TW202134430A - 腫瘤細胞疫苗 - Google Patents

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賈斯汀 詹姆斯 安特
陶得 梅利爾 班德
亞力山德 多戈特
邁西亞 杭特
安麗莎 巴拉奎西南 路易斯
坎德 Ｍ 莫勒
丹尼爾 李 邵勒
建 顏
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Abstract

本揭示案提供一種同種異體全細胞癌症疫苗平台，其包括用於治療及預防癌症之組合物及方法。本文提供含有治療有效量之來自一或多種癌細胞株之細胞的組合物，癌細胞株中之一些或全部經修飾以(i)抑制或減少細胞對一或多種免疫抑制因子之表現，及/或(ii)表現一或多種免疫刺激因子或增加細胞對一或多種免疫刺激因子之表現，及/或(iii)表現一或多種腫瘤相關抗原(TAA)，包括已突變之TAA或增加其表現，且癌細胞株包含天然表現異質性腫瘤相關抗原及/或新抗原之癌細胞株。本文亦提供疫苗組合物之製造方法、其製備方法及其使用方法。

Description

腫瘤細胞疫苗
以引用之方式併入以電子方式提交之材料
作為本揭示案之一部分的序列表與說明書同時以正文檔案提交。含有序列表之正文檔案之名稱為「54907A_Seqlisting.txt」，其創建於2020年11月29日且大小為343,801位元組。序列表之主題以全文引用之方式併入本文中。
癌症係死亡之主要原因。包括檢查點抑制劑之免疫治療方法的最新突破已大大促進癌症之治療，但此等方法既不可定製，亦不能廣泛應用於各種適應症或一種適應症內之所有患者。此外，只有一部分患者適合此等免疫療法且對其產生反應。治療性癌症疫苗具有在癌症患者中產生能夠引起臨床反應之抗腫瘤免疫反應的潛力，但此等療法中之許多療法具有單一目標，或者免疫調節目標之範圍及/或抗原特異性之廣度受到限制。定製用於適應症之靶向個別腫瘤內細胞異質性之治療性疫苗的開發仍然係挑戰。
絕大部分治療性癌症疫苗平台本身在單個調配物中可靶向之抗原數目有限。此等疫苗缺乏廣度會對功效產生不利影響，且可經由一種稱為抗原逃逸之現象導致臨床復發，且出現抗原陰性腫瘤細胞。儘管此等方法可在某種程度上減輕腫瘤負荷，但其不能消除抗原陰性腫瘤細胞或癌症幹細胞。利用患者自身之免疫系統來靶向廣泛抗原可減輕腫瘤負荷，以及經由免疫反應之抗原異質性防止復發。因此，需要改善之全細胞癌症疫苗。本文提供解決此需要之方法及組合物。
在各種實施例中，本揭示案提供一種同種異體全細胞癌症疫苗平台，其包括用於治療及預防癌症之組合物及方法。本揭示案提供可定製用於治療多種實體腫瘤適應症且靶向個別腫瘤內之細胞異質性的組合物及方法。本揭示案之實施例的組合物及方法廣泛適用於實體腫瘤適應症及罹患此類適應症之患者。在一些實施例中，本揭示案提供癌細胞株之組合物，該等癌細胞株(i)如本文所述進行修飾，且(ii)表現足夠數目及量之腫瘤相關抗原(TAA)，使得當向罹患癌症(a cancer)、癌症(cancers)或癌性腫瘤之個體投與時，產生TAA特異性免疫反應。
在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中該組合物能夠引發特異性針對該至少5種TAA之免疫反應。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少10種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中該組合物能夠引發特異性針對該至少10種TAA之免疫反應。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少15種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中該組合物能夠引發特異性針對該至少15種TAA之免疫反應。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少15種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現。在再一實施例中，本文提供一種前述組合物，其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍數。
在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。在另一實施例中，本文提供一種前述組合物，其中各細胞株或該等細胞株之該組合包含表現5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種或30種與意欲接受該組合物之該個體之該癌症相關的TAA的細胞。在另一實施例中，該組合物包含2種、3種、4種、5種或6種癌細胞株。在再一實施例中，各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以表現1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種免疫刺激因子或增加其表現。在又一實施例中，各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以抑制或減少1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種免疫抑制因子之表現。
在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少2種免疫刺激因子之細胞或增加其表現。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中該等細胞株中之至少1種經修飾以減弱或剔除CD276、TGFβ1及TGFβ2中之一或多者。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中該至少1種免疫刺激因子增加樹突狀細胞成熟。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍數。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1.5倍。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1.5倍。在再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1.7倍。在又一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少2.0倍。
在一個實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。在另一實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。在另一實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
在另一實施例中，本文提供一種前述免疫原性組合物，其中各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以(i)表現3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子或增加其表現，及/或(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種TAA之表現。在另一實施例中，本文提供一種前述免疫原性組合物，相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍或2倍。
在又一實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。在另一實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。在另一實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。在另一實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
在一些實施例中，提供一種前述免疫原性組合物，其中該組合物包含4、5或6種癌細胞株。在一些實施例中，各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種或更多種TAA之表現的細胞。在另一實施例中，各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以(i)表現3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種TAA之表現。
在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)表現CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、FBP、TDGF1、緊密連接蛋白18、LYK6K、FAP、PRAME、HPV16/18 E6/E7或其突變型式中之一或多者或增加該等因子表現。在一些實施例中，其中該等突變型式包含：(i)選自由以下組成之群組的經修飾型式：modTERT、modPSMA、modMAGEA1、modTBXT、modBORIS、modFSHR、modMAGEA10、modMAGEC2、modWT1、modKRAS、modFBP、modTDGF1、mod緊密連接蛋白18、modLY6K、modFAP及modPRAME；或(ii)選自由以下組成之群組的融合蛋白：modCT83-MSLN、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65、modTBXT-modBORIS、modFSHR-modMAGEA10、modTBXT-modMAGEC2、modTBXT-modWT1、modTBXT-modWT1-KRAS、modWT1-modFBP、modPSMA-modTDGF1、modWT1-mod緊密連接蛋白18、modPSMA-modLY6K、modFAP-mod緊密連接蛋白18及modPRAME-modTBXT。在其他實施例中，該等突變型式包含：(i)選自由以下組成之群組的經修飾型式：mod間皮素(SEQ ID NO: 62)、modTERT(SEQ ID NO: 36)、modPSMA(SEQ ID NO: 38)、modMAGEA1(SEQ ID NO: 73)、modTBXT(SEQ ID NO: 79)、modBORIS(SEQ ID NO: 60)、modFSHR(SEQ ID NO: 95)、modMAGEA10(SEQ ID NO: 97)、modMAGEC2(SEQ ID NO: 87)、modWT1(SEQ ID NO: 81)、KRAS G12D(SEQ ID NO: 83)or KRAS G12V(SEQ ID NO:85)、modFBP(SEQ ID NO: 93)、modTDGF1(SEQ ID NO: 89)、mod緊密連接蛋白18(SEQ ID NO: 110)、modLYK6K(SEQ ID NO: 112)、modFAP(SEQ ID NO: 115)及modPRAME(SEQ ID NO:99)；或(ii)選自由以下組成之群組的融合蛋白：CT83-MSLN(SEQ ID NO: 22)、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65(SEQ ID NO: 40)、modTBXT-modBORIS(SEQ ID NO:42)、modFSHR-modMAGEA10(SEQ ID NO: 44)、modTBXT-modMAGEC2(SEQ ID NO: 46)、modTBXT-modWT1(SEQ ID NO: 48)、modTBXT-modWT1(KRAS)(SEQ ID NO: 50)、modWT1-modFBP(SEQ ID NO: 52)、modPSMA-modTDGF1(SEQ ID NO: 54)、modWT1-mod緊密連接蛋白18(SEQ ID NO: 56)、modPSMA-modLY6K(SEQ ID NO: 58)及modPRAME-modTBXT(SEQ ID NO: 66)。
在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加該癌幹細胞株不表現或表現極低之至少1種TAA之表現。在一些實施例中，該至少1種TAA係選自由以下組成之群組：TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、緊密連接蛋白18、LY6K、FAP、PRAME、HPV16/18 E6/E7及FAP，或其突變型式。
在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加該癌幹細胞株不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。在另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加該癌幹細胞株不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。在一些實施例中，該癌幹細胞株係選自由以下組成之群組：JHOM-2B、OVCAR-3、OV56、JHOS-4、JHOC-5、OVCAR-4、JHOS-2、EFO-21、CFPAC-1、Capan-1、Panc 02.13、SUIT-2、Panc 03.27、SK-MEL-28、RVH-421、Hs 895.T、Hs 940.T、SK-MEL-1、Hs 936.T、SH-4、COLO 800、UACC-62、NCI-H2066、NCI-H1963、NCI-H209、NCI-H889、COR-L47、NCI-H1092、NCI-H1436、COR-L95、COR-L279、NCI-H1048、NCI-H69、DMS 53、HuH-6、Li7、SNU-182、JHH-7、SK-HEP-1、Hep 3B2.1-7、SNU-1066、SNU-1041、SNU-1076、BICR 18、CAL-33、YD-8、CAL-29、KMBC-2、253J、253J-BV、SW780、SW1710、VM-CUB-1、BC-3C、KNS-81、TM-31、NMC-G1、GB-1、SNU-201、DBTRG-05MG、YKG-1、ECC10、RERF-GC-1B、TGBC-11-TKB、SNU-620、GSU、KE-39、HuG1-N、NUGC-4、SNU-16、OCUM-1、C2BBe1、Caco-2、SNU-1033、SW1463、COLO 201、GP2d、LoVo、SW403、CL-14、HCC2157、HCC38、HCC1954、HCC1143、HCC1806、HCC1599、MDA-MB-415、CAL-51、KO52、SKNO-1、Kasumi-1、Kasumi-6、MHH-CALL-3、MHH-CALL-2、JVM-2、HNT-34、HOS、OUMS-27、T1-73、Hs 870.T、Hs 706.T、SJSA-1、RD-ES、U2OS、SaOS-2、SK-ES-1、MKN-45、HSC-3、HSC-4、DETROIT 562及SCC-9。
在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該細胞株DMS 53經修飾以(i)減弱TGFβ2，(ii)剔除CD276，及(iii)上調GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12之表現。在本揭示案之另一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該細胞株DMS 53經修飾以(i)減弱TGFβ2，(ii)剔除CD276，及(iii)上調GM-CSF及膜結合之CD40L之表現。在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該組合物刺激特異性針對由該細胞株DMS 53表現之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)的免疫反應。在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中該等細胞株中之至少1種包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中該等細胞株中之至少1種為小細胞肺癌細胞株DMS 53且包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現或者抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現的細胞。在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中至少1種細胞株包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中1種細胞株為小細胞肺癌DMS 53。
在本揭示案之又一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，且(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。在本揭示案之再一實施例中，本文提供一種組合物，其包含治療有效量之3種癌細胞株，其中各細胞株所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，且(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中該等細胞株中之1種為小細胞肺癌細胞株DMS 53。
在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該組合物為疫苗組合物。在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該組合物能夠引發個體中之免疫反應。在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該組合物包含3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種癌細胞株。在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該組合物包含表現2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子或增加其表現之修飾。在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該組合物包含抑制或減少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫抑制因子之表現的修飾。在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該組合物包含表現2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種TAA或增加其表現之修飾。在一個實施例中，該等TAA中之一或多者之胺基酸序列已經修飾以包括突變或新抗原決定基。
在本揭示案之一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該免疫反應為先天性免疫反應、適應性免疫反應、細胞免疫反應及/或體液反應。在一個實施例中，免疫反應為適應性免疫反應。在一些實施例中，適應性免疫反應包含選自由CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、γ-δ T細胞、自然殺手T細胞及B細胞組成之群組之抗原特異性細胞的產生。在本揭示案之其他實施例中，抗原特異性CD4+ T細胞包含記憶細胞、T輔助1型細胞、T輔助9型細胞、T輔助17型細胞、T輔助22型細胞及T濾泡性輔助細胞。在一些實施例中，抗原特異性CD8+ T細胞包含記憶細胞及細胞毒性T淋巴球。在其他實施例中，抗原特異性B細胞包含記憶細胞、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E及免疫球蛋白A。在一些實施例中，其中各細胞株或該等細胞株之組合表現至少10種TAA。在其他實施例中，TAA亦在意欲接受該組合物之個體之癌症中表現。
在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該治療有效量包含大約8×106 個細胞之各細胞株。在另一實施例中，治療有效量包含大約1×107 個細胞之各細胞株。在一些實施例中，治療有效量包含大約1.0×106 -6.0×107 個細胞之各細胞株。在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中該治療有效量包含大約相同數目細胞之各細胞株。在一些實施例中，提供一種前述組合物，本文中該等細胞株係遺傳異質性同種異體、遺傳同質性同種異體、遺傳異質性異種、遺傳同質性異種或同種異體與異種之組合。
在多個實施例中，本文提供一種前述組合物，其中該等細胞株來自起源於以下之實體腫瘤之親本細胞株：肺、前列腺、睪丸、乳房、結腸、膀胱、胃腸道系統、腦、脊髓、泌尿道、結腸、直腸、胃、頭頸部、肝臟、腎臟、中樞神經系統、內分泌系統、間皮、卵巢、子宮內膜、胰臟、食道、神經內分泌系統、子宮或皮膚。在一些實施例中，親本細胞株包含選自由以下組成之群組的細胞：鱗狀細胞、癌細胞、腺癌細胞、腺鱗細胞、大細胞細胞、小細胞細胞、肉瘤細胞、透明細胞癌細胞、癌肉瘤細胞、混合間皮細胞及畸胎癌細胞。在一些實施例中，肉瘤細胞包含骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、間皮瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、神經膠質瘤、神經膠質肉瘤、星形細胞瘤、黏液肉瘤、間葉或混合間皮。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為非小細胞肺癌細胞株或小細胞肺癌細胞株。在其他實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為小細胞肺癌細胞株。在其他實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53及NCI-H1694。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為前列腺癌細胞株或睪丸癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：PC3、DU-145、LNCAP、NEC8、and NTERA-2cl-D1。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為大腸直腸癌細胞株。在其他實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116及LS411N。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為乳癌或三陰性乳癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7及T-47D。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為膀胱或泌尿道癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376及SCaBER。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為頭頸癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1及OSC-20。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為胃或胃癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1及MKN1。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為肝癌或肝細胞癌(HCC)細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6及HuH-7。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為神經膠母細胞瘤癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1及KNS-60。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為卵巢癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO及MCAS。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為食道癌細胞株。在其他實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19及OE21。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為腎或腎細胞癌癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ及VMRC-RCW。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為胰臟癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2及PSN11。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為子宮內膜癌細胞株。在其他實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA及石川(Ishikawa)。在一些實施例中，該細胞株或該等細胞株為皮膚或黑色素瘤癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T及A2058。在其他實施例中，該細胞株或該等細胞株為間皮瘤癌細胞株。在一些實施例中，細胞株係選自由以下組成之群組：NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89及IST-Mes2。
在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其進一步包含癌幹細胞株。在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其進一步包含細胞株DMS 53。在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中該等細胞株中之1種屬於與該等其他細胞株中之至少1種不同的癌症。在另一實施例中，至少3種細胞株各自為相同類型癌症。在一些實施例中，至少3種細胞株各自為不同細胞組織學類型或分子亞型。在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中該細胞組織學類型係選自由以下組成之群組：鱗狀、癌瘤、腺癌、大細胞、小細胞及肉瘤。
在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中增加該至少1種免疫刺激因子之表現的該修飾包含使用編碼該至少1種免疫刺激因子之慢病毒載體。在一個實施例中，該至少1種免疫刺激因子以相較於未經修飾之細胞株高至少2.0倍之水準表現。在另一實施例中，該至少1種免疫刺激因子係選自由以下組成之群組：GM-CSF、膜結合之CD40L、GITR、IL-15、IL-23及IL-12。在另一實施例中，免疫刺激因子為GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12。在另一實施例中，免疫刺激因子為GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-15。在另一實施例中，GM-CSF包含SEQ ID NO: 8。在另一實施例中，膜結合之CD40L包含SEQ ID NO: 3。在另一實施例中，IL-12包含SEQ ID NO: 10。
在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中抑制或減少該至少1種免疫抑制因子之表現的該修飾包含該至少1種免疫抑制因子之剔除或減弱。在一個實施例中，該至少1種免疫抑制因子之表現減少至少大約5%、10%、15%、20%、25%或30%。在另一實施例中，修飾為減弱。
在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中抑制或減少該至少1種免疫抑制因子之表現的該等修飾包含減弱該至少1種免疫抑制因子之表現與剔除不同免疫抑制因子之表現的組合。在一些實施例中，該至少1種免疫抑制因子係選自由以下組成之群組：CD276、CD47、CTLA4、HLA-E、HLA-G、IDO1、IL-10、TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3。在另一實施例中，該至少1種免疫抑制因子係選自由以下組成之群組：CD276、HLA-E、HLA-G、TGFβ1及TGFβ2。在另一實施例中，該等免疫抑制因子為TGFβ1、TGFβ2及CD276。在再一實施例中，該等免疫抑制因子為TGFβ2及CD276。在本揭示案之又一實施例中，該等免疫抑制因子為TGFβ1及CD276。在一些實施例中，使用包含SEQ ID NO: 25之短髮夾RNA減弱TGFβ1。在其他實施例中，使用包含SEQ ID NO: 24之短髮夾RNA減弱TGFβ2。在其他實施例中，使用靶向包含SEQ ID NO: 26之CD276基因體DNA序列之鋅指核酸酶對剔除CD276。
在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中該組合物包含表現HLA超型異質性之細胞株，且其中呈現至少2種不同HLA-A及至少2種HLA-B超型。在一些實施例中，該組合物表現HLA-A24、HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B27及HLA-B44超型中之主要組織相容性複合體分子。在其他實施例中，該組合物表現HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01、HLA-B07、HLA-B27及HLA-B44超型中之主要組織相容性複合體分子。在其他實施例中，該組合物表現HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08及HLA-B44超型。在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中該(等)細胞株為遺傳同質性細胞株。在一些實施例中，本揭示案提供一種前述組合物，其中該(等)細胞株為遺傳異質性細胞株。
本揭示案涵蓋及提供多種方法。在一個實施例中，本揭示案提供一種個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之前述組合物。在一個實施例中，本揭示案提供一種刺激個體中特異性針對至少5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種或30種或更多種腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含向該個體投與治療有效量之前述組合物。在一些實施例中，本文提供一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種前述組合物。在一個實施例中，本文提供一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種或更多種本文所述之組合物，其中該等組合物包含細胞株之不同組合。在一個實施例中，本文提供一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種本文所述之組合物，其中該等組合物各自包含3種不同細胞株。在一些實施例中，免疫反應包含抗原特異性或疫苗特異性免疫球蛋白G抗體之產生增加。在其他實施例中，免疫反應包含IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A、IL-20、IL-22、TNFα、IFNγ、CCL5或CXCL10中之一或多者之產生增加。在一個實施例中，免疫反應包含IFNγ之產生增加。在一些實施例中，免疫反應包含顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素及CD107a之產生增加。在其他實施例中，免疫反應包含調節T細胞、單核單核球衍生之抑制細胞及多形核衍生之抑制細胞之含量減少。在其他實施例中，免疫反應包含循環腫瘤細胞(CTC)、嗜中性球與淋巴球之比率(NLR)及血小板與淋巴球之比率(PLR)的水準降低。在其他實施例中，該免疫反應包含腫瘤微環境中免疫浸潤之變化。
在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之組合物。在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種或更多種本文所述之組合物，其中該等組合物包含細胞株之不同組合。在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種本文所述之組合物，其中該等組合物各自包含3種不同細胞株。在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之化學治療劑。在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之一或多種本文所述之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺之治療有效量包含50毫克/天，持續1-10天，接著投與治療有效量之組合物。
在一個實施例中，本揭示案提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之檢查點抑制劑。在另一實施例中，檢查點抑制劑係選自由CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9及2B4之抑制劑組成之群組。在一些實施例中，檢查點抑制劑係選自由以下組成之群組：派姆單抗(pembrolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、西利單抗(cetrelimab)、多斯利單抗(dostarlimab)、賽咪單抗(cemiplimab)、斯巴達珠單抗(spartalizumab)、坎立珠單抗(camrelizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及納武單抗(nivolumab)。在其他實施例中，提供一種前述方法，其進一步包含向該個體投與經分離之腫瘤相關抗原(TAA)。在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之組合物，且進一步包含向該個體投與一或多種選自由ALK、PARP、VEGFRs、EGFR、FGFR1-3、HIF1α、PDGFR1-2、c-Met、c-KIT、Her2、Her3、AR、PR、RET、EPHB4、STAT3、Ras、HDAC1-11、mTOR及CXCR4之抑制劑組成之群組的抑制劑。
在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所提供之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之放射線療法。在一個實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含投與治療有效量之本文所述之組合物，且進一步包含向該患者投與癌症治療手術。在一個實施例中，本文提供一種同時治療個體之兩種或更多種癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之組合物。
在另一實施例中，本文提供一種製備本文所述之疫苗組合物之方法，其包含以下步驟：(a)選擇表現至少5種、10種、15種或20種或更多種TAA之一或多種癌細胞株；以及(b)修飾(a)之該一或多種癌細胞株中之每一者，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及/或(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種TAA之表現。在一個實施例中，該細胞株或該等細胞株之組合包含另外經修飾以抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現的細胞。在另一實施例中，該修飾步驟包含將一或多種載體引入至該等細胞株中之一或多者中。在又一實施例中，該一或多種載體為慢病毒載體。在再一實施例中，該方法進一步包含使該等經修飾之細胞株適應無異種培養基之步驟。在另一實施例中，該方法進一步包含輻照該等細胞株之步驟。在另一實施例中，該方法進一步包含使該等細胞適應冷凍保存培養基之步驟。
在各種實施例中，本揭示案提供一種前述方法，其中該組合物或該等組合物藉由選自由以下組成之群組的途徑投與該個體：非經腸、經腸、經口、肌肉內、皮內、皮下、瘤內、結節內、鼻內、經皮、吸入、黏膜及局部。在一個實施例中，該途徑係皮內。在一些實施例中，該組合物或該等組合物投與該個體上選自由手臂、大腿及背部組成之群組的投與部位。在另一實施例中，組合物皮內投與該個體上之不同投與部位上。在另一實施例中，組合物藉由用位於自該投與部位之表面5°與15°之間的角度下的注射器注射而皮內投與。在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之第一劑量及治療有效量之後續劑量的一或多種本文所提供之組合物，其中該一或多種組合物在第一年投與1-24次、在第二年投與1-16次及在第三年投與1-14次。在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種本文所提供之組合物，其中該最初四劑每21天投與，至第63天，且接著每42天投與另外三劑，至第189天。在一個實施例中，該方法進一步包含以42天時間間隔投與另外五劑，至第399天，且接著隨後至少以兩個84天時間間隔投與。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與第一劑量及後續劑量之治療有效量的兩種本文所提供之組合物，其中該最初四劑每14天投與，至第42天，且接著每42天投與另外三劑，至第168天。在一個實施例中，該方法進一步包含以42天時間間隔投與另外五劑，至第378天，且接著隨後至少以兩個84天時間間隔投與。
在另一實施例中，本揭示案提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之兩種組合物，其中各組合物包含至少2種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)的表現，其中一種組合物投與該個體之上半身，且另一組合物投與該個體之下半身。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與第一劑量及後續劑量之治療有效量之兩種組合物，其中各組合物包含至少2種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以(i)表現GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L中之一或多者或增加其表現，(ii)抑制或減少TGFβ1、TGFβ2及CD276中之一或多者之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種TAA的表現，其中一種組合物投與該個體之上半身，且另一組合物投與該個體之下半身。在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包含向該個體投與一或多種治療劑或治療。在其他實施例中，該個體避免用其他疫苗或治療劑治療。在一些實施例中，該治療劑或治療係選自由以下組成之群組：放射線療法、化學療法、手術、小分子抑制劑及檢查點抑制劑。在一個實施例中，該治療劑為環磷醯胺。在其他實施例中，檢查點抑制劑係選自由CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9及2B4之抑制劑組成之群組。在一些實施例中，檢查點抑制劑為派姆單抗、阿維魯單抗、阿特珠單抗、西利單抗、多斯利單抗、賽咪單抗、斯巴達珠單抗、坎立珠單抗、德瓦魯單抗或納武單抗。在一些實施例中，一或多種治療劑或治療在該第一劑量及/或該等後續劑量之至少1次投與之前投與。在其他實施例中，一或多種治療劑或治療在該組合物之每次投與之前、同時或之後投與。在其他實施例中，第一治療劑在該第一劑量之前投與，且其中第二治療劑與該第一劑量及該等後續劑量同時投與。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含：a.向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種本文所提供之組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與；以及b.視情況，在投與(a)之該第一劑量之前向該個體投與治療有效劑量之環磷醯胺1-10天，及視情況在投與(a)之該等後續劑量之前投與治療有效劑量之環磷醯胺1-10天；c.視情況，(i)與(a)之每個劑量同時，或(ii)在(a)之該第一劑量之後每一週、兩週、三週或四週，向該個體投與檢查點抑制劑。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療個體之癌症之方法，其包含：a.   向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種本文所述之組合物，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與；b.視情況，在投與(a)之該第一劑量之前向該個體投與環磷醯胺1-10天，及視情況在投與(a)之該等後續劑量之前投與環磷醯胺1-10天；c.視情況，(i)與(a)之每個劑量同時，或(ii)在(a)之該第一劑量之後每一週、兩週、三週或四週，向該個體投與檢查點抑制劑。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療個體之癌症之方法，其包含：a.向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種如技術方案1至138中任一項之組合物，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與，且其中該等後續劑量在投與該第一劑量之後3週、6週、9週、15週、21週及27週投與；b.在投與(a)之該第一劑量及該等後續劑量之前每日向該個體投與環磷醯胺7天；c.在(a)之該第一劑量之後3週、6週、9週、12週、15週、18週、21週、24週及27週向該個體投與檢查點抑制劑。在一個實施例中，環磷醯胺經口投與且該檢查點抑制劑為派姆單抗且靜脈內投與。在另一實施例中，環磷醯胺以50 mg之劑量經口投與且該檢查點抑制劑為派姆單抗且以200 mg之劑量靜脈內投與。
在另一實施例中，本揭示案提供一種治療個體之癌症之方法，其包含：a.向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種本文所提供之組合物，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與，且其中該等後續劑量在投與該第一劑量之後2週、4週、6週、12週、18週及24週投與；b.在投與(a)之該第一劑量及該等後續劑量之前每日向該個體投與環磷醯胺7天；以及在(a)之該第一劑量之後2週、4週、6週、8週、10週、12週、14週、16週、18週、20週、22週、24週、26週、28週及30週向該個體投與檢查點抑制劑。在一個實施例中，環磷醯胺以50 mg之劑量經口投與且該檢查點抑制劑為德瓦魯單抗且以10 mg/kg之劑量靜脈內投與。在其他實施例中，該等方法進一步包含以下步驟：在投與該等組合物之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天及在投與該等組合物之後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天禁止投與大麻鹼。
在一些實施例中，各自成組或單獨涵蓋，個體罹患選自由以下組成之群組之癌症：肺癌、前列腺癌、乳癌、食道癌、大腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、腎癌、神經膠質瘤、子宮內膜癌、卵巢癌、胰臟癌、黑色素瘤及間皮瘤。在一個實施例中，乳癌為三陰性乳癌。在另一實施例中，神經膠質瘤為星形細胞瘤。在再一實施例中，星形細胞瘤為多形性神經膠母細胞瘤(GBM)。
本揭示案亦提供套組。在一個實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含一或多種本文所提供之組合物。在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含至少1個小瓶，該小瓶包含本文所述之組合物。在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含第一小瓶中之第一疫苗組合物及第二小瓶中之第二疫苗組合物，其中該第一疫苗組合物及該第二疫苗組合物各自包含至少2種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現。在又一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含6個小瓶，其中該等小瓶各含有包含癌細胞株之組合物，且其中該6個小瓶中之至少4個包含如下癌細胞株，該癌細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及/或(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種TAA之表現，其中該等小瓶中之至少4個含有不同組合物。在一些實施例中，套組進一步包含使用說明書。在一些實施例中，套組用於治療癌症。
亦涵蓋本文提供之組合物之單位劑量。在一個實施例中，本揭示案提供一種用於治療癌症之藥劑之單位劑量，該藥劑包含不同癌細胞株之6種組合物，其中至少4種組合物所包含的細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現。在一些實施例中，細胞株包含：(a)選自由NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23組成之群組的非小細胞肺癌細胞株及/或小細胞肺癌細胞株；(b)DMS 53及選自由DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53及NCI-H1694組成之群組的五種小細胞肺癌細胞株；(c)DMS 53及前列腺癌細胞株或睪丸癌細胞株PC3、DU-145、LNCAP、NEC8及NTERA-2cl-D1；(d)DMS 53及大腸直腸癌細胞株HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116及LS411N；(e)DMS 53及乳癌或三陰性乳癌細胞株Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7及T-47D；(f)DMS 53及膀胱或泌尿道癌細胞株UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376及SCaBER；(g)DMS 53及頭或頸部癌細胞株HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1及OSC-20；(h)DMS 53及胃或胃癌細胞株Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1及MKN1；(i)DMS 53及選自由Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6及HuH-7組成之群組的五種肝癌或肝細胞癌(HCC)細胞株；(j)DMS 53及神經膠母細胞瘤癌細胞株DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1及KNS-60；(k)DMS 53及選自由TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO及MCAS組成之群組的卵巢癌細胞株；(l)DMS 53及選自由TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19及OE21組成之群組的五種食道癌細胞株；(m)DMS 53及選自由A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ及VMRC-RCW組成之群組的五種腎癌或腎細胞癌癌細胞株；(n)DMS 53及胰臟癌細胞株PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2及PSN11；(o)DMS 53及選自由SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA及石川組成之群組的五種子宮內膜癌細胞株；(p)DMS 53及選自由RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T及A2058組成之群組的五種皮膚或黑色素瘤癌細胞株；或(q)DMS 53及選自由NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89及IST-Mes2組成之群組的五種間皮瘤癌細胞株。
在另一實施例中，本揭示案提供一種用於治療癌症之藥劑之單位劑量，該藥劑包含不同癌細胞株之6種組合物，其中各細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)表現該等癌細胞株不表現或表現極低之至少1種TAA或增加其表現。在一些實施例中，混合各包含3種細胞株之兩種組合物。
在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCIH520及A549；其中(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；其中該治療有效量為各細胞株大約1.0×107 個細胞或大約6×107 個細胞。在再一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23，其中(a)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(b)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現，及(iii)表現MSLN及CT83；且(c)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中(a)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(b)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現，及(iii)表現MSLN及CT83；且(c)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；其中該治療有效量為各細胞株大約1.0×107 個細胞或大約6×107 個細胞。
在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株LN-229、GB-1及SF-126，其中(a)LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53，其中：(a)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(b)DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65。
在又一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株HCT-15、RKO及HuTu-80，其中：(a)HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株HCT-116、LS411N及DMS 53，其中：(a)HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V；(b)LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：(a)PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2；(b)NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且(c)NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株DU-145、LNCaP及DMS 53，其中：(a)DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且(c)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株J82、HT-1376及TCCSUP，其中：(a)J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且(c)TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中：(a)SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(b)UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：(a)OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT；(c)TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中：(a)TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(b)ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且(c)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1及DETROIT 562，其中：(a)HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且(c)DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株KON、OSC-20及DMS 53，其中：(a)KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7；(b)OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且(c)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株MKN-1、MKN-45及MKN-74，其中：(a)MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6；(b)MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中：(a)OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；(b)Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且(c)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株CAMA-1、AU565及HS-578T，其中：(a)CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且(c)HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株MCF-7、T47D及DMS 53，其中：(a)MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且(c)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種前述疫苗組合物，其中該治療有效量為各細胞株大約1.0×107 個細胞或大約6×107 個細胞。
在一個實施例中，本揭示案提供一種組合物，其包含第一混合物及第二混合物；其中該第一混合物包含治療有效量之至少2種經輻照之癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且其中該第二混合物包含細胞株DMS 53，該細胞株經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在一個實施例中，該第一混合物及/或該第二混合物包含一或多種經修飾以表現以下或增加以下表現之細胞株：CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2 、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、緊密連接蛋白18、LYK6K、PRAME、HPV16/18 E6/E7或其突變型式。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與非小細胞肺癌(NSCLC)相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且(f)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且(f)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與神經膠母細胞瘤相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126；其中：(a)LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(c)SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53；其中：(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之神經膠母細胞瘤之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126；其中：(a)LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53；其中：(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與大腸直腸癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-15、RKO及HuTu-80，其中：(a)HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-116、LS411N及DMS 53；其中：(d)HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V；(e)LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之大腸直腸癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-15、RKO及HuTu-80，其中：(a)HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(c)HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-116、LS411N及DMS 53；其中：(d)HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V；(e)LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與前列腺癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：(a)PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2；(b)NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(c)NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DU-145、LNCaP及DMS 53，其中：(d)DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(e)LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之前列腺癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：(a)PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2；(b)NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且(c)NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DU-145、LNCaP及DMS 53，其中：(d)DU 145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(e)LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與膀胱癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株J82、HT-1376及TCCSUP，其中：(a)J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(c)TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中：(d)SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之膀胱癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株J82、HT-1376及TCCSUP，其中：(a)J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(c)TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中：(d)SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與卵巢癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：(a)OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT；(c)TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中：(d)TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之卵巢癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：(a)OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT；(c)TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中：(d)TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與頭頸癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中：(a)HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且(c)DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株KON、OSC-20及DMS 53，其中：(d)KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7；(e)OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之頭頸癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中：(a)HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且(c)DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株KON、OSC-20及DMS 53，其中：(d)KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7；(e)OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與胃癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MKN-1、MKN-45及MKN-74；其中：(a)MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6；(b)MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中(d)OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；(e)Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之胃癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MKN-1、MKN-45及MKN-74；其中(a)MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6；(b)MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中(d)OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；(e)Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與乳癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D及DMS 53，其中：(a)CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且(c)HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MCF-7、T47D及DMS 53，其中：(d)MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(e)T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。在另一實施例中，本揭示案提供一種治療人類個體之乳癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株CAMA-1、AU565及HS-578T，其中(a)CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且(c)HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MCF-7、T47D及DMS 53，其中：(d)MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(e)T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與NSCLC相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含：a. 每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週；b. 在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且該第二組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且(f)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；c. 在(a)中之該一週之後，經由注射以200 mg之劑量進一步投與第一劑量之包含派姆單抗之組合物；d. 在(b)中該第一劑量投與之後3週、6週、9週、15週、21週及27週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量；e. 在(c)中該第一劑量之後3週、6週、9週、12週、15週、18週、21週、24週及27週以200 mg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含派姆單抗之組合物；其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在再一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與癌症相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含：a. 每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週；b. 在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物為本文所提供之組合物；且該第二組合物為本文所提供之不同組合物；c. 在(a)中之該一週之後，經由注射以200 mg之劑量進一步投與第一劑量之包含派姆單抗之組合物；d. 在(b)中該第一劑量投與之後3週、6週、9週、15週、21週及27週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量；e. 在(c)中該第一劑量之後3週、6週、9週、12週、15週、18週、21週、24週及27週以200 mg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含派姆單抗之組合物；其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與NSCLC相關之TAA之免疫反應的方法，其包含：a. 每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週；b. 在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且該第二組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且(f)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；c. 在(a)中之該一週之後，以10 mg/kg之劑量經由注射進一步投與第一劑量之包含德瓦魯單抗之組合物；d.在(b)中該第一劑量投與之後2週、4週、10週、16週、22週及28週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量；e. 在(c)中該第一劑量之後2週、4週、6週、8週、10週、12週、14週、16週、18週、20週、22週、24週、26週、28週及30週以10 mg/kg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含德瓦魯單抗之組合物；其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在另一實施例中，本揭示案提供一種刺激人類個體中的特異性針對與NSCLC相關之TAA之免疫反應的方法，其包含：a. 每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週；b. 在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物為本文所提供之組合物且該第二組合物為本文提供之不同組合物；c. 在(a)中之該一週之後，以10 mg/kg之劑量經由注射進一步投與第一劑量之包含德瓦魯單抗之組合物；d. 在(b)中該第一劑量投與之後2週、4週、10週、16週、22週及28週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量；e. 在(c)中該第一劑量之後2週、4週、6週、8週、10週、12週、14週、16週、18週、20週、22週、24週、26週、28週及30週以10 mg/kg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含德瓦魯單抗之組合物；其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
在又一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含肺癌細胞株NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23之細胞，且其中：(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且(f)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53之細胞，其中：(a)LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65。在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N及DMS 53之細胞，其中：(a)HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(d)HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V；(e)LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在再一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP及DMS 53之細胞，其中：(a)PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2；(b)NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；(c)NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；(d)DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(e)LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3及DMS 53之細胞，其中：(a)J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(c)TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中：(a)OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT；(c)TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10；(d)TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20及DMS 53之細胞，其中：(a)HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且(c)DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7；(e)OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在又一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含大約癌細胞株MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97及DMS 53之細胞，其中：(a)MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6；(b)MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(d)OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；(e)Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D及DMS 53之細胞，其中：(a)CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且(c)HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(e)T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在另一實施例中，本揭示案提供一種肺癌疫苗之單位劑量，其包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之肺癌細胞株NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中：(a)NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(b)NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(c)A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且(f)NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53，其中：(a)LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT；(d)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；(e)DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65。
在另一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N及DMS 53，其中：(a)HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(d)HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V；(e)LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP及DMS 53，其中：(a)PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2；(b)NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；(c)NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；(d)DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(e)LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在另一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中：(a)J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(c)TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中：(a)OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(b)MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；(c)TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10；(d)TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1；(e)ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在又一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20及DMS 53，其中：(a)HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且(c)DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7；(e)OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。在另一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中：(a)MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6；(b)MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；(c)MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(d)OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；(e)Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在再一實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D及DMS 53，其中：(a)CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA；(b)AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且(c)HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(d)MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(e)T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且(f)DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
在一些實施例中，提供一種前述組合物，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。在一些實施例中，本揭示案提供一種前述單位劑量，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。在其他實施例中，提供一種前述套組，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。在其他實施例中，本揭示案提供一種前述方法，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。
本揭示案之實施例提供一種癌症疫苗接種之平台方法，其提供能夠由所揭示之組合物、方法及方案治療之癌症類型方面的廣度與由所揭示之組合物、方法及方案引發之免疫反應方面的量值。
在本揭示案之各種實施例中，同種異體全癌細胞疫苗之皮內注射誘導局部發炎反應，使免疫細胞募集至注射部位。不受任何理論或機制束縛，在投與疫苗之後，在皮膚中局部存在(疫苗微環境，VME)之抗原呈遞細胞(APC)，諸如朗格罕氏細胞(Langerhans cell，LC)及皮膚樹突狀細胞(DC)，藉由吞噬作用吸收疫苗細胞組分且接著遷移穿過真皮至引流淋巴結。在引流淋巴結處，已吞噬疫苗細胞株組分之DC或LC可引發原生T細胞及B細胞。原生T細胞及B細胞之引發啟動針對由疫苗細胞株表現之腫瘤相關抗原(TAA)的適應性免疫反應。在本揭示案之一些實施例中，引發在活體內進行且不在活體外或離體進行。在本文所提供之疫苗組合物之實施例中，由疫苗細胞株表現之眾多TAA亦在個體之腫瘤中表現。抗原特異性T細胞在引流淋巴結之擴增及此等T細胞遷移至腫瘤微環境(TME)可啟動疫苗誘導之抗腫瘤反應。
同種異體疫苗之免疫原性可經由構成疫苗組合物之細胞株之引入TAA(原生/野生型或如本文所述，經設計/突變)的基因修飾而增強。同種異體疫苗之免疫原性可經由構成疫苗組合物之細胞株之減少免疫抑制因子之表現及/或增加免疫刺激信號之表現或分泌的基因修飾而進一步增強。此等因子之調節可增強真皮中LC及DC對疫苗細胞組分之吸收，促進DC及LC遷移至引流淋巴結，且增強引流淋巴結中之效應T細胞及B細胞引發，藉此提供更有效之抗腫瘤反應。
在各種實施例中，本揭示案提供一種同種異體全細胞癌症疫苗平台，其包括用於治療癌症及/或預防癌症及/或刺激免疫反應之組合物和方法。根據本揭示案之實施例之標準及方法包括但不限於：(i)用於選擇包括於疫苗組合物中之細胞株之標準及方法；(ii)用於將多種細胞株組合成治療性疫苗之標準及方法；(iii)用於進行細胞株修飾之標準及方法；及(iv)在存在及不存在額外治療劑下用於投與治療組合物之標準及方法。在一些實施例中，本揭示案提供一種同種異體全細胞癌症疫苗平台，其包括不限於投與包含細胞株組合之多種混合物，該等細胞株組合一起構成一個單位劑量，其中單位劑量在策略上隨時間推移而投與，且另外視情況包括投與其他治療劑，諸如環磷醯胺，且另外視情況投與檢查點抑制劑。
在一些實施例中，本揭示案提供用於基於個體之腫瘤類型修改個體之治療方案的組合物和方法。在一些實施例中，本揭示案提供一種癌症疫苗平台，其中可鑑別同種異體細胞株且視情況進行修飾且投與個體。在各種實施例中，細胞株之腫瘤來源(原發部位)、由細胞株表現之TAA之量及數目、細胞株修飾之數目及單位劑量中所包括之細胞株之數目各基於個體之腫瘤類型、癌症階段及其他考慮因素來定製。如本文所述，細胞株之腫瘤來源可與意欲治療之腫瘤相同或不同。在一些實施例中，癌細胞株可為癌幹細胞株。定義
在本揭示案中，「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有」、「具有」及其類似術語具有美國專利法中歸屬於其之含義且意謂「包括(includes)」、「包括(including)」及其類似術語；同樣，術語「基本上由……組成」或「基本上組成」具有美國專利法中歸屬於其之含義且此等術語為開放的，允許存在多於所列舉者，只要所列舉者之基本或新穎特徵不因存在多於所列舉者變化即可，但不包括先前技術實施例。
除非另外特別陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用之術語「一(a)」、「一(an)」及「該」應理解為單數或複數。
如在本文中可互換使用之術語「細胞」、「細胞株」、「癌細胞株」、「腫瘤細胞株」及其類似術語係指源自如本文所述之癌性腫瘤及/或源自起源於特定來源/器官/組織之腫瘤之親本細胞株的細胞株。在一些實施例中，癌細胞株為如本文所述之癌幹細胞株。在某些實施例中，已知癌細胞株表現或確實表現多種腫瘤相關抗原(TAA)及/或腫瘤特異性抗原(TSA)。在本揭示案之一些實施例中，癌細胞株經修飾以表現一或多種TAA或增加其表現。在某些實施例中，癌細胞株包括在許多次細胞繼代之後的細胞株、生長培養基或條件之任何變化、引入可改變諸如人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)永生化之細胞株特徵的修飾、使用異種移植技術(包括經由異種模型連續繼代，模型諸如患者來源之異種移植物(PDX)或下一代定序(NGS)小鼠)、及/或與一或多種其他細胞株共培養以提供混合細胞株群體。如本文所用，術語「細胞株」包括在一些實施例中如藉由短串聯重複序列(STR)定序所確定，或如藉由熟習此項技術者另外所確定，經鑑別在特徵或區段上具有任何重疊之所有細胞株。如本文所用，術語「細胞株」亦涵蓋任何遺傳同質性細胞株，其中構成細胞株之細胞在純系上來源於單個細胞，使得其在基因上係一致的。此可例如藉由異質性細胞株之限制稀釋次選殖來實現。術語「細胞株」亦涵蓋任何遺傳異質性細胞株，其中構成細胞株之細胞並非如期望地在基因上一致且含有癌細胞之多個亞群。本文描述細胞株之各種實例。除非另外特別陳述，否則術語「細胞株」或「癌細胞株」涵蓋複數個「細胞株」。
如本文所用，術語「腫瘤」係指異常細胞累積或腫塊。腫瘤可為良性(非癌性)、癌前(癌前，包括增生、異形型、化生、異常增生及原位癌)或惡性(癌性)。熟知腫瘤可為「熱性」或「冷性」的。藉由實例，尤其黑色素瘤及肺癌證實對檢查點抑制劑之反應率相對較高且通常稱為「熱性」腫瘤。此等腫瘤與具有低免疫浸潤之稱為「冷性」腫瘤或非T細胞發炎癌症之腫瘤(諸如尤其來自前列腺、胰臟、神經膠母細胞瘤及膀胱之腫瘤)形成鮮明對比。在一些實施例中，本文提供之組合物及方法適用於治療或預防具有相關熱性腫瘤之癌症。在一些實施例中，本文提供之組合物及方法適用於治療或預防具有冷性腫瘤之癌症。本揭示案之疫苗組合物之實施例可用於將冷性(亦即，耐治療性或難治性)癌症或腫瘤轉變成熱性(亦即，能夠治療，包括基於檢查點抑制之治療)癌症或腫瘤。因為缺乏與低突變負荷相關之新抗原決定基，所以針對冷性腫瘤之免疫反應減弱。在各種實施例中，本文所述之組合物包含眾多由點突變產生之潛在新抗原決定基，該等點突變可產生眾多外源性抗原性抗原決定基。以此方式，患者之免疫系統可將此等抗原決定基識別為非自身的，隨後破壞自身耐受性，且發動針對冷性腫瘤之抗腫瘤反應，包括誘導針對廣泛抗原之適應性免疫反應(參見Leko, V.等人《免疫學雜誌(J Immunol)》(2019))。
癌症幹細胞負責啟動腫瘤發展、細胞增殖及癌轉移且為化學療法及放射線療法之後復發的關鍵組分。在某些實施例中，癌幹細胞株或顯示癌症幹細胞特徵之細胞株包括在疫苗組合物中之一或多者中。如本文所用，短語「癌症幹細胞」(CSC)或「癌幹細胞株」係指腫瘤內具有自我更新及引起構成腫瘤之癌細胞之異質譜系的能力的細胞或細胞株。CSC對傳統癌症療法具高度抗性且假設其為癌轉移及腫瘤復發之主要驅動因子。澄清一下，顯示癌症幹細胞特徵之細胞株包括於「癌症幹細胞」之定義內。表2中提供由原發性腫瘤部位鑑別之示例性癌症幹細胞標記物且在本文描述。「癌幹細胞株」之定義涵蓋表現此等標記物中之一或多者的細胞株。本文描述示例性癌幹細胞株，「癌幹細胞株」之定義涵蓋每一者。
如本文所用，短語「各細胞株或細胞株之組合」在多種細胞株呈組合提供之情況下係指該等細胞株中之1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種或組合。如本文所用，短語「經修飾之各細胞株或經修飾之細胞株之組合」在多種細胞株呈組合提供之情況下係指一種、一些或所有細胞株之修飾，且亦指可能並非所有包括在組合中之細胞株經修飾。藉由實例，短語「一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾……」意謂兩種細胞株中之每一者經修飾或兩種細胞株之一經修飾。藉由另一實例，短語「一種組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾……」意謂該等細胞株中之每一者(亦即，所有三種)經修飾或三種細胞株中之一或兩種經修飾。
如本文所用，術語「致癌基因」係指與腫瘤形成有關之基因。致癌基因為促使癌症發展之突變基因。在正常未突變狀態下，致癌基因稱為原致癌基因，且其在調控細胞分裂中起作用。
如本文所用，例如在用於製備如本文所述之適用於刺激免疫反應或治療癌症之組合物的方法中短語「鑑別一或多種……突變」係指新鑑別、在資料庫或資料集內或另外使用如本文所述之一系列標準或其一或多種組分鑑別、及視情況選擇致癌基因或突變使用或包括於如本文所述之疫苗組合物中。
如本文所用，短語「……表現至少[]種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞……」係指天然或藉助於基因修飾表現指定數目之TAA的細胞且其中患者腫瘤之細胞表現或已知其表現該等相同TAA。患者腫瘤細胞對特定TAA之表現可藉由分析、手術程序(例如生檢)或所屬領域中已知之其他方法測定。在其他實施例中，臨床醫師可參考癌細胞株百科全書(Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)及其他已知來源來鑑別已知由特定腫瘤類型之細胞表現的TAA清單。
如本文所用，短語「……不表現或表現極低……」意謂所提及之基因或蛋白質(例如TAA或免疫抑制蛋白或免疫刺激蛋白)不由細胞株表現或以低水準表現，其中此類水準對免疫原性無影響或影響有限。舉例而言，在所屬領域中容易理解，TAA在細胞株中存在或表現之量不足以對包括該細胞株之疫苗組合物之治療作用產生期望影響。在此類情況下，本揭示案提供增加此類TAA表現之組合物及方法。
如本文所用，術語「同等」通常意謂相同值+/-10%。在一些實施例中，諸如細胞數目等量測值可為+/-1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。類似地，如本文所用且如與胺基酸位置或核苷酸位置相關，術語「大約」係指1個、2個、3個、4個或5個此類殘基內。關於細胞數目，術語「大約」係指+/-1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。
如本文所用，短語「……其中相較於未經修飾之癌細胞株，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加1.3倍……」意謂當與尚未經修飾之相同細胞株之組合物相比較時，包含經修飾之細胞株之組合物能夠刺激IFNγ產生多至少1.3倍。在此實例中，「至少1.3」意謂1.3、1.4、1.5等或更高。此定義在此參照IFNγ產生之其他值使用，包含(但不限於)相較於未經修飾之癌細胞株IFNγ產生增加1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、4.0倍或5.0或更高(例如經修飾之細胞株相較於經修飾之細胞株、2種或3種經修飾之細胞株之組合物(例如疫苗組合物)相較細胞株於包含未經修飾之細胞株之相同組合物、或包含6種經修飾之細胞株之單位劑量相較於包含未經修飾之細胞株之相同單位劑量)。在其他實施例中，相較於未經修飾之癌細胞株，IFNγ產生增加大約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高。類似地，在各種實施例中，本揭示案提供使用本文所提供之方法及所屬領域中已知之方法，包括(但不限於)ELISA、IFNγ ELISpot及流動式細胞測量術，基於TAA表現、免疫刺激因子表現、免疫抑制因子表現及/或免疫反應刺激與未經修飾之細胞或細胞株相比較的經修飾之細胞或細胞株之組合物。
如本文所用，短語「增加倍數」係指相對於對照之表現單位或反應單位之變化。藉由實例，ELISA變化倍數係指針對經修飾之細胞株所偵測之分泌蛋白之含量除以針對未經修飾之細胞株所偵測之分泌蛋白之含量或偵測下限。在另一實例中，藉由流動式細胞測量術，抗原表現之變化倍數係指經修飾之細胞株之蛋白質表現的平均螢光強度(MFI)除以未經修飾之細胞株之蛋白質表現的MFI。IFNγ ELISpot變化倍數係指藉由測試變數在HLA不同之供體中誘導之平均IFNγ點形成單位(SFU)除以由對照變數誘導之平均IFNγ SFU。例如，三種經修飾之細胞株之組合物的在供體中之平均總抗原特異性IFNγ SFU除以相同三種未經修飾之細胞株之組合物的在相同供體中之IFNγ SFU。
在一些實施例中，當各細胞株中修飾數目(例如免疫刺激因子數目及免疫抑制因子數目)增加時，IFNγ產生增加倍數將增加。在一些實施例中，當細胞株數目(且因此TAA數目)增加時，無論經修飾亦或未經修飾，IFNγ產生增加倍數將增加。因此，在一些實施例中，IFNγ產生增加倍數歸因於TAA數目及修飾數目。
如本文所用，術語「經修飾」意謂經基因修飾以表現一或多種蛋白質或核酸、過度表現一或多種蛋白質或核酸、增加、減少或抑制一或多種蛋白質或核酸之表現。如本文所述，示例性蛋白質包括(但不限於)免疫刺激因子。示例性核酸包括可用於減弱(KD)(亦即，減少表現)或剔除(KO)(亦即完全抑制表現)免疫抑制因子之序列。如本文所用，術語「減少」與「降低」或「部分降低」同義且可結合基因減弱使用。同樣，術語「抑制」與「完全降低」同義且可在基因剔除之情況下使用以描述基因自細胞完全切除。
除非明確陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用之術語「或」應理解為包括性的。
如本文所用，術語「患者」、「個體」、「受體」及其類似術語在本文中可互換使用，係指任何哺乳動物，包括人類、非人類靈長類動物、家畜及農畜以及其他動物，包括(但不限於)犬、馬、貓、牛、綿羊、豬、小鼠、大鼠及山羊。示例性個體為人類，成年人、兒童及老年人。在一些實施例中，個體可為供體。
除非另有指示，否則如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」、「治療(treatment)」及其類似術語係指逆轉、緩解、抑制此類術語適用之疾病、病症或病狀之過程，或此類疾病、病症或病狀之一或多種症狀，且包括投與本文所述之組合物、醫藥組合物或劑型中之任一者，以預防症狀或併發症發作、緩解症狀或併發症、或消除疾病、症狀或病症。如本文所用，治療可為治癒性或改善性的。
如本文所用，「預防」意謂完全或部分預防、控制、減少或中斷此類術語所應用之事物或事件的產生或出現，例如有待預防之疾病、病症或病狀。
本文所提供之方法及組合物之實施例適用於預防腫瘤或癌症，此意謂預防腫瘤之出現或顯著延緩腫瘤發作。在一些實施例中，方法及組合物適用於治療腫瘤或癌症，此意謂如藉由所屬領域中熟知之多種技術，諸如腫瘤體積減少所證明，顯著抑制腫瘤生長。腫瘤體積可藉由多種已知程序(例如用針盤卡尺獲得二維量測)測定。預防及/或治療腫瘤可延長進行治療之個體的存活。
如本文所用，關於免疫反應之術語「刺激」與「促進」、「產生」及「引發」同義且係指產生免疫反應之一或多種指示物。本文描述免疫反應之指示物。可根據本文所述之分析且藉由所屬領域中熟知之方法測定及量測免疫反應。
如本文所用，短語「治療有效量」、「有效量」、「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」及其類似短語指示投與個體或投與個體之細胞、組織或器官以實現治療作用，諸如改善性或治癒性作用所需的量。治療有效量足以在細胞、組織、系統、動物或人類中引起研究人員、獸醫、醫生、臨床醫師或醫療保健提供者所尋求之生物或醫學反應。舉例而言，組合物之治療有效量為無論經修飾亦或未經修飾之細胞株足以刺激如本文所述之免疫反應的量。在某些實施例中，組合物之治療有效量為無論經修飾亦或未經修飾之細胞株足以抑制如本文所述之腫瘤生長的量。在某些實施例中，有效量或治療有效量之確定係基於公開案、資料或其他資訊，諸如給藥方案及/或臨床醫師之經驗。
如本文所用，術語「投與(administering)」、「投與(administer)」、「投與(administration)」及其類似術語係指將治療劑轉移、遞送、引入或輸送至需要用此類藥劑治療之個體的任何模式。此類模式包括(但不限於)經口、局部、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、瘤內、皮內、鼻內及皮下投藥。
如本文所用，術語「疫苗組合物」係指含有一或多種(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)細胞株的本文所述之疫苗組合物中之任一者。如本文所述，疫苗組合物中之細胞株中之一或多者可經修飾。在某些實施例中，疫苗組合物中之細胞株中之一或多者可未經修飾。術語「疫苗」、「腫瘤細胞疫苗」、「癌症疫苗」、「癌細胞疫苗」、「全癌細胞疫苗」、「疫苗組合物」、「組合物」、「混合物」、「疫苗混合物」及其類似術語在本文中可互換使用。在一些實施例中，本文所述之疫苗組合物適用於治療或預防癌症。在一些實施例中，本文所述之疫苗組合物適用於刺激或引發免疫反應。在此類實施例中，使用術語「免疫原性組合物」。在一些實施例中，本文所述之疫苗組合物適用作治療方案之組分以增加該方案之免疫原性。
如在本文中可互換使用之術語「劑量」或「單位劑量」係指包含治療有效量之一多種細胞株之一或多種疫苗組合物。如本文所述，組合物之「劑量」或「單位劑量」可指1種、2種、3種、4種、5種或更多種不同組合物或混合物。在一些實施例中，組合物之單位劑量係指基本上同時投與之2種不同組合物(亦即，連續緊接)。在示例性實施例中，疫苗組合物之一個劑量包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個單獨小瓶，其中各小瓶包含細胞株，且其中各來自單獨小瓶之細胞株在投與之前混合。在一些實施例中，劑量或單位劑量包括6個小瓶，各小瓶包含細胞株，其中將3種細胞株混合且在一個部位投與，且將另3種細胞株混合且在第二部位投與。後續「劑量」可類似地投與。在其他實施例中，涵蓋在個體身體上2個部位投與2種疫苗混合物，總共同時注射4次。
如本文所用，術語「癌症」係指異常細胞不受控制地分裂且能夠侵襲其他組織之疾病。因此，如本文所用，短語「……與個體癌症相關」係指腫瘤相關抗原、新抗原或個體癌症之其他基因型或表型特性的表現。與癌症相關之TAA為在大部分癌症細胞中以可偵測水準表現之TAA。可偵測表現水準且藉由本文所述之方法測定。存在超過100種不同類型癌症。大部分癌症根據其開始之器官或細胞類型命名；舉例而言，在結腸中開始之癌症稱為結腸癌；在皮膚黑色素細胞中開始之癌症稱為黑色素瘤。癌症類型可分組成更寬類別。在一些實施例中，癌症可分組為實體(亦即，形成腫瘤)癌症及液體(例如血液癌症，諸如白血病、淋巴瘤及骨髓瘤)癌症。其他癌症類別包括：癌瘤(意謂在皮膚中或在內襯或覆蓋內臟之組織中開始的癌症，及其亞型，包括腺癌、基底細胞癌、鱗狀細胞癌及移行細胞癌)；肉瘤(意謂在骨骼、軟骨、脂肪、肌肉、血管或其他結締組織或支持組織中開始之癌症)；白血病(意謂在造血組織(例如骨髓)中開始且引起大量異常血細胞產生且進入血液中的癌症；淋巴瘤及骨髓瘤(意謂在免疫系統細胞中開始之癌症)；以及中樞神經系統癌症(意謂在大腦組織及脊髓中開始之癌症)。術語骨髓化生不良症候群係指骨髓無法製造出足夠健康之血細胞(白血球、紅血球及血小板)且在血液及/或骨髓中存在異常細胞之癌症類型。骨髓化生不良症候群可變成急性骨髓性白血病(AML)。藉助於非限制性實例，本文所述之組合物及方法用於治療及/或預防本文所述之癌症，在各種實施例中包括肺癌(例如非小細胞肺癌或小細胞肺癌)、前列腺癌、乳癌、三陰性乳癌、轉移性乳癌、乳腺管原位癌、侵襲性乳癌、炎性乳癌、佩吉特氏病(Paget disease)、乳房血管肉瘤、葉狀腫瘤、睪丸癌、大腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、腎癌、神經膠質瘤、神經膠質肉瘤、星形細胞瘤、卵巢癌、神經內分泌癌、胰臟癌、食道癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、間皮瘤及/或肝細胞癌。
癌瘤之實例包括(但不限於)巨細胞及梭狀細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質癌；移行細胞癌；乳頭狀移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤；膽管癌；肝細胞癌；合併肝細胞癌及膽管癌；小樑狀腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤瘜肉中之腺癌；家族性結腸瘜肉病腺癌；實體癌瘤；類癌腫瘤；細支氣管肺泡癌；乳頭狀腺癌；嫌色細胞癌；嗜酸性球癌；嗜氧性腺癌；嗜鹼性球癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾泡腺癌；非包囊性硬化癌；腎上腺皮質癌；子宮內膜樣癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺腺癌；耵聹腺腺癌；黏液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒環細胞癌；浸潤性導管癌；髓性癌；小葉癌；發炎性癌；佩吉特氏病(Paget's disease)；乳腺腺泡細胞癌；腺鱗癌；腺癌伴鱗狀化生；塞特利氏細胞癌(sertoli cell carcinoma)；胚胎性癌；以及絨毛膜癌。
肉瘤之實例包括(但不限於)血管球肉瘤；肉瘤；纖維肉瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎橫紋肌肉瘤；腺泡狀橫紋肌肉瘤；基質肉瘤；癌肉瘤；滑膜肉瘤；血管肉瘤；卡堡氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質旁骨肉瘤；軟骨肉瘤；間葉細胞軟骨肉瘤；骨骼巨細胞瘤；尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)；牙源性惡性腫瘤；造釉細胞牙肉瘤；惡性造釉細胞瘤；造釉細胞纖維肉瘤；骨髓肉瘤；以及肥大細胞肉瘤。
白血病之實例包括(但不限於)白血病；淋巴球性白血病；漿細胞白血病；紅白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓白血病；嗜鹼性球白血病；嗜酸性球白血病；單核球性白血病；肥大細胞白血病；巨核母細胞白血病；及毛細胞白血病。
淋巴瘤及骨髓瘤之實例包括(但不限於)惡性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin's disease)；霍奇金氏；類肉芽腫；小淋巴球性惡性淋巴瘤；彌漫性大細胞惡性淋巴瘤；濾泡性惡性淋巴瘤；蕈樣黴菌病；其他特指型非霍奇金氏淋巴瘤；惡性黑色素瘤；無黑色素性黑色素瘤；淺表擴散性黑素瘤；巨大色素痣中之惡性黑色素瘤；上皮樣細胞黑色素瘤；以及多發性骨髓瘤。
腦/脊髓癌之實例包括(但不限於)惡性松果體瘤；脊索瘤；惡性神經膠質肉瘤神經膠質瘤；室管膜瘤；星形細胞瘤；原漿性星形細胞瘤；肌原纖維性星形細胞瘤；星形母細胞瘤；神經膠母細胞瘤；寡樹突神經膠細胞瘤；寡樹突神經膠母細胞瘤；原始神經外胚層瘤；小腦肉瘤；神經節母細胞瘤；神經母細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅覺神經腫瘤；惡性腦膜瘤；神經纖維肉瘤；以及惡性神經鞘瘤。
其他癌症之實例包括(但不限於)胸腺瘤；卵巢基質腫瘤；泡膜細胞瘤；粒層細胞腫瘤；睾丸母細胞瘤；萊迪希氏細胞瘤(leydig cell tumor)；脂質細胞腫瘤；副神經節瘤；乳腺外副神經節瘤；嗜鉻細胞瘤；惡性藍痣；惡性纖維組織細胞瘤；惡性混合型腫瘤；苗勒氏管混合型腫瘤；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；惡性間葉瘤；惡性布倫納氏瘤(brenner tumor)；惡性葉狀腫瘤；惡性間皮瘤；無性細胞瘤；惡性畸胎瘤；惡性卵巢甲狀腺腫樣瘤；惡性中腎瘤；惡性血管內皮瘤；惡性血管外皮瘤；惡性軟骨母細胞瘤；惡性顆粒細胞腫瘤；惡性組織細胞增多病；及免疫增殖性小腸疾病。
本文中所揭示之所有參參考文獻、專利及專利申請案中關於各自經引用之主題以引用之方式併入，在一些情況下可涵蓋文件之全部內容。疫苗組合物
本揭示案係針對一種進行癌症疫苗接種之平台方法，其提供關於能夠用所揭示之組合物、方法及方案治療之癌症及腫瘤類型之範圍的廣度以及關於由所揭示之組合物及方案引發之免疫反應之水準的量值。本揭示案之實施例提供包含癌細胞株之組合物。在一些實施例中，細胞株已如本文所述進行修飾。
本揭示案之組合物經設計以增加免疫原性及/或刺激免疫反應。舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之疫苗增加IFNγ產生及針對多種TAA之免疫反應之廣度(例如疫苗能夠靶向1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種、30種、31種、32種、33種、34種、35種、36種、37種、38種、39種、40種或更多種TAA，此指示此等抗TAA T細胞前驅體之T細胞受體(TCR)譜系之多樣性。在一些實施例中，本文提供之疫苗所產生的免疫反應為針對超過一種與所給定TAA相關之抗原決定基之反應(例如疫苗能夠靶向所給定TAA上之1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種、30種、31種、32種、33種、34種、35種、36種、37種、38種、39種、40種或更多種抗原決定基)，此指示此等抗TAA T細胞前驅體之TCR譜系之多樣性。
在某些實施例中，此可藉由以下來實現：選擇表現與有待治療之癌症相關之大量TAA的細胞株；減弱或剔除幫助腫瘤細胞逃避免疫系統監視之一或多種免疫抑制因子的表現；表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現以增加疫苗微環境(VME)內之免疫活化；增加一或多種腫瘤相關抗原(TAA)之表現以增加呈遞至宿主免疫系統之相關抗原目標之範圍，視情況其中TAA經設計或增強(例如藉由突變而修飾)且包含例如非同義突變(NSM)及/或新抗原決定基；投與包含至少1種癌症幹細胞之疫苗組合物；及/或其任何組合。
疫苗組合物之一或多種細胞株可經修飾以減少超過一種免疫抑制因子(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種免疫抑制因子)之產生。疫苗之一或多種細胞株可經修飾以增加超過一種免疫刺激因子(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種免疫刺激因子)之產生。疫苗組合物之一或多種細胞株可天然表現或經修飾以表現超過一種TAA，例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種、30種、31種、32種、33種、34種、35種、36種、37種、38種、39種、40種或更多種TAA。
疫苗組合物可包含來自1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種細胞株之細胞。此外，如本文所述，細胞株可例如在投與之前組合或混合。在一些實施例中，可減少或消除一或多種免疫抑制因子自一或多種細胞株或細胞株之組合。在一些實施例中，可添加或增加一或多種免疫刺激因子自一或多種細胞株或細胞株之組合產生。在某些實施例中，可選擇一或多種細胞株或細胞株之組合以表現TAA之異質性。在一些實施例中，細胞株可經修飾以增加一或多種免疫刺激因子、TAA及/或新抗原之產生。在一些實施例中，細胞株選擇使得HLA超型之異質性在疫苗組合物中表示出。在一些實施例中，選擇細胞株用於包括於疫苗組合物中，使得表示TAA之期望補體。
在各種實施例中，疫苗組合物包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株之細胞，其中該細胞株或細胞株之組合表現表7-23之TAA中之超過一者。在一些實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之來自至少兩種癌細胞株之細胞，其中各細胞株或細胞株之組合表現表7-23之TAA中之至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、至少八者、至少九者或至少十者。在一些實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株之細胞，其中該至少一種癌細胞株經修飾以表現表4之免疫刺激因子中之至少一者、表4之免疫刺激因子中之至少兩者或表4之免疫刺激因子之至少三者。在其他實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株之細胞，其中各細胞株或細胞株之組合經修飾以減少表6之免疫抑制因子中之至少一者或表6之免疫抑制因子中之至少兩者。
在一或多種細胞株經修飾以增加一或多種TAA之產生的實施例中，所表現之TAA可具有或可不具有DNA/蛋白質之原生編碼序列。亦即，表現可經密碼子優化或經修飾。此類優化或修飾可增強某些作用(例如可減少TAA蛋白自疫苗細胞膜排出)。如本文所述，在一些實施例中，所表現之TAA蛋白質為包含一或多個在癌症患者中鑑別之非同義突變(NSM)的經設計之抗原。在一些實施例中，NSM引入CD4、CD8或CD4及CD8新抗原決定基。
本文所述之疫苗組合物中之任一者可投與個體以治療癌症、預防癌症、延長患有癌症之個體之存活及/或刺激個體中之免疫反應。細胞株
在本揭示案之各種實施例中，構成疫苗組合物且用於本文所述之方法中之細胞株來源於親本癌細胞株。
細胞株可自如本文所述之大量來源獲得且容易為所屬領域中已知。例如，癌細胞株可自以下獲得：美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC，弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas, VA))、日本研究生物資源庫(Japanese Collection of Research Bioresources cell bank，JCRB，密蘇里州堪薩斯城市(Kansas City, MO))、細胞株服務(Cell Line Service，CLS，德國埃佩爾海姆(Eppelheim, Germany))、德國微生物與細胞培養物保存中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ，德國不倫瑞克(Braunschweig, Germany))、理研生物資源研究中心(RIKEN BioResource Research Center，RCB，日本築波(Tsukuba, Japan))、韓國細胞株庫(Korean Cell Line Bank，KCLB，韓國首爾(Seoul, South Korea))、NIH AIDS試劑計劃(NIH AIDS Reagent Program，NIH-ARP/Fisher BioServices，馬里蘭州羅克蘭(Rockland, MD))、生物研究收集及研究中心(Bioresearch Collection and Research Center，BCRC，臺灣新竹(Hsinchu, Taiwan))、國際實驗室細胞株保存中心(Interlab Cell Line Collection，ICLC，意大利熱那亞(Genova, Italy))、歐洲認證細胞培養物保存中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures，ECACC，英國索爾茲伯里(Salisbury, United Kingdom))、昆明細胞庫(Kunming Cell Bank，KCB，中國雲南(Yunnan, China))、美國國家癌症研究所發展治療計劃(National Cancer Institute Development Therapeutics Program，NCI-DTP，美國貝塞斯達(Bethesda, MD))、里約熱內盧細胞庫(Rio de Janeiro Cell Bank，BCRJ，巴西里約熱內盧(Rio de Janeiro, Brazil))、倫巴第及艾米莉亞·羅馬涅實驗動物預防研究所(Zooprophylactic Institute of Lombardy and Emilia Romagna，IZSLER，意大利米蘭(Milan, Italy))、日本東北大學細胞株目錄(Tohoku University cell line catalog，TKG，日本宮城(Miyagi, Japan))及伊朗國家細胞庫(National Cell Bank of Iran，NCBI，伊朗德黑蘭(Tehran, Iran))。在一些實施例中，經由關於TAA、免疫抑制因子表現及/或熟習此項技術者容易獲得之其他資訊檢查RNA-seq資料來鑑別細胞株。
在各種實施例中，本文所述之組合物及方法中的細胞株來自起源於以下之實體腫瘤之親本細胞株：肺、前列腺、睪丸、乳房、泌尿道、結腸、直腸、胃、頭頸部、肝臟、腎臟、神經系統、內分泌系統、間皮、卵巢、胰臟、食道、子宮或皮膚。在某些實施例中，親本細胞株包含選自由以下組成之群組的相同或不同組織學之細胞：鱗狀細胞、腺癌細胞、腺鱗細胞、大細胞細胞、小細胞細胞、肉瘤細胞、癌肉瘤細胞、混合間皮細胞及畸胎癌細胞。在相關實施例中，肉瘤細胞包含骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、間皮瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、神經膠質瘤、神經膠質肉瘤、星形細胞瘤、黏液肉瘤、間葉或混合間皮細胞。
在某些實施例中，細胞株包含起源於以下之癌細胞：肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、大腸直腸癌、乳癌(包括三陰性乳癌(TNBC))、膀胱或泌尿道癌、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、肝細胞(HCC)癌、腎或腎細胞癌(RCC)、胃或胃癌、卵巢癌、食道癌、睪丸癌、胰臟癌、中樞神經系統癌症、子宮內膜癌、黑色素瘤及間皮癌。
根據各種實施例，細胞株為同種異體細胞株(亦即，雖然來自相同物種個體個體，但在基因上不同且因此在免疫學上不相容之細胞。)在某些實施例中，細胞株為遺傳異質性同種異體細胞株。在其他實施例中，細胞株為遺傳同質性同種異體細胞株。
基於同種異體細胞之疫苗不同於自體疫苗，因為其不含患者特異性腫瘤抗原。本文所揭示之同種異體疫苗組合物之實施例包含已知表現特定腫瘤類型之TAA的實驗室生長之癌細胞株。本揭示案之同種異體細胞株之實施例在用於疫苗組合物中之前進行策略性選擇、獲得及修飾。本揭示案之實施例之疫苗組合物容易量產。相對於基於自體之療法，在研發、製造、儲存及其他領域中之此效能可降低成本且產生經濟效益。
