (Figura 1). Este vector fue transfectado en la línea celular de empaquetamiento 293.AMIZ [Young y Link, "Chimeric retroviral helper virus and picornavirus IRES sequence to eliminate DNA methylation for improved retroviral packaging cells" J. Virol. (2000) 74: 5242-5249] para generar la línea celular productora del vector 293.AMIZ/LNCKG. Las células transfectadas fueron seleccionadas en presencia de G418 y Zeocin^{TM} durante dos semanas. Una población mixta de células seleccionadas fue subclonada mediante diluciones limitantes. VPC derivadas de células individuales fueron sometidas a selección por su capacidad para transducir eficazmente líneas celulares de cáncer epitelial humano establecidas a partir de diferentes tejidos. Se identificó el clon cuyo sobrenadante producía consistentemente la eficacia de transducción más elevada y la expresión de \alphaGT más elevada en un panel de líneas celulares de cáncer epitelial humano y se denominó 293Z.CKG VPC. Se generó para 293Z.CKG VPC un banco de células maestras, un banco de células de trabajo y un lote de producción a partir de un vial del banco de semillas, se expandieron en frascos a 37ºC \pm 1ºC en un 5% \pm 1% de CO_{2}. El medio de cultivo fue RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y L-glutamina 2 mM. Cuando el cultivo de 293Z.CKG VPC alcanzó densidad suficiente, se recogieron los fluidos del cultivo (sobrenadante), se filtraron y se agruparon en un recipiente estéril. La mezcla se mezcló totalmente y posteriormente se introdujo asépticamente en botellas de plástico estériles, etiquetadas. (Las etiquetas contenían el nombre del producto, el número de lote y la fecha de llenado). Las botellas llenas se congelaron y almacenaron a, o por debajo de, -60ºC. Se enviaron alícuotas para los ensayos de seguridad. Los sobrenadantes de 293Z.CKG VPC que contenían retrovirus fueron utilizados para transducir diferentes líneas celulares de cáncer humano (mencionadas en los ejemplos posteriores) para establecer vacunas de células completas \alphaGal^{(+)}.

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Ejemplo 2 Transducción de células de melanoma B16.BL6 con el vector retrovírico LNCKG

Para generar células B16 \alphaGal^{(+)}, 2 x 10^{6} células fueron transducidas con 2 ml de sobrenadante que contenía el retrovirus LNCKG con un título infeccioso de 2 x 10^{6} tu/ml. Las células fueron seleccionadas por resistencia a neomicina mediante una selección des dos semanas en medio suplementado con 1 mg/ml de G418. Después de este periodo de selección, las células fueron teñidas para detectar la expresión del epítopo \alphaGal con un anticuerpo policlonal anti-\alphaGal de pollo y separadas mediante separación de células activadas por fluorescencia.

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Ejemplo 3 Inducción de anticuerpos anti-\alphaGal en ratones carentes ("knockout") de \alpha(1,3)-galactosiltransferasa (\alphaGT KO) mediante inmunización con glóbulos rojos sanguíneos de conejo

Ratones hembras y machos de 8 a 14 semanas de edad carentes ("knockout" KO) de \alpha(1,3)-galactosiltransferasa (\alphaGT) fueron utilizados en este estudio. Los ratones eran inicialmente de haplotipo mixto (H-2 b/d) y mediante cría y selección se obtuvo la colonia actual de ratones \alphaGT KO que consistía en la generación consanguínea F4 de haplotipo H-2 b/b. Estos animales producían títulos bajos de anticuerpos naturales contra los epítopos \alphaGal. Con el fin de incrementar el título de Ab anti-\alphaGal, los ratones fueron inmunizados intraperitonealmente (i.p.) con 1 x 10^{8} glóbulos rojos sanguíneos de conejo dos veces separadas dos semanas. Se comprobaron los títulos de Ab anti-\alphaGal una semana después de la última inyección de RRBC para corroborar que todos los ratones del estudio tenían títulos elevados de Ab anti-\alphaGal. Todos los ratones utilizados en este estudio tenían títulos de Ab anti-\alphaGal elevados, mayores de la dilución 1:500, medidos mediante ELISA. Un experimento representativo está mostrado en la Fig. 3.

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Ejemplo 4 Ensayo de supervivencia después de la inyección subcutánea de una dosis letal de células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} no irradiadas

El objetivo de este experimento era determinar si la expresión de los epítopos \alphaGal en células cancerosas daría lugar a su rechazo hiperagudo in vivo en huéspedes con Ab anti-\alphaGal preexistentes. Por tanto, ratones \alphaGT KO inyectados con RRBC fueron desafiados con 10^{5} células de melanoma B16 no irradiadas que expresaban o no los epítopos \alphaGT, y se midió el desarrollo tumoral (Figura 4).

La Figura 5 muestra el tamaño del tumor 15 días después del desafío. Según se esperaba, 11 de los 19 ratones que recibieron B16 \alphaGal^{(-)} nativas desarrollaron tumores medibles dos semanas después del desafío. De manera similar, 10 de los 20 ratones que recibieron las células B16 \alphaGal^{(-)} B16.LNL, desarrollaron tumores (57% y 50%, respectivamente. Chi cuadrado, p>0,05, no significativa). Sin embargo, cuando los ratones recibieron las células B16 \alphaGal^{(+)}, significativamente menos animales desarrollaron tumores. Solamente 5 de 20 animales (25%) desarrollaron tumores palpables (Chi cuadrado, p=0,03, diferente significativamente del control). Además, los tumores fueron considerados más grandes en los animales desafiados con las células control y transducidas de manera ficticia, en comparación con los tumores desarrollados en los ratones que recibieron las células que expresaban \alphaGal. Se observaron tamaños medios de los tumores de 200 mm^{3} en ambos grupos control, no siendo las diferencias entre los grupos estadísticamente significativas (test F, p=0,38). Sin embargo, se observó una diferencia significativa en el tamaño de los tumores del grupo que recibió las células B16 \alphaGal^{(+)}. El tamaño tumoral medio del grupo de ensayo fue de 36 mm^{3}, lo que representa una reducción del 80% aproximadamente del tamaño tumoral en comparación con los animales control (test F, p=0,002).

Estos resultados demuestran que unos cuantos animales desarrollaron tumores más pequeños cuando fueron desafiados con células B16 que expresaban \alphaGal, indicando que los ratones presensibilizados con anti-\alphaGal son capaces de mediar un aclaramiento in vivo más eficaz de las células que expresan \alphaGal en comparación con los controles de B16 negativas para \alphaGal nativas o transducidas de manera ficticia.

Se observaron resultados comparables cuando se midieron los tumores 30 días después del desafío. Trece ratones de los 17 ratones del grupo que recibió B16 de tipo salvaje tenían tumores (76%). De manera similar, 13 de 18 ratones desarrollaron tumores grandes en el grupo que recibió células transducidas con el vector ficticio (72%). Sin embargo, solamente el 50% de los ratones tenían tumores medibles en el grupo que recibió las células que expresaban \alphaGal. Y lo que es más importante, un total de cuatro animales, dos de cada uno de los grupos control, tuvieron que ser eutanasiados debido al desarrollo de tumores grandes. Ninguno de los animales que recibieron las células que expresaban \alphaGal murió en los treinta días siguientes a la implantación del tumor, indicando un incremento de la supervivencia de los animales desafiados con las células que expresaban \alphaGal.

La Figura 6 muestra la cinética del desarrollo tumoral después del desafío con células B16 control, ficticias y que expresaban \alphaGal. Los tumores de ambos grupos control \alphaGal^{(-)} crecían extremadamente deprisa, casi doblando su volumen cada 7 días. Por el contrario, los tumores de los ratones desafiados con células B16 \alphaGal^{(+)} crecían significativamente más despacio a puntos de tiempo tempranos (p=0,03). Esto sugiere que mecanismo(s) inmune(s) puede(n) limitar el crecimiento del tumor y ayudar a prolongar la supervivencia de los ratones portadores de tumores.

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Supervivencia a largo plazo de los ratones después del desafío letal con células B16 \alphaGal^{(+)}

Los ratones de los grupos que recibieron B16 \alphaGal^{(-)} control, B16 \alphaGal^{(-)} transducidas de manera ficticia y B16 \alphaGal^{(+)} fueron observados semanalmente durante 90 días (Figura 7). Según se muestra en la figura, ninguno de los diez animales que recibieron B16 nativas sobrevivió al desafío y solamente un ratón de los 11 que recibieron células B16 \alphaGal^{(-)} transducidas de manera ficticia sobrevivió a la inyección subcutánea. Ambos grupos control mostraron curvas de supervivencia muy similares, indicando que el producto del gen NeoR no estaba induciendo un cambio significativo en el rechazo y/o la inmunogenicidad de B16 (Test de Rangos Logarítmicos, p=0,5, diferencias no estadísticamente significativas). Por el contrario, el 47% de los animales que recibieron células B16 no irradiadas que expresaban \alphaGal sobrevivió al desafío letal. Nueve de 19 ratones permanecieron sin tumores durante 80 días después de la inyección subcutánea. Utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, se observó un incremento significativo de la proporción de supervivencia en el grupo inyectado subcutáneamente con células B16 \alphaGal^{(+)} en comparación con los grupos control (Test de Rangos Logarítmicos, p<0,02).