腫瘤通常由隨時間進化及改變之癌細胞之高異質群體構成。因此，可假設，僅包含不靶向此癌症進化及進展之自體細胞株之疫苗組合物不足以引發有效疫苗接種所需之寬泛免疫反應。如本文所揭示之疫苗組合物之實施例中所述，使用一或多種具有某些基因修飾之策略性選擇之同種異體細胞株解決此差異。
在一些實施例中，基於同種異體細胞之疫苗來自設法治療之癌症的同一類型之癌細胞株(例如乳房、前列腺、肺)。在其他實施例中，各種類型細胞株(亦即，來自不同原發性腫瘤來源之細胞株)組合(例如幹細胞、前列腺、睪丸)。在一些實施例中，疫苗組合物中之細胞株為設法治療之癌症之同一類型之細胞株與來自不同原發性腫瘤來源之細胞株的混合物。
示例性癌細胞株，包括(但不限於)以下表1中提供之癌細胞株，考慮用於本文所述之組合物及方法。本文中鑑別之細胞株來源僅出於例示性目的。在本文中之各種實施例中描述之細胞株可自多種來源獲得。表 1. 每個適應症之示例性疫苗組合物細胞株
原發性腫瘤之解剖部位 細胞株通用名稱 細胞株來源 細胞株來源鑑別
肺 (小細胞及非小細胞) ABC-1 JCRB JCRB0815
Calu-1 ATCC HTB-54
LOU-NH91 DSMZ ACC-393
NCI-H1581 ATCC CRL-5878
NCI-H1703 ATCC CRL-5889
NCI-H460 ATCC HTB-177
NCI-H520 ATCC HTB-182
A549 ATCC CCL-185
LK-2 JCRB JCRB0829
NCI-H23 ATCC CRL-5800
NCI-H2066 ATCC CRL-5917
NCI-H2009 ATCC CRL-5911
NCI-H2023 ATCC CRL-5912
RERF-LC-Ad1 JCRB JCRB1020
SK-LU-1 ATCC HTB-57
NCI-H2172 ATCC CRL-5930
NCI-H292 ATCC CRL-1848
NCI-H661 ATCC HTB-183
SQ-1 RCB RCB1905
RERF-LC-KJ JCRB JCRB0137
SW900 ATCC HTB-59
NCI-H838 ATCC CRL-5844
NCI-H1693 ATCC CRL-5887
HCC2935 ATCC CRL-2869
NCI-H226 ATCC CRL-5826
HCC4006 ATCC CRL-2871
DMS 53 ATCC CRL-2062
DMS 114 ATCC CRL-2066
NCI-H196 ATCC CRL-5823
NCI-H1092 ATCC CRL-5855
SBC-5 JCRB JCRB0819
NCI-H510A ATCC HTB-184
NCI-H889 ATCC CRL-5817
NCI-H1341 ATCC CRL-5864
NCIH-1876 ATCC CRL-5902
NCI-H2029 ATCC CRL-5913
NCI-H841 ATCC CRL-5845
NCI-H1694 ATCC CRL-5888
DMS 79 ATCC CRL-20496
HCC33 DSMZ ACC-487
NCI-H1048 ATCC CRL-5853
NCI-H1105 ATCC CRL-5856
NCI-H1184 ATCC CRL-5858
NCI-H128 ATCC HTB-120
NCI-H1436 ATCC CRL-5871
DMS 153 ATCC CRL-2064
NCI-H1836 ATCC CRL-5898
NCI-H1963 ATCC CRL-5982
NCI-H2081 ATCC CRL-5920
NCI-H209 ATCC HTB-172
NCI-H211 ATCC CRL-524
NCI-H2171 ATCC CRL-5929
NCI-H2196 ATCC CRL-5932
NCI-H2227 ATCC CRL-5934
NCI-H446 ATCC HTB-171
NCI-H524 ATCC CRL-5831
NCI-H526 ATCC CRL-5811
NCI-H69 ATCC HTB-119
NCI-H82 ATCC HTB-175
SHP-77 ATCC CRL-2195
SW1271 ATCC CRL-2177
前列腺或睪丸 PC3 ATCC CRL-1435
DU145 ATCC HTB-81
LNCaP純系FGC ATCC CRL-2023
NCCIT ATCC CRL-2073
NEC-8 JCRB JCRB0250
NTERA-2cl-D1 ATCC CRL-1973
NCI-H660 ATCC CRL-5813
VCaP ATCC CRL-2876
MDA-PCa-2b ATCC CRL-2422
22Rv1 ATCC CRL-2505
E006AA Millipore SCC102
NEC14 JCRB JCRB0162
SuSa DSMZ ACC-747
833K-E ECACC 06072611
大腸直腸 LS123 ATCC CCL-255
HCT15 ATCC CCL-225
SW1463 ATCC CCL-234
RKO ATCC CRL-2577
HUTU80 ATCC HTB-40
HCT116 ATCC CCL-247
LOVO ATCC CCL-229
T84 ATCC CCL-248
LS411N ATCC CRL-2159
SW48 ATCC CCL-231
C2BBe1 ATCC CRL-2102
Caco-2 ATCC HTB-37
SNU-1033 KCLB 01033
COLO 201 ATCC CCL-224
GP2d ECACC 95090714
CL-14 DSMZ ACC-504
SW403 ATCC CCL-230
SW1116 ATCC CCL-233
SW837 ATCC CCL-235
SK-CO-1 ATCC HTB-39
CL-34 DSMZ ACC-520
NCI-H508 ATCC CCL-253
CCK-81 JCRB JCRB0208
SNU-C2A ATCC CCL-250.1
GP2d ECACC 95090714
HT-55 ECACC 85061105
MDST8 ECACC 99011801
RCM-1 JCRB JCRB0256
CL-40 DSMZ ACC-535
COLO 678 DSMZ ACC-194
LS180 ATCC CL-187
乳房 BT20 ATCC HTB-19
BT549 ATCC HTB-122
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
HS578T ATCC HTB-126
AU565 ATCC CRL-2351
CAMA1 ATCC HTB-21
MCF7 ATCC HTB-22
T-47D ATCC HTB-133
ZR-75-1 ATCC CRL-1500
MDA-MB-415 ATCC HTB-128
CAL-51 DSMZ ACC-302
CAL-120 DSMZ ACC-459
HCC1187 ATCC CRL-2322
HCC1395 ATCC CRL-2324
SK-BR-3 ATCC HTB-30
HDQ-P1 DSMZ ACC-494
HCC70 ATCC CRL-2315
HCC1937 ATCC CRL-2336
MDA-MB-436 ATCC HTB-130
MDA-MB-468 ATCC HTB-132
MDA-MB-157 ATCC HTB-24
HMC-1-8 JCRB JCRB0166
Hs 274.T ATCC CRL-7222
Hs 281.T ATCC CRL-7227
JIMT-1 ATCC ACC-589
Hs 343.T ATCC CRL-7245
Hs 606.T ATCC CRL-7368
UACC-812 ATCC CRL-1897
UACC-893 ATCC CRL-1902
泌尿道 UM-UC-3 ATCC CRL-1749
5637 ATCC HTB-9
J82 ATCC HTB-1
T24 ATCC HTB-4
HT-1197 ATCC CRL-1473
TCCSUP ATCC HTB-5
HT-1376 ATCC CRL-1472
SCaBER ATCC HTB-3
RT4 ATCC HTB-2
CAL-29 DSMZ ACC-515
AGS ATCC CRL-1739
KMBC-2 JCRB JCRB1148
253J KCLB 080001
253J-BV KCLB 080002
SW780 ATCC CRL-2169
SW1710 DSMZ ACC-426
VM-CUB-1 DSMZ ACC-400
BC-3C DSMZ ACC-450
U-BLC1 ECACC U-BLC1
KMBC-2 JCRB JCRB1148
RT112/84 ECACC 85061106
UM-UC-1 ECACC 06080301
RT-112 DSMZ ACC-418
KU-19-19 DSMZ ACC-395
639V DSMZ ACC-413
647V DSMZ ACC-414
腎 A-498 ATCC HTB-44
A-704 ATCC HTB-45
769-P ATCC CRL-1933
786-O ATCC CRL-1932
ACHN ATCC CRL-1611
KMRC-1 JCRB JCRB1010
KMRC-2 JCRB JCRB1011
VMRC-RCZ JCRB JCRB0827
VMRC-RCW JCRB JCRB0813
UO-31 NCI-DTP UO-31
Caki-1 ATCC HTB-46
Caki-2 ATCC HTB-47
OS-RC-2 RCB RCB0735
TUHR-4TKB RCB RCB1198
RCC-10RGB RCB RCB1151
SNU-1272 KCLB 01272
SNU-349 KCLB 00349
TUHR-14TKB RCB RCB1383
TUHR-10TKB RCB RCB1275
BFTC-909 DSMZ ACC-367
CAL-54 DSMZ ACC-365
KMRC-3 JCRB JCRB1012
KMRC-20 JCRB JCRB1071
上呼吸消化道(頭頸部) HSC-4 JCRB JCRB0624
DETROIT 562 ATCC CCL-138
SCC-9 ATCC CRL-1629
SCC-4 ATCC CRL-1624
OSC-19 JCRB JCRB0198
KON JCRB JCRB0194
HO-1-N-1 JCRB JCRB0831
OSC-20 JCRB JCRB0197
HSC-3 JCRB JCRB0623
SNU-1066 KCLB 01066
SNU-1041 KCLB 01041
SNU-1076 KCLB 01076
BICR 18 ECACC 06051601
CAL-33 DSMZ ACC-447
YD-8 KCLB 60501
FaDu ATCC HTB-43
2A3 ATCC CRL-3212
CAL-27 ATCC CRL-2095
SCC-25 ATCC CRL-1628
SCC-15 ATCC CRL-1623
HO-1-u-1 JCRB JCRB0828
KOSC-2 JCRB JCRB0126.1
RPMI-2650 ATCC CCL-30
SCC-90 ATCC CRL-3239
SKN-3 JCRB JCRB1039
HSC-2 JCRB JCRB0622
Hs 840.T ATCC CRL-7573
SAS JCRB JCRB0260
SAT JCRB JCRB1027
SNU-46 KCLB 00046
YD-38 KCLB 60508
SNU-899 KCLB 00899
HN DSMZ ACC-417
BICR 10 ECACC 04072103
BICR 78 ECACC 04072111
卵巢 OVCAR-3 ATCC HTB-161
TOV-112D ATCC CRL-11731
ES-2 ATCC CRL-1978
TOV-21G ATCC CRL-11730
OVTOKO JCRB JCRB1048
KURAMOCHI JCRB JCRB0098
MCAS JCRB JCRB0240
TYK-nu JCRB JCRB0234.0
OVSAHO JCRB JCRB1046
OVMANA JCRB JCRB1045
JHOM-2B RCB RCB1682
OV56 ECACC 96020759
JHOS-4 RCB RCB1678
JHOC-5 RCB RCB1520
OVCAR-4 NCI-DTP OVCAR-4
JHOS-2 RCB RCB1521
EFO-21 DSMZ ACC-235
OV-90 ATCC CRL-11732
OVKATE JCRB JCRB1044
SK-OV-3 ATCC HTB-77
Caov-4 ATCC HTB-76
Coav-3 ATCC HTB-75
JHOM-1 RCB RCB1676
COV318 ECACC 07071903
OVK-18 RCB RCB1903
SNU-119 KCLB 00119
SNU-840 KCLB 00840
SNU-8 KCLB 0008
COV362 ECACC 07071910
COV434 ECACC 07071909
COV644 ECACC 07071908
OV7 ECACC 96020764
OAW-28 ECACC 85101601
OVCAR-8 NCI-DTP OVCAR-8
59M ECACC 89081802
EFO-27 DSMZ ACC-191
胰臟 PANC-1 ATCC CRL-1469
HPAC ATCC CRL-2119
KP-2 JCRB JCRB0181
KP-3 JCRB JCRB0178.0
KP-4 JCRB JCRB0182
HPAF-II ATCC CRL-1997
SUIT-2 JCRB JCRB1094
AsPC-1 ATCC CRL-1682
PSN1 ATCC CRL-3211
CFPAC-1 ATCC CRL-1918
Capan-1 ATCC HTB-79
Panc 02.13 ATCC CRL-2554
Panc 03.27 ATCC CRL-2549
BxPC-3 ATCC CRL-1687
SU.86.86 ATCC CRL-1837
Hs 766T ATCC HTB-134
Panc 10.05 ATCC CRL-2547
Panc 04.03 ATCC CRL-2555
PaTu 8988s DSMZ ACC-204
PaTu 8988t DSMZ ACC-162
SW1990 ATCC CRL-2172
SNU-324 KCLB 00324
SNU-213 KCLB 00213
DAN-G DSMZ ACC-249
Panc 02.03 ATCC CRL-2553
PaTu 8902 DSMZ ACC-179
Capan-2 ATCC HTB-80
MIA PaCa-2 ATCC CRL-1420
YAPC DSMZ ACC-382
HuP-T3 DSMZ ACC-259
T3M-4 RCB RCB1021
PK-45H RCB RCB1973
Panc 08.13 ATCC CRL-2551
PK-1 RCB RCB1972
PK-59 RCB RCB1901
HuP-T4 DSMZ ACC-223
Panc 05.04 ATCC CRL-2557
胃 RERF-GC-1B JCRB JCRB1009
Fu97 JCRB JCRB1074
MKN74 JCRB JCRB0255
NCI-N87 ATCC CRL-5822
NUGC-2 JCRB JCRB0821
MKN45 JCRB JCRB0254
OCUM-1 JCRB JCRB0192
MKN7 JCRB JCRB1025
MKN1 JCRB JCRB0252
ECC10 RCB RCB0983
TGBC-11-TKB RCB RCB1148
SNU-620 KCLB 00620
GSU RCB RCB2278
KE-39 RCB RCB1434
HuG1-N RCB RCB1179
NUGC-4 JCRB JCRB0834
SNU-16 ATCC CRL-5974
SJSA-1 ATCC CRL-2098
RD-ES ATCC HTB-166
U2OS ATCC HTB-96
SaOS-2 ATCC HTB-85
Hs 746.T ATCC HTP-135
LMSU RCB RCB1062
SNU-520 KCLB 00520
GSS RCB RCB2277
ECC12 RCB RCB1009
GCIY RCB RCB0555
SH-10-TC RCB RCB1940
HGC-27 BCRJ 0310
HuG1-N RCB RCB1179
SNU-601 KCLB KCLB00601
SNU-668 KCLB 00668
NCC-StC-K140 JCRB JCRB1228
SNU-719 KCLB 00719
SNU-216 KCLB 00216
NUGC-3 JCRB JCRB0822
肝 Hep-G2 ATCC HB-8065
JHH-2 JCRB JCRB1028
JHH-4 JCRB JCRB0435
JHH-6 JCRB JCRB1030
Li7 RCB RCB1941
HLF JCRB JCRB0405
HuH-6 RCB BRC1367
JHH-5 JCRB JCRB1029
HuH-7 JCRB JCRB0403
SNU-182 ATCC CRL-2235
JHH-7 JCRB JCRB1031
SK-HEP-1 ATCC HTB-52
Hep 3B2.1-7 ATCC HB-8064
SNU-449 ATCC CRL-2234
SNU-761 KCLB KCLB
JHH-1 JCRB JCRB1062
SNU-398 ATCC CRL-2233
SNU-423 ATCC CRL-2238
SNU-387 ATCC CRL-2237
SNU-475 ATCC CRL-2236
SNU-886 KCLB KCLB 00886
SNU-878 KCLB KCLB 00878
NCI-H684 KCLB KCLB 90684
PLC/PRF/5 ATCC CRL-8024
HuH-1 JCRB JCRB0199
HLE JCRB JCRB0404
C3A ATCC HB-8065
中樞神經系統 DBTRG-05MG ATCC CRL-2020
LN-229 ATCC CRL-2611
SF-126 JCRB IFO50286
M059K ATCC CRL-2365
M059KJ ATCC CRL-2366
U-251 MG JCRB IFO50288
A-172 ATCC CRL-1620
YKG-1 ATCC JCRB0746
GB-1 ATCC IFO50489
KNS-60 ATCC IFO50357
KNS-81 JCRB IFO50359
TM-31 RCB RCB1731
NMC-G1 JCRB IFO50467
SNU-201 KCLB 00201
SW1783 ATCC HTB-13
GOS-3 DSMZ ACC-408
KNS-81 JCRB IFO50359
KG-1-C JCRB JCRB0236
AM-38 JCRB IFO50492
CAS-1 ILCL HTL97009
H4 ATCC HTB-148
D283 Med ATCC HTB-185
DK-MG DSMZ ACC-277
U-118MG ATCC HTB-15
SNU-489 KCLB 00489
SNU-466 KCLB 00426
SNU-1105 KCLB 01105
SNU-738 KCLB 00738
SNU-626 KCLB 00626
Daoy ATCC HTB-186
D341 Med ATCC HTB-187
SW1088 ATCC HTB-12
Hs 683 ATCC HTB-138
ONS-76 JCRB IFO50355
LN-18 ATCC CRL-2610
T98G ATCC CRL-1690
GMS-10 DSMZ ACC-405
42-MG-BA DSMZ ACC-431
GaMG DSMZ ACC-242
8-MG-BA DSMZ ACC-432
IOMM-Lee ATCC CRL-3370
SF268 NCI-DTP SF-268
SF539 NCI-DTP SF-539
SNB75 NCI-DTP SNB-75
食道 TE-10 RCB RCB2099
TE-6 RCB RCB1950
TE-4 RCB RCB2097
EC-GI-10 RCB RCB0774
OE33 ECACC 96070808
TE-9 RCB RCB1988
TT JCRB JCRB0262
TE-11 RCB RCB2100
OE19 ECACC 96071721
OE21 ECACC 96062201
KYSE-450 JCRB JCRB1430
TE-14 RCB RCB2101
TE-8 RCB RCB2098
KYSE-410 JCRB JCRB1419
KYSE-140 DSMZ ACC-348
KYSE-180 JCRB JCRB1083
KYSE-520 JCRB JCRB1439
KYSE-270 JCRB JCRB1087
KYSE-70 JCRB JCRB0190
TE-1 RCB RCB1894
TE-5 RCB RCB1949
TE-15 RCB RCB1951
KYSE-510 JCRB JCRB1436
KYSE-30 ECACC 94072011
KYSE-150 DSMZ ACC-375
COLO 680N DSMZ ACC-182
KYSE-450 JCRB JCRB1430
TE-10 RCB RCB2099
ESO-26 ECACC 11012009
ESO-51 ECACC 11012010
FLO-1 ECACC 11012001
KYAE-1 ECACC 11012002
KYSE-220 JCRB JCRB1086
KYSE-50 JCRB JCRB0189
OACM5.1 C ECACC 11012006
OACP4 C ECACC 11012005
子宮內膜 SNG-M JCRB IFO50313
HEC-1-B ATCC HTB-113
JHUEM-3 Riken RCB RCB1552
RL95-2 ATCC CRL-1671
MFE-280 ECACC 98050131
MFE-296 ECACC 98031101
TEN Riken RCB RCB1433
JHUEM-2 Riken RCB RCB1551
AN3-CA ATCC HTB-111
KLE ATCC CRL-1622
石川 ECACC 99040201
HEC-151 JCRB JCRB1122
SNU-1077 KCLB 01077
MFE-319 DSMZ ACC-423
EFE-184 DSMZ ACC-230
HEC-108 JCRB JCRB1123
HEC-265 JCRB JCRB1142
HEC-6 JCRB JCRB1118
HEC-50B JCRB JCRB1145
JHUEM-1 RCB RCB1548
HEC-251 JCRB JCRB1141
COLO 684 ECACC 87061203
SNU-685 KCLB 00685
HEC-59 JCRB JCRB1120
EN DSMZ ACC-564
ESS-1 DSMZ ACC-461
HEC-1A ATCC HTB-112
JHUEM-7 RCB RCB1677
HEC-1 JCRB JCRB0042
皮膚 RPMI-7951 ATCC HTB-66
MeWo ATCC HTB-65
Hs 688(A).T ATCC CRL-7425
COLO 829 ATCC CRL-1974
C32 ATCC CRL-1585
A-375 ATCC CRL-1619
Hs 294T ATCC HTB-140
Hs 695T ATCC HTB-137
Hs 852T ATCC CRL-7585
A2058 ATCC CRL-11147
RVH-421 DSMZ ACC-127
Hs 895.T ATCC CRL-7637
Hs 940.T ATCC CRL-7691
SK-MEL-1 ATCC HTB-67
SK-MEL-28 ATCC HTB-72
SH-4 ATCC CRL-7724
COLO 800 ECACC 93051123
COLO 783 DSMZ ACC-257
MDA-MB-435S ATCC HTB-129
IGR-1 CLS 300219/p483_IGR-1
IGR-39 DSMZ ACC-239
HT-144 ATCC HTB-63
SK-MEL-31 ATCC HTB-73
Hs 839.T ATCC CRL-7572
Hs 600.T ATCC CRL-7360
A101D ATCC CRL-7898
IPC-298 DSMZ ACC-251
SK-MEL-24 ATCC HTB-71
SK-MEL-3 ATCC HTB-69
HMCB ATCC CRL-9607
Malme-3M ATCC HTB-64
Mel JuSo DSMZ ACC-74
COLO 679 RCB RCB0989
COLO 741 ECACC 93052621
SK-MEL-5 ATCC HTB-70
WM266-4 ATCC CRL-1676
IGR-37 DSMZ ACC-237
Hs 934.T ATCC CRL-7684
UACC-257 NCI-DTP UACC-257
間皮 NCI-H28 ATCC CRL-5820
MSTO-211H ATCC CRL-2081
IST-Mes1 ICLC HTL01005
ACC-MESO-1 RCB RCB2292
NCI-H2052 ATCC CRL-5951
NCI-H2452 ATCC CRL-2081
MPP 89 ICLC HTL00012
IST-Mes2 ICLC HTL01007
RS-5 DSMZ ACC-604
DM-3 DSMZ ACC-595
JL-1 DSMZ ACC-596
COR-L321 ECACC 96020756
除表1中鑑別之細胞株之外，在各種實施例中亦考慮以下細胞株。
在各種實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種非小細胞肺(NSCLC)細胞株。藉由實例，考慮以下NSCLC細胞株：NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23。本揭示案亦考慮另外NSCLC細胞株。如本文所述，亦考慮在包含NSCLC細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種前列腺癌細胞株。藉由實例，考慮以下前列腺癌細胞株：PC3、DU-145、LNCAP、NEC8及NTERA-2cl-D1。本揭示案亦考慮另外前列腺癌細胞株。如本文所述，亦考慮在包含前列腺癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種大腸直腸癌(CRC)細胞株。藉由實例，考慮以下大腸直腸癌細胞株：HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116及LS411N。本揭示案亦考慮另外大腸直腸癌細胞株。如本文所述，亦考慮在包含CRC細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種乳癌或三陰性乳癌(TNBC)細胞株。藉由實例，考慮以下TNBC細胞株：Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7及T-47D。本揭示案亦考慮另外乳癌細胞株。如本文所述，亦考慮在包含乳癌及/或TNBC癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種膀胱或泌尿道癌細胞株。藉由實例，考慮以下泌尿道或膀胱癌細胞株：UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376及SCaBER。本揭示案亦考慮另外膀胱癌細胞株。如本文所述，亦考慮在包含膀胱或泌尿道癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種胃或胃癌細胞株。藉由實例，考慮以下胃或胃癌細胞株：Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1及MKN1。本揭示案亦考慮另外胃癌細胞株。如本文所述，亦考慮在包含胃或胃癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)細胞株。藉由實例，考慮以下SCCHN細胞株：HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1及OSC-20。本揭示案亦考慮另外SCCHN細胞株。如本文所述，亦考慮在包含SCCHN癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種小細胞肺癌(SCLC)細胞株。藉由實例，考慮以下SCLC細胞株：DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841及NCI-H1694。本揭示案亦考慮另外SCLC細胞株。如本文所述，亦考慮在包含SCLC癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種肝臟或肝細胞癌(HCC)細胞株。藉由實例，考慮以下HCC細胞株：Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-6、Li7、HLF、HuH-6、JHH-5及HuH-7。本揭示案亦考慮另外HCC細胞株。如本文所述，亦考慮在包含肝臟或HCC癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種腎癌、諸如腎細胞癌(RCC)細胞株。藉由實例，考慮以下RCC細胞株：A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ及VMRC-RCW。本揭示案亦考慮另外RCC細胞株。如本文所述，亦考慮在包含腎臟或RCC癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種神經膠母細胞瘤(GBM)癌細胞株。藉由實例，考慮以下GBM細胞株：DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1及KNS-60。本揭示案亦考慮另外GBM細胞株。如本文所述，亦考慮在包含GBM癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種卵巢癌細胞株。藉由實例，考慮以下卵巢細胞株：TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO及MCAS。本揭示案亦考慮另外卵巢細胞株。如本文所述，亦考慮在包含卵巢癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種食道癌細胞株。藉由實例，考慮以下食道細胞株：TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19、OE21。本揭示案亦考慮另外食道細胞株。如本文所述，亦考慮在包含食道癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種胰臟癌細胞株。藉由實例，考慮以下胰臟細胞株：PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2及PSN1。本揭示案亦考慮另外胰臟細胞株。如本文所述，亦考慮在包含胰臟癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種子宮內膜癌細胞株。藉由實例，考慮以下子宮內膜細胞株：SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA及石川。本揭示案亦考慮另外子宮內膜細胞株。如本文所述，亦考慮在包含子宮內膜癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種黑色素瘤癌細胞株。藉由實例，考慮以下黑色素瘤細胞株：RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T及A2058。本揭示案亦考慮另外黑色素瘤細胞株。如本文所述，亦考慮在包含黑色素瘤癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
在一些實施例中，根據本揭示案製備及使用一或多種間皮瘤癌細胞株。藉由實例，考慮以下間皮瘤細胞株： NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89及IST-Mes2。本揭示案亦考慮另外間皮瘤細胞株。如本文所述，亦考慮在包含間皮瘤癌細胞株之疫苗中包括諸如DMS 53之癌幹細胞株。
根據本揭示案之疫苗組合物之實施例用於治療及/或預防各種類型之癌症。在一些實施例中，疫苗組合物可包含源自同一癌症類型之癌細胞株。例如，疫苗組合物可包含1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種NSCLC細胞株，且此類組合物可適用於治療或預防NSCLC。根據某些實施例，包含NCSLC細胞株之疫苗組合物可用於治療或預防除NSCLC以外之癌症，其實例在本文中描述。
在一些實施例中，疫苗組合物可包含源自不同癌症類型之癌細胞株。例如，疫苗組合物可包含1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種NSCLC細胞株，加1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種SCLC癌細胞株，視情況，加一種或其他癌細胞株，諸如癌幹細胞株等，且此類組合物可適用於治療或預防NSCLC及/或前列腺癌及/或乳癌等。根據一些實施例，如本文所述之包含不同癌細胞株之疫苗組合物可用於治療或預防多種癌症。在一些實施例中，特定腫瘤中TAA或多種TAA之靶向藉由使用來源於生物系統內不同組織或器官之細胞株來優化以靶向同一系統內原發性來源之癌症。藉助於非限制性實例，來源於生殖系統(例如卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、睪丸、輸精管、儲精囊及前列腺)之腫瘤的細胞株可組合；來源於消化系統(例如唾液腺、食道、胃、肝臟、膽囊、胰臟、腸、直腸及肛門)之腫瘤的細胞株可組合；來源於呼吸系統(例如咽、喉、支氣管、肺及子宮帽)之腫瘤的細胞株可組合；以及來源於泌尿系統(例如腎臟、輸尿管、膀胱及尿道)之腫瘤的細胞株可組合。
根據疫苗組合物之各種實施例，本揭示案提供包含細胞株之組合的組合物。藉助於非限制性實例，下文提供細胞株組合。在以下實例中之每一者中，細胞株DMS 53無論經修飾或未經修飾，均與相關清單中之5種其他癌細胞株組合。各敍述組合內細胞株中之一或多者可如本文所述經修飾。在一些實施例中，細胞株組合中之細胞株中無一者經修飾。
(1)NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23，用於治療及/或預防NSCLC；
(2)DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A 、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53及NCI-H1694，用於治療及/或預防SCLC；
(3)DMS 53、PC3、DU-145、LNCAP、NCC-IT及NTERA- 2cl-D1，用於治療及/或預防前列腺癌；
(4)DMS 53、HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116及LS411N ，用於治療及/或預防大腸直腸癌；
(5)DMS 53、Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7及T-47D，用於治療及/或預防乳癌，包括三陰性乳癌(TNBC)；
(6)DMS 53、UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376及SCaBER ，用於治療及/或預防膀胱癌；
(7)DMS 53、HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1及OSC-20，用於治療及/或預防頭及/或頸癌；
(8)DMS 53、Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1及MKN1 ，用於治療及/或預防胃癌；
(9)DMS 53、Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-6、Li7、HLF 、HuH-6、JHH-5及HuH-7，用於治療及/或預防肝癌；
(10)DMS 53、DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1及KNS-60，用於治療及/或預防神經膠母細胞瘤；
(11)DMS 53、TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO及MCAS，用於治療及/或預防卵巢癌；
(12)DMS 53、TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19及OE21，用於治療及/或預防食道癌；
(13)DMS 53、A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ及VMRC-RCW，用於治療及/或預防腎癌；
(14)DMS 53、PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2及PSN1，用於治療及/或預防胰臟癌；
(15)DMS 53、SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA及石川，用於治療及/或預防子宮內膜癌；
(16)DMS 53、RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T及A2058，用於治療及/或預防皮膚癌；及
(17)DMS 53、NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC- MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89及IST-Mes2，用於治療及/或預防間皮瘤。
在一些實施例中，本文所描述之疫苗組合物及方法中的細胞株包括一或多種癌症幹細胞(CSC)細胞株，無論經修飾或未經修飾。CSC細胞株之一實例為小細胞肺癌細胞株DMS 53，無論經修飾或未經修飾。CSC顯示視腫瘤解剖來源而不同之獨特標記物。示例性CSC標記物包括prominin-1(CD133)、A2B5、醛去氫酶(ALDH1)、多蜂房蛋白(Bmi-1)、整合素-β1(CD29)、玻尿酸受體(CD44)、Thy-1(CD90)、SCF受體(CD117)、TRA-1-60、巢蛋白、Oct-4、階段特異性胚抗原-1(CD15)、GD3(CD60a)、階段特異性胚抗原-1(SSEA-1)或(CD15)、階段特異性胚抗原-4(SSEA-4)、階段特異性胚抗原-5(SSEA-5)及湯姆森-弗雷登雷希抗原(Thomsen-Friedenreich antigen，CD176)。
鑑別具有更大的具有幹細胞樣特性之潛能之癌細胞株的表現標記物視包括原發性腫瘤之解剖來源、器官或組織之多種因子而不同。表2中提供藉由原發性腫瘤部位鑑別之示例性癌症幹細胞標記物且揭示於多個參考文獻中(例如Gilbert, CA及Ross, AH.《細胞生物化學雜誌(J Cell Biochem.)》(2009)；Karsten, U及Goletz, S. SpringerPlus(2013)；Zhao, W等人 《癌症轉化醫學(Cancer Transl Med.)》(2017))。
表2中列出示例性細胞株，該等細胞株表現具有對細胞株所源自之原發性腫瘤之解剖部位具有特異性的癌症幹細胞樣特性之一或多種標記物。表3中提供示例性癌幹細胞株。使用來自癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA-seq資料確定CSC標記物之表現(自www.broadinstitute.org/ccle檢索, 2019年11月23日；Barretina, J等人 《自然(Nature.)》(2012))。將HUGO基因命名委員會基因符號輸入CCLE搜索且針對各CSC標記物下載mRNA表現。若RNA-seq值(FPKM)超過0，則CSC標記物之表現視為陽性。表 2. 根據原發性腫瘤解剖來源之示例性 CSC 標記物
原發性腫瘤之解剖部位 CSC 標記物通用名稱 CSC 標記物基因符號
卵巢 內皮因子、CD105 ENG
CD117、cKIT KIT
CD44 CD44
CD133 PROM1
SALL4 SAL4
Nanog NANOG
Oct-4 POU5F1
胰臟 ALDH1A1 ALDH1A1
c-Myc MYC
EpCAM、TROP1 EPCAM
CD44 CD44
Cd133 PROM1
CXCR4 CXCR4
Oct-4 POU5F1
巢蛋白 NES
BMI-1 BMI1
皮膚 CD27 CD27
ABCB5 ABCB5
ABCG2 ABCG2
CD166 ALCAM
巢蛋白 NES
CD133 PROM1
CD20 MS4A1
NGFR NGFR
肺 ALDH1A1 ALDH1A1
EpCAM、TROP1 EPCAM
CD90 THY1
CD117、cKIT KIT
CD133 PROM1
ABCG2 ABCG2
SOX2 SOX2
肝 Nanog NANOG
CD90/thy1 THY1
CD133 PROM1
CD13 ANPEP
EpCAM、TROP1 EPCAM
CD117、cKIT KIT
SALL4 SAL4
SOX2 SOX2
上呼吸消化道(頭頸部) ABCG2 ABCG2
ALDH1A1 ALDH1A1
Lgr5、GPR49 LGR5
BMI-1 BMI1
CD44 CD44
cMET MET
中樞神經系統 ALDH1A1 ALDH1A1
ABCG2 ABCG2
BMI-1 BMI1
CD15 FUT4
CD44 CD44
CD49f、整合素α6 ITGA6
CD90 THY1
CD133 PROM1
CXCR4 CXCR4
CX3CR1 CX3CR1
SOX2 SOX2
c-Myc MYC
Musashi-1 MSI1
巢蛋白 NES
胃 ALDH1A1 ALDH1A1
ABCB1 ABCB1
ABCG2 ABCG2
CD133 PROM1
CD164 CD164
CD15 FUT4
Lgr5、GPR49 LGR5
CD44 CD44
MUC1 MUC1
DLL4 DLL4
結腸(大腸及小腸) ALDH1A1 ALDH1A1
c-myc MYC
CD44 CD44
CD133 PROM1
Nanog NANOG
Musashi-1 MSI1
EpCAM、TROP1 EPCAM
Lgr5、GPR49 LGR5
SALL4 SAL4
乳房 ABCG2 ABCG2
ALDH1A1 ALDH1A1
BMI-1 BMI1
CD133 PROM1
CD44 CD44
CD49f、整合素α6 ITGA6
CD90 THY1
c-myc MYC
CXCR1 CXCR1
CXCR4 CXCR4
EpCAM、TROP1 EPCAM
KLF4 KLF4
MUC1 MUC1
Nanog NANOG
SALL4 SAL4
SOX2 SOX2
泌尿道 ALDH1A1 ALDH1A1
CEACAM6、CD66c CEACAM6
Oct4 OCT4
CD44 CD44
YAP1 YAP1
造血及淋巴組織 BMI-1 BMI1
CD117、c-kit KIT
CD20 MS4A1
CD27、TNFRSF7 CD27
CD34 CD34
CD38 CD38
CD44 CD44
CD96 CD96
GLI-1 GLI1
GLI-2 GLI2
IL-3Rα IL3RA
MICL CLEC12A
黏結蛋白聚醣-1(Syndecan-1)、CD138 SDC1
TIM-3 HAVCR2
骨 ABCG2 ABCG2
CD44 CD44
內皮因子、CD105 ENG
巢蛋白 NES
表 3. 表現 CSC 標記物之細胞株
原發性腫瘤之解剖部位 細胞株通用名稱 細胞株來源 細胞株來源鑑別
卵巢 JHOM-2B RCB RCB1682
OVCAR-3 ATCC HTB-161
OV56 ECACC 96020759
JHOS-4 RCB RCB1678
JHOC-5 RCB RCB1520
OVCAR-4 NCI-DTP OVCAR-4
JHOS-2 RCB RCB1521
EFO-21 DSMZ ACC-235
胰臟 CFPAC-1 ATCC CRL-1918
Capan-1 ATCC HTB-79
Panc 02.13 ATCC CRL-2554
SUIT-2 JCRB JCRB1094
Panc 03.27 ATCC CRL-2549
皮膚 SK-MEL-28 ATCC HTB-72
RVH-421 DSMZ ACC-127
Hs 895.T ATCC CRL-7637
Hs 940.T ATCC CRL-7691
SK-MEL-1 ATCC HTB-67
Hs 936.T ATCC CRL-7686
SH-4 ATCC CRL-7724
COLO 800 DSMZ ACC-193
UACC-62 NCI-DTP UACC-62
肺 NCI-H2066 ATCC CRL-5917
NCI-H1963 ATCC CRL-5982
NCI-H209 ATCC HTB-172
NCI-H889 ATCC CRL-5817
COR-L47 ECACC 92031915
NCI-H1092 ATCC CRL-5855
NCI-H1436 ATCC CRL-5871
COR-L95 ECACC 96020733
COR-L279 ECACC 96020724
NCI-H1048 ATCC CRL-5853
NCI-H69 ATCC HTB-119
DMS 53 ATCC CRL-2062
肝 HuH-6 RCB RCB1367
Li7 RCB RCB1941
SNU-182 ATCC CRL-2235
JHH-7 JCRB JCRB1031
SK-HEP-1 ATCC HTB-52
Hep 3B2.1-7 ATCC HB-8064
上呼吸消化道(頭頸部) SNU-1066 KCLB 01066
SNU-1041 KCLB 01041
SNU-1076 KCLB 01076
BICR 18 ECACC 06051601
CAL-33 DSMZ ACC-447
DETROIT 562 ATCC CCL-138
HSC-3 JCRB JCRB0623
HSC-4 JCRB JCRB0624
SCC-9 ATCC CRL-1629
YD-8 KCLB 60501
泌尿道 CAL-29 DSMZ ACC-515
KMBC-2 JCRB JCRB1148
253J KCLB 80001
253J-BV KCLB 80002
SW780 ATCC CRL-2169
SW1710 DSMZ ACC-426
VM-CUB-1 DSMZ ACC-400
BC-3C DSMZ ACC-450
中樞神經系統 KNS-81 JCRB IFO50359
TM-31 RCB RCB1731
NMC-G1 JCRB IFO50467
GB-1 JCRB IFO50489
SNU-201 KCLB 00201
DBTRG-05MG ATCC CRL-2020
YKG-1 JCRB JCRB0746
胃 ECC10 RCB RCB0983
RERF-GC-1B JCRB JCRB1009
TGBC-11-TKB RCB RCB1148
SNU-620 KCLB 00620
GSU RCB RCB2278
KE-39 RCB RCB1434
HuG1-N RCB RCB1179
NUGC-4 JCRB JCRB0834
MKN-45 JCRB JCRB0254
SNU-16 ATCC CRL-5974
OCUM-1 JCRB JCRB0192
結腸(大腸及小腸) C2BBe1 ATCC CRL-2102
Caco-2 ATCC HTB-37
SNU-1033 KCLB 01033
SW1463 ATCC CCL-234
COLO 201 ATCC CCL-224
GP2d ECACC 95090714
LoVo ATCC CCL-229
SW403 ATCC CCL-230
CL-14 DSMZ ACC-504
乳房 HCC2157 ATCC CRL-2340
HCC38 ATCC CRL-2314
HCC1954 ATCC CRL-2338
HCC1143 ATCC CRL-2321
HCC1806 ATCC CRL-2335
HCC1599 ATCC CRL-2331
MDA-MB-415 ATCC HTB-128
CAL-51 DSMZ ACC-302
造血及淋巴組織 KO52 JCRB JCRB0123
SKNO-1 JCRB JCRB1170
Kasumi-1 ATCC CRL-2724
Kasumi-6 ATCC CRL-2775
MHH-CALL-3 DSMZ ACC-339
MHH-CALL-2 DSMZ ACC-341
JVM-2 ATCC CRL-3002
HNT-34 DSMZ ACC-600
骨 HOS ATCC CRL-1543
OUMS-27 JCRB IFO50488
T1-73 ATCC CRL-7943
Hs 870.T ATCC CRL-7606
Hs 706.T ATCC CRL-7447
SJSA-1 ATCC CRL-2098
RD-ES ATCC HTB-166
U2OS ATCC HTB-96
SaOS-2 ATCC HTB-85
SK-ES-1 ATCC HTB-86
在某些實施例中，包含細胞株組合之疫苗組合物能夠刺激免疫反應及/或預防癌症及/或治療癌症。本揭示案提供使用一或多種包含治療有效量之細胞株之疫苗組合物的組合物及方法。
在混合物或疫苗組合物中來自多種個別細胞株之細胞的量(例如數目)可相同(如本文所定義)或不同。在各種實施例中，在疫苗組合物中來自細胞株或來自各細胞株(在投與多種細胞株之情況下)之細胞數目為大約1.0×106 個、2.0×106 個、3.0×106 個、4.0×106 個、5.0×106 個、6.0×106 個、7.0×106 個、8×106 個、9.0×106 個、1.0×107 個、2.0×107 個、3.0×107 個、4.0×107 個、5.0×107 個、6.0×107 個、8.0×107 個或9.0×107 個細胞。
例如每個投與部位，投與個體之細胞之總數目可在1.0×106 至9.0×107 之範圍內。例如，投與2.0×106 個、3.0×106 個、4.0×106 個、5.0×106 個、6.0×106 個、7.0×106 個、8×106 個、9.0×106 個、1.0×107 個、2.0×107 個、3.0×107 個、4.0×107 個、5.0×107 個、6.0×107 個、8.0×107 個、8.6×107 個、8.8×107 個或9.0×107 個細胞。
在某些實施例中，疫苗組合物之每次投與中包括的細胞株數目可在1至10種細胞株之範圍內。在一些實施例中，來自各細胞株之細胞數目不相同且使用不同比率之細胞株。舉例而言，若一種混合物含有來自3種不同細胞株之5.0×107 個總細胞，則一種細胞株可為3.33×107 個細胞且其餘2種細胞株可為8.33×106 個細胞。HLA 多樣性
當個體之HLA分子與由所投與疫苗組合物之細胞表現的HLA分子不同時，發生HLA錯配。HLA匹配過程涉及表徵5個主要HLA基因座，其包括三個I類基因座HLA-A、HLA-B及HLA-C及兩個II類基因座HLA-DRB1及HLA-DQB1之HLA對偶基因。當每個個體在各基因座表現兩個對偶基因時，匹配或錯配程度按照10之規模計算，其中10/10為所有10個對偶基因處之完美匹配。
對錯配HLA基因座之反應由免疫系統之先天性及適應性細胞介導。在先天免疫系統之細胞內，HLA對偶基因中錯配之識別在一定程度上由單核球介導。不受任何理論或機制束縛，單核球感測到「非自身」觸發單核球衍生之DC的浸潤，接著其成熟，引起有效抗原呈遞至原生T細胞。與由匹配之同源抗原活化之DC相比，同種異體抗原活化之DC產生之IL-12的量增加，且此增加之IL-12產生引起對Th1 T細胞之反應偏斜及IFN γ產生增加。適應性免疫系統對HLA錯配之識別在一定程度上由T細胞驅動。不受任何理論或機制束縛，所有循環T細胞之1-10%為同種異體反應性的且對自身不存在之HLA分子起反應。此比對習知外來抗原具有反應性之內源性T細胞之頻率大若干數量級。免疫系統識別HLA對偶基因之此等差異及產生免疫反應的能力係供體與患者之間進行成功移植的障礙，且已被視為癌症疫苗研發中之障礙物。
基於HLA分子與抗原決定基錨定殘基之結合親和力，可將多達945個不同HLA-A及HLA-B對偶基因分配至九種超型之一。在一些實施例中，本文所提供之疫苗組合物展現HLA超型之異質性，例如HLA-A超型與HLA-B超型之混合物。如本文所述，可考慮多種特徵及標準以確保疫苗組合物之期望異質性，包括(但不限於)個體種族(關於細胞供體及接受疫苗之個體)。本文描述另外標準(例如實例22)。在某些實施例中，疫苗組合物表現HLA超型之異質性，其中表示至少兩種不同HLA-A及至少兩種HLA-B超型。
在一些實施例中，提供包含治療有效量之多種細胞株之組合物以確保腫瘤細胞疫苗與受體之間的多種I類及II類HLA分子上之廣泛HLA錯配。
在一些實施例中，疫苗組合物表現HLA超型之異質性，其中該組合物表現主要組織相容性複合體(MHC)分子之異質性，以便表示HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01中之兩者及HLA-B07、HLA- B08、HLA-B27及HLA-B44超型中之兩者在一些實施例中，疫苗組合物表現HLA超型之異質性，其中該組合物表現MHC分子之異質性且至少表示HLA-A24。在一些例示性實施例中，組合物表現MHC分子之異質性，以便表示HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01、HLA-B07、HLA-B27及HLA-B44超型。在其他例示性實施例中，組合物表現MHC分子之遺傳異質性，以便表示HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08及HLA-B44超型。
患者顯示充當自身標記物之廣泛HLA類型。在遇到非自身細胞時，會啟動促進諸如IFNγ及IL-2之細胞介素釋放的局部發炎反應。在一些實施例中，增加疫苗混合物內HLA-超型之異質性能夠在遞送疫苗時加強局部發炎反應，賦予輔助作用。如本文所述，在一些實施例中，增加由癌症疫苗組合物引發之腫瘤反應性T細胞的廣度、量值及免疫原性藉由包括多種細胞株而實現，該等細胞株經選擇以在HLA類型中具有錯配，例如基於某些TAA之表現選擇。本文所提供之疫苗組合物之實施例能夠在個體中有效引發寬泛且有效之抗癌反應，且具有由HLA錯配產生之另外輔助作用。疫苗組合物中細胞株組合之各種實施例表現HLA-A超型及HLA-B超型。本文中實例22中提供非限制性實例。細胞株修飾
在某些實施例中，疫苗組合物包含經修飾之細胞。經修飾之細胞株可在純系上來源於單個經修飾之細胞，亦即基因同質，或來源於基因異質群體。
細胞株可經修飾以表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現，抑制或減少一或多種免疫抑制因子之表現，及/或表現一或多種TAA或增加其表現，包括視情況如本文所述的經突變以呈遞新抗原決定基之TAA(例如經設計或增強之具有NSM之抗原)。另外，細胞株可經修飾以表現可間接調節路徑，諸如表現或抑制微型RNA之因子或增加其表現。此外，細胞株可經修飾以分泌非內源性或改變之外來體。
除修飾細胞株以表現TAA或免疫刺激因子之外，本揭示案亦涵蓋將一或多種TAA(例如經分離之TAA或經純化及/或重組TAA)或免疫刺激因子(例如以重組方式產生之治療蛋白)與本文所述之疫苗共投與。
因此，在各種實施例中，本揭示案提供一種疫苗之單位劑量，該疫苗包含(i)第一組合物，該第一組合物包含治療有效量之至少1種、2種、3種、4種、5種或6種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種、10種、15種、20種、25種、30種、35種或40種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中該組合物能夠引發特異性針對至少5種、10種、15種、20種、25種、30種、35種或40種TAA之免疫反應，及(ii)第二組合物，該第二組合物包含一或多種經分離之TAA。在其他實施例中，第一組合物所包含之細胞株經進一步修飾以(a)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及/或(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。 免疫刺激因子
免疫刺激蛋白為膜結合、分泌或兩者之蛋白質，其增強及/或增加效應T細胞反應及/或體液免疫反應之效力。不受任何理論束縛，免疫刺激因子可增強抗腫瘤免疫性且增加癌症疫苗免疫原性。存在增強免疫反應之許多因子。舉例而言，此等因子可影響抗原呈遞機制或T細胞機制。此等因子之基因的插入可藉由使疫苗對抗腫瘤反應更加免疫刺激而增強對疫苗組合物之反應。
不受任何理論或機制束縛，在疫苗微環境(VME)中包括在疫苗中之細胞株之組合對免疫刺激因子之表現可調節適應性免疫反應之多個方面。細胞株對諸如GM-CSF及IL-15之分泌之細胞介素的表現可誘導單核球分化，募集至疫苗遞送部位之發炎性環境、募集至樹突狀細胞(DC)，藉此富集抗原呈遞細胞池彙集在VME中。某些細胞介素之表現亦可使已存在之DC及朗格罕氏細胞(Langerhans cell，LC)成熟及活化。某些細胞介素之表現可促進DC及LC引發T細胞朝向效應表型。在VME中遇到表現IL-12之疫苗細胞的DC應激活引流淋巴結中之效應T細胞且發動更有效之抗腫瘤反應。除增強DC成熟之外，某些免疫刺激因子與DC上之其受體的嚙合可促進具有效應表型之T細胞激活，同時抑制T調控細胞(Treg)之激活。某些免疫刺激因子與DC上之其受體的接合可促進DC之遷移及T細胞介導之後天性免疫。
在本文所提供之疫苗組合物之一些實施例中，不針對某些細胞株，或在其他實施例中，不針對疫苗組合物中存在之所有細胞株進行表現免疫刺激因子之修飾。
本文提供疫苗組合物之實施例，該疫苗組合物包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株(例如GBM細胞株)之細胞，其中該細胞株經修飾以增加至少一種(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)免疫刺激因子之產生。在一些實施例中，免疫刺激因子係選自表4中呈現之彼等免疫刺激因子。亦提供示例性NCBI基因ID，熟練技術人員可利用其確定有待引入本揭示案之疫苗組合物中的序列。此等NCBI基因ID僅為示例性的。表 4. 示例性免疫刺激因子
因子 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
CCL5 CCL5(6352)
XCL1 XCL1(6375)
可溶性CD40L(CD154) CD40LG(959)
膜結合之CD40L CD40LG(959)
CD36 CD36(948)
GITR TNFRSF18(8784)
GM-CSF CSF2(1437)
OX-40 TNFRSF4(7293)
OX-40L TNFSF4(7292)
CD137(41BB) TNFRSF9(13604)
CD80(B7-1) CD80(941)
IFNγ IFNG(3458)
IL-1β IL1B(3553)
IL-2 IL2(3558)
IL-6 IL6(3569)
IL-7 IL7(3574)
IL-9 IL9(3578)
IL-12 IL12A(3592)IL12B(3593)
IL-15 IL15(3600)
IL-18 IL-18(3606)
IL-21 IL21(59067)
IL-23 IL23A(51561)IL12B(3593)
TNFα TNF(7124)
在一些實施例中，疫苗組合物之細胞株可經修飾(例如經基因修飾)以表現、過度表現一或多種選自表4之免疫刺激因子或增加其表現。在某些實施例中，免疫刺激序列可為原生人類序列。在一些實施例中，免疫刺激序列可為經基因工程改造之序列。經基因工程改造之序列可經由密碼子優化進行修飾以增加蛋白質之表現，或改變蛋白質之細胞定位(例如經由蛋白酶裂解位點之突變)。
舉例而言，本文所述之疫苗組合物中之任一者中的至少一種癌細胞株(亦即，1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)可經基因修飾以表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現。由組合物內之細胞表現的免疫刺激因子可均相同，可均不同，或其任何組合。
在一些實施例中，疫苗組合物包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株之細胞，其中該至少一種細胞株經修飾以表現表4之免疫刺激因子中之1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種。在一些實施例中，組合物包含治療有效量之來自2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種癌細胞株之細胞。在一些實施例中，至少一種細胞株經修飾以增加表5之至少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子的產生。在一些實施例中，組合物包含治療有效量之來自2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種癌細胞株之細胞，且各細胞株經修飾以增加表4之至少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子的產生。
在一些實施例中，組合物包含治療有效量之來自3種癌細胞株之細胞，其中細胞株中之1種、2種或所有3種經修飾以表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12或增加其表現。
例如在細胞株經修飾以表現超過一種免疫刺激因子或增加其表現之情況下修飾之示例性組合包括(但不限於)：在其他可能組合當中，GM-CSF + IL-12；CD40L + IL-12；GM-CSF + CD40L；GM-CSF + IL-12 + CD40L；GM-CSF + IL-15；CD40L +IL-15；GM-CSF + CD40L；及GM-CSF + IL-15 + CD40L。
在某些情況下，腫瘤細胞表現包括IL-12A(IL-12之p35組分)、GM-CSF(腎細胞株)及CD40L(白血病細胞株)之免疫刺激因子。因此，在一些實施例中，細胞株亦可經修飾以增加一或多種免疫刺激因子之表現。
在一些實施例中，相對於尚未經修飾以表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現之相同細胞株或細胞株組合，如本文所述經修飾以表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現之細胞株組合或細胞株將表現免疫刺激因子至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
增加本文所述之疫苗組合物中之免疫刺激因子的方法包括(但不限於)藉助於病毒載體或DNA質體引入有待表現之核苷酸序列。免疫刺激因子之表現或表現增加可為穩定表現或短暫表現。
在一些實施例中，本文所述之疫苗組合物中之任一者中的癌細胞經基因修飾以表現CD40配位體(CD40L)。在一些實施例中，CD40L係膜結合的。在一些實施例中，CD40L非膜結合的。除非另外說明，否則如本文所用，CD40L係指膜結合之CD40L。在一些實施例中，本文所述之疫苗組合物中之任一者中的癌細胞經基因修飾以表現GM-CSF、膜結合之CD40L、GITR、IL-12及/或IL-15。表5中呈現用於表現本文提供之免疫刺激因子中之一或多者的示例性胺基酸及核苷酸序列。表 5. 示例性免疫刺激因子之序列
因子 序列
CD154(CD40L) ( 膜結合) atgatcgaaacatacaaccaaacttctccccgatctgcggccactggactgcccatcagcatgaaaatttttatgtatttacttactgtttttcttatcacccagatgattgggtcagcactttttgctgtgtatcttcatagaaggttggacaagatagaagatgaaaggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaaacgatacagagatgcaacacaggagaaagatccttatccttactgaactgtgaggagattaaaagccagtttgaaggctttgtgaaggatataatgttaaacaaagaggagacgaagaaagaaaacagctttgaaatgcctcgtggtgaagaggatagtcaaattgcggcacatgtcataagtgaggccagcagtaaaacaacatctgtgttacagtgggctgaaaaaggatactacaccatgagcaacaacttggtaaccctggaaaatgggaaacagctgaccgttaaaagacaaggactctattatatctatgcccaagtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccatttatagccagcctctgcctaaagtcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgcaaatacccacagttccgccaaaccttgcgggcaacaatccattcacttgggaggagtatttgaattgcaaccaggtgcttcggtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtgagccatggcactggcttcacgtcctttggcttactcaaactctga(SEQ ID NO: 1)
CD154(CD40L) ( 膜結合) ( 密碼子優化) Atgatcgaaacctacaaccagacctcaccacgaagtgccgccaccggactgcctattagtatgaaaatctttatgtacctgctgacagtgttcctgatcacccagatgatcggctccgccctgtttgccgtgtacctgcaccggagactggacaagatcgaggatgagcggaacctgcacgaggacttcgtgtttatgaagaccatccagcggtgcaacacaggcgagagaagcctgtccctgctgaattgtgaggagatcaagagccagttcgagggctttgtgaaggacatcatgctgaacaaggaggagacaaagaaggagaacagcttcgagatgcccagaggcgaggaggattcccagatcgccgcccacgtgatctctgaggccagctccaagaccacaagcgtgctgcagtgggccgagaagggctactataccatgtctaacaatctggtgacactggagaacggcaagcagctgaccgtgaagaggcagggcctgtactatatctatgcccaggtgacattctgcagcaatcgcgaggcctctagccaggccccctttatcgccagcctgtgcctgaagagccctggcaggttcgagcgcatcctgctgagagccgccaacacccactcctctgccaagccatgcggacagcagtcaatccacctgggaggcgtgttcgagctgcagccaggagcaagcgtgttcgtgaatgtgactgacccatcacaggtgtctcacggcactggattcacatcatttggactgctgaaactgtga(SEQ ID NO: 2)
CD154(CD40L) ( 膜結合) MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMPRGEEDSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(SEQ ID NO: 3)
GITR Atggctcagcatggggctatgggggccttcagggctctgtgcggactggctctgctgtgcgctctgtcactggggcagagaccaacaggaggaccaggatgcggacctggcaggctgctgctgggcaccggcacagacgcaaggtgctgtagagtgcacaccacaaggtgctgtcgcgactaccctggcgaggagtgctgttctgagtgggattgcatgtgcgtgcagccagagtttcactgtggcgatccctgctgtaccacatgccgccaccacccatgtccacctggacagggagtgcagtctcagggcaagttcagctttggcttccagtgcatcgactgtgcaagcggcaccttttccggaggacacgagggacactgcaagccctggaccgattgtacacagtttggcttcctgaccgtgttccctggcaacaagacacacaatgccgtgtgcgtgcctggctccccaccagcagagcccctgggctggctgaccgtggtgctgctggccgtggcagcatgcgtgctgctgctgacaagcgcccagctgggactgcacatctggcagctgcggtcccagtgtatgtggccaagagagacccagctgctgctggaggtgcctccatccacagaggacgcccggtcttgccagttccccgaagaggagaggggggaaagaagtgccgaagaaaagggaaggctgggagacctgtgggtg(SEQ ID NO: 4)
GITR MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV(SEQ ID NO: 5)
GM-CSF atgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatctctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagtga(SEQ ID NO: 6)
GM-CSF (密碼子優化) atgtggctgcagtctctgctgctgctgggcaccgtcgcctgttctatttccgcacccgctcgctccccttctccctcaactcagccttgggagcacgtgaacgccatccaggaggcccggagactgctgaatctgtcccgggacaccgccgccgagatgaacgagacagtggaagtgatctctgagatgttcgatctgcaggagcccacctgcctgcagacaaggctggagctgtacaagcagggcctgcgcggctctctgaccaagctgaagggcccactgacaatgatggccagccactataagcagcactgcccccctacccccgagacaagctgtgccacccagatcatcacattcgagtcctttaaggagaacctgaaggactttctgctggtcattccatttgattgttgggagcccgtgcaggagtga(SEQ ID NO: 7)
GM-CSF MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO: 8)
IL-12 atgtgccatcagcaactggttatatcttggttcagtctcgtctttctcgcgtcacccttggtcgctatctgggagcttaaaaaagatgtctacgtcgttgaacttgattggtaccctgatgctccgggggaaatggtggttttgacttgcgatacgccagaagaggatggcataacgtggacactggaccagtcttcagaggttctcgggtctggtaagacactcactatacaggtgaaggagtttggtgacgcaggacaatatacttgccataaaggcggcgaggtgctctcccatagccttctgctccttcataaaaaagaggacgggatatggtcaactgacattctgaaggatcagaaagaaccgaagaacaaaactttcctcagatgcgaggcaaagaactattcaggccgctttacttgctggtggctcactaccatcagcactgacctcactttcagcgtcaagagcagtagaggctcaagtgacccacaaggggttacatgcggggccgctacgttgtctgccgagcgagtcaggggagataataaggaatatgagtatagcgttgaatgccaagaagattcagcctgcccagccgcagaagagagtcttcccatagaagttatggtggacgcagttcataaactgaagtatgagaactatacatcttccttctttattcgcgatatcataaagcctgatcctccgaaaaacttgcaactcaagccgttgaagaatagccgacaggtcgaggtctcttgggagtatccagatacgtggtctaccccgcactcctatttcagtctcaccttctgtgtgcaggtgcaggggaaaagtaagcgggaaaaaaaggaccgggtatttactgataagacctccgctacagtgatttgtagaaagaacgcctctatcagcgtgagagcccaggatagatattattctagtagttggtctgagtgggcctccgtcccttgttccggaagcggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcctatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggcccgaaacctgccggtcgctacacccgatcctggaatgtttccctgccttcatcacagccagaatctgctgagggcagtcagtaacatgctgcagaaggcgcggcaaactctggagttctatccatgtacctccgaggaaattgatcacgaggacattactaaggataaaacaagtacagtagaagcctgtttgcctcttgagctcactaaaaatgagtcatgcttgaacagtcgagagacgagttttatcactaacggttcatgcttggcgtccaggaagacaagctttatgatggcgctctgcctgtcttctatatatgaagaccttaaaatgtaccaagttgagtttaagaccatgaacgccaaacttttgatggaccccaagaggcagatcttccttgatcagaatatgttggcggtgatcgatgaacttatgcaagctttgaacttcaacagtgagacagtgcctcagaaaagttccttggaggaaccggacttctataagaccaagatcaaactgtgcattttgctgcatgcatttagaattcgagccgttacaatcgaccgggtgatgtcatatttgaatgcatcataa(SEQ ID NO: 9)
IL-12 MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO: 10)
IL-15 Atgtataggatgcagctgctgtcatgtatcgcactgtccctggcactggtgactaactctaactgggtgaatgtgatctccgacctgaagaagatcgaggacctgatccagtctatgcacatcgatgccaccctgtacacagagtccgacgtgcacccctcttgcaaggtgaccgccatgaagtgtttcctgctggagctgcaggtcatcagcctggagagcggcgacgcatccatccacgataccgtggagaacctgatcatcctggccaacaatagcctgagctccaacggcaatgtgacagagtccggctgcaaggagtgtgaggagctggaggagaagaatatcaaagagttcctgcagtcattcgtccatatcgtccagatgtttatcaataccagt(SEQ ID NO: 11)
IL-15 MYRMQLLSCIALSLALVTNSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO: 12)
IL-23 atgtgccatcagcagctggtcattagttggtttagcctggtctttctggcctcacccctggtcgcaatctgggaactgaagaaggacgtgtacgtggtggagctggactggtatccagatgcaccaggagagatggtggtgctgacctgcgacacacctgaggaggatggcatcacctggacactggatcagagctccgaggtgctgggcagcggcaagaccctgacaatccaggtgaaggagttcggcgacgccggccagtacacatgtcacaagggcggcgaggtgctgtcccactctctgctgctgctgcacaagaaggaggacggcatctggtccacagacatcctgaaggatcagaaggagccaaagaacaagaccttcctgcggtgcgaggccaagaattatagcggccggttcacctgttggtggctgaccacaatctccaccgatctgacattttctgtgaagtctagcaggggctcctctgacccccagggagtgacatgcggagcagccaccctgagcgccgagcgggtgagaggcgataacaaggagtacgagtattctgtggagtgccaggaggacagcgcctgtccagcagcagaggagtccctgcctatcgaagtgatggtggatgccgtgcacaagctgaagtacgagaattatacaagctccttctttatcagggacatcatcaagccagatccccctaagaacctgcagctgaagcccctgaagaatagccgccaggtggaggtgtcctgggagtaccctgacacctggtccacaccacactcttatttcagcctgaccttttgcgtgcaggtgcagggcaagagcaagagggagaagaaggaccgcgtgttcaccgataagacatccgccaccgtgatctgtcggaagaacgccagcatctccgtgagggcccaggatcgctactattctagctcctggagcgagtgggcctccgtgccatgctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggaggcggcggctctggcggcggcggctccctgggctctcgggccgtgatgctgctgctgctgctgccctggaccgcacagggaagagccgtgccaggaggctctagcccagcatggacacagtgccagcagctgtcccagaagctgtgcaccctggcatggtctgcccaccctctggtgggccacatggacctgagagaggagggcgatgaggagaccacaaacgacgtgcctcacatccagtgcggcgacggctgtgatccacagggcctgagggacaattctcagttctgtctgcagcgcatccaccagggcctgatcttctacgagaagctgctgggcagcgatatctttacaggagagcccagcctgctgcctgactccccagtgggacagctgcacgcctctctgctgggcctgagccagctgctgcagccagagggacaccactgggagacccagcagatcccttctctgagcccatcccagccttggcagcggctgctgctgcggttcaagatcctgagaagcctgcaggcattcgtcgcagtcgcagccagggtgttcgcccacggagccgctactctgagccca(SEQ ID NO: 13)
IL-23 MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP(SEQ ID NO: 14)
XCL1 atgaggctgctgattctggcactgctgggcatctgctctctgaccgcttacatcgtggaaggagtcggctctgaagtctctgacaagcgcacatgcgtgtctctgaccacacagcgcctgcccgtgagccggatcaagacctacacaatcaccgagggcagcctgagagccgtgatcttcatcacaaagaggggcctgaaggtgtgcgccgaccctcaggcaacctgggtgcgggacgtggtgagaagcatggataggaagtccaacacccggaacaatatgatccagacaaaacccacaggaacccagcagagcactaatacagccgtgacactgaccggg(SEQ ID NO: 15)
XCL1 MRLLILALLGICSLTAYIVEGVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG(SEQ ID NO: 16)
本文提供一種GITR蛋白，其包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列或其編碼核酸序列，例如SEQ ID NO: 5。本文提供一種疫苗組合物，其包含一或多種表現該蛋白質之細胞株。
本文提供一種GM-CSF蛋白，其包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或其編碼核酸序列，例如SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7。本文提供一種疫苗組合物，其包含一或多種表現該蛋白質之細胞株。
本文提供一種IL-12蛋白，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列或其編碼核酸序列，例如SEQ ID NO: 9。本文提供一種疫苗組合物，其包含一或多種表現該蛋白質之細胞株。
本文提供一種IL-15蛋白，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或其編碼核酸序列，例如SEQ ID NO: 11。本文提供一種疫苗組合物，其包含一或多種表現該蛋白質之細胞株。
本文提供一種IL-23蛋白，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或其編碼核酸序列，例如SEQ ID NO: 13。本文提供一種疫苗組合物，其包含一或多種表現該蛋白質之細胞株。
本文提供一種XCL1蛋白，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列或其編碼核酸序列，例如SEQ ID NO: 15。本文提供一種疫苗組合物，其包含一或多種表現該蛋白質之細胞株。
在一些實施例中，本文所述之疫苗組合物中之任一者中的癌細胞經基因修飾以表現以下中之一或多者：CD28、B7-H2(ICOS LG)、CD70、CX3CL1、CXCL10(IP10)、CXCL9、LFA-1(ITGB2)、SELP、ICAM-1、ICOS、CD40、CD27(TNFRSF7)、TNFRSF14(HVEM)、BTN3A1、BTN3A2、ENTPD1、GZMA及PERF1。
在一些實施例中，載體含有編碼免疫刺激分子之多核苷酸序列。示例性免疫刺激分子可包括多種細胞介素中之任一者。如本文所用，術語「細胞介素」係指由一個細胞群體釋放之以細胞間介體形式作用於一或多個其他細胞上的蛋白質。此類細胞介素之實例為淋巴因子、單核因子及傳統多肽激素。細胞介素包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛類生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如濾泡刺激激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；苗勒氏管抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II；紅血球生成素(EPO)；骨性誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；顆粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；以及顆粒細胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1至IL-36，包括IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；以及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體(KL)。考慮用於本文中之其他免疫調節分子包括IRF3、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配位體(CD40L)、藥物誘導性CD40(iCD40)及其類似物。
在某些實施例中，編碼免疫刺激因子之多核苷酸處於一或多種引導編碼序列之表現之調控元件的控制下。在各種實施例中，在一種表現載體上編碼超過一種(亦即，2種、3種或4種)免疫刺激因子。在一些實施例中，在單獨表現載體上編碼超過一種(亦即，2種、3種、4種、5種或6種)免疫刺激因子。在各種實施例中，藉由使用LipoD293TM活體外DNA轉染劑(SignaGen實驗室)將293T細胞與慢病毒轉移載體及包裝質體(OriGene)短暫共轉染，產生含有所關注基因(例如GM-CSF、CD40L或IL-12及如本文所述之其他免疫刺激分子)之慢病毒。
對於慢病毒感染，在一些實施例中，在感染當天將細胞株以1-10×105 個細胞/孔之密度接種於孔盤(例如6孔、12孔)中以實現50%-80%細胞匯合。在接種之後18-24小時，將細胞在10 µg/mL凝聚胺存在下用慢病毒感染。在慢病毒感染之後18-24小時，將細胞分離且轉移至較大容器。在24-120小時之後，移除培養基且經補充有抗生素之新鮮培養基置換。 免疫抑制因子
免疫抑制因子係膜結合、分泌或兩者且能夠導致缺陷及減少細胞反應之蛋白質。已在腫瘤微環境(TME)之背景下表徵多種免疫抑制因子。另外，某些免疫抑制因子可負面調控LC及DC自真皮遷移至引流淋巴結。
TGFβ1為對周邊中以及TME中多種免疫細胞子集發揮其作用之抑制性細胞介素。在VME中，TGFβ1負面調控LC及DC自真皮遷移至引流淋巴結。類似地，TGFβ2由大部分腫瘤細胞分泌且發揮類似於TGFβ1之免疫抑制作用。減少VME中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之疫苗細胞株的修飾確保疫苗不促進TGFβ介導之對LC或DC遷移之抑制。
在TME內，藉由預防巨噬細胞吞噬及腫瘤清除，增加呈腫瘤逃逸模式之腫瘤細胞上之CD47表現。DC亦表現SIRPα，且DC上SIRPα之接合可抑制DC存活及活化。疫苗中可能在TME及VME中起作用之另外免疫抑制因子包括CD276(B7-H3)及CTLA4。DC與TME中之表現CD276或CTLA4之腫瘤細胞接觸抑制DC刺激能力，從而減少T細胞激活、增殖及/或促進T細胞增殖。疫苗細胞株上CTLA4及/或CD276之表現可賦予對VME中之DC或LC的類似抑制作用。
在疫苗組合物之某些實施例中，在其中所含之細胞株之細胞中一或多種免疫抑制因子之產生可受到抑制或減少。在一些實施例中，在疫苗組合物中所含之細胞株之細胞中一或多種免疫抑制因子之產生(亦即，表現)受到抑制(亦即剔除或完全消除)。在一些實施例中，細胞株可經基因修飾以減少(亦即，降低)或抑制免疫抑制因子之表現。在一些實施例中，自細胞完全切除免疫抑制因子。在一些實施例中，細胞株中之一或多者經修飾，以便以減少或降低至少5%、10%、15%、20%、25%或30%(亦即，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之程度產生一或多種免疫抑制因子(亦即，表現)。在一些實施例中，一或多種免疫抑制因子係選自表6中呈現之群。
同時，可增加如本文所述之疫苗組合物中一或多種免疫刺激因子、TAA及/或新抗原之產生。在疫苗組合物之一些實施例中，除部分降低或完全(例如切除及/或以無法偵測到之水準表現)抑制細胞對一或多種免疫抑制因子之表現外，組合物內之細胞類型中的一或多種(亦即，1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)亦可經基因修飾以例如藉由確保某些免疫刺激因子及/或TAA之表現而增加疫苗之免疫原性。
此等作用、修飾及/或因子之任何組合可用於產生本文所述之疫苗組合物。藉助於非限制性實例，降低或減少免疫抑制因子之表現至少5%、10%、15%、20%、25%或30%與增加免疫刺激因子之表現比未經修飾之細胞株高至少2倍的組合可有效提高腫瘤細胞疫苗之抗腫瘤反應。藉助於另一非限制性實例，減少免疫抑制因子至少5%、10%、15%、20%、25%或30%與修飾細胞以在疫苗組合物中表現某些TAA的組合可有效提高腫瘤細胞疫苗之抗腫瘤反應。
在一些實施例中，癌症疫苗包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少細胞株之至少一種免疫抑制因子之產生，且其中該至少一種免疫抑制因子為CD47或CD276。在一些實施例中，CTLA4、HLA-E、HLA-G、TGFβ1及/或TGFβ2之表現亦減少。在一些實施例中，疫苗組合物中之一或多種或所有細胞株經修飾以抑制或減少CD276、TGFβ1及TGFβ2之表現。在另一實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含三種細胞株，各細胞株經修飾以抑制(例如剔除)CD276之表現，且減少(例如減弱)TGFβ1及TGFβ2之表現。
在一些實施例中，癌症疫苗組合物包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少至少CD47之表現。在一些實施例中，自細胞切除CD47或以減少至少5%、10%、15%、20%、25%或30%(亦即至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之水準產生。在一些實施例中，自細胞切除CD47或以減少至少90%之含量產生。一或多種細胞株中另外免疫抑制因子之產生可減少。在一些實施例中，CD276、CTLA4、HLA-E、HLA-G、TGFβ1及/或TGFβ2之表現亦減少或受到抑制。此等疫苗組合物中之一或多種細胞株中一或多種免疫刺激因子、TAA或新抗原之產生可增加。
在一些實施例中，本文提供一種癌症疫苗組合物，其包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少至少CD276之產生。在一些實施例中，自細胞切除CD276或以減少至少5%、10%、15%、20%、25%或30%(亦即至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之水準產生。在一些實施例中，自細胞切除CD276或以減少至少90%之水準產生。一或多種細胞株中另外免疫抑制因子之產生可減少。在一些實施例中，CD47、CTLA4、HLA-E、HLA-G、TGFβ1及/或TGFβ2之表現亦減少或受到抑制。此等疫苗組合物中之一或多種細胞株中一或多種免疫刺激因子、TAA或新抗原之產生可增加。
在一些實施例中，本文提供一種癌症疫苗組合物，其包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少至少HLA-G之產生。在一些實施例中，自細胞切除HLA-G或以減少至少5%、10%、15%、20%、25%或30%(亦即至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之水準產生。在一些實施例中，自細胞切除HLA-G或以減少至少90%之水準產生。一或多種細胞株中另外免疫抑制因子之產生可減少。在一些實施例中，CD47、CD276、CTLA4、HLA-E、TGFβ1及/或TGFβ2之表現亦減少或受到抑制。此等疫苗組合物中之一或多種細胞株中一或多種免疫刺激因子、TAA或新抗原之產生可增加。
在一些實施例中，本文提供一種癌症疫苗組合物，其包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少至少CTLA4之產生。在一些實施例中，自細胞切除CTLA4或以減少至少5%、10%、15%、20%、25%或30%(亦即至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之水準產生。在一些實施例中，自細胞切除CTLA4或以減少至少90%之水準產生。一或多種細胞株中另外免疫抑制因子之產生可減少。在一些實施例中，CD47、CD276、HLA-E、TGFβ1及/或TGFβ2之表現亦減少或受到抑制。此等疫苗組合物中之一或多種細胞株中一或多種免疫刺激因子、TAA或新抗原之產生可增加。
在一些實施例中，本文提供一種癌症疫苗組合物，其包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少至少HLA-E之產生。在一些實施例中，自細胞切除HLA-E或以減少至少5%、10%、15%、20%、25%或30%(亦即至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之水準產生。在一些實施例中，自細胞切除HLA-E或以減少至少90%之水準產生。一或多種細胞株中另外免疫抑制因子之產生可減少。在一些實施例中，CD47、CD276、CTLA4、TGFβ1及/或TGFβ2之表現亦減少或受到抑制。此等疫苗組合物中之一或多種細胞株中一或多種免疫刺激因子、TAA或新抗原之產生可增加。
在一些實施例中，本文提供一種癌症疫苗組合物，其包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1與TGFβ2之產生。在一些實施例中，自細胞切除TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1與TGFβ2或以減少至少5%、10%、15%、20%、25%或30%(亦即至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之水準產生。在疫苗組合物之一些實施例中，自細胞切除TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1與TGFβ2或以減少至少90%之水準產生。
在一些實施例中，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1與TGFβ2之表現經由使用慢病毒載體遞送至細胞之短髮夾RNA(shRNA)來減少。另外免疫抑制因子之產生可減少。在一些實施例中，在TGFβ1、TGFβ2、或TGFβ1與TGFβ2表現減少之一或多種細胞株中CD47、CD276、CTLA4、HLA-E及/或HLA-G之表現亦減少。此等疫苗組合物之實施例中之一或多種細胞株中一或多種免疫刺激因子、TAA或新抗原之產生亦可增加。
在一些實施例中，選擇用於減弱或剔除之免疫抑制因子可由多種天然序列變異體編碼。因此，可使用所屬領域之技術人員已知之多種基因編輯/減弱方法實現免疫抑制因子之降低或抑制。如本文所述，在一些實施例中，一或多種免疫抑制因子之完全剔除可能不如減弱理想。舉例而言，TGFβ1有助於調控上皮-間質轉化，因此，完全缺乏TGFβ1(例如經由剔除)可誘導腫瘤細胞中較小免疫原性表型。
表6提供可併入或如本文所述進行修飾或兩者之組合的示例性免疫抑制因子。亦提供熟練技術人員可用於測定靶向進行減弱策略之序列的示例性NCBI基因ID。此等NCBI基因ID僅為示例性的。表 6 ：示例性免疫抑制因子
因子 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
B7-H3(CD276) CD276(80381)
BST2(CD317) BST2(684)
CD200 CD200(4345)
CD39(ENTPD1) ENTPD1(953)
CD47 CD47(961)
CD73(NT5E) NT5E(4907)
COX-2 PTGS2(5743)
CTLA4 CTLA4(1493)
HLA-E HLA-E(3133)
HLA-G HLA-G(3135)
IDO(吲哚胺2,3-二加氧酶) IDO1(3620)
IL-10 IL10(3586)
PD-L1(CD274) CD274(29126)
TGFβ1 TGFB1(7040)
TGFβ2 TGFB2(7042)
TGFβ3 TGFB3(7043)
VISTA(VSIR) VSIR(64115)
M-CSF CSF1(1435)
B7S1(B7H4) VTCN1(79679)
PTPN2 PTPN2(5771)
在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD47 + TGFβ1、CD47 + TGFβ2或CD47 + TGFβ1 + TGFβ2。在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD276 + TGFβ1、CD276 + TGFβ2或CD276 + TGFβ1 + TGFβ2。在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD47 + TGFB1 + CD276、CD47 + TGFβ2 + CD276或CD47 + TGFβ1 + TGFβ2 + CD276。在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD47 + TGFβ1+B7-H3、CD47 + TGFβ2 + CD276或CD47 + TGFβ1 + TGFβ2 + CD276。在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD47 + TGFβ1+ CD276 + BST2、CD47 + TGFβ2 + CD276 + BST2或CD47 + TGFβ1 + TGFβ2 + CD276 + BST2。在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD47 + TGFβ1 + CD276+ CTLA4、CD47 + TGFβ2 + CD276 + CTLA4或CD47 + TGFβ1 + TGFβ2 + CD276 + CTLA4。在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD47 + TGFβ1 + CD276 + CTLA4、CD47 + TGFβ2 + CD276+ CTLA4或CD47 + TGFβ1 + TGFβ2 + CD276 + CTLA4。
在示例性實施例中，疫苗組合物中免疫抑制因子之以下組合之產生減少或受到抑制：CD47 + TGFβ1 + CD276 + CTLA4、CD47 + TGFβ2 + CD276 + CTLA4或CD47 + TGFβ1 + TGFβ2 + CD276+ CTLA4、CD47 + TGFβ2或TGFβ1 + CTLA4或CD47+ TGFβ1 + TGFβ2 + CD276+ HLA-E或CD47+ TGFβ1 + TGFβ2 + CD276 + HLA-G或CD47+ TGFβ1 + TGFβ2 + CD276+HLA-G +CTLA-4或CD47+ TGFβ1 + TGFβ2 + CD276 + HLA-E + CTLA-4。
所屬領域之技術人員將認識到在本文所述之疫苗組合物之實施例中，組合物內至少一種(亦即，1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)細胞株具有至少一種免疫抑制因子(例如表6中列出之因子中之一或多者)之減弱或剔除。組合物內之細胞株可具有相同免疫抑制因子，或各細胞株不同之免疫抑制因子或其某一組合的減弱或剔除。
視情況，組合物內之1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種細胞株可進一步經基因修飾以具有一或多種另外免疫抑制因子(例如表6中列出之因子中之一或多者)的減弱或剔除。舉例而言，組合物內之1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種細胞株可進一步經基因修飾以具有相同另外免疫抑制因子，或各細胞株不同之另外免疫抑制因子或其某一組合的減弱或剔除。
在一些實施例中，本文提供一種癌症疫苗組合物，其包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，其中該細胞株經修飾以減少SLAMF7、BTLA、EDNRB、TIGIT、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、TIM3(HAVCR2)、LAG3、ADORA2A及ARG1之產生。
本文所述之任一疫苗組合物內的細胞中之至少一者可進行一或多種(亦即，1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)基因修飾以實現本文所述之免疫抑制因子之部分或完全減弱及/或本文所述之免疫刺激因子、TAA及/或新抗原之表現(或增加其表現)。在一些實施例中，疫苗組合物中之至少一種細胞株進行少於5種(亦即，少於4種、少於3種、少於2種、1種或0種)基因修飾。在一些實施例中，疫苗組合物中之至少一種細胞進行不少於5種基因修飾。
所屬領域之一般技術人員已知且可獲得減少或抑制一或多種免疫抑制因子之表現的大量方法，其實施例在本文中描述。
根據一些實施例癌細胞株經修飾以抑制或減少免疫抑制因子之產生。本文提供用於選擇有待用以抑制免疫抑制因子產生及/或減少免疫抑制因子產生之適當技術的方法及技術。可使用所屬領域中已知之技術實現免疫抑制因子之表現水準的部分抑制或降低。
在一些實施例中，癌症株之細胞在活體外使用重組DNA技術進行基因工程改造以引入基因構築體至細胞中。此等DNA技術包括(但不限於)轉導(例如使用病毒載體)或轉染程序(例如使用質體、黏質體、酵母人造染色體(YAC)、電穿孔、脂質體)。可採用所屬領域中已知的部分(例如減少表現水準至少5%、10%、15%、20%、25%或30%)或完全抑制細胞產生任何免疫抑制因子之任何合適之方法。
在一些實施例中，基因體編輯用於抑制或減少疫苗中之細胞的免疫抑制因子產生。基因體編輯技術之非限制性實例包括大範圍核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應物核酸酶(TALEN)及CRISPR-Cas系統。在某些實施例中，減少基因表現及隨後具生物活性之蛋白質表現可藉由經由非同源末端連接(NHEJ)插入/缺失核苷酸，或經由同源定向修復(HDR)插入引起過早終止密碼子之適當供體卡匣及表現非功能性蛋白質，或藉由插入核苷酸來實現。
在一些實施例中，使用可包括或可不包括Cre-Lox及FLP-FRT重組系統之自發性位點特異性同源重組技術。在一些實施例中，應用在較高頻率但位點/基因特異性極小下將適當供體卡匣整合至基因體DNA中之轉座子的方法與所需要之選擇及鑑別技術組合使用。非限制性實例為piggyBac及Sleeping Beauty轉座子系統，該等系統分別使用TTAA及TA核苷酸序列進行整合。
此外，可使用由大範圍核酸酶及轉座子組成之基因編輯方法的組合方法。
在某些實施例中，用於抑制或減少免疫抑制因子表現之技術可包括使用反義或核糖核酸酶方法減少或抑制免疫抑制因子之mRNA轉錄物之轉譯；使用三螺旋方法抑制免疫抑制因子之基因之轉譯；或有目標性之同源重組。
反義方法涉及與免疫抑制因子之mRNA互補之寡核苷酸(DNA或RNA)的設計。反義寡核苷酸結合於免疫抑制因子之互補mRNA轉錄物且防止轉譯。絕對互補可為較佳，但不是必需的。如本文中所提及，與RNA一部分「互補」之序列意謂序列足夠互補以能夠與RNA雜交，形成穩定雙螺旋體。在雙股反義核酸之情況下，可測試雙螺旋體DNA之單股，或可分析三螺旋體之形成。雜交能力視互補程度及反義核酸之長度兩者而定。在一些實施例中，與免疫抑制因子之5'或3'非轉譯非編碼區互補的寡核苷酸可用於反義方法中以抑制免疫抑制因子之內源性mRNA之轉譯。在一些實施例中，在短髮夾RNA內使用反義寡核苷酸序列，實現免疫抑制因子之抑制或減少。
在一些實施例中，使用慢病毒介導之shRNA干擾使表現免疫抑制因子之基因沉默。(參見Wei等人，免疫療法雜誌(J. Immunother.)2012 35(3)267-275(2012)，以引用的方式併入本文中。)
微RNA(miRNA)為穩定表現之RNAi髮夾，亦可用於減弱基因表現。在一些實施例中，經設計以催化裂解mRNA轉錄物之核糖核酸酶分子用於防止免疫抑制因子mRNA之轉譯及表現。在某些實施例中，使mRNA在位點特異性識別序列處裂解之核糖核酸酶可用於破壞mRNA。在一些實施例中，使用錘頭狀核糖核酸酶，其使mRNA在由與目標mRNA形成互補鹼基對之側接區域指定的位置處裂解。亦可使用RNA核糖核酸內切酶。
在一些實施例中，例如藉由使用有目標性之同源重組，使基因或其啟動子失活或「剔除」，可減少免疫抑制因子之內源性基因表現。在一些實施例中，藉由靶向與免疫抑制因子之啟動子及/或強化子基因之調控區互補的去氧核糖核苷酸序列，形成防止免疫抑制因子基因在目標細胞中轉譯之三螺旋結構來減少內源性基因表現。在一些實施例中，藉由核酸酶死亡Cas9型式(dCas9)及其與無法使目標DNA裂解之KRAB、VP64及p65之融合物來抑制啟動子活性。dCas9分子保留基於目標序列結合於目標DNA之能力。dCas9靶向至轉錄起始位點藉由阻斷轉譯開始而足以減少或減弱轉譯。
在一些實施例中，使用「顯性陰性」方法減少免疫抑制因子之活性，其中編碼缺陷免疫抑制因子之基因構築體用於減少對相鄰細胞之免疫抑制活性。
在一些實施例中，投與編碼結合於且「中和」細胞內任何其他免疫抑制因子之可溶性肽、蛋白質、融合蛋白或抗體的基因構築體。為此，可利用編碼與免疫抑制因子受體之域、免疫抑制因子受體之缺失突變體或與另一多肽(例如IgFc多肽)融合的此等免疫抑制因子受體域或突變體中之任一者對應之肽的基因構築體。在一些實施例中，使用編碼模擬免疫抑制因子受體且中和免疫抑制因子之抗個體基因型抗體或抗個體基因型抗體之Fab片段的基因構築體。可投與編碼此等免疫抑制因子受體肽、蛋白質、融合蛋白、抗個體基因型抗體或Fab之基因構築體以中和免疫抑制因子。
同樣，亦可使用編碼特異性識別免疫抑制因子之一或多種抗原決定基、或免疫抑制因子之保守變異體之抗原決定基、或免疫抑制因子之肽片段之抗體的基因構築體。此類抗體包括(但不限於)多株抗體、單株抗體(mAb)、人類化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')2片段、由Fab表現文庫產生之片段及上述任一者之抗原決定基結合片段。所屬領域中已知之任何技術均可用於產生編碼適合抗體之基因構築體。
在一些實施例中，抑制使免疫抑制因子前驅物裂解成活性同功型之酶以阻斷免疫抑制因子之活化。此等酶之轉錄或轉譯可藉由所屬領域中已知之方式阻斷。
在其他實施例中，藥理學抑制劑可用於減少酶活性，包括(但不限於)COX-2及IDO，以減少某些免疫抑制因子之量。腫瘤相關抗原 (TAA)
基於載體及基於蛋白質之疫苗方法在單一調配物中可靶向之TAA之數目有限。相比之下，如本文所述之同種異體全細胞疫苗平台之實施例允許靶向大量不同TAA。藉由選擇表現一系列TAA之同種異體細胞株且視情況對該等細胞株進行基因修飾以表現針對期望治療目標(例如癌症類型)所關注之另外抗原，包括新抗原或非同義突變(NSM)，可擴大及/或優化反應廣度。
如本文所用，術語「TAA」係指腫瘤相關抗原且可指如自腫瘤細胞天然表現之「野生型」抗原，或可視情況指包含一或多個突變(諸如新抗原決定基或如本文所述之一或多種NSM)之突變抗原，例如設計抗原或經設計之抗原或經強化之抗原或經工程改造之抗原。
TAA為可在正常組織及腫瘤組織中表現之蛋白質，但相對於健康組織，腫瘤組織中TAA蛋白之表現顯著較高。TAA可包括癌睪丸抗原(CT)，該等抗原對於胚胎發育而言係重要的，但限於在健康成年人中之男性生殖細胞中表現。CT常在腫瘤細胞中表現。
新抗原或新抗原決定基為在癌細胞中表現之異常突變基因。在許多情況下，新抗原可被視為TAA，因為其由腫瘤組織表現且正常組織不表現。靶向新抗原決定基具有許多優點，因為此等新抗原決定基真正係腫瘤特異性的且在胸腺中不會中樞耐受。編碼具有由非同義突變(NSM)產生之新抗原決定基之全長TAA的癌症疫苗能夠引發廣度及量值得到改善的更有效免疫反應。
如本文所用，非同義突變(NSM)為改變蛋白質之胺基酸序列的核苷酸突變。在一些實施例中，錯義突變為蛋白質中一個胺基酸之變化，其由單個核苷酸中之點突變產生。錯義突變為DNA序列中之一類非同義取代。亦考慮另外突變，包括但限於截短、讀框轉移或改變胺基酸序列以與原生抗原蛋白不同的任何其他突變。
如本文所述，在一些實施例中，抗原藉由以下來設計：(i)參考一或多個公開可得之資料庫以鑑別所選TAA中之NSM；(ii)鑑別在超過2名患者中出現之NSM；(iii)將在步驟(ii)中鑑別之各NSM引入至相關TAA序列中；(iv)鑑別TAA中HLA-A及HLA-B超型受限之I類MHC抗原決定基，目前包括NSM；以及(v)將建立新抗原決定基(SB及/或WB)或增加肽-MHC親和力之NSM包括至最終TAA序列中。本文提供預測建立HLA-A及HLA-B超型受限之新抗原決定基的示例性NSM(表135)。
在一些實施例中，在一個患者腫瘤樣品中鑑別出之NSM包括在經設計之抗原(亦即，由一或多個NSM引入所產生之突變抗原)中。在各種實施例中，將1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個NSM引入至TAA中以產生經設計之抗原。在一些實施例中，目標抗原可具有較低數目NSM且可需要使用僅出現1次之NSM來達到與原生抗原蛋白之同源性的目標範圍(94-97%)。在其他實施例中，目標抗原可具有大量出現≥2次出現截止值之NSM且可需要使用出現3次之NSM來達到與原生抗原蛋白之同源性的目標範圍(94-97%)。在經設計之抗原中包括大量NSM將經設計之抗原與原生抗原的同源性降低至目標同源性範圍(94-98%)以下。
在一些實施例中，根據本揭示案之腫瘤細胞疫苗之1種、2種、3種、4種、5種或6種細胞株在至少一種TAA中包含1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種或更多種NSM(且因此1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種或更多種經設計之抗原)。
在各種實施例中，在抗原全長上突變體(例如經設計之抗原)與原生全長蛋白質之序列同源性為80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。
在一些實施例中，將經設計之抗原併入至治療性同種異體全細胞癌症疫苗中以誘導針對經設計之TAA及已存在之TAA的抗原特異性免疫反應。
在一些實施例中，疫苗可由治療有效量之至少一種癌細胞株構成，其中該細胞株或該等細胞株之組合表現至少一種經設計之TAA。在其他實施例中，疫苗包含治療有效量之至少一種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合表現至少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種經設計之TAA。
本文提供疫苗組合物之實施例，該等疫苗組合物包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株之細胞，其中該至少一種癌細胞株表現(天然地，或經設計以表現)一或多種TAA、新抗原(包括包含一或多個NSM之TAA)、CT及/或TAA。在一些實施例中，細胞經重組慢病毒載體轉導，該重組慢病毒載體編碼有待由疫苗組合物中之細胞表現之一或多種TAA、包括包含一或多個NSM之TAA。
在一些實施例中，TAA、包括包含一或多個NSM或新抗原決定基之TAA及/或其他抗原可內源性地在選擇用於包括在疫苗組合物中之細胞上表現。在一些實施例中，細胞株可經修飾(例如經基因修飾)以表現所選TAA，包括包含一或多個NSM之TAA及/或其他抗原(例如CT、TSA、新抗原)。
本文所述之腫瘤細胞疫苗組合物中之任一者可呈現一或多種TAA，包括包含一或多個NSM之TAA或新抗原決定基，且在個體中誘導廣泛抗腫瘤反應。確保此類異質免疫反應可排除通常與某些癌症單一療法相關之一些問題，諸如抗原逃逸。
根據本文所提供之疫苗組合物之各種實施例，疫苗組合物之至少一種細胞株可經修飾以表現一或多種新抗原，例如與以下相關之新抗原：肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、大腸直腸癌、乳癌(包括三陰性乳癌(TNBC))、膀胱或泌尿道癌、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、肝細胞(HCC)癌、腎臟或腎細胞癌(RCC)、胃或胃癌、卵巢癌、食道癌、睪丸癌、胰臟癌、中樞神經系統癌症、子宮內膜癌、黑色素瘤及間皮癌。在一些實施例中，細胞株中之一或多者表現新抗原蛋白之未突變部分。在一些實施例中，細胞株中之一或多者表現新抗原蛋白之突變部分。
在一些實施例中，本文所述之任一疫苗組合物中的癌細胞中之至少一者可天然表現或經修飾以表現一或多種TAA，包括包含一或多種NSM之TAA、CT或TSA/新抗原。在某些實施例中，疫苗組合物中之癌細胞株中的超過一種(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)可表現或可經基因修飾以表現TAA、包括包含一或多個NSM之TAA、CT或TSA/新抗原中之一或多者。由組合物內之細胞株表現之TAA、包括包含一或多個NSM之TAA、CT或TSA/新抗原可均相同，可均不同，或其任何組合。
因為疫苗組合物可含有不同類型及組織學之多種(亦即，2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)癌細胞株，所以廣泛及多種TAA、包括包含一或多個NSM之TAA及/或新抗原可存在於組合物中(表7-23)。可使用細胞株之組合(例如5細胞株組合、6細胞株組合、7細胞株組合、8細胞株組合、9細胞株組合或10細胞株組合)靶向的TAA之數目及TAA之表現水準在細胞株組合中相較於組合中之個別細胞株較高。
在本文所提供之疫苗組合物之實施例中，本文所述之任一疫苗組合物中之癌細胞中的至少一種(亦即1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種)可表現或經修飾以表現一或多種TAA、包括包含一或多個NSM之TAA或新抗原。由組合物內之細胞表現之TAA、包括包含一或多個NSM之TAA可均相同，可均不同，或其任何組合。下表7列出示例性非小細胞肺癌TAA及肺癌TAA之示例性子集。在一些實施例中，TAA係NSCLC特異性的。在一些實施例中，TAA係GBM特異性的。在其他實施例中，TAA係前列腺癌特異性的。
在一些實施例中，本文呈現一種疫苗組合物，其包含治療有效量的來自至少一種癌細胞株之經工程改造之細胞，其中該等細胞株或細胞株之組合表現至少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種、30種、31種、32種、33種、34種、35種、36種、37種、38種、39種、40種或更多種表7-23中之TAA。在其他實施例中，表7-23中之TAA經修飾以包括一或多個如本文所述之NSM。
在一些實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量的來自至少一種癌細胞株之經工程改造之細胞，其中該等細胞株表現至少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種表7-23中之TAA(或經修飾以包括一或多個NSM之表7-23中之TAA)。如本文所提供，在各種實施例中，細胞株表現至少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種表7-23中之TAA(或經修飾以包括一或多個NSM之表7-23中之TAA)且視情況經修飾以表現表4之一或多種免疫刺激因子或增加其表現，及/或抑制或減少表6中之一或多種免疫抑制因子之表現。表 7 ：在非小細胞肺癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
存活素 BIRC5(332)
CD44 CD44(960)
CD44v6 CD44(960)
CEA CEACAM5(1048)
CT83 CT83(203413)
DEPDC1 DEPDC1(55635)
DLL3 DLL3(10683)
NYESO1 CTAG1(1485)
BORIS CTCFL(140690)
EGFR EGFR(1956)
Her2 ERBB2(2064)
PSMA FOLH1(2346)
KOC1 IGF2BP3(10643)
VEGFR KDR(3791)FLT1(2321)
KIF20A KIF20A(10112)
MPHOSPH1 KIF20B(9585)
KRAS KRAS(3845)
LY6K LY6K(54742)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-A6 MAGEA6(4105)
間皮素 MSLN(10232)
MUC1 MUC1(4582)
c-Myc MYC(4609)
NUF2 NUF2(83540)
PRAME PRAME(23532)
CD133(Prominin-1) PROM1(8842)
PTK7 PTK7(5754)
安全蛋白 PTTG1(9232)
STEAP1 STEAP1(26872)
hTERT TERT(7015)
p53 TP53(7157)
5T4 TPBG(7162)
TTK(CT96) TTK(7272)
Brachyury/TBXT T(6862)
WT1 WT1(7490
XAGE1B XAGE1B(653067)
表 8. 在前列腺癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
PAP ACP3(55)
雄激素受體 AR(367)
存活素 BIRC5(332)
NYESO1 CTAG1B(1485)
CXCL12 CXCL12(6387)
CXCR4 CXCR4(7852)
EGFR EGFR(1956)
Her2 ERBB2(2064)
PSMA FOLH1(2346)
GCNT1 GCNT1(2650)
IDH1 IDH1(3417)
FAP FAP(2191)
c-KIT / CD117 KIT(3815)
PSA KLK3(354)
半乳凝素8 LGALS8(3964)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-C2 MAGEC2(51438)
中期因子(Midkine) MDK(4192)
MUC1 MUC1(4582)
PDGF-B PDGFB(5155)
PDGF-D PDGFD(80310)
PDGFRβ PDGFRB(5159)
PLAT(T-PA) PLAT(5327)
uPA PLAU(5328)
uPAR(CD87) PLAUR(5329)
CD133(Prominin-1) PROM1(8842)
PSCA PSCA(8000)
SART3 SART3(9733)
前列腺蛋白 SLC45A3(85414)
CD147 SLC7A11(23657)
SSX2 SSX2(6757)