En ambos grupos control inyectados con B16 \alphaGal^{(-)}, casi el 60% de los animales murió en los primeros 30 días después del desafío. Por el contrario, en el grupo experimental inyectado con B16 \alphaGal^{(+)}, solamente cinco animales (26%) tuvieron que ser eutanasiados en el primer mes después del desafío.

En un segundo experimento independiente se obtuvieron resultados similares. Solamente 2 de los 19 ratones inyectados subcutáneamente con B16 \alphaGal^{(-)} nativas sobrevivieron. De forma comparable, solamente 4 de 21 ratones sobrevivieron al desafío subcutáneo letal con células B16 \alphaGal^{(-)} transducidas de manera ficticia. Por el contrario, 8 de 20 ratones inyectados subcutáneamente con B16 \alphaGal^{(+)} sobrevivieron y permanecieron sin tumores durante más de 80 días.

En conjunto, estos resultados demuestran que la expresión del gen de \alphaGT y el cambio del patrón de glicosilación de B16 inducen la destrucción in vivo de células cancerosas vivas que ayudaron a reducir el crecimiento del tumor, prolongando la supervivencia de los ratones portadores de tumores. Y lo que es más importante, como alrededor del 40% de los ratones desafiados permanecieron sin tumores, la inyección de células que expresan \alphaGal puede dar lugar a la inducción de una potente respuesta inmune capaz de controlar el crecimiento de células de melanoma \alphaGal^{(-)} altamente letales.

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La supervivencia después del desafío letal con células B16 \alphaGal^{(+)} no irradiadas da lugar a la inducción de inmunidad de memoria protectora frente a B16 \alphaGal^{(-)} de tipo salvaje

Nosotros hipotetizamos que los animales que sobrevivieron a la inyección subcutánea de células B16 \alphaGal^{(+)} no irradiadas, desarrollaron una inmunidad celular que se extendía hacia el tumor B16 \alphaGal^{(-)} nativo. Para analizar esta hipótesis, todos los ratones supervivientes sin tumores fueron desafiados de nuevo con B16 de tipo salvaje (negativas para \alphaGal). Se incluyeron como controles ratones de la misma edad y fueron inyectados también con B16 \alphaGal^{(-)} (Fig. 8). Como se esperaba, 11 de los 12 ratones control desafiados con B16 \alphaGal^{(-)} murieron de melanoma subcutáneo, desarrollando tumores grandes y pigmentados (Fig. 9). Por otra parte, ninguno de los ratones que sobrevivieron al primer encuentro con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} no irradiadas desarrolló tumores. Los 8 ratones permanecieron todos ellos sin tumores durante 70 días, incrementando significativamente la supervivencia de los ratones que rechazaron primeramente las células B16 \alphaGal^{(+)} (Test de Rangos Logarítmicos, p<0,001). Y lo que es más interesante, la protección frente al melanoma B16 no estaba asociada con una despigmentación autoinmune (vitíligo) según había sido descrito previamente por otros autores [Overwijk y col., "Vaccination with a recombinant vaccinia virus encoding a self antigen induces autoinmune vitíligo and tumor cell destruction in mice: requirement for CD4+ T lymphocytes" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 2982-2987; Overwijk y col., "Tumor regression and autoimmunity after reversal of functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells" J. Exp. Med. (2003) 198: 569-580; van Elsas y col., "Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-CTLA-4 y GM-CSF-producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation" J. Exp. Med. (1999) 190: 355-366].

Este resultado demostraba que los ratones que sobrevivieron al desafío letal con células \alphaGal^{(+)} desarrollaron una potente inmunidad contra al tumor \alphaGal^{(-)} nativo. Esta respuesta inmune celular y posiblemente humoral protegió a los ratones supervivientes de un segundo desafío letal con el tumor de tipo salvaje, indicando que la respuesta inmune se había extendido hacia el tumor B16 \alphaGal^{(-)} nativo en todos los ratones protegidos.

Para demostrar además la hipótesis de que se había inducido en los ratones protegidos inmunidad mediada por células T, se generaron cultivos de células T específicas para melanoma y se ensayaron frente al melanoma B16 \alphaGal^{(-)} y frente a las líneas celulares no específicas EL-4 y MC38 (Figura 10).

Según se muestra en la Figura 11, se indujeron en los ratones protegidos potentes CTLs capaces de lisar específicamente las células de melanoma B16, según se midió mediante la liberación de LDH en las células diana.

En conjunto, estos resultados demuestran que la inyección de células \alphaGal^{(+)} incrementaba la supervivencia en ratones. Además, los ratones que rechazaron las células B16 \alphaGal^{(+)} y sobrevivieron a la inyección letal inicial, eran capaces de desarrollar una potente inmunidad que se extendía contra el tumor de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} nativo. Esto indica que se había inducido inmunidad de memoria mediada por células T después del rechazo de las células B16 \alphaGal^{(+)} capaz de reconocer el tumor B16 \alphaGal^{(-)}, protegiendo a los ratones de una dosis tumoral letal.

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Ejemplo 5 Modelo de metástasis de melanoma diseminada en los ratones \alphaGT KO mediante inyección intravenosa de una dosis letal de células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)} no irradiadas

Con el fin de demostrar además que los ratones con un título elevado de Ab anti-\alphaGal eran capaces de rechazar las células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)}, se utilizó el modelo de metástasis de melanoma en los pulmones. Se inyectaron ratones intravenosamente (i.v.) con 10^{5} células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)} o \alphaGal^{(+)} no irradiadas. Tres semanas más tarde, se contaron las metástasis de melanoma en los pulmones (Fig. 12). Los ratones inyectados con células B16 \alphaGal^{(-)} tenían muchas metástasis pulmonares. Por el contrario, los ratones inyectados con células B16 \alphaGal^{(+)} tenían una carga pulmonar reducida (Fig. 13). Además, dos de cinco ratones no tenían tumores. Este resultado indica que los Ab anti-\alphaGal preexistentes desempeñan una función importante en el aclaramiento de las células B16 \alphaGal^{(+)}.

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Ejemplo 6 Prevención del desarrollo de tumores subcutáneos mediante vacunación profiláctica con células \alphaGal^{(+)}

El objetivo de este experimento era determinar si podía conseguirse la prevención de tumores subcutáneos mediante vacunación con vacunas \alphaGal^{(+)}, según se describió previamente [La Temple y col., "Increased immunogenicity of tumor vaccines complexed with anti-\alphaGal: studies in knockout mice for \alpha1,3galactosyltransferase" Cancer Res. (1999) 59: 3417-3423]. Se inmunizaron ratones con RRBC según se describió previamente. Una semana después de la última inyección de RRBC, los ratones recibieron la primera dosis de la vacuna de células irradiadas. Los ratones fueron inyectados con células B16 \alphaGal^{(-)} nativas irradiadas, B16 \alphaGal^{(-)} transducidas con el vector control (pLNL, que codifica el Gen de Resistencia a Neomicina) irradiadas o con B16 \alphaGal^{(+)} (transducidas con el vector que codifica el Gen de Resistencia a Neomicina y el gen \alphaGT) irradiadas. Algunos ratones no recibieron vacunas de células irradiadas. La vacunación con las células se repitió dos semanas más tarde. Dos semanas después de la última vacunación, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 10^{5} células B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas (Figura 14). Los tumores fueron medidos dos veces a la semana durante 90 días. Según se muestra en la Figura 15, cero de 10 ratones que no recibieron las vacunas de las células B16 sobrevivieron al desafío y murieron antes de 50 días después del desafío. Se observó cierta protección en los ratones vacunados con las vacunas de B16 \alphaGal^{(-)} nativas y con las vacunas de B16 \alphaGal^{(-)}/NeoR. Cuatro de 14 y 5 de 12 ratones sobrevivieron al desafío con B16, respectivamente. No hay diferencia estadística entre los ratones vacunados con B16 y B16/NeoR, lo cual indica que bajo estas condiciones el producto del gen NeoR no incrementa la inmunogenicidad de B16 (p>0,2, Test de Rangos Logarítmicos). Por el contrario, se observó más protección significativa cuando los ratones fueron vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)}, ya que 12 de 20 ratones sobrevivieron al desafío y permanecieron sin tumores durante más de 90 días (p<0,001, ANOVA, p=0,08, Test de Rangos Logarítmicos). Este resultado demuestra que la vacunación con células \alphaGal^{(+)} irradiadas impide el desarrollo de tumores de melanoma subcutáneos en el 60% de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(+)} y prolonga significativamente la supervivencia de los ratones desafiados con melanoma B16 \alphaGal^{(-)}.

Nosotros hipotetizamos que se inducían células T capaces de reconocer las células B16 \alphaGal^{(-)} nativas después de la vacunación con la vacuna de B16 \alphaGal^{(+)} en ratones protegidos de la inyección con B16 \alphaGal^{(-)} vivas. Para analizar esta hipótesis, se recogieron esplenocitos de ratones vacunados con las vacunas de \alphaGal^{(+)} y se cultivaron durante 6 horas en presencia o ausencia de estimulación. Para una estimulación máxima se utilizó PMA/ionóforo de Ca^{++}. Las células fueron cultivadas con 10^{5} células B16 irradiadas para medir el reconocimiento específico o con CA320M, una línea celular \alphaGal^{(-)} no específica con idéntico haplotipo H-2 b/b. Después de la incubación, las células fueron recogidas y teñidas para detectar TNF-\alpha intracelular. La detección se llevó a cabo mediante FACS, acotando en linfocitos en la gráfica de Dispersión Frontal (Figura 16). Las células T recogidas de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(+)} eran activadas eficazmente por PMA/ionóforo de Ca^{++}. El porcentaje de linfocitos activados por este método de activador policlonal es considerado como la máxima activación detectada en este experimento. Las células T en reposo (no estimuladas) y las células T estimuladas con CA320M no fueron capaces de producir TNF-\alpha, indicando que no se habían inducido precursores de células T después de la vacunación con B16 \alphaGal^{(+)} capaces de reconocer antígenos en CA320M. Por el contrario, la vacunación con B16 \alphaGal^{(+)} inducía precursores de células T que reconocían específicamente B16 \alphaGal^{(-)} in vitro. Este resultado sugiere que estas células T inducidas después de la vacunación con B16 \alphaGal^{(+)} pueden ser responsables de la prevención de tumores en la mitad aproximadamente de los ratones tratados con B16 \alphaGal^{(+)}.

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Ejemplo 7 Tratamiento de tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos mediante vacunación con células \alphaGal^{(+)}

Como la vacunación con células B16 \alphaGal^{(-)} nativas y con B16/NeoR \alphaGal^{(-)} transducidas de manera ficticia tuvo como resultado datos similares en los experimentos mostrados anteriormente, se llevaron a cabo los experimentos siguientes con vacunación utilizando B16/NeoR \alphaGal^{(-)} irradiadas solas como control negativo para incrementar la potencia del análisis estadístico.

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El objetivo del siguiente experimento era determinar si el tratamiento de tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos podría ser realizado mediante vacunación con vacunas de B16 \alphaGal^{(+)}. No es obvio que el tratamiento preventivo eficaz sea también eficaz en el tratamiento de tumores preestablecidos. En el caso particular del melanoma B16 como modelo tumoral, varias estrategias han demostrado ser eficaces en programas de inmunización preventiva y han tenido un bajo impacto, o ningún impacto, en el tratamiento de tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos. Por ejemplo, la vacunación con virus vaccinia recombinantes que codifican mTRP-1 de ratón impide el desarrollo de tumores de melanoma subcutáneos y no tiene impacto en el tratamiento de tumores subcutáneos preestablecidos [Overwijk y col., "Vaccination with a recombinant vaccinia virus encoding a self antigen induces autoinmune vitíligo and tumor cell destruction in mice: requirement for CD4+ T lymphocytes" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 2982-2987]. De manera similar, la inmunización específica con un péptido da lugar a la inducción de una potente inmunidad de células T, pero raramente es eficaz para el tratamiento contra tumores preestablecidos [Davila y col., "Generation of antitumor immunity by cytotoxic T lymphocyte epitope peptide vaccination, CpG oligodeoxynucleotide adjuvant and CTLA-4 blockade" Cancer Research (2003) 63: 3281-3288]. Además, la única presencia de células T específicas para el tumor es condición necesaria pero no suficiente para inducir eficazmente la erradicación
del tumor.

Nosotros hipotetizamos que las vacunas de \alphaGal^{(+)} inducirán una potente inmunidad frente al tumor dependiente de células capaz de rechazar tumores \alphaGal^{(-)} preestablecidos. Para analizar esta hipótesis llevamos a cabo experimentos diseñados para tratar tumores preestablecidos (Figura 17).

Se inyectaron ratones subcutáneamente con 10^{5} células B16 no irradiadas y se distribuyeron aleatoriamente. Tres días después del desafío fueron vacunados subcutáneamente con células B16/NeoR \alphaGal^{(-)} irradiadas o con B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas. Tres días después se repitió la vacunación con las vacunas de células irradiadas. Los ratones control basales recibieron una inyección subcutánea con B16 no irradiadas y no recibieron tratamiento con la vacuna de células irradiadas (grupo sin vacuna). Las Figuras 18a y b muestran la cinética del crecimiento tumoral de los ratones no vacunados (n=11), de los ratones vacunados con B16/NeoR \alphaGal^{(-)} (n=24) y de los ratones que recibieron la vacuna de B16 \alphaGal^{(+)} (n=23). Los datos representan la media y las barras de error el SEM. El análisis estadístico indica una diferencia significativa de las pendientes cuando se comparan los ratones control con los ratones que recibieron las vacunas de células B16 \alphaGal^{(+)} (p<0,009). Este resultado indica que los ratones vacunados con las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas desarrollaban tumores más pequeños que crecían más lentamente.

En el Experimento #2, los ratones recibieron una dosis adicional de la vacuna de células. Los ratones que recibieron únicamente la inyección subcutánea con B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas desarrollaron tumores grandes que crecían muy rápidamente durante el primer mes de observación (n=15). De manera similar, los ratones inyectados con la vacuna control de B16 \alphaGal^{(-)}, desarrollaron tumores grandes que crecían muy rápidamente (n=29). La comparación estadística de las pendientes de estos dos grupos indicaba que no eran significativamente diferentes (p=0,17). Esto indica que la vacunación con B16/NeoR \alphaGal^{(-)} no tiene impacto en el tratamiento de tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos. Por el contrario, los ratones que recibieron las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)}, desarrollaron tumores más pequeños que crecían más lentamente (n=33). Había una diferencia estadísticamente significativa en el crecimiento tumoral de este grupo en comparación con los grupos control (p<0,03).

Estos dos experimentos indicaban que la vacunación con células B16 \alphaGal^{(-)} no es capaz de tratar tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos. Por otra parte, los tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos pueden ser tratados con éxito mediante vacunación con vacunas de B16 \alphaGal^{(+)}.

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Análisis de supervivencia de ratones con tumores subcutáneos preestablecidos tratados con vacunas de B16 \alphaGal^{(+)}

Ratones portadores de tumores subcutáneos B16 \alphaGal^{(-)} preestablecidos vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas mostraron una supervivencia prolongada cuando se compararon con los controles no vacunados y con los grupos vacunados de manera ficticia \alphaGal^{(-)} (Figura 19). Mientras que cero de 9 y sólo 1 de 20 animales no vacunados y vacunados de manera ficticia sobrevivieron al desafío subcutáneo, respectivamente, 5 de 19 ratones tratados con células B16 que expresaban \alphaGal sobrevivieron más de 70 días después del desafío. Los tiempos de supervivencia medios para el grupo sin vacuna y para el grupo con vacuna ficticia fueron 27 y 26 días, respectivamente. Por el contrario, el tiempo medio de supervivencia de los ratones que recibieron las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} fue incrementado significativamente (39 días). Este resultado demuestra que las vacunas de células B16 \alphaGal^{(+)} pueden tratar eficazmente tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos demostrado por el número incrementado de animales supervivientes (26% frente al 5%) y por el tiempo medio de supervivencia prolongado (39 frente a 26 días).

En un segundo experimento, los ratones recibieron tres dosis de las vacunas de células 4, 11 y 18 días después de la inyección subcutánea inicial con B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas (Fig. 20). La dosis de la vacuna cada vez fue de 3 x 10^{5} células. Hubo ratones no vacunados (n=12), vacunados con B16 \alphaGal^{(-)} (n=23) o vacunados con B16 \alphaGal^{(+)} (n=26).

La Figura 20 muestra el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier después de 70 días de observación. La comparación de las curvas de supervivencia mediante el test de rangos logarítmicos indicaba una diferencia significativa en el número de ratones supervivientes portadores de tumores de melanoma subcutáneos tratados con las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)}, en comparación con los ratones control no vacunados y con los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(-)} (p<0,005). Ninguno de los 12 ratones no vacunados sobrevivió a la inyección subcutánea con B16. De manera similar, ninguno de los 23 ratones vacunados con las vacunas B16 \alphaGal^{(-)} sobrevivió a la inyección subcutánea con B16. Por el contrario, 11 de los 26 ratones (42%) que recibieron las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} sobrevivieron durante 70 días después de la inyección subcutánea letal del melanoma B16 \alphaGal^{(-)}.

La supervivencia media de los ratones control y de los ratones vacunados de manera ficticia no era significativamente diferente (38 y 42 días, respectivamente, test de rangos logarítmicos, p=0,43, ns). Por el contrario, la supervivencia media de los ratones tratados con B16 \alphaGal^{(+)} fue mayor de 60 días. Esto representa un incremento significativo de la supervivencia media del grupo vacunado con \alphaGal (p<0,005).

Este resultado demostraba además que el tratamiento de los tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos con vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} era significativamente eficaz en comparación con la vacunación con \alphaGal^{(-)} o con el no tratamiento.