STEAP1 STEAP1(26872)
Brachyury/TBXT T(6862)
hTERT TERT(7015)
5T4 TPBG(7162)
VEGF-A VEGFA(7422)
表 9. 在神經膠母細胞瘤癌症中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
AIM2 AIM2(9447)
B4GALNT1 B4GALNT1(2583)
存活素 BIRC5(4582)
基礎免疫球蛋白(Basigin)(BSG) BSG(682)
週期素B1 CCNB1(891)
CDH5 CDH5(1003)
GP39 CHI3L1(1116)
Trp2 DCT(1638)
DLL3 DLL3(10683)
DRD2 DRD2(1813)
EGFRvIII EGFR(1956)
Epha2 EPHA2(1969)
Epha3 EPHA3(2042)
Her2 ERBB2(2064)
EZH2 EZH2(2146)
PSMA FOLH1(2346)
FOSL1 FOSL1(8061)
GSK3B GSK3B(2932)
IDH1 IDH1(3417)
IDH2 IDH2(3418)
IL13RA2 IL13RA2(3598)
IL4R IL4R(3566)
LRP1 LRP1(4035)
KOC1 IGF2BP3(10643)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MUC1 MUC1(4582)
MUL1 MUL1(79594)
GP100(PMEL) PMEL(6490)
PRAME PRAME(23532)
hCMV pp65 ABQ23593(UniProtKB - P06725(PP65_HCMVA)
PROM1 PROM1(8842)
PTHLH PTHLH(4744)
SART1 SART1(9092)
SART3 SART3(9733)
CD147 SLC7A11(23657)
SOX-2 SOX2(6657)
SOX-11 SOX11(6664)
STEAP1 STEAP1(26872)
hTERT TERT(7015)
肌腱蛋白-C(TNC) TNC(3371)
TYR TYR(7299)
Trp1(TYRP1) TYRP1(7306)
WT1 WT1(7490)
XPO1 XPO1(7514)
pp65* ABQ23593
*病毒抗原，無基因ID可利用。改用寄存編號。表 10. 在卵巢癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
OY-TES-1 ACRBP(84519)
A激酶錨定蛋白3 AKAP3(10566)
抗苗勒氏管激素受體 AMHR2(269)
Axl受體酪胺酸激酶 AXL(558)
存活素 BIRC5(332)
布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton's Tyrosine Kinase) BTK(695)
CD44 CD44(960)
細胞週期檢查點激酶1(CHK1) CHEK1(1111)
緊密連接蛋白6 CLDN6((074)
NY-ESO-1 CTAG1B(1485)
LAGE1 CTAG2(30848)
BORIS CTCFL(140690)
Dickkopf-1 DKK1(22943)
DLL4 DLL4(54567)
Her2 ERBB2(2064)
HER3 ERBB3(2065)
FOLR1 / FBP FOLR1(2348)
GAGE1 GAGE1(2543)
GAGE2 GAGE2A(729447)
IGFBP2 IGFBP2(3485)
FSHR FSHR(3969)
PLU-1 KDM5B(10765)
促黃體生成激素受體 LHCGR(3973)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A10 MAGEA10(4109)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-A9 MAGEA9(4108)
MAGE-C1 MAGEC1(9947)
間皮素 MSLN(10232)
Muc1 MUC1(4582)
Muc16 MUC16(94025)
糖皮質激素受體II NR3C1(2908)
PARP1 PARP1(142)
PIWIL1 PIWIL1(9271)
PIWIL2 PIWIL2(55124)
PIWIL3 PIWIL3(440822)
PIWIL4 PIWIL4(143689)
PRAME PRAME(23532)
SP17 SPA17(53340)
SPAG-9 SPAG9(9043)
STEAP1 STEAP1(26872)
hTERT TERT(7015)
WT1 WT1(7490)
表 11. 在大腸直腸癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
存活素 BIRC5(332)
B-RAF BRAF(673)
CEA CEACAM5(1048)
ßHCG CGB3(1082)
NYESO1 CTAG1B(1485)
EPCAM EPCAM(4072)
EPH受體A2 EPHA2(1969)
Her2 ERBB2(2064)
GUCY2C GUCY2C(2984)
PSMA FOLH1(2346)
KRAS KRAS(3845)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-A6 MAGEA6(4105)
間皮素 MSLN(10232)
MUC1 MUC1(4582)
PRAME PRAME(23532)
CD133 PROM1(8842)
RNF43 RNF43(54894)
SART3 SART3(9733)
STEAP1 STEAP1(26872)
Brachyury/TBXT T(6862)
TROP2 TACSTD2(4070)
hTERT TERT(7015)
TOMM34 TOMM34(10953)
5T4 TPBG(7162)
WT1 WT1(7490)
表 12. 在乳癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
存活素 BIRC5(332)
週期素B1 CCNB1(891)
鈣黏素-3 CDH3(1001)
CEA CEACAM5(1048)
CREB結合蛋白 CREBBP(1387)
CS1 CSH1(1442)
CT83 CT83(203413)
NYESO1 CTAG1B(1485)
BORIS CTCFL(140690)
內皮因子 ENG(2022)
PSMA FOLH1(2346)
FOS樣1 FOSL1(8061)
FOXM1 FOXM1(2305)
GPNMB GPNMB(10457)
MAGE A1 MAGEA1(4100)
MAGE A3 MAGEA3(4102)
MAGE A4 MAGEA4(4103)
MAGE A6 MAGEA6(4105)
間皮素 MSLN(10232)
MMP11 MMP11(4320)
MUC1 MUC1(4582)
PRAME PRAME(23532)
CD133 PROM1(8842)
PTK7 PTK7(5754)
ROR1 ROR1(4919)
乳腺球蛋白A SCGB2A2(4250)
多配體蛋白聚醣(Syndecan)-1 SDC1(6382)
SOX2 SOX2(6657)
SPAG9 SPAG9(9043)
STEAP1 STEAP1(26872)
Brachyury/TBXT T(6862)
TROP2 TACSTD2(4070)
hTERT TERT(7015)
WT1 WT1(7490)
YB-1 YBX1(4904)
表 13. 在膀胱癌中表現之示例性 TAA
雄激素受體 AR(367)
ATG7 ATG7(10533)
AXL受體酪胺酸激酶 AXL(558)
存活素 BIRC5(332)
BTK BTK(695)
CEACAM1 CEACAM1(634)
CEA CEACAM5(1048)
βHCG CGB3(1082)
NYESO1 CTAG1B(1495)
LAGE1 CTAG2(30848)
DEPDC1 DEPDC1(55635)
EPH受體B4 EPHB4(2050)
HER2 ERBB2(2064)
FGFR3 FGFR3(2261)
VEGFR FLT3(2322)
PSMA FOLH1(2346)
FOLR1α(FBP) FOLR1(2348)
IGF2BP3 IGF2BP3(10643)
MPHOSPH1 KIF20B(9585)
LY6K LY6K(54742)
MAGEA1 MAGEA1(4100)
MAGEA3 MAGEA3(4102)
MAGEA6 MAGEA6(4105)
MAGEC2 MAGEC2(51438)
c-Met MET(4233)
MUC1 MUC1(4582)
巢蛋白-4 巢蛋白4(81607)
NUF2 NUF2(83540)
RET RET(5979)
STEAP1 STEAP1(26872)
TDGF1(Cripto1) TDGF1(6997)
hTERT TERT(7015)
TROP2 TACSTD2(4070)
WEE1 WEE1(7465)
WT1 WT1(7490)
表 14. 在頭及 / 或頸癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
存活素 BIRC5(332)
BTK BTK(695)
週期素D1 CCND1(595)
CDK4 CDK4(1019)
CDK6 CDK6(1021)
P16 CDKN2A(1029)
CEA CEACAM5(1048)
EGFR EGFR(1956)
EPH受體B4 EPHB4(2050)
Her2 ERBB2(2064)
HER3 ERBB3(2065)
FGFR1 FGFR1(2260)
FGFR2 FGFR2(2263)
FGFR3 FGFR3(2261)
PSMA FOLH1(2346)
IGF2BP3 IGF2BP3(10643)
IMP3 IMP3(55272)
MPHOSPH1 KIF20B(9585)
LY6K LY6K(54742)
MAGE-A10 MAGEA10(4109)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGE-A4(4103)
MAGE-A6 MAGE-A6(4105)
MUC1 MUC1(4582)
NUF2 NUF2(83540)
PRAME PRAME(23532)
STEAP1 STEAP1(26872)
Brachyury/TBXT T(6862)
hTERT TERT(7015)
p53 TP53(7157)
HPV16 E6* AVN72023
HPV16 E7* AVN80203
HPV18 E6* ALA62736
HPV18 E7* ABP99745
* 病毒抗原，無基因ID可利用；提供GenBank寄存編號。表 15. 在胃癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
TEM-8(ANTXR1) ANTXR1(84168)
膜聯蛋白(Annexin)A2(ANXA2) ANXA2(302)
存活素 BIRC5(332)
CCKBR CCKBR(887)
鈣黏素17 CDH17(1015)
CDKN2A CDKN2A(1029)
CEA CEACAM5(1048)
緊密連接蛋白18 CLDN18(51208)
CT83 CT83(203413)
EPCAM EPCAM(4072)
Her2 ERBB2(2064)
Her3 ERBB3(2065)
PSMA FOLH1(2346)
FOLR1 FOLR1(2348)
FOXM1 FOXM1(2305)
FUT3 FUT3(2525)
胃泌素 GAST(2520)
KIF20A KIF20A(10112)
LY6K LY6K(54742)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MMP9 MMP9(4318)
間皮素 MSLN(10232)
MUC1 MUC1(4582)
MUC3A MUC3A(4584)
PRAME PRAME(23532)
PTPN11 PTPN11(5781)
SART3 SART3(9733)
SATB1 SATB1(6304)
STEAP1 STEAP1(26872)
hTERT TERT(7015)
5T4(TPBG) TPBG(7162)
VEGFR1 FLT1(2321)
WEE1 WEE1(7465)
WT1 WT1(7490)
表 16. 在肝癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
AKR1C3 AKR1C3(8644)
MRP3(ABCC3) ABCC3(8714)
AFP AFP(174)
膜聯蛋白A2(ANXA2) ANXA2(302)
存活素 BIRC5(4582)
基礎免疫球蛋白(BSG) BSG(682)
CEA CEACAM5(1048)
NYESO1 CTAG1B(1485)
DKK-1 DKK1(22943)
SART-2(DSE) DSE(29940)
EpCAM EPCAM(4072)
磷脂肌醇蛋白聚醣-3 GPC3(2719)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-A10 MAGEA10(4109)
MAGE-C1 MAGEC1(9947)
MAGE-C2 MAGEC2(51438)
中期因子(MDK) MDK(4192)
MUC-1 MUC1(4582)
PRAME PRAME(23532)
SALL-4 SALL4(57167)
Spa17 SPA17(53340)
SPHK2 SPHK2(56848)
SSX-2 SSX2(6757)
STAT3 STAT3(6774)
hTERT TERT(7015)
HCA661(TFDP3) TFDP3(51270)
WT1 WT1(7490)
表 17. 在食道癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
ABCA1 ABCA1(19)
NYESO1 CTAG1B(1485)
LAGE1 CTAG2(30848)
DKK1 DKK1(22943)
EGFR EGFR(1956)
EpCAM EPCAM(4072)
Her2 ERBB2(2065)
Her3 ERBB3(2064)
FOLR1 FOLR1(2348)
胃泌素(GAST) GAST(2520)
IGF2BP3 IGF2BP3(10643)
IMP3 IMP3(55272)
LY6K LY6K(54742)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-A11 MAGEA11(4110)
間皮素(MSLN) MSLN(10232)
NUF2 NUF2(83540)
PRAME PRAME(23532)
PTPN11 PTPN11(5781)
hTERT TERT(7015)
TTK TTK(7272)
表 18. 在腎癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
載脂蛋白L1 APOL1(8542)
Axl受體酪胺酸激酶 AXL(558)
存活素 BIRC5(332)
G250 CA9(768)
週期素D1 CCND1(595)
CXCR4 CXCR4(7852)
EPH受體B4 EPHB4(2050)
FAP FAP(2191)
VEGFR FLT3(2322)
GUCY2C GUCY2C(2984)
INTS1 INTS1(26173)
c-KIT / CD117 KIT(3815)
c-Met MET(4233)
MMP7 MMP7(4316)
RAGE1 MOK(5891)
Muc1 MUC1(4582)
PDGFRα PDGFRA(5156)
PDGFRβ PDGFRB(5159)
M2PK PKM(5315)
周脂素(perilipin)2 PLIN2(123)
PRAME PRAME(23532)
PRUNE2 PRUNE2(158471)
RET RET(5979)
RGS5 RGS5(8490)
ROR2 ROR2(4920)
STEAP1 STEAP1(26872)
Tie-1 TIE1(7075)
5T4 TPBG(7162)
gp75 TYRP1(7306)
表 19. 在胰臟癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
存活素 BIRC5(332)
BTK BTK(695)
結締組織生長因子 CCN2(1490)
CEA CEACAM5(1048)
緊密連接蛋白18 CLDN18(51208)
NYESO1 CTAG1B(1495)
CXCR4 CXCR4(7852)
EGFR EGFR(1956)
FAP FAP(2191)
PSMA FOLH1(2346)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
串珠素(Perlecan) HSPG2(3339)
間皮素 MSLN(10232)
MUC1 MUC1(4582)
Muc16 MUC16(94025)
黏蛋白5AC MUC5AC(4586)
CD73 NT5E(4907)
G17(胃泌素1-17) PBX2(5089)
uPA PLAU(5328)
uPAR(CD87) PLAUR(5329)
PRAME PRAME(23532)
PSCA PSCA(8000)
局部黏著斑激酶 PTK2(5747)
SSX2 SSX2(6757)
STEAP1 STEAP1(26872)
hTERT TERT(7015)
神經調壓素受體1 TFIP11(24144)
WT1 WT1(7490)
表 20. 在子宮內膜癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
OY-TES-1 ACRBP(84519)
ARMC3 ARMC3(219681)
存活素 BIRC5(332)
BMI1 BMI1(648)
BST2 BST2(684)
BORIS CTCFL(140690)
DKK1 DKK1(22943)
DRD2 DRD2(1813)
EpCam EPCAM(4072)
EphA2 EphA2(1969)
HER2/neu ERBB2(2064)
HER3 ERBB3(2065
ESR2 ESR2(2100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-C1 MAGEC1(9947)
MUC-1 MUC1(4582)
MUC-16 MUC16(94025)
SPA17 SPA17(53340)
SSX-4 SSX4(6757)
hTERT TERT(7015)
HE4(WFDC2) WFDC2(10406)
WT1 WT1(7490)
XPO1 XPO1(7514)
表 21. 在皮膚癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
B4GALNT1 B4GALNT1(2583)
存活素 BIRC5(332)
內皮唾酸蛋白(CD248) CD248(57124)
CDKN2A CDKN2A(1029)
CSAG2 CSAG2(102423547)
CSPG4 CSPG4(1464)
NYESO1 CTAG1B(1485)
Trp2(DCT) DCT(1638)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A2 MAGEA2(4101)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MAGE-A6 MAGEA6(4105)
MAGE-A10 MAGEA10(4109)
MITF MITF(4286)
MART-1 MLANA(2315)
NFE2L2 NFE2L2(4780)
PMEL PMEL(6490)
PRAME PRAME(23532)
NY-MEL-1 RAB38(23682)
NEF S100B(6285)
SEMA4D SEMA4D(10507)
SSX2 SSX2(6757)
SSX4 SSX4(6759)
ST8SIA1 ST8SIA1(6489)
hTERT TERT(7015)
TYR TYR(7299)
Trp1 TYRP1(7306)
表 22. 在間皮癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
APEX1 APEX1(328)
CHEK1 CHEK1(1111)
NYESO1 CTAG1B(1485)
DHFR DHFR(1719)
DKK3 DKK3(27122)
EGFR EGFR(1956)
ESR2 ESR2(2100)
EZH1 EZH1(2145)
EZH2 EZH2(2146)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGEA4(4103)
MCAM MCAM(4162)
間皮素 MSLN(10232)
MUC1 MUC1(4582)
PTK2 PTK2(5747)
SSX-2 SSX2(6757)
STAT3 STAT3(6774)
THBS2 THBS2(7058)
5T4(TPBG) TPBG(7162)
WT1 WT1(7490)
表 23. 在小細胞肺癌中表現之示例性 TAA
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
AIM2 AIM2(9447)
AKR1C3 AKR1C3(8644)
ASCL1 ASCL1(429)
B4GALNT1 B4GALNT1(2583)
存活素 BIRC5(332)
週期素B1 CCNB1(891)
CEA CEACAM5(1048)
CKB CKB(1152)
DDC DDC(1644)
DLL3 DLL3(10863)
烯醇酶2 ENO2(2026)
Her2 ERBB2(2064)
EZH2 EZH2(2146)
鈴蟾素(Bombesin) GRP(2922)
KDM1A KDM1A(23028)
MAGE-A1 MAGEA1(4100)
MAGE-A3 MAGEA3(4102)
MAGE-A4 MAGA4(4103)
MAGE-A10 MAGEA10(4109)
MDM2 MDM2(4193)
MUC1 MUC1(4582)
NCAM-1 NCAM1(4684)
GP100 PMEL(6490)
SART-1 SART1(9092)
SART-3 SART3(9733)
SFRP1 SFRP1(6422)
SOX-2 SOX2(6657)
SSTR2 SSTR2(6752)
Trp1(TYRP1) TYRP1(7306)
在本文所提供之疫苗組合物之一些實施例中，組合物內之細胞株中的1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種可經基因修飾以表現相同免疫刺激因子、TAA(包括包含一或多個NSM之TAA)及/或新抗原或增加其表現；表現不同免疫刺激因子、TAA及/或新抗原或增加其表現；或其某一組合。在一些實施例中，TAA序列可為原生內源性人類TAA序列。在一些實施例中，TAA序列可為原生內源性人類TAA序列之經基因工程改造之序列。經基因工程改造之序列可經由密碼子優化進行修飾以增加TAA之表現，或經基因工程改造之序列可經修飾以改變TAA之細胞定位(例如經由蛋白酶裂解位點之突變)。
表7-23中呈現示例性NCBI基因ID。如本文所提供，此等基因ID可用於在本揭示案之疫苗組合物之一或多種細胞株中表現(或過度表現)某些TAA。
在各種實施例中，本文所述之組合物中的細胞株中之一或多者經修飾以表現間皮素(MSLN)、CT83(北九州肺癌抗原(kita-kyushu lung cancer antigen)1)TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、FBP、TDGF1、緊密連接蛋白18、LY6K、PRAME、HPV16/18 E6/E7、FAP或其突變型式(表24)。短語「或其突變型式」係指包含一或多個突變(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或更多個取代型突變)的上述TAA或本文所提供之其他TAA(包括如本文所述之新抗原決定基或NSM)之序列。因此，在各種實施例中，本文所述之組合物中的細胞株中之一或多者經修飾以表現mod間皮素(modMSLN)、modTERT、modPSMA、modMAGEA1、modEGFRvIII、modhCMV pp65、modTBXT 、modBORIS、modFSHR、modMAGEA10、modMAGEC2、modWT1、 modKRAS、modFBP、modTDGF1、mod緊密連接蛋白18、modLY6K、modFAP、modPRAME、KRAS G12D突變、KRAS G12V突變及/或modHPV16/18 E6/E7。在其他實施例中，TAA或「其突變型式」可包含本文所提供之TAA或突變型式中的1者、2者或3者或更多者之融合物。在一些實施例中，融合物包含與突變TAA融合之原生或野生型序列。在一些實施例中，融合構築體中之個別TAA由裂解位點、諸如弗林蛋白酶裂解位點分隔開。因此，本揭示案提供TAA融合蛋白，諸如CT83-MSLN或modCT83-MSLN、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65、modTBXT-modBORIS、modFSHR-modMAGEA10、modTBXT-modMAGEC2、modTBXT-modWT1、modTBXT-modWT1(KRAS)、modWT1-modFBP 、modPSMA-modTDGF1、modWT1-mod緊密連接蛋白18、modPSMA-modLY6K、modFAP-mod緊密連接蛋白18及modPRAME-modTBXT，原生TAA之序列容易自NCBI資料庫獲得(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)。上述TAA、突變型式及融合物之序列提供於表24中。表 24. MSLN 、 CT83 及示例性設計抗原之序列
TAA 序列
間皮素 atggctctgcctaccgcaagacccctgctgggctcctgtgggactcctgctctgggatcactgctgtttctgctgttttcactgggctgggtgcagccttcccgcaccctggcaggagagacaggacaggaggcagcaccactggacggcgtgctggccaacccccctaatatcagctccctgtctcctcggcagctgctgggcttcccatgtgcagaggtgagcggactgtccaccgagagggtgcgcgagctggcagtggccctggcacagaagaacgtgaagctgagcacagagcagctgaggtgcctggcacacaggctgtccgagccaccagaggacctggatgcactgccactggacctgctgctgttcctgaacccagatgccttttccggcccccaggcctgtaccaggttcttttctcgcatcacaaaggccaatgtggatctgctgcccagaggcgcacctgagaggcagagactgctgccagccgccctggcatgctggggcgtgaggggctctctgctgagcgaggcagacgtgcgcgccctgggaggactggcctgtgatctgccaggccgctttgtggcagagagcgccgaggtgctgctgccacggctggtgtcctgccctggcccactggaccaggatcagcaggaggcagcccgggccgccctgcagggcggcggccctccctacggccccccttccacctggtctgtgagcacaatggacgcactgagaggactgctgcctgtgctgggacagccaatcatcaggtctatcccccagggcatcgtggcagcatggaggcagcggagcagccgggaccccagctggcggcagcctgagagaaccatcctgcggcctagattccggagagaggtggagaagacagcctgtccatctggcaagaaggccagagagatcgacgagagcctgatcttttacaagaagtgggagctggaggcctgcgtggacgccgccctgctggctacccagatggacagggtgaatgccatccccttcacctacgagcagctggacgtgctgaagcacaagctggatgagctgtacccacagggctatcccgagtccgtgatccagcacctgggctacctgtttctgaagatgtcccccgaggatatcagaaagtggaacgtgacctctctggagacactgaaggccctgctggaggtcaataagggccacgagatgagccctcaggtggccaccctgatcgaccggttcgtgaagggcagaggccagctggacaaggatacactggataccctgacagccttttaccccggctacctgtgctccctgtctcctgaggagctgtcctctgtgccacccagctccatctgggccgtgcggccacaggacctggatacctgcgacccccggcagctggacgtgctgtaccctaaggccaggctggccttccagaacatgaatggctctgagtatttcgtgaagatccagagctttctgggaggagcacctaccgaggacctgaaggccctgagccagcagaacgtgagcatggacctggccacctttatgaagctgcgcacagatgccgtgctgccactgaccgtggcagaggtgcagaagctgctgggacctcacgtggagggcctgaaggcagaggagaggcacaggccagtgcgggactggattctgcggcagagacaggacgatctggataccctgggactgggactgcagggaggcatcccaaatggaggcagcacatccggctctggcaagccaggctccggagagggctctaccaagggaatgcaggaggccctgagcggcacaccttgcctgctgggacctggacctgtgctgactgtgctggctctgctgctggcatctactctggct(SEQ ID NO: 17)
間皮素 MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGGSTSGSGKPGSGEGSTKGMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA(SEQ ID NO: 18)
CT83 atgaacttttacctgctgctggcatcctcaatcctgtgcgccctgatcgtgttttggaaataccgacgctttcagagaaatactggcgagatgagcagcaacagcaccgccctggccctggtgcggccctctagctccggcctgatcaactctaatacagacaacaatctggccgtgtacgacctgtctcgggatatcctgaacaatttccctcacagcatcgcccggcagaagagaatcctggtgaacctgagcatggtggagaataagctggtggagctggaacatacactgctgagtaagggctttaggggggcttcaccacatcgcaagtcaaca(SEQ ID NO: 19)
CT83 MNFYLLLASSILCALIVFWKYRRFQRNTGEMSSNSTALALVRPSSSGLINSNTDNNLAVYDLSRDILNNFPHSIARQKRILVNLSMVENKLVELEHTLLSKGFRGASPHRKST(SEQ ID NO: 20)
CT83- 間皮素 atgaatttctacctgctgctggcatcttcaatcctgtgcgccctgatcgtcttttggaagtatcgccgctttcagaggaacactggcgagatgagcagcaacagcaccgccctggccctggtgcggccttctagctccggcctgatcaactctaatacagacaacaatctggccgtgtatgacctgtcccgggatatcctgaacaatttcccacactctatcgccaggcagaagcgcatcctggtgaacctgagcatggtggagaataagctggtggagctggagcacaccctgctgagcaagggcttccggggagcatccccacacagaaagtctaccggcagcggcgccacaaacttttctctgctgaagcaggcaggcgacgtggaggagaatcctggaccagccctgccaaccgccagacccctgctgggcagctgtggcacacccgccctgggctctctgctgttcctgctgtttagcctgggatgggtgcagccatcaaggaccctggcaggagagacaggacaggaggcagcacccctggatggcgtgctggccaacccccctaatatctctagcctgagcccaagacagctgctgggcttcccatgtgcagaggtgtccggactgtctaccgagagggtgcgcgagctggcagtggccctggcacagaagaatgtgaagctgtctacagagcagctgaggtgcctggcacacagactgagcgagccaccagaggacctggatgcactgcctctggacctgctgctgttcctgaaccccgatgcctttagcggacctcaggcctgcacccggttcttttccagaatcacaaaggccaatgtggatctgctgcctaggggcgcaccagagaggcagagactgctgccagccgccctggcctgctggggcgtgaggggcagcctgctgtccgaggcagacgtgcgcgccctgggaggactggcctgtgatctgccaggccgctttgtggcagagtctgccgaggtgctgctgcctaggctggtgagctgcccaggacctctggaccaggatcagcaggaggcagcccgggccgccctgcagggcggcggccctccatacggccccccttccacctggtccgtgtctacaatggacgcactgagaggactgctgccagtgctgggacagccaatcatcaggagcatcccccagggcatcgtggcagcatggaggcagcggagcagccgggacccctcctggaggcagccagagaggaccatcctgcggccaagattccggagagaggtggagaagacagcatgtccatccggcaagaaggcccgcgagatcgacgagtctctgatcttttacaagaagtgggagctggaggcctgcgtggacgccgccctgctggctacccagatggaccgggtgaacgccatccccttcacctacgagcagctggacgtgctgaagcacaagctggatgagctgtacccccagggctatcctgagtccgtgatccagcacctgggctacctgtttctgaagatgagccccgaggatatccggaagtggaacgtgacctccctggagacactgaaggccctgctggaggtcaataagggccacgagatgagccctcaggtggccaccctgatcgacaggttcgtgaagggccgcggccagctggacaaggatacactggataccctgacagccttttaccctggctacctgtgcagcctgtccccagaggagctgagctccgtgccaccctctagcatctgggccgtgcggccccaggacctggatacctgcgaccctagacagctggatgtgctgtacccaaaggccaggctggccttccagaacatgaatggctctgagtatttcgtgaagatccagagctttctgggaggagcaccaaccgaggacctgaaggccctgtcccagcagaacgtgtctatggacctggccacctttatgaagctgagaacagatgccgtgctgcctctgaccgtggcagaggtgcagaagctgctgggaccacacgtggagggcctgaaggcagaggagaggcacaggcctgtgagggactggattctgcggcagagacaggacgatctggataccctgggactgggactgcagggaggcatccccaatggcggctctacaagcggctccggcaagcctggctctggagagggcagcaccaagggaatgcaggaggccctgagcggcacaccctgtctgctgggacctggacccgtgctgactgtgctggctctgctgctggcttcaaccctggca(SEQ ID NO: 21)
CT83- 間皮素 MNFYLLLASSILCALIVFWKYRRFQRNTGEMSSNSTALALVRPSSSGLINSNTDNNLAVYDLSRDILNNFPHSIARQKRILVNLSMVENKLVELEHTLLSKGFRGASPHRKSTGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLK5ALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGGSTSGSGKPGSGEGSTKGMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA(SEQ ID NO: 22)
modTERT atgcctagagcacctagatgtagagctgtgcggagcctgctgcggagccactatagagaagttctgcccctggccaccttcgtgcgtagacttggacctcaaggatggcggctggtgcagagaggcgatcctgctgcttttagagccctggtggcccagtgtctcgtgtgcgttccatgggatgctagacctccaccagctgctcccagcttcagacaggtgtcctgcctgaaagaactggtggccagagtgctgcagcggctgtgtgaaaggggcgccaaaaatgtgctggccttcggctttgccctgctggatgaagctagaggcggacctcctgaggcctttacaacaagcgtgcggagctacctgcctaacaccgtgacagatgccctgagaggatctggcgcttggggactgctgctgagaagagtgggagatgacgtgctggtgcatctgctggcccactgtgctctgtttgtgctggtggctcctagctgcgcctaccaagtttgcggccctctgctgtatcagctgggcgctgctacacaggctagaccacctccacatgccagcggacctagaagaaggctgggctgcgaaagagcctggaaccactctgttagagaagccggcgtgccactgggattgcctgcacctggtgctcggagaagagatggcagcgcctctagatctctgcctctgcctaagaggcccagaagaggcgcagcacctgagcctgagagaacccctatcggccaaggatcttgggcccatcctggcagaacaagaggccctagcgatagaggcttctgcgtggtgtctcctgccagacctgccgaggaagctacatctcttgacggcgccctgagcggcacaagacactctcatccatctgtgggctgccagcaccatgccggacctccatctacaagcagaccacctagaccttgggacaccccttgtcctccagtgtacgccgagacaaagcacttcctgtacagcagcggcgacaaagagcagctgaggcctagcttcctgctgagctttctgaggccaagcctgacaggcgccagacggctgctggaaacaatcttcctgggcagcagaccctggatgcctggcacacttagaaggctgcctagactgccccagcggtactggcaaatgaggcccctgtttctggaactgctgggcaaccacgctcagtgcccttatggcgtgctgctgaaaacccactgtccactgagagccgtggttactccagctgctggcgtgtgtgccagagagaagccacagggatctgtggtggcccctgaggaagaggacaccgatcctagaaggctcgtgcagctgctgaggcagcatagctctccatggcaggtctacggattcgtgcgggcctgtctgcatagactggttccacctggactgtggggctccagacacaacgagcggcggtttctgcggaacaccaagaagttcatcagcctgggaaagcacgccaagctgagcctgcaagagctgacctggaagatgagcgtgtgggattgtgcttggctgcggagaagtcctggcgtgggatgtgttcctgccgccgaacacagactgcgggaagagatcctggccaagttcctgcactggctgatgtccgtgtacgtggtcgaactgctgcggtccctgttctgcgtgaccgagacaaccttccagaagaaccggctgttcttctaccggaagtccgtgtggtccaagctgcagagcatcggcatccggcagcatctgaagagagtgcagctgagagagctgctcgaagccgaagttcggcagcacagaaaagccagactggccctgctgaccagcaggctgagattcatccccaagcacgatggcctgcggcctattgtgaacatggactacgttgtgggcgccagaaccttccaccgggaaaagagagccgagcggctgacctctagagtgaaggccctgtttagcgtgctgaactacgagcgggccagaaggccatctctgctgggagcctttgtgctcggcctggacgatattcatagagcctggcggacattcgtgctgagagtcagagcccaggatagccctcctgagctgtacttcgtgaaggccgatgtgatgggcgcctacaacacaatccctcaggaccggctgaccgagatcattgccagcatcatcaagccccagaacatgtactgtgtgcggagatacgccgtggtgcagaaagccacacatggccacgtgcgcaaggccttcaagagccatgtgtctaccctgaccgacctgcagccttacatgagacagttcgtggcctatctgcaagagacaagccctctgagggacgccgtgatcatcgaacagagcagcagcctgaatgaggccagctccggcctgtttgacgtgttcctcagattcatgtgccaccacgccgtgcggatcagaggcaagagctacatccagtgccagggcattccacagggctccatcctgagcacactgctgtgcagcctgtgctacggcgacatggaaaacaagctgttcgccggcattcggcgcgacggactgcttcttagactggtggacgacttcctgctcgtgacccctcatctgacccacgccaagacctttctgaaaacactcgtgcggggcgtgcccgagtatggctgtgtggtcaatctgagaaagaccgtggtcaacttccccgtcgaggatgaagccctcggcggcacagcttttgtgcagatgcctgctcacggactgttcccttggtgctccctgctgctggacactagaaccctggaagtgcagagcgactacagcagctatgcccggacctctatcagagccagcctgaccttcaaccggggctttaaggccggcagaaacatgcggagaaagctgtttggagtgctgcggctgaagtgccacagcctgttcctcgacctgcaagtgaacagcctgcagaccgtgtgcaccaatatctacaagattctgctgctgcaagcctaccggttccacgcctgtgttctgcagctgcccttccaccagcaagtgtggaagaaccctacattcttcctgcggatcatcagcgacaccgccagcctgtgttacagcatcctgaaggccaagaacgccggcatgtctctgggagctaaaggcgctgcaggacccctgccttttgaagctgttcagtggctgtgtcaccaggcctttctgctgaagctgacccggcacagagtgacatatgtgcccctgctgggctccctgagaacagctcagatgcagctgtccagaaagctgccaggcacaaccctgacagccctggaagctgctgctaaccctgctctgcccagcgacttcaagaccatcctggactgatga(SEQ ID NO: 35)
modTERT MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDEARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLAHCALFVLVAPSCAYQVCGPLLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRDGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPIGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLDGALSGTRHSHPSVGCQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSFLRPSLTGARRLLETIFLGSRPWMPGTLRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAVVTPAAGVCAREKPQGSVVAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLHRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVWDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSLFCVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELLEAEVRQHRKARLALLTSRLRFIPKHDGLRPIVNMDYVVGARTFHREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPSLLGAFVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDSPPELYFVKADVMGAYNTIPQDRLTEIIASIIKPQNMYCVRRYAVVQKATHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAYLQETSPLRDAVIIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYIQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLKTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCSLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRIISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPFEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQMQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(SEQ ID NO: 36)
modPSMA atgtggaatctgctgcacgagacagatagcgccgtggctaccgttagaaggcccagatggctttgtgctggcgctctggttctggctggcggcttttttctgctgggcttcctgttcggctggttcatcaagagcagcaacgaggccaccaacatcacccctaagcacaacatgaaggcctttctggacgagctgaaggccgagaatatcaagaagttcctgtacaacttcacgcacatccctcacctggccggcaccgagcagaattttcagctggccaagcagatccagagccagtggaaagagttcggcctggactctgtggaactggcccactacgatgtgctgctgagctaccccaacaagacacaccccaactacatcagcatcatcaacgaggacggcaacgagatcttcaacaccagcctgttcgagcctccacctcctggctacgagaacgtgtccgatatcgtgcctccattcagcgctttcagcccacagcggatgcctgagggctacctggtgtacgtgaactacgccagaaccgaggacttcttcaagctggaatgggacatgaagatcagctgcagcggcaagatcgtgatcgcccggtacagaaaggtgttccgcgagaacaaagtgaagaacgcccagctggcaggcgccaaaggcgtgatcctgtatagcgaccccgccgactattttgcccctggcgtgaagtcttaccccgacggctggaattttcctggcggcggagtgcagcggcggaacatccttaatcttaacggcgctggcgaccctctgacacctggctatcctgccaatgagtacgcctacagacacggaattgccgaggctgtgggcctgccttctattcctgtgcaccctgtgcggtactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggaagcgcccctcctgactcttcttggagaggctctctgaaggtgccctacaatgtcggcccaggcttcaccggcaacttcagcacccagaaagtgaaaatgcacatccacagcaccaacgaagtgacccggatctacaacgtgatcggcacactgagaggcgccgtggaacccgacaaatacgtgatcctcggcggccacagagacagctgggtgttcggaggaatcgaccctcaatctggcgccgctgtggtgtatgagatcgtgcggtctttcggcaccctgaagaaagaaggatggcggcccagacggaccatcctgtttgcctcttgggacgccgaggaatttggcctgctgggatctacagagtgggccgaagagaacagcagactgctgcaagaaagaggcgtggcctacatcaacgccgacagcagcatcgagggcaactacaccctgcggatcgattgcacccctctgatgtacagcctggtgcacaacctgaccaaagagctgaagtcccctgacgagggctttgagggcaagagcctgtacaagagctggaccaagaagtccccatctcctgagttcagcggcatgcccagaatctctaagctggaaagcggcaacaacttcgaggtgttcttccagcggctgggaatcgcctctggaatcgccagatacaccaagaactgggagacaaacaagttctccggctatcccctgtaccacagcgtgtacgagacatacgagctggtggaaaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgacagtggcccaagtgcgcggaggcatggtgttcgaactggccaatagcatcgtgctgcccttcaactgcagagactacgccgtggtgctgcggaagtacgccgacaagatctacagcatcagcatgaagcacccgcaagagatgaagacctacagcgtgtccttcgactccctgttcttcgccgtgaagaacttcaccaagatcgccagcaagttcagcgagcggctgcaggacttcgacaagagcaaccctatcgtgctgaggatgatgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcatcaaccctctgggactgcccgacagacccttctacaggcacgtgatctgtgcccctagcagccacaacaaatacgccggcgagagcttccccggcatctacgatgccctgttcgacatcgagagcaacgtgaaccctagcaaggcctggggcgaagtgaagagacagatctacgtggccgcattcacagtgcaggccgctgccgaaacactgtctgaggtggcctgatga(SEQ ID NO: 37)
modPSMA MWNLLHETDSAVATVRRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTHIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQRMPEGYLVYVNYARTEDFFKLEWDMKISCSGKIVIARYRKVFRENKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNFPGGGVQRRNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRHGIAEAVGLPSIPVHPVRYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDKYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVYEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRIDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYKSWTKKSPSPEFSGMPRISKLESGNNFEVFFQRLGIASGIARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFNCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFFAVKNFTKIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFINPLGLPDRPFYRHVICAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESNVNPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA(SEQ ID NO: 38)
modMAGEA1-EGFRvIII-pp65 atgtctctcgaacagagaagcctgcactgcaagcccgaggaagctctggaagctcagcaagaggctctgggccttgtgtgtgttcaggccgctgccagcagcttttctcctctggtgctgggcacactggaagaggtgccaacagccggctctaccgatcctcctcaatctcctcaaggcgccagcgcctttcctaccaccatcaacttcacccggcagagacagcctagcgagggctctagctctcacgaggaaaagggccctagcaccagctgcatcctggaaagcctgttccgggccgtgatcacaaagaaagtggccgacctcgtgggcttcctgctgctgaagtacagagccagagaacccgtgaccaaggccgagatgctggaaagcgtgatcaagaactacaagcactgcttcagcgagatcttcggcaaggccagcgagtctctgcagctcgtgtttggcatcgacgtgaaagaggccgatcctaccggccacagctacgtgttcgtgacatgtctgggcctgagctacgatggcctgctgggcgacaatcagattatgctgaaaaccggcttcctgatcatcgtgctggtcatgatcgccatggaaggctctcacgcccctaaagaggaaatctgggaagaactgagcgtgatggaagtgtacgacggcagagagcatagcgcctacggcgagcctagaaaactgctgacccaggacctggtgcaagagaagtacctcgagtacagacaggtgcccgacagcgaccctgccagatacgaatttctgtggggccctagagcactggccgagacaagctatgtgaaggtgctggaatacgtcatcaaggtgtccgccagagtgtgcttcttcttcccatctctgcgggaagccgctctgcgcgaagaggaagaaggcgtcagaggccggaagagaagaagcctggaagagaaaaagggcaactacgtggtcaccgaccactgcagaggcagaaagcggagaagcgagtctagaggcagacggtgccctgagatgattagcgtgctgggccctatctctggccacgtgctgaaggccgtgttcagcagaggcgatacacctgtgctgccccacgagacaagactgctgcagacaggcatccatgtgcgggtgtcacagccaagcctgatcctggtgtctcagtacacccctgacagcaccccttgtcacagaggcgacaaccagctccaggtgcagcacacctactttaccggcagcgaggtggaaaacgtgtccgtgaacgtgcacaatcccaccggcagatccatctgtcccagccaagagcctatgagcatctacgtgtacgccctgcctctgaagatgctgaacatccccagcatcaatgtgcatcactacccctctgccgccgagcggaaacacagacatctgcctgtggccgatgccgtgattcacgcctctggaaagcagatgtggcaggccagactgacagtgtccggactggcttggaccagacagcagaaccagtggaaagaacccgacgtgtactacacctccgccttcgtgttccccacaaaggacgtggccctgagacacgttgtgtgcgcccatgaactcgtgtgcagcatggaaaacacccgggccaccaagatgcaagtgatcggcgaccagtacgtgaaggtgtacctggaatccttctgcgaggacgtgccaagcggcaagctgttcatgcacgtgaccctgggctccgatgtggaagaggacctgaccatgaccagaaatccccagcctttcatgcggcctcacgagagaaatggcttcaccgtgctgtgccccaagaacatgatcatcaagcccggcaagatcagccacatcatgctggatgtggccttcaccagccacgagcacttcggactgctgtgtcctaagagcatccccggcctgagcatcagcggcaacctgctgatgaatggccagcagatcttcctggaagtgcaggccattcgggaaaccgtggaactgagacagtacgaccctgtggctgccctgttcttcttcgacatcgatctgctgctccagagaggccctcagtacagcgagcacccaacctttaccagccagtacagaatccagggcaagctggaatatcggcacacctgggatagacacgatgagggtgctgcacagggcgacgatgatgtgtggacaagcggcagcgatagcgacgaggaactggtcaccaccgagagaaagacccctagagttacaggcggaggcgcaatggctggcgcttctacatctgccggacgcaagagaaagagcgcctcttctgccaccgcctgtacaagcggcgtgatgacaagaggcaggctgaaagccgagagcacagtggcccctgaggaagatacagacgaggacagcgacaacgagattcacaaccccgccgtgtttacctggcctccttggcaggctggcattctggctagaaacctggtgcctatggtggccacagtgcagggccagaacctgaagtaccaagagttcttctgggacgccaacgacatctaccggatcttcgccgaactggaaggcgtgtggcaaccagccgctcagcccaaaagacgcagacacagacaggacgctctgcccggaccttgtattgccagcacacccaagaaacaccggggctgataa(SEQ ID NO: 39)
modMAGEA1-EGFRvIII-pp65 MSLEQRSLHCKPEEALEAQQEALGLVCVQAAASSFSPLVLGTLEEVPTAGSTDPPQSPQGASAFPTTINFTRQRQPSEGSSSHEEKGPSTSCILESLFRAVITKKVADLVGFLLLKYRAREPVTKAEMLESVIKNYKHCFSEIFGKASESLQLVFGIDVKEADPTGHSYVFVTCLGLSYDGLLGDNQIMLKTGFLIIVLVMIAMEGSHAPKEEIWEELSVMEVYDGREHSAYGEPRKLLTQDLVQEKYLEYRQVPDSDPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEYVIKVSARVCFFFPSLREAALREEEEGVRGRKRRSLEEKKGNYVVTDHCRGRKRRSESRGRRCPEMISVLGPISGHVLKAVFSRGDTPVLPHETRLLQTGIHVRVSQPSLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLQVQHTYFTGSEVENVSVNVHNPTGRSICPSQEPMSIYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHRHLPVADAVIHASGKQMWQARLTVSGLAWTRQQNQWKEPDVYYTSAFVFPTKDVALRHVVCAHELVCSMENTRATKMQVIGDQYVKVYLESFCEDVPSGKLFMHVTLGSDVEEDLTMTRNPQPFMRPHERNGFTVLCPKNMIIKPGKISHIMLDVAFTSHEHFGLLCPKSIPGLSISGNLLMNGQQIFLEVQAIRETVELRQYDPVAALFFFDIDLLLQRGPQYSEHPTFTSQYRIQGKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAMAGASTSAGRKRKSASSATACTSGVMTRGRLKAESTVAPEEDTDEDSDNEIHNPAVFTWPPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDANDIYRIFAELEGVWQPAAQPKRRRHRQDALPGPCIASTPKKHRG(SEQ ID NO: 40)
modTBXT-modBORIS atgtctagccctggaacagagtctgccggcaagagcctgcagtacagagtggaccatctgctgagcgccgtggaaaatgaactgcaggccggaagcgagaagggcgatcctacagagcacgagctgagagtcggcctggaagagtctgagctgtggctgcggttcaaagaactgaccaacgagatgatcgtgaccaagaacggcagacggatgttccccgtgctgaaagtgaacgtgtccggactggaccccaacgccatgtacagctttctgctggacttcgtggtggccgacaaccacagatggaaatacgtgaacggcgagtgggtgccaggcggaaaacctcaactgcaagcccctagctgcgtgtacattcaccctgacagccccaatttcggcgcccactggatgaaggcccctgtgtccttcagcaaagtgaagctgaccaacaagctgaacggcggaggccagatcatgctgaacagcctgcacaaatacgagcccagaatccacatcgtcagagtcggcggaccccagagaatgatcaccagccactgcttccccgagacacagtttatcgccgtgaccgcctaccagaacgaggaaatcaccacactgaagatcaagtacaaccccttcgccaaggccttcctggacgccaaagagcggagcgaccacaaagagatgatcaaagagcccggcgacagccagcagccaggctattctcaatggggatggctgctgccaggcaccagcacattgtgccctccagccaatcctcacagccagtttggaggcgccctgagcctgtctagcacccacagctacgacagataccccacactgcggagccacagaagcagcccctatccttctccttacgctcaccggaacaacagccccacctacagcgataatagccccgcctgtctgagcatgctgcagtcccacgataactggtccagcctgagaatgcctgctcacccttccatgctgcccgtgtctcacaatgcctctccacctaccagcagctctcagtaccctagcctttggagcgtgtccaatggcgccgtgacactgggatctcaggcagccgctgtgtctaatggactgggagcccagttcttcagaggcagccctgctcactacacccctctgacacatcctgtgtctgcccctagcagcagcggcttccctatgtataagggcgctgccgccgctaccgacatcgtggattctcagtatgatgccgccgcacagggacacctgatcgcctcttggacacctgtgtctccaccttccatgagaggcagaaagagaagatccgccgccaccgagatcagcgtgctgagcgagcagttcaccaagatcaaagaattgaagctgatgctcgagaaggggctgaagaaagaagagaaggacggcgtctgccgcgagaagaatcacagaagccctagcgagctggaagcccagagaacatctggcgccttccaggacagcatcctggaagaagaggtggaactggttctggcccctctggaagagagcaagaagtacatcctgacactgcagaccgtgcacttcacctctgaagccgtgcagctccaggacatgagcctgctgtctatccagcagcaagagggcgtgcaggttgtggttcagcaacctggacctggactgctctggctgcaagagggacctagacagtccctgcagcagtgtgtggccatcagcatccagcaagagctgtatagccctcaagagatggaagtgctgcagtttcacgccctcgaagagaacgtgatggtggccatcgaggacagcaagctggctgtgtctctggccgaaacaaccggcctgatcaagctggaagaggaacaagagaagaaccagctgctggccgagaaaacaaaaaagcaactgttcttcgtggaaaccatgagcggcgacgagagaagcgacgagatcgtgctgacagtgtccaacagcaacgtggaagaacaagaggaccagcctaccgcctgtcaggccgatgccgagaaagccaagtttaccaagaaccagagaaagaccaagggcgccaagggcaccttccactgcaacgtgtgcatgttcaccagcagccggatgagcagcttcaactgccacatgaagacccacaccagcgagaagccccatctgtgtcacctgtgcctgaaaaccttccggacagtgacactgctgtggaactatgtgaacacccacacaggcacccggccttacaagtgcaacgactgcaacatggccttcgtgaccagcggagaactcgtgcggcacagaagatacaagcacacccacgagaaacccttcaagtgcagcatgtgcaaatacgcatccatggaagcctccaagctgaagtgccacgtgcgctctcacacaggcgagcaccctttccagtgctgtcagtgtagctacgccagccgggacacctataagctgaagcggcacatgagaacccactctggcgaaaagccctacgagtgccacatctgccacaccagattcacccagagcggcaccatgaagattcacatcctgcagaaacacggcaagaacgtgcccaagtaccagtgtcctcactgcgccaccattatcgccagaaagtccgacctgcgggtgcacatgaggaatctgcacgcctattctgccgccgagctgaaatgcagatactgcagcgccgtgttccacaagagatacgccctgatccagcaccagaaaacccacaagaacgagaagcggtttaagtgcaagcactgcagctacgcctgcaagcaagagcgccacatgatcgcccacatccacacacacaccggggagaagccttttacctgcctgagctgcaacaagtgcttccggcagaaacagctgctcaacgcccacttcagaaagtaccacgacgccaacttcatccccaccgtgtacaagtgctccaagtgcggcaagggcttcagccggtggatcaatctgcaccggcacctggaaaagtgcgagtctggcgaagccaagtctgccgcctctggcaagggcagaagaacccggaagagaaagcagaccatcctgaaagaggccaccaagagccagaaagaagccgccaagcgctggaaagaggctgccaacggcgacgaagctgctgccgaagaagccagcacaacaaagggcgaacagttccccgaagagatgttccctgtggcctgcagagaaaccacagccagagtgaagcaagaggtcgaccagggcgtgacctgcgagatgctgctgaacaccatggacaagtgatga(SEQ ID NO: 41)
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modTBXT_WT1 MSSPGTESAGKSLQYRVDHLLSAVENELQAGSEKGDPTEHELRVGLEESELWLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSFLLDFVVADNHRWKYVNGEWVPGGKPQLQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYEPRIHIVRVGGPQRMITSHCFPETQFIAVTAYQNEEITTLKIKYNPFAKAFLDAKERSDHKEMIKEPGDSQQPGYSQWGWLLPGTSTLCPPANPHSQFGGALSLSSTHSYDRYPTLRSHRSSPYPSPYAHRNNSPTYSDNSPACLSMLQSHDNWSSLRMPAHPSMLPVSHNASPPTSSSQYPSLWSVSNGAVTLGSQAAAVSNGLGAQFFRGSPAHYTPLTHPVSAPSSSGFPMYKGAAAATDIVDSQYDAAAQGHLIASWTPVSPPSMRGRKRRSDFLLLQNPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAECLQGRRSRGASGSEPHQMGSDVHDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEKQCLSAFTVHFFGQFTGTVGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPTIRNQGFSTVTFDGMPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGNQALLLRMPFSSDNLYQMTSQLECMIWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTAGQSNHSTGYESDNHTMPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVGSASETSEKHPFMCAYPGCNKRYFKLSHLKMHSRKHTGEKLYQCDFKDCERRFSCSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRTFSWSNHLKTHTRTHTGKTIEKPFSCRWPSCQKKFARSNELVHHHNMHQRNMTKLQLVL(SEQ ID NO: 48)
modTBXT_WT1_(KRAS 突變 ) agagtctgagctgtggctgcggttcaaagaactgaccaacgagatgatcgtgaccaagaacggcagacggatgttccccgtgctgaaagtgaacgtgtccggactggaccccaacgccatgtacagctttctgctggacttcgtggtggccgacaaccacagatggaaatacgtgaacggcgagtgggtgccaggcggaaaacctcaactgcaagcccctagctgcgtgtacattcaccctgacagccccaatttcggcgcccactggatgaaggcccctgtgtccttcagcaaagtgaagctgaccaacaagctgaacggcggaggccagatcatgctgaacagcctgcacaaatacgagcccagaatccacatcgtcagagtcggcggaccccagagaatgatcaccagccactgcttccccgagacacagtttatcgccgtgaccgcctaccagaacgaggaaatcaccacactgaagatcaagtacaaccccttcgccaaggccttcctggacgccaaagagcggagcgaccacaaagagatgatcaaagagcccggcgacagccagcagccaggctattctcaatggggatggctgctgccaggcaccagcacattgtgccctccagccaatcctcacagccagtttggaggcgccctgagcctgtctagcacccacagctacgacagataccccacactgcggagccacagaagcagcccctatccttctccttacgctcaccggaacaacagccccacctacagcgataatagccccgcctgtctgagcatgctgcagtcccacgataactggtccagcctgagaatgcctgctcacccttccatgctgcccgtgtctcacaatgcctctccacctaccagcagctctcagtaccctagcctttggagcgtgtccaatggcgccgtgacactgggatctcaggcagccgctgtgtctaatggactgggagcccagttcttcagaggcagccctgctcactacacccctctgacacatcctgtgtctgcccctagcagcagcggcttccctatgtataagggcgctgccgccgctaccgacatcgtggattctcagtatgatgccgccgcacagggacacctgatcgcctcttggacacctgtgtctccaccttccatgagaggcagaaagcggagaagcgacttcctgctgctgcagaaccctgcctctacctgtgtgcctgaaccagcctctcagcacaccctgagatctggccctggatgtctccagcagcctgaacagcagggcgttagagatcctggcggaatctgggccaaactgggagctgccgaagcctctgccgaatgtctgcagggcagaagaagcagaggcgccagcggatctgaacctcaccagatgggaagcgacgtgcacgacctgaatgctctgttgcctgccgtgccatctcttggcggaggcggaggatgtgctttgcctgtttctggtgctgcccagtgggctcccgtgctggattttgctcctcctggcgcttctgcctatggctctcttggaggacctgctcctccaccagctccacctccaccgccgcctccaccacctcacagctttatcaagcaagagccctcctggggcggagccgagcctcacgaaaaacagtgtctgagcgccttcaccgtgcactttttcggccagtttaccggcaccgtgggcgcctgtagatacggcccttttggaccaccaccacctagccaggcttctagcggacaggccagaatgttccccaacgctccttacctgcctagctgcctggaaagccagcctaccatcagaaaccagggcttcagcaccgtgaccttcgacggcatgcctagctatggccacacaccatctcaccacgccgctcagttccccaatcacagcttcaagcacgaggaccctatgggccagcagggatctctgggagagcagcagtatagcgtgccacctcctgtgtacggctgtcacacccctaccgatagctgcacaggcaatcaggctctgctgctgaggatgcctttcagcagcgacaacctgtaccagatgacaagccagctggaatgcatgatttggaaccagatgaacctgggcgccactctgaaaggcgtggccgctggatctagcagctccgtgaaatggacagccggccagagcaatcactccaccggctacgagagcgacaatcacaccatgcctatcctgtgtggggcccagtaccggattcacacacacggcgtgttcaggggcattcaggatgtgcgaagagtgcctggcgtggcccctacacttgtgggatctgccagcgaaaccagcgagaagcaccccttcatgtgcgcctatccaggctgcaacaagcggtacttcaagctgagccacctgaagatgcacagccggaagcacacaggcgagaagctgtaccagtgcgacttcaaggactgcgagcggagattcagctgcagcgaccagctgaagagacaccagagaaggcacaccggcgtgaagccctttcagtgcaagacctgccagcggaccttctcctggtccaaccacctgaaaacccacacaagaacccacaccggcaagaccatcgagaagcccttcagctgtagatggcccagctgccagaagaagttcgcccggtctaacgagctggtgcatcaccacaacatgcaccagaggaacatgaccaaactgcagctggtgctgaggggaagaaagaggcggtccaccgagtacaagctggtggttgttggagccgatggcgtgggaaagagcgccctgacaattcagctgatccagaaccacttcgtgcgcggcagaaagagaagatctacagagtataagctcgtggtcgtgggcgctgtcggagtgggaaaatctgccctgaccatccaactcattcagaatcactttgtgtgatga(SEQ ID NO: 49)
modTBXT_WT1_(KRAS 突變 ) MSSPGTESAGKSLQYRVDHLLSAVENELQAGSEKGDPTEHELRVGLEESELWLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSFLLDFVVADNHRWKYVNGEWVPGGKPQLQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYEPRIHIVRVGGPQRMITSHCFPETQFIAVTAYQNEEITTLKIKYNPFAKAFLDAKERSDHKEMIKEPGDSQQPGYSQWGWLLPGTSTLCPPANPHSQFGGALSLSSTHSYDRYPTLRSHRSSPYPSPYAHRNNSPTYSDNSPACLSMLQSHDNWSSLRMPAHPSMLPVSHNASPPTSSSQYPSLWSVSNGAVTLGSQAAAVSNGLGAQFFRGSPAHYTPLTHPVSAPSSSGFPMYKGAAAATDIVDSQYDAAAQGHLIASWTPVSPPSMRGRKRRSDFLLLQNPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAECLQGRRSRGASGSEPHQMGSDVHDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEKQCLSAFTVHFFGQFTGTVGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPTIRNQGFSTVTFDGMPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGNQALLLRMPFSSDNLYQMTSQLECMIWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTAGQSNHSTGYESDNHTMPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVGSASETSEKHPFMCAYPGCNKRYFKLSHLKMHSRKHTGEKLYQCDFKDCERRFSCSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRTFSWSNHLKTHTRTHTGKTIEKPFSCRWPSCQKKFARSNELVHHHNMHQRNMTKLQLVLRGRKRRSTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVRGRKRRSTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFV(SEQ ID NO: 50)
modWT1-modFBP atggactttctgctgctgcagaaccctgccagcacctgtgttccagaacctgcctctcagcacaccctgagatctggccctggatgtctccagcagcctgaacagcagggcgttagagatcctggcggaatctgggccaaactgggagccgctgaagcctctgccgaatgtctgcagggcagaagaagcagaggcgccagcggatctgaacctcaccagatgggaagcgacgtgcacgacctgaatgctctgctgcctgccgtgccatctcttggcggaggcggaggatgtgctttgcctgtttctggtgctgcccagtgggctcccgtgctggattttgctcctcctggcgcttctgcctatggctctcttggaggacctgctcctccaccagctccacctccaccgccgcctccaccacctcacagctttatcaagcaagagccctcctggggcggagccgagcctcacgaaaaacagtgtctgagcgccttcaccgtgcactttttcggccagtttaccggcacagtgggcgcctgtagatacggcccttttggaccaccaccacctagccaggctagctctggacaggccagaatgttccccaacgctccctacctgcctagctgcctggaaagccagcctaccatcagaaaccagggcttcagcaccgtgaccttcgacggcatgcctagctatggccacacaccatctcaccacgccgctcagttccccaatcacagcttcaagcacgaggaccctatgggccagcagggatctctgggagagcagcagtatagcgtgccacctcctgtgtacggctgtcacacccctaccgatagctgcacaggcaatcaggccctgctgctgaggatgcccttcagcagcgacaacctgtaccagatgacaagccagctggaatgcatgatctggaaccagatgaacctgggcgccacactgaaaggcgtggccgctggatctagcagcagcgtgaaatggacagccggccagagcaatcactccaccggctacgagtccgacaaccacaccatgcctattctgtgcggagcccagtacagaatccacacacacggcgtgttccggggcattcaggatgtgcgaagagtgcctggcgtggcccctacacttgtgggatctgcctctgagacaagcgagaagcaccccttcatgtgcgcctatcctggctgcaacaagcggtacttcaagctgagccacctgaagatgcacagccggaagcacacaggcgagaagctgtaccagtgcgacttcaaggactgcgagcggagattcagctgcagcgaccagctgaagagacaccagagaaggcacaccggcgtgaagcccttccagtgcaagacctgccagcggacctttagctggtccaaccacctgaaaacccacacaagaacccacaccggcaagaccatcgagaagcctttcagctgtagatggcccagctgccagaagaagttcgcccggtctaacgagctggtgcatcaccacaacatgcaccagaggaacatgaccaaactgcagctggtgctgaggggaagaaagcggagaagcgcccagagaatgaccacacagttgctgctgctcctcgtgtgggttgccgttgtgggagaagtgcagaccagaatcgcctgggccagaaccgagctgctgaacgtgtgcatgaacgccaagcaccacaagaagaagcccgatcctgaggacaagctgcacgagcagtgtcggccttggagaaagaacgcctgctgtagcaccaacaccagccaagaggcccacaagaacgtgtcctacctgtaccggttcaactggaaccactgcggcgagatgacacccgcctgcaagagacacttcatccaggatacctgcctgtacgagtgcagccccaatctcggcccctggattcagcaagtggaccagagctggcggaaagaactggtcctgaatgtgcccctgtgcaaagaggattgcgagcagtggtgggaagattgcagaaccagctacacatgcaagagcaactggcacaaaggctggaactggaccagcggcttcaacaagtgtgccgtgggagctgcctgtcagcctttccacttctactttcacacacccaccgtgctgtgcaacaagatctggacccacagctacaaggtgtccaactacagcagaggcagcggccggtgtatccagatgtggttcgatcccgccaagggcaaccccaatgaggaagtggccagattctacgccgctgccatgtctggtgcaggaccttgggctgcttggccctttctgctttcactggccctgatgctgctgtggctgctgagctgataa(SEQ ID NO: 51)
modWT1-modFBP MDFLLLQNPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAECLQGRRSRGASGSEPHQMGSDVHDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEKQCLSAFTVHFFGQFTGTVGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPTIRNQGFSTVTFDGMPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGNQALLLRMPFSSDNLYQMTSQLECMIWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTAGQSNHSTGYESDNHTMPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVGSASETSEKHPFMCAYPGCNKRYFKLSHLKMHSRKHTGEKLYQCDFKDCERRFSCSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRTFSWSNHLKTHTRTHTGKTIEKPFSCRWPSCQKKFARSNELVHHHNMHQRNMTKLQLVLRGRKRRSAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEVQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKKKPDPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKNVSYLYRFNWNHCGEMTPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKELVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFHTPTVLCNKIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAKGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS(SEQ ID NO: 52)
modPSMA-modTDGF1 atgtggaatctgctgcacgagacagatagcgccgtggctaccgttagaaggcccagatggctttgtgctggcgctctggttctggctggcggcttttttctgctgggcttcctgttcggctggttcatcaagagcagcaacgaggccaccaacatcacccctaagcacaacatgaaggcctttctggacgagctgaaggccgagaatatcaagaagttcctgtacaacttcacgcacatccctcacctggccggcaccgagcagaattttcagctggccaagcagatccagagccagtggaaagagttcggcctggactctgtggaactggcccactacgatgtgctgctgagctaccccaacaagacacaccccaactacatcagcatcatcaacgaggacggcaacgagatcttcaacaccagcctgttcgagcctccacctcctggctacgagaacgtgtccgatatcgtgcctccattcagcgctttcagcccacagcggatgcctgagggctacctggtgtacgtgaactacgccagaaccgaggacttcttcaagctggaatgggacatgaagatcagctgcagcggcaagatcgtgatcgcccggtacagaaaggtgttccgcgagaacaaagtgaagaacgcccagctggcaggcgccaaaggcgtgatcctgtatagcgaccccgccgactattttgcccctggcgtgaagtcttaccccgacggctggaattttcctggcggcggagtgcagcggcggaacatccttaatcttaacggcgctggcgaccctctgacacctggctatcctgccaatgagtacgcctacagacacggaattgccgaggctgtgggcctgccttctattcctgtgcaccctgtgcggtactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggaagcgcccctcctgactcttcttggagaggctctctgaaggtgccctacaatgtcggcccaggcttcaccggcaacttcagcacccagaaagtgaaaatgcacatccacagcaccaacgaagtgacccggatctacaacgtgatcggcacactgagaggcgccgtggaacccgacaaatacgtgatcctcggcggccacagagacagctgggtgttcggaggaatcgaccctcaatctggcgccgctgtggtgtatgagatcgtgcggtctttcggcaccctgaagaaagaaggatggcggcccagacggaccatcctgtttgcctcttgggacgccgaggaatttggcctgctgggatctacagagtgggccgaagagaacagcagactgctgcaagaaagaggcgtggcctacatcaacgccgacagcagcatcgagggcaactacaccctgcggatcgattgcacccctctgatgtacagcctggtgcacaacctgaccaaagagctgaagtcccctgacgagggctttgagggcaagagcctgtacaagagctggaccaagaagtccccatctcctgagttcagcggcatgcccagaatctctaagctggaaagcggcaacaacttcgaggtgttcttccagcggctgggaatcgcctctggaatcgccagatacaccaagaactgggagacaaacaagttctccggctatcccctgtaccacagcgtgtacgagacatacgagctggtggaaaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgacagtggcccaagtgcgcggaggcatggtgttcgaactggccaatagcatcgtgctgcccttcaactgcagagactacgccgtggtgctgcggaagtacgccgacaagatctacagcatcagcatgaagcacccgcaagagatgaagacctacagcgtgtccttcgactccctgttcttcgccgtgaagaacttcaccaagatcgccagcaagttcagcgagcggctgcaggacttcgacaagagcaaccctatcgtgctgaggatgatgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcatcaaccctctgggactgcccgacagacccttctacaggcacgtgatctgtgcccctagcagccacaacaaatacgccggcgagagcttccccggcatctacgatgccctgttcgacatcgagagcaacgtgaaccctagcaaggcctggggcgaagtgaagagacagatctacgtggccgcattcacagtgcaggccgctgccgaaacactgtctgaagtggccagaggccggaagagaagatccgactgcagaaagatggcccggttcagctactccgtgatctggatcatggccatctccaaggccttcgagctgagactggttgccggactgggccaccaagagtttgccagacctagctggggctatctggccttccgggacgatagcatctggccccaagaggaacctgccatcagacccagatctagccagcgggtgccacctatggaaatccagcacagcaaagaactgaaccggacctgctgcctgaacggcagaacctgtatgctgggcagcttctgcgcctgtcctcctagcttctacggccggaattgcgagcacgacgtgcggaaagaaaactgcggcagcgtgccacacgatacctggctgcctaagaaatgcagcctgtgcaagtgttggcacggccagctgcggtgtttccccagagcttttctgcccgtgtgtgacggcctggtcatggatgaacacctggtggccagcagaacccctgagcttcctccaagcgccaggaccaccacctttatgctcgtgggcatctgcctgagcatccagagctactactgatga(SEQ ID NO: 53)
modPSMA-modTDGF1 MWNLLHETDSAVATVRRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTHIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQRMPEGYLVYVNYARTEDFFKLEWDMKISCSGKIVIARYRKVFRENKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNFPGGGVQRRNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRHGIAEAVGLPSIPVHPVRYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDKYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVYEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRIDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYKSWTKKSPSPEFSGMPRISKLESGNNFEVFFQRLGIASGIARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFNCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFFAVKNFTKIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFINPLGLPDRPFYRHVICAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESNVNPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVARGRKRRSDCRKMARFSYSVIWIMAISKAFELRLVAGLGHQEFARPSWGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMEIQHSKELNRTCCLNGRTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPRAFLPVCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY(SEQ ID NO: 54)
modWT1-mod 緊密連接蛋白 18 atggactttctgctgctgcagaaccctgccagcacctgtgttccagaacctgcctctcagcacaccctgagatctggccctggatgtctccagcagcctgaacagcagggcgttagagatcctggcggaatctgggccaaactgggagccgctgaagcctctgccgaatgtctgcagggcagaagaagcagaggcgccagcggatctgaacctcaccagatgggaagcgacgtgcacgacctgaatgctctgctgcctgccgtgccatctcttggcggaggcggaggatgtgctttgcctgtttctggtgctgcccagtgggctcccgtgctggattttgctcctcctggcgcttctgcctatggctctcttggaggacctgctcctccaccagctccacctccaccgccgcctccaccacctcacagctttatcaagcaagagccctcctggggcggagccgagcctcacgaaaaacagtgtctgagcgccttcaccgtgcactttttcggccagtttaccggcacagtgggcgcctgtagatacggcccttttggaccaccaccacctagccaggctagctctggacaggccagaatgttccccaacgctccctacctgcctagctgcctggaaagccagcctaccatcagaaaccagggcttcagcaccgtgaccttcgacggcatgcctagctatggccacacaccatctcaccacgccgctcagttccccaatcacagcttcaagcacgaggaccctatgggccagcagggatctctgggagagcagcagtatagcgtgccacctcctgtgtacggctgtcacacccctaccgatagctgcacaggcaatcaggccctgctgctgaggatgcccttcagcagcgacaacctgtaccagatgacaagccagctggaatgcatgatctggaaccagatgaacctgggcgccacactgaaaggcgtggccgctggatctagcagcagcgtgaaatggacagccggccagagcaatcactccaccggctacgagtccgacaaccacaccatgcctattctgtgcggagcccagtacagaatccacacacacggcgtgttccggggcattcaggatgtgcgaagagtgcctggcgtggcccctacacttgtgggatctgcctctgagacaagcgagaagcaccccttcatgtgcgcctatcctggctgcaacaagcggtacttcaagctgagccacctgaagatgcacagccggaagcacacaggcgagaagctgtaccagtgcgacttcaaggactgcgagcggagattcagctgcagcgaccagctgaagagacaccagagaaggcacaccggcgtgaagcccttccagtgcaagacctgccagcggacctttagctggtccaaccacctgaaaacccacacaagaacccacaccggcaagaccatcgagaagcctttcagctgtagatggcccagctgccagaagaagttcgcccggtctaacgagctggtgcatcaccacaacatgcaccagaggaacatgaccaaactgcagctggtgctgaggggaagaaagcggagatctgccgtgacagcctgtcagagcctgggctttgtggtgtccctgatcgagatcgtgggcatcattgccgctacctgcatggaccagtggtctacccaggacctgtacaacaaccctgtgaccgccgtgttcaactaccaaggcctgtggcacagctgcatgagagagagcagcggcttcaccgagtgcagaggctacttcaccctgctggaactgcctgccatgctgcaggctgtgcaggcccttatgatcgtgggaattgtgctgggagccatcggcctgctggtgtccattttcgccctgaagtgcatccggatcggcagcatggaagatagcgccaaggccaacatgaccctgaccagcggcatcatgttcatcgtgtccggcctgtgcgccattgctggcgtgtccgtgtttgccaatatgctcgtgaccaacttctggctgagcaccgccaacatgtacaccggcatgggcgagatggtgcagaccgtgcagacacggtacacatttggcgccgctctgtttgtcggatgggttgcaggcggactgacactgattggcggcgtgatgatgtgtatcgcctgcagaggactggcccctgaggaaacaaactacaaggccgtgtactaccacgcctccggacacagcgtggcatacaaacctggcggctttaaggccagcaccggcttcggcagcaacaccaagaacaagaagatctacgacggcggagcacacaccgaggatgaggtgcagagctaccccagcaagcacgactacgtgtgatga(SEQ ID NO: 55)
modWT1-mod 緊密連接蛋白 18 MDFLLLQNPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAECLQGRRSRGASGSEPHQMGSDVHDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEKQCLSAFTVHFFGQFTGTVGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPTIRNQGFSTVTFDGMPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGNQALLLRMPFSSDNLYQMTSQLECMIWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTAGQSNHSTGYESDNHTMPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVGSASETSEKHPFMCAYPGCNKRYFKLSHLKMHSRKHTGEKLYQCDFKDCERRFSCSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRTFSWSNHLKTHTRTHTGKTIEKPFSCRWPSCQKKFARSNELVHHHNMHQRNMTKLQLVLRGRKRRSAVTACQSLGFVVSLIEIVGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWHSCMRESSGFTECRGYFTLLELPAMLQAVQALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWLSTANMYTGMGEMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVYYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGAHTEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO: 56)
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modPSMA-modLY6K MWNLLHETDSAVATVRRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTHIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQRMPEGYLVYVNYARTEDFFKLEWDMKISCSGKIVIARYRKVFRENKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNFPGGGVQRRNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRHGIAEAVGLPSIPVHPVRYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDKYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVYEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRIDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYKSWTKKSPSPEFSGMPRISKLESGNNFEVFFQRLGIASGIARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFNCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFFAVKNFTKIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFINPLGLPDRPFYRHVICAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESNVNPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVARGRKRRSALLALLLVVALPRVWTDANLTVRQRDPEDSQRTDDGDNRVWCHVCERENTFECQNPRRCKWTEPYCVIAAVKIFPRFFMVVKQCSAGCAAMERPKPEEKRFLLEEPMLFFYLKCCKICYCNLEGPPINSSVLKEYAGSMGESCGGLWLAILLLLASIAASLSLS(SEQ ID NO: 58)
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modBORIS MAATEISVLSEQFTKIKELKLMLEKGLKKEEKDGVCREKNHRSPSELEAQRTSGAFQDSILEEEVELVLAPLEESKKYILTLQTVHFTSEAVQLQDMSLLSIQQQEGVQVVVQQPGPGLLWLQEGPRQSLQQCVAISIQQELYSPQEMEVLQFHALEENVMVAIEDSKLAVSLAETTGLIKLEEEQEKNQLLAEKTKKQLFFVETMSGDERSDEIVLTVSNSNVEEQEDQPTACQADAEKAKFTKNQRKTKGAKGTFHCNVCMFTSSRMSSFNCHMKTHTSEKPHLCHLCLKTFRTVTLLWNYVNTHTGTRPYKCNDCNMAFVTSGELVRHRRYKHTHEKPFKCSMCKYASMEASKLKCHVRSHTGEHPFQCCQCSYASRDTYKLKRHMRTHSGEKPYECHICHTRFTQSGTMKIHILQKHGKNVPKYQCPHCATIIARKSDLRVHMRNLHAYSAAELKCRYCSAVFHKRYALIQHQKTHKNEKRFKCKHCSYACKQERHMIAHIHTHTGEKPFTCLSCNKCFRQKQLLNAHFRKYHDANFIPTVYKCSKCGKGFSRWINLHRHLEKCESGEAKSAASGKGRRTRKRKQTILKEATKSQKEAAKRWKEAANGDEAAAEEASTTKGEQFPEEMFPVACRETTARVKQEVDQGVTCEMLLNTMDK(SEQ ID NO: 60)
mod 間皮素 atggcattgcctacagctagacctctgctgggcagctgtggaacaccagctctgggaagcctgctgtttctgctgttcagcctcggatgggtgcagccttctagaacactggccggcgagacaggacaagaagctgctcctcttgacggcgtgctggccaatcctcctaatatcagctctctgagccccagacagctgctcggctttccttgtgccgaagtgtctggcctgagcaccgagagagtgtgggaacttgctgtggccctggctcagaaaaacgtgaagctgagcacagagcagctgagatgtctggcccaccagctgagtgaacctccagaggatctggatgccctgcctctggacctgctgctgttcctgaatcctgacgcctttagcggccctcaggcctgcaccagattcttcagcagaatcaccaaggccaatgtggatctgctgcccagaggcgcccctgagagacaaagacttctgcctgctgctctggcctgttggggcgttagaggatctctgctgtctgaggccgatgtgctggctcttggaggcctggcttgtaacctgcctggcagatttgtggccgagtctgctgaggtgctgctgcctagactggtgtcctgtcctggacctctggatcaggaccagcaagaagccgctagagctgcacttcaaggcggcggacctccttatggacctcctctgacttggagcgtgtccaccatggacgctctgagaggactgctgcctgttctgggccagcctatcatccggtctatccctcagggaattgtggccgcttggcggcagagaagcttcagagatccctcttggagacagcccaagcagaccatcctgtggcctcggttcagatgggaagtcgagaaaaccgcctgtcctagcggcaagaaggccagagagatcgacgagagcctgatcttctacaagaagtgggaactcgaggcctgcgtggacgctgctctgctggctacacagatggacagagtgaacgctatccccttcacctatgagcagctggacgtgctgaagcacaagctggatgagctgtaccctcagggctaccccgagtctgtgattcagcacctgggctacctgtttctgaagatgagccccgaggacatccggaagtggaacgtgaccagcctggaaaccctgaaggccctgctggaagtgaacaagggccacgagatgtccccacaggctcctagaaggcctctgcctcaagtggccacactgatcgacagattcgtgaaaggcaggggccagctggacaaggacaccctggatacactgaccgccttctatcccggctatctgtgcagcctgtctcctgaggaactgtcctctgtgcctcctagctctatttgggctgtgcggcctcaggacctggatacctgtgatcctagacagctggatgtcctgtatcctaaggctcggctggccttccagaacatgaacggcagcgagtacttcgtgaagatccagttcttccttggcggcgctcccaccgaggatctgaaagctctgtcccagcagaatgtgtctatggacctggccacctttatgaagctgcggaccgatgctgtgctgcctctgacagtggccgaggtgcaaaaactgctgggccctcatgtggaaggactgaaggccgaagaacggcacagacccgtcagagactggattctgagacagcggcaggacgacctggacacactggaacttggactgcaaggcggcatccccaatggctacctggtgctggatctgagcgtgcaagaggccctctctggcacaccttgtttgctcggacctggaccagtgctgacagtgttggctctgctgctggcctctacactggcctgataa(SEQ ID NO: 61)
mod 間皮素 MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVWELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHQLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVLALGGLACNLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPLTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSFRDPSWRQPKQTILWPRFRWEVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQFFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLELGLQGGIPNGYLVLDLSVQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA(SEQ ID NO: 62)