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Ejemplo 8 Tratamiento de las metástasis de melanoma en los pulmones mediante vacunas de células B16 \alphaGal^{(+)}

Evaluamos además la eficacia en el tratamiento de las metástasis de melanoma en los pulmones como modelo de enfermedad diseminada. Este experimento es muy relevante desde el punto de vista clínico, ya que los pacientes portadores de tumores morirán muy probablemente de la enfermedad diseminada, que no es extraíble quirúrgicamente. Por tanto, ratones inmunizados con RRBC fueron desafiados intravenosamente (i.v.) con 10^{5} células B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas y distribuidos aleatoriamente. Los ratones fueron tratados subcutáneamente con la vacuna de B16/NeoR irradiada (\alphaGal^{(-)}, n=6) o con la vacuna de B16 \alphaGal^{(+)} (n=7). Las vacunas (2 x 10^{5} células irradiadas) fueron administradas subcutáneamente 4, 11 y 21 días después de la inyección i.v. de B16 (Fig. 21). Los ratones fueron sacrificados 30 días después del desafío y se contó el número de metástasis de melanoma (Fig. 22). El número de metástasis pulmonares era "demasiado numeroso para ser contado" (valor arbitrario > 250 tumores) en 3 ratones y se contaron 30 tumores en los demás ratones, mientras que solamente dos ratones no tenían tumores. Además, uno de los animales de este grupo presentaba tres nódulos metastásicos adicionales en la cavidad peritoneal, demostrando la diseminación de la enfermedad en otros lugares además de en los pulmones.

Por el contrario, los ratones tratados con la vacuna de B16 \alphaGal^{(+)} no tenían ninguno de ellos tumores, demostrando que el tumor preestablecido había sido tratado con mucho éxito mediante la terapia con la vacuna que expresaba \alphaGal.

En un segundo experimento independiente (Fig. 23) se utilizó un escalado de dosis con incrementos de 5 veces de las B16 \alphaGal^{(-)} no irradiadas. Los ratones fueron inyectados i.v. con 5 x 10^{5} B16 vivas para preestablecer las metástasis de melanoma en los pulmones. Cuatro días más tarde, se llevó a cabo la vacunación con células control y con células B16 \alphaGal^{(+)}, igual que anteriormente. Hubo ratones que no recibieron tratamiento con ninguna vacuna (n=10), otros recibieron tres dosis de las vacunas de B16 \alphaGal^{(-)} (n=11) o de B16 \alphaGal^{(+)} (n=11).

Treinta después del desafío i.v. con B16, los ratones fueron eutanasiados y se contaron las metástasis de melanoma en los pulmones (Fig. 23). También se evaluó el crecimiento tumoral contando la carga tumoral en los pulmones y pesando el tejido pulmonar (Fig. 24).

Se encontraron numerosas metástasis de melanoma en los pulmones de los ratones no vacunados así como en el grupo vacunado con el control. Para realizar las comparaciones estadísticas se utilizó el peso del tejido pulmonar. La diferencia entre la carga pulmonar del grupo control y del grupo no vacunado no era estadísticamente diferente (test t no pareado, p=0,66, ns). Por el contrario, se observó una carga pulmonar significativamente reducida en los ratones vacunados con las vacunas de B16 que expresaban \alphaGal (ANOVA de una vía, p<0,006).

De manera similar a las observaciones del primer experimento, algunos ratones del grupo control y del grupo sin vacuna tenían metástasis de melanoma "demasiado numerosas para ser contadas". Además, dos animales tenían tumores de melanoma dispersados extrapulmonarmente, indicando la enfermedad diseminada además de en el tejido pulmonar. Ninguno de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(+)} tenía tumores de melanoma en los pulmones "demasiado numerosos para ser contados" y ninguno tenía tumores extrapulmonares. Esto indica que la vacunación con las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} puede tratar eficazmente el melanoma metastásico diseminado. Además, la vacunación con las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} puede impedir la propagación posterior de la enfermedad sistémica.

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Ejemplo 9 Estudios con células T para demostrar la inducción de precursores de células T específicas para B16 \alphaGal^{(-)} después de la vacunación con células B16 \alphaGal^{(+)}

Una de las cuestiones fundamentales de esta tecnología es si la vacunación con células \alphaGal^{(+)} inducirá inmunidad mediada por células T capaz de reaccionar contra el tumor \alphaGal^{(-)}. En los experimentos mostrados anteriormente demostramos que las vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} inducen una potente inmunidad capaz de mediar la eliminación de tumores \alphaGal^{(-)} preestablecidos. Esta inmunidad no es inducida cuando los ratones son vacunados con vacunas de B16 \alphaGal^{(-)}. Para demostrar adicionalmente que los precursores de células T específicos para los tumores de B16 \alphaGal^{(-)} eran inducidos después de la vacunación con vacunas de B16 \alphaGal^{(+)}, se llevaron a cabo estudios con células T in vitro. El objetivo de estos experimentos era demostrar el reconocimiento específico de las células B16 \alphaGal^{(-)} por células T. Se recogieron células T de ratones vacunados con la vacuna control de B16 \alphaGal^{(-)} o de ratones vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas (Figura 25). Se llevaron a cabo dos tipos de estudios que demostraron por diferentes medios la misma conclusión, esto es, que los ratones vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas tienen un número incrementado de precursores de células T capaces de reconocer específicamente las células tumorales B16 \alphaGal^{(-)}.

En el primer grupo de experimentos, se detectó la citoquina intracelular TNF-\alpha mediante FACS. Se recogieron células de los ratones vacunados con células B16 \alphaGal^{(-)} o con células B16 \alphaGal^{(+)} irradiadas, dos semanas después de la última vacunación subcutánea. Se cultivaron esplenocitos sin estimulación como control negativo. Para la estimulación, fueron cocultivados con CA320M (\alphaGal^{(-)}, singénicas de haplotipo H-2 b/b) como control negativo o con células B16 \alphaGal^{(-)}. Después de 6 horas de estimulación, se recogieron las células y se tiñeron para detectar TNF-\alpha intracelular. Se encontró un porcentaje incrementado de linfocitos TNF-\alpha^{(+)} en los bazos de los ratones vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)} que reconocían específicamente células B16 \alphaGal^{(-)} (Figura 26). Estas células T no producían TNF-\alpha cuando eran cultivadas con CA320M, lo cual indica que reconocen específicamente B16 y no reconocen una línea celular singénica no relacionada. Además del número incrementado de precursores de células T específicas para melanoma, el valor cuantitativo de TNF-\alpha producido por estas células estaba incrementado significativamente cuando se midió mediante la intensidad de fluorescencia media detectada por FACS (Figura 26). Se detectó una IFM incrementada cuatro veces en las células TNF-\alpha^{(+)}. Cuando se cultivaron esplenocitos de los ratones vacunados de manera ficticia con B16 \alphaGal^{(-)}, se detectó únicamente un 4% de células TNF-\alpha^{(+)} con una IFM de 17. Por el contrario, cuando células T de los ratones que recibieron las vacunas de células B16 \alphaGal^{(+)} fueron cultivadas con B16 \alphaGal^{(-)}, se detectó un 7% de células TNF-\alpha^{(+)} con una IFM de 69. Esto representa un incremento de dos veces en el porcentaje de precursores de células T presentes en el bazo. Este experimento fue repetido un total de tres veces y se obtuvieron resultados similares.

Este resultado demostraba que la vacunación con células B16 \alphaGal^{(+)} y la no vacunación con células B16 \alphaGal^{(-)} induce una potente inmunidad de células T específicas detectada in vitro por el reconocimiento específico del melanoma diana por las células T.

En un grupo de experimentos diferentes, se utilizaron marcadores de activación de la superficie celular para medir el reconocimiento específico por las células T de la línea celular de melanoma B16 \alphaGal^{(-)}. Esta bien descrito que después de la ocupación del receptor de células T (TCR), las células T incrementan de manera regulada varias moléculas de la superficie celular que indican un estado activado del linfocito. Una de estas moléculas es la cadena alfa del receptor de IL-2 o CD25. Después de la ocupación del TCR, CD25 aumenta de manera regulada y puede ser detectado mediante FACS 1 día después de la activación. De manera similar, CD69 (o antígeno de activación muy temprana (VEA)) aumenta de manera regulada tras la activación de las células T. CD69 funciona como un receptor que transmite señales en diferentes células, está implicado en los acontecimiento tempranos de la activación de los linfocitos y contribuye a la activación de las células T mediante la inducción de la síntesis de diferentes citoquinas y sus receptores. Ambos marcadores de activación (CD25 y CD69) son expresados a un nivel muy bajo en las células T en reposo. Para demostrar que la vacunación con células B16 \alphaGal^{(+)} inducía precursores de células T capaces de reconocer específicamente B16 \alphaGal^{(-)}, se utilizó el incremento regulado de los marcadores de activación como parámetro para medir el reconocimiento y la activación. Se recogieron células de ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(-)} o vacunados con B16 \alphaGal^{(+)}. Fueron cultivadas sin estimulación o estimuladas con una línea celular control negativo (CA320M) o con B16 \alphaGal^{(-)}. Después de 24 horas de cultivo, las células fueron recogidas y teñidas para detectar CD25 o CD69. La adquisición se llevó a cabo acotando las células que excluían la tinción vital 7-AAD (células vivas). Según se esperaba, las células T en reposo (sin estimulación) y las células estimuladas con la línea celular singénica CA320M que no es de melanoma, expresaban niveles muy bajos de los marcadores de activación (Figuras 27a y 27b). Cuando se cultivaron esplenocitos procedentes de ratones que recibieron B16 \alphaGal^{(-)} con B16, se observó cierto incremento regulado de los marcadores de activación. Esto corrobora informes previos de la literatura que indicaban que podía observarse un bajo grado de inmunorreactividad cuando los ratones reciben vacunas de B16 \alphaGal^{(-)} nativas. Sin embargo, esta reactividad no es suficiente para prevenir y/o tratar tumores de melanoma preestablecidos. Por otra parte, se detectó una activación incrementada de los linfocitos procedentes de ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(+)} cuando las células T fueron cultivadas con B16 \alphaGal^{(-)}, ya que se midió un número incrementado de células CD25^{(+)} y CD69^{(+)}.