modFAP-mod 緊密連接蛋白 18 cctgaacgtgaccttcagctacaagatattcttccccaactggatctccggccaagagtacctgcaccagagcgccgacaacaacatcgtgctgtacaacatcgagacaggccagagctacaccatcatgagcaaccggaccatgaagtccgtgaacgccagcaactacggactgagccccgattggcagttcgtgtacctggaaagcgactacagcaagctgtggcggtacagctacaccgccacctactacatctacgacctgagcaacggcgagttcgtgaagggcaacgagctgccccatcctatccagtacctgtgttggagccctgtgggctccaagctggcctacgtgtaccagaacaacatctacctgaagcagcggcctggcgaccctccattccagatcaccttcaacggcagagagaacaagatctttaacggcatccccgactgggtgtacgaggaagagatgctggccaccaaatacgccctgtggtggtcccctaacggcaagtttctggcctatgccgacttcaacgacacagacatccccgtgatcgcctacagctactacggcaatgagcagtaccccaggaccatcaacatcagctaccccaaagccggcgctaagaaccctgtcgtgcggatcttcatcatcgacaccacctatcctgtgtacgtgggccctcaagaggtgccagtgcctgccatgattgccagcagcgactactacttcagctggctgacctgggtcaccgacgagcgagtttgtctgcagtggctgaagcgggtgcagaacatcagcgtgctgagcatctgcgacttcagaaaggactggcagacatgggactgccccaacacacagcagcacatcgaggaaagcagaaccggctgggctggcggcttctttgtgtctacccctgtgttcagctacgacgccatcctgtactataagatcttcagcgacaaggacggctacaagcacatccactacatcaagtacaccgtcgagaacgtgatccagattaccagcggcaagtgggaagccatcaatatcttcagagtgatccagtacagcctgttctacagcagcaacgagttcgaggaataccccggcagacggaacatctacagaatcagcatcggcagctacccgcctagcaagaaatgcgtgacctgccacctgagaaaagagcggtgccagtactacacagccagcttctccaactacgccaagtactacgccctcgtgtgttacggccctggcatccctatcagcacactgcacgatggcagaaccgaccaagagatcaagatcctggaagaaaacaaagagctggaaaacgccctgaagaacatccagctgcctaaagaggaaatcaagaagctggaagtcgacgagatcaccctgtggtacaagatgatcctgcctcctcagttcgaccggtccaagaagtaccctctgctgatccaggtgtacggcggaccttgttctcagtctgtgcgctccgtgttcgccgtgaattggatcagctatctggccagcaaagaaggcatggttatcgccctggtggacggcagaggcacagcttttcaaggcgacaagctgctgtacgccgtgtatcagaaactgggcgtgtacgaagtggaagatcagatcaccgccgtgcggaagttcatcgagatgggcttcatcgacgagaagcggatcgccatctggggctggtcttacggcggctatattagctctctggccctggcctctggcaccggcctgtttaagtgtggaattgccgtggctcccgtgtccagctgggagtactataccagcgtgtacaccgagcggttcatgggcctgcctaccaaggacgacaacctggaacactacaagaactctaccgtgatggccagagccgagtacttccggaacgtggactacctgctgattcacggcaccgccgacgacaacgtgcacttccaaaacagcgcccagatcgctaaggccctcgtgaatgcccaggtggactttcaggccatgtggtacagcgaccagaaccacggactgtctggcctgagcaccaaccacctgtacacccacatgacccactttctgaaacagtgcttcagcctgagcgaccggggcagaaagagaagatctgccgtcacagcctgtcagagcctgggctttgtggtgtccctgatcgagatcgtgggcatcattgccgctacctgcatggaccagtggtctacccaggacctgtataacaaccccgtgaccgccgtgttcaactaccaaggcctgtggcacagctgcatgagagagagcagcggcttcaccgagtgcaggggctactttaccctgctggaactgccagccatgctgcaggctgtgcaggcccttatgatcgtgggaattgtgctgggcgccatcggcctgctggtgtctatttttgccctgaagtgcatccggatcggcagcatggaagatagcgccaaggccaacatgaccctgacctccggcatcatgttcatcgtgtccggcctgtgtgccattgcaggcgtgtccgtgtttgccaatatgctcgtgaccaacttctggctgtccaccgccaacatgtacaccggcatgggcgagatggtgcagaccgtgcagacacggtacacatttggcgccgctctgtttgtcggatgggttgcaggcggactgactctgattggcggcgtgatgatgtgtatcgcctgcagaggactggcccctgaggaaacaaactacaaggccgtgtactaccacgccagcggacacagcgtggcatacaaaccaggcggctttaaggccagcacaggcttcggcagcaacaccaagaacaagaagatctacgacggcggagcccataccgaggatgaggtgcagagctaccctagcaagcacgactacgtgtgatga(SEQ ID NO: 63)
modFAP-mod 緊密連接蛋白 18 MKTLVKIVFGVATSAVLALLVMCIVLHPSRVHNSEENTMRALTLKDILNVTFSYKIFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTIMSNRTMKSVNASNYGLSPDWQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVKGNELPHPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYADFNDTDIPVIAYSYYGNEQYPRTINISYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPVYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNISVLSICDFRKDWQTWDCPNTQQHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAILYYKIFSDKDGYKHIHYIKYTVENVIQITSGKWEAINIFRVIQYSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSNYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYQKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYISSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYTSVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDRGRKRRSAVTACQSLGFVVSLIEIVGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWHSCMRESSGFTECRGYFTLLELPAMLQAVQALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWLSTANMYTGMGEMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVYYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGAHTEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO: 64)
modPRAME-modTBXT atggaaagaagaaggctctggggcagcatccagagccggtacatcagcatgagcgtgtggacaagccctcggagactggtggaactggctggacagagcctgctgaaggatgaggccctggccattgctgctctggaactgctgcctagagagctgttccctcctctgttcatggccgccttcgacggcagacacagccagacactgaaagccatggtgcaggcctggcctttcacctgtctgcctctgggagtgctgatgaagggccagcatctgcacctggaaaccttcaaggccgtgctggatggcctggatgtgctgctggctcaagaagtgcggcctcggcgttggaaactgcaggttctggatctgctgaagaacagccaccaggatttctggaccgtttggagcggcaacagagccagcctgtacagctttcctgagcctgaagccgctcagcccatgaccaagaaaagaaaggtggacggcctgagcaccgaggccgagcagccttttattcccgtggaagtgctggtggacctgttcctgaaagaaggcgcctgcgacgagctgttcagctacctgaccgagaaagtgaagcagaagaagaacgtcctgcacctgtgctgcaagaagctgaagatctttgccatgcctatgcaggacatcaagatgatcctgaagatggtgcagctggacagcatcgaggacctggaagtgacctgtacctggaagctgcccacactggccaagttctttagctacctgggccagatgatcaacctgcggagactgctgctgagccacatccacgccagctcctacatcagccccgagaaagaggaacagtacatctcccagttcacctctcagtttctgagcctgcagtgtctgcaggccctgtacgtggacagcctgttcttcctgagaggcaggctggaccagctgctgagacacgtgatgaaccctctggaaaccctgagcatcaccaactgcagactgctggaaggcgacgtgatgcacctgtctcagagcccatctgtgtcccagctgagcgtgctgtctctgtctggcgtgatgctgaccgatgtgtcccctgaacctctgcaggcactgctgaaaaaggccagcgccactctgcaggacctggtgtttgatgagtgcggcatcatggacgaccagctgtttgccctgctgccaagcctgagccactgtagccaactgaccacactgagcttctacggcaacagcatctacatctctgccctgcagagcctcctgcagcacctgatcggactgagcaatctgacccacgtgctgtacccagtgctgctcgagagctacgaggacatccacgtgaccctgcaccaagagagactggcctatctgcatgcccggctgagagaactgctgtgcgaactgggcagacccagcatggtttggctgagcgctaatctgtgccctcactgcggcgacagaaccttctacgaccccaagctgatcatgtgcccctgcttcatgcccaaccggggcagaaagagaagaagctctagccctggcacagagagcgccggaaagtccctgcagtacagagtggatcatctgctgagcgccgtggaaaacgaactgcaggccggatctgagaagggcgatcctacagagcacgagctgagagtcggcctggaagagtctgagctgtggctgcggttcaaagaactgaccaacgagatgatcgtcaccaagaacggcagacggatgttccccgtgctgaaagtgaacgtgtccggactggaccccaacgccatgtatagctttctgctggacttcgtggtggccgacaaccacagatggaaatacgtgaacggcgagtgggtgccaggcggaaaacctcaactgcaagcccctagctgcgtgtacattcaccctgacagccccaatttcggcgcccactggatgaaggcccctgtgtcctttagcaaagtcaagctgaccaacaagctgaacggcggaggccagatcatgctgaactccctgcacaaatacgagcccagaatccacatcgtcagagtcggcggaccccagagaatgatcaccagccactgcttccccgagacacagtttatcgccgtgaccgcctaccagaacgaggaaatcacaaccctgaagatcaagtacaaccccttcgccaaggccttcctggacgccaaagagcggagcgaccacaaagaaatgatcaaagagcccggcgactcccagcagccaggctattctcaatggggatggctgctgccaggcaccagcacattgtgccctccagccaatcctcacagccagtttggaggcgctctgtccctgagcagcacacacagctacgacagataccccacactgcggagccacagaagcagcccctatccttctccttacgctcaccggaacaacagccccacctacagcgataatagccccgcctgtctgagcatgctgcagtcccacgataattggagcagcctgcggatgcctgctcacccttctatgctgcccgtgtctcacaacgcctctccacctacaagcagctctcagtaccccagcctttggagcgtgtccaatggcgctgtgacactgggatctcaggccgctgctgtgtctaatggactgggagcccagttcttcagaggcagccctgctcactacacccctctgacacatcctgtgtcagccccttctagcagcggcttccctatgtacaaaggcgccgctgccgccaccgatatcgtggattctcagtacgatgccgccgctcagggccacctgattgcatcttggacacctgtgtctccaccttccatgtgatga(SEQ ID NO: 65)
modPRAME-modTBXT MERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVELAGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKAVLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDLLKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAEQPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLTEKVKQKKNVLHLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLEVTCTWKLPTLAKFFSYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYISQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFLRGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLLEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLKKASATLQDLVFDECGIMDDQLFALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSIYISALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVLLESYEDIHVTLHQERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANLCPHCGDRTFYDPKLIMCPCFMPNRGRKRRSSSPGTESAGKSLQYRVDHLLSAVENELQAGSEKGDPTEHELRVGLEESELWLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSFLLDFVVADNHRWKYVNGEWVPGGKPQLQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYEPRIHIVRVGGPQRMITSHCFPETQFIAVTAYQNEEITTLKIKYNPFAKAFLDAKERSDHKEMIKEPGDSQQPGYSQWGWLLPGTSTLCPPANPHSQFGGALSLSSTHSYDRYPTLRSHRSSPYPSPYAHRNNSPTYSDNSPACLSMLQSHDNWSSLRMPAHPSMLPVSHNASPPTSSSQYPSLWSVSNGAVTLGSQAAAVSNGLGAQFFRGSPAHYTPLTHPVSAPSSSGFPMYKGAAAATDIVDSQYDAAAQGHLIASWTPVSPPSM(SEQ ID NO: 66)
HPV16/18 E6/E7 atgcaccagaaacggaccgccatgtttcaggaccctcaagagaggcccagaaagctgcctcacctgtgtaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggaatgcgtgtactgcaagcagcagctcctgcggagagaggtgtacgatttcgccttccgggacctgtgcatcgtgtacagagatggcaacccctacgccgtgtgcaacaagtgcctgaagttctacagcaagatcagcgagtaccgctactactgctacagcgtgtacggcaccacactggaacagcagtacaacaagcccctgtgcgacctgctgatccggtgcatcaactgccagaaacctctgtgccccgaggaaaagcagcggcacctggacaagaagcagcggttccacaacatcagaggccggtggaccggcagatgcatgagctgttgtcggagcagccggaccagaagagagacacagctgagaggccggaagagaagaagccacggcgatacccctacactgcacgagtacatgctggacctgcagcctgagacaaccgacctgtactgctacgagcagctgaacgacagcagcgaggaagaggacgagattgacggacctgccggacaggccgaacctgatagagcccactacaatatcgtgaccttctgctgcaagtgcaacagcaccctgagactgtgcgtgcagagcacccacgtggacatcagaaccctggaagatctgctgatgggcaccctgggaatcgtgtgccctatctgcagccagaagcctagaggcagaaagcggagaagcgccagattcgacgaccccaccagaaggccttacaagctgcctgatctgtgcactgaactgaacaccagcctgcaggacatcgagattacctgtgtgtattgcaagaccgtgctggaactgaccgaggtgttcgagtttgcctttaaggacctgttcgtggtgtaccgggacagcattcctcacgccgcctgccacaagtgcatcgacttctacagccggatcagagagctgcggcactacagcgattctgtgtacggggacaccctggaaaagctgaccaacaccggcctgtacaacctgctcatcagatgcctgcggtgtcagaagcccctgaatcctgccgagaagctgagacacctgaacgagaagcggagattccacaatatcgccggccactacagaggccagtgccacagctgttgcaaccgggccagacaagagagactgcagagaaggcgggaaacccaagtgcggggcagaaagagaagatctcacggccctaaggccacactgcaggatatcgtgctgcacctggaacctcagaacgagatccccgtggatctgctgtgccatgagcagctgtccgactccaaagaggaaaacgacgaaatcgacggcgtgaaccaccagcatctgcctgccagaagggccgaaccacagagacacaccatgctgtgcatgtgttgcaagtgcgaggcccggattgagctggtggtggaaagctctgccgacgacctgagagccttccagcagctgttcctgaacaccctgagcttcgtgtgtccttggtgcgccagccagcagtgataa(SEQ ID NO: 67)
HPV16/18 E6/E7 MHQKRTAMFQDPQERPRKLPHLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCNKCLKFYSKISEYRYYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLRGRKRRSHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCNSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPRGRKRRSARFDDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVRGRKRRSHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSKEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID NO: 68)
huPSMA atgtggaatctccttcacgaaaccgactcggctgtggccaccgcgcgccgcccgcgctggctgtgcgctggggcgctggtgctggcgggtggcttctttctcctcggcttcctcttcgggtggtttataaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctagcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaataagactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccagatatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagcttggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatcacagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggagggatggtgtttgagctagccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatgatgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatctatgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcctaa(SEQ ID NO: 69)
huPSMA MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA(SEQ ID NO: 70)
CD276 shRNA ccggtgctggagaaagatcaaacagctcgagctgtttgatctttctccagcatttttt(SEQ ID NO: 71)
modMAGEA1 atgtctctcgaacagagaagcctgcactgcaagcccgaggaagctctggaagctcagcaagaggctctgggccttgtgtgtgttcaggccgctgccagcagcttttctcctctggtgctgggcacactggaagaggtgccaacagccggctctaccgatcctcctcaatctcctcaaggcgccagcgcctttcctaccaccatcaacttcacccggcagagacagcctagcgagggctctagctctcacgaggaaaagggccctagcaccagctgcatcctggaaagcctgttccgggccgtgatcacaaagaaagtggccgacctcgtgggcttcctgctgctgaagtacagagccagagaacccgtgaccaaggccgagatgctggaaagcgtgatcaagaactacaagcactgcttcagcgagatcttcggcaaggccagcgagtctctgcagctcgtgtttggcatcgacgtgaaagaggccgatcctaccggccacagctacgtgttcgtgacatgtctgggcctgagctacgatggcctgctgggcgacaatcagattatgctgaaaaccggcttcctgatcatcgtgctggtcatgatcgccatggaaggctctcacgcccctaaagaggaaatctgggaagaactgagcgtgatggaagtgtacgacggcagagagcatagcgcctacggcgagcctagaaaactgctgacccaggacctggtgcaagagaagtacctcgagtacagacaggtgcccgacagcgaccctgccagatacgaatttctgtggggccctagagcactggccgagacaagctatgtgaaggtgctggaatacgtcatcaaggtgtccgccagagtgtgcttcttcttcccatctctgcgggaagccgctctgcgcgaagaggaagaaggcgtc(SEQ ID NO: 72)
modMAGEA1 MSLEQRSLHCKPEEALEAQQEALGLVCVQAAASSFSPLVLGTLEEVPTAGSTDPPQSPQGASAFPTTINFTRQRQPSEGSSSHEEKGPSTSCILESLFRAVITKKVADLVGFLLLKYRAREPVTKAEMLESVIKNYKHCFSEIFGKASESLQLVFGIDVKEADPTGHSYVFVTCLGLSYDGLLGDNQIMLKTGFLIIVLVMIAMEGSHAPKEEIWEELSVMEVYDGREHSAYGEPRKLLTQDLVQEKYLEYRQVPDSDPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEYVIKVSARVCFFFPSLREAALREEEEGV(SEQ ID NO: 73)
EGFRvIII ctggaagagaaaaagggcaactacgtggtcaccgaccactgc(SEQ ID NO: 74)
EGFRvIII LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO: 75)
hCMV pp65 gagtctagaggcagacggtgccctgagatgattagcgtgctgggccctatctctggccacgtgctgaaggccgtgttcagcagaggcgatacacctgtgctgccccacgagacaagactgctgcagacaggcatccatgtgcgggtgtcacagccaagcctgatcctggtgtctcagtacacccctgacagcaccccttgtcacagaggcgacaaccagctccaggtgcagcacacctactttaccggcagcgaggtggaaaacgtgtccgtgaacgtgcacaatcccaccggcagatccatctgtcccagccaagagcctatgagcatctacgtgtacgccctgcctctgaagatgctgaacatccccagcatcaatgtgcatcactacccctctgccgccgagcggaaacacagacatctgcctgtggccgatgccgtgattcacgcctctggaaagcagatgtggcaggccagactgacagtgtccggactggcttggaccagacagcagaaccagtggaaagaacccgacgtgtactacacctccgccttcgtgttccccacaaaggacgtggccctgagacacgttgtgtgcgcccatgaactcgtgtgcagcatggaaaacacccgggccaccaagatgcaagtgatcggcgaccagtacgtgaaggtgtacctggaatccttctgcgaggacgtgccaagcggcaagctgttcatgcacgtgaccctgggctccgatgtggaagaggacctgaccatgaccagaaatccccagcctttcatgcggcctcacgagagaaatggcttcaccgtgctgtgccccaagaacatgatcatcaagcccggcaagatcagccacatcatgctggatgtggccttcaccagccacgagcacttcggactgctgtgtcctaagagcatccccggcctgagcatcagcggcaacctgctgatgaatggccagcagatcttcctggaagtgcaggccattcgggaaaccgtggaactgagacagtacgaccctgtggctgccctgttcttcttcgacatcgatctgctgctccagagaggccctcagtacagcgagcacccaacctttaccagccagtacagaatccagggcaagctggaatatcggcacacctgggatagacacgatgagggtgctgcacagggcgacgatgatgtgtggacaagcggcagcgatagcgacgaggaactggtcaccaccgagagaaagacccctagagttacaggcggaggcgcaatggctggcgcttctacatctgccggacgcaagagaaagagcgcctcttctgccaccgcctgtacaagcggcgtgatgacaagaggcaggctgaaagccgagagcacagtggcccctgaggaagatacagacgaggacagcgacaacgagattcacaaccccgccgtgtttacctggcctccttggcaggctggcattctggctagaaacctggtgcctatggtggccacagtgcagggccagaacctgaagtaccaagagttcttctgggacgccaacgacatctaccggatcttcgccgaactggaaggcgtgtggcaaccagccgctcagcccaaaagacgcagacacagacaggacgctctgcccggaccttgtattgccagcacacccaagaaacaccggggc(SEQ ID NO: 76)
hCMV pp65 ESRGRRCPEMISVLGPISGHVLKAVFSRGDTPVLPHETRLLQTGIHVRVSQPSLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLQVQHTYFTGSEVENVSVNVHNPTGRSICPSQEPMSIYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHRHLPVADAVIHASGKQMWQARLTVSGLAWTRQQNQWKEPDVYYTSAFVFPTKDVALRHVVCAHELVCSMENTRATKMQVIGDQYVKVYLESFCEDVPSGKLFMHVTLGSDVEEDLTMTRNPQPFMRPHERNGFTVLCPKNMIIKPGKISHIMLDVAFTSHEHFGLLCPKSIPGLSISGNLLMNGQQIFLEVQAIRETVELRQYDPVAALFFFDIDLLLQRGPQYSEHPTFTSQYRIQGKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAMAGASTSAGRKRKSASSATACTSGVMTRGRLKAESTVAPEEDTDEDSDNEIHNPAVFTWPPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDANDIYRIFAELEGVWQPAAQPKRRRHRQDALPGPCIASTPKKHRG(SEQ ID NO: 77)
modTBXT atgtctagccctggaacagagtctgccggcaagagcctgcagtacagagtggaccatctgctgagcgccgtggaaaatgaactgcaggccggaagcgagaagggcgatcctacagagcacgagctgagagtcggcctggaagagtctgagctgtggctgcggttcaaagaactgaccaacgagatgatcgtgaccaagaacggcagacggatgttccccgtgctgaaagtgaacgtgtccggactggaccccaacgccatgtacagctttctgctggacttcgtggtggccgacaaccacagatggaaatacgtgaacggcgagtgggtgccaggcggaaaacctcaactgcaagcccctagctgcgtgtacattcaccctgacagccccaatttcggcgcccactggatgaaggcccctgtgtccttcagcaaagtgaagctgaccaacaagctgaacggcggaggccagatcatgctgaacagcctgcacaaatacgagcccagaatccacatcgtcagagtcggcggaccccagagaatgatcaccagccactgcttccccgagacacagtttatcgccgtgaccgcctaccagaacgaggaaatcaccacactgaagatcaagtacaaccccttcgccaaggccttcctggacgccaaagagcggagcgaccacaaagagatgatcaaagagcccggcgacagccagcagccaggctattctcaatggggatggctgctgccaggcaccagcacattgtgccctccagccaatcctcacagccagtttggaggcgccctgagcctgtctagcacccacagctacgacagataccccacactgcggagccacagaagcagcccctatccttctccttacgctcaccggaacaacagccccacctacagcgataatagccccgcctgtctgagcatgctgcagtcccacgataactggtccagcctgagaatgcctgctcacccttccatgctgcccgtgtctcacaatgcctctccacctaccagcagctctcagtaccctagcctttggagcgtgtccaatggcgccgtgacactgggatctcaggcagccgctgtgtctaatggactgggagcccagttcttcagaggcagccctgctcactacacccctctgacacatcctgtgtctgcccctagcagcagcggcttccctatgtataagggcgctgccgccgctaccgacatcgtggattctcagtatgatgccgccgcacagggacacctgatcgcctcttggacacctgtgtctccaccttccatg(SEQ ID NO: 78)
modTBXT MSSPGTESAGKSLQYRVDHLLSAVENELQAGSEKGDPTEHELRVGLEESELWLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSFLLDFVVADNHRWKYVNGEWVPGGKPQLQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYEPRIHIVRVGGPQRMITSHCFPETQFIAVTAYQNEEITTLKIKYNPFAKAFLDAKERSDHKEMIKEPGDSQQPGYSQWGWLLPGTSTLCPPANPHSQFGGALSLSSTHSYDRYPTLRSHRSSPYPSPYAHRNNSPTYSDNSPACLSMLQSHDNWSSLRMPAHPSMLPVSHNASPPTSSSQYPSLWSVSNGAVTLGSQAAAVSNGLGAQFFRGSPAHYTPLTHPVSAPSSSGFPMYKGAAAATDIVDSQYDAAAQGHLIASWTPVSPPSM(SEQ ID NO: 79)
modWT1 gacttcctgctgctgcagaaccctgcctctacctgtgtgcctgaaccagcctctcagcacaccctgagatctggccctggatgtctccagcagcctgaacagcagggcgttagagatcctggcggaatctgggccaaactgggagctgccgaagcctctgccgaatgtctgcagggcagaagaagcagaggcgccagcggatctgaacctcaccagatgggaagcgacgtgcacgacctgaatgctctgttgcctgccgtgccatctcttggcggaggcggaggatgtgctttgcctgtttctggtgctgcccagtgggctcccgtgctggattttgctcctcctggcgcttctgcctatggctctcttggaggacctgctcctccaccagctccacctccaccgccgcctccaccacctcacagctttatcaagcaagagccctcctggggcggagccgagcctcacgaaaaacagtgtctgagcgccttcaccgtgcactttttcggccagtttaccggcaccgtgggcgcctgtagatacggcccttttggaccaccaccacctagccaggcttctagcggacaggccagaatgttccccaacgctccttacctgcctagctgcctggaaagccagcctaccatcagaaaccagggcttcagcaccgtgaccttcgacggcatgcctagctatggccacacaccatctcaccacgccgctcagttccccaatcacagcttcaagcacgaggaccctatgggccagcagggatctctgggagagcagcagtatagcgtgccacctcctgtgtacggctgtcacacccctaccgatagctgcacaggcaatcaggctctgctgctgaggatgcctttcagcagcgacaacctgtaccagatgacaagccagctggaatgcatgatttggaaccagatgaacctgggcgccactctgaaaggcgtggccgctggatctagcagctccgtgaaatggacagccggccagagcaatcactccaccggctacgagagcgacaatcacaccatgcctatcctgtgtggggcccagtaccggattcacacacacggcgtgttcaggggcattcaggatgtgcgaagagtgcctggcgtggcccctacacttgtgggatctgccagcgaaaccagcgagaagcaccccttcatgtgcgcctatccaggctgcaacaagcggtacttcaagctgagccacctgaagatgcacagccggaagcacacaggcgagaagctgtaccagtgcgacttcaaggactgcgagcggagattcagctgcagcgaccagctgaagagacaccagagaaggcacaccggcgtgaagccctttcagtgcaagacctgccagcggaccttctcctggtccaaccacctgaaaacccacacaagaacccacaccggcaagaccatcgagaagcccttcagctgtagatggcccagctgccagaagaagttcgcccggtctaacgagctggtgcatcaccacaacatgcaccagaggaacatgaccaaactgcagctggtgctg(SEQ ID NO: 80)
modWT1 DFLLLQNPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAECLQGRRSRGASGSEPHQMGSDVHDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEKQCLSAFTVHFFGQFTGTVGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPTIRNQGFSTVTFDGMPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGNQALLLRMPFSSDNLYQMTSQLECMIWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTAGQSNHSTGYESDNHTMPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVGSASETSEKHPFMCAYPGCNKRYFKLSHLKMHSRKHTGEKLYQCDFKDCERRFSCSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRTFSWSNHLKTHTRTHTGKTIEKPFSCRWPSCQKKFARSNELVHHHNMHQRNMTKLQLVL(SEQ ID NO: 81)
KRAS G12D 突變 accgagtacaagctggtggttgttggagccgatggcgtgggaaagagcgccctgacaattcagctgatccagaaccacttcgtg(SEQ ID NO: 82)
KRAS G12D 突變 TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFV(SEQ ID NO: 83)
KRAS G12V 突變 acagagtataagctcgtggtcgtgggcgctgtcggagtgggaaaatctgccctgaccatccaactcattcagaatcactttgtg(SEQ ID NO: 84)
KRAS G12V 突變 TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFV(SEQ ID NO: 85)
modMAGEC2 cctcctgtgcctggcgtgcccttcagaaacgtggacaacgatagcctgaccagcgtggaactggaagattgggtcgacgcccagcatcctaccgacgaggaagaggaagaagccagctctgccagcagcaccctgtacctggtgtttagccccagcagcttctccaccagctctagcctgattctcggaggccccgaagaagaagaggtcccaagcggcgtgatccccaatctgacagagagcatcccaagcagccctccacagggaccaccacaaggaccttctcagagccctctgagcagctgttgcagcagtttcctgtggtccagcttcagcgaggaaagcagctcccagaaaggcgaggataccggcacttgtcagggcctgccagatagcgagagcagcttcacctacacactggacgagaaggtggccaagctggtcgagttcctgctgctgaagtacgaggccgaggaacctgtgacagaggccgagatgctgatgatcgtcatcaagtataaggactacttccccgtgatcctgaagcgggccagagaattcatggaactgctgttcggactggccctgatcgaagtgggccccgatcacttctgcgtgttcgctaacacagtgggcctgaccgatgagggctccgatgatgagggaatgcccgagaactccctgctgatcatcatcctgagcgtcatcttcatcaagggcaactgcgcctccgaggaagtgatctgggaagtcctgaatgccgtgggcgtttacgccggcagagaacactttgtgtacggcaagccccgcgagctgctgaccaatgtttgggtgcagggccactacctggaatactgggaagtgcctcactctagccctctgtactacgagtttctgtggggccctagagcacacagcgagtccatcaagaaaaaggtgctggaattcctggccaaactgaacaataccgtgcctagcttcttcccgtcctggtacaaggatgccctgaaggacgtggaagagagagtgcaggccaccatcgacaccgccgatgatgctacagtgatggccagcgagagcctgagcgtgatgagcagcaacgtgtcctttagcgag(SEQ ID NO: 86)
modMAGEC2 PPVPGVPFRNVDNDSLTSVELEDWVDAQHPTDEEEEEASSASSTLYLVFSPSSFSTSSSLILGGPEEEEVPSGVIPNLTESIPSSPPQGPPQGPSQSPLSSCCSSFLWSSFSEESSSQKGEDTGTCQGLPDSESSFTYTLDEKVAKLVEFLLLKYEAEEPVTEAEMLMIVIKYKDYFPVILKRAREFMELLFGLALIEVGPDHFCVFANTVGLTDEGSDDEGMPENSLLIIILSVIFIKGNCASEEVIWEVLNAVGVYAGREHFVYGKPRELLTNVWVQGHYLEYWEVPHSSPLYYEFLWGPRAHSESIKKKVLEFLAKLNNTVPSFFPSWYKDALKDVEERVQATIDTADDATVMASESLSVMSSNVSFSE(SEQ ID NO: 87)
modTDGF1 gactgcagaaagatggcccggttcagctactccgtgatctggatcatggccatctccaaggccttcgagctgagactggttgccggactgggccaccaagagtttgccagacctagctggggctatctggccttccgggacgatagcatctggccccaagaggaacctgccatcagacccagatctagccagcgggtgccacctatggaaatccagcacagcaaagaactgaaccggacctgctgcctgaacggcagaacctgtatgctgggcagcttctgcgcctgtcctcctagcttctacggccggaattgcgagcacgacgtgcggaaagaaaactgcggcagcgtgccacacgatacctggctgcctaagaaatgcagcctgtgcaagtgttggcacggccagctgcggtgtttccccagagcttttctgcccgtgtgtgacggcctggtcatggatgaacacctggtggccagcagaacccctgagcttcctccaagcgccaggaccaccacctttatgctcgtgggcatctgcctgagcatccagagctactac(SEQ ID NO: 88)
modTDGF1 DCRKMARFSYSVIWIMAISKAFELRLVAGLGHQEFARPSWGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMEIQHSKELNRTCCLNGRTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPRAFLPVCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY(SEQ ID NO: 89)
modPSMA_ TDGF1 中之 modPSMA ggatccgccaccatgtggaatctgctgcacgagacagatagcgccgtggctaccgttagaaggcccagatggctttgtgctggcgctctggttctggctggcggcttttttctgctgggcttcctgttcggctggttcatcaagagcagcaacgaggccaccaacatcacccctaagcacaacatgaaggcctttctggacgagctgaaggccgagaatatcaagaagttcctgtacaacttcacgcacatccctcacctggccggcaccgagcagaattttcagctggccaagcagatccagagccagtggaaagagttcggcctggactctgtggaactggcccactacgatgtgctgctgagctaccccaacaagacacaccccaactacatcagcatcatcaacgaggacggcaacgagatcttcaacaccagcctgttcgagcctccacctcctggctacgagaacgtgtccgatatcgtgcctccattcagcgctttcagcccacagcggatgcctgagggctacctggtgtacgtgaactacgccagaaccgaggacttcttcaagctggaatgggacatgaagatcagctgcagcggcaagatcgtgatcgcccggtacagaaaggtgttccgcgagaacaaagtgaagaacgcccagctggcaggcgccaaaggcgtgatcctgtatagcgaccccgccgactattttgcccctggcgtgaagtcttaccccgacggctggaattttcctggcggcggagtgcagcggcggaacatccttaatcttaacggcgctggcgaccctctgacacctggctatcctgccaatgagtacgcctacagacacggaattgccgaggctgtgggcctgccttctattcctgtgcaccctgtgcggtactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggaagcgcccctcctgactcttcttggagaggctctctgaaggtgccctacaatgtcggcccaggcttcaccggcaacttcagcacccagaaagtgaaaatgcacatccacagcaccaacgaagtgacccggatctacaacgtgatcggcacactgagaggcgccgtggaacccgacaaatacgtgatcctcggcggccacagagacagctgggtgttcggaggaatcgaccctcaatctggcgccgctgtggtgtatgagatcgtgcggtctttcggcaccctgaagaaagaaggatggcggcccagacggaccatcctgtttgcctcttgggacgccgaggaatttggcctgctgggatctacagagtgggccgaagagaacagcagactgctgcaagaaagaggcgtggcctacatcaacgccgacagcagcatcgagggcaactacaccctgcggatcgattgcacccctctgatgtacagcctggtgcacaacctgaccaaagagctgaagtcccctgacgagggctttgagggcaagagcctgtacaagagctggaccaagaagtccccatctcctgagttcagcggcatgcccagaatctctaagctggaaagcggcaacaacttcgaggtgttcttccagcggctgggaatcgcctctggaatcgccagatacaccaagaactgggagacaaacaagttctccggctatcccctgtaccacagcgtgtacgagacatacgagctggtggaaaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgacagtggcccaagtgcgcggaggcatggtgttcgaactggccaatagcatcgtgctgcccttcaactgcagagactacgccgtggtgctgcggaagtacgccgacaagatctacagcatcagcatgaagcacccgcaagagatgaagacctacagcgtgtccttcgactccctgttcttcgccgtgaagaacttcaccaagatcgccagcaagttcagcgagcggctgcaggacttcgacaagagcaaccctatcgtgctgaggatgatgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcatcaaccctctgggactgcccgacagacccttctacaggcacgtgatctgtgcccctagcagccacaacaaatacgccggcgagagcttccccggcatctacgatgccctgttcgacatcgagagcaacgtgaaccctagcaaggcctggggcgaagtgaagagacagatctacgtggccgcattcacagtgcaggccgctgccgaaacactgtctgaagtggccagaggc(SEQ ID NO: 90)
modWT1_FBP 中之 modWT1 atggactttctgctgctgcagaaccctgccagcacctgtgttccagaacctgcctctcagcacaccctgagatctggccctggatgtctccagcagcctgaacagcagggcgttagagatcctggcggaatctgggccaaactgggagccgctgaagcctctgccgaatgtctgcagggcagaagaagcagaggcgccagcggatctgaacctcaccagatgggaagcgacgtgcacgacctgaatgctctgctgcctgccgtgccatctcttggcggaggcggaggatgtgctttgcctgtttctggtgctgcccagtgggctcccgtgctggattttgctcctcctggcgcttctgcctatggctctcttggaggacctgctcctccaccagctccacctccaccgccgcctccaccacctcacagctttatcaagcaagagccctcctggggcggagccgagcctcacgaaaaacagtgtctgagcgccttcaccgtgcactttttcggccagtttaccggcacagtgggcgcctgtagatacggcccttttggaccaccaccacctagccaggctagctctggacaggccagaatgttccccaacgctccctacctgcctagctgcctggaaagccagcctaccatcagaaaccagggcttcagcaccgtgaccttcgacggcatgcctagctatggccacacaccatctcaccacgccgctcagttccccaatcacagcttcaagcacgaggaccctatgggccagcagggatctctgggagagcagcagtatagcgtgccacctcctgtgtacggctgtcacacccctaccgatagctgcacaggcaatcaggccctgctgctgaggatgcccttcagcagcgacaacctgtaccagatgacaagccagctggaatgcatgatctggaaccagatgaacctgggcgccacactgaaaggcgtggccgctggatctagcagcagcgtgaaatggacagccggccagagcaatcactccaccggctacgagtccgacaaccacaccatgcctattctgtgcggagcccagtacagaatccacacacacggcgtgttccggggcattcaggatgtgcgaagagtgcctggcgtggcccctacacttgtgggatctgcctctgagacaagcgagaagcaccccttcatgtgcgcctatcctggctgcaacaagcggtacttcaagctgagccacctgaagatgcacagccggaagcacacaggcgagaagctgtaccagtgcgacttcaaggactgcgagcggagattcagctgcagcgaccagctgaagagacaccagagaaggcacaccggcgtgaagcccttccagtgcaagacctgccagcggacctttagctggtccaaccacctgaaaacccacacaagaacccacaccggcaagaccatcgagaagcctttcagctgtagatggcccagctgccagaagaagttcgcccggtctaacgagctggtgcatcaccacaacatgcaccagaggaacatgaccaaactgcagctggtgctg(SEQ ID NO: 91)
modFBP gcccagagaatgaccacacagttgctgctgctcctcgtgtgggttgccgttgtgggagaagtgcagaccagaatcgcctgggccagaaccgagctgctgaacgtgtgcatgaacgccaagcaccacaagaagaagcccgatcctgaggacaagctgcacgagcagtgtcggccttggagaaagaacgcctgctgtagcaccaacaccagccaagaggcccacaagaacgtgtcctacctgtaccggttcaactggaaccactgcggcgagatgacacccgcctgcaagagacacttcatccaggatacctgcctgtacgagtgcagccccaatctcggcccctggattcagcaagtggaccagagctggcggaaagaactggtcctgaatgtgcccctgtgcaaagaggattgcgagcagtggtgggaagattgcagaaccagctacacatgcaagagcaactggcacaaaggctggaactggaccagcggcttcaacaagtgtgccgtgggagctgcctgtcagcctttccacttctactttcacacacccaccgtgctgtgcaacaagatctggacccacagctacaaggtgtccaactacagcagaggcagcggccggtgtatccagatgtggttcgatcccgccaagggcaaccccaatgaggaagtggccagattctacgccgctgccatgtctggtgcaggaccttgggctgcttggccctttctgctttcactggccctgatgctgctgtggctgctgagc(SEQ ID NO: 92)
modFBP AQRMTTQLLLLLVWVAVVGEVQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKKKPDPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKNVSYLYRFNWNHCGEMTPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKELVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFHTPTVLCNKIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAKGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS(SEQ ID NO: 93)
modFSHR atggctctgctgctggtttctctgctggccctgctgtctctcggctctggatgtcaccacagaatctgccactgcagcaaccgggtgttcctgtgccagaaaagcaaagtgaccgagatcctgagcgacctgcagcggaatgccatcgagctgagattcgtgctgaccaagctgcaagtgatccagaagggcgccttcagcggcttcggcgacctggaaaagatcgagatcagccagaacaacgtgctggaagtgatcgaggcccacgtgttcagcaacctgcctaagctgcacgagatcagaatcgagaaggccaacaacctgctgtacatcaaccccgaggccttccagaacttccccaacctgcagtacctgctgatctccaacaccggcatcaaacatctgcccgacgtgcacaagatccacagcctgcagaaggtgctgctggacatccaggacaacatcaacatccacacaatcgagcggaactacttcctgggcctgagcttcgagagcgtgatcctgtggctgaacaagaacggcatccaagagatccacaactgcgccttcaatggcacccagctggacgagctgaacctgtccgacaacaacaatctggaagaactgcccaacgacgtgttccacagagccagcggacctgtgatcctggacatcagcagaaccagaatccactctctgcccagctacggcctggaaaacctgaagaagctgcgggccagaagcacctacaatctgaaaaagctgcctacgctggaaaccctggtggccctgatggaagccagcctgacataccctagccactgctgcgcctttgccaactggcggagacagatctctgagctgcaccccatctgcaacaagagcatcctgcggcaagaggtggactacatgacacaggccagaggccagagattcagcctggccgaggataacgagagcagctacagcagaggcttcgacatgacctacaccgagttcgactacgacctgtgcaacaaggtggtggacgtgacatgcagccccaagcctgatgccttcaatccctgcgaggacatcatgggctacaacatcctgagagtgctgatctggttcatcagcatcctggccatcaccgagaacatcatcgtgctggtcatcctgaccaccagccagtacaagctgaccgtgcctatgttcctgatgtgcaacctggccttcgccgatctgtgcatcggcatctacctgctgctgatcgccagcgtggacattcacaccaagagccagtaccacaactacgccatcgactggcagacaggcgccggatgtgatgccgccggattctttacagtgttcgccagcgagctgtccgtgtacaccctgacagctatcaccctggaacggtggcacaccatcacacacgctatgcagctggactgcaaagtgcacctgagacacagcgcctccgtgatggttatgggctggatcttcgccttcgctgccgctctgttccccatctttggcatcagctcctacatgaaggtgtccatctatctgcccatggacatcgacagccctctgagccagctgtacgtgatgagtctgctggtgctgaatgtgctggcctttgtggtcatctgcggctgctacatctatatctacctgacagtgcggaaccccaacatcgtgtccagctccagcgacacccggatcgctaagagaatggccatgctgatcttcaccgactttctgtgcatggcccctatcagcctgttcgccattagcgctagcctgaaggtgcccctgatcaccgtgtccaaggccaagattctgctggtcctgttctaccccatcaacagctgcgccaatcctttcctgtacgccatcttcaccaagaacttcaggcggaacttcttcatcctgctgagcaagcggggctgttacaagatgcaggcccagatctaccggaccgagacactgtccaccgtgcacaacacacaccccagaaacggccactgtagcagcgcccctagagtgacaaatggctccacctacatcctggtgccactgagccatctggcccagaac(SEQ ID NO: 94)
modFSHR MALLLVSLLALLSLGSGCHHRICHCSNRVFLCQKSKVTEILSDLQRNAIELRFVLTKLQVIQKGAFSGFGDLEKIEISQNNVLEVIEAHVFSNLPKLHEIRIEKANNLLYINPEAFQNFPNLQYLLISNTGIKHLPDVHKIHSLQKVLLDIQDNINIHTIERNYFLGLSFESVILWLNKNGIQEIHNCAFNGTQLDELNLSDNNNLEELPNDVFHRASGPVILDISRTRIHSLPSYGLENLKKLRARSTYNLKKLPTLETLVALMEASLTYPSHCCAFANWRRQISELHPICNKSILRQEVDYMTQARGQRFSLAEDNESSYSRGFDMTYTEFDYDLCNKVVDVTCSPKPDAFNPCEDIMGYNILRVLIWFISILAITENIIVLVILTTSQYKLTVPMFLMCNLAFADLCIGIYLLLIASVDIHTKSQYHNYAIDWQTGAGCDAAGFFTVFASELSVYTLTAITLERWHTITHAMQLDCKVHLRHSASVMVMGWIFAFAAALFPIFGISSYMKVSIYLPMDIDSPLSQLYVMSLLVLNVLAFVVICGCYIYIYLTVRNPNIVSSSSDTRIAKRMAMLIFTDFLCMAPISLFAISASLKVPLITVSKAKILLVLFYPINSCANPFLYAIFTKNFRRNFFILLSKRGCYKMQAQIYRTETLSTVHNTHPRNGHCSSAPRVTNGSTYILVPLSHLAQN(SEQ ID NO: 95)
modMAGEA10 cccagggctcccaagagacagagatgcatgcccgaagaggacctgcagagccagagcgaaacacagggactcgaaggtgctcaggctcctctggccgtggaagaagatgccagcagctctaccagcacctccagcagcttccctagcagctttccattcagctcctctagctctagcagcagctgttaccctctgatccccagcacacccgagaaggtgttcgccgacgacgagacacctaatccactgcagtctgcccagatcgcctgcagcagtacactggtggttgctagcctgcctctggaccagtctgatgagggaagcagcagccagaaagaggaaagccctagcacactccaggtgctgcccgatagcgagagcctgcctagaagcgagatctacaagaaaatgaccgacctggtgcagttcctcctgttcaagtaccagatgaaggaacccatcaccaaggccgaaatcctggaaagcgtgatcagaaactacgaggaccactttccactgctgttcagcgaggccagcgagtgcatgctgctcgtgtttagcatcgacgtgaagaaggtggaccccaccggccacagctttgtgctggttacaagcctgggactgacctacgacggcatgctgtccgatgtgcagagcatgcctaagaccggcatcctgatcctgattctgagcatcgtgttcatcgagggctactgcacccctgaggaagtgatttgggaagccctgaacatgatgggcctgtacgatggcatggaacacctgatctacggcgagcccagaaaactgctgacccaggactgggtgcaagagaactacctggaataccggcagatgcccggcagcgatcctgccagatatgagtttctgtggggccctagagcacatgccgagatccggaagatgagcctgctgaagttcctggccaaagtgaacggcagcgacccaatcagcttcccactttggtacgaagaggccctgaaggacgaggaagagagagcccaggatagaatcgccaccaccgacgacacaacagccatggcctctgcctcttctagcgccaccggcagctttagctaccccgag(SEQ ID NO: 96)
modMAGEA10 PRAPKRQRCMPEEDLQSQSETQGLEGAQAPLAVEEDASSSTSTSSSFPSSFPFSSSSSSSSCYPLIPSTPEKVFADDETPNPLQSAQIACSSTLVVASLPLDQSDEGSSSQKEESPSTLQVLPDSESLPRSEIYKKMTDLVQFLLFKYQMKEPITKAEILESVIRNYEDHFPLLFSEASECMLLVFSIDVKKVDPTGHSFVLVTSLGLTYDGMLSDVQSMPKTGILILILSIVFIEGYCTPEEVIWEALNMMGLYDGMEHLIYGEPRKLLTQDWVQENYLEYRQMPGSDPARYEFLWGPRAHAEIRKMSLLKFLAKVNGSDPISFPLWYEEALKDEEERAQDRIATTDDTTAMASASSSATGSFSYPE(SEQ ID NO: 97)
modPRAME atggaaagaagaaggctctggggcagcatccagagccggtacatcagcatgagcgtgtggacaagccctcggagactggtggaactggctggacagagcctgctgaaggatgaggccctggccattgctgctctggaactgctgcctagagagctgttccctcctctgttcatggccgccttcgacggcagacacagccagacactgaaagccatggtgcaggcctggcctttcacctgtctgcctctgggagtgctgatgaagggccagcatctgcacctggaaaccttcaaggccgtgctggatggcctggatgtgctgctggctcaagaagtgcggcctcggcgttggaaactgcaggttctggatctgctgaagaacagccaccaggatttctggaccgtttggagcggcaacagagccagcctgtacagctttcctgagcctgaagccgctcagcccatgaccaagaaaagaaaggtggacggcctgagcaccgaggccgagcagccttttattcccgtggaagtgctggtggacctgttcctgaaagaaggcgcctgcgacgagctgttcagctacctgaccgagaaagtgaagcagaagaagaacgtcctgcacctgtgctgcaagaagctgaagatctttgccatgcctatgcaggacatcaagatgatcctgaagatggtgcagctggacagcatcgaggacctggaagtgacctgtacctggaagctgcccacactggccaagttctttagctacctgggccagatgatcaacctgcggagactgctgctgagccacatccacgccagctcctacatcagccccgagaaagaggaacagtacatctcccagttcacctctcagtttctgagcctgcagtgtctgcaggccctgtacgtggacagcctgttcttcctgagaggcaggctggaccagctgctgagacacgtgatgaaccctctggaaaccctgagcatcaccaactgcagactgctggaaggcgacgtgatgcacctgtctcagagcccatctgtgtcccagctgagcgtgctgtctctgtctggcgtgatgctgaccgatgtgtcccctgaacctctgcaggcactgctgaaaaaggccagcgccactctgcaggacctggtgtttgatgagtgcggcatcatggacgaccagctgtttgccctgctgccaagcctgagccactgtagccaactgaccacactgagcttctacggcaacagcatctacatctctgccctgcagagcctcctgcagcacctgatcggactgagcaatctgacccacgtgctgtacccagtgctgctcgagagctacgaggacatccacgtgaccctgcaccaagagagactggcctatctgcatgcccggctgagagaactgctgtgcgaactgggcagacccagcatggtttggctgagcgctaatctgtgccctcactgcggcgacagaaccttctacgaccccaagctgatcatgtgcccctgcttcatgcccaac(SEQ ID NO: 98)
modPRAME MERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVELAGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKAVLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDLLKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAEQPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLTEKVKQKKNVLHLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLEVTCTWKLPTLAKFFSYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYISQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFLRGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLLEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLKKASATLQDLVFDECGIMDDQLFALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSIYISALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVLLESYEDIHVTLHQERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANLCPHCGDRTFYDPKLIMCPCFMPN(SEQ ID NO: 99)
modPRAME_ TBXT 中之 modTBXT tctagccctggcacagagagcgccggaaagtccctgcagtacagagtggatcatctgctgagcgccgtggaaaacgaactgcaggccggatctgagaagggcgatcctacagagcacgagctgagagtcggcctggaagagtctgagctgtggctgcggttcaaagaactgaccaacgagatgatcgtcaccaagaacggcagacggatgttccccgtgctgaaagtgaacgtgtccggactggaccccaacgccatgtatagctttctgctggacttcgtggtggccgacaaccacagatggaaatacgtgaacggcgagtgggtgccaggcggaaaacctcaactgcaagcccctagctgcgtgtacattcaccctgacagccccaatttcggcgcccactggatgaaggcccctgtgtcctttagcaaagtcaagctgaccaacaagctgaacggcggaggccagatcatgctgaactccctgcacaaatacgagcccagaatccacatcgtcagagtcggcggaccccagagaatgatcaccagccactgcttccccgagacacagtttatcgccgtgaccgcctaccagaacgaggaaatcacaaccctgaagatcaagtacaaccccttcgccaaggccttcctggacgccaaagagcggagcgaccacaaagaaatgatcaaagagcccggcgactcccagcagccaggctattctcaatggggatggctgctgccaggcaccagcacattgtgccctccagccaatcctcacagccagtttggaggcgctctgtccctgagcagcacacacagctacgacagataccccacactgcggagccacagaagcagcccctatccttctccttacgctcaccggaacaacagccccacctacagcgataatagccccgcctgtctgagcatgctgcagtcccacgataattggagcagcctgcggatgcctgctcacccttctatgctgcccgtgtctcacaacgcctctccacctacaagcagctctcagtaccccagcctttggagcgtgtccaatggcgctgtgacactgggatctcaggccgctgctgtgtctaatggactgggagcccagttcttcagaggcagccctgctcactacacccctctgacacatcctgtgtcagccccttctagcagcggcttccctatgtacaaaggcgccgctgccgccaccgatatcgtggattctcagtacgatgccgccgctcagggccacctgattgcatcttggacacctgtgtctccaccttccatg(SEQ ID NO: 100)
HPV16 E6 atgcaccagaaacggaccgccatgtttcaggaccctcaagagaggcccagaaagctgcctcacctgtgtaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggaatgcgtgtactgcaagcagcagctcctgcggagagaggtgtacgatttcgccttccgggacctgtgcatcgtgtacagagatggcaacccctacgccgtgtgcaacaagtgcctgaagttctacagcaagatcagcgagtaccgctactactgctacagcgtgtacggcaccacactggaacagcagtacaacaagcccctgtgcgacctgctgatccggtgcatcaactgccagaaacctctgtgccccgaggaaaagcagcggcacctggacaagaagcagcggttccacaacatcagaggccggtggaccggcagatgcatgagctgttgtcggagcagccggaccagaagagagacacagctg(SEQ ID NO: 101)
HPV16 E6 MHQKRTAMFQDPQERPRKLPHLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCNKCLKFYSKISEYRYYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL(SEQ ID NO: 102)
HPV16 E7 cacggcgatacccctacactgcacgagtacatgctggacctgcagcctgagacaaccgacctgtactgctacgagcagctgaacgacagcagcgaggaagaggacgagattgacggacctgccggacaggccgaacctgatagagcccactacaatatcgtgaccttctgctgcaagtgcaacagcaccctgagactgtgcgtgcagagcacccacgtggacatcagaaccctggaagatctgctgatgggcaccctgggaatcgtgtgccctatctgcagccagaagcct(SEQ ID NO: 103)
HPV16 E7 HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCNSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO: 104)
HPV18 E6 gccagattcgacgaccccaccagaaggccttacaagctgcctgatctgtgcactgaactgaacaccagcctgcaggacatcgagattacctgtgtgtattgcaagaccgtgctggaactgaccgaggtgttcgagtttgcctttaaggacctgttcgtggtgtaccgggacagcattcctcacgccgcctgccacaagtgcatcgacttctacagccggatcagagagctgcggcactacagcgattctgtgtacggggacaccctggaaaagctgaccaacaccggcctgtacaacctgctcatcagatgcctgcggtgtcagaagcccctgaatcctgccgagaagctgagacacctgaacgagaagcggagattccacaatatcgccggccactacagaggccagtgccacagctgttgcaaccgggccagacaagagagactgcagagaaggcgggaaacccaagtg(SEQ ID NO: 105)
HPV18 E6 ARFDDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV(SEQ ID NO: 106)
HPV18 E7 cacggccctaaggccacactgcaggatatcgtgctgcacctggaacctcagaacgagatccccgtggatctgctgtgccatgagcagctgtccgactccaaagaggaaaacgacgaaatcgacggcgtgaaccaccagcatctgcctgccagaagggccgaaccacagagacacaccatgctgtgcatgtgttgcaagtgcgaggcccggattgagctggtggtggaaagctctgccgacgacctgagagccttccagcagctgttcctgaacaccctgagcttcgtgtgtccttggtgcgccagccagcag(SEQ ID NO: 107)
HPV18 E7 HGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSKEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID NO: 108)
mod 緊密連接蛋白 18(CLDN18) gccgtgacagcctgtcagagcctgggctttgtggtgtccctgatcgagatcgtgggcatcattgccgctacctgcatggaccagtggtctacccaggacctgtacaacaaccctgtgaccgccgtgttcaactaccaaggcctgtggcacagctgcatgagagagagcagcggcttcaccgagtgcagaggctacttcaccctgctggaactgcctgccatgctgcaggctgtgcaggcccttatgatcgtgggaattgtgctgggagccatcggcctgctggtgtccattttcgccctgaagtgcatccggatcggcagcatggaagatagcgccaaggccaacatgaccctgaccagcggcatcatgttcatcgtgtccggcctgtgcgccattgctggcgtgtccgtgtttgccaatatgctcgtgaccaacttctggctgagcaccgccaacatgtacaccggcatgggcgagatggtgcagaccgtgcagacacggtacacatttggcgccgctctgtttgtcggatgggttgcaggcggactgacactgattggcggcgtgatgatgtgtatcgcctgcagaggactggcccctgaggaaacaaactacaaggccgtgtactaccacgcctccggacacagcgtggcatacaaacctggcggctttaaggccagcaccggcttcggcagcaacaccaagaacaagaagatctacgacggcggagcacacaccgaggatgaggtgcagagctaccccagcaagcacgactacgtg(SEQ ID NO: 109)
mod 緊密連接蛋白 18 (CLDN18) AVTACQSLGFVVSLIEIVGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWHSCMRESSGFTECRGYFTLLELPAMLQAVQALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWLSTANMYTGMGEMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVYYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGAHTEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO: 110)
modLY6K gctctgctggcactgctgctggtggtggctttgcctagagtgtggaccgacgccaatctgacagtgcggcagagagatcctgaggacagccagagaaccgacgacggcgataacagagtgtggtgccacgtgtgcgagcgcgagaataccttcgagtgtcagaaccccagacggtgcaagtggaccgagccttactgtgtgatcgccgccgtgaaaatcttcccacggttcttcatggtggtcaagcagtgcagcgctggctgtgccgctatggaaagacccaagcctgaggaaaagcggttcctgctcgaggaacccatgctgttcttctacctgaagtgctgcaaaatctgctactgcaacctggaaggccctcctatcaacagcagcgtcctgaaagaatatgccggcagcatgggcgagtcttgtggtggactgtggctggccattctgctgctgcttgcctctattgccgcctctctgagcctgagc(SEQ ID NO: 111)
modLY6K ALLALLLVVALPRVWTDANLTVRQRDPEDSQRTDDGDNRVWCHVCERENTFECQNPRRCKWTEPYCVIAAVKIFPRFFMVVKQCSAGCAAMERPKPEEKRFLLEEPMLFFYLKCCKICYCNLEGPPINSSVLKEYAGSMGESCGGLWLAILLLLASIAASLSLS(SEQ ID NO: 112)
modTBXT_ BORIS 中之 modBORIS gccgccaccgagatcagcgtgctgagcgagcagttcaccaagatcaaagaattgaagctgatgctcgagaaggggctgaagaaagaagagaaggacggcgtctgccgcgagaagaatcacagaagccctagcgagctggaagcccagagaacatctggcgccttccaggacagcatcctggaagaagaggtggaactggttctggcccctctggaagagagcaagaagtacatcctgacactgcagaccgtgcacttcacctctgaagccgtgcagctccaggacatgagcctgctgtctatccagcagcaagagggcgtgcaggttgtggttcagcaacctggacctggactgctctggctgcaagagggacctagacagtccctgcagcagtgtgtggccatcagcatccagcaagagctgtatagccctcaagagatggaagtgctgcagtttcacgccctcgaagagaacgtgatggtggccatcgaggacagcaagctggctgtgtctctggccgaaacaaccggcctgatcaagctggaagaggaacaagagaagaaccagctgctggccgagaaaacaaaaaagcaactgttcttcgtggaaaccatgagcggcgacgagagaagcgacgagatcgtgctgacagtgtccaacagcaacgtggaagaacaagaggaccagcctaccgcctgtcaggccgatgccgagaaagccaagtttaccaagaaccagagaaagaccaagggcgccaagggcaccttccactgcaacgtgtgcatgttcaccagcagccggatgagcagcttcaactgccacatgaagacccacaccagcgagaagccccatctgtgtcacctgtgcctgaaaaccttccggacagtgacactgctgtggaactatgtgaacacccacacaggcacccggccttacaagtgcaacgactgcaacatggccttcgtgaccagcggagaactcgtgcggcacagaagatacaagcacacccacgagaaacccttcaagtgcagcatgtgcaaatacgcatccatggaagcctccaagctgaagtgccacgtgcgctctcacacaggcgagcaccctttccagtgctgtcagtgtagctacgccagccgggacacctataagctgaagcggcacatgagaacccactctggcgaaaagccctacgagtgccacatctgccacaccagattcacccagagcggcaccatgaagattcacatcctgcagaaacacggcaagaacgtgcccaagtaccagtgtcctcactgcgccaccattatcgccagaaagtccgacctgcgggtgcacatgaggaatctgcacgcctattctgccgccgagctgaaatgcagatactgcagcgccgtgttccacaagagatacgccctgatccagcaccagaaaacccacaagaacgagaagcggtttaagtgcaagcactgcagctacgcctgcaagcaagagcgccacatgatcgcccacatccacacacacaccggggagaagccttttacctgcctgagctgcaacaagtgcttccggcagaaacagctgctcaacgcccacttcagaaagtaccacgacgccaacttcatccccaccgtgtacaagtgctccaagtgcggcaagggcttcagccggtggatcaatctgcaccggcacctggaaaagtgcgagtctggcgaagccaagtctgccgcctctggcaagggcagaagaacccggaagagaaagcagaccatcctgaaagaggccaccaagagccagaaagaagccgccaagcgctggaaagaggctgccaacggcgacgaagctgctgccgaagaagccagcacaacaaagggcgaacagttccccgaagagatgttccctgtggcctgcagagaaaccacagccagagtgaagcaagaggtcgaccagggcgtgacctgcgagatgctgctgaacaccatggacaag(SEQ ID NO: 113)
modFAP atgaagaccctggtcaagatcgtgtttggcgtggccacatctgccgtgctggctctgctggtcatgtgcattgtgctgcaccccagcagagtgcacaacagcgaagagaacaccatgcgggccctgacactgaaggacatcctgaacgtgaccttcagctacaagatattcttccccaactggatctccggccaagagtacctgcaccagagcgccgacaacaacatcgtgctgtacaacatcgagacaggccagagctacaccatcatgagcaaccggaccatgaagtccgtgaacgccagcaactacggactgagccccgattggcagttcgtgtacctggaaagcgactacagcaagctgtggcggtacagctacaccgccacctactacatctacgacctgagcaacggcgagttcgtgaagggcaacgagctgccccatcctatccagtacctgtgttggagccctgtgggctccaagctggcctacgtgtaccagaacaacatctacctgaagcagcggcctggcgaccctccattccagatcaccttcaacggcagagagaacaagatctttaacggcatccccgactgggtgtacgaggaagagatgctggccaccaaatacgccctgtggtggtcccctaacggcaagtttctggcctatgccgacttcaacgacacagacatccccgtgatcgcctacagctactacggcaatgagcagtaccccaggaccatcaacatcagctaccccaaagccggcgctaagaaccctgtcgtgcggatcttcatcatcgacaccacctatcctgtgtacgtgggccctcaagaggtgccagtgcctgccatgattgccagcagcgactactacttcagctggctgacctgggtcaccgacgagcgagtttgtctgcagtggctgaagcgggtgcagaacatcagcgtgctgagcatctgcgacttcagaaaggactggcagacatgggactgccccaacacacagcagcacatcgaggaaagcagaaccggctgggctggcggcttctttgtgtctacccctgtgttcagctacgacgccatcctgtactataagatcttcagcgacaaggacggctacaagcacatccactacatcaagtacaccgtcgagaacgtgatccagattaccagcggcaagtgggaagccatcaatatcttcagagtgatccagtacagcctgttctacagcagcaacgagttcgaggaataccccggcagacggaacatctacagaatcagcatcggcagctacccgcctagcaagaaatgcgtgacctgccacctgagaaaagagcggtgccagtactacacagccagcttctccaactacgccaagtactacgccctcgtgtgttacggccctggcatccctatcagcacactgcacgatggcagaaccgaccaagagatcaagatcctggaagaaaacaaagagctggaaaacgccctgaagaacatccagctgcctaaagaggaaatcaagaagctggaagtcgacgagatcaccctgtggtacaagatgatcctgcctcctcagttcgaccggtccaagaagtaccctctgctgatccaggtgtacggcggaccttgttctcagtctgtgcgctccgtgttcgccgtgaattggatcagctatctggccagcaaagaaggcatggttatcgccctggtggacggcagaggcacagcttttcaaggcgacaagctgctgtacgccgtgtatcagaaactgggcgtgtacgaagtggaagatcagatcaccgccgtgcggaagttcatcgagatgggcttcatcgacgagaagcggatcgccatctggggctggtcttacggcggctatattagctctctggccctggcctctggcaccggcctgtttaagtgtggaattgccgtggctcccgtgtccagctgggagtactataccagcgtgtacaccgagcggttcatgggcctgcctaccaaggacgacaacctggaacactacaagaactctaccgtgatggccagagccgagtacttccggaacgtggactacctgctgattcacggcaccgccgacgacaacgtgcacttccaaaacagcgcccagatcgctaaggccctcgtgaatgcccaggtggactttcaggccatgtggtacagcgaccagaaccacggactgtctggcctgagcaccaaccacctgtacacccacatgacccactttctgaaacagtgcttcagcctgagcgac(SEQ ID NO: 114)
modFAP MKTLVKIVFGVATSAVLALLVMCIVLHPSRVHNSEENTMRALTLKDILNVTFSYKIFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTIMSNRTMKSVNASNYGLSPDWQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVKGNELPHPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYADFNDTDIPVIAYSYYGNEQYPRTINISYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPVYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNISVLSICDFRKDWQTWDCPNTQQHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAILYYKIFSDKDGYKHIHYIKYTVENVIQITSGKWEAINIFRVIQYSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSNYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYQKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYISSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYTSVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSD(SEQ ID NO: 115)
modFAP_ 緊密連接蛋白 18 中之 mod 緊密連接蛋白 18 gccgtcacagcctgtcagagcctgggctttgtggtgtccctgatcgagatcgtgggcatcattgccgctacctgcatggaccagtggtctacccaggacctgtataacaaccccgtgaccgccgtgttcaactaccaaggcctgtggcacagctgcatgagagagagcagcggcttcaccgagtgcaggggctactttaccctgctggaactgccagccatgctgcaggctgtgcaggcccttatgatcgtgggaattgtgctgggcgccatcggcctgctggtgtctatttttgccctgaagtgcatccggatcggcagcatggaagatagcgccaaggccaacatgaccctgacctccggcatcatgttcatcgtgtccggcctgtgtgccattgcaggcgtgtccgtgtttgccaatatgctcgtgaccaacttctggctgtccaccgccaacatgtacaccggcatgggcgagatggtgcagaccgtgcagacacggtacacatttggcgccgctctgtttgtcggatgggttgcaggcggactgactctgattggcggcgtgatgatgtgtatcgcctgcagaggactggcccctgaggaaacaaactacaaggccgtgtactaccacgccagcggacacagcgtggcatacaaaccaggcggctttaaggccagcacaggcttcggcagcaacaccaagaacaagaagatctacgacggcggagcccataccgaggatgaggtgcagagctaccctagcaagcacgactacgtg(SEQ ID NO: 116)
在一些實施例中，本文提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之來自至少兩種癌細胞株之細胞，其中各細胞株或細胞株之組合表現表7-23之TAA中之至少1者、2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者或10者。在其他實施例中，表7-23中之TAA經修飾以包括一或多個如本文所述之NSM。在一些實施例中，至少一種細胞株經修飾以增加至少1種、2種或3種免疫刺激因子、例如來自表4之免疫刺激因子的產生。在一些實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含治療有效量之來自至少一種癌細胞株之細胞，其中各細胞株或細胞株之組合經修飾以減少至少1種、2種或3種免疫抑制因子、例如來自表6之免疫抑制因子。在一些實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含兩種混合物，其中各混合物包含三種細胞株，該等細胞株經修飾以表現1種、2種或3種免疫刺激因子及抑制或減少1種、2種或3種免疫抑制因子之表現，且其中各細胞株表現至少10種TAA或包含一或多個NSM之TAA。
用於確定根據本揭示案之細胞株中或來自個體之腫瘤中TAA之存在或表現水準的方法及分析係所屬領域中已知的。藉由實例，本揭示案考慮所有以下方法：沃伯格-克里斯蒂安法(Warburg-Christian method)、勞立分析(Lowry Assay)、布拉福分析(Bradford Assay)、光譜法(諸如高效液相層析法(HPLC)、液相層析-質譜分析(LC/MS))、基於免疫印跡及抗體之技術(諸如西方墨點法)、ELISA、免疫電泳、蛋白質免疫沈澱、流動式細胞測量術及蛋白質免疫染色。
在一些實施例中，可在生檢試樣中使用下一代定序及基於抗體之方法評估由患者腫瘤展示之抗原譜系。類似地，在一些實施例中，可使用相同技術確定循環腫瘤細胞(CTC)所表現之抗原來評估潛在轉移性病變之抗原譜系。腫瘤生檢及CTC中之抗原表現之評估可代表所表現之抗原子集。在一些實施例中，鑑別患者原發性腫瘤及/或CTC所表現之抗原子集，且如本文所述，告知有待包括在疫苗組合物中之細胞株的選擇以便提供與患者腫瘤及/或轉移性病變中所表現之抗原的最佳可能匹配。
本揭示案之實施例提供細胞株之組合物，該等細胞株(i)如本文所述進行修飾，及(ii)表現足夠數目及量之TAA，使得當投與罹患癌症、多種癌症或癌性腫瘤之患者時，產生TAA特異性免疫反應。刺激免疫反應之方法及治療方法
可向有需要之個體投與本文所述之疫苗組合物。本文提供用於誘導個體中之免疫反應的方法，其涉及向個體投與免疫學上有效量之經基因修飾之細胞。亦提供用於預防或治療個體之腫瘤的方法，其藉由投與抗腫瘤有效量之本文所述之疫苗組合物。此類組合物及方法可有效延長個體之存活。
根據各種實施例，本文所提供之任一疫苗組合物的投與可增加白血球之促炎性細胞介素產生(例如IFNγ分泌)。在一些實施例中，本文所提供之任一疫苗組合物之投與可增加白血球之促炎性細胞介素產生(例如IFNγ分泌)至少1.5倍、1.6倍、1.75倍、2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍或更多倍。在其他實施例中，相較於未經修飾之癌細胞株，IFNγ產生增加大約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高。不受任何理論或機制束縛，白血球之促炎性細胞介素產生(例如IFNγ分泌)之增加係與疫苗組合物之間接或直接相互作用的結果。
在一些實施例中，與不包含經修飾之細胞之組合物相比，包含如本文所述之一或多種經修飾之細胞株的本文所提供之任一疫苗組合物之投與可增加吞噬細胞對疫苗組合物之細胞的吸收，例如增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍或更多倍。
在一些實施例中，藉由皮內注射向個體提供疫苗組合物。不受任何理論或機制束縛，在至少一些實施例中，皮內注射產生局部發炎反應，將免疫細胞募集至注射部位。在投與疫苗之後，皮膚中之抗原呈遞細胞(APC)，諸如朗格罕氏細胞(LC)及皮膚樹突狀細胞(DC)，藉由吞噬作用吸收疫苗細胞株組分，且接著遷移穿過真皮，至引流淋巴結。在引流淋巴結處，預期已吞噬疫苗細胞株組分之DC或LC引發原生T細胞及B細胞。預期原生T細胞及B細胞之引發開啟針對由疫苗細胞株表現之腫瘤相關抗原(TAA)的適應性免疫反應。由疫苗細胞株組分表現之某些TAA亦由患者腫瘤表現。預期引流淋巴結處抗原特異性T細胞之擴增及此等T細胞遷移至腫瘤微環境(TME)產生疫苗誘導之抗腫瘤反應。
根據各種實施例，同種異體疫苗組合物之免疫原性可經由減少免疫抑制因子之表現同時增加免疫刺激信號之表現或分泌的基因修飾而進一步增強。此等因子之調節旨在增強真皮中LC及DC對疫苗細胞株組分之吸收，DC及LC遷移至引流淋巴結，引流淋巴結中之T細胞及B細胞引發，及藉此引起更有效之抗腫瘤反應。
在一些實施例中，疫苗組合物中靶向之TAAs之廣度可經由包括多種細胞株而增加。例如，某一腫瘤類型內之不同組織學子集往往表現不同TAA子集。作為另一實例，在NSCLC中，腺癌及鱗狀細胞癌表現不同抗原。根據本發明之一些實施例，由疫苗組合物誘導之適應性免疫反應的量值及廣度可經由包括表現相同或不同免疫刺激因子之另外細胞株而增強。例如，三種細胞株之混合物內之一種細胞株對諸如IL-12之免疫刺激因子的表現可用於局部增強對遞送至相同位點中之所有細胞株的免疫反應。混合物內超過一種細胞株之免疫刺激因子(諸如GM-CSF)之表現可增加注射部位中之免疫刺激因子之量，藉此增強誘導之針對混合物所有組分之免疫反應。疫苗混合物內存在之HLA錯配之程度可進一步增強由該混合物誘導之免疫反應。
如本文所述，在各種實施例中，提供一種刺激個體中特異性針對至少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種、30種、31種、32種、33種、34種、35種、36種、37種、38種、39種、40種或更多種TAA之免疫反應的方法，其包含投與治療有效量之包含經修飾之癌細胞株的疫苗組合物。
「免疫反應」為免疫系統細胞、諸如B細胞、T細胞或單核球對諸如細胞或抗原(例如調配為抗原組合物或疫苗)之刺激的反應。免疫反應可為B細胞反應，其引起諸如抗原特異性中和抗體之特異性抗體的產生。免疫反應亦可為T細胞反應，諸如CD4+反應或CD8+反應。B細胞及T細胞反應為「細胞」免疫反應之態樣。免疫反應亦可為「體液」免疫反應，由抗體介導。在一些情況下，反應對特定抗原、諸如一或多種TAA具有特異性(亦即，「抗原特異性反應」)，且此特異性可包括產生抗原特異性抗體及/或產生細胞介素，諸如干擾素γ，干擾素γ係與Th1 T細胞反應產生有關之關鍵細胞介素且可藉由ELISpot及流動式細胞測量術量測。
可藉由在免疫接種之後使用流動式細胞測量術(FACS)分析、ELISpot分析或所屬領域中已知之其他方法量測T細胞反應CD4+及CD8+來測試疫苗功效。個體暴露於免疫原性刺激、諸如細胞或抗原(例如調配為抗原組合物或疫苗)會引發對刺激具有特異性之原發性免疫反應，亦即，暴露「引發」免疫反應。隨後例如藉由免疫接種暴露於刺激物可增加或「加強」特異性免疫反應之量值(或持續時間或兩者)。因此，藉由投與抗原組合物「加強」預先存在之免疫反應可增加抗原(或細胞)特異性反應之量值(例如藉由增加抗體滴度及/或親和力、藉由增加抗原特異性B或T細胞之頻率、藉由誘導成熟效應功能或其組合)。
藉由本文所述之方法監測/分析或刺激的免疫反應包括(但不限於)：(a)抗原特異性或疫苗特異性IgG抗體；(b)血清細胞介素水準之變化，細胞介素可包括且不限於：IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17A、IL-20、IL-22、TNFα、IFNγ、TGFβ、CCL5、CXCL10；(c)由ELISpot測定之針對CD4及CD8 T細胞疫苗之IFNγ反應及抗原特異性反應；(d)對TAA或疫苗細胞組分之IFNγ反應的變化；(e)對抗原刺激起反應，T細胞之細胞內細胞介素IFNγ、TNFα及IL-2以及細胞溶解可能性之指示物顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素及CD107a之產生增加；(f)調控T細胞(Treg、單核性單核球衍生之抑制細胞(M-MDSC)及多形核衍生之抑制細胞(PMN-MDSC)之含量減少；(g)循環腫瘤細胞之含量減少(CTC)；(h)嗜中性球與淋巴球比率(NLR)及血小板與淋巴球比率(PLR)；(i)TME中免疫浸潤之變化；以及(j)樹突狀細胞成熟。
本文描述用於測定免疫反應之分析且係所屬領域中熟知。DC成熟可例如藉由分析諸如CD80、CD83、CD86及MHC II之DC成熟標記物之存在來評估。(參見Dudek, A.等人, 《免疫學前沿(Front. Immunol.)》, 4:438(2013))。抗原特異性或疫苗特異性IgG抗體可藉由ELISA或流動式細胞測量術評估。血清細胞介素水準可使用多路方法，諸如Luminex或Meso Scale Discovery電化學發光(MSD)量測。T細胞活化及淋巴球群體中之變化可藉由流動式細胞測量術量測。可使用基於RT-PCR之方法量測PBMC中之CTC。可使用標準全血球計數(CBC)化學組確定NLR及PLR比率。TME中免疫浸潤之變化可藉由流動式細胞測量術、腫瘤生檢及下一代定序(NGS)或個體之正電子發射斷層攝影法(PET)掃描來評估。
鑒於不同類型之癌症及腫瘤之間的TAA表現之重疊，在某些實施例中，本揭示案提供可治療多種不同癌症之組合物。舉例而言，包含各三種細胞株之兩種混合物的一種疫苗組合物可投與罹患兩種或更多種類型癌症之個體且該疫苗組合物有效治療兩種、另外或所有類型之癌症。在示例性實施例中且考慮到TAA表現圖譜，包含經修飾之癌細胞株之相同疫苗組合物用於治療同一患者(或不同患者)之前列腺癌及睪丸癌、胃癌及食道癌、或子宮內膜癌、卵巢癌及乳癌。在熱性腫瘤或冷性腫瘤之子集內亦可出現TAA重疊。舉例而言，在視為冷性腫瘤之GBM及SCLC中出現TAA重疊。包括在疫苗組合物之實施例中的示例性TAA包括GP100、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-A10、Sart-1、Sart-3、Trp-1及Sox2。在一些實施例中，包括在疫苗組合物中之細胞株可選自類似免疫狀況之兩種腫瘤類型以治療相同個體中之腫瘤類型中的一或兩者。
如本文所用，例如細胞介素(諸如IFNγ)之變化或「產生增加」係指產生/分泌/表現相對於對照或基線水準變化或增加，且指示對抗原或疫苗組分之免疫刺激反應。組合治療及方案 調配物、佐劑及額外治療劑
本文所述之組合物可調配為醫藥組合物。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料。在與醫藥調配物之其他成分相容之意義上，每種組分必須為「醫藥學上可接受的」。其亦必須適於與組織、器官或其他人類組分接觸使用，而無過量毒性、刺激、過敏反應、免疫原性或其他問題或併發症，滿足合理效益/風險比。(參見《雷明頓：藥學科學與實踐(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)》, 第21版；賓夕法尼亞州費城(Philadelphia, PA)的Lippincott Williams & Wilkins: 2005；《藥物賦形劑手冊(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》, 第5版；Rowe等人編, The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005；及《醫藥添加劑手冊(Handbook of Pharmaceutical Additives)》, 第3版；Ash及Ash編, Gower Publishing Company: 2007；《醫藥預調配及調配(Pharmaceutical Preformulation and Formulation)》, Gibson編, CRC Press LLC: 《佛羅里達州博卡拉頓(Boca Raton, FL)》, 2004))。
本揭示案之醫藥組合物之實施例經調配以與其預期投藥途徑(亦即，非經腸、靜脈內、動脈內、皮內、皮下、經口、吸入、經皮、局部、瘤內、經黏膜、腹膜內或胸膜內及/或直腸投藥)相容。用於非經腸、皮內或皮下應用之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如水、生理食鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；二甲亞碸(DMSO)；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，及用於調整張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉調節pH。非經腸製劑可封裝在安瓿、拋棄式注射器或一或多個包含玻璃或聚合物(例如聚丙烯)之小瓶中。如本文所用，術語「小瓶」意謂適於儲存如本文所述之疫苗組合物之實施例的任一種類器皿、容器、管、燒瓶或其類似物。
在一些實施例中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，術語「載劑」涵蓋稀釋劑、賦形劑、佐劑及其組合。醫藥學上可接受之載劑為所屬領域中所熟知(參見《雷明頓：藥學科學與實踐》, 第21版)。示例性「稀釋劑」包括無菌液體，諸如無菌水、生理食鹽水溶液及緩衝劑(例如磷酸鹽、tris、硼酸鹽、丁二酸鹽或組胺酸)。示例性「賦形劑」為可增強疫苗穩定性且包括(但不限於)聚合物(例如聚乙二醇)、碳水化合物(例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖或纖維素)及醇(例如甘油、山梨糖醇或木糖醇)之惰性物質。
在各種實施例中，疫苗組合物及其細胞株組分係無菌且流體的，以至組合物及/或細胞株組分可負載至一或多個注射器中。在各種實施例中，組合物在製造及儲存條件下應為穩定的，且通常防止微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。在一些實施例中，載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由維持所需粒度(在分散液之情況下)、藉由使用界面活性劑及藉由所屬領域之技術人員已知之其他方式來維持。微生物作用之防止可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苄酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及類似物。在一些實施例中，可能期望組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)及/或氯化鈉。在一些實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
在一些實施例中，可藉由如下方法來製備無菌可注射溶液：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，視需要隨後進行過濾滅菌。在某些實施例中，分散液係藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及來自本文中列舉之成分的其他所需成分之無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，製備方法之實施例包括真空乾燥及冷凍乾燥，由其先前無菌過濾溶液產生活性成分加任何額外所需成分之粉末。
先天免疫系統包含以非特異性方式提供對其他生物體感染之防禦的細胞。雖然個體中之先天性免疫係即時防禦，但其並不持久或預防未來挑戰。通常在先天性免疫中起作用之免疫系統細胞為吞噬細胞，諸如巨噬細胞及樹突狀細胞。先天免疫系統以多種方式與適應性(亦稱為後天性)免疫系統相互作用。
在一些實施例中，疫苗組合物單獨活化免疫反應(亦即，先天性免疫反應、適應性免疫反應及/或其他免疫反應)。在一些實施例中，一或多種佐劑視情況包括在疫苗組合物中，或相對於疫苗組合物同時或策略性地投與，以提供支持先天性免疫活化以增強疫苗組合物之效力的藥劑。如本文所用，「佐劑」為併入至疫苗組合物中或相對於疫苗組合物之投與同時或在所選時間點或以所選方式投與的「藥劑」或物質。在一些實施例中，佐劑為小分子、化學組合物或治療性蛋白質，諸如細胞介素或檢查點抑制劑。已提出多種機制來解釋不同藥劑如何起作用(例如抗原儲槽、樹突狀細胞、巨噬細胞之活化劑)。藥劑可用於以各種方式增強後天性免疫反應且許多類型藥劑可活化先天性免疫。如細菌及病毒之生物體可活化先天性免疫，生物體之組分、化學物質(諸如2'-5'寡核苷酸A)、細菌內毒素、RNA雙螺旋體、單股RNA及其他組合物亦可活化先天性免疫。許多藥劑經由在本文中稱為「鐸樣受體(toll-like receptor)」(TLR)之分子家族起作用。與TLR之接合亦可引起細胞介素及趨化因子產生及樹突狀細胞(與後天性免疫性之發展有關之組分)之活化及成熟。TLR家族可對多種試劑，包括脂蛋白、肽聚醣、鞭毛蛋白、咪唑喹啉、CpG DNA、脂多醣及雙股RNA起反應。此等類型試劑有時稱為病原體(或微生物)相關分子模式。在一些實施例中，佐劑為TLR4促效劑。
在一些實施例中，可用於疫苗組合物中之一種佐劑為一元酸脂質A(MALA)型分子。一種示例性MALA為MPL®佐劑，如例如以下中所述：Ulrich J.T.及Myers, K.R., 第21章, 《疫苗設計：次單元與佐劑途徑(Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach)》, Powell, M.F.及Newman, M.J.編Plenum Press, NY(1995)。
在其他實施例中，佐劑可為「明礬」，其中此術語係指鋁鹽，諸如磷酸鋁及氫氧化鋁。
在一些實施例中，佐劑可為具有疫苗佐劑特性之乳液。此類乳液包括水包油乳液。不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's adjuvant，IFA)為一種此類佐劑。另一適合水包油乳液為MF-59™佐劑，其含有角鯊烯、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(亦稱為Tween® 80界面活性劑)及脫水山梨糖醇三油酸酯。其他合適乳液佐劑為Montanide™佐劑(新澤西州費爾菲爾德(Fairfield NJ)的Seppic公司)，包括Montanide™ ISA 50V(其為基於礦物油之佐劑)、Montanide™ ISA 206及Montanide™ IMS 1312。雖然礦物油可存在於佐劑中，在一個實施例中，本揭示方案之組合物之油組分均為可代謝油類。