Este resultado demostraba una vez más que la vacunación con células B16 \alphaGal^{(+)} inducía precursores de células T capaces de reconocer específicamente las células de melanoma B16 \alphaGal^{(-)}.

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Ejemplo 10 Tratamiento de tumores de melanoma metastásicos preestablecidos mediante transferencia adoptiva de células T procedentes de ratones vacunados con las vacunas de células B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)}

Los experimentos in vitro mostrados anteriormente demostraban que se inducía más cantidad y calidad de células T específicas para melanoma en los ratones vacunados con las células B16 \alphaGal^{(+)} cuando se comparaban con los ratones que recibieron la vacunación con células B16 \alphaGal^{(-)}. Estas células T específicas para melanoma se incrementaban en número (se encontraron más células T en los bazos) y producían más TNF-\alpha. Además, se activaban más esplenocitos cuando se cocultivaban con B16 (incremento regulado de CD25 y CD69). En los experimentos mostrados anteriormente, los ratones portadores de tumores subcutáneos y de metástasis pulmonares en los pulmones que recibieron B16 \alphaGal^{(+)} mostraron una supervivencia prolongada y una eliminación incrementada de los tumores pulmonares. Teniendo estos dos grupos de datos, pudimos deducir que de hecho las células T inducidas por la vacunación con B16 \alphaGal^{(+)} eran responsables del tratamiento de los tumores de melanoma preestablecidos. Sin embargo, no es obvio que éste sea el caso, ya que se ha demostrado que una gran cantidad de células T específicas para melanoma no es suficiente para tratar tumores de melanoma subcutáneos preestablecidos, debido a que están en un estado tolerante [Overwijk y col., "Tumor regression and autoimmunity after reversal of functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells" J. Exp. Med. (2003) 198: 569-580]. Nosotros hipotetizamos que la vacunación con células B16 \alphaGal^{(+)} inducía una potente inmunidad mediada por células que podía ser activada rápidamente después del recuerdo y que era responsable de la eliminación de tumores en los ratones portadores de enfermedad preestablecida. Para demostrar esta hipótesis se llevaron a cabo experimentos de transferencia celular adoptiva (Fig. 28). Los ratones donantes fueron vacunados recibiendo tres dosis de vacunas de B16 \alphaGal^{(+)} o de B16 \alphaGal^{(-)} irradiadas según se describió anteriormente. Los ratones receptores fueron inyectados i.v. con B16 \alphaGal^{(-)} vivas para establecer las metástasis de melanoma en los pulmones y se distribuyeron aleatoriamente. Cuatro días después de la inyección i.v. de B16 no irradiadas, los ratones recibieron o no recibieron células T de los donantes vacunados con las células B16 \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)}. Cuatro semanas después, se midió la carga de metástasis de melanoma en los pulmones contando los tumores pulmonares y pesando en bloque los pulmones obtenidos. El experimento se llevó a cabo dos veces y los resultados de ambos están representados en las Figuras 29a y 29b. El Experimento #1 muestra el peso de medio de los pulmones de los ratones que recibieron i.v. B16 sin terapia de células T (n=16), de los ratones que recibieron células T procedentes de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(-)} (n=15) y de los ratones que recibieron células T procedentes de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(+)} (n=17). Las barras representan la media de los pesos de los pulmones y las barras de error representan el SEM. Tumores grandes y un peso pulmonar incrementado significativamente estaban presentes en los ratones control y en los ratones que recibieron células T procedentes de ratones vacunados de manera ficticia. Se encontró que la diferencia de las metástasis de melanoma en pulmones entre los ratones que no recibieron células T (control) y los ratones que recibieron células T procedentes de los ratones vacunados de manera ficticia no era estadísticamente diferente (p>0,05). Por el contrario, se observó una reducción significativa de la carga de melanoma en los pulmones en los ratones que recibieron células T procedentes de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(+)} (ANOVA de una vía, p<0,05). Se observaron resultados similares en un segundo experimento independiente. Los ratones que no recibieron células T tenían una media de 64 tumores de melanoma en los pulmones (n=7). Los ratones que recibieron células procedentes de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(-)} tenían muchas metástasis de melanoma en los pulmones (media=90, n=10, p=>0,05). En contraste, se observó una media de solamente 31 tumores de melanoma en los pulmones en los ratones que recibieron esplenocitos procedentes de los ratones vacunados con células B16 \alphaGal^{(+)}. Esto representa una reducción significativa de la carga de melanoma en los pulmones de los ratones que recibieron células T procedentes de los ratones vacunados con B16 \alphaGal^{(+)}
(Test t no pareado, p<0,05).

Este notable éxito en la reducción de la metástasis de melanoma en los pulmones preestablecida con el único tratamiento de células procedentes de ratones vacunados con \alphaGal^{(+)}, demuestra por vez primera que se induce una potente inmunidad mediada por células mediante las vacunas con células \alphaGal^{(+)} y no con las vacunas de células \alphaGal^{(-)}. Esta potente inmunidad tumoral dependiente de células es, con pocas dudas, responsable del tratamiento de la enfermedad diseminada preestablecida.

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Ejemplo 11 Supervivencia de ratones "knockout" \alphaGal^{(-)} vacunados con células de sarcoma CA320M irradiadas \alphaGal^{(-)} o \alphaGal^{(+)} después de la inyección subcutánea de una dosis letal de células CA320M \alphaGal^{(-)} no irradiadas

Los experimentos de vacunación profiláctica descritos anteriormente con células de melanoma B16 fueron repetidos con una línea celular tumoral diferente derivada de los ratones "knockout" \alphaGal^{(-)} y por tanto son completamente singénicas con el huésped. Esta línea celular es CA320M y fue obtenida por inyección intraperitoneal de 2 mg de 9,10-dimetil-1,2-benz-antraceno (DMBA) y 1 mg de 3-metilcolantreno (3-MC) disueltos en 250 \mul de aceite de oliva a intervalos de dos semanas a ratones "knockout" \alphaGT. Un ratón presentó un tumor ocho meses después de la primera inyección. El tumor fue localizado en la cavidad intraperitoneal con una gran masa de 2 cm de ancho por 3 cm de alto y 1,5 cm de profundidad aproximadamente. Se observaron nódulos metastásicos localizados en los mesenterios. Se recogieron la masa primaria y el tracto intestinal para cultivo y examen histopatológico. Los nódulos metastásicos recogidos de los mesenterios asociados con el sitio primario del tumor fueron cultivados con éxito y se denominaron CA320M. El examen histopatológico de secciones congeladas y en parafina del tumor primario y del tumor trasplantado, respectivamente, demostró morfologías consistentes con un sarcoma poco diferenciado. La tinción con hematoxilina y eosina junto con el análisis inmunohistoquímico, sugiere que CA320M puede ser clasificado dentro de la familia de los tumores estromales gastrointestinales como un sarcoma del intestino delgado. Las células CA320M inducidas en un ratón \alphaGT KO no se unían a isolectina IB_{4} que detecta específicamente epítopos \alphaGal, verificando que este tumor murino, según se esperaba, carece de un enzima \alphaGT funcional y, por tanto, de epítopos \alphaGal. Las células CA320M eran susceptibles a la infección por un vector basado en HSV-1 y expresaban epítopos \alphaGal después de la transducción con HE7\alphaGalI.

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Se estimularon ratones \alphaGT KO para que desarrollan inmunidad frente al epítopo \alphaGal mediante inyección subcutánea de 2 x 10^{7} células sanguíneas completas de conejo dos veces a intervalos de 14 días. Las células CA320M fueron transducidas con 10 MOI de HDKgal o de HDKgal\DeltasalI durante ocho horas para obtener células CA320M \alphaGal^{(+)} o \alphaGal^{(-)}, respectivamente. Brevemente, HDKgal fue desarrollado insertando el gen de \alphaGT con una secuencia de Kozak en el vector HSV-1 con el amplicón de pHD1. El pHDKgal lleva por tanto un único gen eucariótico, \alphaGT, bajo el control del promotor de CMV. Para construir el gen de \alphaGT mutante, un único sitio de restricción de SalI, situado en el dominio catalítico correspondiente del enzima \alphaGT, fue cortado y rellenado utilizando Klenow y dNTPs. La mutación por desplazamiento del marco resultante da lugar a una terminación prematura del polipéptido, haciendo que el enzima no sea funcional. El gen de \alphaGT mutante fue clonado también en el amplicón de pHD1 y ambos amplicones fueron empaquetados en viriones de VHS infecciosos utilizando un sistema de virus herpes sin cooperador. Las células CA320M transducidas fueron irradiadas (25 Gy) y se inyectaron 1 x 10^{3} células en cada uno de 15 animales. Veintiún días más tarde, los animales fueron desafiados con 1 x 10^{7} células CA320M vivas y se monitorizaron para determinar el crecimiento tumoral y el análisis de supervivencia. El 93 por ciento de los animales vacunados con CA320M \alphaGal^{(+)} sobrevivieron al desafío con el tumor letal hasta 60 días (tumor > 400 mm^{3}) en comparación con los animales vacunados con las CA320M \alphaGal^{(-)} mutantes (33%) y con los controles sin vacunación (38%) (Figura 30). Estos resultados confirman que la vacunación con células singénicas \alphaGal^{(+)} es capaz de inducir una respuesta inmune protectora frente a las células \alphaGal^{(-)} correspondientes.

Tomados en conjunto, todos estos resultados demuestran por vez primera que la presencia de epítopos \alpha-galactosilo en vacunas de células completas representa un potente adyuvante inmune capaz de inducir inmunidad mediada por células T para tratar tumores preestablecidos que carezcan de la expresión de epítopos \alphaGal. Estos resultados indican también que la utilización clínica de esta vacuna puede tener un impacto significativo en la medicina humana. Además, la vacunación preventiva de pacientes de cáncer no es actualmente posible y, por consiguiente, abordajes terapéuticos como la tecnología descrita en la presente tienen un valor realista para la aplicación rápida y el posible beneficio para los pacientes con cáncer.

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Ejemplo 12 Desarrollo de la vacuna contra el cáncer de células completas humanas (HyperAcute^{TM})

Las vacunas contra el cáncer de células completas Hyperacute^{TM} constan de líneas de células cancerosas alogénicas manipuladas genéticamente para que expresen el gen de la \alpha(1,3)-galactosiltransferasa murina. Varias líneas celulares de cáncer independientes procedentes de diferentes tipos de tejido tumoral han sido manipuladas para que expresen epítopos \alphaGal en su superficie. Una vacuna contra el cáncer terapéutica de células completas consta de la inyección de líneas celulares individuales irradiadas o de una mezcla de varios tipos de células cancerosas manipuladas pertenecientes al mismo tipo de tejido tumoral. La Tabla 1 indica las líneas celulares de cáncer que fueron utilizadas para originar las vacunas contra el cáncer de células completas HyperAcute^{TM}.

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TABLA 1 Vacunas contra el cáncer de células completas HyperAcute^{TM}

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Las vacunas contra en cáncer de células completas HyperAcute^{TM} fueron establecidas por transducción de las líneas celulares indicadas en la Tabla 1 con sobrenadante retrovírico procedente de 293Z.CKG en presencia de 10 \mug/ml de sulfato de protamina. La población de células transducidas fue teñida para detectar epítopos \alphaGal en la superficie celular utilizando el anticuerpo anti-\alphaGal 0-2605 (NewLink). El 5% de la población celular con la intensidad más elevada de expresión de epítopos \alphaGal en su superficie fue separado en una subpoblación separada utilizando un separador FACS. La subpoblación separada de células transducidas con la expresión más elevada de epítopos \alphaGal fue la que se denominó según está indicado en la Tabla 1. Estas células fueron expandidas (proporción de división 1:5) para generar un banco maestro de células (MCB). Se monitorizaron el patrón de crecimiento, el aspecto morfológico y la intensidad media de expresión de epítopos \alphaGal y permanecieron estables durante todo el periodo de propagación en cultivo. Los MCB se desarrollaron expandiendo las células en frascos a 37ºC \pm 1ºC en un 5% \pm 1% de CO_{2}. El medio de cultivo fue RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y L-glutamina 2 mM. En cada pase las células fueron tripsinizadas, contadas y se determinó su viabilidad mediante exclusión de Azul Trypan. Las células fueron propagadas para proporcionar un billón de células, recogidas, agrupadas, distribuidas en 100 crioviales y congeladas utilizando una cámara de congelación de velocidad programada. Las células son almacenadas en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se desarrolló un banco de células de trabajo (WCB) para cada línea celular a partir de cada MCB. Las condiciones para la expansión, la recogida, la congelación y el almacenamiento del WCB fueron igual que las descritas para el MCB. Se originó un lote de producción para cada línea celular cancerosa HyperAcute^{TM} a partir de cada WCB. Cuando las células procedentes del lote de producción alcanzan una densidad suficiente, los fluidos del cultivo (sobrenadantes) son recogidos, filtrados y agrupados en un recipiente estéril. La agrupación de células es mezclada exhaustivamente y posteriormente introducida asépticamente en botellas de plástico estériles etiquetadas (las etiquetas contienen el nombre del producto, el número de lote y la fecha de llenado). Las botellas llenas son congeladas y almacenadas a, o por debajo de, -60ºC. Se envían alícuotas para el ensayo de seguridad. Las células para un Lote de Producción son recogidas por tripsinización, agrupadas y resuspendidas en medio de cultivo completo. Las células agrupadas son irradiadas a 150-200 Grey. Las células fueron irradiadas utilizando un acelerador lineal médico Varian Clinic 2100C operando en el modo de fotones a 6 MV. La salida de radiación de la máquina es calibrada en agua utilizando el protocolo de calibración AAPM TG-51. La consistencia de salida es monitorizada diariamente y la calibración de salida es comprobada mensualmente con un dosímetro de cámara iónica/electrómetro trazable con calibración NIST. Las células irradiadas son centrifugadas y resuspendidas en una formulación final para inyección que consta de glicerol al 5% y seroalbúmina humana. Posteriormente, se distribuyen 0,4 ml de células a concentraciones de 1 x 10^{6}/0,2 ml, 3,5 x 10^{6}/0,2 ml, 1 x 10^{7}/0,2 ml y 3,5 x 10^{7} células/0,2 ml, correspondientes a los niveles de dosis I, II, III y IV, en crioviales estériles. El ensayo de control de calidad para las células del MCB, el WCB y el PL de HyperAcute^{TM} implica a células y a sobrenadantes. Los criterios de aceptación para las células del MCB, el WCB y el PL de la vacuna contra el cáncer HyperAcute^{TM} consisten en ensayos para determinar tumorigenicidad en ratones desnudos.

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Ejemplo 13 Niveles de dosis y pautas de dosificación para pacientes humanos

Los datos siguientes apoyan los niveles de dosis propuestos y la pauta de vacunación propuesta. Estudios de toxicología preclínicos en ratones han demostrado que tumores alogénicos y singénicos que expresan \alpha-gal son bien tolerados hasta 1 x 10^{6} células por ratón, lo cual es equivalente a 3,5 x 10^{9} células para un humano de 70 kg. Un estudio de Fase I con células productoras del vector murino (ver la Sección 2.1) que expresan de forma natural epítopos \alpha-gal en la superficie celular, ha demostrado que VPC murinas eran bien toleradas a la dosis de 7 x 10^{9} células por paciente. En un ensayo de Fase II con VPC murinas, un paciente fue sometido a tres ciclos de tratamiento con 7 x 10^{9} células inyectadas en cada ciclo. El paciente toleró bien el tratamiento. Se repitieron las inyecciones de VPC murinas con un intervalo de 6 semanas. Los niveles de dosis propuestos están dentro de las dosis bien toleradas de la vacuna de \alpha-gal en ratones (máximo 4 x 10^{8} células por paciente). Intervalos de cuatro semanas entre las inyecciones de la vacuna permitirán un tiempo suficiente para la evaluación de la toxicidad del tratamiento y para la maduración de la respuesta inmune. Datos del estudio de Fase I con VPC murinas sugieren que la respuesta inmune anti-\alphaGal alcanza su máximo entre 14 y 21 días después de la inyección de las células que expresan \alphaGal.

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Ejemplo 14 Estudios de toxicología utilizando vacunas tumorales singénicas transducidas con un vector retrovírico portador del gen de la \alphaGT murina

En un primer estudio, se inyectaron ratones subcutáneamente con células de melanoma B16 \alphaGal^{(+)} a una dosis de 1 x 10^{5} células por ratón. Los animales que rechazaron las células de melanoma \alphaGal^{(+)} vivas se volvieron a desafiar con células B16 \alphaGal^{(-)} para demostrar que el rechazo de las células de melanoma \alphaGal^{(+)} inducía inmunidad frente al tumor. Todos los ratones sobrevivieron al segundo desafío con B16. Estos animales protegidos frente al melanoma (n=8 en el primer experimento y n=9 en el segundo experimento) fueron seguidos para estudios de toxicidad de larga duración durante un periodo de seis meses. Se han realizado observaciones histológicas, hematológicas y clínicas para estudios de toxicidad con algunos de los ratones protegidos. El examen histopatológico incluía los principales órganos perfundidos: riñón, bazo e hígado, así como el tejido diana potencial, piel y glándula mamaria. Los estudios histológicos que evaluaban la seguridad indicaron que no había lesiones notables en ninguna de las muestras de tejido examinadas (piel, glándula mamaria, riñón, bazo, hígado). Algunos ratones (que incluían ratones control) mostraron perivasculitis renal con infiltrados mínimos de células inflamatorias. La frecuencia de esta observación en el grupo de ensayo fue similar a la frecuencia en el grupo de animales control. Los resultados de la hematología mostraron que todos los valores estudiados estaban dentro del rango de los valores normales. Se consideraban valores normales los resultados de ratones \alphaGal KO no manipulados ni tratados. No se detectaron observaciones clínicas, incluyendo el comportamiento y el desarrollo de despigmentación autoinmune (vitíligo) o cambios en el pelo, como posibles eventos adversos secundarios, durante el periodo del estudio en los ratones protegidos frente al melanoma (n=17).