在一些實施例中，佐劑可為AS02™佐劑或AS04™佐劑。AS02™佐劑為水包油乳液，其含有MPL™佐劑及QS-21™佐劑(本文中其他地方論述之皂素佐劑)。AS04™佐劑含有MPL™佐劑及明礬。佐劑可為Matrix-M™佐劑。佐劑可為皂素，諸如來源於皂皮樹(Quillaja saponaria)物種樹皮之皂素，或經修飾之皂素，參見例如美國專利第5,057,540號、第5,273,965號、第5,352,449號、第5,443,829號及第5,560,398號。由Antigenics公司(馬薩諸塞州列克星敦(Lexington, MA))出售之產品QS-21™佐劑為一種示例性含皂素之輔佐劑，可用於本文所述之組合物之實施例。在其他實施例中，佐劑可為來自ISCOM™家族佐劑之試劑中的一種或試劑組合，最初由Iscotec(瑞典(Sweden))研發且通常自來源於皂皮樹之皂苷或合成類似物、膽固醇及磷脂形成，均形成為蜂巢樣結構。
在一些實施例中，佐劑或試劑可為充當佐劑之細胞介素，參見例如Lin R.等人 《臨床感染性疾病(Clin. Infec. Dis.)》21(6):1439-1449(1995)；Taylor, C.E., 《傳染與免疫(Infect. Immun.)》63(9):3241-3244(1995)；及Egilmez, N.K., 第14章 《疫苗佐劑與遞送系統(Vaccine Adjuvants and Delivery Systems)》, John Wiley & Sons公司(2007)。在各種實施例中，細胞介素可為例如顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)；參見例如Change D.Z.等人 《血液學(Hematology)》 9(3):207-215(2004), Dranoff, G. 《免疫學評論(Immunol. Rev.)》188:147-154(2002)及美國專利5,679,356；或干擾素，諸如I型干擾素，例如干擾素-α(IFN-α)或干擾素-β(IFN-β)或II型干擾素，例如干擾素-γ(IFNγ)，參見例如Boehm, U.等人 《免疫學年鑒(Ann. Rev. Immunol.)》15:749-795(1997)；及Theofilopoulos, A.N.等人 《免疫學年鑒》23:307-336(2005)；介白素，特別包括介白素-1α(IL-1α)、介白素-1β(IL-1β)、介白素-2(IL-2)；參見例如Nelson, B.H., 《免疫學雜誌(J. Immunol.)》172(7): 3983-3988(2004)；介白素-4(IL-4)、介白素-7(IL-7)、介白素-12(IL-12)；參見例如Portielje, J.E.等人, 《癌症免疫學與免疫治療(Cancer Immunol. Immunother.)》52(3): 133-144(2003)及Trinchieri. G. 《自然免疫學評論(Nat. Rev. Immunol.)》3(2):133-146(2003)；介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)；胎兒肝臟酪胺酸激酶3配位體(Flt3L)或腫瘤壞死因子α(TNFα)。
在一些實施例中，佐劑可為未甲基化之CpG二核苷酸，視情況結合於本文所述之抗原。
可作為佐劑用於本文所述之組合物及方法之實踐中的免疫增強劑之實例包括：MPL™；MDP及衍生物；寡核苷酸；雙股RNA；替代病原體相關分子模式(PAMPS)；皂苷；小分子免疫增強劑(SMIP)；細胞介素；以及趨化因子。
當兩種或更多種佐劑或試劑組合使用時，可選擇多種佐劑之相對量以相對於單獨抗原，實現含有佐劑之組合物之所需效能特性。舉例而言，可選擇佐劑組合以增強抗原之抗體反應，及/或增強個體之先天性免疫系統反應。活化先天性免疫系統引起趨化因子及細胞介素之產生，此又可活化適應性(後天性)免疫反應。活化適應性免疫反應之一個重要結果係形成記憶免疫細胞，以便在宿主再遇到該抗原時，免疫反應更快地出現且通常品質更佳。在一些實施例中，佐劑可在其與本文所述之組合物組合之前預調配。
本文所述之疫苗組合物之實施例可與一或多種其他佐劑或試劑、包括治療劑投與同時、在其之前或在其之後投與。在某些實施例中，此類試劑可在本領域中公認為針對特定癌症之標準治療或預防。所考慮之示例性試劑包括細胞介素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、消炎劑、免疫檢查點抑制劑、化學治療劑、放射線治療劑或其他活性及輔助劑。在其他實施例中，試劑為如本文所述之一或多種經分離之TAA。
在一些實施例中，本文提供之疫苗組合物投與先前尚未接受過針對癌症或其他疾病或病症之某些治療之個體。如本文所用，短語「其中該個體避免用其他疫苗或治療劑治療」係指個體在接受本揭示案之疫苗之前尚未接受過癌症治療或其他治療或程序。在一些實施例中，個體避免在投與如本文各種實施例中所述之治療性疫苗之前接受一或多種治療性疫苗(例如流感疫苗、covid-19疫苗，諸如AZD1222、BNT162b2、mRNA-1273及其類似物)。在一些實施例中，個體避免在投與如本文各種實施例中所述之治療性疫苗之前接受一或多種抗生素。「免疫耐受性」為免疫系統對可能誘導免疫反應之物質、抗原或組織的無反應狀態。在某些實施例中，投與本揭示案之疫苗組合物以避免誘導免疫耐受性或逆轉免疫耐受性。
在各種實施例中，疫苗組合物與用於治療癌症之一或多種活性劑、包括一或多種化學治療劑組合投與。此類活性劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclophosphamide，CYTOXANTM )；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、氧氮芥鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麴黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺藥，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲(hydroxyurea)；磨菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；PSK®；雷佐生(razoxane)；西佐糖(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside，「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology, 新澤西州普林斯頓(Princeton, N.J.))及太平洋紫杉醇蛋白質結合顆粒(ABRAXANE®)及多西他賽(doxetaxel)(TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, 法國安東尼(Antony, France))；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼、多西他賽、鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞賓(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷；道諾黴素；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylomithine，DMFO)；視黃酸衍生物，諸如TARGRETIN™(貝瑟羅汀(貝瑟羅汀))、PANRETIN™(阿利維甲酸(alitretinoin))；以及ONTAK™(迪夫托斯地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括用來調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷諾昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(法樂通(Fareston))；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。其他癌症治療劑包括索拉非尼(sorafenib)及其他蛋白激酶抑制劑，諸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、克卓替尼(crizotinib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼羅替尼(nilotinib)、帕尼單抗(panitumumab)、帕佐泮尼(pazopanib)、派加替尼(pegaptanib)、蘭比珠單抗(ranibizumab)、盧佐替尼(ruxolitinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)及舒尼替尼(sunitinib)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、依維莫司(everolimus)及其他mTOR抑制劑。
在其他實施例中，疫苗組合物與TLR4促效劑、TLR8促效劑或TLR9促效劑組合投與。此類促效劑可選自肽聚醣、polyI:C、CpG、3M003、鞭毛蛋白及真核核糖體伸長及起始因子4a之利什曼原蟲同源物(LeIF)。
在一些實施例中，疫苗組合物與如本文中所述之細胞激素組合投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物可與靶向以下各者中之一或多者的分子結合投與：黏附：MAdCAM1、ICAM1、VCAM1、CD103；抑制介體：IDO、TDO；MDSC/Treg：NOS1、精胺酸酶、CSFR1、FOXP3、環磷醯胺、PI3Kγ、PI3Kδ、他喹莫德(tasquinimod)；免疫抑制：TGFβ、IL-10；引發及呈遞：BATF3、XCR1/XCL1、STING、INFα；細胞凋亡再循環：IL-6、存活素、IAP、mTOR、MCL1、PI3K；T細胞遷移：CXCL9/10/11、CXCL1/13、CCL2/5、抗LIGHT、抗CCR5；致癌活化：WNT-β-cat、MEK、PPARγ、FGFR3、TKI、MET；表觀遺傳重新程式化：HDAC、HMA、BET；血管生成免疫調節：VEGF(α、β、γ)；低氧：HIF1α、腺苷、抗ADORA2A、抗CD73及抗CD39。
在某些實施例中，本文所揭示之組合物可與組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制劑結合投與。HDAC抑制劑包括異羥肟酸酯、環肽、脂族酸及苯甲醯胺。考慮用於本文中之例示性HDAC抑制劑包括(但不限於)辛二醯苯胺異羥肟酸(SAHA/伏立諾他(Vorinostat)/佐林紮(Zolinza))、曲古黴素(Trichostatin A，TSA)、PXD-101、縮酚酞(Depsipeptide)(FK228/羅米地辛(romidepsin)/ISTODAX®)、帕比諾他(panobinostat)(LBH589)、MS-275、莫塞諾他(Mocetinostat)(MGCD0103)、ACY-738、TMP195、妥西司他(Tucidinostat)、丙戊酸(valproic acid)、苯丁酸鈉、5-氮雜-2'-去氧胞苷(地西他濱(decitabine))。參見例如Kim及Bae, 《美國轉化研究雜誌(Am J Transl Res 2011)》;3(2):166-179；Odunsi等人, 《癌症免疫學研究(Cancer Immunol Res.)》 2014年1月1日; 2(1): 37-49。其他HDAC抑制劑包括伏立諾他(SAHA、MK0683)、恩替諾特(Entinostat)(MS-275)、帕比諾他(Panobinostat)(LBH589)、曲古黴素A(Trichostatin A，TSA)、莫塞諾他(Mocetinostat)(MGCD0103)、ACY-738、妥西司他(Tucidinostat)西達本胺(Chidamide)、TMP195、西他司他(Citarinostat)(ACY-241)、貝林諾他(Belinostat)(PXD101)、羅米地辛(Romidepsin)(FK228、縮酚酞)、MC1568、土巴他汀(Tubastatin)A HCl、吉韋諾他(Givinostat)(ITF2357)、達諾司他(Dacinostat)(LAQ824)、CUDC-101、奎西諾他(Quisinostat)(JNJ-26481585)2HCl、普拉諾他(Pracinostat)(SB939)、PCI-34051、卓新諾他(Droxinostat)、阿貝司他(Abexinostat)(PCI-24781)、RGFP966、AR-42、瑞考司他(Ricolinostat)(ACY-1215)、丙戊酸鈉鹽(丙戊酸鈉)、泰克地那林(Tacedinaline)(CI994)、CUDC-907、丁酸鈉、薑黃素(Curcumin)、M344、突巴辛(Tubacin)、RG2833(RGFP109)、雷米諾他(Resminostat)、雙丙戊酸鈉(Divalproex Sodium)、斯克太德(Scriptaid)及土巴他汀A。
在某些實施例中，疫苗組合物與氯奎寧(chloroquine)組合投與，氯奎寧係一種趨溶酶體劑，其阻止核內體酸化且抑制由腫瘤細胞誘導之自體吞噬，從而經受住加速之細胞生長及營養剝奪。更一般而言，包含如本文所述之異型接合病毒載體之組合物可與充當自體吞噬抑制劑、放射敏化劑或化學敏化劑(諸如氯奎寧、米索硝唑(misonidazole)、甲硝噠唑(metronidazole)及諸如替拉紮明(tirapazamine)之低氧細胞毒素)之活性劑組合投與。在此點上，異型接合病毒載體與氯奎寧或其他放射或化學敏化劑或自體吞噬抑制劑之此類組合可進一步與其他癌症活性劑或放射線療法或手術組合使用。
在其他實施例中，疫苗組合物與已知引起腫瘤細胞殺死且伴隨免疫反應活化(稱為「免疫原性細胞死亡」)之一或多種小分子藥物，諸如環磷醯胺、多柔比星、奧沙利鉑(oxaliplatin)及米托蒽醌組合投與。此外，與已知增強腫瘤細胞之免疫原性之藥物組合，該等藥物諸如帕土匹龍(patupilone)(埃坡黴素B(epothilone B))、靶向表皮生長因子受體(EGFR)之單株抗體7A7.27、組蛋白去乙醯基酶抑制劑(例如伏立諾他、羅米地辛(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、貝林諾他及恩替諾特)、n3-多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸，此外蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib))、紫草醌(shikonin)(紫草(Lithospermum erythrorhizon)根部主要成分)及溶瘤病毒，諸如TVec(塔利拉帕(talimogene laherparepvec))。在一些實施例中，如本文所述之包含異型接合病毒載體之組合物可與可局部或全身投與之表觀遺傳療法，諸如DNA甲基轉移酶抑制劑(例如地西他濱、5-氮雜-2'-去氧胞苷)組合投與。
在其他實施例中，疫苗組合物與增加DC對腫瘤之ADCC吸收的一或多種抗體組合投與。因此，本揭示案之實施例考慮將癌症疫苗組合物與誘導或增強抗原呈遞細胞對腫瘤細胞或其片段之攝取及隨後腫瘤抗原呈遞至免疫系統的任何分子組合。此等分子包括誘導受體結合(例如Fc或甘露糖受體)及輸送至抗原呈遞細胞之試劑，諸如抗體、抗體樣分子、多特異性多價分子及聚合物。此類分子可在腫瘤內與包含異型接合病毒載體之組合物一起投與或藉由不同途徑投與。舉例而言，如本文所述之包含異型接合病毒載體之組合物可在腫瘤內與在腫瘤內注射以下各者一起投與：利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、坎帕斯(Campath)、帕尼單抗(panitumumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、本妥昔單抗(brentuximab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、阿多-曲妥珠單抗恩他新(Ado-trastuzumab emtansine)、阿托珠單抗(Obinutuzumab)、抗HER1、抗HER2或抗HER3抗體(例如MEHD7945A；MM-111；MM-151；MM-121；AMG888)、抗EGFR抗體(例如尼妥珠單抗(nimotuzumab)、ABT-806)或其他類似抗體。能夠接合Fc受體及可誘導內化之其他受體的任何多價骨架可用於本文所述之組合療法中(例如能夠結合連接於Fc片段之目標的肽及/或蛋白質或能夠接合受體之聚合物)。
在某些實施例中，疫苗組合物可進一步與以下各者之抑制劑組合：ALK、PARP、VEGFRs、EGFR、FGFR1-3、HIF1α、PDGFR1-2、c-Met、c-KIT、Her2、Her3、AR、PR、RET、EPHB4、STAT3、Ras、HDAC1-11、mTOR及/或CXCR4。
在某些實施例中，癌症疫苗組合物可進一步與促進協同刺激信號(例如藉由阻斷抑制路徑)之抗體(諸如抗CTLA-4)，或活化協同刺激路徑之抗體(諸如抗CD40、抗CD28、抗ICOS、抗OX40、抗CD27、抗ICOS、抗CD127、抗GITR、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、GM-CSF、IL-12及INFα組合。 檢查點抑制劑
在某些實施例中，檢查點抑制劑分子與本文所述之疫苗組合物組合投與。免疫檢查點係指對於維持自體耐受性及調節免疫反應之持續時間及幅度而言至關重要的免疫系統之多種抑制路徑。腫瘤使用某些免疫檢查點路徑作為免疫抵抗之主要機制，尤其抵抗對腫瘤抗原具有特異性之T細胞。(參見Pardoll, 2012 《自然(Nature)》 12:252；Chen及Mellman 《免疫性(Immunity)》 39:1(2013))。免疫檢查點抑制劑包括以統計學上顯著之方式阻斷或抑制免疫系統之抑制路徑的任何藥劑。此類抑制劑可包括結合於且阻斷或抑制免疫檢查點受體之抗體或其抗原結合片段，或結合於且阻斷或抑制免疫檢查點受體配位體之抗體。可靶向用於阻斷或抑制之例示性免疫檢查點分子包括(但不限於)CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9、2B4(屬於CD2家族之分子且在所有NK、γδ及記憶CD8+(αβ)T細胞上表現)、CD160(亦稱為BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括抗體或其抗原結合片段、或其他結合蛋白，其結合於且阻斷或抑制以下中之一或多者之活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9、2B4、CD160及CGEN-15049。
例示性免疫檢查點抑制劑包括抗PD1、抗PDL1及抗PDL2劑，諸如A167、AB122、ABBV-181、ADG-104、AK-103、AK-105、AK-106、AGEN2034、AM0001、AMG-404、ANB-030、APL-502、APL-501、賽帕利單抗(zimberelimab)、阿特珠單抗、AVA-040、AVA-040-100、阿維魯單抗、巴提利單抗(balstilimab)、BAT-1306、BCD-135、BGB-A333、BI-754091、布地格單抗(budigalimab)、坎立珠單抗、CB-201、CBT-502、CCX-4503、賽咪單抗、科西貝利單抗(cosibelimab)、西利單抗、CS-1001、CS-1003、CX-072、CX-188、多斯利單抗、德瓦魯單抗、恩沃利單抗(envafolimab)、舒格利單抗(sugemalimab)、HBM9167、F-520、FAZ-053、傑諾珠單抗(genolimzumab)、GLS-010、GS-4224、hAB21、HLX-10、HLX-20、HS-636、HX-008、IMC-001、IMM-25、INCB-86550、JS-003、JTX-4014、JYO-34、KL-A167、LBL-006、羅達泊單抗(lodapolimab)、LP-002、LVGN-3616、LYN-00102、LMZ-009、MAX-10181、MEDI-0680、MGA-012(瑞弗利單抗(Retifanlimab))、MSB-2311、納武單抗、派姆單抗、普羅高單抗(prolgolimab)、普羅力單抗(prololimab)、三薩力單抗(sansalimab)、SCT-I10A、SG-001、SHR-1316、斯迪利單抗(sintilimab)、斯巴達珠單抗(spartalizumab)、RG6084、RG6139、RG6279、CA-170、CA-327、STI-3031、托勒拉西(toleracyte)、toca 521、Sym-021、TG-1501、緹勒珠單抗(tislelizumab)、特瑞普利單抗(toripalimab)、TT-01、ZKAB-001及WO/2017/124050中所述之能夠阻斷與其配位體PD-L1及PD-L2之相互作用的抗PD-1抗體。
至少一個目標為抗PD1、抗PDL1或抗PDL2之例示性多特異性免疫檢查點抑制劑包括ABP-160(CD47×PD-L1)、AK-104(PD-1×CTLA-4)、AK-112(PD-1×VEGF)、ALPN-202(PD-L1×CTLA-4×CD28)、AP-201(PD-L1×OX-40)、AP-505(PD-L1×VEGF)、AVA-0017(PD-L1×LAG-3)、AVA-0021(PD-L1×LAG-3)、AUPM-170(PD-L1×VISTA)、BCD-217(PD-1×CTLA-4)、BH-2950(PD-1×HER2)、BH-2996h(PD-1×PD-L1)、BH-29xx(PD-L1×CD47)、α賓曲福斯(bintrafusp alfa)(PD-L1×TGFβ)、CB-213(PD-1×LAG-3)、CDX-527(CD27×PD-L1)、CS-4100(PD-1×PD-L1)、DB-001(PD-L1×HER2)、DB-002(PD-L1×CTLA-4)、DSP-105(PD-1×4-1BBL)、DSP-106、(PD-1×CD70)、FS-118(LAG-3×PD-L1)、FS-222(CD137/4-1BB×PD-L1)、GEN-1046(PD-L1×CD137/4-1BB)、IBI-318(PD-1×PD-L1)、IBI-322(PD-L1×CD-47)、KD-033(PD-L1×IL-15)、KN-046(PD-L1×CTLA-4)、KY-1043(PD-L1×IL-2)、LY-3434172(PD-1×PD-L1)、MCLA-145(PD-L1×CD137)、MEDI-5752(PD-1×CTLA-4)、MGD-013(PD-1×LAG-3)、MGD-019(PD-1×CTLA-4)、ND-021(PD-L1×4-1BB×HSA)、OSE-279(PD-1×PD-L1)、PRS-332(PD-1×HER2)、PRS-344(PD-L1×CD137)、PSB-205(PD-1×CTLA-4)、R-7015(PD-L1×TGFβ)、RO-7121661(PD-1×TIM-3)、RO-7247669(PD-1×LAG-3)、SHR-1701(PD-L1×TGFβ2)、SL-279252(PD-1×OX40L)、TSR-075(PD-1×LAG-3)、XmAb-20717(CTLA-4×PD-1)、XmAb-23104(PD-1×ICOS)及Y-111(PD-L1×CD-3)。
另外例示性免疫檢查點抑制劑包括抗CTLA4劑，諸如：ADG-116、AGEN-2041、BA-3071、BCD-145、BJ-003、BMS-986218、BMS-986249、BPI-002、CBT-509、CG-0161、Olipass-1、HBM-4003、HLX-09、IBI-310、伊派利單抗(ipilimumab)、JS-007、KN-044、MK-1308、ONC-392、REGN-4659、RP-2、曲美木單抗(tremelimumab)及紮弗利單抗(zalifrelimab)。至少一個目標為抗CTLA4之另外例示性多特異性免疫檢查點抑制劑包括：AK-104(PD-1×CTLA-4)、ALPN-202(PD-L1×CTLA-4×CD28)、ATOR-1015(CTLA-4×OX40)、ATOR-1144(CTLA-4×GITR)、BCD-217(PD-1×CTLA-4)、DB-002(PD-L1×CTLA-4)、FPT-155(CD28×CTLA-4)、KN-046(PD-L1×CTLA-4)、)、MEDI-5752(PD-1×CTLA-4)、MGD-019(PD-1×CTLA-4)、PSB-205(PD-1×CTLA-4)、XmAb-20717(CTLA-4×PD-1)及XmAb-22841(CTLA-4×LAG-3)。另外例示性免疫檢查點抑制劑包括抗LAG3劑，諸如BI-754111、BJ-007、α艾法莫德(eftilagimod alfa)、GSK-2831781、HLX-26、IBI-110、IMP-701、IMP-761、INCAGN-2385、LBL-007、MK-4280、REGN-3767、瑞拉單抗(relatlimab)、Sym-022、TJ-A3及TSR-033。至少一個目標為抗LAG3之另外例示性多特異性免疫檢查點抑制劑包括：CB-213(PD-1×LAG-3)、FS-118(LAG-3×PD-L1)、MGD-013(PD-1×LAG-3)、AVA-0017(PD-L1×LAG-3)、AVA-0021(PD-L1×LAG-3)、RO-7247669(PD-1×LAG-3)、TSR-075(PD-1×LAG-3)及XmAb-22841(CTLA-4×LAG-3)。另外例示性免疫檢查點抑制劑包括抗TIGIT劑，諸如AB-154、ASP8374、BGB-A1217、BMS-986207、CASC-674、COM-902、EOS-884448、HLX-53、IBI-939、JS-006、MK-7684、NB-6253、RXI-804、替拉格魯單抗(tiragolumab)及YH-29143。考慮至少一個目標為抗TIGIT之另外例示性多特異性免疫檢查點抑制劑。另外例示性免疫檢查點抑制劑包括抗TIM3劑，諸如：BGB-A425、BMS-986258、ES-001、HLX-52、INCAGN-2390、LBL-003、LY-3321367、MBG-453、SHR-1702、Sym-023及TSR-022。至少一個目標為抗TIM3之另外例示性多特異性免疫檢查點抑制劑包括：AUPM-327(PD-L1×TIM-3)及RO-7121661(PD-1×TIM-3)。另外例示性免疫檢查點抑制劑包括抗VISTA劑，諸如：HMBD-002及PMC-309。至少一個目標為抗VISTA之另外例示性多特異性免疫檢查點抑制劑包括CA-170(PD-L1×VISTA)。另外例示性免疫檢查點抑制劑包括抗BTLA劑，諸如：JS-004。考慮至少一個目標為抗BTLA之另外例示性多特異性免疫檢查點抑制劑。例示性刺激免疫檢查點包括抗OX40劑，諸如ABBV-368、GSK-3174998、HLX-51、IBI-101、INBRX-106、INCAGN-1949、INV-531、JNJ-6892及KHK-4083。至少一個目標為抗OX40之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括AP-201(PD-L1×OX-40)、APVO-603(CD138/4-1BB×OX-40)、ATOR-1015(CTLA-4×OX-40)及FS-120(OX40×CD137/4-1BB)。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗GITR劑，諸如BMS-986256、CK-302、GWN-323、INCAGN-1876、MK-4166、PTZ-522及TRX-518。至少一個目標為抗GITR之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括ATOR-1144(CTLA-4×GITR)。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗CD137/4-1BB劑，諸如：ADG-106、AGEN-2373、AP-116、ATOR-1017、BCY-3814、CTX-471、EU-101、LB-001、LVGN-6051、RTX-4-1BBL、SCB-333、烏瑞魯單抗(urelumab)、烏圖木單抗(utomilumab)及WTiNT。至少一個目標為抗CD137/4-1BB之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括ALG.APV-527(CD137/4-1BB×5T4)、APVO-603(CD137/4-1BB×OX40)、BT-7480(巢蛋白-4×CD137/4-1BB)、CB-307(CD137/4-1BB×PSMA)、CUE-201(CD80×CD137/4-1BB)、DSP-105(PD-1×CD137/4-1BB)、FS-120(OX40×CD137/4-1BB)、FS-222(PD-L1×CD137/4-1BB)、GEN-1042(CD40×CD137/4-1BB)、GEN-1046(PD-L1×CD137/4-1BB)、INBRX-105(PD-L1×CD137/4-1BB)、MCLA-145(PD-L1×CD137/4-1BB)、MP-0310(CD137/4-1BB×FAP)、ND-021(PD-L1×CD137/4-1BB×HSA)、PRS-343(CD137/4-1BB×HER2)、PRS-342(CD137/4-1BB×GPC3)、PRS-344(CD137/4-1BB×PD-L1)、RG-7827(FAP×4-1BBL)及RO-7227166(CD-19×4-1BBL)。
另外例示性刺激免疫檢查點包括抗ICOS劑，諸如BMS-986226、GSK-3359609、KY-1044及沃普瑞單抗(vopratelimab)。至少一個目標為抗ICOS之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括XmAb-23104(PD-1×ICOS)。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗CD127劑，諸如MD-707及OSE-703。考慮至少一個目標為抗CD127之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗CD40劑，諸如ABBV-428、ABBV-927、APG-1233、APX-005M、BI-655064、比勒斯單抗(bleselumab)、CD-40GEX、CDX-1140、LVGN-7408、MEDI-5083、米佐利單抗(mitazalimab)及塞立路單抗(selicrelumab)。至少一個目標為抗CD40之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括GEN-1042(CD40×CD137/4-1BB)。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗CD28劑，諸如FR-104及賽拉利單抗(theralizumab)。至少一個目標為抗CD28之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括ALPN-101(CD28×ICOS)、ALPN-202(PD-L1×CD28)、CUE-201(CD80×CD137/4-1BB)、FPT-155(CD28×CTLA-4)及REGN-5678(PSMA×CD28)。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗CD27劑，諸如：HLX-59及瓦里木單抗。至少一個目標為抗CD27之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括DSP-160(PD-L1×CD27/CD70)及CDX-256(PD-L1×CD27)。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗IL-2劑，諸如ALKS-4230、BNT-151、CUE-103、NL-201及THOR-707。至少一個目標為抗IL-2之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點包括CUE-102(IL-2×WT1)。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗IL-7劑，諸如BNT-152。考慮至少一個目標為抗IL-7之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點。另外例示性刺激免疫檢查點包括抗IL-12劑，諸如AK-101、M-9241及優特克單抗(ustekinumab)。考慮至少一個目標為抗IL-12之另外例示性多特異性刺激免疫檢查點。
如本文所述，本揭示案提供投與疫苗組合物、環磷醯胺、檢查點抑制劑及/或諸如Treg抑制劑之其他治療劑之方法。Treg抑制劑係所屬領域中已知的且包括例如貝培阿地白介素(bempegaldesleukin)、氟達拉賓、吉西他濱、米托蒽醌、環孢黴素A、他克莫司(tacrolimus)、太平洋紫杉醇、伊馬替尼、達沙替尼、貝伐單抗、艾代拉里斯(idelalisib)、抗CD25、抗葉酸受體4、抗CTLA4、抗GITR、抗OX40、抗CCR4、抗CCR5、抗CCR8或TLR8配位體。 給藥
如本文所用，「劑量」或「單位劑量」係指包含治療有效量之一種多種細胞株之一或多種疫苗組合物。劑量可為單一疫苗組合物、兩種單獨疫苗組合物或兩種單獨疫苗組合物加包含一或多種本文所述之治療劑之一或多種組合物。當在單獨組合物中時，「劑量」之兩種或更多種組合物意謂「同時」投與。在一些實施例中，兩種或更多種組合物投與在個體之不同部位(例如手臂、大腿或背部)上。如本文所用，「同時」投與兩種組合物或治療劑指示在第一種組合物或治療劑投與約30分鐘內，投與第二種組合物或治療劑。在超過兩種組合物及/或治療劑同時投與之狀況下，各組合物或藥劑在30分鐘內投與，其中此類投與之時機開始於第一種組合物或藥劑之投與，且以開始投與最後一種組合物或藥劑結束。在一些狀況下，同時投與可在開始投與第一種組合物或藥劑、約30分鐘內或15分鐘內或10分鐘內或5分鐘內完成(亦即，投與最後一種組合物或藥劑開始)在投與第一種組合物「之前」或「之後」投與第二(或多種)治療劑或組合物意謂第一種組合物與另一治療劑之投與相隔至少30分鐘，例如至少1小時、至少2小時、至少4小時、至少6小時、至少8小時、至少10小時、至少12小時、至少18小時、至少24小時或至少48小時。
來自疫苗組合物中之多種個別細胞株之細胞的量(例如數目)可相同(如本文所定義)、大約(如本文所定義)相同或不同。在各種實施例中，疫苗組合物之各細胞株以大約相同之量存在。在其他實施例中，一種疫苗組合物中之2種或3種細胞株以大約相同之量存在，且第二組合物中之2種或3種不同細胞株以大約相同之量存在。
在一些實施例中，來自各細胞株(在投與多種細胞株之狀況下)之細胞之數目為大約5.0×105 、1.0×106 、2.0×106 、3.0×106 、4.0×106 、5.0×106 、6.0×106 、7.0×106 、8×106 、9.0×106 、1.0×107 、2.0×107 、 3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、8.0×107 、9.0×107 、1.0×108 、2.0×108 、3.0×108 、4.0×108 或5.0×108 個細胞。在一個實施例中，考慮大約1000萬(例如1.0×107 )個來自一種細胞株之細胞。在另一實施例中，在投與6種單獨細胞株之情況下，考慮大約1000萬個來自各細胞株之細胞或6000萬(例如6.0×107 )個總細胞。
疫苗組合物中例如每個投與部位投與之細胞總數目可在1.0×106 至3.0×108 之範圍內。舉例而言，在一些實施例中，投與2.0×106 、3.0×106 、4.0×106 、5.0×106 、6.0×106 、7.0×106 、8×106 、9.0×106 、1.0×107 、2.0×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、8.0×107 、9.0×107 、1.0×108 、2.0×108 或3.0×108 個細胞。
如本文所述，每次投與混合物或疫苗組合物下所含之細胞株之數目可在1至10種細胞株之範圍內。在一些實施例中，來自各細胞株之細胞之數目不相同，且混合物或疫苗組合物中包括不同比率之細胞株。舉例而言，若一種混合物含有來自3種不同細胞株之5.0×107 個總細胞，則一種細胞株可為3.33×107 個細胞且其餘2種細胞株可為8.33×106 個細胞。
疫苗組合物及包含額外治療劑(例如化學治療劑、檢查點抑制劑及其類似物)之組合物可經口、非經腸、藉由吸入噴霧、局部、經直腸、經鼻、頰內、經陰道或經由植入式儲集囊投與。如本文所用，術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內、顱內、經皮、皮內、肺內、腹膜內、心內、動脈內及舌下注射或輸注技術。亦設想如下實施例，其中疫苗組合物及包含額外治療劑(例如化學治療劑、檢查點抑制劑及其類似物)之組合物在結節內或腫瘤內投與。
在一些實施例中，疫苗組合物在皮內投與。在相關實施例中，皮內注射涉及以5至15°之投與角度注射混合物或疫苗組合物。
注射(例如皮內或皮下注射)可提供於單個部位(例如手臂、大腿或背部)或多個部位(例如手臂及大腿)處。在一些實施例中，疫苗組合物同時在兩個部位投與，其中各部位接受包含不同組合物(例如混合物)之疫苗組合物。舉例而言，在一些實施例中，個體接受包含手臂中三種細胞株及大腿中三種不同或部分重疊細胞株之組合物。在一些實施例中，個體在每個手臂及每個大腿中同時接受包含一或多種細胞株之組合物。
在一些實施例中，個體接受多個劑量之混合物或疫苗組合物且劑量投與在個體上之不同部位，以避免某些(例如引流)淋巴結處之可能抗原競爭。在一些實施例中，在劑量之間藉由在個體上交替投與部位(例如左臂和右臂或左大腿和右大腿)來投與多個劑量。在一些實施例中，多個劑量如下投與：第一劑量在一個手臂中投與，且第二劑量在另一個手臂中投與；若投與後續劑量，則繼續以此方式交替投與。在一些實施例中，多個劑量如下投與：第一劑量在一個大腿中投與，且第二劑量在另一個大腿中投與；若投與後續劑量，則繼續以此方式交替投與。在一些實施例中，多個劑量如下投與：第一劑量在一個大腿中投與，且第二劑量在一個手臂中投與；若投與後續劑量，則可以對於個體而言安全且有效之任何組合交替投與。在一些實施例中，多個劑量如下投與：第一劑量在一個大腿及一個手臂中投與，且第二劑量在另一個手臂及另一個大腿中投與；若投與後續劑量，則可以對於個體而言安全且有效之任何組合交替投與。
在一些實施例中，經由皮內注射，個體接受包含總共六種細胞株(例如NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、LK-2、NCI-H23及A549或本文所述之其他6細胞株組合)之疫苗組合物，呈一種、兩種或更多種單獨混合物，各混合物包含6細胞株中之一種或兩種或更多種之混合物。在一些實施例中，經由皮內注射，個體接受包含三種細胞株(例如NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、LK-2、NCI-H23及A549中之三種或來自本文所述之其他6細胞株組合之三種細胞株)之混合物的疫苗組合物。在一些實施例中，經由皮內注射至手臂(例如上臂)，個體接受包含三種細胞株之混合物的疫苗組合物，該等細胞株包含NCI-H460、NCI-H520及A549；且經由皮內注射至腿(例如大腿)，個體同時接受包含三種細胞株之混合物的疫苗組合物，該等細胞株包含DMS 53、LK-2及NCI-H23。
在投與額外治療劑之情況下，劑量或多個劑量可經由與疫苗組合物相同或不同之途徑投與。藉由實例，在一些實施例中，包含檢查點抑制劑之組合物經由靜脈內注射來投與，且疫苗組合物經由皮內注射來投與。在一些實施例中，環磷醯胺經口投與，且疫苗組合物在皮內投與。 方案
根據本揭示案之疫苗組合物可在個體上之多個投與部位、多次及以多種量投與。若個體免疫系統處於容許活化抗腫瘤免疫反應之狀態下，則可能影響腫瘤細胞疫苗之功效。若個體正進行或已接受放射線療法、化學療法或其他先前治療，則功效亦可能因此受影響。在一些實施例中，此需要在活化及效應元件完全起作用時，抑制免疫系統之免疫抑制元件。除本文所述之免疫抑制因子之外，抑制抗腫瘤免疫性之其他元件包括(但不限於)T調控細胞(Treg)及檢查點分子，諸如CTLA-4、PD-1及PD-L1。
在一些實施例中，疫苗相對於先前化學療法及放射線療法週期之投與時機經設定以使個體免疫系統在疫苗投與之前的免疫容許狀態達到最大。本揭示案提供用於調節免疫系統之方法，該等方法在疫苗接種之前一劑或低劑量投與諸如環磷醯胺之化學治療劑以增加全細胞腫瘤疫苗之功效。在一些實施例中，節拍化學療法(例如頻繁、低劑量投與化學療法藥物，沒有長期無藥物中斷)用於調節免疫系統。在一些實施例中，節拍化學療法允許低含量藥物存留在血液中，沒有在較高劑量下常看到之毒性及副作用之併發症。藉由實例，在一些實施例中，投與環磷醯胺以調節免疫系統包括在接受疫苗劑量之前的時間(例如在投與疫苗組合物之前15天至1小時)投與藥物以維持水準小於1之效應T細胞與調節T細胞之比率。
在一些實施例中，在本文所提供之疫苗組合物之一些或所有投與之前可投與化學療法方案(例如清髓性化學療法、環磷醯胺及/或氟達拉賓方案)。環磷醯胺(CYTOXANTM 、NEOSARTM )係一種熟知之癌症藥物，其干擾癌細胞在體內之生長及擴散。環磷醯胺可呈丸劑(經口)、液體或經由靜脈內注射投與。大量研究顯示，環磷醯胺可增強疫苗功效。(參見例如Machiels等人, 《癌症研究(Cancer Res.)》, 61:3689, 2001；Greten, T.F.等人, 《免疫療法雜誌(J. Immunother.)》, 2010, 33:211；Ghiringhelli等人, 《癌症免疫學與免疫治療》, 56:641, 2007；Ge等人, 《癌症免疫學與免疫治療》, 61:353, 2011；Laheru等人, 《臨床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》, 14:1455, 2008；及Borch等人, 《腫瘤免疫學(OncoImmunol)》, e1207842, 2016)。在一些實施例中，如本文所述之「低劑量」環磷醯胺有效耗乏Treg、減弱Treg活性及增強效應T細胞功能。在一些實施例中，靜脈內低劑量投與環磷醯胺包括在2-5天內40-50 mg/kg分次給藥。其他低給藥方案包括每7-10天1-15 mg/kg或每週兩次3-5 mg/kg。根據本揭示案之一些實施例，低劑量口服包括初始及維持給藥均為每天1-5 mg/kg。口服錠劑之劑型為25 mg及50 mg。在一些實施例中，環磷醯胺呈口服50 mg錠劑投與7天，直至第一個及視情況每個後續劑量之本文所述之疫苗組合物。
在一些實施例中，環磷醯胺在7天中之每一天呈口服50 mg錠劑投與，直至第一個後續劑量之疫苗組合物，且視情況在每個後續劑量之疫苗組合物之前的7天中之每一天投與。在另一實施例中，在每次投與癌症疫苗混合物或單位劑量之前，患者服用或接受口服劑量之25 mg環磷醯胺，每日兩次，其中一個劑量在日出時的早晨且第二劑量在入睡前的夜晚，歷時7天。在某些實施例中，疫苗組合物在幾年內多次在皮內投與。在一些實施例中，在投與疫苗組合物之後每兩週或每三週投與檢查點抑制劑。
在另一實施例中，在投與癌症疫苗混合物或單位劑量之疫苗組合物之前至少一天，患者接受200、250、300、500或600 mg/m2 單個靜脈內劑量之環磷醯胺。在另一實施例中，在投與第4、8、12號疫苗劑量之癌症疫苗混合物或單位劑量之前至少一天，患者接受200、250、300、500或600 mg/m2 靜脈內劑量之環磷醯胺。在另一實施例中，在投與癌症疫苗混合物或單位劑量之前至少1小時，患者接受呈靜脈內注射之1000 mg/kg單次劑量之環磷醯胺。在一些實施例中，投與200 mg/kg之口服高劑量或500-1000 mg/m²之IV高劑量。
環磷醯胺之投與可經由以下任一者：經口(例如呈膠囊、用於溶液之散劑、或錠劑)；靜脈內(例如藉由注射或輸注經靜脈(IV)投與)；肌肉內(例如經由注射至肌肉中(IM))；腹膜內(例如經由注射至腹部內層中(IP))；以及胸膜內(例如經由注射至肺內層中)。
在一些實施例中，可在疫苗組合物之前、與其同時或在其之後投與免疫療法檢查點抑制劑(例如抗CTLA4、抗PD-1抗體(諸如派姆單抗及納武單抗)、抗PDL1(諸如德瓦魯單抗))。在某些實施例中，每3週經60分鐘呈靜脈內輸注投與2 mg/kg派姆單抗。在一些實施例中，每3週經30分鐘呈靜脈內輸注投與200 mg派姆單抗。在一些實施例中，每6週經30分鐘呈靜脈內輸注投與400 mg派姆單抗。在一些實施例中，每兩週投與10 mg/kg德瓦魯單抗。在一些實施例中，每2週投與240 mg納武單抗(或每4週480 mg)。在一些實施例中，每3週投與1 mg/kg納武單抗，接著在同一天投與伊派利單抗，4劑，接著每2週240 mg(或每4週480 mg)。在一些實施例中，每3週投與3 mg/kg納武單抗，接著在同一天投與1 mg/kg伊派利單抗，4劑，接著每2週240 mg(或每4週480 mg)。在一些實施例中，每2週投與或3 mg/kg納武單抗。
在一些實施例中，每2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週投與德瓦魯單抗或派姆單抗，投與多達8次，且接著視需要減少至每6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週。
在其他實施例中，本揭示案提供PD-1及PD-L1抑制劑以固定給藥方案(亦即，不基於體重)投與。在非限制性實例中，PD-1抑制劑每週或在第2週、第3週、第4週、第6週及第8週以100-1200 mg之間的量投與。在非限制性實例中，PD-L1抑制劑每週或在第2週、第3週、第4週、第6週及第8週以250-2000 mg之間的量投與。
在一些實施例中，如本文所述之疫苗組合物或組合物與PD-1抑制劑同時或組合投與，該PD-1抑制劑以100 mg與1500 mg之間的固定劑量或基於重量0.5 mg/kg與15 mg/kg之間的劑量Q1W、Q2W、Q3W、Q4W、Q6W或Q8W給與。在另一實施例中，如本文所述之疫苗組合物或組合物與PD-L1抑制劑同時組合投與，該PD-L1抑制劑以250 mg與2000 mg之間的固定劑量或基於重量2 mg/kg與30 mg/kg之間的劑量Q2W、Q3W或Q4W給與。在其他實施例中，投與上述方案，但以短連續或串聯的形式投與組合物，使得患者在同一次問診期間接受疫苗組合物或組合物及檢查點抑制劑。
植物印度大麻(Cannabis sativa L.)用作草藥療法已有數百年歷史，且為植物大麻素之重要來源。內源性大麻素系統(ECS)由受體、內源性配位體(內源性大麻素)及代謝酶組成，且在不同生理學及病理學過程中起作用。植物大麻素及合成大麻素可與ECS之組分或其他細胞路徑相互作用，且因此可影響包括癌症之疾病的發展或進展。在癌症患者中，大麻素可用作姑息護理之一部分以緩解疼痛，減輕噁心及刺激食慾。另外，大量細胞培養及動物研究顯示大麻素在多種癌症類型中之抗腫瘤作用。(關於評論，參見Daris, B.等人, 《波斯尼亞基礎醫學科學雜誌(Bosn. J. Basic. Med. Sci.)》, 19(1):14-23(2019)。)植物大麻素為一組C21萜烯酚類化合物，主要由來自大麻屬之植物產生。存在若干不同大麻素及相關分解產物。當中有四氫大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)、 大麻酚(CBN)、大麻環萜酚(CBC)、∆8-THC、大麻二酚酸(CBDA)、次大麻二酚(CBDV)及大麻萜酚(CBG)。
在本揭示案之某些實施例中，在投與諸如環磷醯胺之Treg細胞抑制劑之前或與之同時，停止所有植物大麻素之使用，及/或另外在投與根據本揭示案之疫苗組合物之前或與之同時，停止所有植物大麻素之使用。在一些實施例中，在多次投與環磷醯胺或疫苗組合物之情況下，視情況在每次投與之前或與之同時發生終止。在某些實施例中，直至投與疫苗組合物一段時間之後才恢復植物大麻素之使用。舉例而言，考慮在投與環磷醯胺或疫苗劑量之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天及在投與之後至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天禁止投與大麻素。
在一些實施例中，患者將在化學療法結束後的6-12週內接受第一劑量之疫苗。在癌症治療中使用之高劑量化學療法消除增殖細胞且耗乏免疫細胞子集。化學療法結束後，免疫系統將開始重建。T細胞再現之時間間隔為大致2-3週。因為T細胞係目標為活化之免疫細胞子集，所以在一些實施例中，在存在足夠T細胞進行引發之窗口內投與癌症疫苗，而個體仍然為淋巴球減少的。在此環境中，較少的細胞佔據小生境，此將使引發之T細胞迅速分裂，響應於對細胞介素(例如IL7和IL15)之利用增加而經歷「穩態增殖」。因此，藉由在此窗口下給與疫苗，使如本文所述之癌症疫苗平台之實施例的潛在功效最大化以允許引發抗原特異性T細胞及擴大疫苗相關之T細胞反應。選擇細胞株及製備疫苗之方法 細胞株選擇
對於既定癌症或在患者罹患超過一種癌症之情況下，基於若干標準鑑別一種細胞株或細胞株之組合用於包括於疫苗組合物中。在一些實施例中，如以下所提供，逐步進行細胞株之選擇。並非所有癌症適應症均需要所有選擇步驟及/或標準。
步驟1.基於例如癌細胞株百科全書(CCLE)資料庫中RNA-seq資料之可用性，選擇各適應症之細胞株。RNA-seq資料允許鑑別可能顯示特異性針對所關注之癌症適應症之最大抗原廣度的候選細胞株且告知細胞株對免疫抑制因子之可能表現。若CCLE中之RNA-seq資料之可用性受到限制，則RNA-seq資料可源自歐洲分子生物學實驗室-歐洲生物資訊學研究所(EMBL-EBI)資料庫或所屬領域中已知之其他來源。在一些實施例中，當RNA-seq值＞0時，基於RNA-seq資料之所關注蛋白質(例如TAA)的可能表現視為「陽性」。
步驟2.對於所有適應症，優先考慮來源於轉移部位之細胞株，以擴大抗原廣度且更有效地靶向癌轉移患者中之晚期疾病。在一些實施例中包括來源於原發性腫瘤之細胞株以進一步擴大疫苗組合物之廣度。在一些實施例中，還考慮細胞株所源自之癌轉移的位置。舉例而言，在一些實施例中，可選擇來源於淋巴結、腹水及肝臟轉移部位之細胞株，而非所有三種細胞株均來源於肝臟轉移部位。
步驟3.細胞株經選擇以涵蓋廣泛癌症類型分類。舉例而言，管式腺癌為胃癌之常見診斷分類。因此，可選擇匹配此分類之大量細胞株。對於原發性腫瘤部位變化之適應症，可選擇滿足此多樣性之細胞株。舉例而言，對於頭頸部小細胞癌(SCCHN)，在一些實施例中，選擇細胞株以涵蓋起源於口腔、頰黏膜及舌之腫瘤。此等選擇標準能夠靶向患者腫瘤類型之異質群體。在一些實施例中，細胞株經選擇以涵蓋種族多樣化群體以產生來源於不同組織學及種族背景之細胞株候選池。
步驟4.在一些實施例中，基於其他因素選擇細胞株。舉例而言，在轉移性大腸直腸癌(mCRC)中，可包括報導為高微衛星不穩定性(MSI-H)及微衛星穩定性(MSS)細胞株。作為另一實例，對於病毒驅動之適應症，出於安全性及/或製造複雜性問題，可排除編碼病毒基因體之細胞株。
步驟5.在一些實施例中，細胞株經選擇以涵蓋適應症相關突變中變化程度之遺傳複雜性。細胞株突變之異質性可擴大抗原譜系以靶向具有一或多種腫瘤類型之患者內的較大群體。藉由實例，乳癌細胞株可在Her2、孕酮受體及雌激素受體之缺失狀態上多樣化，使得最終單位劑量包括三陰性、雙陰性、單陰性及野生型組合。各癌症類型具有複雜基因體狀況，因此，針對特定適應症，選擇類似基因突變之細胞株。舉例而言，黑色素瘤最常具有BRAF、CDKN2A、NRAS及TP53之改變，因此在一些實施例中，所選黑色素瘤細胞株含有此等基因中之一或多者的基因改變。
步驟6.在一些實施例中，依據基於RNA-seq資料之TAA、TSA及/或癌症/睪丸抗原表現進一步縮小細胞株。使用所屬領域之技術人員顯而易見之搜索方法鑑別與特定腫瘤相關之抗原或抗原集合(參見例如www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/及clinicaltrials.gov)。在一些實施例中，若抗原與陽性臨床結果相關或鑑別作為由特定腫瘤或腫瘤類型高度表現，同時在正常組織中以較低水準表現，則可包括該等抗原。
步驟7.在步驟1至6結束之後，在一些實施例中，基於細胞培養特性及諸如倍增時間、黏附性、尺寸及血清需求之考慮因素，鞏固其餘細胞株候選物之清單。舉例而言，可選擇倍增時間小於80小時之細胞株或需要培養基血清(FBS、FCS)＜10%之細胞株。在一些實施例中，可選擇不形成聚集體之黏附或懸浮細胞株以確保適當細胞計數及活力。
步驟8.在一些實施例中，基於免疫抑制因子之表現(例如如步驟1中所述之基於源自CCLE或EMBL之RNA-seq資料)選擇細胞株。
在一些實施例中，患者腫瘤之生檢及生檢樣品之後續TAA表現圖譜將幫助選擇細胞株。因此，本揭示案之實施例提供一種製備疫苗組合物之方法，其包含以下步驟：確定個體腫瘤之TAA表現圖譜；選擇癌細胞株；修飾癌細胞株；以及在投與之前對細胞株進行輻照以防在投與患者之後增殖。 製備疫苗組合物
在某些實施例中，在製造擴大後，經修飾之細胞株中之所有細胞經輻照、懸浮及低溫保存。在一些實施例中，細胞以10,000 cGy輻照。根據一些實施例，細胞以7,000至15,000 cGy輻照。根據一些實施例，細胞以7,000至15,000 cGy輻照。
在某些實施例中，各小瓶含有120±10 μL(1.2×107 個細胞)之體積。在一些實施例中，每個部位注射之總體積為300 µL或更少。在一些實施例中，每個部位注射之總體積為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300 μL。在例如注射之總體積為300 μL的情況下，本揭示案提供在一些實施例中，注射3×100 μL體積或2×150 μL，總計300 μL。
在一些實施例中，組分細胞株之小瓶儲存於液氮氣相中，直至準備注射。在一些實施例中，組分細胞株中之每一者包裝在單獨小瓶中。
如本文所述，在投與之前，在一些實施例中，藉由針頭及注射器移出兩個小瓶之內含物且注射至第三小瓶中進行混合。在一些實施例中，對於各混合物重複此混合。在其他實施例中，六個小瓶之內含物分成兩組-A及B，其中將三個小瓶之內含物視情況組合或混合至新小瓶(A)中，且其餘三個小瓶之內含物視情況組合或混合至新小瓶(B)中。
在某些實施例中，在低溫保存之前細胞經輻照以防在投與患者之後增殖。在一些實施例中，細胞以7,000至15,000 cGy經輻照，以使細胞無法增殖。
在一些實施例中，細胞株分開且在相同生長培養基中生長。在一些實施例中，細胞株分開且在不同細胞生長培養基中生長。 全腫瘤細胞疫苗組分細胞株之無異種轉化
對用全腫瘤細胞疫苗治療之個體中之抗體反應的分析表明，存活率與針對牛α-Gal抗原之IgG抗體反應之發展之間存在負相關。(參見Xia等人,《細胞化學生物學(Cell Chem Biol)》 23(12):1515-1525(2016))。此係重要的，因為大部分全腫瘤細胞疫苗由已在含有胎牛血清(FBS，其含有牛α-Gal抗原)之培養基中擴增且低溫保存之腫瘤細胞株構成。
在一些實施例中，為防止對FBS中存在之外來抗原起免疫反應，在大規模cGMP製造之前，使本文所揭示之細胞株適應無異種培養基，該等培養基由來自人類來源之為細胞生長必需的生長因子及補充劑構成。如本文所用，術語「適應」及「轉換(converting)」或「轉換(conversion)」可互換使用，如所屬領域技術人員將理解，係指將細胞轉移/改變至不同培養基。在一些實施例中，所選擇之無異種培養基調配物可在所有細胞株中為相同的，或在其他實施例中，可為不同細胞株不同的。在一些實施例中，培養基組合物將不含任何非人類物質，且可包括人類來源蛋白質作為單獨FBS之替代，或人類來源蛋白質與人類來源重組細胞介素及生長因子(例如EGF)之組合。另外，在一些實施例中，無異種培養基組合物亦可含有增強腫瘤細胞株生長之其他補充劑(例如胺基酸、能量來源)。將針對維持細胞株形態之能力及倍增時間不超過FBS中之倍增時間的兩倍以及維持轉殖基因之表現與FBS中類似之能力，選擇無異種培養基調配物。
可採取多種程序以使誘導針對牛抗原之IgG、IgA、IgE、IgM及IgD抗體之可能性降至最低。此等包括(但不限於)：適於在無異種培養基中生長之細胞株；在FBS中生長且在收穫之前置於無異種培養基中一段時間(例如至少三天)的細胞株；在FBS中生長且在收穫及低溫保存之前在無異種培養基中洗滌之細胞株；在含有Buminate(USP級醫藥人類血清白蛋白)作為FBS替代物之培養基中低溫保存的細胞株；及/或在無異種及無動物組分之中間調配物(例如CryoStor)中低溫保存的細胞株。在一些實施例中，此等程序中之一或多者之實施可藉由自疫苗組合物移除牛抗原而降低誘導抗牛抗體之風險。
根據一個實施例，本文所述之疫苗組合物不包含非人類物質。在一些實施例中，本文所述之細胞株在無異種培養基中調配。無異種培養基之使用避免使用免疫顯性異種抗原及諸如BSE朊病毒之可能人畜生物體。藉由實例，在基因修飾之後，細胞株轉移至無異種培養基且擴增以產生種子庫。種子庫低溫保存且儲存於液氮低溫冷凍機中氣相中。
本文提供NSCLC及GBM疫苗製劑之示例性無異種轉換。活體外分析
同種異體全細胞癌症疫苗(諸如本文所述之同種異體全細胞癌症疫苗)引發抗腫瘤免疫反應及證實對疫苗細胞株之修飾增強疫苗相關免疫反應的能力可在活體外分析下模型化。不受任何理論束縛，對疫苗細胞株組分進行之基因修飾經由增強疫苗微環境中之樹突狀細胞(DC)功能而加強適應性免疫反應。TAA、免疫抑制因子及/或免疫刺激因子之表現的可能作用可在活體外，例如使用基於流動式細胞測量術之分析及IFNγ ELISpot分析模型化。
在一些實施例中，為在活體外將對疫苗細胞株組分之修飾的作用模型化，DC來源於自健康供體周邊血液單核細胞(PBMC)分離之單核球且用於下游分析中以表徵在一或多種免疫刺激或免疫抑制因子存在或不存在下的免疫反應。在與未經修飾之親本疫苗細胞株(對照)或經修飾之疫苗細胞株組分共培養期間疫苗細胞株組分被供體來源之不成熟DC吞噬。可使用流動式細胞測量術偵測諸如CD40、CD83、CD86及HLA-DR之DC成熟標記物的變化來評估經修飾之疫苗細胞株組分對DC成熟及藉此後續T細胞引發之作用。可替代地，在與疫苗細胞株組分共培養之後不成熟DC成熟，以磁性方式將成熟DC與疫苗細胞株組分分離，且接著與自體CD14- PBMC共培養6天以模擬T細胞之活體內呈遞及刺激。IFNγ產生係對T細胞刺激活性之量測，在IFNγ ELISpot分析中量測，或藉由流動式細胞測量術評估免疫細胞子集之增殖及表徵。在IFNγ ELISpot分析中，將PBMC用負載有未經修飾之親本疫苗細胞株組分之自體DC刺激以評估在活體內針對未經修飾之腫瘤細胞之可能反應。
IFNγ ELISpot分析可用於評估同種異體疫苗驅動針對由疫苗細胞株表現之臨床上相關TAA之免疫反應的潛能。為在IFNγ ELISpot分析中評估TAA特異性反應，在與DC共培養後，將該等PBMC用包含所關注TAA之已知之不同MHC-I抗原決定基的肽池刺激。在各種實施例中，疫苗組合物可包含3種細胞株，該等細胞株誘導針對至少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或11種非病毒抗原或針對IFNγ反應所評估之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%抗原的IFNγ反應。在一些實施例中，疫苗組合物可為6種細胞株之單位劑量，該等細胞株誘導針對至少5種、6種、7種、8種、9種、10種或11種非病毒抗原或針對IFNγ反應所評估之至少60%、70%、80%、90%或100%抗原的IFNγ反應。活體內小鼠模型
同種異體全細胞疫苗對抗原特異性T細胞之誘導可在活體內使用小鼠腫瘤激發模型模型化，歸因於小鼠與人類之間的TAA之不同異種同源性，本文實施例中提供之疫苗可不直接投與小鼠腫瘤模型。然而，疫苗之鼠類同源物可使用小鼠腫瘤細胞株產生。小鼠模型中其他免疫讀取結果之一些實例為：特異性針對疫苗或TAA之體液免疫反應的表徵；在後續免疫接種下細胞免疫反應之加強；在引流淋巴結處DC遷移及DC子集之表徵；細胞及體液記憶反應之評估；腫瘤負荷之減少；及確定TME中之疫苗相關免疫學變化，諸如腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)與Treg之比率。將使用諸如ELISA、IFNγ ELISpot及流動式細胞測量術之標準免疫學方法。套組
本文所述之疫苗組合物可用於製造藥劑，例如供治療患有癌症之個體或延長個體存活用之藥劑，該癌症為例如肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、大腸直腸癌、乳癌(包括三陰性乳癌(TNBC))、膀胱或泌尿道癌、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、肝細胞(HCC)癌、腎臟或腎細胞癌(RCC)癌、胃或胃癌、卵巢癌、食道癌、睪丸癌、胰臟癌、中樞神經系統癌症、子宮內膜癌、黑色素瘤及間皮癌。
亦提供用於治療患有癌症之個體或延長個體存活之套組，其含有本文所述之任一疫苗組合物，視情況連同注射器、針頭及/或使用說明書一起。亦提供製品，其包括至少一個含有本文所述之任一疫苗組合物之器皿或小瓶及治療患有癌症之個體或延長個體存活的使用說明書。本文所述之任一疫苗組合物可連同投藥說明書一起包括於包含容器、包裝或分配器之套組中。
在一些實施例中，本文提供一種套組，其包含至少兩個小瓶，各小瓶包含疫苗組合物(例如混合物A及混合物B)，其中各小瓶包含至少1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種或更多種細胞株，其中該等細胞株經修飾以抑制或減少一或多種免疫抑制因子之產生，及/或表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現，及/或表現異質性腫瘤相關抗原或新抗原。
藉由實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、LK-2、NCI-H23及A549。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1及KNS-60。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS53、PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145及LNCAP。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、HCT-15、HuTu80、LS411N、HCT-116及RKO。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G及ES-2。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON及OSC-20。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER及UM-UC-3。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1及Fu97。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、AU565、CAMA-1、HS-578T、MCF-7及T-47D。作為另一實例，提供一種套組，其包含6個單獨小瓶，其中各小瓶包含以下細胞株之一：DMS 53、PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2及PSN1。
在一些實施例中，本文提供一種套組，其包含至少兩個小瓶，各小瓶包含疫苗組合物(例如混合物A及混合物B)，其中各小瓶包含至少3種細胞株，其中該等細胞株經修飾以減少一或多種免疫抑制因子之產生或表現，及/或經修飾以增加一或多種免疫刺激因子之表現，及/或表現腫瘤相關抗原之異質性或新抗原。在此等實施例中，兩個小瓶一起為單位劑量。各單位劑量可每個小瓶具有約5×106 個至約5×107 個細胞，例如每個小瓶約5×106 個至約3×107 個細胞。
在一些實施例中，本文提供一種套組，其包含至少六個小瓶，各小瓶包含疫苗組合物，其中各疫苗組合物包含一種細胞株，其中該細胞株經修飾以抑制或減少一或多種免疫抑制因子之產生，及/或經修飾以表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現，及/或表現腫瘤相關抗原之異質性或新抗原。本文提供之實施例中之至少六個小瓶中的每一者可為疫苗組合物之單位劑量。各單位劑量可每個小瓶具有約2×106 個至約50×106 個細胞，例如每個小瓶約2×106 個至約10×106 個細胞。
在一些實施例中，本文提供一種套組，其包含單獨小瓶，各小瓶包含疫苗組合物，其中各疫苗組合物包含一種細胞株，其中該細胞株經修飾以抑制或減少一或多種免疫抑制因子之產生，及/或經修飾以表現一或多種免疫刺激因子或增加其表現，及/或表現腫瘤相關抗原之異質性或新抗原。本文提供之實施例中之每一小瓶可為疫苗組合物之單位劑量。各單位劑量可每個小瓶具有約2×106 個至約50×106 個細胞，例如每個小瓶約2×106 個至約10×106 個細胞。
在一例示性實施例中，提供一種套組，其包含各3種細胞株之兩種混合物(亦即，2種不同疫苗組合物中總共6種細胞株)，如下：每種細胞株8×106 個細胞；每次注射2.4×107 個細胞；以及4.8×107 個細胞總劑量。在另一例示性實施例中，提供每種細胞株1×107 個細胞；每次注射3.0×107 個細胞；以及6.0×107 個細胞總劑量。在一些實施例中，本文所揭示之任一套組之小瓶含有約0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL或1.0 mL本揭示案之疫苗組合物。在一些實施例中，小瓶中細胞之濃度為約5×107 個細胞/毫升至約5×108 個細胞/毫升。
如本文所述之套組可進一步包含針、注射器及其他用於投與之附件。實例 實例 1 ：在與周邊血液單核細胞 (PBMC) 之共培養物中人類肺腺癌細胞株中之 HLA-G 表現之減少增加 IFNγ 分泌
腫瘤細胞對HLA-G之異常表現與腫瘤免疫逃逸、癌轉移及不良預後相關聯。HLA-G與DC上之其受體ILT2及ILT4之接合可促進免疫耐受性及引發具有免疫抑制表型之T細胞。全細胞疫苗之細胞株組分上HLA-G表現之減少可提高VME中之免疫原性。人類腺癌細胞株中 HLA-G 表現之減少
人類腺癌細胞株RERF-LC-Ad1經慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒表現對HLA-G減弱具有特異性之短髮夾核糖核酸(shRNA)(成熟反義序列：TACAGCTGCAAGGACAACCAG)(SEQ ID NO: 23)。親本細胞或經對照(未沉默)shRNA轉導之細胞充當對照。藉由細胞測量術，藉由用APC結合之小鼠單株抗體人類HLA-G(純系87G)染色來測定在shRNA介導之HLA-G減弱之後的HLA-G表現量，且接著進行FACs分選以富集HLA-G低群體。將經修飾及未經修飾之細胞分離且用APC結合之小鼠單株抗體人類HLA-G(純系87G)染色。在用嘌呤黴素進行選擇以富集穩定表現shRNA之細胞之後，在mRNA層面下藉由定量聚合酶鏈反應(qPCR)及在蛋白質層面下藉由流動式細胞測量術分析細胞對HLA-G之表現。對於qPCR，使細胞溶解在Trizol中，分離總RNA且接著轉錄成互補DNA(cDNA)。使用ΔΔCt法，將相對HLA-G mRNA表現用對HLA-G及PSMB4(用於正規化)具有特異性之探針定量。與親本(未經轉導)細胞及經對照(未沉默)shRNA轉導之細胞相比，經針對HLA-G之shRNA穩定轉導之細胞中HLA-G mRNA表現減少至少75%(圖1A)。藉由流動式細胞測量術測定在shRNA介導之HLA-G減弱之後的HLA-G表現量。將經修飾及未經修飾之細胞分離且用APC結合之小鼠單株抗體人類HLA-G(純系87G)染色。螢光(表現)強度計算為△平均螢光強度(ΔMFI=MFI抗 HLA-G -MFI未染色 )。與親本(未經轉導)細胞相比，經針對HLA-G之shRNA穩定轉導之細胞中HLA-G細胞表面表現減少70%(圖1B)。混合淋巴球腫瘤反應 (MLR) 中 IFNγ 分泌之增加
自健康供體血液分離PBMC且與腺癌肺癌細胞株以10:1之PBMC:腫瘤細胞比率共培育，該等細胞株用絲裂黴素C(0.4 µg/ml，16小時)預處理以防腫瘤細胞生長及增殖。在共培養第3天(及第7天)添加不同濃度之介白素-2(IL2)。在第7天及/或第10天收穫細胞培養上清液且藉由ELISA量測IFNγ分泌。在第10天，相較於親本及未沉默腫瘤細胞，PBMC與HLA-G表現減少之腫瘤細胞的共培養物中IFNγ之增加顯著(p＜0.01)(雙向ANOVA與斯達克多重比較檢驗(Sidak's multiple comparisons test))(圖2A)。另外，在共培養期間IFNγ分泌之顯著增加與IL-2濃度無關(p＜0.0001，雙向ANOVA與杜凱氏多重比較檢驗(Tukey's multiple comparisons test))(圖2B)。實例 2 ： CD47 表現之減少增加抗原呈遞細胞對腫瘤細胞株之吞噬作用且增強免疫原性
CD47為「自身」細胞表面標記物且藉此阻止針對健康細胞之免疫反應。原發性腫瘤細胞以及腫瘤細胞株可表現高水準CD47。人類腺癌細胞株中 CD47 表現之減少
將人類NSCLC細胞株A549、NCI-H460及NCI-H520用對CD47具有特異性之靶向以下基因體DNA序列的鋅指核酸酶(ZFN)對電穿孔：CACACAGGAAACTACacttgtGAAGTAACAGAATTA(SEQ ID NO: 27)。在用PE結合之抗人類CD47單株抗體(純系CC2C6)染色之後，藉由流動式細胞測量術鑑別全對偶基因剔除細胞，且接著進行FACS分選以富集CD47陰性群體。ZFN對CD47之基因編輯引起A549(圖3A)、NCI-H460(圖3B)及NCI-H520(圖3C)細胞株對CD47之表現減少超過99%。CD47 之減少增加抗原呈遞細胞對腫瘤細胞株之吞噬作用且增強免疫原性
使用NCI-H520細胞株來測定減少CD47表現(CD47 KO)對吞噬作用及免疫原性之作用。具體而言，使用吞噬作用分析來測定CD47 KO對人類單核球來源之專業抗原呈遞細胞(APC)DC與巨噬細胞之吞噬作用的作用。在IFNγ ELISpot分析中評估藉由NCI-H520未修飾之親本及CD47 KO誘導的免疫反應。人類樹突狀細胞及巨噬細胞之產生
根據製造商說明書，藉由磁力分離自分離自健康供體leukopak(StemCell Technologies，#70500)之CD14+ 細胞獲得人類不成熟樹突狀細胞(iDC)及M1巨噬細胞(MDM)。根據製造商說明書，藉由在ImmunoCult™-ACF樹突狀細胞培養基(StemCell Technologies，#10986)中在ImmunoCult™-ACF樹突狀細胞分化補充劑(StemCell Technologies，#10988)存在下培養CD14+ 細胞來產生iDC。在第3天收穫iDC用於吞噬作用分析，且在第6天收穫用於IFNγ ELISpot分析。藉由在補充有10% FBS之RPMI中在100 ng/mL GM-CSF(PeproTech，#300-03-100UG)存在下培養CD14+ 細胞7天來產生MDM。為使巨噬細胞偏向M1表型，在第7天，將RPMI + 10% FBS培養基替換成含有20 ng/mL LPS(InvivoGen，#tlrl-3pelps)及20 ng/mL IFNγ(PeproTech，300-02-100UG)之巨噬細胞-SFM(Gibco，#12065074)。在第9天收穫MDM用於吞噬作用分析。吞噬作用分析
將未經修飾之親本及CD47 KO NCI-H520細胞用10 μg/mL絲裂黴素C(MMC)處理2小時且靜置隔夜，接著在37℃下用1 μM CSFE(Invitrogen，#C34554)標記30分鐘。將iDC及MDM與經CSFE標記之未經修飾之親本及CD47 KO NCI-H520細胞在37℃下共培養4小時。iDC及細胞株以1:1效應:目標比率在96孔低黏附性U形底盤中共培養。MDM以1:4效應:目標比率在96孔盤中共培養。在培育4小時之後，將共培養物用LIVE/DEAD Aqua(Molecular Probes，#L23105)、αCD45-PE-Cy7(BD Biosciences，純系HI30)及αCD11c-BV605(BD Biosciences，純系B-ly6)針對iDC，或αCD11b-BV421(BD Biosciences，純系ICRF44)針對MDM進行表面染色。使用FlowJo(FlowJo有限責任公司)分析流動式細胞測量術資料。MDM吞噬作用定義為藉由流動式細胞測量術，亦呈CFSE(FITC)陽性之活CD45+ CD11b+ 細胞之百分比。iDC吞噬作用定義為藉由流動式細胞測量術，亦呈CFSE(FITC+ )陽性之活CD45+ CD11c+ 細胞之百分比。未與未經修飾之親本或CD47 KO NCI-H520細胞共培養之MDM及iDC充當對照。IFNγ ELISpot 分析
在裝載iDC之前24小時，以100 Gy(Rad Source 1800 Q)對未經修飾之親本及CD47 KO NCI-H520細胞進行x射線輻照。為裝載iDC，將經輻照之未經修飾之親本及CD47 KO NCI-H520(ATCC HTB-182)與iDC以1:1比率在25 μg/mL匙孔螺血氰蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)(Calbiochem #374807)及1 μg/mL可溶性CD40L(sCD40L)(PeproTech，#AF31002100UG)存在下共培養24小時。接著藉由添加100 IU/mL IFNγ(PeproTech，300-02-100UG)、10 ng/mL LPS(InvivoGen，#tlrl-3pelps)及2.5 μg/mL雷西莫特(Resiquimod，R848)(InvivoGen，#tlrl-3r848)使負載腫瘤細胞之iDC成熟隔夜。將成熟DC(mDC)用αCD45-PE(BD Biosciences，純系HI30)標記且根據製造商之說明書，使用EasySep™釋放人類PE陽性選擇套組(StemCell Technologies，#17654)以磁性方式自共培養物中分離。接著將經分離之mDC與自體CD14- PBMC以1:10 DC:PBMC比率共培養6天。對於IFNγ ELISpot分析(MabTech，3420-4APT-10)，自與mDC之共培養物中分離CD14- PBMC且用負載未經修飾之親本NCI-H520之mDC刺激24小時。根據製造商說明書，偵測IFNγ斑點形成單位(SFU)，計數(S6 Core Analyzer，ImmunoSpot)，且表示為超過對照之SFU數目/106 PBMC。單核球來源之樹突狀細胞及巨噬細胞對 NCI-H520 CD47KO 細胞株之吞噬作用增加
相對於未經修飾之親本細胞株之吞噬作用(7.0 ± 1.2%活/CD45+ /CD11b+ /CFSE+ )，CD47之減少平均使來源於2個健康供體之MDM之吞噬作用增加1.6倍(11.1 ± 1.9%活/CD45+ /CD11b+ /CFSE+ )。相對於未經修飾之親本細胞株之吞噬作用(5.5 ± 3.4%活/CD45+ /CD11c+ /CFSE+ )，CD47之減少亦平均使來源於2個健康供體之iDC之吞噬作用增加2.2倍(11.9 ± 2.3%活/CD45+ /CD11c+ /CFSE+ )(圖4A)。CD47 之減少提高人類鱗狀腫瘤細胞株之免疫原性
相對於負載有未經修飾之親本CD47陽性細胞之DC (5,253±109 SFU)，當自體PBMC與負載有CD47 KO細胞之DC共培養時藉由ELISpot之IFNγ反應高1.9倍(9,980±903 SFU)(p=0.007，史都登氏T檢驗(Student's T-test))(n=3)(圖4B)。實例 3 ：計劃性細胞死亡配位體 1 表現之減少
DC上之PD1結合於腫瘤細胞上之PDL1(CD274)可抑制DC功能且可能減少發炎性(Th1 )T細胞之引發且促進免疫抑制(Th2 )T細胞之引發。
使用鋅指介導之基因編輯減少NSCLC細胞株NCI-H460對PDL1之表現。將細胞株用編碼對PD-L1具有特異性之靶向以下基因體DNA序列之鋅指核酸酶(ZFN)對的DNA質體電穿孔：CCAGTCACCTCTGAACATGaactgaCATGTCAGGCTGAGGGCT(SEQ ID NO:28)。在用PE結合之抗人類CD274單株抗體(純系MIH1)染色之後藉由流動式細胞測量術鑑別全對偶基因剔除細胞，且接著進行FACS分選。在分選之後ZFN對PD-L1之基因編輯引起超過99%之PD-L1陰性NCI-H460細胞(圖5)。實例 4 ：骨髓基質細胞抗原 2(bst2) 表現之減少
BST2為原發性腫瘤細胞及腫瘤細胞株上經由與漿細胞樣樹突狀細胞上之ILT7(CD85g)之相互作用而抑制細胞介素產生(I型干擾素)的細胞表面標記物。
使用ZFN介導之基因編輯，實現NCI-H2009細胞株對BST2之表現的減少。將細胞株用編碼對BST2具有特異性之靶向以下基因體DNA序列之ZFN對的DNA質體電穿孔CCTAATGGCTTCCCTGGATgcagagAAGGCCCAAGGACAAAAG(SEQ ID NO:34)。在用BV421結合之抗人類BST2單株抗體(純系HM1.24)染色之後藉由流動式細胞測量術鑑別全對偶基因剔除細胞。ZFN對BST2之基因編輯引起NCI-H2009細胞對BST2之表現減少98.5%(圖6)。隨後可對經BST2-ZFN處理之NCI-H2009細胞之BST2陽性部分進行FACS分選至純度。實例 5 ：肺癌細胞株中 TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 分泌之減少
TGFβ1及TGFβ2為腫瘤細胞分泌之高免疫抑制性分子以避開免疫監視。此實例描述產生TGFβ1及TGFβ2之分泌減少或不分泌之肺癌細胞株的程序及如何驗證分泌之變化。細胞株、培養及選擇
肺癌細胞株NCI-H460(ATCC HTB-177)、DMS 53(ATCC CRL-2062)、NCI-H520(ATCC HTB-182)、A549(ATCC CCL-185)、NCI-H2023(ATCC CRL-5912)、NCI-H23(ATCC CRL-5800)及NCI-H1703(ATCC CRL-5889)係獲自ATCC且根據ATCC建議進行培養。LK-2(JCRB0829)係獲自日本生物資源研究中心細胞庫(Japanese Collection of Research Biosources Cell Bank，JCRB)且根據JCRB建議進行培養。對於在慢病毒轉導之後的哺乳動物細胞株選擇，使用濃度在2至8 µg/mL範圍內之嘌呤黴素(puromycin)及殺稻瘟菌素(blasticidin)進行選擇及維持。shRNA 介導之 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
細胞株NCI-H460、DMS 53及NCI-H520、A549、NCI-H2023、NCI-H23、LK-2及NCI-H1703經慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒表現對TGFβ1(shTGFβ1，成熟反義序列：TTTCCACCATTAGCACGCGGG(SEQ ID NO:25 ))及TGFβ2(shTGFβ2，成熟反義序列：AATCTGATATAGCTCAATCCG(SEQ ID NO: 24))減弱具有特異性之短髮夾核糖核酸(shRNA)。經對照shRNA(NS)之細胞或親本未經修飾之細胞株充當對照。在進行抗生素選擇以富集穩定表現shRNA之細胞之後，分析細胞之TGFβ1及TGFβ2分泌。TGFβ1 及 TGFβ2 之剔除
使用CRISPR-Cas9及ZFN方法完成TGFβ1及TGFβ2之剔除。對於CRISPR-Cas9剔除，將NCI-H460及NCI-H520細胞株用編碼對TGFβ2具有特異性之靶向以下gDNA序列：GCTTGCTCAGGATCTGCCCG(SEQ ID NO: 29)之Cas9及嚮導RNA或靶向序列GCACTACCAGAGCTAACTCA(SEQ ID NO: 30)之對照嚮導RNA的質體DNA電穿孔。藉由ELISA，針對TGFβ1及TGFβ2之分泌，篩選全對偶基因剔除純系。對於ZFN介導之剔除，將NCI-H460細胞株用編碼對TGFβ1具有特異性之靶向以下基因體DNA(gDNA)序列：CTCGCCAGCCCCCCGagccaGGGGGAGGTGCCGCCCGG(SEQ ID NO: 31)及對TGFβ2具有特異性之靶向以下gDNA序列：AGCTCACCAGTCCCCCAGAagactaTCCTGAGCCCGAGGAAGTC(SEQ ID NO: 32)的鋅指核酸酶(ZFN)對的RNA電穿孔。藉由對擴增單細胞進行基因體DNA定序來篩選全對偶基因剔除純系，且接著分析TGFβ1及TGFβ2分泌。TGFβ1 及 TGFβ2 分泌分析
將TGFβ1及TGFβ2減弱或剔除之細胞及未經修飾或對照經修飾之親本細胞以8.33×104 個細胞/孔塗鋪於24孔中，於常規生長培養基(含有10% FBS之RPMI)中塗鋪。在塗鋪二十四小時之後，將黏附細胞充分洗滌以移除FBS且在RPMI + 5% CTS中繼續培養。在替換培養基四十八小時之後，收穫細胞培養上清液，且儲存於-70℃下，直至根據製造商說明書(DB100B及DB250，R&D Systems)開始TGFβ1及TGFβ2分泌分析。TGFβ1及TGFβ2分泌含量表示為皮克/106 個細胞/24小時。人類TGFβ1及TGFβ2之定量下限分別為15.4 pg/mL(92.4皮克/106 個細胞/24小時)及7.0 pg/mL(42.0皮克/106 個細胞/24小時)。當經修飾之細胞株分泌之TGFβ1或TGFβ2含量低於分析定量下限時，ELISA分析之定量下限用於估計TGFβ1或TGFβ2相對於未經修飾之親本細胞株shRNA之減少百分比。在TGFβ1或TGFβ2分泌低於定量下限之狀況下，定量下限用於確定完成分析之n下的統計顯著性。NCI-H460 細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌之減少
NCI-H460中TGFβ1之減弱使TGFβ1分泌減少62%。類似地，NCI-H460中TGFβ2之減弱使TGFβ2分泌減少84%。NCI-H460中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ1分泌減少57%及TGFβ2分泌減少＞98%(表26)(圖7A)。相較於來自用對照嚮導RNA處理之NCI-H460之純系，在NCI-H460細胞中使用TGFβ2特異性嚮導RNA來源於Cas9介導之剔除的純系顯示純系不分泌超過偵測下限之TGFβ2(減少＞99%)(3686±1478皮克/106 個細胞/24小時)(圖7B)。相較於來自用TGFβ2特異性ZFN對處理之NCI-H460之純系，來源於用TGFβ1特異性ZFN對處理之NCI-H460的純系不分泌超過分析偵測下限之TGFβ1。相較於來自用TGFβ1特異性ZFN對處理之NCI-H460之純系，來源於用TGFβ2特異性ZFN對處理之NCI-H460的純系不分泌超過偵測下限之TGFβ2。來源於用TGFβ1特異性ZFN對處理及用TGFβ2特異性ZFN對處理之NCI-H460的純系不分泌超過偵測下限之TGFβ1或TGFβ2(圖7C)。 DMS 53細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
DMS 53中shRNA介導之TGFβ1之減弱使TGFβ1分泌減少66%。類似地，DMS 53中shRNA介導之TGFβ2之減弱使TGFβ2分泌減少53%。DMS 53中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ1分泌減少74%及TGFβ2分泌減少32%(表26)(圖8A)。NCI-H520 細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
NCI-H520中TGFβ1之減弱無法評估，因為親本細胞株缺乏可偵測之TGFβ1分泌。NCI-H520中TGFβ2之減弱使TGFβ2分泌減少＞99%。NCI-H520(ATCC HTB-182)中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ2分泌減少＞99%(表26)(圖8B)。NCI-H2023 細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
NCI-H2023中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ1分泌減少至低於定量下限(n=8)，估計相較於未經修飾之親本細胞株TGFβ1分泌減少＞90%(933 ± 125皮克/106 個細胞/24小時)(n=8)。相較於未經修飾之親本細胞株，TGFβ1分泌顯著減少(p＜0.0002)。相較於未經修飾之親本細胞株(341 ± 32皮克/106 個細胞/24小時)(n=8)，NCI-H2023中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ2分泌減少65%(118 ± 42皮克/106 個細胞/24小時)(n=8)。相較於未經修飾之親本細胞株，TGFβ2(p=0.0010)分泌顯著減少(曼-惠特尼U檢驗(Mann-Whitney U Test))(表25)(圖9A)。表 25. shRNA 介導肺癌細胞株中 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌之減少
細胞株 TGF β 1( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 ) TGF β 2( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
親本 TGFβ1 KD 減少% 親本 TGFβ2 KD 減少%
NCI-H460 2263 ± 2080 973 ± 551 57 2096 ± 1023 ＜ 42 98
NCI-H520 ＜ 92 ＜ 92 NA 3657 ± 3394 ＜ 42 ＞ 99*
DMS 53 504 ± 407 170 ± 128 53 4869 ± 5024 3293 ± 4161 32
NCI-H2023 933 ± 125 ＜ 92 ＞ 90* 341 ± 32 118 ± 42 65
NCI-H23 1575 ± 125 644 ± 102 59 506 ± 42 48 ± 9 90
A549 5796 ± 339 914 ± 54 84 772 + 49 42 ± 7 95
NCI-H1703 1736 ± 177 429 ± 133 75 ＜ 42 ＜ 42 NA
LK-2 ＜ 92 ＜ 92 NA 197 ± 34 77 ± 12 61
親本指示未經修飾之細胞株。 * 分泌含量低於TGFβ1(92皮克/106 個細胞/24小時)或TGFβ2(42皮克/106 個細胞/24小時)之定量下限。定量下限用於估計相對於親本之減少%。NA：分泌含量低於親本與shRNA修飾之細胞株的定量下限。
NCI-H23 細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
相較於未經修飾之親本細胞株(1,575 ± 125皮克/106 個細胞/24小時)(n=8)，NCI-H23(ATCC CRL-5800)中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ1分泌減少59%(644 ± 102皮克/106 個細胞/24小時)(n=8)。相較於未經修飾之親本細胞株(506 ± 42皮克/106 個細胞/24小時)(n=9)，NCI-H23(ATCC CRL-5800)中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ2分泌減少90%(48 ± 9皮克/106 個細胞/24小時)(n=9)。相較於未經修飾之親本細胞株，TGFβ1(p=0.0011)及TGFβ2(p＜0.0001)分泌顯著減少(曼-惠特尼U檢驗)(表25)(圖9B)。A549 細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
相較於未經修飾之親本細胞株(5,796 ± 339皮克/106 個細胞/24小時)(n=11)，A549中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ1分泌減少84%(914 ± 54皮克/106 個細胞/24小時)(n=11)。相較於未經修飾之親本細胞株(772 ± 49皮克/106 個細胞/24小時)(n=11)，A549中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ2分泌減少95%(42 ± 7皮克/106 個細胞/24小時)(n=11)。相較於未經修飾之親本細胞株，TGFβ1(p=0.0128)與TGFβ2(p=0.0042)分泌顯著減少(曼-惠特尼U檢驗)(表25)(圖9C)。LK-2 細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
未經修飾之親本(n=9)與shRNA修飾之細胞株(n=9)均未分泌超過ELISA分析定量下限之TGFβ1。相較於未經修飾之親本細胞株(197 ± 34皮克/106 個細胞/24小時)(n=10)，LK-2中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ2分泌減少61%(77 ± 12皮克/106 個細胞/24小時)(n=10)。相較於未經修飾之親本細胞株，TGFβ2(p=0.0042)分泌顯著減少(曼-惠特尼U檢驗)(表25)(圖9D)。NCI-H1703 細胞中 TGFβ1 及 TGFβ2 之減弱
相較於未經修飾之親本細胞株(1,736 ± 177皮克/106 個細胞/24小時)(n=3)，NCI-H1703中TGFβ1與TGFβ2之組合減弱使TGFβ1分泌減少75%(429 ± 133皮克/106 個細胞/24小時)(n=3)。未經修飾之親本(n=5)與shRNA修飾之細胞株(n=5)均未分泌超過ELISA分析定量下限之TGFβ2(表25)(圖9E)。實例 6 ： TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 之下調增強細胞免疫反應
將未經修飾之親本、TGFβ1 KD、TGFβ2 KD或TGFβ1+β2 KD NCI-H460細胞用10 μg/mL MMC處理2小時且接著在添加健康供體PBMC之前24小時接種於6孔盤中。將PBMC與經MMC處理之NCI-H460在IL-2存在下共培養5-6天。在第5或6天，小心地自共培養物分離PBMC，計數，且裝載在預塗之IFNγ ELISpot培養盤(MabTech)上。接著將PBMC用經MMC處理之未經修飾之親本NCI-H460細胞或包含已知I類MHC限制性存活素抗原決定基之11種肽之混合物刺激36-48小時。根據製造商說明書偵測IFNγ SFU，計數(CTL CRO Scanning Services)且表示為SFU數目/106 個PBMC。
相較於用未經修飾之親本NCI-H460敏化(507 ± 152 SFU)，用TGFβ1 KD NCI-H460敏化之健康供體(HLA-A*01、HLA-A*02)來源之PBMC顯著增加細胞免疫反應(1613 ± 187 SFU)(p＜0.001)(圖10A)。相較於未經修飾之親本NCI-H460，TGFβ1與TGFβ2之減弱亦顯著增加IFNγ反應(1823 ± 93 SFU)(p＜0.001)。相對於未經修飾之親本細胞株(390 ± 170 SFU)，TGFβ2之減弱未增加IFNγ產生(p=0.692)。在TGFβ1及TGFβ2減弱下免疫反應之增加可能歸因於TGFβ1減弱之作用，因為單獨TGFβ2減弱未增強免疫原性。相較於用未經修飾之親本NCI-H460敏化(773 ± 236 SFU)，在來源於不同供體(HLA-A*01、HLA-A*11)之PBMC中，NCI-H460中TGFβ1之減弱顯著增加細胞免疫反應(1883 ± 144 SFU)(p=0.013)(圖10B)。相對於用未經修飾之親本NCI-H460細胞敏化，單獨TGFβ2(1317 ± 85 SFU(p＞0.999)及TGFβ1與TGFβ2(1630 ± 62)(p=0.249)之減弱亦增加IFNγ反應，但未達到統計顯著性。
存活素(BIRC5)為在多種癌症免疫療法適應症中過度表現之特徵明確之TAA。圖10C展示相較於未經修飾之親本NCI-H460細胞(28±44)，當供體PBMC用NCI-H460 TGFβ2 KD細胞敏化時(192 ± 120 SFU)，IFNγ ELISpot分析中對存活素之I類MHC限制性反應顯著更穩固(p=0.005)。用NCI-H460 TGFβ1 KD(30 ± 64)(p=0.999)或TGFβ1及TGFβ2 KD(30 ± 38)(p=0.999)敏化PBMC在兩個獨立實驗中未展示存活素特異性IFNγ產生顯著增加。
在混合淋巴球共培養反應中在自兩個健康供體(HLA-A*24、HLA-A*30)(HLA-A*02、HLA-A*68)分離之PBMC中進一步表徵TGFβ1 KD對此疫苗方法之免疫原性的作用(n=3/供體)。在IL-2存在下，PBMC單獨培養或與NCI-H520 TGFβ1無義對照或TGFβ1 KD細胞共培養10天。在沒有腫瘤細胞之情況下培養的PBMC用作另外的對照。在第10天，藉由ELISA，量測共培養上清液中之IFNγ分泌(圖11A)。相較於單獨PBMC(83 ± 86 pg/mL)，在與NCI-H520 TGFβ1 KD細胞(272 ± 259 pg/mL)共培養之PBMC的上清液中IFNγ分泌顯著增加(p=0.046)。相較於單獨PBMC，NCI-H520 TGFβ1無義KD之上清液中IFNγ分泌未顯著增加(86 ± 32 pg/mL)(p=0.512)。
在自體PBMC DC共培養分析中進一步評估TGFβ1減弱對NCI-H520之免疫原性的影響。將自分離自健康供體(HLA-A*24、HLA-A*30)之單核球分化的DC負載來自NCI-H520未修飾之親本細胞、TGFβ1 KD、TGFβ2 KD或TGFβ1+β2 KD細胞之細胞溶解產物。將自體PBMC與負載溶解產物之DC在20 U/mL IL-2存在下共培養5-6天。在第5或6天，小心地自共培養物分離PBMC，計數，且以每孔1×105 塗鋪在預塗之IFNγ ELISpot培養盤(MabTech)上。接著將PBMC用經MMC處理之未經修飾之親本NCI-H520細胞刺激36-48小時。結果指示藉由IFNγ ELISpot分析，相較於未經修飾之親本NCI-H520細胞(93 ± 162 SFU)，TGFβ1 KD傾向於增加對NCI-H520未修飾之親本細胞之細胞免疫反應(357 ± 181 SFU)(p=0.181)(圖11B)。相較於與負載NCI-H520(ATCC HTB-182)未修飾之親本溶解產物之DC共培養的自體PBMC，在與來自NCI-H520 TGFβ2 KD(13 ± 23 SFU)(p=0.897)及TGFβ1及TGFβ2 KD(240 ± 142 SFU)(p=0.603)之溶解產物共培養的自體PBMC中誘導的對未經修飾之親本NCI-H520細胞之IFNγ反應未顯著增加IFNγ反應儘管未達到統計顯著性，藉由自體PBMC與負載NCI-H520 TGFβ1 KD及TGFβ1及TGFβ2 KD之DC共培養所誘導之細胞免疫反應比NCI-H520 TGFβ2 KD及未經修飾之親本溶解產物下的細胞免疫反應更穩固。實例 7 ：在細胞株中 TGFβ 之 shRNA 下調誘導比 TGFβ 剔除更強之免疫反應
活體外資料表明完全剔除TGFβ1及TGFβ2誘導針對腫瘤細胞之反應不如兩個分子之shRNA減弱有效。代表性分析在圖12中示出。在IFNγ ELISpot分析中分析之前，將正常供體PBMC與TGFβ1/TGFβ2 shRNA修飾或NCI-H460或TGFβ1/TGFβ2 ZFN剔除之NCI-H460共培養。資料顯示shRNA修飾之細胞誘導之IFNγ分泌比ZFN剔除細胞顯著更佳(p=0.0143，未配對t檢驗)。對於此實驗，測試5個個別供體，shRNA修飾之細胞總共複製24次且剔除細胞總共複製31次。
因為TGFβ1在調控上皮-間質轉化中起關鍵作用，所以完全缺乏TGFβ1在腫瘤細胞中誘導免疫原性較小之表型(Miyazono, K等人, 《醫學前沿(Frontiers of Medicine)》.2018)。當相較於剔除，比較NCI-H460中TGFβ1 TGFβ2 shRNA減弱中重要免疫反應相關蛋白之表現的比率時，此係明顯的(圖13)。相較於剔除細胞，減弱細胞表現高含量之免疫原性蛋白及TAA。
總體而言，實例6及7中所呈現之資料證明在同種異體全細胞疫苗之情況下TGFβ1及/或TGFβ2之減少可增加對未經修飾之親本腫瘤細胞及抗原之細胞免疫反應。此外，此等資料證明相較於TGFβ1及TGFβ2之剔除，shRNA介導之減弱誘導更穩固之免疫反應。實例 8. 具有 shRNA 介導之下調之 TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 分泌的細胞株之組合之免疫原性
如實例2中所述，在進行修改下，藉由IFNγ ELISpot測定TGFβ1及/或TGFβ2分泌減少之細胞株之示例組合的免疫原性。評估兩種不同反應，第一種針對細胞株之組合，且第二種針對已知之腫瘤相關、腫瘤特異性及癌症-睪丸抗原(統稱為抗原)。為評估由細胞株之組合產生之免疫反應，DC以1.0:0.33 DC:細胞株比率負載，以使得DC:總細胞株之比率為1:1。具體而言，將1.5×106 DC與5.0×106 細胞株1、5.0e5 細胞株2及5.0e5 細胞株3共培養。
為評估對抗原之反應，在IFNγ ELISpot分析中將在第6天自與mDC之共培養物分離之CD14- PBMC用抗原特異性肽池刺激24小時，接著偵測IFNγ SFU。抗原特異性反應表示為超過對照之SFU數目/106 PBMC。如下自商業來源獲得抗原肽池：Mage A1(JPT，PM-MAGEA1)、Mage A3(JPT，PM-MAGEA3)、Mage A4(JPT，PM-MAGEA4)、CEACAM(CEA)(JPT，PM-CEA)、MUC1(JPT，PM-MUC1)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、PRAME(Miltenyi Biotec，130-097-286)、WT1(JPT，PM-WT1)、TERT(JPT，PM-TERT)、STEAP(PM-STEAP1)及HER2(JPT，PM-ERB_ECD)。使用來源於HLA-A02(供體1-3)及HLA-A11(供體4)健康供體(n=2-3/細胞株/供體)之細胞測定免疫反應。
藉由IFNγ ELISpot測定三種TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株之六個示例組合的免疫原性(圖14)。
示例疫苗細胞株組合1由NCI-2023、NCI-H23及LK-2 TGFβ1及TGFβ2修飾之細胞株構成。細胞株組合誘導5,499 ± 1,016 SFU之總IFNγ反應(n=9/3供體)，由對NCI-2023之1,800 ± 553 SFU、對NCI-H23之2,069 ± 393 SFU及對LK-2之1,630 ± 102 SFU(圖14A)組成(表26)。示例疫苗細胞株組合2由NCI-H23、DMS 53及NCI-H1703 TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株構成。此示例疫苗組合誘導3,604 ± 1,491 SFU之總IFNγ反應(n=9/3供體)，由對NCI-H23之1,738 ± 529 SFU、對DMS 53之826 ± 457 SFU及對NCI-H1703之1,041 ± 555 SFU(圖14B)組成(表26)。示例疫苗細胞株組合3由NCI-H2023、DMS 53及NCI-H1703 TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株構成。此示例細胞株組合誘導6,065 ± 941 SFU之總IFNγ反應(n=9/3供體)，由對NCI-H2023之2,847 ± 484 SFU、對DMS 53之1,820 ± 260 SFU及對NCI-H1703之1,398 ± 309 SFU(圖14C)組成(表26)。示例疫苗細胞株組合4由NCI-H23、DMS 53及LK-2 TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株構成。此示例細胞株組合誘導9,612 ± 5,293 SFU之總IFNγ反應(n=12/4供體)，由對NCI-H23之2,654 ± 1,091 SFU、對DMS 53之3,017 ± 1,914 SFU及對LK-2之3,942 ± 2,474 SFU組成。(圖14D)(表26)。示例疫苗細胞株組合5由NCI-H2023、DMS 53及LK-2 TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株構成。此示例細胞株組合誘導6,358 ± 2,278 SFU之總IFNγ反應(n=9/3供體)，由對NCI-H2023之2,869 ± 1,150 SFU、對DMS 53之1,698 ± 568 SFU及對LK-2之1,791 ± 637 SFU(圖14E)組成(表26)。示例疫苗細胞株組合6由NCI-H460、NCI-H520及A549 TGFβ1及TGFβ2修飾之細胞株組成。此示例細胞株組合誘導8,407 ± 1,535 SFU之總IFNγ(n=12/4供體)，由對NCI-H460之2,320 ± 666 SFU、對NCI-H520之2,723 ± 644 SFU及對A549之3,005 ± 487 SFU(圖14F)構成(表26)。
對於一些示例性細胞株組合，當PBMC與呈遞來自三種疫苗細胞株組合之抗原的DC共培養時，相對於與呈遞來自單一疫苗細胞株組分之抗原之DC共培養的PBMC，增強針對個別未經修飾之親本細胞株之IFNγ反應(表26)。藉由三種細胞株組合誘導之免疫反應比藉由各個別細胞株誘導之反應更穩固。表 26. 針對示例組合中之細胞株或針對單一個別疫苗組分細胞株之 IFNγ 反應
細胞株組合 1 三種疫苗細胞株組合 (SFU) 單一疫苗細胞株組分 (SFU)
NCI-2023 1,800 ± 553 903 ± 136
NCI-H23 2,069 ± 393 1,014 ± 773
LK-2 1,630 ± 102 1,573 ± 935
細胞株組合 2 三種疫苗細胞株組合 (SFU) 單一疫苗細胞株組分 (SFU)
NCI-H23 1,738 ± 529 1,014 ± 773
DMS 53 826 ± 457 227 ± 227
NCI-H1703 1,041 ± 555 724 ± 724
細胞株組合 3 三種疫苗細胞株組合 (SFU) 單一疫苗細胞株組分 (SFU)
NCI-H2023 2,847 ± 484 903 ± 136
DMS 53 1,820 ± 260 227 ± 227
NCI-H1703 1,398 ± 309 724 ± 724
細胞株組合 4 三種疫苗細胞株組合 (SFU) 單一疫苗細胞株組分 (SFU)
NCI-H23 2,654 ± 1,091 1,567 ± 788
DMS 53 3,017 ± 1,914 138 ± 85
LK-2 3,942 ± 2,474 1,592 ± 965
細胞株組合 5 三種疫苗細胞株組合 (SFU) 單一疫苗細胞株組分 (SFU)
NCI-H2023 2,869 ± 1,150 903 ± 136
DMS 53 1,698 ± 568 227 ± 227
LK-2 1,791 ± 637 1,573 ± 935
細胞株組合 6 三種疫苗細胞株組合 (SFU) 單一疫苗細胞株組分 (SFU)
NCI-H460 2,320 ± 666 970 ± 281
NCI-H520 2,723 ± 644 596 ± 336
A549 3,005 ± 487 2,677 ± 632
針對示例疫苗組合4(NCI-H23、DMS 53及LK-2 TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株)，測定對11種抗原之IFNγ反應。在3個HLA-A02健康供體(n=3/供體)中評估針對抗原Mage A1、Mage A3、Mage A4、CEACAM(CEA)、MUC1、存活素、PRAME、WT1、TERT、STEAP及HER2之反應。相較於單一疫苗組分TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株，示例疫苗組合4以更大量值5,423 ± 427 SFU(圖15A)及廣度(圖15B)誘導抗原特異性IFNγ反應；NCI-H23(4,1115 ± 2,118 SFU)、DMS 53(3,661 ± 1,982 SFU)及LK-2(2,772 ±2,936 SFU)。對特異性抗原之反應呈圖例中所指示之次序。圖15B中詳述由單一組分及組合細胞株疫苗誘導之針對各抗原之平均IFNγ反應。實例 9 ： HLA-E 表現之減少改善細胞免疫反應
HLA-E屬於HLA I類重鏈旁系同源物。HLA-E之人類腫瘤細胞表面表現可經由結合於NK、DC及CD8 T細胞上之NKG2A受體而抑制此等免疫細胞子集之抗腫瘤功能。RERF-LC-Ad1 細胞株 (JCRB1020) 中 HLA-E 表現之減少
將人類腺癌細胞株RERF-LC-Ad1用對HLA-E具有特異性之靶向以下基因體DNA序列的鋅指核酸酶(ZFN)對電穿孔：TACTCCTCTCGGAGGCCCTGgcccttACCCAGACCTGGGCGGGT(SEQ ID NO: 33)。在用PE結合之抗人類HLA-E(BioLegend，純系3D12)染色之後藉由流動式細胞測量術鑑別全對偶基因剔除細胞，且接著進行FACS分選。在分選之後細胞擴增且測定剔除百分比。自用PE結合之抗人類HLA-E(BioLegend，純系3D12)染色之HLA-E KO或未經修飾之親本細胞的MFI減去HLA-E KO或未經修飾之親本細胞之未染色對照的MFI。在FACS分選之後ZFN對HLA-E之基因編輯引起超過99%之HLA-E陰性細胞(圖16A)。剔除百分比表示為：(RERF-LC-Ad1 HLA-E KO MFI/親本MFI)×100。HLA-E 表現之減少改善免疫反應
如實例8中所述，完成IFNγ ELISpot，但有一處修改。在此實驗中，iDC負載僅一種細胞株，亦即RERF-LC-Ad1親本或HLA-E KO細胞株。此處，1.5×106 DC負載1.5×106 RERF-LC-Ad1親本或HLA-E KO細胞。當自體PBMC與負載HLA-E陰性細胞之DC共培養時(5085 ± 1157 SFU)，相對於負載未經修飾之親本HLA-E陽性細胞之DC(2810 ± 491 SFU)，IFNγ反應高1.8倍。史都登氏檢驗，p=0.012。n=12，3個HLA-A不同供體(圖16B)。實例 10 ：細胞毒性 T 淋巴球相關蛋白 4(CTLA-4) 表現 之減少增加細胞免疫反應
CTLA-4(CD152)充當免疫檢查點且在一些腫瘤細胞上組成性表現。CTLA-4結合於DC表面上之CD80或CD86可負面調控DC成熟且抑制T細胞之增殖及效應功能。人類鱗狀細胞株中 CTLA-4 表現之減少
將NCI-H520細胞株用靶向CTLA -4之siRNA(Dharmacon，L-016267-00-0050)轉染。將細胞於無抗生素培養基中以6×105 接種於六孔盤之各孔中且在5% CO2 中在37℃下培育。根據DharmaFECT siRNA轉染方案，每孔使用4 uL DharmaFECT 1轉染劑(Dharmacon，T-20001-01)，將各孔用25 nM最終濃度之CTLA-4 siRNA轉染。在siRNA轉染之後72小時，藉由流動式細胞測量術測定活細胞上CTLA-4表現之減少，接著用於IFNγ ELISpot分析中。具體而言，將NCI-H520細胞用LIVE/DEAD™ Aqua(Invitrogen，L34965)及人類α-CTLA4-APC(BioLegend，純系L3D10)染色。相較於未經修飾之親本NCI-H520(7.59%)，siRNA使CTLA-4之NCI-H520細胞表面表現(3.59%)減少2.1倍(圖17A)。NCI-H520(ATCC HTB-182) 細胞株中 CTLA-4 表現之減少增加細胞免疫反應
在IFNγ ELISpot分析中，使用來源於HLA-A 02:01供體之細胞評估減少CTLA-4之細胞表面表現對細胞免疫反應之影響。在siRNA轉染之後72小時開始ELISpot且如實例9中所述進行。相較於未經修飾之親本細胞株(1,730 ± 210 SFU)(n=2)，NCI-H520中CTLA-4表現之減少引起IFNγ反應增加1.6倍(2,770 ± 180 SFU)(n=2)(圖17B)。實例 11.A549 細胞株中 CD276 表現之減少增強細胞免疫反應
CD276(B7-H3)為B7及CD28家族之免疫檢查點成員。人類實體癌中CD276之過度表現可誘導免疫抑制表型且優先下調Th1介導之免疫反應。
使用CRISPR-Cas9系統，利用對TGCCCACCAGTGCCACCACT(SEQ ID NO:117)具有特異性的嚮導RNA(Synthego)完成A549中CD276表現之減少。初始異質群體含有71%其中CD276表現減少之A549細胞。將異質群體用BB700結合之α-人類CD276(BD Biosciences，純系7-517)表面染色，且藉由細胞分選(BioRad S3e細胞分選儀)富集全對偶基因剔除細胞。藉由用PE α-人類CD276(BioLegend，純系DCN.70)對分選富集之A540 CD276 KO細胞及親本A549細胞進行細胞外染色來證實CD276之減少。未染色及同型對照PE α-小鼠IgG1(BioLegend，純系MOPC-21)染色之A549 CD276 KO細胞充當對照。Cas9介導之對CD276之基因編輯引起相較於對照，CD276減少＞99%(圖18A)。
在代表性實驗中，iDC負載A549親本細胞或A549 CD276 KO細胞且與自體CD14- PBMC共培養6天，接著用負載來自野生型A549之細胞溶解產物之自體DC刺激。接著在ELISpot分析中，針對野生型A549細胞，分析細胞之IFNγ分泌。此等資料顯示，CD276 KO細胞比野生型細胞刺激性更佳(p=0.017；未配對t檢驗)(圖18B)。實例 12 ： CD47 表現及 TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 分泌之減少
在實例5中描述shRNA下調TGFβ1及TGFβ1及測定分泌之TGFβ1及TGFβ2之含量的方法。 利用shRNA下調TGFβ1及或TGFβ2使人類肺癌株中CD47表現減少
經修飾以減少TGFβ1及/或TGFβ2分泌之A549、NCI-H460、NCI-H2023、NCI-H23、NCI-H520、LK-2及NCI-H1703如實例2及此處所述之其他方法中所述進行修飾以減少CD47之表現。在ZFN介導之CD47剔除之後，將細胞株用FITC結合之α-CD47(BD Biosciences，純系B6H12)進行表面染色，且藉由細胞分選(BioRad S3e細胞分選儀)富集全對偶基因剔除細胞。使用純度分選策略收集細胞以確保僅收集CD47陰性細胞。基於細胞數目將分選之細胞塗鋪在適當尺寸之器皿中，生長且擴增。在針對全對偶基因剔除進行細胞富集之後，將TGFβ1及/或TGFβ2 KD CD47 KO細胞繼代2-5次，且藉由流動式細胞測量術測定CD47剔除百分比(BV421結合之人類αCD47，BD Biosciences，純系B6H12)。自用BV421結合之人類α-CD47染色之經修飾或未經修飾之親本細胞的MFI減去經修飾或未經修飾之親本細胞之未染色對照的MFI。CD47剔除百分比表示為：(1-(TGFβ1/TGFβ2 KD CD47 KO MFI/親本MFI))×100)。
ZFN對CD47之基因編輯引起細胞株中在FACS分選之後CD47陰性細胞超過99%(表27)，同時維持減少之TGFβ1及/或TGFβ2分泌(表28)。TGFβ1及/或TGFβ2下調且CD47表現減少如下所示：圖19中之NCI-H2023，圖20中之NCI-H23，圖21中之A549，圖22中之NCI-H460，圖23中之NCI-H1703，圖24中之LK-2，圖25中之DMS 53及圖26中之NCI-H520。表 27.TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 KD 細胞株中之 CD47 KO
細胞株 親本 CD47 MFI 經修飾之 CD47 MFI CD47 減少 %
NCI-H2023 244,674 0 100.0
NCI-H23 252,210 1745 99.3
A549 96,845 29 99.9
NCI-H460 134,473 343 99.7
NCI-H1703 202,482 1069 99.5
LK-2 92,360 0 100.0
DMS 53 46,399 389 99.2
NCI-H520 158,037 145 99.9
MFI在減去未染色對照下報導。親本指示未經修飾之細胞株。
表 28.TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 KD 細胞株 CD47 KO 細胞株中之 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌
細胞株 TGF β 1( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 ) TGF β 2( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
親本 TGFβ1 KD 減少% 親本 TGFβ2 KD 減少%
NCI-H2023 1262 ± 163 ＜ 92 ＞ 93* 393 ± 168 168 ±57 57
NCI-H23 1993 ± 540 590 ± 136 70 679 ± 211 ＜ 42 ＞ 94*
A549 5962 ± 636 952 ± 77 84 718 ± 82 45 ± 12 94
NCI-H460 1758 ± 75 227 ± 45 87 2564 ±200 559 ± 147 57
NCI-H1703 1700 ± 300 565 ± 91 67 ＜ 42 ＜ 42 NA
LK-2 ＜ 92 ＜ 92 NA 111 ± 41 58 ± 13 48
DMS 53 未完成 2458 ± 675 1409 ± 313 43
NCI-H520 ＜ 92 ＜ 92 NA 3278 ± 837 151 ± 13 95
親本指示未經修飾之細胞株。* 分泌含量低於TGFβ1(92皮克/106 個細胞/24小時)或TGFβ2(42皮克/106 個細胞/24小時)之定量下限。定量下限用於估計相對於親本之減少%。NA：分泌含量低於親本與shRNA修飾之細胞株的定量下限。
實例 13 ： CD276 表現及 TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 分泌之減少增加細胞免疫反應
將在實例5中藉由shRNA減少TGFβ1及/或TGFβ2分泌之人類腫瘤細胞株NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、A549、NCI-H2023、NCI-H23、LK-2及NCI-H1703用對CD276具有特異性之靶向以下基因體DNA序列的鋅指核酸酶(ZFN)對電穿孔：GGCAGCCCTGGCATGggtgtgCATGTGGGTGCAGCC(SEQ ID NO: 26)。在TGFβ1及/或TGFβ2 KD株中ZFN介導之CD276剔除之後，將細胞株用BB700結合之α-人類CD276(BD Biosciences，純系7-517)進行表面染色且藉由細胞分選(BioRad S3e細胞分選儀)富集全對偶基因剔除細胞。使用純度分選策略收集細胞以確保僅收集CD276陰性細胞。基於細胞數目將分選之細胞塗鋪在適當尺寸之器皿中，生長且擴增。在針對全對偶基因剔除進行細胞富集之後，將TGFβ1及/或TGFβ2 KD CD276 KO細胞繼代2-5次，且藉由流動式細胞測量術測定CD276剔除百分比(BV421結合之人類α-CD276，BD Biosciences，純系7-517)。自用BV421結合之人類α-CD276染色之經修飾或未經修飾之親本細胞的MFI減去經修飾或未經修飾之親本細胞之未染色對照的MFI。減少百分比表示為：(1-(TGFβ1/β2 KD CD276 KO MFI/親本MFI))×100)。
ZFN對CD276之基因編輯引起細胞株中CD276陰性細胞超過99%(表29)，且TGFβ1及/或TGFβ2分泌減少(表31)。TGFβ1及/或TGFβ2下調且CD276表現減少如下所示：圖27中之NCI-H2023，圖28中之NCI-H23，圖29中之A549，圖30中之NCI-H460，圖31中之NCI-H1703，圖32中之LK-2，圖33中之DMS 53及圖34中之NCI-H520。表 29. TGFβ1及/或TGFβ2分泌減少之細胞株中CD276剔除
細胞株 親本 CD276 MFI 經修飾之 CD276 MFI CD276 減少 %
NCI-H2023 262,460 680 99.7
NCI-H23 74,176 648 99.1
A549 141,009 688 99.5
NCI-H460 366,565 838 99.8
NCI-H1703 262,386 417 99.9
LK-2 385,535 867 99.8
DMS 53 304,637 972 99.7
NCI-H520 341,202 212 99.9
MFI在減去未染色對照下報導。親本指示未經修飾之細胞株。
表 30.TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 KD CD276 KO 細胞株中之 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌
細胞株 TGF β 1( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 ) TGF β 2( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
親本 TGFβ1 KD 減少% 親本 TGFβ2 KD 減少%
NCI-H2023 1090 ± 279 97 ± 23 91 347 ± 57 153 ± 93 56
NCI-H23 1683 ± 111 706 ± 180 58 523 ± 37 55 ± 18 89
A549 6443 ± 406 770 ± 29 88 757 ± 125 61 ± 8 92
NCI-H460 1415 ± 282 390 ± 14 72 2100 ± 542 680 ± 166 68
NCI-H1703 1682 ± 155 434 ± 53 74 ＜ 42 ＜ 42 NA
LK-2 ＜ 92 ＜ 92 NA 140 ± 64 76 ± 16 46
DMS 53 未完成 4053 ± 2548 2329 ± 1175 52
NCI-H520 ＜ 92 ＜ 92 NA 4045 ± 525 59 ± 34 99
親本指示未經修飾之細胞株NA ：分泌含量低於親本與shRNA修飾之細胞株的定量下限。
TGFβ1 及 TGFβ2 KD 及 CD276 KO 增加細胞免疫反應
如實例9中所述進行IFNγ ELISpot。來源於HLA-A02及HLA-A03健康供體之細胞用於評估TGFβ1及TGFβ2分泌及CD276表現之減少是否可相較於未經修飾之親本細胞株改善免疫反應。相對於未經修飾之親本細胞株(250 ± 63 SFU)(n=11)，在NCI-H460細胞株中，TGFβ1、TGFβ2及CD276之修飾使IFNγ反應增加2.3倍(569 ± 87 SFU)(n=11)(p=0.0078，曼-惠特尼U檢驗)(圖35A)。相對於未經修飾之親本細胞株(1,848 ± 569 SFU)(n=11)，在A549細胞株中，TGFβ1、TGFβ2及CD276之修飾使IFNγ反應增加22.2倍(83 ± 29 SFU)(n=11)(p=0.0091，曼-惠特尼U檢驗)(圖35B)。實例 14 ： CD276 及 CD47 表現及 TGFβ1 及 / 或 TGFβ2 分泌之減少增加細胞免疫反應
使用shRNA，對A549細胞株進行修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌且減少CD47及CD276之表現。實例5中描述用於分泌TGFβ1及TGFβ2及確定其含量之方法。實例12及實例13中分別描述用以減少CD47及CD276之表現及確定表現量之方法。如實例9中所述完成IFNγ ELISpot。CD276 及 CD47 之表現及 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌減少之 A549 細胞的表徵
相對於未經修飾之親本細胞株(104,442 MFI)，經修飾之細胞株(136 MFI)上CD47表現減少99.9%(圖36A)(表31)。相對於未經修飾之親本細胞株(53,196 MFI)，經修飾之細胞株(0 MFI)上CD276表現減少100%(圖36B)(表31)。相較於未經修飾之親本細胞株(9093 ± 175皮克/106 個細胞/24小時)(n=2)，經修飾之細胞株(2027 ± 31皮克/106 個細胞/24小時)(n=2)使TGFβ1分泌減少78%(圖36C)。經修飾之細胞株的TGFβ2分泌低於ELISA分析之定量下限(n=2)，引起分泌含量相對於未經修飾之親本細胞株(607 ± 76皮克/106 個細胞/24小時)(n=2)減少100%(圖36D)。CD276 及 CD47 表現及 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌之減少增加細胞免疫反應
來源於HLA-A02(圖37A)、HLA-A03(圖37A)及HLA-A24(圖37B)健康供體之細胞用於IFNγ ELISpot分析中以確定A549細胞株中TGFβ1及TGFβ2、CD276及CD47之修飾是否相對於未經修飾之親本細胞株增強免疫反應。如實例9中所述完成IFNγ ELISpot。相對於未經修飾之親本細胞株(2,233 ± 493 SFU)(n=11)，經修飾之細胞株使IFNγ反應增加26.8倍(83 ± 29 SFU)(n=11)(p=0.0091，曼-惠特尼U檢驗)(圖37A)。評估未經修飾之親本、TGFβ1 TGFβ2 KD CD47KO、TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO及TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 CD47KO A549修飾之細胞株針對10種抗原之反應。相對於由未經修飾之親本細胞株(15,140 SFU)(n=3)誘導之總TAA反應，TGFβ1、TGFβ2及CD47之減少使總抗原特異性反應增加1.7倍(25,813 SFU)(n=3)，TGFβ1、TGFβ2及CD276之減少使總抗原特異性反應增加2.0倍(30,640 SFU)(n=3)，且TGFβ1、TGFβ2、CD47及CD276之減少使總TAA反應增加2.0倍(29,993 SFU)(n=3)(圖37B)。對特異性抗原之反應呈圖例中所指示之次序。資料表明CD47及/或CD276之減少同時TGFβ1及TGFβ2分泌之減少可促進TAA特異性IFNγ產生增加。表 31. 經修飾以分泌 GM-CSF 、表現膜結合之 CD40L 及分泌 IL-12 之 TGFβ1 及 TGFβ2 KD 細胞株中 CD47 或 CD276 之剔除
細胞株 親本 MFI CD47 MFI 減少 %
A549 100,228 33 99.9
NCI-H460 140,990 6 ＞ 99.9
細胞株 親本 MFI CD276 MFI 減少 %
A549 30,636 326 98.9
NCI-H460 82,858 1,467 98.2
MFI在減去未染色對照下報導。親本指示未經修飾之細胞株。
實例 15 ：膜結合之 CD154( 膜結合之 CD40 配位體 ) 之表現增強細胞免疫反應
在發炎條件下CD40配位體(CD40L)在T細胞及其他非免疫細胞上短暫表現且結合於B細胞及專業抗原呈遞細胞上之共刺激分子CD40。CD40L結合於CD40上調適應性細胞及體液免疫之多個方面。A549 細胞株中膜結合之 CD40L 之表現
將細胞株A549細胞株用慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒表現經修飾以減少ADAM17裂解且藉此促進膜結合之CD40L表現的CD40L序列。親本未經修飾之細胞株充當對照。在以200 µg/mL進行抗生素選擇以富集穩定表現CD40L之細胞之後，使用流動式細胞測量術，針對細胞表面上之CD40L表現，分析細胞，且藉由ELISA來偵測溶解CD40L。在此實例中使用之膜結合之CD40L的序列在SEQ ID NO: 1中示出。
為測定膜結合之CD40L的表現量，將未經修飾之親本及經修飾之細胞用PE結合之人類α-CD40L(BD Biosciences，純系TRAP1)染色。相較於未經修飾之親本A549細胞株(1702 MFI)，細胞表面上CD40L之表現增加25.5倍(43,466 MFI)(圖38A)。
藉由ELISA定量溶解CD40L。經CD40L轉導及未經修飾之親本細胞以8.33×104 個細胞/孔塗鋪於24孔中，於常規生長培養基(含有10% FBS之RPMI)中塗鋪。在塗鋪二十四小時之後，將黏附細胞充分洗滌以移除FBS且在RPMI + 5% CTS中繼續培養。在替換培養基四十八小時之後，收穫細胞培養上清液，且儲存於-70℃下，直至根據製造商說明書(BioLegend，DCDL40)完成分析。人類CD40L之定量下限為62.5 pg/mL或0.375奈克/106 個細胞/24小時。CD40L之過度表現引起2.93奈克/106 個細胞/24小時之sCD40L(圖38B)。
A549 CD40L表現對DC成熟之作用通過流動式細胞測量術來表徵。iDC及A549未修飾之親本細胞、具有外源性sCD40L(1 μg/mL)(PeproTech，#AF31002100UG)之未經修飾之親本細胞或過度表現膜結合之CD40L的A549細胞以1:1比率在96孔低黏附U形底盤中共培養。在培育24小時之後，將共培養物用LIVE/DEAD Aqua(Molecular Probes，#L23105)、αCD45-PE-Cy7(BD Biosciences，純系HI30)及αCD11c-BV605(BD Biosciences，純系B-ly6)及αCD83-APC(BD Biosciences，純系HB15e)進行表面染色。使用FlowJo(FlowJo有限責任公司)分析流動式細胞測量術資料。DC成熟增加定義為活CD45+ CD11c+ CD83+ DC%增加。針對7個HLA不同健康供體評估DC成熟。
相對於未經修飾之親本細胞株(10±3)，CD40L之A549表現使活CD45+ CD11c+ CD83+ DC%顯著增加3.9倍(40±5)(p＜0.001，霍爾姆-斯達克多重比較檢驗(Holm-Sidak's multiple comparisons test))(n=7)。外源性sCD40L未顯著增加活CD45+ CD11c+ CD83+ DC%(16±3)(p=0.4402，霍爾姆-斯達克多重比較檢驗)(n=7)(圖38C)。膜結合之 CD40L 之表現增強細胞免疫反應
如實例9中所述，藉由IFNγ ELISpot分析評估CD40L之過度表現對細胞免疫反應之誘導的作用。負載之iDC負載A549細胞、具有1 μg/mL外源性sCD40L之A549細胞或過度表現CD40L之A549細胞。相較於未經修飾之親本細胞株(15 ± 15 SFU)，A549細胞對CD40L之表現使IFNγ反應增加87倍(1,305 ± 438 SFU)(p=0.0198，霍爾姆-斯達克多重比較檢驗)(n=4)。相對於未經修飾之親本細胞株(p=0.5303，霍爾姆-斯達克多重比較檢驗)(n=4)，共培養物中包括外源性sCD40L不顯著增加IFNγ反應(255 ± 103 SFU)。由A549細胞上CD40L之過度表現引發的IFNγ反應顯著超過在添加外源性sCD40L下所偵測之反應(p=0.0375，霍爾姆-斯達克多重比較檢驗)(n=4)(圖38D)。實例 16 ： GM-CSF 之表現增強細胞免疫反應
將未經修飾之親本NCI-H460細胞用空慢病毒載體(對照)或經設計以過度表現GM-CSF(SEQ ID NO: 6)之慢病毒載體轉染。對照及過度表現GM-CSF之細胞株在嘌呤黴素(2 μg/mL)存在下生長，接著用於IFNγ ELISpot分析中。如實例6中所述進行IFNγ ELISpot。圖39展示當相較於用對照NCI-H460細胞敏化時(1163 ± 183 SFU)(p=0.002)，用過度表現GM-CSF之NCI-H460細胞敏化健康供體(HLA-A*01、HLA-A*02)來源之PBMC顯著增加對未經修飾之親本NCI-H460細胞的細胞免疫反應(2600 ± 207 SFU)。實例 17 ：介白素至 12(IL-12) 之表現增強細胞免疫反應
IL-12為一種促發炎細胞介素，其促進DC及LC來引發T細胞趨向效應表型。IL-12亦可直接作用於DC以逆轉或防止免疫耐受性之誘導。
將A549細胞用慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒表現IL-12之p40及p35鏈兩者以形成功能性IL-12 p70細胞介素蛋白。p40及p35序列由P2A裂解序列分隔開。在此實例中使用之IL-12的序列在SEQ ID NO: 9中示出。未經修飾之親本、未經修飾之細胞株充當對照。在以600 µg/mL吉歐黴素(zeocin)進行抗生素選擇以富集穩定表現IL-12之細胞之後，如實例9中所述測定由親本及IL-12修飾之細胞株產生之免疫反應。相較於由未經修飾之親本細胞誘導之IFNγ反應(53 ± 53 SFU)(p=0.0163，曼-惠特尼U檢驗)(n=3)，在IL-12表現下IFNγ SFU增加16倍(873 ± 199 SFU)(n=3)(圖40)。實例 18 ：糖皮質激素誘導之 TNFR 家族相關基因 (GITR) 之表現增強細胞免疫反應
GITR為與抑制T-調控細胞(Treg)之遏制活性有關且延長T-效應細胞之存活的表面受體分子。GITR結合於APC上之其配位體GITR觸發協同刺激CD8+ 與CD4+ 效應T細胞之信號傳導，引起T細胞擴增及效應功能增強，同時遏制Treg之活性。GITR 之表現
基於GITR之天然之膜結合變異體(NP_004186)，產生密碼子優化序列，且選殖至pVAX1(Invitrogen，#V26020)(GenScript)之BamHI及XhoI限制性核酸內切酶中。在此實例中使用之GITR的序列在SEQ ID NO: 4中示出。對於使用編碼GITR之pVAX1轉染細胞，在轉染之前18-24小時使用45 mL完全培養基將A549(5.38×106 個細胞)、NCI-H460(1.79×107 個細胞)、LK-2(2.39×107 個細胞)或NCI-H520(1.02×107 個細胞)塗鋪至T175燒瓶中且維持在37℃/5% CO2下。根據製造商說明書，使用脂染胺轉染劑(Invitrogen，#2075084)進行質體DNA轉染。將細胞在37℃及5% CO2 下培育72小時，接著藉由流動式細胞測量術評估GITR表現。
為測定GITR之細胞表面表現，將經轉染之細胞及未經修飾之親本對照用BV421結合之小鼠抗人類GITR抗體(BD Biosciences，純系V27-580)進行表面染色。於BD LSRFortessa上獲取流動式細胞測量術資料且使用FlowJo軟體分析。在未經轉染之未經修飾之親本細胞株上偵測到GITR之最低表現(各細胞株n=3)(圖41)。GITR在17.7±0.1%之經轉染NCI-H520細胞(n=3)(圖41A)、29.3 ± 3.3%之經轉染LK-2細胞(n=3)(圖41B)、7.7± 0.2%之經轉染A549細胞(n=3)(圖41C)及14.1 ± 0.9%之經轉染NCI-H460細胞(n=3)(圖41D)上表現。GITR 之表現增強細胞免疫反應
使用來源於兩個HLA-A02供體及一個HLA-A24健康供體之細胞(n=3/供體)，如實例9中所述，藉由IFNγ ELISpot評估GITR之表現對細胞免疫原性之作用。相較於未經修飾之親本A549細胞株(128 ± 38 SFU)(n=9)，A549細胞株對GITR之表現使IFNγ產生顯著增加7.4倍(947 ± 217 SFU)(n=9)(p=0.0003，曼-惠特尼U檢驗)(圖42A)。相較於未經修飾之親本細胞株(773 ± 255 SFU)(n=9)，在LK-2細胞株(1,053 ± 449 SFU)(n=9)中GITR表現下IFNγ產生存在增加之傾向(圖42B)。相較於未經修飾之親本未經修飾之細胞株(1,953 ± 385 SFU)(n=3)，在NCI-H520細胞株(2,953 ± 504 SFU)(n=3)中GITR表現下免疫原性存在增加之傾向(圖42C)。相較於未經修飾之親本細胞(3,400 ± 181 SFU)(n=3)，在NCI-H460(4,940 ± 557 SFU)細胞株中GITR表現下免疫原性存在增加之傾向(圖42D)。實例 19 ：介白素 -15(IL-15) 之表現增強細胞免疫反應
IL-15為細胞介素之四α-螺旋束家族之成員，且藉由包括DC之多種細胞產生且對CD8+ 記憶T細胞之分化而言係至關重要的。IL-15之兩種同功型天然表現，其編碼兩種不同N端信號肽。此等信號肽用以減少或抑制IL-15蛋白自腫瘤細胞之分泌。產生IL-15之密碼子優化序列，其中天然IL-15長信號肽區經IL-2信號肽替換以促進IL-15蛋白(GenScript)之分泌。將密碼子優化序列選殖至pVAX1之BamHI及XhoI限制位點中。在此實例中使用之IL-15的序列在SEQ ID NO: 11中示出。IL-15 分泌之定量
如實例18中所述，完成編碼IL-15之質體之轉染。藉由ELISA，使用人類IL-15 Quantikine ELISA套組(R&D Systems，D1500)且根據製造商說明書來分析上清液中分泌之IL-15之存在。IL-15 ELISA之定量下限為3.98 pg/mL或0.0239奈克/106 個細胞/24小時。NCI-H520、LK-2、NCI-H460及A549細胞株分別表現9.04、5.99、59.43及34.74奈克/106 個細胞/24小時之IL-15(圖43A)。IL-15 增強細胞免疫反應
如實例9中所述，完成IFNγ ELISpot以評估IL-15對細胞免疫反應之作用。使用來源於HLA-A02健康供體(n=3)之免疫細胞評估NCI-H460細胞株之IL-15分泌對細胞免疫反應的作用。相對於未經修飾之親本NCI-H460細胞株(4,360 ± 806 SFU)，IL-15過度表現下IFNγ產生存在增加之傾向(5,593± 474 SFU)(圖43B)。實例 20 ：介白素 -23(IL-23) 之表現增強細胞免疫反應
IL-23為四螺旋束細胞介素(p19)與可溶性I類細胞介素受體p40之二元複合物。IL-23充當增強DC成熟及遏制原始T細胞來源Treg之DC活化的促發炎細胞介素。IL-23 之表現
產生人類密碼子優化IL-23 p19及p40序列且選殖至pVAX1(GenScript)之BamHI及XhoI限制位點中。p19及p40序列由可撓性連接子GS3 連接子分隔開。在此實例中使用之IL-23的序列在SEQ ID NO: 13中示出。如實例18中所述完成轉染。
根據製造商說明書使用人類IL-23 Quantikine ELISA套組(R&D Systems，D2300B)來分析上清液中功能性(p19及p40二聚體)分泌之IL-23之存在。IL-23 ELISA之定量下限為39.1 pg/mL或0.235奈克/106 個細胞/24小時。LK-2及A549細胞株分別表現1,559及1,929奈克/106 個細胞/24小時之IL-23(圖44A)。IL-23 之分泌增加細胞免疫反應
如實例9中所述，完成IFNγ ELISpot以評估IL-23對細胞免疫反應之作用。使用來源於HLA-A02健康供體之免疫細胞評估A549(ATCC CCL-185)細胞株之IL-15分泌對細胞免疫反應之作用。相對於未經修飾之親本A549(ATCC CCL-185)細胞株(573 ± 401 SFU)(圖44B)，IL-23過度表現下IFNγ產生顯著增加3.9倍(2,247 ± 580 SFU)(p=0.0284，史都登氏t檢驗)(n=3)。實例 21 ： X-C 模體趨化因子配位體 1(XCL1) 之表現
細胞介素XCL1亦稱為淋巴細胞趨化因子，結合於在抗原交叉呈遞DC上選擇性表現之趨化因子受體XCR1。XCL1之表現具有充當佐劑用於皮內疫苗投與之潛能。XCL1 之表現
產生編碼人類XCL1之人類密碼子優化序列(GenScript)且選殖至pVAX1質體之BamHI及XhoI限制位點中。藉由ELISA表徵XCL1之短暫表現及分泌。在此實例中使用之XCL1的序列在SEQ ID NO: 15中示出。XCL1 分泌之定量
如實例18中所述，將NCI-H460及A549細胞用編碼密碼子優化XCL1之pVAX1轉染。在轉染二十四小時之後，自細胞移除上清液且藉由ELISA分析分泌之XCL1之存在。根據製造商說明書(R&D Systems，#DXCL10)分析上清液之XCL1分泌。NCI-H460及A549細胞株分別短暫表現418及144及奈克/106 個細胞/24小時之XCL1(圖45)。實例 22 ：間皮素 (MSLN) 之表現
MSLN在許多肺腺癌之表面上表現且表現與不良預後相關。MSLN為一種具有吸引力之靶向之TAA，因為對MSLN之抗原特異性免疫反應可預測患有由若干不同原發性腫瘤，包括卵巢、肺及黑色素瘤引起之腦癌轉移之患者的存活。儘管MSLN在許多患者腫瘤中表現，但肺癌細胞株僅一小部分子集表現MSLN。在實例22中，在不天然表現MSLN之示例性疫苗細胞株中基因上引入MSLN之表現，以拓寬對NSCLC患者可能重要之TAA的覆蓋範圍。MSLN 之表現
產生密碼子優化人類MSLN序列，其中ADAM17裂解位點經可撓性連接子替換以促進MSLN保留在細胞膜中(GenScript)。將密碼子優化序列選殖至pVAX1之BamHI及XhoI限制位點中。在此實例中使用之MSLN的序列為SEQ ID NO: 17。MSLN 表現之定量
如實例18中所述，完成編碼MSLN之質體之轉染。為測定MSLN之細胞表面表現，將經轉染之細胞及未經修飾之親本對照用PE結合之大鼠抗人類MSLN抗體(R&D Systems，FAB32652P)進行表面染色。於BD LSRFortessa上獲取流動式細胞測量術資料且使用FlowJo軟體分析。在未經轉染之未經修飾之親本細胞株上偵測到MSLN之最低表現(各細胞株n=3)(圖46)。MSLN在34.7 ± 2.2%之經轉染NCI-H520細胞(n=3)(圖46A)、41.4 ± 0.7%之經轉染LK-2細胞(n=3)(圖46B)、34.6 ± 0.7%之經轉染A549細胞(n=3)(圖46C)及48.5 ± 1.3%之經轉染NCI-H460細胞(n=3)(圖46D)上表現。MSLN 特異性 IFNγ 反應
藉由IFNγ ELISpot表徵對過度表現之MSLN抗原的免疫反應。為在此分析中偵測MSLN特異性反應，產生長15個胺基酸之11個胺基酸重疊之肽以覆蓋天然蛋白質MSLN蛋白且如實例8中所述用於刺激PBMC。IFNγ對LK-2中過度表現之MSLN蛋白作出反應(240 SFU)(圖46E)。實例 23 ：北九州 (Kita-Kyushu) 肺癌抗原 1(CT83) 之表現
CT83由40%非小細胞肺癌組織及31% 1期NSCLC表現。相較於正常組織，CT83在肺腫瘤中高度表現。CT83之表現亦通常與不良預後相關。在實例23中，在不天然表現CT83之示例性疫苗細胞株中基因上引入CT83之表現，以拓寬對一些NSCLC患者可能相關之TAA的覆蓋範圍。CT83 之表現
產生人類CT83之密碼子優化序列且與密碼子優化MSLN同框選殖(實例17)。使用SEQ ID NO: 21。MSLN及CT83編碼序列由P2A裂解位點分隔開且選殖至pVAX1之BamHI及XhoI限制位點中。CT83 表現之表徵
藉由西方墨點法確定pVAX1-MSLN-CT83對CT83之表現。如實例18中所述完成轉染。藉由添加100 µL 1x NuPAGE® LDS樣品緩衝液(Invitrogen，#NP0007)使經轉染細胞溶解且在室溫下培育5分鐘。將細胞溶解產物轉移至埃彭道夫管(Eppendorf tube)且音波處理5分鐘以減少黏度。將樣品在70℃下加熱10分鐘且接著裝載至4-12% NuPAGE® Bis-Tris凝膠上。BLUelf預染色蛋白質梯度(FroggaBio，PM008-0500)作為蛋白質大小確定標準而包括。使用1x MES SDS操作緩衝液(Invitrogen，NP0002)，將凝膠在還原條件下在200伏下電泳約1小時。接著在還原條件下使用NuPAGE®轉移緩衝液(Invitrogen，NP0006)加20%甲醇將蛋白質轉移至硝化纖維。在30伏下進行墨點法1小時。在墨點法之後，在室溫下在震盪(100 rpm)下將膜用5% Blotto(ChemCruz，DC2324)在Tris緩衝生理食鹽水加Tween(TBST：10 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、0.1% Tween 20)中阻斷1小時。接著在4℃下用TBST-5% Blotto中4 µg/mL之初級抗體抗CT83兔多株(Sigma，HPA004773)探測墨點。次日，將墨點用TBST洗滌5次且接著在室溫下在震盪下用TBST-5% Blotto中1:5,000稀釋之抗兔IgG HRP結合抗體(Southern Biotech，4030-05)探測1小時。將墨點用TBST洗滌5次且藉由添加1步Ultra TMB墨點溶液(Pierce，#37574)來顯影(圖47)。實例 24 ：免疫抑制因子表現減少之 A549 及 NCI-H460 中免疫刺激因子之表現
VME中免疫抑制抑制因子之減少可增強細胞免疫反應。在免疫抑制因子之產生減少之情況下，VME中免疫刺激因子之表現應進一步增強疫苗引發穩固免疫反應之能力。
在此實例中，三種免疫抑制因子之表現減少的A549及NCI-H460組分疫苗細胞株經修飾以分泌GM-CSF，表現膜結合之CD40L，及/或分泌功能性異二聚體IL-12 p70細胞介素。實例16中描述GM-CSF在活體外增加IFNγ反應之能力。皮膚中GM-CSF之活體內表現增強DC活化、成熟及DC促進具更強功能性之偏向Th1之免疫反應的能力。實例15及實例17中分別描述膜結合之CD40L及IL-12 p70在單獨表現時的免疫刺激功能。實例5中描述用於shRNA介導之減弱TGFβ1及TGFβ2分泌及測定所得到之分泌含量的方法。實例12及實例13中分別描述用於ZFN介導之CD47及CD276剔除及測定所得到之細胞表面表現量的方法。
在一些實例中，具有三種減少之免疫抑制因子的組分疫苗細胞株經修飾以分泌GM-CSF及表現膜結合之CD40L。在一些實例中，具有三種減少之免疫抑制因子的組分疫苗細胞株經修飾以分泌GM-CSF，表現膜結合之CD40L，及分泌功能性IL-12 p70細胞介素。本文中描述用於定量膜結合之CD40L之表現的方法。A549 及 NCI-H460 之 GM-CSF 分泌
疫苗組分細胞株A549及NCI-H460經表現天然人類GM-CSF之慢病毒顆粒轉導。未經修飾之親本、未經修飾之細胞株充當對照。在以100 µg /mL進行抗生素選擇以富集穩定表現GM-CSF之細胞之後，藉由ELISA分析細胞之GM-CSF分泌。在此實例中使用之GM-CSF的序列在SEQ ID NO: 6中示出。分泌之 GM-CSF 之定量
經GM-CSF轉導及未經修飾之親本細胞以8.33×104 個細胞/孔塗鋪於24孔中，於常規生長培養基(含有10% FBS之RPMI)中塗鋪。在塗鋪二十四小時之後，將黏附細胞充分洗滌以移除FBS且在RPMI + 5% CTS中繼續培養。在替換培養基四十八小時之後，收穫細胞培養上清液，且儲存於-70℃下，直至根據製造商說明書(人類GM-CSF Quantikine ELISA套組#DGM00，R&D Systems)完成GM-CSF分泌分析。ELISA分析中人類GM-CSF之定量下限小於3.0 pg/mL或0.018奈克/106 個細胞/24小時。未經修飾之親本細胞株之GM-CSF分泌低於ELISA分析之定量下限。分泌之 IL-12 p70 之定量
經IL-12轉導及未經修飾之親本細胞以8.33×104 個細胞/孔塗鋪於24孔中，於常規生長培養基(含有10% FBS之RPMI)中塗鋪。在塗鋪二十四小時之後，將黏附細胞充分洗滌以移除FBS且在RPMI + 5% CTS中繼續培養。在替換培養基四十八小時之後，收穫細胞培養上清液，且儲存於-70℃下，直至根據製造商說明書(BioLegend，人類IL-12 p40 LEGEND MAX ELISA套組#430707及人類IL-12 p70 LEGEND MAX ELISA套組#431707)完成p40及p70之IL-12分泌分析。人類IL-12 p40之定量下限為9.5 pg/mL或0.057奈克/106 個細胞/24小時。人類IL-12 p70之定量下限為1.2 pg/mL或0.007奈克/106 個細胞/24小時。未經修飾之親本細胞株之IL-12分泌低於ELISA分析之定量下限。TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549 及 NCI-H460 細胞株之 GM-CSF 分泌及膜結合之 CD40L 之表現
A549細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少86%(n=2)(圖48A)(表32)，及TGFβ2減少＞89%(n=2)(圖48B)(表32)，使得CD47之表現減少99.9%(圖48C)(表33)，分泌2,656 ± 69奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖48D)(表34)，且膜結合之CD40L表現增加38倍(圖48E)(表34)。NCI-H460細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少＞95%(n=2)(圖49A)(表32)，及TGFβ2減少93%(n=2)(圖49B)(表32)，使得CD47之表現減少99.9%(圖49C)(表33)，分泌940 ± 19奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖49D)(表35)，且膜結合之CD40L表現增加5倍(圖49E)(表34)。表 32. 分泌 GM-CSF 及表現膜結合之 CD40L 之 CD47 KO 細胞株中的 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌
細胞株 TGFβ1(皮克/106 個細胞/24小時) TGFβ2(皮克/106 個細胞/24小時)
親本 TGFβ1 KD 減少% 親本 TGFβ2 KD 減少%
A549 4,767 ± 300 679 + 51 86 732 ± 14 ＜ 42 ＞ 89*
NCI-H460 1,850 ± 1 ＜ 92 ＞ 95* 3,433 ± 271 239 ± 13 93
親本指示未經修飾之細胞株。*分泌含量低於TGFβ1(92皮克/106 個細胞/24小時)或TGFβ2(42皮克/106 個細胞/24小時)之定量下限。定量下限用於估計相對於親本之減少%。NA ：分泌含量低於親本與shRNA修飾之細胞株的定量下限。
表 33. 分泌 GM-CSF 及表現膜結合之 CD40L 之 TGFβ1 及 TGFβ2 KD 細胞株中的 CD47 KO 或 CD276 KO
細胞株 親本 CD47 MFI 經修飾之 CD47 MFI 減少 %
A549 100,228 74 99.9
NCI-H460 140,990 30 99.9
細胞株 親本 MFI 經修飾之 CD276 MFI 減少 %
A549 30,636 1,983 93.5
NCI-H460 82,858 712 99.1
MFI在減去未染色對照下報導。親本指示未經修飾之細胞株。
表 34.TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO 及 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO 細胞株之 GM-CSF 分泌及膜結合之 CD40L 之表現
細胞株 GMCSF( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) 親本 CD40L MFI 經修飾之 CD40L MFI CD40L 增加倍數
A549TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD47 KO 2,656 ± 69 9,537 360,236 38
NCI-H460TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD47 KO 940 ± 19 16,992 84,924 5
A549TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD276 KO 1,704 ± 60 41,076 1,660,242 40
NCI-H460TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD276 KO 943 ± 13 16,992 121,555 7
TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549 及 NCI-H460 細胞株之 GM-CSF 分泌及膜結合之 CD40L 之表現
A549細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少＞98%(n=2)(圖50A)(表35)，及TGFβ2減少＞89%(n=2)(圖50B)(表35)，使得CD276之表現減少93.5%(圖50C)(表33)，分泌1,704 ± 60奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖50D)(表34)，且膜結合之CD40L表現增加40倍(圖50E)(表34)。NCI-H460細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少93%(n=2)(圖51A)(表32)，及TGFβ2減少89%(n=2)(圖51B)(表32)，使得CD276之表現減少99.1%(圖51C)(表33)，分泌943 ± 13奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖51D)(表34)，且膜結合之CD40L表現增加7倍(圖51D)(表34)。表 35. 分泌 GM-CSF 及表現膜結合之 CD40L 之 CD276 KO 細胞株中的 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌
細胞株 TGF β 1( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 ) TGF β 2( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
親本 TGFβ1 KD 減少% 親本 TGFβ2 KD 減少%
A549 4,967 ± 399 ＜ 92 ＞ 98* 807 ± 8 ＜ 42 ＞ 89*
NCI-H460 1,850 ± 1 126 ± 5 93 3,433 ± 271 366 ± 5 89
親本指示未經修飾之細胞株。* 分泌含量低於TGFβ1(92皮克/106 個細胞/24小時)或TGFβ2(42皮克/106 個細胞/24小時)之定量下限。定量下限用於估計相對於親本之減少%。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO 及 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549 細胞株之 GM-CSF 分泌及膜結合之 CD40L 表現增加細胞免疫反應
使用IFNγ ELISpot評估A549細胞株中TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO之GM-CSF分泌及膜結合之CD40L之表現及TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO之GM-CSF分泌及膜結合之CD40L表現對細胞免疫反應的作用。如實例9中所述，使用來源於兩個HLA-A02健康供體(n=3/供體)之細胞完成IFNγ ELISpot。相較於未經修飾之親本A549細胞株(1,793 ± 215 SFU)(n=6)，TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO(3,213 ± 287)(n=6)(p=0.0357)及TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO(3,207 ± 663)(n=6)(p=0.0143)之GM-CSF分泌及膜結合之CD40L表現使IFNγ反應顯著增加(圖52A)。使用單向ANOVA及霍爾姆-斯達克多重比較檢驗確定統計顯著性。TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549 及 NCI-H460 細胞株之 GM-CSF 分泌及膜結合之 CD40L 之表現增加 DC 成熟
如實例15中所述，藉由流動式細胞測量術測定iDC之成熟。在此實例中，將來源於三個HLA-A02供體之iDC與未經修飾之親本A549或未經修飾之親本NCI-H460細胞株或者分泌GM-CSF且表現膜結合之CD40L的經修飾之A549或NCI-H460 TGFβ1及TGFβ2 KD CD276 KO共培養。相較於與未經修飾之親本A549細胞株共培養之DC(53 ± 3 %)，在與經修飾之A549共培養之DC上DC成熟標記物CD83之表現顯著增加(71 ± 2 %)(p=0.0015)(圖52B)。類似地，相較於與未經修飾之親本H460(ATCC HTB-177)細胞株共培養之DC(52 ± 3 %)，在與經修飾之NCI-H460共培養之DC上CD83顯著增加(71 ± 5 %)(p=0.0126)(圖52C)。使用單向ANOVA及霍爾姆-斯達克多重比較檢驗確定統計顯著性。TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549 及 NCI-H460 疫苗組分細胞株之 GM-CSF 分泌、膜結合之 CD40L 之表現及 IL-12 分泌
A549細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少84%(n=2)(圖53A)(表36)，及TGFβ2減少＞89%(n=2)(圖53B)(表36)，使得CD47之表現減少99.9%(圖53C)(表33)，分泌2,295 ± 60奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖53D)(表37)，膜結合之CD40L表現增加56倍(圖53E)(表37)，及分泌300 ± 24奈克/106 個細胞/24小時之IL-12 p70(圖53F)(表37)。表 36. 分泌 GM-CSF 、表現膜結合之 CD40L 及分泌 IL-12 之 TGFβ1 及 TGFβ KD 、 CD47 KO 細胞株中的 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌
細胞株 TGFβ1(皮克/106 個細胞/24小時) TGFβ2(皮克/106 個細胞/24小時)
親本 TGFβ1 KD 減少% 親本 TGFβ2 KD 減少%
A549 4,767 ± 300 760 ± 55 84 732 ± 14 ＜ 42 ＞ 89*
NCI-H460 1,850 ± 1 ＜ 92 ＞ 95* 3,433 ± 271 492 ± 10 86
親本係指未經修飾之細胞株。* 分泌含量低於TGFβ1(92皮克/106 個細胞/24小時)或TGFβ2(42皮克/106 個細胞/24小時)之定量下限。定量下限用於估計相對於親本之減少%。
表 37.TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO 及 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO 細胞株之 GM-CSF 分泌、膜結合之 CD40L 之表現及 IL-12 分泌
細胞株 GMCSF( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) 親本 CD40L MFI 經修飾之 CD40L MFI CD40L 增加倍數 IL-12 p70( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 )
A549TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD47 KO 2,295 ± 60 9,537 536,953 56 300 ± 24
NCI-H460TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD47 KO 1,586 ±24 16,992 154,964 9 434 ± 15
A549TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD276 KO 1,113 ± 51 41,076 1,476,699 36 263 ± 24
NCI-H460TGFβ1 及 TGFβ2 KD 、 CD276 KO 1,234 ± 24 16,992 267,023 16 312 ± 50
NCI-H460細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少＞95%(n=2)(圖54A)(表36)，及TGFβ2減少86%(n=2)(圖54B)(表36)，使得CD47之表現減少＞99.9%(圖54C)(表33)，分泌1,586 ± 24奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖54C)(表37)，膜結合之CD40L表現增加9倍(圖54E)(表36)，及分泌434 ± 15奈克/106 個細胞/24小時之IL-12 p70(圖54F)(表36)。TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549(ATCC CCL-185) 及 NCI-H460(ATCC HTB-177) 細胞株之 GM-CSF 分泌、膜結合之 CD40L 表現及 IL-12 分泌增加 TAA 特異性 IFNγ 反應
使用IFNγ ELISpot評估TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549及TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO NCI-H460細胞株之GM-CSF分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12分泌對針對抗原之IFNγ反應的作用。如實例9中所述，使用來源於兩個HLA-A02健康供體(n=3/供體)之細胞完成IFNγ ELISpot。相較於未經修飾之親本細胞株(382 ± 96 SFU)(n=6)，A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞(1,586 ± 887 SFU)(n=6)使針對TAA MAGE A3、存活素、PRAME、Muc1、STEAP1、Her2及TERT之總IFNγ反應增加(p=0.5887)(圖55A)。類似地，相對於未經修飾之親本細胞株(262 ± 105 SFU)(n=6)，由NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞株(1702 ± 682 SFU)(n=6)引發之總抗原特異性IFNγ反應增加(p=0.1385)(圖55B)。對特異性抗原之反應呈圖例中所指示之次序。TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549 及 NCI-H460 疫苗組分細胞株之 GM-CSF 分泌、膜結合之 CD40L 之表現及 IL-12 分泌
A549細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少96%(n=2)(圖56A)(表38)，及TGFβ2減少＞89%(n=2)(圖56B)(表38)，使得CD276之表現減少98.9%(圖56C)(表33)，分泌1,113 ± 51奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖56D)(表37)，膜結合之CD40L表現增加36倍(圖56E)(表37)，及分泌263 ± 24奈克/106 個細胞/24小時之IL-12 p70(圖56F)(表37)。
NCI-H460細胞株經修飾使得TGFβ1分泌減少＞95%(n=2)(圖57A)(表38)，及TGFβ2減少78%(n=2)(圖57B)(表38)，使得CD276之表現減少98.2%(圖57C)(表33)，分泌1,234 ± 24奈克/106 個細胞/24小時之GM-CSF(圖57D)(表37)，膜結合之CD40L表現增加16倍(圖57E)(表37)，及分泌312 ± 50奈克/106 個細胞/24小時之IL-12 p70(圖57F)(表37)。表 38.CD276 表現減少之經修飾以表現 CD40L 、 GM-CSF 及 IL-12 p70 之細胞株內的 TGFβ1 及 TGFβ2 分泌
細胞株 TGFβ1(皮克/106 個細胞/24小時) TGFβ2(皮克/106 個細胞/24小時)
親本 TGFβ1 減少% 親本 TGFβ2 減少%
A549 4,967 ± 399 179 ± 6 96 807 ± 8 ＜ 42 ＞ 89*
NCI-H460 1,850 ± 1 ＜ 92 ＞ 95* 3,433 ± 271 738 ± 34 78
親本指示未經修飾之細胞株。 * 分泌含量低於TGFβ1(92皮克/106 個細胞/24小時)或TGFβ2(42皮克/106 個細胞/24小時)之定量下限。定量下限用於估計相對於親本之減少%。NA ： 分泌含量低於親本與shRNA修飾之細胞株的定量下限。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549 及 NCI-H460 細胞株之 GM-CSF 分泌、膜結合之 CD40L 之表現及 IL-12 分泌增加 DC 成熟
如實例15中所述，藉由流動式細胞測量術測定組分疫苗細胞株之GM-CSF分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12之分泌對DC成熟的作用。具體而言，將來源於三個HLA-A02供體之iDC與未經修飾之親本A549(ATCC CCL-185)或NCI-H460(ATCC HTB-177)細胞株或者分泌GM-CSF、表現膜結合之CD40L及分泌IL-12的經修飾之TGFβ1及TGFβ2 KD CD276 KO A549(ATCC CCL-185)或NCI-H460(ATCC HTB-177)共培養。相較於與未經修飾之親本A549(ATCC CCL-185)細胞株共培養之DC(53 ± 3%)，在與經修飾之A549(ATCC CCL-185)細胞株共培養之DC上DC成熟標記物CD83之表現顯著增加(71 ± 3%)(p=0.0014)(圖58A)。類似地，相較於與未經修飾之親本H460(ATCC HTB-177)細胞株共培養之DC(52 ± 3%)，在與經修飾之NCI-H460(69 ± 4%)細胞株共培養之DC上CD83顯著增加(p=0.0077)(圖58B)。使用單向ANOVA及霍爾姆-斯達克多重比較檢驗確定統計顯著性。TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549(ATCC CCL-185) 及 NCI-H460(ATCC HTB-177) 細胞株之 GM-CSF 分泌、膜結合之 CD40L 表現及 IL-12 分泌增加 TAA 特異性 IFNγ 反應
使用IFNγ ELISpot評估TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549及TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO NCI-H460細胞株之GM-CSF分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12分泌對針對抗原之IFNγ反應的作用。如實例9中所述，使用來源於兩個HLA-A02健康供體(n=3/供體)之細胞完成IFNγ ELISpot。相較於未經修飾之親本細胞株(421 ± 149 SFU)(n=6)，A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞(1,408 ± 738 SFU)(n=6)使針對抗原MAGE A3、存活素、PRAME、Muc1、STEAP1、Her2及TERT之總IFNγ反應顯著增加(p=0.1385)(圖58C)。類似地，相對於未經修飾之親本細胞株(262 ± 105 SFU)(n=6)，由NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO細胞株(1725 ± 735 SFU)(n=6)引發之總抗原特異性IFNγ反應增加(p=0.1385)(圖58D)。對特異性抗原之反應呈圖例中所指示之次序。實例 25 ： HLA 錯配引起免疫原性增加
免疫細胞藉由產生免疫反應而對「非自身」蛋白質起反應。在HLA錯配之情況下，免疫反應係針對不在個體細胞上表現之HLA蛋白質且此反應可藉由干擾素γ之產生來量測。干擾素γ為與Th1 T細胞反應之產生有關之關鍵細胞介素且Th1 T細胞為抗癌反應之必需介體。不同於幹細胞或器官移植中，藉由充當增強T細胞對在腫瘤疫苗內表現之TAA之引發作用的佐劑，HLA錯配免疫反應在增加全細胞腫瘤疫苗之免疫原性中發揮高度有益之作用。
根據本揭示案之各種實施例，包含最終疫苗產物之細胞株混合物以包括疫苗與患者之間的在兩個最具免疫原性HLA基因座HLA-A及HLA-B處的HLA錯配的設計在疫苗部位產生有益發炎反應，使得疫苗吸收及DC呈遞增加且活化較大數目之T細胞，因此最終增加由癌症疫苗混合物引發之腫瘤反應性T細胞的廣度、量值及免疫原性。藉由包括經選擇以具有HLA類型之錯配及經選擇以表現關鍵TAA的多種細胞株，疫苗能夠有效引發廣泛而有效之抗癌反應以及由HLA錯配產生之其他輔助作用。
在一個實例中，根據本揭示案之疫苗組合物包括多種細胞株，該等細胞株經選擇以確保TAA之廣度以及最具免疫原性HLA蛋白質(HLA-A及HLA-B)之多樣性，以刺激針對腫瘤之最大有效免疫反應。包括HLA錯配可加強免疫反應，幫助引起藉由ELISpot及流動式細胞測量術可量測之總抗TAA干擾素γ產生增加。根據各種實施例，可遵循以下特徵及選擇標準：
因為HLA基因具有遺傳性，所以在來自不同種族之個體當中HLA錯配程度增加。因此，在一些實施例中，細胞株選擇程序可包括獲得來自全世界庫之細胞以設計包括HLA對偶基因多樣性之混合物。
已鑑別HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DPB1之差別可能具有較小免疫原性，因此在一些實施例中，疫苗組合物之細胞株可經選擇以確保高度免疫原性HLA-A及HLA-B對偶基因中之至少2者的錯配。
根據一些實施例，增加所選細胞株之間的錯配HLA-A及HLA B基因座之數目可引起接受疫苗之所有患者中更大程度之錯配以確保藉由干擾素γ ELISpot可量測之輔助作用。
將樹突狀細胞與癌細胞株一起培育以允許抗原吸收及DC成熟。接著將DC與來自供體之PBMC共培養，用相同細胞株或細胞株混合物再刺激，細胞株經選擇以在其HLA亞型上具有異質性且建立與供體PBMC HLA類型之錯配。將細胞塗鋪在ELISpot盤上且活化。藉由如實例6中所述，計數干擾素γ斑點/孔來量測腫瘤特異性T細胞。
如圖59中所示，包括在多種HLA分子中與供體具有較大程度之HLA錯配的肺癌細胞株之組合可引起抗腫瘤T細胞反應增加。歸因於HLA錯配之免疫反應充當增強總體反應之佐劑。此等資料表明，包括多種細胞株以確保全腫瘤癌症疫苗混合物與受體之間在多種I類及II類HLA分子上廣泛程度之HLA錯配可產生增加之同種異體反應。實例 26 ：非小細胞肺癌 (NSCLC) 疫苗之製備
腫瘤及腫瘤細胞株係高度異質的。腫瘤內之亞群表現具有不同生物學潛能及不同抗原譜之不同表型。在全腫瘤細胞疫苗後面之驅動目的之一係將多種腫瘤細胞呈遞至免疫系統。藉由進行此，產生針對多種TAA之免疫反應，繞過與抗原流失相關之問題，抗原丟失可引起抗原逃逸(或免疫復發)及患者復發(Keenan BP等人, 《腫瘤學研討會(Semin Oncol.)》2012; 39: 276-86)。首先在用抗個體基因型單株抗體治療B細胞淋巴瘤中觀測到抗原逃逸(Meeker T等人, 《新英格蘭醫學雜誌(N Engl J Med.)》 1985; 312: 1658-65)且自此之後在諸如CAR-T療法之其他免疫療法治療中觀測(Majzner RG等人, 《癌症探索(Cancer Discov.)》2018; 8: 1219-26)。NSCLC TAA 之表現
藉由源自廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA表現資料確定候選組分細胞株對二十四種TAA之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA下載mRNA表現。若RNA-seq值(FPKM)超過0.5，則細胞株對TAA之表現視為陽性。總體而言，六個組分細胞株表現二十四種所鑑別之TAA中的二十三種，mRNA含量＞0.5 FPKM(圖60)。具體而言，一種細胞株表現五種TAA，兩種細胞株表現四種TAA，三種細胞株表現四種TAA，三種細胞株表現五種TAA，且八種細胞株表現六種TAA。由單個細胞株表現之TAA之最小數目為十二(NCI-H520)且由單個細胞表現之TAA之最大數目為十八(DMS 53)。由A549、NCI-H520、NCI-H460、DMS 53、LK-2、NCI-H23構成之示例性6細胞株單位劑量可靶向的抗原數目高於該等個別細胞株。
本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強TAA之陣列，如本文所述，一種細胞株(LK-2)亦經CT83及間皮素之基因轉導(圖65)。在六種細胞株中之兩個中CT83 mRNA以低水準內源性表現，且六個組分細胞株之一內源性表現間皮素。
因為需要維持TAA之最大異質性，所以使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
累積地，本發明疫苗中之細胞表現更多的已顯示在抗腫瘤免疫中重要之TAA。本發明NSCLC疫苗中使用表39中之細胞株。表 39.NSCLC 疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A NCI-H520 鱗狀
A A549 腺癌
A NCI-H460 大細胞
B LK-2 鱗狀
B NCI-H23 腺癌
B DMS 53 SCLC
shRNA 下調 TGF-β 分泌
減弱TGFβ1及TGFβ2，且如實例5中所述測定所得分泌含量。在混合物A中之親本細胞株中，NCI-H460及A549分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2，而LK-2分泌TGFβ2但不分泌TGFβ1。在混合物B中之親本細胞株中，NCI-H23分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2，且LK-2分泌TGFβ2但不分泌TGFβ1。DMS 53分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2，但TGFβ1分泌低。
除DMS 53之外，組分細胞株均經TGFβ1 shRNA及TGFβ2 shRNA轉導以減弱兩種分子之分泌。因為用TGFβ1及TGFβ2 shRNA修飾之多次嘗試不成功，所以DMS 53僅經TGFβ2 shRNA進行基因修飾。因為在此細胞株中TGFβ2之分泌含量已較低，所以選擇TGFβ1減弱以繼續前進。此等細胞用純系名稱DK4描述。其餘細胞株經TGFβ1及TGFβ2 shRNA雙重修飾。此等細胞用純系名稱DK6描述。
表40示出相較於野生型細胞株，經基因修飾之組分細胞株中的TGF-β分泌。TGFβ1減少之範圍為59%至90%。TGFβ2減少之範圍為42%至97%。表 40. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
NCI-H520 A 野生型 ND 3872
NCI-H520 A DK6 ND 124
NCI-H520 A 減少百分比 NA 97%
A549 A 野生型 5727 775
A549 A DK6 577 42
A549 A 減少百分比 90% 95%
NCI-H460 A 野生型 1573 2307
NCI-H460 A DK6 287 533
NCI-H460 A 減少百分比 82% 77%
LK-2 B 野生型 ND 161
LK-2 B DK6 ND 69
LK-2 B 減少百分比 NA 88%
NCI-H23 B 野生型 1761 588
NCI-H23 B DK6 719 61
NCI-H23 B 減少百分比 59% 90%
DMS 53 B 野生型 261 2833
DMS 53 B DK4 286 1640
DMS 53 B 減少百分比 0% 42%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；ND=無法偵測到；NA=不適用
基於8×106 各組分細胞株之注射劑量，混合物A及B中之總TGF-β分泌展示在表41中。亦顯示混合物中野生型細胞中之分泌。混合物A顯示TGFβ1每24小時每注射劑量9679 pg之總分泌及TGFβ2每24小時每注射劑量5600 pg。混合物B顯示TGFβ1每24小時每注射劑量8220 pg之總分泌及TGFβ2每24小時每注射劑量14163 pg。
貝拉金普(Belagenpumatucel-L)具有每24小時每注射劑量18,813 pg之總TGFβ2分泌(Nemunaitis, J.等人 JCO.(2006)24:29, 4721-4730)(Fakhrai, H 2010)。儘管相較於貝拉金普中之2.5×107 個細胞，NSCLC疫苗中4.8×107 個細胞之較高注射細胞數目，但NSCLC疫苗中之總TGFβ2分泌(每24小時每注射劑量19,763 pg)大致相當於貝拉金普中之TGFβ2分泌。表 41.NSCLC 疫苗混合物中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 58592 55638
   DK6 9679 5600
   減少百分比 83% 90%
B 野生型 16735 28654
   DK6/4 8220 14163
   減少百分比 51% 51%
NSCLC疫苗中之總TGFβ1分泌(每24小時每注射劑量17,899 pg)為貝拉金普中估計TGFβ1分泌之31%。CD276 表現
所有組分細胞株均表現CD276且藉由如實例13中及本文中所述用ZFN電穿孔來剔除CD276表現。除僅TGFβ2減弱之DMS 53(稱為DK4)以外，組分細胞株先前經shRNA基因修飾以減弱TGFβ1及TGFβ2之表現(稱為DK6)。因為需要維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔之細胞。實際上，細胞經受多輪藉由FACS之細胞分選。CD276表現之減少描述於表42中。亦藉由西方墨點分析使用(資料未示出)證實剔除細胞中蛋白質表現之缺乏。此等資料說明CD276之基因編輯引起所有六個組分細胞株中超過99%之CD276陰性細胞。表 42.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI TGFβ1/B2 KDCD276 KO MFI CD276減少%
NCI-H460 366,565 838 99.8
NCI-H520 341,202 212 99.9
A549 141,009 688 99.5
DMS 53 304,637 972 99.7
LK-2 385,535 867 99.8
NCI-H23 74,176 648 99.1
MFI在減去未染色對照下報導
GM-CSF 分泌
如本文及實例24所述，組分細胞株經GM-CSF轉導。結果在表43中示出。表 43. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
NCI-H520 10 80
A549 2880 23,040
NCI-H460 1330 10,640
混合物A總計 4220 33,760
LK-2 2 16
NCI-H23 2310 18,480
DMS 53 170 1,360
混合物B總計 2482 19,856
基於8×106 各組分細胞株之注射劑量，混合物A之總GM-CSF分泌為每24小時每注射劑量33,760 ng。混合物B之總GM-CSF分泌為每24小時每注射劑量19,856 ng。因此，每次注射之總分泌為每24小時43,616 ng。CD40L 表現
如本文所述且藉由實例15中所述之方法，組分細胞株經CD40L載體轉導。如實例15中所述，藉由流動式細胞測量術，利用抗CD40L單株抗體評估CD40L表現。圖74中所示之結果證明所有六種細胞株中顯著之CD40L膜表現。IL-12 表現
組分細胞株經IL-12載體轉導且所得IL-12 p70表現如實例24中及本文中所述來測定，結果在表44中示出。表 44. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
NCI-H520 NA NA
A549 440 3520
NCI-H460 420 3360
混合物A總計 860 6880
LK-2 NA NA
NCI-H23 580 4640
DMS 53 140 1120
混合物B總計 720 5760
基於8×106 各組分細胞株之注射劑量，混合物A之總IL-12分泌為每24小時每注射劑量6880 ng。混合物B之總IL-12分泌為每24小時每注射劑量5760 ng。因此，每次注射之總IL-12分泌為每24小時12,640 ng。LK-2 細胞株穩定表現間皮素及 CT83
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對於抗腫瘤免疫重要之彼等TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF及膜結合之CD40L的LK-2細胞株亦經表現CT83及間皮素抗原之慢病毒顆粒轉導。CT83及間皮素抗原由P2A裂解位點(SEQ ID NO:21)連接。
藉由流動式細胞測量術表徵膜結合之間皮素及CT83之表現。根據製造商說明書，將未經修飾之親本及經修飾之細胞在細胞外用抗間皮素-PE(R&D Systems FAB32652P)染色。將未經修飾之親本及經修飾之細胞在細胞內用抗CT83(Abcam，ab121219)染色，接著山羊抗兔Alex488(Invitrogen，A-11034)染色。自針對CT83與間皮素染色之未經修飾之細胞的MFI減去未染色之未經修飾之親本細胞的MFI。自針對CT83與間皮素經修飾之細胞的MFI減去經修飾之親本細胞的MFI。表現增加百分比計算為：(1-(背景減去之經修飾之MFI/背景減去之未經修飾之MFI))×100)。經修飾之細胞株(934,985 MFI)中CT83表現比親本細胞株(323,878 MFI)增加3倍。經修飾之細胞株(123,128 MFI)對間皮素之表現比親本細胞株(1443 MFI)增加85倍(圖65A)。
如實例8中所述，藉由自體DC與CD14- PBMC共培養，接著ELISpot來測定IFNγ對CT83及間皮素抗原之反應。在NSCLC-疫苗B之情況下評估IFNγ對由經修飾之LK-2細胞株表現之CT83及間皮素抗原的反應。具體而言，將5×105 個經修飾之DMS 53、NCI-H23及LK-2細胞(1.5×106 個總經修飾細胞)與來自3個HLA不同之供體(n=3/供體)之1.5×106 個iDC共培養。在IFNγ ELISpot分析中將在第6天自與mDC之共培養物分離的CD14- PBMC用CT83及間皮素肽池(15聚體，跨越天然蛋白質序列之重疊11個胺基酸)刺激24小時，接著偵測IFNγ SFU。偵測針對CT83(205 ± 158 SFU)(n=9)及間皮素(3449 ± 889 SFU)(n=9)之IFNγ產生(圖65B)。相較於個別組分細胞株，疫苗混合物引發更強及更廣泛之細胞免疫反應
如實例8及9中所述，藉由IFNγ ELISpot量測相較於NSCLC疫苗混合物誘導針對個別細胞株之IFNγ反應的能力，個別NSCLC疫苗組分細胞株誘導針對自身之IFNγ反應的能力。圖62中之資料證明對於6種細胞株中之4個，混合物(NSCLC-A及NSCLC-B)引發之免疫反應比個別組分細胞株更強。
接著量測由疫苗混合物誘導之針對相關TAA之免疫反應。將正常供體PBMC與個別組分細胞株或與NSCLC-A或NSCLC-B混合物共培養6天，接著用負載含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池的自體DC刺激。接著在IFNγ ELISpot分析中分析細胞之IFNγ分泌。圖63中所示之資料證明NSCLC疫苗組分細胞株中之每一者能夠誘導TAA特異性IFNγ反應。更重要地，相較於個別組分細胞株，兩種NSCLC疫苗混合物誘導更強之針對更多TAA之IFNγ反應，此表明疫苗混合物能夠誘導更廣泛之免疫反應。實例 27 ：非小細胞肺癌 (NSLC) 疫苗
基於本揭示案及本文提供之資料，以下實例提供用於NSCLC之全細胞疫苗，其由下表45中所示之六個肺癌細胞株構成。細胞株代表兩種腺癌(A549及NCI-H23)、兩種鱗狀細胞癌(NCI-H520及LK-2)、一種大細胞癌(NCI-H460)及一種小細胞肺癌(SCLC)(DMS 53)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗混合物A及疫苗混合物B(亦即，NSCLC-A及NSCLC-B)。混合物A經設計以在上臂中皮內投與且混合物B經設計以在大腿中皮內投與。混合物A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 45. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO GM-CSF CD40L IL-12 MSLN CT83
A NCI-H520 X X X X X ND ND ND
A A549 X X X X X X ND ND
A NCI-H460 X X X X X X ND ND
B LK-2 X X X X X ND X X
B NCI-H23 X X X X X X ND ND
B DMS 53 ND X X X X X ND ND
   ND = 未進行
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。已藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除CD276之基因。藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、間皮素及CT83之基因。
六個已建立之肺癌細胞株中之五個係獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC，弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas, VA))且一個係獲自日本生物資源研究中心細胞庫(JCRB，密蘇里州堪薩斯市(Kansas City, MO))。實例 28 ：貝拉金普與 NSCLC 疫苗之比較
貝拉金普之臨床研究結果在同行評審雜誌中公開且包括NSCLC中之兩個II期試驗(Nemunaitis J等人, 《臨床腫瘤學雜誌(J Clin Oncol.)》2006; 24: 4721-30；Nemunaitis J等人, 《癌症基因療法(Cancer Gene Ther.)》 2009; 16: 620-4)及III期試驗(Giaccone G等人, 《歐洲癌症雜誌(Eur J Cancer.)》2015; 51: 2321-9)。
貝拉金普為一種疫苗，其中使用TGFβ2反義質體下調四種同種異體NSCLC腫瘤細胞株中之TGFβ2分泌。然而，貝拉金普並未解決TGFβ1分泌之問題。近期研究顯示，TGFβ1為免疫系統中表現之主要同功型。TGFβ1以高親和力結合於TGFβRII受體，而TGFβ2僅在TGFβRIII輔助受體(亦稱為β蛋白聚醣)存在下以高親和力結合。NSCLC中β蛋白聚醣下調，此使得TGFβ1成為主要TGFβ同功型。
在其他修飾及改善當中，關於TGFβ1及TGFβ2之分泌，實例27中所述之NSCLC疫苗引入相對於貝拉金普之巨大改善。NSCLC疫苗中較低TGFβ2分泌含量係重要的，但甚至更顯著的係降低之TGFβ1含量。本發明NSCLC疫苗亦引入以下改善：shRNA之慢病毒轉導之使用正用以減弱TGFβ2及TGFβ1之表現，提供表現與穩定性上相對於反義之重大改善；使用鋅指核酸酶電穿孔剔除CD276之表現；使用慢病毒轉導誘導免疫刺激分子GM-CSF、IL-12及CD40L之表現；使用SCLC細胞株，注意到近期觀測結果，亦即NSCLC腫瘤含有大量SCLC組分且該組分造成抗藥性、癌轉移及復發；以及使用無血清培養基調配物。
如上所述，鑑別出可能在NSCLC患者中產生相關抗腫瘤免疫反應之二十四種TAA。圖61A中展示NSCLC疫苗及貝拉金普中此等二十四種抗原之mRNA表現。圖61中之資料示為對應的貝拉金普及NSCLC疫苗細胞株組分中各抗原之Log10 FPKM+14 mRNA表現之和。FPKM mRNA值調整為14.0，以顧及負基礎值(-13.00 FPKM)，從而允許添加具有正值之mRNA含量。在573個NSCLC患者樣品中確定由NSCLC疫苗細胞組分表現之二十三種優先NSCLC TAA的表現。在2020年2月23日與2020年7月2日之間自以下可公開獲得之資料庫下載NSCLC患者資料：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami, E.等人 《癌症發現(Cancer Discovery.)》2012.；Gao, J.等人 《科學信號(Sci Signal.)》2013.)(圖78C)。HUGO基因命名委員會(HGNC)基因符號包括在搜索中且針對各TAA下載mRNA表現。
NSCLC疫苗可能靶向由573個患者腫瘤樣品表現之21種TAA之中位數(圖61B)且貝拉金普靶向17種TAA之中位數(圖61C)。在所有573個患者中NSCLC疫苗及貝拉金普均具有誘導針對至少五種抗原之抗腫瘤反應的潛能。NSCLC疫苗可對572個患者(99.8%)至少17種抗原、565個患者(98.6%)中至少18種抗原、538個患者(93.9%)中至少19種抗原、438個患者(76.4%)中至少20種抗原、290個患者(50.6%)中至少21種抗原、183個患者(31.9%)中至少22種抗原及73個患者(12.7%)中至少23種抗原誘導抗腫瘤反應。相比之下，貝拉金普僅能對572個患者(99.8%)中至少14種抗原、558個患者(97.4%)中至少15種抗原、525個患者(91.6%)中至少16種抗原、351個患者(61.3%)中至少17種抗原、233個患者(40.7%)中至少18種抗原及126個患者(22.0%)中至少19種抗原誘導抗腫瘤反應。以上分析包括在NSCLC患者中優先誘導及抗腫瘤反應之抗原且不考慮組分細胞株表現之其他及可能臨床上相關之抗原。
本文所述之NSCLC疫苗中包括之六種細胞株經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。因此，可使用示例性六細胞株組合物靶向之TAA數目及抗原表現量高於貝拉金普。如早先所描述，為進一步增強抗原廣度，一種細胞株(LK-2)亦經CT83(SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20)及間皮素(SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18)之基因轉導，CT83及間皮素係在六個組分細胞株中之任一者中mRNA以低水準內源性表現之兩種TAA。
本實例證明，相較於貝拉金普，在包含兩種混合物之NSCLC疫苗中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加抗原廣度及細胞免疫反應量值，各混合物由三種細胞株組分構成，總共6個組分細胞株。貝拉金普細胞株中 TGFβ2 分泌之減少
貝拉金普混合物之細胞株組分NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1及Rh2經慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒表現特異性靶向TGFβ2(SEQ ID NO: 24)之shRNA且如實例5中所述測定經修飾之細胞株中所得TGFβ2含量。經修飾之細胞中的TGFβ2分泌含量低於NCI-H520及SK-LU-1之ELISA分析定量下限且MDD(42.0皮克/106 個細胞/24小時用於估計相對於親本細胞株之減少百分比。相較於親本未經修飾之細胞株，NCI-H460中TGFβ2分泌減少84%，NCI-H520中減少≥99%，SK-LU-1中減少≥84%，且Rh2中減少74%。NSCLC混合物A及混合物B之TGFβ1及TGFβ2含量之減少描述於表41中。NSCLC疫苗如實例27中所述製備。針對 NSCLC 疫苗 -A 、 NSCLC 疫苗 -B 及貝拉金普之抗原特異性及腫瘤細胞特異性 IFNγ 產生
如實例8中所述，在自身DC及PBMC共培養之後，藉由IFNγ ELISpot測定針對抗原及親本未經修飾之細胞的細胞免疫反應，修改如下所述。
調整自身DC及PBMC共培養物以模擬貝拉金普及NSCLC疫苗之活體內投與。貝拉金普投與單個部位且NSCLC疫苗-A及NSCLC疫苗-B投與兩個單獨注射部位。在表示貝拉金普之自身DC及PBMC共培養物中，將3.75×105 個NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1、Rh2經修飾之細胞、1.5×106 個總經修飾之細胞與1.5×106 個iDC共培養。NSCLC疫苗-A，將5.00×105 個經修飾之NCI-H460、NCI-H520、A549細胞、1.5×106 個總經修飾之細胞與1.5×106 個iDC共培養。對於NSCLC疫苗-B，5.0×105 個經修飾之DMS 53、NCI-H23及LK-2細胞、1.5×106 個總經修飾之細胞與1.5×106 個iDC共培養。在共培養之後，藉由IFNγ ELISpot測定針對親本腫瘤細胞株及抗原之細胞免疫反應。在單獨孔中用未經修飾之NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1或Rh2(n=4/細胞株/供體)刺激來自貝拉金普共培養物之CD14- PBMC。在單獨孔中用NCI-H460、NCI-H520或A549(n=4/細胞株/供體)刺激來自NSCLC疫苗-A混合物之CD14- PBMC。在單獨孔中用DMS 53、LK-2或NCI-H23(n=4/細胞株/供體)刺激來自NSCLC疫苗-B混合物之CD14- PBMC。使用自相同貝拉金普、NSCLC疫苗-A及NSCLC疫苗-B共培養物分離之CD14- PBMC(n=4/供體/抗原)測定抗原特異性反應。測定針對包含貝拉金普疫苗、NSCLC疫苗-A及NSCLC疫苗-B之親本未經修飾之細胞株及對示例性腫瘤相關抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)及癌症/睾丸抗原(CTA)的IFNγ產生反應。相較於單一混合物免疫療法方法中 4 個組分細胞株中 TGFβ2 之減少， 2 混合物方法中 6 個組分細胞株中 TGFβ1 、 TGFβ2 及 CD276 表現之減少同時 GM-CSF 、 CD40L 及 IL-12 之過度表現顯著增加細胞免疫反應
在來源於8個HLA不同之健康供體之CD14- PBMC及DC共培養之後，測定由貝拉金普、混合物A及混合物B誘導之針對親本腫瘤細胞及抗原之IFNγ反應。將與負載有經修飾之貝拉金普NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1、Rh2組分細胞株之DC共培養的PBMC用親本未經修飾之NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1、Rh2細胞(n=4/供體/細胞株)刺激。將與負載有混合物A之DC共培養的PBMC用親本未經修飾之NCI-H460、NCI-H520、A549細胞(n=4/供體/細胞株)刺激。將與負載有混合物B之DC共培養的PBMC用親本未經修飾之DMS 53、NCI-H23及LK-2細胞(n=4/供體/細胞株)刺激。各供體變數之複製樣品(n=4)之平均SFU報導為±SEM。相較於貝拉金普(1,850 ± 764 SFU)(n=8)(p=0.0148，曼-惠特尼U檢驗)(圖66A)，NSCLC疫苗單位劑量引發顯著更穩固之腫瘤細胞特異性IFNγ反應(7,613 ± 1,763 SFU)(n=8)。圖67A中示出對貝拉金普、NSCLC疫苗混合物A、NSCLC疫苗混合物B及NSCLC疫苗單位劑量之供體特異性IFNγ反應。
表46展示隨供體而變的對混合物A及混合物B之IFNγ反應的分佈，突出增加細胞株組分之細胞株數目及遞送部位能夠達到比4種細胞株之單一組合物更廣泛之群體。表 46.IFNγ 反應
貝拉金普 混合物 A 混合物 B NSCLC 疫苗單位劑量 增加倍數 *
供體 1 473 943 75 1,018 2.2
供體 2 6,180 6,180 4,983 11,163 3.4
供體 3 339 926 1,303 2,229 6.6
供體 4 4,163 4,413 829 5,242 1.3
供體 5 1,476 3,039 8,780 11,819 8.0
供體 6 1,200 11,240 2,330 13,570 11.3
供體 7 225 2,107 1,956 4,063 18.1
供體 8 740 7,848 3,950 11,798 15.9
平均值 1,850 4,587 3,026 7,613   
SEM 764 1,287 999 1,763   
*相對於貝拉金普，由IA單位劑量誘導之IFNγ SFU之增加倍數。(n=4/供體)
NSCLC疫苗混合物A及混合物B亦誘導對與NSCLC及其他實體腫瘤適應症相關之示例性抗原組更穩固之抗原特異性IFNγ反應。將與負載有貝拉金普、NSCLC疫苗混合物A或NSCLC疫苗混合物B之DC共培養的PBMC用含有廣泛範圍之HLA單純型之已知抗原特異性T細胞抗原決定基的肽池刺激(n=4/供體/抗原)。在表47及圖67B中各抗原及供體(n=4)之複製樣品之平均SFU報導為±SEM。在8個供體中，相對於貝拉金普(392 ± 157 SFU)，NSCLC疫苗單位劑量顯著增加抗原特異性IFNγ產生之平均量值及廣度(6,576 ± 2,147 SFU)(n=8)(p=0.0002，曼-惠特尼U檢驗)(圖66B)。表 47. 抗原特異性 IFNγ 產生之平均量值
貝拉金普 NSCLC 疫苗單位劑量 增加倍數 *
供體 1 172 3,847 22.4
供體 2 125 7,493 59.9
供體 3 23 1,248 55.4
供體 4 35 2,500 71.4
供體 5 275 3,723 13.5
供體 6 977 20,603 21.1
供體 7 340 6,748 19.8
供體 8 1,191 6,447 5.4
平均值 392 6,576   
SEM 157 2,147   
*相對於貝拉金普，由NSCLC疫苗單位劑量誘導之IFNγ SFU之增加倍數。(n=4/供體)
實例 29 ：多形性膠質母細胞瘤 (GBM) 癌症疫苗之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種GBM相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物GBM疫苗-A由亦經修飾以表現modPSMA之細胞株LN-229、細胞株GB-1及亦經修飾以表現modTERT之細胞株SF-126構成。第二混合物GBM疫苗-B由細胞株DBTRG-05MG、亦經修飾以表現modMAGEA1、hCMV pp65及EGFRvIII之細胞株KNS 60及細胞株DMS 53構成。6種組分細胞株總體而言表現至少二十二種可提供抗GBM腫瘤反應之抗原。多形性膠質母細胞瘤疫苗組分之鑑別
初始細胞株選擇標準鑑別出十七種疫苗組分細胞株，用於可能包括在GBM疫苗中。應用其他選擇標準以將十七種候選細胞株縮小至八種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性GBM相關抗原之表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、GBM特異性CSC標記物之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、GBM組織學及分子亞型(可獲得時)及O6 -甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)啟動子之甲基化狀態(可獲得時)。
GBM腫瘤富含表現各種CSC標記物之異質CSC群體(表2)。在2020年2月23日與2020年7月2日之間自以下可公開獲得之資料庫下載之患者腫瘤樣品資料中證實十三種GBM相關CSC標記物ABCG2、ALDH1A1、BMI-1、FUT4、CD44、CD49f、CD90、PROM1、CXCR4、Musashi-1、Nestin、MYC及SOX2之表現：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami, E.等人 《癌症研究》2012.；Gao, J.等人 《科學信號》2013.)(圖68C)。HUGO基因命名委員會(HGNC)基因符號包括在搜索中且針對各CSC標記物下載mRNA表現。
藉由源自廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA表現資料確定候選組分細胞株對TAA及CSC標記物之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA或CSC標記物下載mRNA表現。若RNA-seq值(FPKM)超過一，則細胞株對TAA或CSC標記物之表現視為陽性。基於上述選擇標準，鑑別出十七種GBM疫苗候選組分中之八種，用於進一步評估：DBTRG-05MG、LN-229、A-172、YKG-1、U-251 MG、GB-1、KNS 60及SF-126。八種候選組分細胞株表現七種至十種CSC標記物(圖68B)及十一種至十四種TAA(圖68A)。如本文所述，包括CSC樣細胞株DMS 53作為6種細胞株之一。
如實例9中所述，針對三個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估未經修飾之GBM組分細胞株候選物之免疫原性。供體HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*02:01 B*35:01及A*31:01 B*35:03；供體2，A*01:01 B*30:01及A*02:01 B*12:02，供體3，A*02:01 B*15:07及A24:02 B*18:01。LN-229(5,039 ± 637 SFU)及DBTRG-05MG(6,094 ± 734 SFU)比A-172(808 ± 152 SFU)、YKG-1(576 ± 154)、U-251 MG(2,314 ± 434)、GB-1(908 ± 284 SFU)、KNS-60(2,177 ± 415 SFU)及SF-126(1,716 ± 332 SFU)免疫原性大。(圖69A)如在本文中進一步描述，選擇LN-229包括在疫苗混合物A中且選擇DBTRG-05MG包括在疫苗混合物B中。
在三種組分細胞株之八種不同組合中評估DBTRG-05MG及LN-229之免疫原性，四種組合含有DBTRG-05MG且四種組合含有LN-229(圖69C)。如實例8中所述，使用上述相同三個健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對八種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。偵測所有八種混合物及針對各混合物中之各細胞株組分之IFNγ反應。相較於針對單個細胞株組分所偵測之IFNγ反應，針對個別混合物組分細胞株之反應顯著減少。在所有八種評估之組合中，DBTRG-05MG及LN-229保持最大免疫原性(圖69B)。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對GBM抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如IL13Rα2，以及已知對GBM及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。如本文中所示，為進一步增強TAA陣列，LN-229經編碼modPSMA之基因轉導，SF-126經編碼modTERT之基因轉導，且KNS-60經編碼modMAGEA1、hCMV pp65及跨越EGFR之267個胺基酸之框內缺失，產生EGFR突變形式EGFRvIII之14胺基序列的基因轉導，如本文所述。
TERT、PSMA及MAGEA1在六種組分細胞株中之一種中內源性表現，且活化突變EGFRvIII及GBM相關病毒抗原hCMV pp65在一或多種細胞株中以＞1.0 FPKM非內源性地表現，如下所述(圖70)。如本文所述，藉由流動式細胞測量術偵測SF-126對經轉導之抗原modTERT之表現(SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 36)(圖71A)，LN-229對modPSMA之表現(SEQ ID NO: 37；SEQ ID NO: 38)(圖71B)，KNS 60對modMAGEA1之表現(SEQ ID NO: 39；SEQ ID NO: 40)(圖71C)，KNS 60對EGFRvIII之表現(SEQ ID NO: 39；SEQ ID NO: 40)(圖71D)及KNS 60對hCMV pp65之表現(SEQ ID NO: 39；SEQ ID NO: 40)(圖71E)。如本文所述，亦藉由RT-PCR偵測KNS 60對EGFRvIII及hCMV pp65之表現(圖71F)。在相同慢病毒轉移載體中編碼MAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65之基因，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開。本文描述針對經轉導之抗原的IFNγ產生。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
本發明疫苗中代表性TAA之mRNA表現在圖70A中示出。本發明疫苗高度表現所有鑑別之二十二種通常靶向且可能臨床上相關之用於誘導GBM抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在GBM腫瘤中且一些亦可誘導針對GBM及其他實體腫瘤之免疫反應。使用相同方法及170個用於證實上述GBM CSC標記物之表現的患者樣品，在170個GBM患者樣品中測定二十二種優先GBM TAA之表現。100%樣品表現十八種優先GBM TAA，97.2%樣品表現19種TAA，79.4%樣品表現20種TAA，32.9%樣品表現21種TAA，且1.8%樣品表現22種TAA(圖70B)。基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表48中鑑別出之細胞株以包含本發明GBM疫苗。表 48. 膠質母細胞瘤疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A LN-229 多形性膠質母細胞瘤
A GB-1 多形性膠質母細胞瘤
A SF-126 多形性膠質母細胞瘤
B DBTRG-05MG 多形性膠質母細胞瘤
B KNS-60 多形性膠質母細胞瘤
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現
LN-229、GB-1、SF-126、KNS-60及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。DBTRG-05MG經表現對CD276減弱具有特異性之shRNA(shCD276，ccggtgctggagaaagatcaaacagctcgagctgtttgatctttctccagcatttttt(SEQ ID NO:71 )的慢病毒顆粒轉導。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受藉由FACS之多輪細胞分選。
藉由在第1天(在輻照之前)及第3天(輻照之後48小時)用PE α-人類CD276(BioLegend，純系DCN.70)細胞外染色經修飾及親本細胞株來測定CD276之表現。輻照並未影響CD276表現量且報導第1天MFI值。未染色細胞及同型對照PE α-小鼠IgG1(BioLegend，純系MOPC-21)染色之親本細胞及CD276 KO細胞充當對照。自針對親本及經修飾之細胞株報導之值減去同型對照之MFI。CD276表現之減少百分比表示為：(1-(CD276KO細胞株之MFI/親本之MFI))×100)。MFI相對於100,000個細胞正規化。表49中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用shRNA或ZFN對CD276進行基因編輯引起超過58.5%之CD276陰性細胞。表 49.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
LN-229 17,549 176 99.0
GB-1 31,439 137 99.6
SF-126 25,608 18 99.9
DBTRG-05MG 67,196 27,879 58.5
KNS-60 12,218 122 99.0
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
TGFβ1 、 TGFβ2 、 GM-CSF 及 IL-12 之細胞介素分泌分析
以100 Gy對細胞株進行X射線輻照，接著以2種細胞密度(5.0e5及7.5e5)一式兩份地塗鋪在6孔盤中。第二天，將細胞用PBS洗滌且培養基變成分泌分析培養基(基礎培養基+5% CTS)。在48小時之後，收集培養基用於ELISA。使用Luna細胞計數器(Logos Biosystems)對每孔之細胞數目計數。記錄總細胞計數及活細胞計數。如藉由ELISA測定之培養基中之細胞介素之分泌相對於記錄之總細胞計數正規化。
根據製造商說明書(人類TGFβ1 Quantikine ELISA，R&D Systems，#SB100B)藉由ELISA測定TGFβ1分泌。針對各上清液樣品，將四種稀釋液一式兩份地塗鋪。若ELISA分析結果低於LLD，則藉由自分析中回收之細胞數目及偵測下限15.4 pg/mL估計相對於親本細胞株之減少百分比。若＞2個樣品或稀釋液中偵測到TGFβ1，則報導n個樣品操作之陽性值之平均值。
根據製造商說明書(人類TGFβ2 Quantikine ELISA，R&D Systems，#SB250)藉由ELISA測定TGFβ2分泌。針對各上清液樣品，將四種稀釋液一式兩份地塗鋪。若ELISA分析結果低於LLD，則藉由自分析中回收之細胞數目及偵測下限7.0 pg/mL估計相對於親本細胞株之減少百分比。若＞2個樣品或稀釋液中偵測到TGFβ2，則報導n個樣品操作之陽性值之平均值。
根據製造商說明書(GM-CSF Quantikine ELISA，R&D Systems，#SGM00)藉由ELISA測定GM-CSF分泌。針對各上清液樣品，將四種稀釋液一式兩份地塗鋪。若ELISA分析結果低於LLD，則藉由自分析中回收之細胞數目及偵測下限3.0 pg/mL估計相對於親本細胞株之增加百分比。若＞2個樣品或稀釋液中偵測到GM-CSF，則報導n個樣品操作之陽性值之平均值。
根據製造商說明書(LEGEND MAX人類IL-12(p70)ELISA，Biolegend #431707)藉由ELISA測定IL-12分泌。針對各上清液樣品，將四種稀釋液一式兩份地塗鋪。若ELISA分析結果低於LLD，則藉由自分析中回收之細胞數目及偵測下限1.2 pg/mL估計增加百分比。若＞2個樣品或稀釋液中偵測到IL-12，則報導n個樣品操作之陽性值之平均值。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及TGFβ2分泌含量且如上所述測定所得含量。在GBM疫苗-A中之親本細胞株中，LN-229、GB -1及SF-126分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。在GBM疫苗-B中之親本細胞株中，DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。實例5中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上所述測定所得含量。
GBM來源之五種組分細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌。編碼TGFβ1 shRNA之慢病毒顆粒亦編碼用於在不同啟動子控制下表現膜結合之CD40L的基因。此允許同時減少TGFβ1及表現膜結合之CD40L。隨後SF-126及KNS 60經編碼TGFβ2 shRNA及GM-CSF之慢病毒顆粒(SEQ ID NO: 6)轉導。此允許在兩種細胞株中同時減少TGFβ2及表現GM-CSF。
DBTRG-05MG及GB-1僅經TGFβ1 shRNA進行基因修飾。TGFβ1及TGFβ2促進細胞增殖及存活。在一些細胞株中，如一些腫瘤中，TGFβ信號傳導之減少可誘導生長阻滯且導致細胞死亡。在諸如GBM之神經元細胞中，TGFβ信號傳導之喪失亦與細胞死亡相關。選擇TGFβ1減弱用於修飾，因為認為其為一種相對於TGFβ2更有效之免疫抑制因子且保留一些TGFβ信號傳導可能是此等細胞株增殖及存活必要的。LN-229以可偵測但低的含量分泌TGFβ2，且不用TGFβ2 shRNA修飾。此等細胞用純系名稱DK2描述。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌而不減少TGFβ1之分泌。此等細胞用純系名稱DK4描述。其餘細胞株用TGFβ1 shRNA及TGFβ2 shRNA雙重修飾。此等細胞用純系名稱DK6描述。
表50展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。基因修飾引起TGFβ1分泌減少49%至80%。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少51%至99%。經TGFβ1 shRNA修飾之DBTRG-05MG分泌之TGFβ2比未經修飾之親本細胞株少。在多個獨立實驗中證實經修飾之細胞株對TGFβ2之較低分泌。在其他組分細胞株中未觀測到TGFβ1減弱之後TGFβ2之較低分泌。表 50. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
LN-229 A 野生型 1,874 ± 294 116 ± 19
LN-229 A DK2 384 ± 47 73 ± 41
LN-229 A 減少百分比 80% NA
GB-1 A 野生型 204 ± 28 481 ± 51
GB-1 A DK2 66 ± 16 438 ± 59
GB-1 A 減少百分比 68% NA
SF-126 A 野生型 2,818 ± 258 784 ± 98
SF-126 A DK6 792 ± 188 * ≤ 11
SF-126 A 減少百分比 72% 99%
DBTRG-05MG B 野生型 6,626 ± 389 2,664 ±461
DBTRG-05MG B DK2 3,365 ± 653 612 ± 190
DBTRG-05MG B 減少百分比 49% NA
KNS 60 B 野生型 3,308 ± 615 1,451 ± 235
KNS 60 B DK6 1,296 ± 110 36 ± 11
KNS 60 B 減少百分比 61% 97%
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 219 ± 33 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之GBM疫苗-A及GBM疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表51中示出。GBM疫苗-A之TGFβ1分泌減少75%，且TGFβ2減少62%皮克/劑量/24小時。GBM疫苗-B之TGFβ1分泌減少51%，且TGFβ2減少74%皮克/劑量/24小時。表 51.GBM 疫苗 -A 及 GBM 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 2,448 691
   DK2/6 621 261
   減少百分比 75% 62%
B 野生型 5,020 2,301
   DK2/4/6 2,440 600
減少百分比 51% 74%
GM-CSF 分泌
兩種GBM組分細胞株KNS 60及SF-126經慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒含有TGFβ2 shRNA與在不同啟動子控制下表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)。此允許同時減少TGFβ2分泌及表現GM-CSF。DBTRG-05MG、LN-229及GB-1細胞株經慢病毒顆粒轉導以僅表現GM-CSF(SEQ ID NO: 7)。如實例24中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表52中示出且在下文描述。
在所有經修飾之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，GM-CSF之分泌增加至少19,000倍。在GBM疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株，LN-229之GM-CSF之分泌增加303,000倍(≤ 0.002奈克/106 個細胞/24小時)，相較於親本細胞株，GB-1之GM-CSF之分泌增加409,000倍(≤0.001奈克/106 個細胞/24小時)，且相較於親本細胞株，SF-126之GM-CSF之分泌增加19,000倍(≤0.003奈克/106 個細胞/24小時)。在GBM疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.002奈克/106 個細胞/24小時)，DBTRG-05MG之GM-CSF之分泌增加1,209,500倍，相較於親本細胞株，KNS 60(≤0.003奈克/106 個細胞/24小時)之GM-CSF之分泌增加109,667倍，且相較於親本細胞株，DMS 53(≤0.004奈克/106 個細胞/24小時)之GM-CSF之分泌增加39,450倍。表 52. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
LN-229 606 ± 228 303
GB-1 409 ± 161 205
SF-126 57 ± 13 29
混合物A總計 1,072 537
DBTRG-05MG 2,419 ± 721 1,210
KNS 60 329 ± 45 165
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 2,906 1,454
基於5×105 各組分細胞株之劑量，GBM疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量537 ng。GBM疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量1,454 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時1,991 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L之載體。本文中描述偵測五種GBM細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述用於修飾DMS 53以表現CD40L之方法。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。
如實例15中所述，藉由流動式細胞測量術，利用抗CD40L單株抗體評估CD40L表現。在第1天(在輻照之前)及第3天(在輻照之後)測定CD40L表現。輻照並未影響表現量且報導第1天CD40L表現。若同型對照MFI之減去產生負值，則使用1.0之MFI計算相對於未經修飾之細胞株，經修飾之組分細胞株對CD40L之表現的增加倍數。圖72中所示及下文所述之結果證明在所有六種細胞GBM疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
圖72展示GBM疫苗組分細胞株對膜結合之CD40L的表現。在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少172倍。在GBM疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，LN-229對CD40L之表現增加11,628倍(11,628 MFI)，相較於親本細胞株(19 MFI)，GB-1對CD40L之表現增加233倍(4,464 MFI)，且相較於親本細胞株(32 MFI)，SF-126對CD40L之表現增加172倍(5,526)。在GBM疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，DBTRG-05MG對CD40L之表現增加20,510倍，相較於親本細胞株(0 MFI)，KNS 60對CD40L之表現增加5,599倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表53中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少45,000倍。在GBM疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，LN-229之IL-12之分泌增加81,000倍，相較於親本細胞株(≤ 0.0002奈克/106 個細胞/24小時)，GB-1之IL-12之分泌增加50,000倍，且相較於親本細胞株(≤0.001奈克/106 個細胞/24小時)，SF-126之IL-12之分泌增加45,000倍。在GBM疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，DBTRG-05MG對IL-12之表現增加133,560倍，且相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，KNS 60對IL-12之表現增加116,000倍。DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 53. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
LN-229 81 ± 4 41
GB-1 10 ± 1 5
SF-126 45 ± 7 23
混合物A總計 136 69
DBTRG-05MG 134 ± 24 67
KNS 60 116 ± 5 58
DMS 53 NA NA
混合物B總計 250 125
基於5×105 各組分細胞株之劑量，GBM疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量69 ng。GBM疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量125 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時194 ng。LN-229 細胞株穩定表現 modPSMA
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對GBM抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ1分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的LN-229細胞株亦經表現modPSMA抗原(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)之慢病毒顆粒轉導。
藉由流動式細胞測量術表徵modPSMA之表現。未經修飾之親本及經修飾之細胞在細胞內用0.06微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PSMA抗體(AbCam ab268061，純系FOLH1/3734)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(Biolegend #405322)染色。自抗PSMA染色之細胞之MFI減去同型對照染色親本及經修飾之細胞的MFI。MFI相對於100,000個事件正規化。抗原表現增加倍數計算為：(減去背景之經修飾之MFI/減去背景之親本MFI)。經修飾之細胞株(533,577 MFI)中PSMA之表現比親本細胞株(14,008 MFI)增加38倍(圖71B)。KNS 60 細胞株穩定表現 modMAGEA1 、 EGFRvIII 、 hCMV-pp65
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的KNS 60細胞株亦經表現modMAGEA1、hCMV pp65及EGFRvIII抗原之慢病毒顆粒轉導。modMAGEA1、hCMV pp65及EGFRvIII抗原由弗林蛋白酶裂解位點連接(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40)。
藉由流動式細胞測量術表徵modMAGEA1、hCMV pp65及EGFRvIII之表現。未經修飾之親本及經修飾之細胞在細胞內染色以如下偵測各抗原之表現。為偵測modMAGEA1，首先將細胞用小鼠IgG1抗MAGEA1抗體(SC-71539，純系3F256)染色(0.03微克/檢驗)，接著用AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(Biolegend #405322)染色(0.125微克/檢驗)。為偵測hCMVpp65，首先將細胞用小鼠IgG1抗pp65抗體(AbCam ab31624，純系1-L-11)染色(0.06微克/檢驗)，接著用AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(Biolegend #405322)染色(0.125微克/檢驗)。為偵測EGFRvIII，首先將細胞用小鼠IgG1抗EGFRvIII抗體(Novus NBP2-50599，純系DH8.3)染色(0.06微克/檢驗)，接著用AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(Biolegend #405322)染色(0.125微克/檢驗)。自針對MAGEA1、hCMV pp65或EGFRvIII染色之細胞之MFI減去同型對照染色細胞之MFI。MFI相對於100,000個事件正規化。抗原表現增加倍數計算為：(減去背景之經修飾之MFI/減去背景之親本MFI)。
亦藉由RT-PCR證實hCMV pp65及EGFRvIII之表現(圖81F)。1.0-3.0×106 個細胞用於RNA分離。根據製造商說明書，使用Direct-zolTM RNA MiniPrep套組(ZYMO RESEARCH，目錄號：R2051)分離RNA。使用NanoDrop™ OneC(Thermo Scientific™，目錄號13-400-519)進行RNA定量。對於逆轉錄，根據製造商說明書，使用qScript cDNA SuperMix(Quantabio，目錄號：95048-025)將1 µg RNA逆轉錄成cDNA。在完成cDNA合成之後，將反應稀釋兩次且使用2 µL cDNA用於擴增。對於hCMV pp65，正向引子經設計以在轉殖基因中之1925-1945鹼基對(bp)位置(CGGACTGCTGTGTCCTAAGAG(SEQ ID NO:118))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之2414-2435 bp位置(GCTGTCCTCGTCTGTATCTTCC(SEQ ID NO:119))處退火且得到511 bp產物。對於EGFRvIII，正向引子經設計以在轉殖基因中之839-858 bp位置(TGTGAAGGTGCTGGAATACG(SEQ ID NO:120))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之1252-1271 bp位置(GCCGGTAAAGTAGGTGTGCT(SEQ ID NO:121))處退火且得到433 bp產物。退火成變異體1、外顯子1(TGTCTAGGGGAAGGGTGTGG(SEQ ID NO:122)及外顯子4(TGCCCCAGACTGACCAAATAC(SEQ ID NO:123))之β-微管蛋白引子用作對照。偵測hCMV pp65、EGFRvIII及β-微管蛋白之PCR如下完成：初始變性，98℃ 30秒，接著25個如下循環：在98℃下變性5至10秒，在58℃下退火10至30秒，及在72℃下延伸30秒。在25個循環之後，完成在72℃下最終延伸2分鐘，且反應保持在10℃下，直至藉由凝膠電泳偵測PCR產物。在完成PCR之後，以1X濃度添加Lel負載染料紫色(6X)(New England BioLabs, # B7024S)。接著PCR產物與8 µL exACT Gene 100 bp梯度(Fisher BioReagents，#BP2573100)一起在2%瓊脂糖凝膠(LonzaSeaKem® LE瓊脂糖，#50004)上跑動以估計條帶尺寸。在條帶適當分開之後，使用ChemiDoc成像系統(BioRAD，#17001401)使凝膠成像。對於利用β-微管蛋白基因進行相對定量，使用Image Lab軟體v6.0(BioRAD)。
經修飾之細胞株(140,342 MFI)中modMAGEA1之表現比親本細胞株(3,460 MFI)增加41倍(圖71C)。經修飾之細胞株(9,545 MFI)中hCMV pp65之表現比親本細胞株(0 MFI)增加9,545倍。自pp65染色之親本KNS 60之MFI減去同型對照之MFI得到負值。使用1 MFI計算經修飾之細胞株中pp65表現之增加倍數(圖71E)。經修飾之細胞株(4,925 MFI)對EGFRvIII之表現比親本細胞株(1,053 MFI)增加5倍(圖71D)。SF-126 細胞株穩定表現 modTERT
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的SF-126細胞株亦經表現modTERT抗原(SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36)之慢病毒顆粒轉導。
藉由流動式細胞測量術表徵modTERT之表現。未經修飾之親本及經修飾之細胞在細胞內用抗兔IgG1抗TERT抗體(AbCam ab32020，純系Y182)(0.03微克/檢驗)染色，接著用AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(Biolegend #406414)(0.125微克/檢驗)染色。MFI相對於100,000個事件正規化。自針對親本及經修飾之細胞染色之細胞的MFI減去同型對照染色之親本及經修飾之細胞的MFI。抗原表現增加倍數計算為：(減去背景之經修飾之MFI/減去背景之親本MFI)。經修飾之細胞株(281,904 MFI)中modTERT之表現比親本細胞株(10,578 MFI)增加27倍(圖71A)。GBM- 疫苗 B 中對 MAGEA1 、 EGFRvIII 及 hCMV pp65 之免疫反應
在GBM-疫苗B之情況下評估對MAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65抗原之IFNγ反應。具體而言，將5×105 個經修飾之DMS 53、DBTRG-05MG及KNS 60細胞株共1.5×106 個總經修飾之細胞與來自八個HLA不同之供體之1.5×106 個iDC(n=4/供體)共培養。八個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表54中示出。MHC I類不同供體中產生免疫反應之能力證明GBM疫苗可能在不同患者群體中引發CD8+ T細胞反應，且類別不限於特定MHC對偶基因。在IFNγ ELISpot分析中，在第6天，自與DC之共培養物分離CD14- PBMC，且用肽池(跨越天然蛋白質序列之重疊11個胺基酸的15聚體或跨越天然蛋白質序列之重疊9個胺基酸的15聚體)刺激24小時，接著偵測產生IFNγ之細胞。肽的來源如下：EGFRvIII，重疊9個胺基酸之15聚體，係購自Scientific Custom Peptide Service，MAGE A1(JPT，PM-MAGEA1及hCMV pp65(JPT，PM-PP65-1)。相較於未經修飾之GBM疫苗-B(225 ± 64 SFU)，在經修飾之GBM疫苗-B(1,323 ± 442 SFU)下對MAGEA1之IFNγ反應顯著增加(p=0.005，曼-惠特尼U檢驗)(n=8)(圖71I)。相較於未經修飾之GBM疫苗-B(165 ± 93 SFU)，在經修飾之GBM疫苗-B(855 ± 231 SFU)下EGFRvIII特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.049，曼-惠特尼U檢驗)(圖71J)。相較於未經修飾之GBM疫苗-B(814 ± 229 SFU)，在經修飾之GBM疫苗-B(5,283 ± 1,434 SFU)下hCMV pp65特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.001，曼-惠特尼U檢驗)(圖71K)。GBM- 疫苗 A 中對 PSMA 及 TERT 之免疫反應
在GBM-疫苗A之情況下評估對PSMA及TERT之IFNγ反應。具體而言，將5×105 個經修飾之LN-229、GB-1及SF-126細胞株共1.5×106 個經修飾之細胞與來自8個HLA不同之供體之1.5×106 個iDC(n=4/供體)共培養(表54)且如上所述藉由ELISpot測定IFNγ反應。PSMA肽，跨越天然抗原長度之重疊9個胺基酸的15聚體，係購自Thermo Scientific Custom Peptide Service。覆蓋全長天然抗原之TERT肽係購自JPT(PM-TERT)。相較於親本未經修飾之GBM疫苗-A(231 ± 102 SFU)，在經修飾之GBM疫苗-A(1,284 ± 258 SFU)下TERT特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.011，曼-惠特尼U檢驗)(n=8)(圖71G)。相較於親本未經修飾之GBM疫苗-A(154 ± 22 SFU)，在經修飾之GBM疫苗-A(1,210 ± 348 SFU)下PSMA特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.028，曼-惠特尼U檢驗)(n=8)(圖71H)。表 54. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *02:01*03:01 *18:01 *38:01 *07:01 *12:03
2 *03:01 *25:01 *07:02 *18:01 *07:02 *12:03
3 *02:01 *24:02 *08:01 *44:02 *05:01 *07:01
4 *02:01 *03:01 *08:01 *51:01 *07:01 *14:02
5 *02:05 *31:01 *27:25 *50:01 *07:01 *07:02
6 *23:01 *24:02 *35:03 *55:01 *27:25 *50:01
7 *30:02 *30:04 *15:10 *58:02 *03:04 *06:02
8 *03:01 *32:01 *07:02 *15:17 *07:01 *07:02
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
藉由ELISpot量測個別組分細胞株及兩種GBM疫苗混合物誘導針對相關GBM抗原之IFNγ產生的能力。將來自八個HLA不同之健康供體(表54)的PBMC與GBM-A或GBM-B混合物共培養6天，接著用負載含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池的自體DC刺激。用於刺激CD14- PBMC之肽的來源如下。對於PSMA、WT1及EGFRvIII，重疊9個胺基酸之15聚體之常規肽文庫係自Pierce定購。額外的重疊11個胺基酸之15聚體肽池來源如下：TERT(JPT，PM-TERT)、MAGE A1(JPT，PM-MAGEA1)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、WT1(HER2(JPT，PM-ERB_ECD)、STEAP(PM-STEAP1)、MUC1(JPT，PM-MUC1)及hCMV pp65(JPT，PM-PP65-1)。接著在IFNγ ELISpot分析中分析細胞之IFNγ分泌。
大約60-70%發達國家人口為hCMV陽性(Hyun等人《免疫學前沿(Front. Immunol.)》2017)且健康供體之hCMV狀態未知。GBM疫苗中之hCMV pp65抗原有可能加強健康供體PBMC中預先存在之記憶反應且未引發重新反應。出於此原因，對hCMV之反應與其他九種優先TAA分開顯示且不包括於圖73、圖74或表55中所示之TAA反應中。圖71J中示出當用親本對照或GBM疫苗刺激時供體PBMC中對hCMV pp65抗原之反應。相較於親本對照，在八個供體中之七個中，在GBM疫苗下對pp65之IFNγ反應顯著增加。具體而言，相較於親本未經修飾之GBM疫苗-A(814 ± 229 SFU)，在經修飾之GBM疫苗-A(5,283 ± 1,434 SFU)之情況下KNS 60對hCMV pp65之表現顯著增加pp65特異性IFNγ反應(p=0.001，曼-惠特尼U檢驗)。
圖73證明，相較於未經修飾之親本對照(2,769 ± 691 SFU)，在八個HLA不同之供體中GBM疫苗能夠誘導顯著更穩固之抗原特異性IFNγ反應(17,316 ± 4,171 SFU)(p=0.004，曼-惠特尼U檢驗)(n=8)(圖73A)。GBM疫苗-A及GBM疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，抗原特異性反應顯著更大。具體而言，相較於未經修飾之對照(1,718 ± 556 SFU)，GBM疫苗-A引發7,716 ± 2,308 SFU(p=0.038，曼-惠特尼U檢驗)(圖73B)。對於GBM疫苗-A，排除hCMV(n=9種抗原)，一個供體對四種抗原作出反應，三個供體對七種抗原作出反應，一個供體對八種抗原作出反應，且三個供體對九種抗原作出反應。相較於親本對照(1,051 ± 365 SFU)，GBM疫苗-B引發9,601 ± 2,413 SFU(p＜0.001，曼-惠特尼U檢驗)(圖73C)。對於GBM疫苗-B，排除hCMV(n=9種抗原)，兩個供體對七種抗原作出反應，三個供體對八種抗原作出反應，且三個供體對九種抗原作出反應。在八個供體中之七個中GBM疫苗(疫苗-A及疫苗-B)誘導針對所有九種非病毒抗原之IFNγ產生(圖74)(表55)。表 55. 對未經修飾及經修飾之 GBM 疫苗組分之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
GBM 疫苗 -A GBM 疫苗 -B GBM 疫苗 GBM 疫苗 -A GBM 疫苗 -B GBM 疫苗
1 89 ± 73 738 ± 401 826 ± 469 8,653 ± 4,964 11,450 ± 6,712 20,103 ± 11,633
2 246 ± 75 594 ± 58 840 ± 112 888 ± 383 1,086 ± 642 1,974 ± 956
3 5,204 ± 1,111 433 ± 145 5,636 ± 1,178 669 ± 634 3,535 ± 2,146 4,234 ± 2,748
4 1,877 ± 1,002 450 ± 317 2,327 ± 1,298 5,314 ± 3,529 20,347 ± 9856 25,661 ± 13,310
5 1,295 ± 732 1,268 ± 433 2,563 ±1,151 6,005 ± 2,330 8,130 ± 2,423 14,135 ± 4,605
6 2,330 ± 677 3,525 ± 330 5,858 ± 740 15,253 ± 4,183 7,795 ± 2,324 23,048 ± 5,931
7 1,103 ± 503 751 ± 223 1,638 ± 938 5,710 ± 4,657 5,965 ± 4,267 11,675 ± 8,893
8 1,600 ± 863 751 ± 223 2,351 ± 1,020 19,204 ± 6,757 18,497 ± 5,934 37,701 ± 12,442
基於本揭示案及本文提供之資料，表56中示出用於多形性膠質母細胞瘤之包含來源於ATCC或JCRB之六種癌細胞株(LN-229(ATCC，CRL-2611)、GB-1(JCRB，IFO50489)、SF-126(JCRB，IFO50286)、DBTRG-05MG(ATCC，CRL-2020)、KNS 60(JCRB，IFO50357)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種膠質母細胞瘤細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53，ATCC CRL-2062)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 56. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO/KD GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A LN-229 X ND X X X X X