En un segundo estudio, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con células de mama alogénicas EMT-6 \alphaGal^{(+)} a una dosis de 1 x 10^{6} células por ratón. Dos, cuatro y seis semanas después de la vacunación, se obtuvieron muestras de sangre y tejidos para llevar a cabo estudios de toxicología. Se llevaron a cabo estudios de toxicidad histológicos y hematológicos. Los exámenes de histopatología incluían los órganos perfundidos principales: riñón, bazo e hígado, así como el tejido diana potencial, piel y glándula mamaria. Los estudios histológicos que evaluaban la seguridad no indicaron lesiones dignas de mención en ninguna de la muestras de tejido examinadas (piel, glándula mamaria, riñón, bazo, hígado). Algunos animales (que incluían ratones control) mostraron perivasculitis renal con infiltrados mínimos de células inflamatorias. La frecuencia de esta observación en el grupo de ensayo fue similar a la frecuencia en el grupo de animales control. Los resultados de hematología mostraron que todos los valores estudiados estaban dentro del rango de los valores normales. Se consideraron valores normales los resultados procedentes de ratones \alphaGal KO no manipulados ni tratados. Se observó una eosinofilia transitoria dos semanas después de la vacunación alogénica. La dosis máxima utilizada en los estudios de toxicología fue de 1 x 10^{6} células/ratón. El aumento a escala de esta dosis para humanos sobre la base de la dosis/kg, asumiendo que un ratón pesa 20 gramos, muestra que la dosis/ratón es equivalente a 3,5 x 10^{9} células en un humano de 70 kg. Considerando también que la duración media de la vida de un ratón es de 2 años aproximadamente en comparación con una media de 70 años para los humanos, el estudio de toxicidad de larga duración (6 meses) sería equivalente a la cuarta parte de la duración de la vida de los ratones, que es alrededor de 17 años en los humanos. Estos estudios apoyan la pauta de dosis actual de 4 x 10^{8} por paciente a lo largo de un periodo de tratamiento de 16 semanas.

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Ejemplo 15 Preparación y pauta de administración a los pacientes de la vacuna contra el cáncer HyperAcute^{TM}

Este procedimiento describe cómo preparar y administrar a pacientes humanos la vacuna contra el cáncer de células completas (la composición farmacéutica de la invención). Las células deben ser inyectadas a los pacientes inmediatamente después de haber sido preparadas. No son necesarias precauciones de seguridad específicas, ya que las células administradas han sido irradiadas letalmente antes de ser congeladas. En primer lugar, se recuperan los crioviales de cada línea de células vacuna del contenedor de nitrógeno líquido. Posteriormente, todos los viales son descongelados simultáneamente mediante inmersión en un baño de agua a 37ºC hasta por encima del nivel del contenido congelado. Tan pronto como los viales se hayan descongelado, se lava su superficie con alcohol al 70%. Se combinan en una jeringa para inyección cantidades iguales del(los) contenido(s) del(los) vial(es) de cada línea celular componente de la vacuna y se inyectan inmediatamente al paciente. Las células de la vacuna serán inyectadas intradérmicamente (i.d.) utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 25. Las inyecciones deben administrarse en los brazos y en las piernas de forma rotatoria. Las células de la vacuna HAB serán administradas los días 1, 29, 57 y 85. Los pacientes serán monitorizados durante dos horas después de cada inyección en la clínica para pacientes externos por el personal de enfermería. La monitorización de los pacientes debe incluir: la temperatura (T), el pulso (P), la presión sanguínea (BP) y el ritmo respiratorio (R), dentro de los 30 minutos anteriores a la administración de la vacuna y, posteriormente, comprobando estos parámetros cada 15 minutos x 4, a continuación cada 30 minutos x 2 después de la vacunación. La temperatura será comprobada antes de abandonar la clínica. Además, los pacientes serán monitorizados para detectar signos de reacciones agudas, incluyendo erupción cutánea local o diseminada y otras reacciones adversas. Los pacientes que experimenten acontecimientos adversos agudos de Grado II o mayor pueden ser monitorizados durante 1-2 horas adicionales en la clínica hasta que el acontecimiento se haya resuelto hasta un Grado menor de II. Si persiste un acontecimiento adverso (AE) de Grado II o mayor durante más de 4 horas a pesar de la observación y/o el tratamiento, debe tomarse una decisión de si continuar la observación, instituir o modificar el tratamiento o ingresar al paciente en el hospital.

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Ejemplo 16 Determinación de la dosis máxima tolerada

El tratamiento se llevará a cabo en cohortes de dosis de 3 pacientes adecuados. Se define la dosis máxima tolerada (MTD) como la cohorte de dosis por debajo de la cual se observa toxicidad limitante de la dosis (DLT). Si >33% de los pacientes (esto es, 1/3 o 2/4-6) de una cohorte de dosis manifiestan DLT, se habrá determinado entonces la MTD y no se permitirán más incrementos de dosis. Si se observa DLT en uno de tres pacientes (1/3) de una cohorte de dosis, entonces esa cohorte será expandida hasta acumular un total de seis (6) pacientes. Si se observa otra DLT, se cerrará la cohorte, se definirá la MTD y no se permitirá un incremento de dosis posterior. Si no se observa en la cohorte ninguna otra DLT, se iniciará una acumulación hacia la cohorte de dosis mayor siguiente. Se tratarán más pacientes en la porción del estudio de Fase II con la MTD.

Habrá un retraso mínimo de 4 semanas entre la entrada del último paciente en una cohorte de dosis y la entrada del primer paciente en la cohorte de dosis mayor siguiente.

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TABLA 2 Plan de Tratamiento

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La respuesta y la evolución se evaluaron en este estudio utilizando los nuevos criterios internacionales propuestos por el Comité "Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) Committee". Cambios en solamente el diámetro mayor (medida unidimensional) de las lesiones tumorales son utilizados en los criterios RECIST. Las lesiones son medibles o no medibles utilizando los criterios proporcionados a continuación. El término "evaluable" con referencia a la capacidad de ser medido no se utilizará, ya que no proporciona ningún significado ni ninguna precisión adicionales. Se definen lesiones medibles como aquéllas que pueden ser medidas de manera precisa en al menos una dimensión (diámetro más largo para ser registrado) como \geq20 mm con técnicas convencionales (CT, MRI, rayos x) o como \geq10 mm con un barrido de CT en espiral. Todas las medidas de los tumores deben ser registradas en milímetros (o en fracciones decimales de centímetros). Todas las demás lesiones (o sitios de enfermedad), incluyendo las lesiones pequeñas (diámetro más largo <20 mm con técnicas convencionales o <10 mm utilizando un barrido de CT en espiral), son consideradas como enfermedad no medible. Las lesiones óseas, la enfermedad leptomeníngea, el líquido ascítico, efusiones pleurales o pericárdicas, linfangitis cutis o pulmonis, enfermedad inflamatoria de la mama, masas abdominales (no seguidas por CT o MRI) y las lesiones quísticas son todas ellas consideradas no medibles. Todas las lesiones medibles hasta un máximo de cinco lesiones por órgano y 10 lesiones en total, representativas de todos los órganos implicados, deben ser identificadas como lesiones diana y registradas y medidas en la línea basal. Las lesiones diana deben ser seleccionadas sobre la base de su tamaño (lesiones con el diámetro más largo) y su idoneidad para medidas repetidas precisas (mediante técnicas de imagen o clínicamente). Se calcula la suma del diámetro más largo (LD) para todas las lesiones diana y se describe como la suma de los LD basal. La suma de los LD basal será utilizada como referencia mediante la cual se caracterizará la respuesta del tumor objetivo. Todas las demás lesiones (o sitios de enfermedad) deben ser identificadas como lesiones no diana y deben ser también registradas en la línea basal. Las lesiones no diana incluyen las lesiones medibles que sobrepasen el número máximo por órgano o el total de todos los órganos implicados así como las lesiones no medibles. No se requiere la medida de estas lesiones, pero la presencia o ausencia de cada una de ellas debe ser indicada a lo largo del seguimiento. Todas las medidas deben ser tomadas y registradas en notación métrica utilizando una regla o preferiblemente un calibre. Todas las evaluaciones basales deben ser realizadas tan cerca como sea posible del comienzo del tratamiento y nunca más de 2 semanas antes del comienzo del tratamiento. Las lesiones tumorales que estén situadas en un área irradiada previamente no son consideradas como medibles. Las lesiones clínicas son consideradas medibles únicamente cuando son superficiales (por ejemplo, nódulos cutáneos y nódulos linfáticos palpables). En el caso de lesiones cutáneas, se recomienda la documentación mediante fotografía digital en color, incluyendo una regla para estimar el tamaño de la lesión. Las lesiones en rayos x del tórax son aceptables como lesiones medibles cuando están claramente definidas y rodeadas por un pulmón oxigenado. Sin embargo, se prefiere la CT. La tomografía computerizada (CT) convencional y las imágenes de resonancia magnética (MRI) debe ser realizadas con cortes contiguos de 10 mm de espesor o menores. La CT espiral debe ser realizada utilizando un algoritmo de reconstrucción contigua de 5 mm. Esto aplica tumores del tórax, el abdomen y la pelvis. Los tumores de cabeza y cuello y los de las extremidades requieren normalmente protocolos específicos. Se utiliza ultrasonido (US) cuando el punto final primario del estudio es la evaluación de la respuesta objetiva. No debe utilizarse US para medir lesiones tumorales. Es, sin embargo, una alternativa posible a las medidas clínicas de nódulos linfáticos palpables superficiales, lesiones subcutáneas y nódulos tiroideos. Los US podrían ser también útiles para confirmar la desaparición completa de lesiones superficiales, determinada normalmente mediante examen clínico. La endoscopia y la laparoscopia para la evaluación objetiva de tumores no han sido todavía validadas completamente ni generalizadamente. Sus usos en este contexto específico requieren un equipamiento sofisticado y un nivel elevado de experiencia que pueden estar disponibles únicamente en algunos centros. Por tanto, la utilización de tales técnicas para valorar la respuesta tumoral objetiva debe estar limitada a fines de validación en centros de referencia. Sin embargo, tales técnicas pueden ser útiles para confirmar la respuesta patológica completa cuando se obtienen biopsias. No pueden utilizarse marcadores tumorales solos para determinar la respuesta de los tumores de mama. Pueden utilizarse citología e histología para diferenciar entre respuestas parciales (PR) y respuestas completas (CR) en casos raros (por ejemplo, lesiones residuales en tipos tumorales tales como tumores de células germinales, en los que pueden permanecer tumores benignos residuales conocidos). La confirmación citopatológica del origen neoplásico de cualquier efusión que aparezca o empeore durante el tratamiento cuando el tumor medible ha cumplido los criterios de respuesta o enfermedad estable, es obligatoria para diferenciar entre respuesta o enfermedad estable (una efusión puede ser un efecto colateral del tratamiento) y enfermedad progresiva.