A GB-1* X ND X X X X ND
A SF-126 X X X X X X X
B DBTRG-05MG* X ND X^ X X X ND
B KNS 60 X X X X X X X
B DMS 53* ND X X X X X ND
   ND = 未進行。^ CD276 KD。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。CD276之基因藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除，或使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導來減弱。已藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(LN-229)、modTERT(SF-126)、modMAGEA1(KNS 60)、EGFRvIII(KNS 60)及hCMV pp65(KNS 60)之基因。實例 30 ：大腸直腸癌 (CRC) 疫苗之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種CRC相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物CRC疫苗-A由細胞株HCT-15、亦經修飾以表現modPSMA之細胞株HuTu-80及細胞株LS411N構成。第二混合物CRC疫苗-B由亦經修飾以表現modTBXT、modWT1及KRAS突變G12D及G12V之細胞株HCT-116、細胞株RKO及細胞株DMS 53構成。六種組分細胞株總體而言表現至少二十種可提供抗CRC腫瘤反應之抗原。大腸直腸疫苗組分之鑑別
使用初始細胞株選擇標準鑑別出十六種疫苗組分細胞株，用於可能包括在CRC疫苗中。應用其他選擇標準以將十六種候選細胞株縮小至八種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性CRC相關抗原之表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、CRC相關之CSC標記物ALDH1、c-myc、CD44、CD133、Nanog、Musashi-1、EpCAM、Lgr-5及SALL4之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、微衛星不穩定性及CRC組織學亞型。
CSC在大腸直腸癌之癌轉移及復發中起關鍵作用(表2)。在2019年10月1日與2020年10月20日之間自以下可公開獲得之資料庫下載之患者腫瘤樣品資料中證實CRC腫瘤表現九種CRC相關CSC標記物：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami, E.等人 《癌症研究》2012.；Gao, J.等人 《科學信號》2013.)(圖75C)。HUGO基因命名委員會(HGNC)基因符號包括在搜索中且針對各CSC標記物下載經RSEM正規化之mRNA豐度。在1,534個患者樣品中，592個樣品具有可供用於上述十種CSC標記物之mRNA表現資料。若Log10 (RSEM +1)＞ 0，則認為樣品對於CRC CSC標記物之表現呈陽性。在592個樣品內，0.8%表現8種CSC標記物(n=5)，43.9%表現9種CSC標記物(n=260)且55.2%表現10種CSC標記物。
藉由源自廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA表現資料確定候選組分細胞株對TAA及CSC標記物之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA或CSC標記物下載mRNA表現。若RNA-seq值(FPKM)超過一，則細胞株對TAA或CSC標記物之表現視為陽性。基於上述選擇標準，鑑別出十六種CRC疫苗候選組分中之九種，用於進一步評估：HCT-15、SW1463、RKO、HuTu80、HCT-116、LoVo、T84、LS411N及SW48。九種候選組分細胞株表現四種至八種CSC標記物(圖75B)及七種至十二種TAA(圖75A)。如本文所述，CSC樣細胞株DMS 53作為6種細胞株之一包括且表現十五種CRC TAA。
如實例9中所述，針對兩個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估未經修飾之CRC組分細胞株候選物之免疫原性。供體1之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*02:01 B*40:01及A*30:01 B*57:01。供體2之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*24:02 B*18:01及A*02:01 B*15:07。HCT-15(2,375± 774 SFU)及LoVo(1,758 ± 311 SFU)比SW1463(170 ± 90 SFU)、RKO(280 ± 102)、HuTu80(80 ± 47)、HCT-116(981 ± 433 SFU)、T84(406 ± 185 SFU)、LS411N(496 ± 213)及SW48(636 ± 289 SFU)免疫原性大(圖76A)。如在本文中進一步描述，選擇HCT-15及LoVo包括在疫苗混合物A或疫苗混合物B中。
在三種組分細胞株之八種不同組合中評估HCT-15及LoVo之免疫原性，四種組合含有HCT-15且四種組合含有LoVo(圖76C)。如實例8中所述，使用上述相同兩個供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對八種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。偵測所有八種混合物及針對各混合物中之各細胞株組分之IFNγ反應(圖76B)。
如實例8及9中所述，藉由IFNγELISpot量測相較於可能CRC疫苗混合物誘導針對個別細胞株之IFNγ反應的能力，個別CRC疫苗組分細胞株誘導針對自身之IFNγ反應的能力。圖77中之資料證明混合物CRC-A、CRC-B、CRC-C、CRC-D、CRC-E、CRC-F、CRC-G及CRC-H(圖76C)在一些狀況下傾向於或為比個別組分細胞株顯著更佳之抗腫瘤免疫刺激劑，且表明藉由一次投與超過一種細胞株增加反應廣度。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對CRC抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如CEA，以及已知對CRC及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。如本文中所示，為進一步增強TAA陣列，HuTu80經編碼modPSMA之基因轉導，且HCT-116亦經修飾以表現modTBXT、modWT1及分別跨越KRAS突變G12D及G12V，產生KRAS之活化突變形式的28個胺基酸，如本文所述。KRAS突變在大約35%至45%之CRC患者中出現。KRAS G12V及G12D係CRC患者中多個KRAS突變中最頻繁出現的。
如下所述，PSMA在六種組分細胞株中之一種中以＞1.0 FPKM內源性表現。TBXT及WT1未在六種組分細胞株中之任一種中以＞1.0 FPKM內源性表現(圖78A)。六種組分細胞株中之任一種未內源性表現KRAS突變G12D及G12V。使用cBioPortal測定KRAS突變之內源性表現。細胞株資料集用HGNC基因符號(KRAS)來搜索且各細胞株在「突變」資料集內搜索。HCT-15及HCT-116內源性表現亦在CRC腫瘤中經常表現之KRAS G13D突變。
本發明疫苗中代表性TAA之mRNA表現在圖78A中示出。本發明疫苗高度表現所有鑑別之二十種通常靶向且可能臨床上相關之用於誘導GBM抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在CRC腫瘤中且一些亦可誘導針對CRC及其他實體腫瘤之免疫反應。利用如上所述的可利用之所有TAA之表現資料，在365個CRC患者樣品中測定二十種優先CRC TAA之RNA豐度，以確定CSC標記物表現患者樣品。100%樣品表現優先CRC TAA中之十四種，94.5%樣品表現15種TAA，65.8%樣品表現16種TAA，42.2%樣品表現17種TAA，25.8%樣品表現18種TAA，11.5%樣品表現19種TAA，且1.4%樣品表現20種TAA(圖78B)。365個CRC患者腫瘤樣品中之21.1%(n=77)表現KRAS G12D(n=40)或G12V(n=37)突變。365個CRC患者腫瘤樣品中之7.7%(n=28)表現由兩種組分細胞株內源性表現之KRAS G13D突變。因此，本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，其中該等細胞株之組合表現至少14種與意欲接受該組合物之CRC癌症個體之子集的癌症相關之TAA。
如本文所述，藉由流動式細胞測量術偵測HuTu80對經轉導之抗原modPSMA(SEQ ID NO: 37；SEQ ID NO: 38)的表現(圖79A)及HCT-116對modTBXT(SEQ ID NO: 49；SEQ ID NO: 50)(圖79B)及modWT1(SEQ ID NO: 49；SEQ ID NO: 50)的表現(圖79C)。如本文中之實例29中所述，藉由RT-PCR偵測編碼KRAS G12D(SEQ ID NO: 49；SEQ ID NO: 50)(圖89D)及G12V(SEQ ID NO: 49；SEQ ID NO: 50)(圖79D)之基因。將編碼modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V之基因次選殖至相同慢病毒轉移載體中，由弗林蛋白酶裂解位點SEQ ID: X)分隔開。本文描述針對經轉導之抗原的IFNγ產生。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表57中鑑別出之細胞株以包含本發明CRC疫苗。表 57.CRC 疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A HCT-15 大腸直腸腺癌
A HuTu-80 十二指腸腺癌
A LS411N 大腸直腸腺癌
B HCT-116 大腸直腸癌
B RKO 大腸直腸癌
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現之減少
HCT-15、HuTu-80、LS411N、HCT-116、RKO及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受多輪FACS細胞分選。如實例29中所述測定CD276之表現。表58中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用ZFN對CD276進行基因編輯引起超過99.6%之CD276陰性細胞。表 58.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
HCT-15 6,737 26 99.6
HuTu-80 10,389 0 100.0
LS411N 34,278 4 100.0
HCT-116 12,782 0 100.0
RKO 3,632 0 100.0
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
TGFβ1 、 TGFβ2 、 GM-CSF 及 IL-12 之細胞介素分泌分析 如實例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF及IL-12之細胞介素分泌分析。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及TGFβ2分泌含量且如實例29中所述測定所得含量。CRC疫苗-A中之所有親本細胞株分泌可量測含量之TGFβ1且HuTu80亦分泌可量測含量之TGFβ2。在CRC疫苗-B中之親本細胞株中，HCT-116及RKO分泌可量測含量之TGFβ1。實例5中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上所述測定所得含量。
如實例29中所述，CRC來源之五種組分細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌且增加膜結合之CD40L之表現。此等細胞用純系名稱DK2描述。隨後HuTu80經編碼TGFβ2 shRNA及GM-CSF(SEQ ID NO: 6)之慢病毒顆粒轉導(實例29)。此等細胞用純系名稱DK6描述。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌而不減少TGFβ1之分泌。此等細胞用純系名稱DK4描述。其餘細胞株用TGFβ1 shRNA及TGFβ2 shRNA雙重修飾。
表59展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。若僅在ELISA分析中16個複製操作中之1個中偵測到TGFβ1或TGFβ2分泌，則報導之值無平均值之標準誤差。基因修飾引起TGFβ1分泌減少至少49%。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少至少51%。表 59. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
HCT-15 A 野生型 369 ± 69 21
HCT-15 A DK2 189 ± 23 21 ± 5
HCT-15 A 減少百分比 49% NA
HuTu-80 A 野生型 2,529 ± 549 4,299 ± 821
HuTu-80 A DK6 327 ± 76 115 ± 42
HuTu-80 A 減少百分比 87% 97%
LS411N A 野生型 413 ± 125 * ≤ 9
LS411N A DK2 89 ± 5 78 ± 13
LS411N A 減少百分比 78% NA
HCT-116 B 野生型 2,400 ± 250 * ≤ 8
HCT-116 B DK2 990 ± 72 * ≤ 8
HCT-116 B 減少百分比 59% NA
RKO B 野生型 971 ± 120 * ≤ 6
RKO B DK2 206 ± 10 * ≤ 11
RKO B 減少百分比 79% NA
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 219 ± 33 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之CRC疫苗-A及CRC疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表60中示出。CRC疫苗-A之TGFβ1分泌減少82%，且TGFβ2減少95%皮克/劑量/24小時。CRC疫苗-B之TGFβ1分泌減少59%，且TGFβ2減少49%皮克/劑量/24小時。表 60.CRC 疫苗 -A 及 CRC 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 1,656 2,165
   DK2/DK6 303 107
   減少百分比 82% 95%
B 野生型 1,739 250
   DK2/DK4 708 129
減少百分比 59% 49%
GM-CSF 分泌
HuTu80細胞株經慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒含有TGFβ2 shRNA與在不同啟動子控制下表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)。HCT-15、LS411N、HCT-116及RKO細胞株經慢病毒顆粒轉導以僅表現GM-CSF(SEQ ID NO: 7)。如實例24中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表61中示出且在下文描述。
相較於未經修飾之親本細胞株，在所有經修飾之組分細胞株中GM-CSF之分泌增加至少9,182倍。在CRC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.002奈克/106 個細胞/24小時)，HCT-15之GM-CSF之分泌增加29,500倍，相較於親本細胞株(≤0.011奈克/106 個細胞/24小時)，HuTu80之GM-CSF之分泌增加9,182倍，且相較於親本細胞株(≤0.004奈克/106 個細胞/24小時)，LS411N之GM-CSF之分泌增加36,250倍。在CRC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.003奈克/106 個細胞/24小時)，HCT-116之GM-CSF之分泌增加114,000倍，相較於親本細胞株(≤0.003奈克/106 個細胞/24小時)，RKO之GM-CSF之分泌增加43,667倍，且相較於親本細胞株(≤0.004奈克/106 個細胞/24小時)，DMS 53之GM-CSF之分泌增加39,450倍。表 61. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
HCT-15 59 ± 9 30
HuTu80 101 ± 40 51
LS411N 145 ± 17 73
混合物A總計 305 154
HCT-116 342 ± 97 171
RKO 131 ± 13 66
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 631 316
基於5×105 各組分細胞株之劑量，CRC疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量154 ng。CRC疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量316 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時470 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L。實例29中描述偵測五種CRC細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述用於修飾DMS 53以表現CD40L之方法。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。圖80中所示及下文所述之結果證明在所有六種細胞CRC疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
圖80展示CRC疫苗組分細胞株對膜結合之CD40L的表現。在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少669倍。在CRC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，HCT-15對CD40L之表現增加669倍(669 MFI)，相較於親本細胞株(5 MFI)，HuTu80對CD40L之表現增加1,178倍(5,890 MFI)，且相較於親本細胞株(0 MFI)，LS411N對CD40L之表現增加4,703倍(4,703)。在CRC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，HCT-116對CD40L之表現增加21,549倍，相較於親本細胞株(0 MFI)，RKO對CD40L之表現增加7,107倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表52中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少10,200倍。在CRC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，HCT-15之IL-12之分泌增加27,000倍，相較於親本細胞株(≤0.005奈克/106 個細胞/24小時)，HuTu80之IL-12之分泌增加10,200倍，且相較於親本細胞株(≤0.002奈克/106 個細胞/24小時)，LS411N之IL-12之分泌增加13,000倍。在CRC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，HCT-116對IL-12之表現增加186,000倍，且相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，RKO對IL-12之表現增加43,000倍。DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 52. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
HCT-15 27 ± 3 14
HuTu80 51 ±14 26
LS411N 26 ± 6 13
混合物A總計 104 52
HCT-116 186 ± 16 93
RKO 43 ± 8 22
DMS 53 NA NA
混合物B總計 229 115
基於5×105 各組分細胞株之劑量，CRC疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量52 ng。CRC疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量115 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時167 ng。HuTu80 細胞株穩定表現 modPSMA
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對CRC抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的HuTu80細胞株亦經表現modPSMA抗原之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵modPSMA之表現。將經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2之分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12(抗原未經修飾)之細胞株及經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2之分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L、IL-12及modPSMA之細胞株在細胞內用0.06微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PSMA抗體(AbCam ab268061，純系FOLH1/3734)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(Biolegend #405322)染色。自PSMA染色之細胞之MFI減去同型對照染色之PSMA未修飾及PSMA修飾之細胞的MFI。MFI相對於100,000個事件正規化。抗原表現增加倍數計算為：(減去背景之經修飾之MFI/減去背景之親本MFI)。經修飾之細胞株(756,908 MFI)中modPSMA之表現比PSMA未修飾之細胞株(82,993 MFI)增加9.1倍(圖79A)。HCT-116 細胞株穩定表現 modTBXT 、 modWT1 、 KRAS G12D 及 KRAS G12V
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ1分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的HCT-116細胞株亦經表現modTBXT、modWT1、KRAS G12V及KRAS G12D抗原之慢病毒顆粒轉導。抗原未修飾之親本及抗原修飾之細胞在細胞內染色以如下偵測各抗原之表現。為偵測modTBXT，首先將細胞用兔IgG1抗TBXT抗體(Abcam ab209665，純系EPR18113)(0.06微克/檢驗)染色，接著用AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(Biolegend #406414)(0.125微克/檢驗)染色。為偵測modWT1，首先將細胞用兔IgG1抗WT1抗體(AbCam ab89901，純系CAN-R9)(0.06微克/檢驗)染色，接著用AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(Biolegend #406414)(0.125微克/檢驗)染色。自針對TBXT或WT1染色之細胞之MFI減去同型對照染色細胞之MFI。MFI相對於100,000個事件正規化。抗原表現增加倍數計算為：(減去背景之經修飾之MFI/減去背景之親本MFI)。經修飾之細胞株(356,691 MFI)中modTBXT之表現比未經修飾之細胞株(0 MFI)增加356,691倍(圖79B)。自TBXT染色之未經修飾之HCT-116細胞株的MFI減去同型對照之MFI得到負值。使用1 MFI計算經修飾之細胞株中TBXT表現之增加倍數。經修飾之細胞株(362,698 MFI)對modWT1之表現比未經修飾之細胞株(5,235 MFI)增加69.3倍(圖79C)。
如實例29及本文中所述，使用RT-PCR測定HCT-116對KRAS G12D及KRAS G12V之表現。對於KRAS G12D，正向引子經設計以在轉殖基因中之2786-2807鹼基對(bp)位置(GAAGCCCTTCAGCTGTAGATGG(SEQ ID NO:124))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之2966-2984 bp位置(CTGAATTGTCAGGGCGCTC(SEQ ID NO:125))處退火且得到199 bp產物。對於KRAS G12V，正向引子經設計以在轉殖基因中之2861-2882 bp位置(CATGCACCAGAGGAACATGACC(SEQ ID NO:126))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之3071-3094 bp位置(GAGTTGGATGGTCAGGGCAGAT(SEQ ID NO:127))處退火且得到238 bp產物。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子。分別在199 bp及238 bp預期尺寸下偵測到KRAS G12D及KRAS G12V之基因產物(圖79D)。相對於親本對照，KRAS G12D mRNA增加3,127倍且KRAS G12V mRNA增加4,095倍(圖79E)。CRC- 疫苗 A 中對 PSMA 之免疫反應
如實例29中所述，在四個HLA不同之供體(n=4/供體)(表63供體1、3、5及6)中評估在CRC-疫苗A之情況下對PSMA之IFNγ反應，且如下所述，藉由ELISpot測定IFNγ反應。PSMA肽，跨越天然抗原序列之重疊9個胺基酸的15聚體，係購自Thermo Scientific Custom Peptide Service。相較於親本未經修飾之CRC疫苗-A(350 ± 260 SFU)，在經修飾之CRC疫苗-A(1,832 ± 627 SFU)下PSMA特異性IFNγ反應增加(n=4)(圖79F)。CRC- 疫苗 B 中對 TBXT 、 WT1 及 KRAS 突變之免疫反應
如實例29中所述，在四個HLA不同之供體(n=4/供體)(表63供體1、3、5及6)中評估在CRC-疫苗B之情況下對TBXT、WT1、KRAS G12D及KRAS G12V抗原之IFNγ反應。肽的來源如下：TBXT(JPT，PM-BRAC)、WT1(JPT，PM-WT1)、KRAS G12D及KRAS G12V，重疊9個胺基酸之15聚體，係購自Thermo Scientific Custom Peptide Service。相較於未經修飾之CRC疫苗-B(154 ± 111 SFU)，在經修飾之CRC疫苗-B(511 ± 203 SFU)下對TBXT之IFNγ反應增加(n=4)(圖79G)。相較於未經修飾之CRC疫苗-B(208 ± 208 SFU)，在經修飾之CRC疫苗-B(1,278 ± 303 SFU)下WT1特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.027，史都登氏T檢驗)(圖79H)。相較於未經修飾之CRC疫苗-B(153 ± 153 SFU)，在經修飾之CRC疫苗-B(1,716 ± 420 SFU)下KRAS G12D特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.013，史都登氏T檢驗)(圖79I)。相較於未經修飾之CRC疫苗-B(254 ± 525 SFU)，在經修飾之CRC疫苗-B(2,047 ± 420 SFU)下KRAS G12V特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.018，史都登氏T檢驗)(圖79J)。表 63. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *02:01*03:01 *08:01 *51:01 *07:01 *14:02
2 *30:02 *30:04 *15:10 *58:02 *03:04 *06:02
3 *01:01 *30:01 *08:01 *13:02 *06:02 *07:01
4 *03:01 *25:01 *17:02 *18:01 *07:02 *12:03
5 *02:05 *29:02 *15:01 *44:03 *03:04 *16:01
6 *02:01*03:01 *18:01 *31:08 *07:01 *12:03
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
如實例29中所述，使用來自六個HLA不同之健康供體之PBMC量測個別組分細胞株及兩種CRC疫苗混合物誘導針對相關CRC抗原之IFNγ產生的能力(表63)。PSMA、WT1、TBXT、KRAS G12D及KRAS G12V之肽來源如上所述。其餘抗原之肽來源如下：存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、PRAME(Miltenyi Biotech，130-097-286)、STEAP(PM-STEAP1)、TERT(JPT，PM-TERT)MUC1(JPT，PM-MUC1)及CEACAM(CEA)(JPT，PM-CEA)。接著在IFNγ ELISpot分析中分析細胞之IFNγ分泌。
圖81證明，相較於未經修飾之親本對照(6,470 ± 3,361SFU)，在六個HLA不同之供體中CRC疫苗能夠誘導顯著更穩固之抗原特異性IFNγ反應(30,480 ± 9,980 SFU)(p=0.009，曼-惠特尼U檢驗)(n=8)(圖81A)。CRC疫苗-A及CRC疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，抗原特異性反應顯著更大。體而言，相較於未經修飾之對照(3,665 ± 1,849 SFU)，CRC疫苗-A引發12,080 ± 3,569 SFU(p=0.041，曼-惠特尼U檢驗)(圖81B)。對於CRC疫苗-A，一個供體對五種抗原作出反應，一個供體對九種抗原作出反應，兩個供體對十種抗原作出反應，且兩個供體對十一種抗原作出反應。相較於親本對照(2,805 ± 1,549 SFU)，CRC疫苗-B(n=11種抗原)引發15,417 ± 4,127 SFU(p=0.004，曼-惠特尼U檢驗)(圖81C)。對於CRC疫苗-B(n=11種抗原)，一個供體對九種抗原作出反應，兩個供體對十種抗原作出反應，且三個供體對十一種抗原作出反應。在六個供體中之兩個中CRC疫苗(疫苗-A及疫苗-B)誘導針對十種抗原之IFNγ產生且在六個供體中之四個中誘導針對所有十一種抗原之IFNγ產生(圖82)(表64)。因此，本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株(例如單位劑量之六種細胞株)，其中該單位劑量能夠引發超過未經修飾之組合物4.7倍的特異性針對至少十種在CRC患者腫瘤中表現之TAA的免疫反應。CRC疫苗A使針對至少五種TAA之IFNγ反應增加4.1倍且CRC疫苗-B使針對至少九種TAA之IFNγ反應增加5.5倍。
相較於由個別經修飾之CRC細胞株組分誘導的反應，由CRC疫苗-A及CRC疫苗-B誘導之針對TAA之IFNγ反應更穩固。具體而言，CRC疫苗-A相關之針對十一種所分析抗原之反應(18,910 ± 8,852 SFU)超過由經修飾之HCT-15(11,255 ± 6,354 SFU)、HuTu80(7,332 ± 2,814 SFU)及LS411N(8,277 ± 3,187 SFU)誘導之反應。類似地，CRC疫苗-B相關之針對十一種所分析抗原之反應(17,635 ± 6,056 SFU)超過由經修飾之HCT-116(11,984 ± 5,085 SFU)及RKO(10,740 ± 5,216 SFU)(圖83)誘導之反應。表 64.I 由未經修飾及經修飾之 CRC 疫苗誘導的針對 TAA 之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
CRC 疫苗 -A CRC 疫苗 -B CRC 疫苗 CRC 疫苗 -A CRC 疫苗 -B CRC 疫苗
1 6,101 ± 2,763 2,659 ± 1,128 8,760 ± 3,640 3,969 ± 2,029 11,498 ± 3,813 15,466 ± 5,590
2 3,694 ± 1,363 3,699 ± 1,868 7,394 ± 3,217 5,465 ± 2,522 8,543 ± 4,763 14,008 ± 7,258
3 11,488 ± 1,912 9,910 ± 3,165 21,398 ± 4,907 43,448 ± 7,892 35,693 ± 4,638 79,140 ± 11,908
4 100 ± 50 388 ± 130 488 ± 84 9,276 ± 3,150 13,419 ± 5,196 22,694 ± 7,650
5 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 12,666 ± 5,766 10,052 ± 6,559 22,718 ± 11,181
6 608 ± 334 173 ± 103 781 ± 436 15,557 ± 3,291 13,296 ± 2,843 28,853 ± 5,346
基於本揭示案及本文提供之資料，表65中示出用於大腸直腸癌之包含來源於ATCC之六種癌細胞株(HCT-15(ATCC，CCL-225)、HuTu80(ATCC，HTB-40)、LS411N(ATCC，CRL-2159)、HCT-116(ATCC，CCL-247)、RKO(ATCC，CRL-2577)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種大腸直腸細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53，ATCC CRL-2062)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 65. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A HCT-15 X ND X X X X ND
A HuTu80 X X X X X X X
A LS411N X ND X X X X ND
B HCT-116 X ND X X X X X
B RKO X ND X X X X ND
B DMS 53* ND X X X X ND ND
   ND = 未進行。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除CD276之基因。藉由慢病毒載體轉導來添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(HuTu80)、modTBXT(HCT-116)、modWT1(HCT-116)、KRAS G12D(HCT-116)及KRAS G12V(HCT-116)之基因。
本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以減少至少兩種免疫抑制因子之表現及表現至少兩種免疫刺激因子。一種組合物CRC疫苗-A經修飾以增加一種TAA，modPSMA之表現，且第二組合物CRC疫苗-B經修飾以表現四種TAA，modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V。單位劑量之六種癌細胞株表現CRC患者腫瘤中之至少十五種TAA且誘導超過未經修飾之組合物組分4.7倍之IFNγ反應。實例 31 ：前列腺癌 (PCa) 疫苗之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種PCa相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物PCa疫苗-A由亦經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2之細胞株PC3、細胞株NEC8及細胞株NTERA-2cl-D1構成。第二混合物PCa疫苗-B由亦經修飾以表現modPSMA之細胞株DU145、細胞株LNCaP及細胞株DMS 53構成。六種組分細胞株總體而言表現至少二十二種可提供抗PCa腫瘤反應之抗原。PCa 疫苗組分之鑑別
初始細胞株選擇標準鑑別出十六種疫苗組分細胞株，用於可能包括在PCa疫苗中。應用其他選擇標準以將十四種候選細胞株縮小至六種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性PCa相關抗原之表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、細胞株來源於原發性腫瘤還是轉移部位及組織學亞型。
藉由來源於廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)及歐洲分子生物學實驗室-歐洲生物資訊學研究所(EMBL-EBI)之關於NCCIT、NEC8及NTERA-2cl-D1之RNA表現資料確定候選組分細胞株對TAA之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA下載mRNA表現。若RNA-seq值超過一(CCLE，FPKM)或零(EMBL-EBI，TPM)，則細胞株對TAA之表現視為陽性。基於上述選擇標準，鑑別出十四種PCa疫苗候選組分中之六種，用於進一步評估：PC3、DU145、LNCaP、NCCIT、NEC8及NTERA-2cl-D1。六種候選組分細胞株表現十二至十九種TAA(圖84)。如本文所述，CSC樣細胞株DMS 53作為6種細胞株之一包括且表現十六種PCa TAA。
如實例9中所述，針對四個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估未經修飾之PCa個別組分細胞株候選物之免疫原性。供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*02:01 B*35:01及A*31:01 B*35:03；供體2，A*02:02 B*15:03及A*30:02 B*57:03；供體3，A*02:01 B*40:01及A*30:01 B*57:01；供體4，A*24:02 B*18:01及A*02:01 B*15:07。PC3(3,409 ± 672 SFU)及DU145(1,497 ± 231 SFU)比LNCaP(428 ± 204 SFU)、NCCIT(25 ± 11 SFU)、NEC8(80 ± 47 SFU)及NTERA-2cl-D1(188 ± 93 SFU)免疫原性大(圖86A)。NCCIT的免疫原性較差，因此無法進一步分析。如在本文中進一步描述，選擇PC3及DU145分別包括在疫苗混合物A及疫苗混合物B中。
在三種組分細胞株之兩種不同組合中評估五種所選PCa細胞株及CSC細胞株DMS 53之免疫原性(圖86C)。如實例8中所述，在五個HLA不同之健康供體中(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對兩種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*02:01 B*08:01及A*03:01 B*51:01；供體2，A*30:02 B*18:01及A*30:04 B*58:02；供體3，A*02:01 B*18:01及A*25:01 B*27:05；供體4，A*03:01 B*07:02及A*25:01 B*18:01；供體5，A*02:01 B*07:02及A*33:01 B*14:02。偵測混合物及各混合物中針對各細胞株組分之IFNγ反應。(圖86B)。
如實例8及9中所述，亦藉由IFNγ ELISpot量測相較於可能PCa疫苗混合物誘導針對個別細胞株之IFNγ反應的能力，個別PCa疫苗組分細胞株誘導針對自身之IFNγ反應的能力。相較於單獨細胞株之反應(283 ± 101 SFU)，對PCa-A中NEC8細胞株之IFNγ反應(1,963 ± 863 SFU)顯著增加(曼-惠特尼U檢驗，p=0.032)。類似地，相較於單獨細胞株之反應(283 ± 101 SFU)，對PCa-A中NTERA-2cl-D1細胞株之IFNγ反應(630 ± 280 SFU)顯著增加(曼-惠特尼U檢驗，p=0.032)。相較於單獨細胞株之反應(139 ± 111 SFU)，對PCa-B中LNCaP細胞株之IFNγ反應(624 ± 254 SFU)顯著增加(曼-惠特尼U檢驗，p=0.032)。圖86D中之資料證明混合物PCa-A及PCa-B在一些狀況下傾向於或為比個別組分細胞株顯著更佳之抗腫瘤免疫刺激劑，且表明藉由投與具有不同HLA超型之多種細胞株增加反應之廣度及量值。具體而言，PCa-A細胞株為以下HLA超型：PC3、A01 A24及B07；NTERA-2cl-D1、A01、B08及B44。NEC8之HLA類型不可用。PCa-B細胞株為以下HLA超型：DU145、A03、B44及B58；LNCaP、A01、A02 B08、B44；DMS 53、A03、B08及B07。以上資料證明，構成混合物之細胞株之HLA錯配可提高對個別細胞株組分之免疫反應。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對PCa抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如PSA或PAP，以及已知對PCa及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。如本文所示，為進一步增強TAA陣列，DU145經編碼modPSMA之基因轉導且PC3經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2。PSMA在六種組分細胞株中之三種中以＞1.0 FPKM或＞0 TPM內源性表現。TBXT及MAGEC2在六種組分細胞株中之兩種中以＞1.0 FPKM或＞0 TPM內源性表現(圖84)。
如實例29中及本文中所述，藉由流動式細胞測量術或RT-PCR偵測PC3對經轉導之抗原modTBXT(圖87A)及modMAGEC2(圖87B)之表現(SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO: 46)及DU145對modPSMA之表現(SEQ ID NO: 37；SEQ ID NO: 38)(圖87C)。編碼modTBXT及modMAGEC2之基因在相同慢病毒轉移載體中編碼，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
本發明疫苗中二十二種代表性TAA之mRNA表現在圖84中示出。NCCIT為圖84中唯一不包括在本發明疫苗中之細胞株。本發明疫苗高度表現所有鑑別之二十二種通常靶向且可能臨床上相關之用於誘導PCa抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在PCa腫瘤中且一些亦可誘導針對PCa及其他實體腫瘤之免疫反應。利用如實例29中所述的可利用之所有TAA之表現資料，在460個PCa患者樣品中測定二十二種優先PCa TAA之RNA豐度(圖85A)。100%樣品表現十八種優先PCa TAA，99.3%樣品表現19種TAA，75.4%樣品表現20種TAA，21.1%樣品表現21種TAA，1.5%樣品表現22種TAA(圖85B)。本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，其中該等細胞株之組合表現至少18種與意欲接受該組合物之PCa癌症個體之子集的癌症相關之TAA。基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表66中鑑別出之細胞株以包含本發明PCa疫苗。表 66.PCa 疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A PC3 來源於轉移部位(骨骼)之前列腺癌
A NEC8 睾丸生殖細胞腫瘤
A NTERA-2cl-D1 來源於轉移部位(肺)之睾丸胚胎癌
B DU145 來源於轉移部位(骨骼)之前列腺癌
B LNCaP 來源於轉移部位(淋巴結)之前列腺癌
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現之減少
PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU145、LNCaP及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受藉由FACS之多輪細胞分選。如實例29中所述測定CD276之表現。表67中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用ZFN對CD276進行基因編輯引起超過98.7%之CD276陰性細胞。表 67.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
PC3 6,645 0 100.0
NEC8 6,317 33 99.5
NTERA-2cl-D1 7,240 95 98.7
DU145 8,461 8 99.9
LNCaP 41,563 3 99.9
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
TGFβ1 、 TGFβ2 、 GM-CSF 及 IL-12 之細胞介素分泌分析 如實例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF及IL-12之細胞介素分泌分析。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及TGFβ2分泌含量且如實例29中所述測定所得含量。PCa疫苗-A中之PC3及NEC8親本細胞株分泌可量測含量之TGFβ1。PC3亦分泌可量測含量之TGFβ2。NEC8分泌相對低含量之TGFβ1且不分泌可量測含量之TGFβ2。NTERA-2cl-D1不分泌可量測含量之TGFβ1或TGFβ2。在PCa疫苗-B中之親本細胞株中，DU145分泌可量測但相對低含量之TGFβ1及TGFβ2，且LNCaP不分泌可量測含量之TGFβ1或TGFβ2。實例26中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上所述測定所得含量。
如實例29中所述，PC3組分細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌且增加膜結合之CD40L之表現，且隨後經編碼TGFβ2 shRNA及GM-CSF之慢病毒顆粒(SEQ ID NO: 6)轉導實例29。此等細胞用純系名稱DK6描述。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌而不減少TGFβ1之分泌。此等細胞用純系名稱DK4描述。其餘細胞株用TGFβ1 shRNA或TGFβ2 shRNA修飾。
表68展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。若僅在ELISA分析中16個複製操作中之1個中偵測到TGFβ1或TGFβ2分泌，則報導之值無平均值之標準誤差。基因修飾引起TGFβ1分泌減少82%。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少至少51%。表 68. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
PC3 A 野生型 686 ± 93 3,878 ± 556
PC3 A DK6 122 ± 119 382 ± 89
PC3 A 減少百分比 82% 90%
NEC8 A 野生型 97 ± 26 * ≤ 4
NEC8 A NA NA NA
NEC8 A 減少百分比 NA NA
NTERA-2cl-D1 A 野生型 * ≤ 304 * ≤ 138
NTERA-2cl-D1 A NA NA NA
NTERA-2cl-D1 A 減少百分比 NA NA
DU145 B 野生型 161 ± 28 435 ± 64
DU145 B NA NA NA
DU145 B 減少百分比 NA NA
LNCaP B 野生型 * ≤ 63 * ≤ 28
LNCaP B NA NA NA
LNCaP B 減少百分比 NA NA
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 NA 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之PCa疫苗-A及PCa疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表69中示出。PCa疫苗-A之TGFβ1分泌減少52%皮克/劑量/24小時，且TGFβ2減少87%皮克/劑量/24小時。PCa疫苗-B之TGFβ2分泌減少26%皮克/劑量/24小時。表 69.PCa 疫苗 -A 及 PCa 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 544 2,010
   DK6 262 262
   減少百分比 52% 87%
B 野生型 166 475
   DK4 NA 351
減少百分比 NA 26%
GM-CSF 分泌
PC3細胞株經慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒含有TGFβ2 shRNA與在不同啟動子控制下表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)。NEC8、NTERA-2cl-D1、DU145及LNCaP細胞株經慢病毒顆粒轉導以僅表現GM-CSF(SEQ ID NO: 7)。如實例24中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表70中示出且在下文描述。
相較於未經修飾之親本細胞株，在所有經修飾之組分細胞株中GM-CSF之分泌增加至少68倍。在PCa疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.003奈克/106 個細胞/24小時)，PC3之GM-CSF之分泌增加67,987倍，相較於親本細胞株(≤0.002奈克/106 個細胞/24小時)，NEC-8之GM-CSF之分泌增加128,543倍，且相較於親本細胞株(≤0.059奈克/106 個細胞/24小時)，NTERA-2cl-D1之GM-CSF之分泌增加68倍。在PCa疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.003奈克/106 個細胞/24小時)，DU145之GM-CSF之分泌增加119,645倍，相較於親本細胞株(≤0.012奈克/106 個細胞/24小時)，LNCaP之GM-CSF之分泌增加10,151倍，且相較於親本細胞株(≤ 004奈克/106 個細胞/24小時)，DMS 53之GM-CSF之分泌增加39,450倍。表 70. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
PC3 187 ± 16 94
NEC-8 208 ± 9 104
NTERA-2cl-D1 4 ± 0.2 2
混合物A總計 399 200
DU145 386 ± 71 193
LNCaP 124 ± 11 62
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 668 334
基於5×105 各組分細胞株之劑量，PCa疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量200 ng。PCa疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量334 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時534 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L之載體。實例29中描述偵測五種PCa細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述用於修飾DMS 53以表現CD40L之方法。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。圖88中所示及下文所述之結果證明在所有六種細胞PCa疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
圖88中示出PCa疫苗細胞株對膜結合之CD40L的表現。在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少9,019倍。在PCa疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，PC3對CD40L之表現增加9,019倍(9,019 MFI)，相較於親本細胞株(0 MFI)，NEC8對CD40L之表現增加11,571倍(11,571 MFI)，且相較於親本細胞株(0 MFI)，NTERA-2cl-D1對CD40L之表現增加15,609倍(15,609 MFI)。在PCa疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，DU145對CD40L之表現增加18,699倍，相較於親本細胞株(0 MFI)，LNCaP對CD40L之表現增加30,243倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表71中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少507倍。在PCa疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，PC3之IL-12之分泌增加42,727倍，相較於親本細胞株(≤0.001奈克/106 個細胞/24小時)，NEC8之IL-12之分泌增加30,769倍，且相較於親本細胞株(≤0.024奈克/106 個細胞/24小時)，NTERA-2cl-D1之IL-12之分泌增加507倍。在PCa疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，DU145對IL-12之表現增加13,178倍，且相較於親本細胞株(≤ 0.005奈克/106 個細胞/24小時)，LNCaP對IL-12之表現增加3,901倍。DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 71. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
PC3 47 ± 24 24
NEC-8 20 ± 3 10
NTERA-2cl-D1 12 6
混合物A總計 79 40
DU145 17 ± 4 9
LNCaP 19 ± 6 10
DMS 53 NA NA
混合物B總計 36 19
基於5×105 各組分細胞株之劑量，PCa疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量40 ng。PCa疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量19 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時59 ng。PC3 細胞株穩定表現 modTBXT 及 modMAGEC2
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的PC3細胞株亦經表現modTBXT及modMAGEC2抗原之慢病毒顆粒轉導。編碼modTBXT及modMAGEC2抗原之基因由弗林蛋白酶裂解位點連接(SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46)。
藉由流動式細胞測量術表徵PC3對modTBXT之表現。為偵測modTBXT，首先將細胞在細胞內用兔IgG1抗TBXT抗體(Abcam ab209665，純系EPR18113)(0.06微克/檢驗)染色，接著用AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(Biolegend #4406414)(0.125微克/檢驗)染色。經修飾之細胞株(1,209,613 MFI)中modTBXT之表現比未經修飾之細胞株(0 MFI)增加1,209,613倍(圖87A)。如實例29及本文中所述，使用RT-PCR測定PC3對modMAGEC2之表現。正向引子經設計以在轉殖基因中之604-631鹼基對(bp)位置(GATCACTTCTGCGTGTTCGCTAACACAG(SEQ ID NO: 128))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之1072-1094 bp位置(CTCATCACGCTCAGGCTCTCGCT(SEQ ID NO: 129))處退火且得到491 bp產物。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子及所得產物。在預期尺寸下偵測到MAGEC2之基因產物(圖97B)。相對於親本對照，modMAGEC2 mRNA增加3,914倍(圖87B)。DU145 細胞株穩定表現 modPSMA
經修飾以減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12之DU145細胞株亦經表現modPSMA抗原之慢病毒顆粒(SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38)轉導。藉由流動式細胞測量術表徵modPSMA之表現。抗原未修飾之親本及抗原修飾之細胞在細胞內用0.06微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PSMA抗體(AbCam ab268061，純系FOLH1/3734)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(Biolegend #405322)染色。經修飾之細胞株(249,632 MFI)中modPSMA之表現比親本細胞株(42,196 MFI)增加6倍(圖87C)。PCa 疫苗 -A 中對 TBXT 及 MAGEC2 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體中，在經修飾之PCa疫苗-A之情況下，評估對TBXT及MAGEC2抗原之IFNγ反應。七個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表72中示出。藉由ELISpot，使用跨越天然TBXT抗原全長重疊11個胺基酸之15聚體肽(JPT，PM-BRAC)，測定對TBXT之IFNγ反應。相較於未經修飾之PCa疫苗-A(73±70 SFU)，在經修飾之PCa疫苗-B(605±615 SFU)下對TBXT之IFNγ反應顯著增加(p=0.033，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖87D)。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對MAGEC2之IFNγ反應。相較於未經修飾之PCa疫苗-B(SFU)，在經修飾之PCa疫苗-B(697±536 SFU)下對MAGEC2之IFNγ反應顯著增加(p=0.018，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖87E)。PCa- 疫苗 B 中對 PSMA 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體中，在PCa-疫苗B之情況下，評估對PSMA抗原之IFNγ反應(表72)。如實例29中所述藉由ELISpot測定IFNγ反應。PSMA肽，跨越天然抗原序列之重疊9個胺基酸的15聚體，係購自Thermo Scientific Custom Peptide Service。相較於親本未經修飾之PCa疫苗-A(327 ± 33 SFU)，在經修飾之PCa疫苗-B(1,580 ± 847 SFU)下PSMA特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.011，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖87F)。表 72. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *02:01 *03:01 *08:01 *51:01 *07:01 *14:02
2 *30:02 *30:01 *15:10 *58:02 *03:04 *06:02
3 *03:01 *32:01 *07:02 *15:17 *07:01 *07:02
4 *03:01 *25:01 *07:02 *18:01 *07:02 *12:03
5 *02:01 *33:01 *07:02 *14:02 *07:02 *08:02
6 *01:01 *30:01 *08:01 *13:02 *06:02 *07:01
7 *26:01 *68:02 *08:01 *15:03 *03:04 *12:03
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
藉由ELISpot量測兩種PCa疫苗混合物誘導針對相關PCa抗原之IFNγ產生的能力。將來自七個HLA不同之健康供體(表72)的PBMC與PCA疫苗-A或PCa疫苗-B混合物共培養6天，接著用負載有含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池的自身DC刺激。在上文描述刺激CD14- PBMC以偵測對TBXT、MAGEC2及PSMA之IFNγ反應的肽。額外的重疊11個胺基酸之15聚體肽池來源如下：TERT(JPT，PM-TERT)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、HER2(JPT，PM-ERB_ECD)、STEAP(PM-STEAP1)、MUC1(JPT，PM-MUC1)、PAP(JPT，PM-PAP)及PSA(JPT，PM-PSA)。接著在IFNγ ELISpot分析中分析細胞之IFNγ分泌。
圖89證明，相較於未經修飾之親本對照(3,259 ± 1,046 SFU)，在七個HLA不同之供體中PCa疫苗能夠誘導顯著更穩固之針對十種PCa之抗原特異性IFNγ反應(19,982 ± 5,480 SFU)(p=0.011，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖89A)。在七個供體中之一個中，單位劑量之PCa疫苗-A及PCa疫苗-B引發針對八種抗原之IFNγ反應，且在七個供體中之六個中，引發對十種抗原之IFNγ反應。PCa疫苗-A及PCa疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，抗原特異性反應顯著更大。對於PCa疫苗-A，一個供體對三種抗原作出反應，一個供體對八種抗原作出反應，一個供體對九種抗原作出反應，且四個供體對十種抗原作出反應。具體而言，相較於未經修飾之對照(1,430 ± 911 SFU)，PCa疫苗-A引發9,412 ± 6,170 SFU(p=0.026，曼-惠特尼U檢驗)(圖89B)。對於PCa疫苗-B，一個供體對六種抗原作出反應，三個供體對九種抗原作出反應，且三個供體對十種抗原作出反應。相較於親本對照(1,830 ± 371 SFU)，PCa疫苗-B引發10,570 ± 2,913 SFU(p=0.004，曼-惠特尼U檢驗)(圖89C)。在七個供體中之一個中PCA疫苗(疫苗-A及疫苗-B)誘導針對九種抗原之IFNγ產生且在七個供體中之六個中誘導針對所有十種抗原之IFNγ產生(圖90)(表73)。以上描述兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，單位劑量之六種細胞株，其中該單位劑量能夠引發超過未經修飾之組合物6.1倍的特異性針對至少八種在PCA患者腫瘤中表現之TAA的免疫反應。PCA疫苗-A使對至少三種TAA之IFNγ反應增加6.6倍且PCA疫苗-B使對至少六種TAA之IFNγ反應增加5.8倍。
如實例8及9中所述，對於四個HLA不同之供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot量測個別經修飾之PCa疫苗組分細胞株誘導針對匹配之未經修飾之細胞株組分之IFNγ反應的能力(表73供體1、2、4及5)。偵測混合物及各混合物中之各經修飾之細胞株組分的針對親本未經修飾之細胞株的IFNγ反應。相較於個別經修飾之細胞株，PCa疫苗-A及PCa疫苗-B傾向於使IFNγ產生增加，但此傾向並未達到統計顯著性，可能因為用於進行所有比較之曼惠特尼U檢驗的供體數目低(n=4)(圖91A)。
在PCa疫苗-A與個別經修飾之細胞株組分之間，IFNγ產生存在顯著差異(p=0.036，克魯斯卡爾沃利斯檢驗(Kruskal Wallis test))。具體而言，PCa疫苗-A誘導之IFNγ產生(5,685 ± 2,060 SFU)比經修飾之NTERA-2cl-D1(253 ± 136)(p=0.019)組分細胞株顯著更大，但NEC8(1,151 ± 735 SFU)(p=0.307)及PC3組分細胞株(1,898 ± 947 SFU)(p=0.621)未如此(事後鄧恩檢驗(post-hoc Dunn's test)用於多重比較)(圖91B)。在PCa疫苗-B與個別經修飾之細胞株組分之間，IFNγ產生亦存在顯著差異(p=0.006，克魯斯卡爾沃利斯檢驗)。具體而言，PCa疫苗-B誘導之IFNγ產生(5,686 ± 1,866 SFU)比經修飾之LNCaP(240 ± 122 SFU)(p=0.043)及DMS 53(222±113)(p=0.028)組分細胞株顯著更大，但DU145組分細胞株(1,943 ± 1,291 SFU)(p=0.704)未如此(事後鄧恩檢驗用於多重比較)。(圖91C)。
對於構成PCa疫苗-A及PCa疫苗-B之個別經修飾之細胞株，測定上文所描述之相同四個供體針對十種PCa抗原之抗原特異性反應(表73供體1、2、4及5)。相較於由個別經修飾之PCa細胞株組分誘導的反應，由PCa疫苗-A及PCa疫苗-B誘導之針對TAA之IFNγ反應更穩固。具體而言，針對十種所分析抗原之PCa疫苗-A相關反應(9,412 ± 6,170 SFU)超過由經修飾之PC3(2,357 ± 1,076 SFU)、NEC8(3,491 ± 1,196 SFU)及NTERA-2cl-D1(1,381 ± 429 SFU SFU)誘導的反應。相較於個別經修飾之細胞株，PCa疫苗-A傾向於增加IFNγ產生，但此傾向於並未達到統計顯著性，可能因為供體數目低(n=4)(圖100D)。PCa疫苗-B誘導之針對十種所分析抗原之反應(12,067 ± 6,694 SFU)顯著不同於個別組分細胞株(p=0.047，克魯斯卡爾沃利斯檢驗)。具體而言，PCa疫苗-B抗原特異性反應比經修飾之DU145(2,064 ± 1,604 SFU)誘導之反應顯著更大(p=0.0345)，但LNCaP(1,419 ± 189 SFU)(p=0.113)或DMS 53(2,615 ± 1,044 SFU)(p=0.544)未如此(事後鄧恩檢驗用於多重比較)(圖91E)。總體而言，上述資料證明包含治療有效量之三種癌細胞株之組合物誘導的針對未經修飾之親本細胞株及PCa抗原之IFNγ反應比單個細胞株組合物更穩固。表 73. 對未經修飾及經修飾之 PCa 疫苗組分之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
PCa 疫苗 -A PCa 疫苗 -B PCa 疫苗 PCa 疫苗 -A PCa 疫苗 -B PCa 疫苗
1 729 ± 243 7,608 ± 2,463 8,337 ± 2,584 251 ± 251 1,652 ± 882 3,588 ± 1,844
2 320 ± 241 1,545 ± 663 2,430 ± 841 10,603 ± 6,129 12,750 ± 8,596 30,478 ± 18,894
3 1,608 ± 360 461 ± 272 4,519 ± 1,314 8,400 ± 2,027 13,863 ± 3,296 46,955 ± 10,118
4 3,781 ± 2,630 3 ± 3 3,784 ± 2,630 2,753 ± 630 2,749 ± 1,141 7,471 ± 2,329
5 25 ± 25 505 ± 221 530 ± 243 26,323 ± 12,033 10,649 ± 6,413 42,613 ± 19,867
6 56 ± 45 214 ± 93 270 ± 124 3,621 ± 1,500 16,753 ± 1,766 20,961 ± 3,534
7 3,028 ± 1,007 1,789 ± 561 4,824 ± 1,363 2,395 ± 1,031 4,135 ± 1,811 7,399 ± 2,637
基於本揭示案及本文提供之資料，表74中示出用於前列腺癌之包含來源於ATCC或JCRB之六種癌細胞株(PC-3(ATCC，CRL-1435)、NEC-8(JCRB，JCRB0250)、NTERA-2cl-D1(ATCC，CRL-1973)、DU145(ATCC，HTB-81)、LNCaP(ATCC，CRL-2023)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種前列腺癌及睾丸癌細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53，ATCC CRL-2062)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 74. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A PC3 X X X X X X X
A NEC8 ND ND X X X X ND
A NTERA-2cl-D1 ND ND X X X X ND
B DU-145 ND ND X X X X X
B LNCaP ND ND X X X X ND
B DMS 53* ND X X X X X ND
   ND = 未進行。^ CD276 KD。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。CD276之基因藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除，或使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導來減弱。藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modTBXT(PC3)、modMAGEC2(PC3)及modPSMA(DU145)之基因。
因此，本實例提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以減少至少一種免疫抑制因子之表現及表現至少兩種免疫刺激因子。一種組合物PCa疫苗-A經修飾以增加兩種TAA，modTBXT及modMAGEC2之表現。第二組合物PCa疫苗-B經修飾以表現一種TAA，modPSMA。單位劑量之六種癌細胞株表現至少18種與意欲接受該組合物之PCa癌症個體之子集的癌症相關之TAA且誘導超過未經修飾之組合物組分6.1倍之IFNγ反應。實例 32 ：膀胱癌 (UBC) 疫苗之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種UBC相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物UBC疫苗-A由亦經修飾以表現modPSMA及modCripto1(modTDGF1)之細胞株J82、細胞株HT-1376及細胞株TCCSUP構成。第二混合物UBC疫苗-B由亦經修飾以表現modWT1及modFOLR1(modFBP)之細胞株SCaBER、細胞株UM-UC-3及細胞株DMS 53構成。六種組分細胞株總體而言表現至少二十四種可提供抗UBC腫瘤反應之抗原。UBC 疫苗組分之鑑別
初始細胞株選擇標準鑑別出二十六種疫苗組分細胞株用於可能包括在UBC疫苗中。應用其他選擇標準以將二十六種細胞株縮小至八種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性UBC相關抗原之表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、UBC相關之CSC樣標記物YAP1、ALDH1A、CD44、CEACAM6及Oct4之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、膀胱癌之部位及階段及組織學亞型。
CSC在膀胱癌之癌轉移、治療抗性及復發中起關鍵作用(表2)。藉由源自廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA表現資料確定候選組分細胞株對TAA及UBC特異性CSC樣標記物之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA下載mRNA表現。若RNA-seq值超過一，則細胞株對TAA或CSC標記物之表現視為陽性。選擇標準鑑別出八種候選UBC疫苗組分用於進一步評估：UM-UC-3、J82、T24、HT-1376、HT-1197、TCCSUP、SCaBER及RT-4。八種候選組分細胞株表現九種至十七種TAA(圖92A)及兩種或三種CSC標記物(圖92B)。如本文所述，CSC樣細胞株DMS 53作為六種疫苗細胞株之一包括且表現十五種UBC TAA及三種UBC CSC樣標記物。
如實例9中所述，針對三個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估八種未經修飾之UBC疫苗組分候選物之免疫原性。供體1之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*02:01 B*35:02及A*02:01 B*49:01。供體2之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*32:01 B*27:05及A*68:05 B*39:08。供體3之HLA-A對偶基因為A*01:01及A*03:01。HLA-B分型不可用於供體3。J82(5,420 ± 577 SFU)、TCCSUP(3,504 ± 702 SFU)及SCaBER(2,903 ± 654 SFU)比UM-UC-3(1,022 ± 284 SFU)、T24(1,492 ± 211 SFU)、HT-1376(922 ± 230 SFU)、HT-1197(63 ± 63 SFU)及RT-4(13 ± 13 SFU)免疫原性大(圖93A)。
在三種組分細胞株之八種不同組合中評估J82及TCCSUP之免疫原性，四種組合含有J82且四種組合含有TCCSUP(圖93C)。如實例8中所述，使用三個健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對八種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。供體1之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*01:01 B*08:01及A*02:01 B*15:01。供體2之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*03:01 B*15:01及A*24:02 B*07:02。HLA-分型僅可用於供體3之一種HLA-A等位基因，其為A*02:01。供體3 HLA-B對偶基因為B*15:01及B*51:01。偵測所有八種混合物及針對各混合物中之各細胞株組分之IFNγ反應。相較於針對單個細胞株組分所偵測之IFNγ反應，針對個別混合物組分細胞株之反應顯著減少(圖93B)。在所有八種評估之組合中，TCCSUP保持最大免疫原性。單獨及在三種細胞株組分混合物中HT-1197免疫原性差，因此不包括於UBC疫苗中。當在三種細胞株組分混合物中評估時J82、T24及SCaBER之免疫原性類似。在此三種細胞株中，T24內源性表現最小數目之TAA(九種TAA＞1.0 FPKM)(圖92A)且自UBC疫苗排除。選擇J82及SCaBER，藉由如上所述進行慢病毒轉導來表現UBC抗原，且置於單獨疫苗混合物中以減輕當在相同疫苗混合物中遞送時抗原競爭之任何可能性。如上文及本文中進一步描述，選擇TCCSUP及J82包括在疫苗混合物A中且選擇SCaBER包括在疫苗混合物B中。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對UBC抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如Cripto1或DEPDC1，以及已知對UBC及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。如本文所示，為進一步增強TAA陣列，J82經修飾以表現modPSMA及modCripto1(TDGF1)且SCaBER經修飾以表現modWT1及modFOLR1(FBP)。Cripto1(TDGF1)未在六種組分細胞株中之任一種中以＞1.0 FPKM內源性表現。PSMA、FOLR1(FBP)及WT1由六種組分細胞株中之任一種以＞1.0 FPKM內源性表現(圖94A)。
如實例29中及本文中所述，藉由流動式細胞測量術或RT-PCR偵測J82對經轉導之抗原modPSMA(圖95A)及modCripto1(modTDGF1)(圖95B)之表現(SEQ ID NO: 53；SEQ ID NO: 54)及SCaBER對modWT1(圖95C)及modFOLR1(modFBP)(圖94D)之表現(SEQ ID NO: 51；SEQ ID NO: 52)。modPSMA及Cripto1(TDGF1)抗原在相同慢病毒轉移載體中編碼，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開(SEQ ID NO: 53；SEQ ID NO: 54)。在相同慢病毒轉移載體中編碼modWT1及modFOLR1(FBP)，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開(SEQ ID NO: 52)。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
本發明疫苗中二十四種代表性UBC TAA之內源性mRNA表現在圖94A中示出。在引入上述抗原之後，本發明疫苗表現所有鑑別之二十四種通常靶向且可能臨床上相關之能夠誘導UBC抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在UBC腫瘤中且一些亦可誘導針對UBC及其他實體腫瘤之免疫反應。如實例29中所述，利用可利用之mRNA表現資料，在407個UBC患者樣品中測定二十四種優先UBC TAA之RNA豐度(圖94B)。100%樣品表現優先UBC TAA中之十五種，99.3%樣品表現16種TAA，96.8%樣品表現17種TAA，90.7%樣品表現18種TAA，80.3%樣品表現19種TAA，68.6%樣品表現20種TAA，56.3%樣品表現21種TAA，41.3%樣品表現22種TAA，27.5%樣品表現23種TAA且9.1%樣品表現24種TAA(圖94C)。因此，本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，其中該等細胞株之組合，亦即單位劑量之六種細胞株包含表現至少15種與意欲接受該組合物之UBC癌症個體之子集相關的TAA。基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表75中鑑別出之細胞株以包含本發明UBC疫苗。表 75. 膀胱疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A J82 膀胱移行細胞癌
A HT-1376 膀胱III級癌
A TCCSUP 膀胱退行性IV級移行細胞癌
B SCaBER 膀胱鱗狀細胞癌
B UM-UC-3 膀胱移行細胞癌
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現之減少
J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受藉由FACS之多輪細胞分選。如實例29中所述測定CD276之表現。表76中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用ZFN對CD276進行基因編輯引起超過99.8%之CD276陰性細胞。表 76.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
J82 13,721 27 99.8
HT-1376 27,871 0 ＞ 99.9
TCCSUP 21,401 37 99.8
SCaBER 31,950 29 99.9
UM-UC-3 2,135 2 99.9
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
如實例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF及IL-12之細胞介素分泌分析。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及TGFβ2分泌含量且如實例29中所述測定所得含量。UBC疫苗-A中之J82、HT-1376及TCCSUP親本細胞株分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。J82分泌低含量之TGFβ1且未經修飾成減少TGFβ1分泌。UBC疫苗-B之SCaBER及UM-UC-3組分細胞株分泌可量測含量之TGFβ1。SCaBER亦分泌可量測含量之TGFβ2。實例26中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上文及本文中所述測定所得含量。
如實例29中所述，HT-1376、TCCSUP、SCaBER組分細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌，同時經轉殖基因轉導以增加膜結合之CD40L之表現。如實例29中所述，HT-1376、TCCSUP、SCaBER亦經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。此等細胞用純系名稱DK6描述。如實例29中所述，UM-UC-3細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌且同時增加膜結合之CD40L之表現。經修飾以減少TGFβ1之分泌而非TGFβ2之分泌的此等細胞用純系名稱DK2描述。如實例29中所述，J82經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌。經修飾以減少TGFβ2而非TGFβ1之分泌之J82及DMS 53細胞用純系名稱DK4描述。
表77展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。基因修飾引起TGFβ1分泌減少至少78%。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少至少51%。表 77. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
J82 A 野生型 * ≤ 24 955 ± 462
J82 A DK4 NA * ≤ 8
J82 A 減少百分比 NA ≥ 99%
HT-1376 A 野生型 817 ± 206 230 ± 86
HT-1376 A DK6 * ≤ 49 * ≤ 23
HT-1376 A 減少百分比 ≥ 94% ≥ 90%
TCCSUP A 野生型 2,273 ± 502 675 ± 157
TCCSUP A DK6 133 ± 26 62 ± 24
TCCSUP A 減少百分比 94% 91%
SCaBER B 野生型 85 ± 13 1,954 ± 341
SCaBER B DK6 * ≤ 18 224 ± 35
SCaBER B 減少百分比 79% 89%
UM-UC-3 B 野生型 375 ± 80 * ≤ 8
UM-UC-3 B DK2 81 ± 12 NA
UM-UC-3 B 減少百分比 78% NA
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 NA 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之UBC疫苗-A及UBC疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表78中示出。UBC疫苗-A之TGFβ1分泌減少93%皮克/劑量/24小時，且TGFβ2減少95%皮克/劑量/24小時。UBC疫苗-B之TGFβ1分泌減少64%皮克/劑量/24小時，且TGFβ2減少81%皮克/劑量/24小時。表 78.UBC 疫苗 -A 及 UBC 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 1,557 930
   DK4 / DK6 103 47
   減少百分比 93% 95%
B 野生型 283 1,224
   DK2 / DK4 / DK6 103 235
   減少百分比 64% 81%
GM-CSF 分泌
如上所述，HT-1376、TCCSUP、SCaBER及J82細胞株經慢病毒顆粒轉導，該等慢病毒顆粒含有TGFβ2 shRNA與表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)。UM-UC-3細胞株經慢病毒顆粒轉導以僅表現GM-CSF(SEQ ID NO: 7)。如實例24中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表79中示出且在下文描述。
相較於未經修飾之親本細胞株，在所有經修飾之組分細胞株中GM-CSF之分泌增加至少2,700倍。UBC疫苗-A組分細胞株使GM-CSF之表現增加的倍數如下：相對於未經修飾之細胞株(≤0.010奈克/106 個細胞/24小時)，J82增加2,700倍；相對於未經修飾之細胞株(≤0.030奈克/106 個細胞/24小時)，HT-1376增加6,500倍；相對於未經修飾之細胞株(≤0.012奈克/106 個細胞/24小時)，TCCSUP增加2,500倍。UBC疫苗-B組分細胞株使GM-CSF之表現增加的倍數如下：相對於未經修飾之細胞株(≤0.009奈克/106 個細胞/24小時)，SCaBER增加12,556倍；相對於未經修飾之細胞株(≤0.008奈克/106 個細胞/24小時)，UM-UC-3增加15,500倍；相對於未經修飾之細胞株(≤0.004奈克/106 個細胞/24小時)，DMS 53增加39,450倍。表 79. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
J82 27 ± 8 14
HT-1376 195 ± 59 98
TCCSUP 30 ± 9 15
混合物A總計 252 127
SCaBER 113 ± 30 57
UM-UC-3 124 ± 35 62
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 395 198
基於5×105 各組分細胞株之劑量，UBC疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量127 ng。UBC疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量198 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時325 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L之載體。實例29中描述偵測五種UBC細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述表現膜結合之CD40L的DMS 53修飾。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。圖96中所示及下文所述之結果證明在所有六種UBC疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少851倍。在UBC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，J82對CD40L之表現增加37,196倍(37,196 MFI)，相較於親本細胞株(44 MFI)，HT-1376對CD40L之表現增加851倍(37,444 MFI)，且相較於親本細胞株(188 MFI)，TCCSUP對CD40L之表現增加1,062倍(199,687 MFI)。在UBC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，SCaBER對CD40L之表現(13,772 MFI)增加13,772倍，相較於親本細胞株(0 MFI)，UM-UC-3對CD40L之表現(11,301 MFI)增加11,301倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表80中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少1,400倍。在UBC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.004奈克/106 個細胞/24小時)，J82之IL-12之分泌增加3,500倍，相較於親本細胞株(≤0.001奈克/106 個細胞/24小時)，HT-1376之IL-12之分泌增加609,000倍，且相較於親本細胞株(≤0.005奈克/106 個細胞/24小時)，TCCSUP之IL-12之分泌增加1,400倍。在UBC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.004奈克/106 個細胞/24小時)，SCaBER對IL-12之表現增加6,750倍，且相較於親本細胞株(≤ 0.003奈克/106 個細胞/24小時)，UM-UC-3對IL-12之表現增加6,000。DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 80. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
J82 14 ± 4 7
HT-1376 609 ± 51 305
TCCSUP 7 ± 3 4
混合物A總計 630 316
SCaBER 27 ± 12 14
UM-UC-3 18 ± 19 9
DMS 53 NA NA
混合物B總計 45 23
基於5×105 各組分細胞株之劑量，UBC疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量316 ng。UBC疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量23 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時339 ng。J82 細胞株穩定表現 modPSMA 及 modCripto1(modTDGF1)
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的J82細胞株亦經表現modPSMA及modCripto1抗原之慢病毒顆粒轉導。編碼modPSMA及modCripto1抗原之基因由弗林蛋白酶裂解位點連接(SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54)。
藉由流動式細胞測量術表徵J82對modPSMA之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PSMA抗體(Abcam，ab268061)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(BioLegend #405322)染色。經修飾之細胞株(249,632 MFI)中modPSMA之表現比親本細胞株(16,481 MFI)增加60倍(圖95A)。亦藉由流動式細胞測量術表徵J82對modCripto1之表現。首先將細胞在細胞內用兔IgG抗Cripto1抗體(Abcam，ab108391)(0.03微克/檢驗)染色，接著用AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)(0.125微克/檢驗)染色。經修飾之細胞株(3,330,400 MFI)中modCripto1之表現比未經修飾之細胞株(13,042 MFI)增加255倍(圖94B)。SCaBER 細胞株穩定表現 modWT1 及 modFOLR1(modFBP)
經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的SCaBER細胞株亦經表現modWT1及modFOLR1抗原(SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:52)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵SCaBER對modWT1之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗兔IgG1抗WT1抗體(Abcam，ab89901)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(4,121,028 MFI)對modWT1之表現比未經修飾之細胞株(46,012 MFI)增加90倍(圖94C)。如實例29及本文中所述，藉由RT-PCR測定SCaBER對modFOLR1之表現。正向引子經設計以在轉殖基因中之56-76 bp位置(GAGAAGTGCAGACCAGAATCG(SEQ ID NO: 130))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之588-609 bp位置(TCTGCTGTAGTTGGACACCTTG(SEQ ID NO: 131))處退火，得到554 bp產物。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子。在預期尺寸下偵測到modFOLR1之基因產物(圖95D)，且相對於親本對照，mRNA增加249,810倍。UBC 疫苗 -A 中對 PSMA 及 Cripto1(TDGF1) 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在UBC疫苗-A之情況下對PSMA及Cripto1之IFNγ反應。七個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表81中示出。如實例29中所述藉由ELISpot測定IFNγ反應。
相較於親本未經修飾之UBC疫苗-A(450±179 SFU，在經修飾之UBC疫苗-A下PSMA特異性IFNγ反應增加(757±278 SFU)(圖95E)。藉由ELISpot，使用跨越天然Cripto1抗原全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對Cripto1之IFNγ反應。相較於未經修飾之UBC疫苗-A(67±47 SFU)，在經修飾之UBC疫苗-A下針對Cripto1之IFNγ反應顯著增加(420±132 SFU)(p=0.023，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖95F)。UBC 疫苗 -B 中對 WT1 及 FOLR1(FBP) 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在UBC疫苗-B之情況下對WT1及FOLR1之IFNγ反應(表81)。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白質全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對WT1及FOLR1之IFNγ反應。相較於未經修飾之UBC疫苗-B(65±23 SFU)，UBC疫苗-B使WT1特異性IFNγ反應顯著增加(654±268 SFU)(p=0.017，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖95G)。相較於未經修飾之UBC疫苗-B(95±51 SFU)，UBC疫苗-B使FOLR1特異性IFNγ反應顯著增加(643±244 SFU)(p=0.011，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖95H)。表 81. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *02:01 *11:01 *07:02 *37:02 *06:02 *07:02
2 *03:01 *03:01 *07:02 *18:01 *07:02 *12:03
3 *02:01 *02:01 *15:01 *51:01 *02:02 *03:04
4 *01:01 *30:01 *08:01 *13:02 *06:02 *07:02
5 *02:01 *30:02 *14:02 *13:02 *08:02 *18:02
6 *03:01 *32:01 *07:02 *15:17 *07:01 *07:02
7 *02:01 *25:01 *18:01 *27:05 *02:02 *12:03
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
藉由ELISpot量測UBC疫苗-A及UBC疫苗-B誘導針對十種UBC抗原之IFNγ產生的能力。將來自七個HLA不同之健康供體(表81)的PBMC與負載有UBC疫苗-A或UBC疫苗-B之自身DC共培養6天，接著用含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池刺激。在上文描述用於刺激CD14- PBMC以偵測針對PSMA、Cripto1、WT1及FOLR1之IFNγ反應的肽。額外的重疊11個胺基酸之15聚體肽來源的肽池如下：存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、MUC1(JPT，PM-MUC1)、MAGEA1(JPT，PM-MAGEA1)、MAGEA3(JPT，PM-MAGEA3)、TERT(JPT，PM-TERT)及STEAP1(PM-STEAP1)。
圖97證明，在七個HLA不同之供體中UBC疫苗能夠誘導針對十種UBC抗原之抗原特異性IFNγ反應，其相較於未經修飾之親本對照(2,986 ± 813 SFU)穩固4.3倍(12,706 ± 3,223 SFU)(p=0.007，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖97A)(表82)。在兩個供體中單位劑量之UBC疫苗-A及UBC疫苗-B引發針對八種抗原之IFNγ反應，在一個供體中引發針對九種抗原之IFNγ反應，且在四個供體中引發針對十種抗原之IFNγ反應(圖98)。UBC疫苗-A及UBC疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，抗原特異性反應分別增加2.5倍及7.9倍。具體而言，相較於未經修飾之對照(2,027 ± 573 SFU)，UBC疫苗-A引發5,140 ± 1,422 SFU(圖97B)。對於UBC疫苗-A，一個供體對四種抗原作出反應，一個供體對六種抗原作出反應，一個供體對七種抗原作出反應，一個供體對七種抗原作出反應，且三個供體對十種抗原作出反應。相較於親本對照(959±331 SFU)，UBC疫苗-B引發7,565 ± 1,933 SFU(p=0.011，曼-惠特尼U檢驗)(圖97C)。對於UBC疫苗-B，一個供體對四種抗原作出反應，一個供體對八種抗原作出反應，一個供體對九種抗原作出反應，且四個供體對十種抗原作出反應。以上描述兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，單位劑量之六種細胞株，其中該單位劑量能夠引發超過未經修飾之組合物4.3倍的特異性針對至少八種在UBC患者腫瘤中表現之TAA的免疫反應。UBC疫苗-A使對至少四種TAA之IFNγ反應增加2.5倍且UBC疫苗-B使對至少四種TAA之IFNγ反應增加7.9倍。表 82. 對未經修飾及經修飾之 UBC 疫苗組分之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
UBC 疫苗 -A UBC 疫苗 -B UBC 疫苗 UBC 疫苗 -A UBC 疫苗 -B UBC 疫苗
1 319 ± 71 415 ± 18 734 ± 78 2,058 ± 1,247 6,667 ± 4,459 8,725 ± 5,658
2 3,568 ± 268 2,905 ± 300 6,473 ±128 9,138 ± 2,363 15,225 ± 1,123 24,363 ± 3,099
3 3,270 ± 1,234 845 ± 339 4,115 ± 1,022 1,549 ± 343 5,376 ± 1,730 6,924 ± 1,986
4 3,141 ± 715 841 ± 527 3,982 ± 788 9,881 ± 1,359 13,551 ± 1,749 23,432 ± 2,220
5 318 ± 183 405 ± 268 723 ± 440 1,100 ± 902 551 ± 551 1,651 ± 1,452
6* 2,945 ± 816 614 ± 406 3,559 ± 1,031 7,838 ± 3,795 6,603 ± 3,431 14,440 ± 7,091
7 628 ± 146 688 ± 193 1,315 ± 327 4,420 ± 1,896 4,985 ± 1,725 9,405 ± 3,522
* 供體6，n=3。所有其他供體，n=4。
基於本揭示案及本文提供之資料，表83中示出用於膀胱癌之包含來源於ATCC之六種癌細胞株(J82(ATCC，HTB-1)、HT-1376(ATCC，CRL-1472)、TCCSUP(ATCC，HTB-5)、SCaBER(ATCC，HTB-3)、UM-UC-3(ATCC，CRL-1749)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種膀胱癌細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53，ATCC CRL-2062)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 83. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A J82 ND X X X X X X
A HT-1376 X X X X X X ND
A TCCSUP X X X X X X ND
B SCaBER X X X X X X X
B UM-UC-3 X ND X X X X ND
B DMS 53* ND X X X X X ND
   ND = 未進行。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。CD276之基因藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除，或使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導來減弱。藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(J82)、modCripto1(modTDGF1)(J82)、modWT1(SCaBER)及modFOLR1(modFBP)(SCaBER)之基因。
因此，本實例提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以減少至少兩種免疫抑制因子之表現及表現至少兩種免疫刺激因子。一種組合物UBC疫苗-A經修飾以增加兩種TAA，modPSMA及modCripto1(modTDGF1)之表現。第二組合物UBC疫苗-B經修飾以表現兩種TAA，modWT1及modFOLR1(modFBP)。單位劑量之六種癌細胞株表現至少15種與意欲接受該組合物之膀胱癌個體之子集的癌症相關之TAA且誘導超過未經修飾之組合物組分4.3倍之IFNγ反應。實例 33 ：卵巢癌疫苗 (OC) 之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種OC相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物OC疫苗-A由細胞株OVTOKO、亦經修飾以表現modTERT之細胞株MCAS及亦經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10之細胞株TOV-112D構成。第二混合物OC疫苗-B由亦經修飾以表現modWT1及modFOLR1(modFBP)之細胞株TOV-21G、亦經修飾以表現modBORIS之細胞株ES-2及細胞株DMS 53構成。六種組分細胞株總體而言表現至少二十種可提供抗OC腫瘤反應之抗原。OC 疫苗組分之鑑別
初始細胞株選擇標準鑑別出三十六種疫苗組分細胞株用於可能包括在OC疫苗中。應用本文所述之其他選擇標準以將三十六種細胞株縮小至十種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性OC相關抗原之表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、OC相關之CSC樣標記物ALDH1A、EPCAM、CD44、CD133、CD117、內皮糖蛋白、Oct4、NANOG及SAL4之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、細胞株來源於原發性腫瘤還是轉移部位及卵巢組織學亞型。
CSC在卵巢癌之癌轉移、治療抗性及復發中起關鍵作用(表2)。藉由源自廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA表現資料確定候選組分細胞株對TAA及CSC樣標記物之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA或CSC標記物下載mRNA表現。若RNA-seq值超過一，則細胞株對TAA或CSC標記物之表現視為陽性。選擇標準鑑別出十種候選OC疫苗組分用於進一步評估：OVCAR-3、KURAMOCHI、MCAS、TYK-nu、OVSAHO、OVTOKO、TOV-21G、ES-2、OVMANA及TOV-112D。十種候選組分細胞株表現六種至十四種TAA(圖99A)及兩種至五種CSC樣標記物(圖99B)。如本文所述，CSC樣細胞株DMS 53作為六種疫苗細胞株之一包括且表現十二種OC TAA及五種OC CSC樣標記物。
如實例9中所述，針對三個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估十種未經修飾之OC疫苗組分候選物之免疫原性。三個供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*02:01 B*35:01及A*31:01 B*35:03；供體2，A*01:01 B*07:02及A*30:01 B*12:02；供體3，A*02:01 B*15:07及A*24:02 B*18:01。KURAMOCHI(1,896 ± 421 SFU)、OVTOKO(2,124 ± 591 SFU)及TOV-21G(1,559 ± 273 SFU)比OVCAR-3(54 ± 24 SFU)、MCAS(420 ± 218 SFU)、TYK-nu(339 ± 109 SFU)、OVSAHO(404 ± 163 SFU)、ES-2(215 ± 117 SFU)、OVMANA(46 ± 29)及TOV-112D(89 ± 62)(圖100A)免疫原性大。
在三種組分細胞株之十一種不同組合中評估KURAMOCHI、OVTOKO及TOV-21G之免疫原性，三種組合含有KURAMOCHI，四種組合含有OVTOKO且四種組合含有TOV-21G(圖100C)。歸因於在本文所述之實驗完成之前證實的由JCRB指出之低溫保存後活力較差，OVMANA(JCRB，JCRB1045)不包括於十一種混合物中。如實例8中所述，針對三個健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對十一種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*02:01 B*07:02及A*23:01 B*14:02；供體2，A*32:01 B*27:05及A*68:05 B*39:08；供體3，A*02:02 B*15:03及A*30:02 B*57:03。偵測所有十一種混合物及針對各混合物中之各細胞株組分之IFNγ反應。相較於針對單個細胞株所偵測之反應，針對大部分混合物組分細胞株之IFNγ反應類似或顯著增加。在所有評估之十一種組合中，KURAMOCHI、OVTOKO及TOV-21G保持最大免疫原性(圖100B)。由於基於基因修飾之後的生長形態而可能存在大規模製造問題，故KURAMOCHI未被選擇用於包括在最終OC疫苗中。如在本文中進一步描述，選擇OVTOKO及TOV-21G分別包括在疫苗混合物A及疫苗混合物B中。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對OC抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如FOLR1或FSHR，以及已知對OC及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。
如本文所示，為進一步增強TAA陣列，MCAS經修飾以表現modTERT，TOV-112D經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10，TOV-21G經修飾以表現modWT1及modFOLR1(modFBP)且ES-2經修飾以表現modBORIS。FSHR、MAGEA10、WT1、FOLR1及BORIS未在六種組分細胞株中以＞1.0 FPKM內源性表現。TERT藉六種組分細胞株中之兩種以＞1.0 FPKM內源性表現(圖101A)。
如實例29中及本文中所述，藉由流動式細胞測量術或RT-PCR偵測MCAS對經轉導之抗原modTERT之表現(圖102A)(SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 36)，TOV-112D對modFSHR(圖112B)及modMAGEA10(圖102C)之表現(SEQ ID NO: 43；SEQ ID NO: 44)，TOV-21G對modWT1(圖102D)及modFOLR1(modFBP)(圖102E)之表現(SEQ ID NO: 51；SEQ ID NO: 52)及ES -2對modBORIS(圖102F)之表現(SEQ ID NO: 59；SEQ ID NO: 60)。在相同慢病毒轉移載體中編碼modFSHR及modMAGEA10，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開。亦在相同慢病毒轉移載體中編碼modWT1及modFOLR1，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
本發明疫苗中二十種代表性OC TAA之內源性mRNA表現在圖101A中示出。在引入上述抗原之後，本發明疫苗表現所有鑑別之二十種通常靶向且可能臨床上相關之能夠誘導OC抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在OC腫瘤中，諸如FOLR1(FBP)或FSHR，且一些亦可誘導針對OC及其他實體腫瘤之免疫反應，諸如TERT。如實例29中所述，利用可利用之mRNA表現資料，在307個OC患者樣品中測定二十種優先OC TAA之RNA豐度(圖101B)。100%樣品表現優先OC TAA中之十五種，98.0%樣品表現16種TAA，79.8%樣品表現17種TAA，43.3%樣品表現18種TAA，16.6%樣品表現19種TAA，且3.9%樣品表現20種TAA(圖101C)。因此，本實例提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，其中細胞株之組合，單位劑量之六種癌細胞株，包含表現至少15種與意欲接受該組合物之OC癌症個體之子集相關的TAA的細胞。基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表84中鑑別出之細胞株來構成本發明OC疫苗。表 84. 卵巢疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A OVTOKO 來源於轉移部位(脾臟)之卵巢透明細胞癌
A MCAS 卵巢黏液性囊腺癌
A TOV-112D 卵巢子宮內膜樣腺癌
B TOV-21G 卵巢透明細胞癌
B ES-2 卵巢分化不良透明細胞腺癌
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現之減少
OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受藉由FACS之多輪細胞分選。如實例29中所述測定CD276之表現。表85中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用ZFN對CD276進行基因編輯引起超過98.1%之CD276陰性細胞。表 85.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
OVTOKO 108,003 705 99.3
MCAS 2,356 44 98.1
TOV-112D 2,969 7 99.8
TOV-21G 13,475 0 ≥ 99.9
ES-2 3,216 0 ≥ 99.9
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
TGFβ1 、 TGFβ2 、 GM-CSF 及 IL-12 之細胞介素分泌分析 如實例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF及IL-12之細胞介素分泌分析。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及/或TGFβ2分泌含量且如實例29中所述測定所得含量。OC疫苗-A中之OVTOKO、MCAS及TOV-112D親本細胞株分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。OC疫苗-B之TOV-21G及ES-2組分細胞株分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。實例5中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上文及本文中所述測定所得含量。
如實例29中所述，MCAS、TOV-112D及ES-2組分細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌，同時經轉殖基因轉導以增加膜結合之CD40L之表現。如實例29中所述，MCAS、TOV-112D及ES-2亦經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。此等細胞用純系名稱DK6描述。如實例29中所述，OVTOKO及TOV-21G細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌且同時增加膜結合之CD40L之表現。經修飾以減少TGFβ1之分泌而非TGFβ2之分泌的此等細胞用純系名稱DK2描述。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌。經修飾以減少TGFβ2而非TGFβ1之分泌之J82及DMS 53細胞用純系名稱DK4描述。
用TGFβ1 shRNA修飾TOV-21G最初使TGFβ1分泌減少，但在進一步基因修飾之後，可能經由代償機制來維持細胞增殖及存活，TGFβ1分泌增加。經TGFβ2 shRNA轉導使得ES-2細胞株之TGFβ2分泌減少19%。如實例9中所述，在五個HLA不同之供體中，OC疫苗-B組分細胞株TOV-21G及ES-2之免疫原性與未經修飾之對照之免疫原性相比較。供體1-3之HLA-A及HLA-B對偶基因描述於表74中。其他兩個供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體7，A*03:01 B*07:02及A*25:01 B*18:01；及供體8，A*30:02 B*15:10及A*30:04 B*58:02。資料表明，TOV-21G OC疫苗B組分細胞株(4,390 ± 517 SFU)比未經修飾之TOV-21G(349 ± 121 SFU)免疫原性大(圖103A)。資料進一步表明，OC疫苗B組分細胞株ES-2(1,505 ± 394 SFU)比未經修飾之ES-2(238 ± 100 SFU)免疫原性大(p=0.016，曼-惠特尼U)(圖103B)。上述資料表明經由多個修飾獲得免疫學益處。