De todo lo anterior puede verse que la invención consigue al menos todos sus objetivos.

Claims

1. Una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de un tumor preestablecido en un animal que sintetice anti-\alphaGal que comprende: una mezcla de células tumorales vacuna atenuadas alogénicas para dicho animal, conteniendo dichas células una secuencia que codifica \alpha(1,3)-galactosiltransferasa y una pluralidad de glicoproteínas o glicolípidos en la superficie celular sobre las cuales está presente un epítopo \alphaGal, y un vehículo.

2. Una composición farmacéutica para estimular una respuesta inmune simultáneamente hacia una pluralidad de antígenos tumorales, independientemente de su estado de glicosilación, en un animal que sintetice anti-\alphaGal portador de un tumor preestablecido, que comprende: una mezcla de células tumorales vacuna completas atenuadas alogénicas para dicho animal, codificando dichas células una proteína \alpha(1,3)-galactosiltransferasa y una pluralidad de glicoproteínas o glicolípidos de la superficie celular sobre los cuales está presente un epítopo \alphaGal, de tal manera que los antígenos de la célula tumoral completa puedan ser presentados al sistema inmune, y un vehículo adecuado.

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que dichas células tumorales son células de carcinoma de células grandes, de carcinoma de células escamosas, de adenocarcinoma ascítico, de carcinoma de efusión pleural, de carcinoma epitelial ductal primario, de adenocarcinoma metastásico, de adenocarcinoma primario, de carcinoma de células claras, de adenocarcinoma de ovario, de teratocarcinoma de ovario, de melanoma maligno, de carcinoma colorrectal, de adenocarcinoma colorrectal o de adenocarcinoma colorrectal de grado II.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichas células tumorales vacuna derivan de células A549, células NCI-H460, células NCI-H520, células MCF-7, células BT-20, células HPAF-II, células PANC-1, células ASPC-1, células BxPC3, células IGROV, células ES-2, células NIH:OVCAR3, células COLO829, células G-361, células HCT-116, células COLO205, células LoVo, células WiDr, células DLD-1, células HCT-15, células SW620, células SW480, células SW1116, células HT-29, células FHC, células CCD841CoN, células PC-3, células LNCaPFGC, células MDAPca2b o células DU145.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha composición contiene una célula vacuna obtenible mediante el método que comprende:

(a): la obtención del vector retrovírico pLNCKG, conteniendo dicho vector una secuencia de nucleótidos del vector pLNCX de SEC ID Nº: 1 y una secuencia de nucleótidos del \alphaGT murino clonada en el vector pLNCX en los sitios de las endonucleasas de restricción ClaI y HindIII del vector pLNCX;

(b): la transfección de una línea celular productora de vectores 293.AMIZ con el vector retrovírico para obtener una línea celular productora de vectores 293.AMIZ/LNCKG;

(c): la recogida del sobrenadante de 293.AMIZ/LNCKG para obtener el retrovirus de pLNCKG; y

(d): la transducción en presencia de sulfato de protamina de una de las líneas celulares de cáncer humano A549 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-185), NCI-H460 (Nº de Acceso de la ATCC: HTB-177), NCI-H520 (Nº de Acceso de la ATCC: HTB-182), MCF-7 (Nº de Acceso de la ATCC: HTB-22), BT-20 (Nº de Acceso de la ATCC: HTB-19), HPAF-II (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1997), PANC-1 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1469), ASPC-1 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1682), BxPC3 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1687), IGROV (Nº de Acceso de la ATCC: NA), ES-2 (Nº de Acceso de la ATCC: Curl-1978), NIH:OVCAR3 (Nº de Acceso de la ATCC: HBT-161), PA-1 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1572), A375 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1619), COLO829 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1974), G-361 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1424), HCT-116 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-247), COLO205 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-222), LoVo (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-229), WiDr (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-218), DLD-1 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-221), HCT-15 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-225), SW620 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-227), SW480 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-228), SW1116 (Nº de Acceso de la ATCC: CCL-233), HT-29 (Nº de Acceso de la ATCC: HTB-38), FHC (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1831), CCD841CoN (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1790), PC-3 (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1435), LNCaPFGC (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-1740), MDAPca2b (Nº de Acceso de la ATCC: CRL-2422), DU145 (Nº de Acceso de la ATCC: HTB-81) para obtener las vacunas de células completas denominadas respectivamente HAL1, HAL2, HAL3, HAB1, HAB2, HAPA1, HAPA2, HAPA3, HAPA4, HAO1, HAO2, HAO3, HAO4, HAM1, HAM2, HAM3, HAC1, HAC2, HAC3, HAC4, HAC5, HAC6, HAC7, HAC8, HAC9, HAC10, HAC11, HAC12, HAPR1, HAPR2, HAPR3, HAPR4.

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6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene además un adyuvante.

7. Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune frente a células tumorales en un animal que sintetice anti-\alphaGal portador de un tumor preestablecido, que comprende: una mezcla de células tumorales atenuadas alogénicas para dicho animal, conteniendo dichas células una secuencia que codifica \alpha(1,3)galactosiltransferasa y una pluralidad de glicoproteínas o glicolípidos de la superficie celular sobre los cuales está presente un epítopo \alpha-galactosilo, donde dichas células tumorales derivan del grupo de células A549, NCI-H460, NCI-H520, MCF-7, BT-20, HPAF-II, PANC-1, ASPC-1, BxPC3, IGROV, ES-2, NIH:OVCAR3, PA1, A375, COLO829, G-361, HCT-116, COLO205, LoVo, WiDr, DLD-1, HCT-15, SW620, SW480, SW1116, HT-29, FHC, CCD841CoN, PC-3, LNCaPFGC, MDAPca2b o DU145; y un vehículo.

8. Una composición farmacéutica para el tratamiento de células tumorales en los tejidos de un animal, conteniendo dicha composición una o más vacunas de células completas, donde dichas vacunas de células completas son obtenibles mediante el método definido en la reivindicación 5.

9. Utilización de una mezcla de células tumorales atenuadas alogénicas para un paciente con células tumorales preestablecidas, expresando dichas células el gen de la \alpha(1,3)-galactosiltransferasa y conteniendo una pluralidad de glicoproteínas en la superficie celular sobre las cuales está presente un epítopo \alphaGal, en la fabricación de un medicamento para inducir la destrucción mediada por el sistema inmune de las células tumorales de dicho paciente, donde dicho paciente es un animal que sintetice anti-\alphaGal.

10. Utilización de una composición que contiene una mezcla de células tumorales atenuadas alogénicas para un animal que sintetice anti-\alphaGal con un tumor preestablecido, y modificadas genéticamente con un polinucleótido que codifica una proteína \alpha(1,3)-galactosiltransferasa, en la fabricación de un medicamento para tratar a dicho animal.

11. La utilización de células tumorales irradiadas letalmente alogénicas para un animal que sintetice anti-\alphaGal con células tumorales preestablecidas, y que expresan el gen de la \alpha(1,3)-galactosiltransferasa, en la fabricación de un medicamento para tratar a dicho animal.

12. La utilización de la reivindicación 11 en la que el polinucleótido \alpha(1,3)-galactosiltransferasa es de origen murino.

13. La utilización de la reivindicación 11 ó 12, en la que dicho gen codifica una \alpha(1,3)-galactosiltransferasa con al menos un 70% aproximadamente de identidad de secuencias de aminoácidos, o un 85% de similitud de secuencias de aminoácidos, con la secuencia de SEC ID Nº: 2.

14. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que el gen de la \alpha(1,3)-galactosiltransferasa es introducido en las células por un vector.

15. La utilización de la reivindicación 14, en la que el vector es un vector vírico.

16. La utilización de la reivindicación 15, en la que el vector vírico está basado en un vector retrovírico murino, en un vector lentivírico, en un vector adenovírico, en un vector adenoasociado o en un vector virus del herpes simple.