表86展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。若僅在ELISA分析中16個複製操作中之1個中偵測到TGFβ1或TGFβ2分泌，則報導之值無平均值之標準誤差。基因修飾引起TGFβ1分泌減少至少70%(排除TOV-21G)。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少至少19%。表 86. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
OVTOKO A 野生型 517 ± 148 124 ± 35
OVTOKO A DK2 157 ± 36 NA
OVTOKO A 減少百分比 70% NA
MCAS A 野生型 1,506 ± 203 871 ± 193
MCAS A DK6 161 ± 35 61 ± 37
MCAS A 減少百分比 89% 93%
TOV-112D A 野生型 490 ± 91 2,397 ± 635
TOV-112D A DK6 * ≤ 62 * ≤ 28
TOV-112D A 減少百分比 ≥ 87% ≥ 99%
TOV-21G B 野生型 1,102 ± 150 526 ± 712
TOV-21G B DK2 1,401 ± 370 NA
TOV-21G B 減少百分比 NA NA
ES-2 B 野生型 987 ± 209 272 ± 115
ES-2 B DK6 * ≤ 19 220 ± 26
ES-2 B 減少百分比 ≥ 98% 19%
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 NA 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用。
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之OC疫苗-A及OC疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表87中示出。OC疫苗-A之TGFβ1分泌減少85%皮克/劑量/24小時，且TGFβ2減少94%皮克/劑量/24小時。OC疫苗-A之TGFβ1分泌減少31%皮克/劑量/24小時，OC疫苗-B之TGFβ2減少23%皮克/劑量/24小時。表 87.OC 疫苗 -A 及 OC 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 1,257 1,696
   DK2 / DK6 190 107
   減少百分比 85% 94%
B 野生型 1,098 642
   DK2 / DK4 /DK6 763 492
   減少百分比 31% 23%
GM-CSF 分泌
如上所述，MCAS、TOV-112D及ES-2細胞株經含有TGFβ2 shRNA及表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)的慢病毒顆粒轉導。OVTOKO及TOV-21G細胞株經慢病毒顆粒轉導以僅表現GM-CSF(SEQ ID NO: 7)。如實例26中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表87中示出且在下文描述。
相較於未經修飾之親本細胞株，在所有經修飾之組分細胞株中GM-CSF之分泌增加至少656倍。在OC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.003奈克/106 個細胞/24小時)，OVTOKO之GM-CSF之分泌增加656倍，相較於親本細胞株(≤0.003奈克/106 個細胞/24小時)，MCAS之GM-CSF之分泌增加13,280倍，且相較於親本細胞株(≤0.014奈克/106 個細胞/24小時)，TOV-112D之GM-CSF之分泌增加1,875倍。在OC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.003奈克/106 個細胞/24小時)，TOV-21G之GM-CSF之分泌增加426,660倍，相較於親本細胞株(≤0.003奈克/106 個細胞/24小時)，ES-2之GM-CSF之分泌增加22,047倍，且相較於親本細胞株(≤0.003奈克/106 個細胞/24小時)，DMS 53之GM-CSF之分泌增加49,313倍。表 88. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
OVTOKO 2 ± 0.6 1
MCAS 41 ± 13 21
TOV-112D 27 ± 8 14
混合物A總計 70 36
TOV-21G 1,382 ± 302 691
ES-2 64 ± 19 32
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 1,604 802
基於5×105 各組分細胞株之劑量，OC疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量36 ng。OC疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量802 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時838 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L。實例29中描述偵測五種OC細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述表現膜結合之CD40L的DMS 53修飾。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。圖104中所示及下文所述之結果證明在所有六種OC疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少288倍。在OC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，OVTOKO對CD40L之表現增加18,046倍(13,661 MFI)，相較於親本細胞株(17 MFI)，MCAS對CD40L之表現增加1,068倍(18,150 MFI)，且相較於親本細胞株(0 MFI)，TOV-112D對CD40L之表現增加288倍(288 MFI)。隨後TOV-112D進行分選以富集膜結合之CD40L之表現。在分選之後，相較於親本細胞株，膜結合之CD40L的表現增加728倍。使膜結合之CD40L之表現增加288倍的TOV-112D組分細胞株用於產生本文所述之且在圖104中示出。在OC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，TOV-21G對CD40L之表現增加18,874倍，相較於親本細胞株(0 MFI)，ES-2對CD40L之表現(2,823 MFI)增加2,823倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現(88,261 MFI)增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表89中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少1,739倍。在OC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0014奈克/106 個細胞/24小時)，OVTOKO之IL-12之分泌增加35倍，相較於親本細胞株(≤0.001奈克/106 個細胞/24小時)，MCAS之IL-12之分泌增加11倍，且相較於親本細胞株(≤0.006奈克/106 個細胞/24小時)，TOV-112D之IL-12之分泌增加1,739倍。在與經修飾之細胞株之IL-12分泌分開的實驗中，測定未經修飾之TOV-112D細胞株對IL-12之表現。在OC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，TOV-21G對IL-12之表現增加137倍，且相較於親本細胞株(≤ 0.001奈克/106 個細胞/24小時)，ES-2對IL-12之表現增加43倍。DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 89. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
OVTOKO 16 ± 3 8
MCAS 31 ± 7 16
TOV-112D 10 ± 7 5
混合物A總計 57 29
TOV-21G 38 ± 9 19
ES-2 26 ± 5 13
DMS 53 NA NA
混合物B總計 64 32
基於5×105 各組分細胞株之劑量，OC疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量29 ng。OC疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量32 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時61 ng。MCAS 細胞株穩定表現 modTERT
如上所述，本文所述之疫苗組分中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的MCAS細胞株亦經表現modTERT抗原(SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵MCAS對modTERT之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗兔IgG抗TERT(Abcam ab32020)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(1,558,528 MFI)中modTERT之表現比未經修飾之細胞株(227,724 MFI)增加6.8倍(圖102A)。TOV-112D 細胞株對 modFSHR 及 modMAGEA10 之穩定表現
經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的TOV-112D細胞株亦經表現modFSHR及modMAGEA10抗原(SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44)之慢病毒顆粒轉導。流動式細胞測量術測定TOV-112D對modFSHR之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗小鼠IgG1抗FSHR抗體(Novus Biologicals，NBP2-36489)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(Biolegend #405322)染色。經修飾之細胞株(86,796 MFI)中modFSHR之表現比未經修飾之細胞株(13,249 MFI)增加6.6倍(圖102B)。如實例29及本文中所述，藉由RT-PCR測定TOV-112D對modMAGEA10之表現。正向引子經設計以在轉殖基因中之24-50 bp位置(ATGCATGCCCGAAGAGGACCTGCAGAG(SEQ ID NO: 132))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之637-659 bp位置(GCTCTGCACATCGGACAGCAT(SEQ ID NO: 133))處退火，得到634 bp產物。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子。在預期尺寸下偵測到modMAGEA10之基因產物(圖102D)，且相對於親本對照，mRNA增加141,476倍。TOV-21G 細胞株穩定表現 modWT1 及 modFOLR1(modFBP)
經修飾以減少TGFβ1分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的TOV-21G細胞株亦經表現modWT1及modFOLR1抗原(SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:52)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵TOV-21G對modWT1之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗兔IgG1抗WT1抗體(Abcam，ab89901)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(687,582 MFI)對modWT1之表現比未經修飾之細胞株(140,770 MFI)增加4.9倍(圖102C)。
如實例29及本文中所述，藉由RT-PCR測定TOV-21G對modFOLR1之表現。正向引子經設計以在轉殖基因中之56-76 bp位置(GAGAAGTGCAGACCAGAATCG(SEQ ID NO: 130))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之588-609 bp位置(TCTGCTGTAGTTGGACACCTTG(SEQ ID NO: 131))處退火，得到554 bp產物。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子。在預期尺寸下偵測到modFOLR1之基因產物(圖102E)，且相對於親本對照，mRNA增加170,855倍。ES-2 細胞株穩定表現 modBORIS
經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的ES-2細胞株亦經表現modBORIS抗原(SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60)之慢病毒顆粒轉導。如實例29及本文中所述，藉由RT-PCR測定ES-2對modBORIS之表現。正向引子經設計以在轉殖基因中之1119-1138 bp位置(TTCCAGTGCTGCCAGTGTAG(SEQ ID NO: 134))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之1559-1578 bp位置(AGCACTTGTTGCAGCTCAGA(SEQ ID NO: 135))處退火，得到460 bp產物。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子。在預期尺寸下偵測到modBORIS之基因產物(圖102F)，且相對於親本對照，mRNA增加4,196倍。OC 疫苗 -A 中對 TERT 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在OC疫苗-A之情況下對TERT之IFNγ反應。七個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表90中示出。如實例29中所述藉由ELISpot測定IFNγ反應。藉由ELISpot，使用跨越天然TERT抗原全長重疊11個胺基酸之15聚體肽(JPT，PM-TERT)，測定對TERT之IFNγ反應。相較於未經修飾之OC疫苗-A(707 ± 314 SFU)，在經修飾之OC疫苗-A(1047 ± 313 SFU)下對TERT之IFNγ反應增加，但未達到統計顯著性(n=7)(圖102G)。OC 疫苗 -A 中對 FSHR 及 MAGEA10 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在OC疫苗-A之情況下對FSHR及MAGEA10之IFNγ反應。七個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表90中示出。如實例29中所述藉由ELISpot測定IFNγ反應。藉由ELISpot，使用跨越天然FSHR抗原全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對FSHR之IFNγ反應。相較於親本未經修飾之OC疫苗-A(709 ± 482 SFU)，由經修飾之OC疫苗-A(3,379 ± 1,923 SFU)誘導之FSHR特異性IFNγ反應增加，但未達到統計顯著性(n=7)(圖102H)。藉由ELISpot，使用跨越天然MAGEA10抗原全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對MAGEA10之IFNγ反應。相較於未經修飾之OC疫苗-A(630 ± 156 SFU)，在經修飾之OC疫苗-A(893 ± 495 SFU)下對MAGEA10之IFNγ反應增加，但未達到統計顯著性(n=7)(圖102I)。OC 疫苗 -B 中對 WT1 及 FOLR1(FBP) 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在OC疫苗-B之情況下對WT1及FOLR1之IFNγ反應(表90)。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白質全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對WT1及FOLR1(FBP)之IFNγ反應。相較於未經修飾之OC疫苗-B(132 ± 74 SFU)，OC疫苗-B使WT1特異性IFNγ反應增加(516 ± 241 SFU)(n=7)，但未達到統計顯著性(n=7)(圖102K)。相較於未經修飾之OC疫苗-B(168 ± 65 SFU)，OC疫苗-B使FOLR1(FBP)特異性IFNγ反應增加(467 ± 175 SFU)，但未達到統計顯著性(n=7)(圖102J)。OC 疫苗 -B 中對 BORIS 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在七個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在OC疫苗-B之情況下對BORIS之IFNγ反應(表90)。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白質全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定針對BORIS之IFNγ反應。相較於未經修飾之OC疫苗-B(121 ± 65 SFU)，OC疫苗-B使BORIS特異性IFNγ反應顯著增加(2,234 ± 1,011 SFU)(p=0.011，曼-惠特尼U檢驗)(n=7)(圖102L)。表 90. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *02:01 *24:02 *08:01 *44:02 *05:01 *07:01
2 *02:01 *25:01 *18:01 *27:05 *02:02 *12:03
3 *02:01 *33:01 *07:02 *14:02 *07:02 *08:02
4 *02:01 *02:01 *15:01 *51:01 *02:02 *03:04
5 *01:01 *30:01 *08:01 *13:02 *06:02 *07:01
6 *02:01 *03:01 *07:02 *44:03 *07:02 *16:01
7 *29:02 *31:01 *40:01 *55:01 *03:04 *16:01
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
藉由ELISpot量測OC疫苗-A及OC疫苗-B誘導針對十種OC抗原之IFNγ反應的能力。將來自七個HLA不同之健康供體(表90)的PBMC與負載有OC疫苗-A或OC疫苗-B之自身DC共培養6天，接著用含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池刺激。在上文描述用於刺激CD14- PBMC以偵測針對TERT、FSHR、MAGEA10、WT1、FOLR1及BORIS之IFNγ反應的肽。額外的重疊11個胺基酸之15聚體肽的肽池來源如下：MSLN(GeneScript常規文庫)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、PRAME(JPT，PM-OIP4)及STEAP1(PM-STEAP1)。
圖105證明，在七個HLA不同之供體中OC疫苗能夠誘導針對十種OC抗原之抗原特異性IFNγ反應，其相較於未經修飾之親本對照(7,495 ± 2,317)穩固3.3倍(24,942 ± 10,138 SFU)(n=7)(圖105A)(表91)。在一個供體中單位劑量之OC疫苗-A及OC疫苗-B引發針對七種抗原之IFNγ反應，在兩個供體中引發針對九種抗原之IFNγ反應，且在四個供體中引發針對十種抗原之IFNγ反應(圖106)。OC疫苗-A及OC疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，抗原特異性反應分別增加2.2倍及6.1倍。具體而言，相較於未經修飾之對照(5,385 ± 1,892 SFU)，OC疫苗-A引發12,116 ± 5,813 SFU(圖105B)。對於OC疫苗-A，一個供體對六種抗原作出反應，兩個供體對七種抗原作出反應，兩個供體對八種抗原作出反應，一個供體對七種抗原作出反應，且兩個供體對十種抗原作出反應。相較於親本對照(2,110 ± 529 SFU)，OC疫苗-B引發12,826 ± 4,780 SFU(p=0.011，曼-惠特尼U檢驗)(圖105C)。對於OC疫苗-B，一個供體對六種抗原作出反應，一個供體對七種抗原作出反應，兩個供體對八種抗原作出反應，且三個供體對十種抗原作出反應。因此，本實例提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，單位劑量之六種細胞株，其中該單位劑量能夠引發超過未經修飾之組合物3.3倍的特異性針對至少七種在OC患者腫瘤中表現之TAA的免疫反應。OC疫苗-A使對至少六種TAA之IFNγ反應增加2.2倍且OC疫苗-B使對至少六種TAA之IFNγ反應增加6.1倍。表 91. 對未經修飾及經修飾之 OC 疫苗組分之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
OC 疫苗 -A OC 疫苗 -B OC 疫苗 OC 疫苗 -A OC 疫苗 -B OC 疫苗
1 4,459 ± 2,295 260 ± 101 4,719 ± 2,970 386 ± 115 998 ± 446 1,383 ± 537
2 5,910 ± 1,175 2,240 ± 1,648 7,530 ± 1,735 2,188 ± 1,211 4,801 ± 1,430 6,989 ±2,542
3 2,097 ± 1,631 813 ± 369 2,910 ± 1,933 9,273 ± 2,655 5,615 ±1,764 14,888 ± 4,156
4 5,910 ± 1,175 3,331 ± 1,964 9,241 ± 3,012 22,102 ± 7,899 27,321 ±11,471 49,423 ± 18,471
5 1,962 ± 863 1,414 ± 617 3,376 ± 1,398 42,826 ± 2,276 23,162 ±7,880 65,985 ± 8,801
6^ 1,418 ± 636 1,686 ± 683 4,138 ± 1,060 2,433 ± 1,859 14,107 ± 8,825 22,053 ± 12,915
7 16,072 ± 4,222 4,333 ± 1,591 20,405 ± 5,270 4,797 ±1,783 1,358 ± 826 6,154 ± 2,592
^ 供體6之n=3。所有其他n=4
基於本揭示案及本文提供之資料，表92中示出用於卵巢癌之包含來源於ATCC或JCRB之六種癌細胞株(OVTOKO(JCRB，JCRB1048)、MCAS(JCRB，JCRB0240)、TOV-112D(ATCC，CRL-11731)、TOV-21G(ATCC，CRL-11730)、ES-2(ATCC，CRL-1978)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種卵巢癌細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 92. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A OVTOKO X ND X X X X ND
A MCAS X X X X X X X
A TOV-112D X X X X X X X
B TOV-21G ND ND X X X X X
B ES-2 X X X X X X X
B DMS 53* ND X X X X X ND
   ND = 未進行。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。CD276之基因藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除，或使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導來減弱。藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modTERT(MCAS)、modFSHR(TOV-112D)、modMAGEA10(TOV-112D)、modWT1(TOV-21G)、modFOLR1(modFBP)(TOV-21G)及modBORIS(ES-2)之基因。
本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以減少至少一種免疫抑制因子之表現及表現至少兩種免疫刺激因子。一種組合物OC疫苗-A經修飾以增加三種TAA，modhTERT、modFSHR及modMAGEA10之表現。第二組合物OC疫苗-B經修飾以表現三種TAA，modWT1、modFOLR1(modFBP)及modBORIS。單位劑量之六種癌細胞株表現至少15種與意欲接受該組合物之卵巢癌個體之子集的癌症相關之TAA且誘導超過未經修飾之組合物組分2.2倍之IFNγ反應。實例 34 ：鱗狀細胞頭頸癌 (SCCHN) 癌症疫苗之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種HN相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物HN疫苗-A由亦經修飾以表現modPSMA之細胞株HSC-4、亦經修飾以表現modPRAME及modTBXT之細胞株HO-1-N-1、及細胞株DETROIT 562構成。第二混合物HN疫苗-B由亦經修飾以表現HPV16及HPV18 E6/E7之細胞株KON、細胞株OSC-20及細胞株DMS 53構成。六種組分細胞株總體而言表現至少二十種及至少二十四種可提供抗HN腫瘤反應之非病毒抗原。HN 疫苗組分之鑑別
初始細胞株選擇標準鑑別出三十五種疫苗組分細胞株用於可能包括在HN疫苗中。應用本文所述之其他選擇標準以將三十五種細胞株縮小至六種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性HN相關抗原之表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、相關CSC樣標記物CD44、cMET、ABCG2、LRG5、ALDH1及BMI-1之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、HN癌症之主要部位及階段及細胞株來源於之部位(原發性或轉移性)。
CSC在頭頸癌之癌轉移、治療抗性及復發中起關鍵作用(表2)。藉由來源於廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)及歐洲分子生物學實驗室-歐洲生物資訊學研究所(EMBL-EBI)之RNA表現資料(OSC-20、HO-1-N-1及KON)確定候選組分細胞株對TAA及CSC樣標記物之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA下載mRNA表現。若RNA-seq值超過一(CCLE，FPKM)或零(EMBL-EBI，TPM)，則細胞株對TAA或CSC樣標記物之表現視為陽性。選擇標準鑑別出六種候選HN疫苗組分用於進一步評估：DETROIT 562、SCC-9、HSC-4、OSC-20、HO-1-N-1及KON。六種候選組分細胞株表現九種至十七種TAA(圖107A)及四種至六種CSC樣標記物(圖107B)。如本文所述，CSC樣細胞株DMS 53作為六種疫苗細胞株之一包括且表現十五種HN TAA及三種HN CSC樣標記物。
如實例9中所述，針對三個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估六種未經修飾之HN疫苗組分候選物之免疫原性。三個供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*01:01 B*08:01及A*02:01 B*15:01；供體2，A*03:01 B*15:01及A*24:02 B*07:02；供體3，A*01:01 B*07:02及A*30:01 B*12:02。KON(1,645 ± 215 SFU)及HSC-4(1,124 ± 394 SFU)比DETROIT 562(372 ± 132 SFU)、SCC-9(0 ± 0 SFU)、OSC-20(985 ± 265 SFU)及HO-1-N-1(486 ± 137 SFU)(圖109A)具有免疫原性。SCC-9的免疫原性較差，無法進行進一步分析。如在本文中進一步描述，選擇HSC-4及KON分別包括在疫苗混合物A及疫苗混合物B中。
在三種組分細胞株之兩種不同組合中評估五種所選HN細胞株及CSC樣細胞株DMS 53之免疫原性(圖109C)。如實例8中所述，在五個HLA不同之健康供體中(n=4/供體)(表99，供體1-3、5及6)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對兩種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。偵測混合物及針對各混合物中之各細胞株組分之IFNγ反應(圖109B)。如實例8及9中所述，亦藉由IFNγ ELISpot量測相較於可能HN疫苗混合物誘導針對個別細胞株之IFNγ反應的能力，個別HN疫苗組分細胞株誘導針對自身之IFNγ反應的能力。除HSC-4之外，相較於對單獨細胞株之反應，針對疫苗混合物中所包括之各HN細胞株的IFNγ反應傾向於增加(圖109D)。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對HN抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如NUF2或PSMA，以及已知對HN及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。另外，六種細胞株之一亦經修飾以表現HPV16及18病毒抗原E6及E7，因為約25-50%HNC為HPV驅動的且高危病毒株HPV16及HPV18影響全世界大部分(約85%)HPV+HNC病例。病毒腫瘤蛋白E6及E7代表免疫療法之良好目標，因為腫瘤細胞不斷表現其且其為維持HPV+癌細胞之轉型狀態所必需的。如本文所示，為進一步增強TAA及HPV病毒抗原之陣列，HSC-4經修飾以表現modPSMA，HO-1-N-1經修飾以表現modPRAME及modTBXT，且KON經修飾以表現HPV16及HPV18 E6/E7。TBXT在六種組分細胞株中不以＞1.0 FPKM或＞0 TPM內源性表現。根據ATCC或JCRB提供之產品資訊，HN疫苗組分細胞株不表現HPV16 E6/E7或HPV18 E6/E7。HPV 16或18病毒抗原之表現資料無法在CCLE或EMBL中獲得。PSMA由六種組分細胞株中之一種以＞1.0 FPKM或＞0 TPM內源性表現。PRAME未由六種組分細胞株中之兩種以＞1.0 FPKM或＞0 TPM內源性表現。(圖107A)。
如實例29中及本文中所述，藉由流動式細胞測量術或RT-PCR偵測HSC-4對經轉導之抗原modPSMA(圖110A)之表現(SEQ ID NO: 37；SEQ ID NO: 38)，HO-1-N-1對modPRAME(圖110B)及TBXT(圖120C)之表現(SEQ ID NO: 65；SEQ ID NO: 66)，及KON對HPV16 E6/E7及HPV18 E6/E7(圖110D)之表現(SEQ ID NO: 67；SEQ ID NO: 68)。在相同慢病毒轉移載體中編碼modPRAME及modTBXT抗原，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開(SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO: 66)。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
本發明疫苗中二十種代表性HN TAA之內源性mRNA表現在圖107A中示出。SCC-9為圖107中唯一不包括在本發明疫苗中之細胞株。在引入上述抗原之後，本發明疫苗表現所有鑑別之二十種通常靶向且可能臨床上相關之能夠誘導HN抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在HN腫瘤中且一些亦可誘導針對HN及其他實體腫瘤之免疫反應。如實例29中所述，利用可利用之mRNA表現資料，在515個HN患者樣品中測定二十四種優先HN TAA之RNA豐度(圖108A)。100%樣品表現優先TAA中之十四種，97.5%樣品表現15種TAA，89.5%樣品表現16種TAA，79.8%樣品表現17種TAA，61.0%樣品表現18種TAA，35.1%樣品表現19種TAA，且10.9%樣品表現20種TAA(圖108B)。本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，其中該等細胞株之組合，亦即單位劑量之六種細胞株包含表現至少14種與意欲接受該組合物之HN癌症個體之子集相關的TAA。基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表93中鑑別出之細胞株來構成本發明HN疫苗。表 93. 頭頸疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A HSC-4 來源於轉移部位(子宮頸淋巴結)之舌鱗狀細胞癌
A HO-1-N-1 頰黏膜鱗狀細胞癌
A DETROIT 562 來源於轉移部位(肋膜積液)之咽鱗狀細胞癌
B KON 來源於轉移部位(子宮頸淋巴結)之口底鱗狀細胞癌
B OSC-20 來源於轉移部位(子宮頸淋巴結)之舌鱗狀細胞癌
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現之減少
HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-2及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受藉由FACS之多輪細胞分選。如實例29中所述測定CD276之表現。表94中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用ZFN對CD276進行基因編輯引起超過98.9%之CD276陰性細胞。表 94.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
HSC-4 21,934 15 99.9
HO-1-N-1 12,200 139 98.9
DETROIT 562 9,434 79 99.2
KON 14,762 6 ≥ 99.9
OSC-20 8,357 33 99.6
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
TGFβ1 、 TGFβ2 、 GM-CSF 及 IL-12 之細胞介素分泌分析 如實例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF及IL-12之細胞介素分泌分析。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及TGFβ2分泌含量且如實例29中所述測定所得含量。HN疫苗-A中之HSC-4、HO-1-N-1及DETROIT 562親本細胞株分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。HN疫苗-B之KON及OSC-2組分細胞株分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。OSC-2分泌低含量之TGFβ1且未經修飾成減少TGFβ1分泌。實例26中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上文及本文中所述測定所得含量。
如實例29中所述，HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562及組分KON細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌且同時增加膜結合之CD40L之表現。如實例29中所述，HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562及KON亦經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。此等細胞用純系名稱DK6描述。HSC-4用TGFβ1 shRNA修飾最初減少TGFβ1之分泌。隨後HSC-4用TGFβ2 shRNA修飾減少TGFβ2之分泌，但產生與親本細胞株類似之TGFβ1分泌含量(表95)。TGFβ1及TGFβ2促進細胞增殖及存活且保留一些TGFβ信號傳導可能為一些細胞株增殖及存活所必需的。如實例9中所述，在五個HLA不同之供體(表99，供體1-3、5及6)中評估個別未經修飾及經修飾之HN細胞疫苗細胞株組分的免疫原性。儘管分泌與未經修飾之細胞株類似的TGFβ1含量，但經修飾之HSC-4細胞株保持比未經修飾之細胞株(400 ±183 SFU)更大免疫原性(1,108 ± 628 SFU)(圖109E)。在HSC-4細胞株中在TGFβ2減少之後TGFβ1分泌增加可能為一種代償存活機制。如實例29中所述，OSC-20經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。隨後OSC-20經慢病毒顆粒轉導以增加膜結合之CD40L之表現。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌。經修飾以減少TGFβ2而非TGFβ1之分泌之OCS-20及DMS 53細胞用純系名稱DK4描述。
表95展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。基因修飾引起TGFβ1分泌減少至少79%。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少至少51%。表 95. 組分細胞株中之TGF-β分泌(皮克/106 個細胞/24小時)
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
HSC-4 A 野生型 477 ± 88 252 ± 46
HSC-4 A DK6 515 ± 69 * ≤ 15
HSC-4 A 減少百分比 NA 94%
HO-1-N-1 A 野生型 1,226 ± 183 2,238 ± 488
HO-1-N-1 A DK6 254 ± 60 224 ± 114
HO-1-N-1 A 減少百分比 79% 90%
DETROIT 562 A 野生型 361 ± 86 1,037 ± 392
DETROIT 562 A DK6 * ≤ 29 * ≤ 15
DETROIT 562 A 減少百分比 ≥ 92% ≥ 99%
KON B 野生型 863 ± 375 675 ± 243
KON B DK6 * ≤ 32 268 ± 148
KON B 減少百分比 96% 60%
OSC-2 B 野生型 268 ± 46 1,249 ± 383
OSC-2 B DK4 NA 94 ± 31
OSC-2 B 減少百分比 NA 92%
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 NA 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之HN疫苗-A及HN疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表96中示出。HN疫苗-A之TGFβ1分泌減少61%，且TGFβ2減少93%皮克/劑量/24小時。HN疫苗-B之TGFβ1分泌減少67%，且TGFβ2減少75%皮克/劑量/24小時。表 96.HN 疫苗 -A 及 HN 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 1,032 1,764
   DK6 399 127
   減少百分比 61% 93%
B 野生型 619 1,205
   DK4/DK6 203 300
   減少百分比 67% 75%
GM-CSF 分泌
如上所述，HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562及KON細胞株經含有TGFβ2 shRNA及表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)的慢病毒顆粒轉導。如實例26中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表96中示出且在下文描述。
相較於未經修飾之親本細胞株，在所有經修飾之組分細胞株中GM-CSF之分泌增加至少9,578倍。在HN疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0042奈克/106 個細胞/24小時)，HSC-4之GM-CSF之分泌增加53,794倍，相較於親本細胞株(≤0.0039奈克/106 個細胞/24小時)，HO-1-N-1之GM-CSF之分泌增加13,703倍，且相較於親本細胞株(≤0.0038奈克/106 個細胞/24小時)，DETROIT 562之GM-CSF之分泌增加13,235倍。在HN疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0047奈克/106 個細胞/24小時)，KON之GM-CSF之分泌增加14,867倍，相較於親本細胞株(≤0.0039奈克/106 個細胞/24小時)，OSC-2之GM-CSF之分泌增加9,578倍，且相較於親本細胞株(≤0.0032奈克/106 個細胞/24小時)，DMS 53之GM-CSF之分泌增加49,313倍。表 97. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
HSC-4 226 ± 84 113
HO-1-N-1 53 ± 11 27
DETROIT 562 50 ± 11 25
混合物A總計 329 165
KON 70 ± 21 35
OSC-2 37 ± 11 19
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 265 133
基於5×105 各組分細胞株之劑量，HN疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量165 ng。HN疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量133 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時298 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L之載體。實例29中描述偵測五種HN細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述表現膜結合之CD40L的DMS 53修飾。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。圖111中所示及下文所述之結果證明在所有六種HN疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少2,144倍。在HN疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，HSC-4對CD40L之表現增加18,046倍(18,046 MFI)，相較於親本細胞株(0 MFI)，HO-1-N-1對CD40L之表現增加9,796倍(9,796 MFI)，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DETROIT 562對CD40L之表現增加18,374倍(18,374 MFI)。在HN疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，KON對CD40L之表現增加15,603倍，相較於親本細胞株(19 MFI)，OSC-20對CD40L之表現(40,738 MFI)增加2,144倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表98中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少11,274倍。在HN疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0017奈克/106 個細胞/24小時)，HSC-4之IL-12之分泌增加148,017倍，相較於親本細胞株(≤0.0016奈克/106 個細胞/24小時)，HO-1-N-1之IL-12之分泌增加33,271倍，且相較於親本細胞株(≤0.0015奈克/106 個細胞/24小時)，DETROIT 562之IL-12之分泌增加21,272倍。在HN疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0019奈克/106 個細胞/24小時)，KON對IL-12之表現增加11,274倍，且相較於親本細胞株(≤ 0.0016奈克/106 個細胞/24小時)，OSC-2對IL-12之表現增加22,641倍。DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 98. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
HSC-4 249 ± 120 125
HO-1-N-1 52 ±11 26
DETROIT 562 32 ± 6 16
混合物A總計 333 167
KON 21 ± 15 11
OSC-2 35 ± 12 18
DMS 53 NA NA
混合物B總計 56 29
基於5×105 各組分細胞株之劑量，HN疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量167 ng。HN疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量29 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時196 ng。HSC-4 細胞株穩定表現 modPSMA
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的HSC-4細胞株亦經表現modPSMA抗原(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)之慢病毒顆粒轉導。
藉由流動式細胞測量術表徵HSC-4對modPSMA之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PSMA抗體(Abcam，ab268061)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(BioLegend #405322)染色。經修飾之細胞株(4,473,981 MFI)中modPSMA之表現比親本細胞株(174,545 MFI)增加25倍(圖110A)。HO-1-N-1 細胞株穩定表現 modPRAME 及 modTBXT
經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的HO-1-N-1細胞株亦經表現modPRAME及modTBXT抗原(SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵HO-1-N-1對modPRAME之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.015微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PRAME抗體(Thermo Scientific，MA5-31909)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(BioLegend #405322)染色。經修飾之細胞株(290,436 MFI)中modPRAME之表現比未經修飾之細胞株(10,846 MFI)增加27倍(圖110B)。亦藉由流動式細胞測量術表徵HO-1-N-1對modTBXT之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.06微克/檢驗兔抗TBXT抗體(Abcam，ab209665)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(3,338,324 MFI)中modTBXT之表現比未經修飾之細胞株(0 MFI)增加3,338,324倍(圖110C)。 KON細胞株穩定表現HPV16 E6/E7 HPV18 E6/E7
經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的KON細胞株亦經表現HPV16及HPV18 E6及E7抗原(SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68)之慢病毒顆粒轉導。如實例29中及本文中所述，藉由RT-PCR測定KON對HPV16及HPV18 E6/E7之表現。偵測HPV16 E6之正向引子經設計以在轉殖基因中之33-54 bp位置(CCCTCAAGAGAGGCCCAGAAAG(SEQ ID NO: 136))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之160-182 bp位置(TACACGATGCACAGGTCCCGGAA(SEQ ID NO: 137))處退火，得到150 bp產物。在預期尺寸下偵測到HPV16 E6之基因產物(圖110D)，且相對於親本對照，mRNA增加8,422倍。偵測HPV16 E7之正向引子經設計以在轉殖基因中之1-21 bp位置(CACGGCGATACCCCTACACTG(SEQ ID NO: 138))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之228-250 bp位置(CCATCAGCAGATCTTCCAGGGTT(SEQ ID NO: 139))處退火，得到250 bp產物。在預期尺寸下偵測到HPV16 E7之基因產物(圖110D)，且相對於親本對照，mRNA增加7,816倍。偵測HPV18 E6之正向引子經設計以在轉殖基因中之59-81 bp位置(TGAACACCAGCCTGCAGGACATC(SEQ ID NO: 140))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之287-312 bp位置(GCATCTGATGAGCAGGTTGTACAGGC(SEQ ID NO: 141))處退火，得到254 bp產物。在預期尺寸下偵測到HPV18 E6之基因產物(圖110D)，且相對於親本對照，mRNA增加1,224倍。偵測HPV18 E7之正向引子經設計以在轉殖基因中之74-97 bp位置(TGTGCCATGAGCAGCTGTCCGACT(SEQ ID NO: 142))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之232-254 bp位置(AAGGCTCTCAGGTCGTCGGCAGA(SEQ ID NO: 143))處退火，得到181 bp產物。在預期尺寸下偵測到HPV18 E7之基因產物(圖110D)，且相對於親本對照，mRNA增加1,684倍。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子。HN 疫苗 -A 中對 PSMA 之免疫反應
如實例32中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在HN疫苗-A之情況下對PSMA之IFNγ反應。七個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表99中示出。如實例29中所述藉由ELISpot測定IFNγ反應。相較於親本未經修飾之HN疫苗-A(637 ± 369 SFU，在經修飾之HN疫苗-A(1,433 ± 479 SFU)下PSMA特異性IFNγ反應增加(圖110E)。HN 疫苗 -A 中對 PRAME 及 TBXT 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在HN-疫苗A之情況下對PRAME及FOLR1之IFNγ反應(表99)。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白質PRAME全長重疊11個胺基酸之15聚體肽(JPT，PM-OIP4)，測定對modPRAME之IFNγ反應。相較於未經修飾之HN疫苗-A(375 ± 314 SFU)，HN疫苗-A(687 ± 333 SFU)增加modPRAME特異性IFNγ反應(圖110F)。藉由ELISpot，使用跨越天然TBXT抗原全長重疊11個胺基酸之15聚體肽(JPT，PM-BRAC)，測定對TBXT之IFNγ反應。相較於未經修飾之HN疫苗-A(559 ± 289 SFU)，HN疫苗-A(1,071 ± 455 SFU)增加modTBXT特異性IFNγ反應(圖110G)。HN 疫苗 -B 中對 HPV16 及 HPV18 E6/E7 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在HN-疫苗B之情況下對引入至KON細胞株中之HPV16及HPV18 E6/E7抗原之IFNγ反應(表99)。不篩選可從中獲得免疫細胞以完成此等研究之健康供體的HPV16和HPV18，且若供體為HPV16或HPV18陽性，則對HPV16 E6/E7及HPV18 E6/E7抗原之反應可能為加強之記憶反應，而非重新引發。
藉由ELISpot，使用跨越HPV16及HPV18 E6/E7抗原全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對HPV16及HPV18 E6/E7抗原之IFNγ反應。相較於未經修飾之HN疫苗-B(1,845 ± 878 SFU)，在經修飾之HN疫苗-B下對HPV16 E6/E7之平均IFNγ反應類似(1,974 ± 537 SFU)(圖110H)。相較於未經修飾之HN疫苗-B，用HN疫苗-B引發之六個供體中之兩個(供體2及供體6)中HPV16 E6/E7反應減少(圖110I)。在其他四個供體中在HN疫苗-B下HPV16 E6/E7反應增加。供體2及供體6可能為HPV16陽性，且在與由HN疫苗-B表現之HPV16 E6/E7之活體外共培養分析之情況下連續刺激誘導T細胞耗乏，藉此在ELISpot分析中當用肽時減少IFNγ產生。在HPV16或HPV18陽性患者中HN疫苗不應誘導T細胞耗乏，因為在活體外及活體內誘導免疫反應之機制存在差異。相較於未經修飾之HN疫苗-B(822 ± 342 SFU)，經修飾之HN疫苗-B使對HPV18 E6/E7之平均IFNγ反應增加(2,195 ± 757 SFU)(圖110J)。相較於未經修飾之HN疫苗-B，當用HN疫苗-B引發時，供體6中之HPV18 E6/E7反應減少，但在其他五個供體中增加(圖110K)。表 99. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *02:01 *02:01 *15:01 *51:01 *02:02 *03:04
2 *02:01 *03:01 *07:02 *49:01 *07:01 *07:02
3 *03:01 *32:01 *07:02 *15:17 *07:01 *07:02
4 *01:01 *30:01 *08:01 *13:02 *06:02 *07:02
5 *02:01 *30:02 *14:02 *13:02 *08:02 *18:02
6 *30:02 *30:04 *15:10 *58:02 *03:04 *06:02
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
藉由ELISpot量測HN疫苗-A及HN疫苗-B誘導針對十種HN抗原之IFNγ產生的能力。將來自六個HLA不同之健康供體(表99)的PBMC與負載有HN疫苗-A或HN疫苗-B之自身DC共培養6天，接著用含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池刺激。在上文描述用於刺激CD14- PBMC以偵測針對PSMA、PRAME、TBXT、HPV16 E6/E7及HPV18 E6/E7之IFNγ反應的肽。額外的重疊11個胺基酸之15聚體肽的肽池來源如下：存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、MUC1(JPT，PM-MUC1)及STEAP1(PM-STEAP1)。
圖112證明，在六個HLA不同之供體中HN疫苗能夠誘導針對十種HN抗原之抗原特異性IFNγ反應，其相較於未經修飾之親本對照(11,537 ± 5,281)穩固1.6倍(18,901 ± 3,963 SFU)(圖109A)(表100)。相較於未經修飾之親本對照組(6,568 ± 3,112 SFU)，HN疫苗亦使針對非病毒抗原之IFNγ反應增加1.6倍(10,331 ± 2,342 SFU)(圖112D)。在一個供體中單位劑量之HN疫苗-A及HN疫苗-B引發針對九種抗原之IFNγ反應，且在五個供體中引發針對十種抗原之IFNγ反應(圖113A及113B，上圖)。在一個供體中單位劑量之HN疫苗-A及HN疫苗-B引發針對五種非病毒抗原之IFNγ反應，且在五個供體中引發針對六種非病毒抗原之IFNγ反應(圖113A及113B，下圖)(表101)。HN疫苗-A及HN疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，對於所有抗原，抗原特異性反應分別增加1.7倍及1.6倍。
HN疫苗-A及HN疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，非病毒抗原特異性反應分別增加1.5倍及1.6倍。具體而言，對於所有抗原，相較於未經修飾之對照(5,848 ± 3,222 SFU)，HN疫苗-A引發9,843 ± 2,539 SFU及(圖112B)(表100)，且相較於未經修飾之對照(3,547 ± 1,990 SFU)，對非病毒抗原為5,441 ± 1,694 SFU(圖112E)(表101)。對於HN疫苗-A，一個供體對七種抗原作出反應，兩個供體對九種抗原作出反應，且三個供體對十種抗原作出反應。在一個供體中HN疫苗-A引發對四種非病毒抗原之IFNγ反應，在兩個供體中引發對五種非病毒抗原之IFNγ反應，且在三個供體中引發對六種非病毒抗原之IFNγ反應。相較於未經修飾之對照(5,688 ± 2,472 SFU)，HN疫苗-B引發9,058 ± 1,715 SFU及(圖112C)(表100)，且相較於未經修飾之對照(3,022 ± 1,333 SFU)，對非病毒抗原為4,890 ± 932 SFU(圖112F)(表101)。對於HN疫苗-B，一個供體對六種抗原作出反應，一個供體對七種抗原作出反應，且兩個供體對九種抗原作出反應且兩個供體對十種抗原作出反應。在一個供體中HN疫苗-A引發對三種非病毒抗原之IFNγ反應，在一個供體中引發對四種非病毒抗原之IFNγ反應，在兩個供體中引發對五種非病毒抗原之IFNγ反應且在兩個供體中引發對六種非病毒抗原之IFNγ反應。
上文描述兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，單位劑量之六種細胞株，其中該單位劑量能夠引發超過未經修飾之組合物1.6倍的特異性針對至少九種在HN患者腫瘤中表現之TAA的免疫反應。HN疫苗-A使對至少七種TAA之IFNγ反應增加1.7倍且HN疫苗-B使對至少六種TAA之IFNγ反應增加1.6倍。表 100. 對未經修飾及經修飾之 HN 疫苗組分之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
HN 疫苗 -A HN 疫苗 -B HN 疫苗 HN 疫苗 -A HN 疫苗 -B HN 疫苗
1 542 ± 306 2,149 ± 1,421 2,691 ± 1,718 4,209 ± 1,876 10,106 ± 2,386 14,314 ± 1,483
2 20,690 ± 3,007 15,873 ± 4,506 36,563 ± 6,481 17,240 ± 5,541 14,265 ± 3,225 31,505 ± 3,770
3 3,500 ± 2,201 2,663 ± 450 6,133 ± 2,484 6,055 ± 2,562 8,905 ± 2,398 14,960 ± 4,113
4 8,620 ± 2,267 2,158 ± 1,092 10,778 ± 2,642 15,348 ± 5,682 10,780 ± 2,484 26,128 ± 7,506
5 520 ± 263 903 ± 572 1,423 ± 802 2,800 ± 1,336 1,513 ± 725 4,313 ± 1,640
6 1,218 ± 652 10,415 ± 3,103 11,633 ± 3,700 13,405 ± 2,355 8,783 ± 3,081 22,188 ± 2,851
表 101. 由未經修飾及經修飾之 HN 疫苗組分引起之對非病毒抗原之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
HN 疫苗 -A HN 疫苗 -B HN 疫苗 HN 疫苗 -A HN 疫苗 -B HN 疫苗
1 405 ± 313 1,408 ± 1,127 1,294 ± 737 1,003 ± 420 5,078 ± 833 3,709 ± 1,241
2 12,757 ± 2,435 8,840 ± 2,337 16,102 ± 3,210 10,984 ± 3,964 4,863 ± 1,434 12,679 ± 4,886
3 2,223 ± 1,278 1,583 ± 294 2,815 ± 1,076 2,700 ± 1,782 4,568 ± 1,385 4,813 ± 1,368
4 5,098 ± 1,131 683 ± 383 5,013 ± 1,069 8,513 ± 2,941 6,770 ± 1,525 9,655 ± 2,574
5 168 ± 89 665 ± 344 958 ± 516 1,745 ± 692 795 ± 541 2,493 ± 1,137
6 630 ± 514 4,953 ± 1,337 6,008 ± 1,624 7,700 ± 692 7,265 ± 1,702 13,590 ± 1,823
基於本揭示案及本文提供之資料，表101A中示出用於頭頸癌之包含來源於ATCC或JCRB之六種癌細胞株(HSC-4(JCRB，JCRB0624)、HO-1-N-1(JCRB，JCRB0831)、DETROIT 562(ATCC，CCL-138)、KON(JCRB，JCRB0194)、OSC-20(JCRB，JCRB0197)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種頭頸癌細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53，ATCC CRL-2062)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 101A. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A HSC-4* X X X X X X X
A HO-1-N-1 X X X X X X X
A DETROIT 562* X X X X X X ND
B KON X X X X X X X
B OSC-20 ND X X X X X ND
B DMS 53* ND X X X X X ND
   ND = 未進行。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。CD276之基因藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除，或使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導來減弱。藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(HSC-4)、modPRAME(HO-1-N-1)、modTBXT(HO-1-N-1)、HPV16 E6及E7(KON)及HPV18 E6及E7(KON)之基因。
本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以減少至少兩種免疫抑制因子之表現及表現至少兩種免疫刺激因子。一種組合物HN疫苗-A經修飾以增加三種TAA，modPSMA、modPRAME及modTBXT之表現。第二組合物HN疫苗-B經修飾以表現四種病毒腫瘤相關抗原HPV16 E6及E7以及HPV18 E6及E7。單位劑量之六種癌細胞株表現至少14種與意欲接受該組合物之頭頸癌個體之子集的癌症相關之非病毒TAA且誘導超過未經修飾之組合物組分1.6倍之IFNγ反應。實例 35 ：胃癌疫苗之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種GCA相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物GCA疫苗-A由亦經修飾以表現modPSMA及modLYK6之細胞株MKN-1、細胞株MKN-45及細胞株MKN-74構成。第二混合物GCA疫苗-B由細胞株OCUM-1、亦經修飾以表現modWT1及modCLDN18(緊密連接蛋白18)之細胞株Fu97、及細胞株DMS 53構成。六種組分細胞株總體而言表現至少二十種可提供抗GCA腫瘤反應之抗原。GCA 疫苗組分之鑑別
初始細胞株選擇標準鑑別出三十六種疫苗組分細胞株用於可能包括在GCA疫苗中。應用本文所述之其他選擇標準以將三十六種細胞株縮小至七種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性GCA相關抗原之表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、GCA相關CSC樣標記物ABCB1、ABCG2、ALDH1A、CD133、CD164、FUT4、LGR5、CD44、MUC1及DLL4之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、從中獲得細胞株之癌症階段及部位、及組織學亞型。
CSC在胃癌之癌轉移、治療抗性及復發中起關鍵作用(表2)。藉由源自廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA表現資料確定候選組分細胞株對TAA及GCA特異性CSC樣標記物之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA下載mRNA表現。若RNA-seq值超過一，則細胞株對TAA或CSC樣標記物之表現視為陽性。選擇標準鑑別出七種候選GCA疫苗組分用於進一步評估：RERF-GC-1B、MKN-74、MKN-45、OCUM-1、MKN-1、Fu97及NCI-N87。七種候選組分細胞株表現十種至十四種TAA(圖114A)及兩種至六種CSC標記物(圖114B)。如本文所述，CSC樣細胞株DMS 53作為六種疫苗細胞株之一包括且表現十四種GCA TAA及七種GCA CSC樣標記物。
如實例9中所述，使用三個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估七種未經修飾之GCA疫苗組分候選物之免疫原性。供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*01:01 B*08:01及A*02:01 B*15:01；供體2，A*01:01 B*08:01及A*02:01 B*57:03；及供體3，A*02:01 B*40:01及A*30:01 B*57:01。MKN-1(5,417 ± 152 SFU)及OCUM-1(1,123 ±  258 SFU)比RERF-GC-1B(120 ± 56 SFU)、MKN-74(241 ± 107 SFU)、MKN-45(0 ± 0 SFU)、Fu97(578 ± 209 SFU)及NCI-N87(0 ± 0 SFU)(圖115A)免疫原性大。
在三種組分細胞株之八種不同組合中評估MKN-1及OCUM-1之免疫原性，四種組合含有MKN-1且四種組合含有OCUM-1(圖115C)。如實例8中所述，使用三個健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對八種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*02:06 B*15:01及A*34:02 B*51:01；供體2，A*03:01 B*07:02及A*24:02 B*15:09；及供體3，A*02:01 B*40:01及A*30:01 B*57:01。偵測所有八種混合物及針對各混合物中之各細胞株組分之IFNγ反應。相較於針對單個細胞株組分所偵測之IFNγ反應，對於大多數細胞株，針對個別混合物組分細胞株之反應顯著增加(圖115B)。在所有八種評估之組合中，MKN-1保持最大免疫原性。如上文及本文中進一步描述，選擇MKN-1包括在疫苗混合物A中且選擇OCUM-1包括在疫苗混合物B中。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對GCA抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如LY6K或MUC1，以及已知對GCA及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。如本文所示，為進一步增強TAA陣列，MKN-1經修飾以表現modPSMA及modLY6K，且Fu97經修飾以表現modWT1及modCLDN18。PSMA、CLDN18及WT1由六種組分細胞株中之一種內源性表現且LY6K由六種組分細胞株中之兩種以＞1.0 FPKM內源性表現(圖116A)。
如實例29中及本文中所述，藉由流動式細胞測量術偵測MKN-1對經轉導之抗原modPSMA(圖117A)及modLY6K(圖117B)之表現(SEQ ID NO: 57；SEQ ID NO: 58)及Fu97對modWT1(圖114C)及modCLDN18(圖114D)之表現(SEQ ID NO: 55；SEQ ID NO: 56)。在相同慢病毒轉移載體中編碼modPSMA及modLY6K抗原，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開。在相同慢病毒轉移載體中編碼modWT1及modCLDN18，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
本發明疫苗中二十種代表性GCA TAA之內源性mRNA表現在圖116A中示出。在引入上述抗原之後，本發明疫苗表現所有鑑別之二十種通常靶向且可能臨床上相關之能夠誘導GCA抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在GCA腫瘤中且一些亦可誘導針對GCA及其他實體腫瘤之免疫反應。如實例29中所述，利用可利用之mRNA表現資料，在371個GCA患者樣品中測定二十種優先GCA TAA之RNA豐度(圖116B)。100%樣品表現優先GCA TAA中之十一種，99.5%樣品表現12種TAA，98.9%樣品表現13種TAA，94.9%樣品表現14種TAA，83.0%樣品表現15種TAA，67.1%樣品表現16種TAA，43.4%樣品表現17種TAA，24.5%樣品表現18種TAA，8.6%樣品表現19種TAA且0.3%樣品表現20種TAA(圖116C)。本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，其中該等細胞株之組合，亦即單位劑量之六種細胞株包含表現至少11種與意欲接受該組合物之GCA癌症個體之子集相關的TAA。基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表102中鑑別出之細胞株來構成本發明GCA疫苗。表 102. 胃疫苗細胞株及組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A MKN-1 胃腺癌；來源於轉移部位(淋巴結)
A MKN-45 胃腺癌；來源於轉移部位(肝臟)
A MKN-74 胃管腺癌
B OCUM-1 印戒細胞胃腺癌；來源於轉移部位(肋膜積液)
B Fu97 胃腺癌；來源於轉移部位(淋巴結)
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現之減少
MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、FU97及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受藉由FACS之多輪細胞分選。如實例29中所述測定CD276之表現。表103中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用ZFN對CD276進行基因編輯引起超過83.3%之CD276陰性細胞。表 103.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
MKN-1 35,503 6 ≥ 99.9
MKN-45 8,479 11 99.9
MKN-74 11,335 3 ≥ 99.9
OCUM-1 13,474 2,244 83.3
FU97 178,603 394 99.8
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
TGFβ1 、 TGFβ2 、 GM-CSF 及 IL-12 之細胞介素分泌分析 如實例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF及IL-12之細胞介素分泌分析。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及TGFβ2分泌含量且如實例26中所述測定所得含量。GCA疫苗-A中之MKN-1、MKN-45及MKN-74細胞株分泌可量測含量之TGFβ1。MKN-1亦分泌可量測含量之TGFβ2。GCA疫苗-B之Fu97及DMS 53組分細胞株分泌可量測含量之TGFβ1。DMS 53亦分泌可量測含量之TGFβ2。OCUM-1不分泌可量測含量TGFβ1或TGFβ2。實例26中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上文及本文中所述測定所得含量。
如實例29中所述，MKN-1組分細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌，同時經轉殖基因轉導以增加膜結合之CD40L之表現。如實例29中所述，MKN-1亦經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。此等細胞用純系名稱DK6描述。如實例29中所述，MKN-45、MKN-74及Fu97細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌且同時增加膜結合之CD40L之表現。經修飾以減少TGFβ1之分泌而非TGFβ2之分泌的此等細胞用純系名稱DK2描述。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌。經修飾以減少TGFβ2而非TGFβ1之分泌之DMS 53細胞用純系名稱DK4描述。OCUM-1未經修飾成減少TGFβ1或TGFβ2分泌，因為親本株不分泌可偵測含量之TGFβ1或TGFβ2。
表104展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。基因修飾引起TGFβ1分泌減少至少72%。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少至少51%。表 104. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
MKN-1 A 野生型 2,539 ± 670 1,634 ± 670
MKN-1 A DK6 218 ± 58 * ＞ 12
MKN-1 A 減少百分比 91% ≥ 99%
MKN-45 A 野生型 704 ± 101 * ＞ 11
MKN-45 A DK2 98 ± 49 NA
MKN-45 A 減少百分比 86% NA
MKN-74 A 野生型 753 ± 104 * ＞ 6
MKN-74 A DK2 119 ± 18 NA
MKN-74 A 減少百分比 84% NA
OCUM-1 B 野生型 * ＞ 22 * ＞ 10
OCUM-1 B NA NA NA
OCUM-1 B 減少百分比 NA NA
Fu97 B 野生型 402 ± 103 * ＞ 11
Fu97 B DK2 113 ± 14 NA
Fu97 B 減少百分比 72% NA
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 NA 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之GCA疫苗-A及GCA疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表105中示出。GCA疫苗-A之TGFβ1分泌減少89%，且TGFβ2減少98%皮克/劑量/24小時。GCA疫苗-B之TGFβ1分泌減少54%，且TGFβ2減少49%皮克/劑量/24小時。表 105.GCA 疫苗 -A 及 GCA 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 1,998 826
   DK2/DK6 218 15
   減少百分比 89% 98%
B 野生型 265 254
   DK2/DK4 121 130
   減少百分比 54% 49%
GM-CSF 分泌
如上所述，MKN-1細胞株經含有TGFβ2 shRNA及表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)的慢病毒顆粒轉導。MKN-45、MKN-74、OCUM-1及Fu97細胞株慢病毒顆粒轉導以僅表現GM-CSF(SEQ ID NO: 7)。如實例26中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表106中示出且在下文描述。
相較於未經修飾之親本細胞株，在所有經修飾之組分細胞株中GM-CSF之分泌增加至少3,941倍。在GCA疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0028奈克/106 個細胞/24小時)，MKN-1之GM-CSF之分泌增加46,419倍，相較於親本細胞株(≤0.0051奈克/106 個細胞/24小時)，MKN-45之GM-CSF之分泌增加3,941倍，且相較於親本細胞株(≤0.0027奈克/106 個細胞/24小時)，MKN-74之GM-CSF之分泌增加242,155倍。在GCA疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0043奈克/106 個細胞/24小時)，OCUM-1之GM-CSF之分泌增加7,866倍，相較於親本細胞株(≤0.0046奈克/106 個細胞/24小時)，Fu97之GM-CSF之分泌增加193,248倍，且相較於親本細胞株(≤0.0032奈克/106 個細胞/24小時)，DMS 53之GM-CSF之分泌增加49,313倍。表 106. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
MKN-1 130 ± 66 65
MKN-45 20 ± 8 10
MKN-74 664 ± 374 332
混合物A總計 814 407
OCUM-1 34 ± 17 17
FU97 893 ± 422 447
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 1,085 543
基於5×105 各組分細胞株之劑量，GCA疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量407 ng。GCA疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量543 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時950 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L之載體。實例29中描述偵測五種GCA細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述表現膜結合之CD40L的DMS 53修飾。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。圖118中所示及下文所述之結果證明在所有六種GCA疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少374倍。在GCA疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，MKN-1對CD40L之表現(15,941 MFI)增加15,941倍，相較於親本細胞株(9 MFI)，MKN-45對CD40L之表現(3,397 MFI)增加374倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，MKN-74對CD40L之表現(4,914 MFI)增加4,914倍。在GCA疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，OCUM-1對CD40L之表現(3,741 MFI)增加3,741倍，相較於親本細胞株(17 MFI)，FU97對CD40L之表現(26,449 MFI)增加1,569倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，MKN-1、MKN-45、MKN-74及Fu97組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表107中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少1,715倍。在GCA疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0011奈克/106 個細胞/24小時)，MKN-1之IL-12之分泌增加53,185倍，相較於親本細胞株(≤0.0021奈克/106 個細胞/24小時)，MKN-45之IL-12之分泌增加1,715倍，且相較於親本細胞株(≤0.0011奈克/106 個細胞/24小時)，MKN-74之IL-12之分泌增加56,743倍。在GCA疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤0.0037奈克/106 個細胞/24小時)，FU97對IL-12之表現增加13,078倍。OCUM-1及DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 107. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
MKN-1 60 ± 25 30
MKN-45 4 ± 2 2
MKN-74 62 ± 7 31
混合物A總計 126 63
OCUM-1 NA NA
FU97 48 ± 11 24
DMS 53 NA NA
混合物B總計 48 24
基於5×105 各組分細胞株之劑量，GCA疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量63 ng。GCA疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量24 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時87 ng。MKN-1 細胞株穩定表現 modPSMA 及 modLY6K
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ1及TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的MKN-1細胞株亦經表現modPSMA及modLY6K抗原之慢病毒顆粒轉導。來源於CCLE之RNA表現資料表明MKN-1內源性表現LYK6(圖116A)，但在未經修飾之MKN-1細胞，藉由流動式細胞測量術未偵測到LYK6蛋白(圖117B)。編碼modPSMA及modLY6K抗原(SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58)之基因由弗林蛋白酶裂解位點連接。
藉由流動式細胞測量術表徵MKN-1對modPSMA之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PSMA抗體(Abcam，ab268061)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(BioLegend #405322)染色。經修飾之細胞株(697,744 MFI)中modPSMA之表現比親本細胞株(46,955 MFI)增加15倍(圖117A)。亦藉由流動式細胞測量術表徵MKN-1對modLY6K之表現。首先將細胞在細胞內用兔IgG抗LY6K抗體(Abcam，ab246486)(0.03微克/檢驗)染色，接著用AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)(0.125微克/檢驗)染色。經修飾之細胞株(2,890,315 MFI)中modLY6K之表現比未經修飾之細胞株(0 MFI)增加2,890,315倍(圖117B)。Fu97 細胞株穩定表現 modWT1 及 modCLDN18
經修飾以減少TGFβ1分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的Fu97細胞株亦經表現modWT1及modCLDN18抗原(SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO:56)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵Fu97對modWT1之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗兔IgG1抗WT1抗體(Abcam，ab89901)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(7,418,365 MFI)對modWT1之表現比未經修飾之細胞株(129,611 MFI)增加57倍(圖117C)。藉由流動式細胞測量術表徵Fu97對modCLDN18之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗兔IgG1抗CLDN18抗體(Abcam，ab203563)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(3,168,563 MFI)對modCLDN18之表現比未經修飾之細胞株(558,211 MFI)增加5.7倍(圖117D)。GCA 疫苗 -A 中對 PSMA 及 LY6K 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在GCA疫苗-A之情況下對PSMA及LY6K之IFNγ反應。六個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表108中示出。如實例29中所述藉由ELISpot測定IFNγ反應。
相較於親本未經修飾之GCA疫苗-A(137 ± 82 SFU，在經修飾之GCA疫苗-A下PSMA特異性IFNγ反應增加(2,413 ± 829 SFU)(圖117E)。藉由ELISpot，使用跨越天然LY6K抗原全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對LY6K之IFNγ反應。相較於未經修飾之GCA疫苗-A(63 ± 30 SFU)，在經修飾之GCA疫苗-A(1,598 ± 639 SFU)下對LY6K之IFNγ反應顯著增加(p=0.002，曼-惠特尼U檢驗)(n=6)(圖117F)。GCA 疫苗 -B 中對 WT1 及 CLDN18 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在GCA-疫苗B之情況下對WT1及CLDN18之IFNγ反應(表108)。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白質全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定對WT1及CLDN18之IFNγ反應。相較於未經修飾之GCA疫苗-B(37 ± 22 SFU)，在GCA疫苗-B(686 ± 330 SFU)下WT1特異性IFNγ反應增加(n=6)(圖117G)。相較於未經修飾之GCA疫苗-B(113 ± 65 SFU)，GCA疫苗-B(1,682 ± 773 SFU)使CLDN18特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.026，曼-惠特尼U檢驗)(n=6)(圖117H)。表 108. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *02:01 *02:01 *15:01 *51:01 *02:02 *03:04
2 *01:01 *32:01 *08:01 *14:01 *07:01 *08:01
3 *03:01 *25:01 *07:02 *18:01 *07:02 *12:03
4 *02:01 *30:02 *14:02 *57:02 *08:02 *18:02
5 *02:01 *33:01 *07:02 *14:02 *07:02 *08:02
6 *01:01 *32:01 *35:01 *40:06 *04:01 *15:02
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
藉由ELISpot量測GCA疫苗-A及GCA疫苗-B誘導針對十種GCA抗原之IFNγ產生的能力。將來自七個HLA不同之健康供體(表108)的PBMC與負載有GCA疫苗-A或GCA疫苗-B之自身DC共培養6天，接著用含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池刺激。在上文描述用於刺激CD14- PBMC以偵測針對PSMA、LY6K、WT1及CLDN18之IFNγ反應的肽。額外的重疊11個胺基酸之15聚體肽大肽池來源如下：MSLN(GenScript常規肽文庫)、MAGEA3(JPT，PM-MAGEA3)、CEA(JPT，PM-CEA)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、STEAP1(PM-STEAP1)及MUC1(JPT，PM-MUC1)。
圖119證明，在六個HLA不同之供體中GCA疫苗能夠誘導針對十種GCA抗原之抗原特異性IFNγ反應，其相較於未經修飾之親本對照(1,879 ± 463 SFU)穩固17.5倍(32,898 ± 13,617 SFU)(p=0.009，曼-惠特尼U檢驗)(n=6)(圖119A)(表109)。在兩個供體中單位劑量之GCA疫苗-A及GCA疫苗-B引發針對八種抗原之IFNγ反應，在一個供體中引發針對九種抗原之IFNγ反應，且在四個供體中引發針對十種抗原之IFNγ反應(圖120)。GCA疫苗-A及GCA疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，抗原特異性反應分別增加17.4倍及17.7倍。具體而言，相較於未經修飾之對照(1,055 ± 518 SFU)，GCA疫苗-A引發18,332 ± 6,823 SFU(p=0.004，曼-惠特尼U檢驗)(圖119B)。對於GCA疫苗-A，一個供體對五種抗原作出反應，兩個供體對九種抗原作出反應，且三個供體對十種抗原作出反應。相較於親本對照(823 ± 287 SFU)，GCA疫苗-B引發14,566 ± 7,499 SFU(p=0.015，曼-惠特尼U檢驗)(圖119C)。對於GCA疫苗-B，一個供體對五種抗原作出反應，兩個供體對九種抗原作出反應，且三個供體對十種抗原作出反應。以上描述兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種細胞株，其中該單位劑量能夠引發超過未經修飾之組合物17.5倍的特異性針對至少八種在GCA患者腫瘤中表現之TAA的免疫反應。GCA疫苗-A使對至少五種TAA之IFNγ反應增加17.4且GCA疫苗-B使對至少五種TAA之IFNγ反應增加17.7。表 109. 對未經修飾及經修飾之 GCA 疫苗組分之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
GCA 疫苗 -A GCA 疫苗 -B GCA 疫苗 GCA 疫苗 -A GCA 疫苗 -B GCA 疫苗
1 305 ± 107 73 ± 73 378 ± 173 5,616 ± 1,720 5,438 ± 3,569 11,054 ± 4,736
2 3,542 ± 1,184 24 ± 24 3,566 ± 1,193 35,007 ± 15,203 51,023 ± 17,176 86,030 ± 32,196
3 811 ± 119 1,366 ± 468 2,176 ± 531 25,519 ± 11,590 11,586± 7,416 37,105 ± 18,093
4 0 ± 0 1,313 ± 533 1,313 ± 533 1,869 ± 632 675 ± 236 2,544 ± 673
5 530 ± 215 400 ± 173 1,240 ± 329 32,064 ± 1,785 9,261 ± 3,145 41,326 ± 2,571
6 968 ± 236 1,631 ± 701 2,599 ± 927 2,920 ± 1,014 4,743 ± 1,593 10,218 ± 585
基於本揭示案及本文提供之資料，表110中示出用於胃癌之包含來源於ATCC或JCRB之六種癌細胞株(MKN-1(JCRB，JCRB0252)、MKN-45(JCRB，JCRB0254)、MKN-74(JCRB，JCRB0255)、OCUM-1(JCRB，JCRB0192)、Fu97(JCRB，JCRB1074)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種胃癌細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53，ATCC CRL-2062)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 110. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A MKN-1 X X X X X X X
A MKN-45* X ND X X X X ND
A MKN-74 X ND X X X X ND
B OCUM-1* ND ND X X X ND ND
B Fu97 X ND X X X X X
B DMS 53* ND X X X X ND ND
   ND = 未進行。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。CD276之基因藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除，或使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導來減弱。藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(MKN-1)、modLY6K(MKN-1)、modWT1(Fu97)及modCLDN18(Fu97)之基因。
本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以減少至少一種免疫抑制因子之表現及表現至少兩種免疫刺激因子。一種組合物GCA疫苗-A經修飾以增加兩種TAA，modPSMA及modLY6K之表現。第二組合物GCA疫苗-B經修飾以表現兩種TAA，modWT1及modCLDN18。單位劑量之六種癌細胞株表現至少11種與意欲接受該組合物之胃癌個體之子集的癌症相關之TAA且誘導超過未經修飾之組合物組分17.5倍之IFNγ反應。實例 36 ：乳癌 (BRCA) 疫苗之製備
本實例證明，在兩種混合物之疫苗組合物中TGFβ1、TGFβ2及CD276表現之減少同時GM-CSF、CD40L及IL-12之過度表現顯著增加HLA不同之群體中針對至少10種BRC相關抗原之細胞免疫反應的量值，各混合物由三種細胞株構成，總共6種細胞株。如本文所述，第一混合物BRC疫苗-A由亦經修飾以表現modPSMA之細胞株CAMA-1、亦經修飾以表現modTERT之細胞株AU565、及細胞株HS-578T構成。第二混合物BRC疫苗-B由細胞株MCF-7、亦經修飾以表現modTBXT及modBORIS之細胞株T47D、及細胞株DMS 53構成。六種組分細胞株總體而言表現至少二十二種可提供抗BRC腫瘤反應之抗原。BRC 疫苗組分之鑑別
初始細胞株選擇標準鑑別出二十九種疫苗組分細胞株用於可能包括在BRC疫苗中。應用本文所述之其他選擇標準以將二十九種細胞株縮小至七種細胞株，用於在免疫原性分析中進一步評估。此等標準包括：內源性BRC相關抗原之表現、三陰性乳癌中富含之抗原之內源性表現、缺乏諸如IL-10或IDO1之其他免疫抑制因子之表現、BRC相關之CSC樣標記物ABCG2、ALDH1A、BMI1、CD133、CD44、ITGA6、CD90、c-myc、CXCR1、CXCR4、EPCAM、KLF4、MUC1、NANOG、SAL4及SOX2之表現、從中獲得細胞株之患者之種族及年齡、乳癌之部位及階段、分子亞型及組織學亞型。
CSC在乳癌之癌轉移、治療抗性及復發中起關鍵作用(表2)。藉由源自廣泛研究所癌細胞株百科全書(CCLE)之RNA表現資料確定候選組分細胞株對TAA及BRC特異性CSC樣標記物之表現。HGNC基因符號包括在CCLE搜索中且針對各TAA下載mRNA表現。若RNA-seq值超過一，則細胞株對TAA或CSC標記物之表現視為陽性。選擇標準鑑別出七種候選BRC疫苗組分用於進一步評估：BT20、HS-578T、AU565、ZR751、MCF-7、CAMA-1及T47D。七種候選組分細胞株表現七種至十一種TAA(圖121A)及六種至九種CSC標記物(圖121B)。如本文所述，CSC樣細胞株DMS 53作為六種疫苗細胞株之一包括且表現十五種BRC TAA及三種BRC CSC樣標記物。
如實例9中所述，使用三個HLA不同之健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot評估七種未經修飾之BRC疫苗組分候選物之免疫原性。供體1之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*02:01 B*57:03及A*01:01 B*08:01。供體2之HLA-A及HLA-B對偶基因為A*30:01 B*57:01及A*02:01 B*40:01。供體3之HLA-A對偶基因為A*01:01及A*02:01。HLA-B分型不可用於供體3。分別在五個HLA不同之供體(表117，供體2-6)中評估T47D之免疫原性。MCF-7(2,314 ± 448 SFU)及CAMA-1(990 ± 223 SFU)比AU565(274 ± 87 SFU)、ZR751(292 ± 133 SFU)、BT20(524 ± 192 SFU)、HS-578T(281 ± 81 SFU)(圖122A)及T47D(491 ± 202 SFU)(圖122C)免疫原性大。
在三種組分細胞株之八種不同組合中評估MCF-7及CAMA-1之免疫原性，四種組合含有MCF-7且四種組合含有CAMA-1(圖122D)。如實例8中所述，使用三個健康供體(n=4/供體)，藉由IFNγ ELISpot，測定針對八種可能疫苗混合物內之三種組分細胞株之IFNγ反應。供體之HLA-A及HLA-B對偶基因如下：供體1，A*01:01 B*08:01及A*02:01 B*15:01；供體2，A*03:01 B*15:01及A*24:02 B*07:02；供體3，A*01:01 B*30:01及A*02:01 B*12:02。在相同五個HLA不同之供體中，亦評估包括T47D、MCF-7及DMS 53 T47D之三種組分細胞株之一個額外混合物組合(圖122C)(表117，供體2-6)。偵測所有九種混合物及針對各混合物中之各細胞株組分之IFNγ反應。
在所有八種評估之組合中，MCF-7及CAMA-1保持最大免疫原性。除了CAMA-1及ZR751，對個別混合物組分細胞株之反應類似。在三種組分細胞株之組合中對CAMA-1之IFNγ反應略微減少。在三種細胞株組分之組合中對ZR751之IFNγ反應亦略微減少，且因此ZR751不包括於BRC疫苗中(圖122B-C)。三陰性乳癌佔乳癌大約15%。出於此原因，一種三陰性乳癌細胞株包括在組合物疫苗中，佔BRC疫苗之單位劑量的17%。當在三種細胞株組分之混合物中評估時三陰性乳癌細胞株BT20及HS-578T之免疫原性類似。在此兩個細胞株中，HS-578T內源性表現之TAA(十一種TAA＞1.0 FPKM)比BT20(九種TAA＞1.0 FPKM)多(圖121A)且選擇用於包括在BRC疫苗中。如上文及本文中進一步描述，選擇CAMA-1包括在疫苗混合物A中且選擇MCF-7包括在疫苗混合物B中。
本文所述之疫苗中的細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對BRC抗腫瘤反應特別重要之TAA，諸如乳房珠蛋白A(SCGB2A2)及MUC1，三陰性乳癌中富含之TAA，諸如TBXT及NY-ESO-1，以及已知對BRC及其他實體腫瘤之目標重要的TAA，諸如TERT。如本文所示，為進一步增強TAA陣列，CAMA-1經修飾以表現modPSMA，AU565經修飾以表現modTERT，且T47D亦經修飾以表現modTBXT及modBORIS。
TBXT及BORIS在六種組分細胞株中之任一種中不以＞1.0 FPKM內源性表現。TERT及PSMA由六種組分細胞株中之一種以＞1.0 FPKM內源性表現(圖123A)。
如實例29中及本文中所述，藉由流動式細胞測量術或RT-PCR偵測CAMA-1對經轉導之抗原modPSMA(圖124A)之表現(SEQ ID NO: 37；SEQ ID NO: 38)，AU565對modTERT(圖124B)之表現(SEQ ID NO: 35；SEQ ID NO: 36)，及T47D對modTBXT(圖124C)及modBORIS(圖124D)之表現(SEQ ID NO: 41；SEQ ID NO: 42)。在相同慢病毒轉移載體中編碼modTBXT及modBORIS抗原，由弗林蛋白酶裂解位點分隔開(SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42)。
因為需要維持抗原與包含各細胞株之純系亞群之最大異質性，所以已使用抗生素選擇及流動式細胞測量術且不經由限制稀釋次選殖來建立本發明疫苗中所利用之經基因修飾之細胞株。
本發明疫苗中二十二種代表性BRC TAA之內源性mRNA表現在圖123A中示出。在引入上述抗原之後，本發明疫苗表現所有鑑別之二十二種通常靶向且可能臨床上相關之能夠誘導BRC抗腫瘤反應的TAA。已知此等TAA中之一些主要富集在BRC腫瘤中且一些亦可誘導針對BRC及其他實體腫瘤之免疫反應。如實例29中所述，利用可利用之mRNA表現資料，在1082個BRC患者樣品中測定二十二種優先BRC TAA之RNA豐度(圖123B)。100%樣品表現優先BRC TAA中之十五種，99.9%樣品表現16種TAA，99.3%樣品表現17種TAA，95.1%樣品表現18種TAA，79.9%樣品表現19種TAA，47.6%樣品表現20種TAA，17.1%樣品表現21種TAA且3.4%樣品表現22種TAA(圖123C)。本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，其中該等細胞株之組合，亦即單位劑量之六種細胞株包含表現至少15種與意欲接受該組合物之BRC癌症個體之子集相關之TAA。基於本文中所呈現之表現及免疫原性資料，選擇表111中鑑別出之細胞株來構成本發明GBM疫苗。表 111. 乳癌疫苗細胞株及和組織學
混合物 細胞株名稱 組織學
A CAMA-1 管腔A型乳腺癌，ER+、PR+、Her2-；來源於轉移部位(肋膜積液)
A AU565 管腔乳腺癌，ER-、PR-、Her2+；來源於轉移部位(肋膜積液)
A HS-578T 三陰性乳腺管癌，ER-、PR-、Her2-
B MCF-7 管腔A型乳腺癌，ER+、PR+、Her2；來源於轉移部位(肋膜積液)
B T47D 管腔A型乳腺管癌，ER+、PR+、Her2；來源於轉移部位(肋膜積液)
B DMS 53 小細胞肺癌
CD276 表現之減少
CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D及DMS 53組分細胞株表現CD276且如實例13中及本文中其他地方所述，藉由用ZFN電穿孔來剔除表現。因為希望維持儘可能多之腫瘤異質性，所以不藉由限制稀釋法選殖經電穿孔及shRNA修飾之細胞。實際上，如實例13中所述，細胞經受藉由FACS之多輪細胞分選。如實例29中所述測定CD276之表現。表112中描述CD276表現之減少。此等資料顯示在所有六種疫苗組分細胞株中用ZFN對CD276進行基因編輯引起超過95.2%之CD276陰性細胞。表 112.CD276 表現之減少
細胞株 親本細胞株MFI 經修飾之細胞株MFI CD276減少%
CAMA-1 14,699 75 99.5
AU565 4,085 0 ≥ 99.9
HS-578T 33,832 234 99.3
MCF-7 25,952 1,243 95.2
T47D 11,737 3 ≥ 99.9
DMS 53 11,928 24 99.8
MFI在減去同型對照下報導
TGFβ1 、 TGFβ2 、 GM-CSF 及 IL-12 之細胞介素分泌分析 如實例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF及IL-12之細胞介素分泌分析。shRNA 下調 TGF-β 分泌
在剔除CD276之後，使用shRNA減少TGFβ1及TGFβ2分泌含量且如實例29中所述測定所得含量。BRC疫苗-A中之AU565及HS-578T親本細胞株分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。CAMA-1分泌可偵測含量之TGFβ2，但不分泌TGFβ1。BRC疫苗-B之MCF-7組分細胞株分泌可量測含量之TGFβ1及TGFβ2。T47D不分泌可量測含量之TGFβ1或TGFβ2，因此不經修飾成減少TGFβ1或TGFβ2之分泌。實例26中描述DMS 53細胞株使TGFβ2分泌減少且如上文及本文中所述測定所得含量。
如實例29中所述，HS-578T及MCF-7組分細胞株經TGFβ1 shRNA轉導以減少TGFβ1之分泌，同時經轉殖基因轉導以增加膜結合之CD40L之表現。如實例29中所述，HS-578T及MCF-7亦經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。此等細胞用純系名稱DK6描述。如實例29中所述，HS-578T、MCF-7、CAMA-1及AU565細胞株經編碼TGFβ2 shRNA之慢病毒顆粒轉導以減少TGFβ2之分泌，且同時增加GM-CSF之表現(SEQ ID NO: 6)。如實例26中所述，DMS 53用shRNA修飾以減少TGFβ2之分泌。經修飾以減少TGFβ2而非TGFβ1之分泌之細胞株用純系名稱DK4描述。
表113展示相較於未經修飾之親本細胞株，經基因修飾之組分細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2分泌之減少百分比。若僅在ELISA分析中16個複製操作中之1個中偵測到TGFβ1或TGFβ2分泌，則報導之值無平均值之標準誤差。基因修飾引起TGFβ1分泌減少至少44%。TGFβ2之基因修飾引起TGFβ2分泌減少至少51%。表 113. 組分細胞株中之 TGF-β 分泌 ( 皮克 /106 個細胞 /24 小時 )
細胞株 混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
CAMA-1 A 野生型 * ≤ 20 249 ± 59
CAMA-1 A DK4 NA * ≤ 11
CAMA-1 A 減少百分比 79% ≥ 96%
AU565 A 野生型 325 ± 219 306 ± 294
AU565 A DK4 NA * ≤ 23
AU565 A 減少百分比 ≥ 85% ≥ 92%
HS-578T A 野生型 3,574 ± 690 615 ± 247
HS-578T A DK6 1,989 ± 200 118 ± 26
HS-578T A 減少百分比 44% 81%
MCF-7 B 野生型 1,279 ± 174 411 ± 149
MCF-7 B DK6 306 ± 48 * ≤ 14
MCF-7 B 減少百分比 76% 60%
T47D B 野生型 * ≤ 32 * ≤ 15
T47D B NA NA NA
T47D B 減少百分比 NA NA
DMS 53 B 野生型 106 ± 10 486 ± 35
DMS 53 B DK4 NA 238 ± 40
DMS 53 B 減少百分比 NA 51%
DK6：TGFβ1/TGFβ2雙重減弱；DK4：TGFβ2單一減弱；DK2：TGFβ1單一減弱；*=使用LLD估計，未偵測到；NA=不適用
基於5×105 各組分細胞株之劑量，經修飾之BRC疫苗-A及BRC疫苗-B及對應的未經修飾之親本細胞株的總TGFβ1及TGFβ2分泌在表114中示出。BRC疫苗-A之TGFβ1分泌減少49%，且TGFβ2減少87%皮克/劑量/24小時。BRC疫苗-B之TGFβ1分泌減少67%，且TGFβ2減少71%皮克/劑量/24小時。表 114.BRC 疫苗 -A 及 BRC 疫苗 -B 中之總 TGF-β 分泌 ( 皮克 / 劑量 /24 小時 )
混合物 純系 TGFβ1 TGFβ2
A 野生型 1,960 585
   DK4/DK6 995 76
   減少百分比 49% 87%
B 野生型 709 456
   DK4/DK6 222 134
   減少百分比 67% 71%
GM-CSF 分泌
如上所述，HS-578T、MCF-7、CAMA-1及AU565細胞株經含有TGFβ2 shRNA及表現GM-CSF之基因(SEQ ID NO: 6)的慢病毒顆粒轉導。T47D細胞株經慢病毒顆粒轉導以僅表現GM-CSF(SEQ ID NO: 7)。如實例26中及本文中其他地方所述，DMS 53經修飾以分泌GM-CSF。結果在表115中示出且在下文描述。
相較於未經修飾之親本細胞株，在所有經修飾之組分細胞株中GM-CSF之分泌增加至少15,714倍。在BRC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0039奈克/106 個細胞/24小時)，CAMA-1之GM-CSF之分泌增加36,990倍，相較於親本細胞株(≤0.0042奈克/106 個細胞/24小時)，AU565之GM-CSF之分泌增加15,714倍，且相較於親本細胞株(≤0.0064奈克/106 個細胞/24小時)，HS-578T之GM-CSF之分泌增加21,061倍。在BRC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0118奈克/106 個細胞/24小時)，MCF-7之GM-CSF之分泌增加25,528倍，相較於親本細胞株(≤0.0063奈克/106 個細胞/24小時)，T47D之GM-CSF之分泌增加33,920倍，且相較於親本細胞株(≤0.0032奈克/106 個細胞/24小時)，DMS 53之GM-CSF之分泌增加49,313倍。表 115. 組分細胞株中之 GM-CSF 分泌
細胞株 GM-CSF ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) GM-CSF ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
CAMA-1 145 ± 30 73
AU565 66 ± 37 33
HS-578T 135 ± 20 68
混合物A總計 346 174
MCF-7 302 ± 66 151
T47D 212 ± 40 106
DMS 53 158 ± 15 79
混合物B總計 672 336
基於5×105 各組分細胞株之劑量，BRC疫苗-A之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量174 ng。BRC疫苗-B之總GM-CSF分泌為每24小時每劑量336 ng。因此，每劑量之總GM-CSF分泌為每24小時510 ng。膜結合之 CD40L(CD154) 表現
如上所述，組分細胞株經慢病毒顆粒轉導以表現膜結合之CD40L之載體。實例29中描述偵測五種BRC細胞株組分對CD40L之表現的方法。實例15中描述表現膜結合之CD40L的DMS 53修飾。下文描述所有六種疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的評估。圖125中所示及下文所述之結果證明在所有六種BRC疫苗組分細胞株中CD40L膜表現基本上增加。
在所有組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，膜結合之CD40L之表現增加至少3,417倍。在BRC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，CAMA-1對CD40L之表現增加3,417倍(3,417 MFI)，相較於親本細胞株(0 MFI)，AU565對CD40L之表現增加6,527倍(6,527 MFI)，且相較於親本細胞株(0 MFI)，HS-578T對CD40L之表現增加6,560倍(6,560 MFI)。在BR-BT疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(0 MFI)，MCF-7對CD40L之表現(5,986 MFI)增加5,986倍，相較於親本細胞株(0 MFI)，T47D對CD40L之表現(45,071 MFI)增加45,071倍，且相較於親本細胞株(0 MFI)，DMS 53對CD40L之表現增加88,261倍。IL-12 表現
如實例17中所述，組分細胞株經IL-12載體轉導，且如上文及本文中所述測定所得IL-12 p70表現。結果在表116中示出且在下文描述。
在所有經修飾以分泌IL-12 p70之組分細胞株中，相較於未經修飾之親本細胞株，IL-12之分泌增加至少4,034倍。在BRC疫苗-A組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0016奈克/106 個細胞/24小時)，CAMA-1之IL-12之分泌增加39,490倍，相較於親本細胞株(≤0.0017奈克/106 個細胞/24小時)，AU565之IL-12之分泌增加14,793倍，且相較於親本細胞株(≤0.0026奈克/106 個細胞/24小時)，HS-578T之IL-12之分泌增加19,141倍。在BRC疫苗-B組分細胞株中，相較於親本細胞株(≤ 0.0047奈克/106 個細胞/24小時)，MCF-7對IL-12之表現增加4,034倍，且相較於親本細胞株(≤ 0.002奈克/106 個細胞/24小時)，T47D對IL-12之表現增加43,655倍。DMS 53未經修飾成分泌IL-12。表 116. 組分細胞株中之 IL-12 分泌
細胞株 IL-12 ( 奈克 /106 個細胞 /24 小時 ) IL-12 ( 奈克 / 劑量 /24 小時 )
CAMA-1 62 ±13 31
AU565 25 ± 12 13
HS-578T 49 ± 11 25
混合物A總計 136 69
MCF-7 19 ± 13 10
T47D 86 ± 17 43
DMS 53 NA NA
混合物B總計 105 53
基於5×105 各組分細胞株之劑量，BRC疫苗-A之總IL-12分泌為每24小時每劑量69 ng。BRC疫苗-B之總IL-12分泌為每24小時每劑量53 ng。因此，每劑量之總IL-12分泌為每24小時122 ng。CAMA-1 細胞株穩定表現 modPSMA
如上所述，本文所述之疫苗中之細胞經選擇以表現廣泛TAA陣列，包括已知對抗腫瘤免疫重要之TAA。為進一步增強抗原陣列，經修飾以減少TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的CAMA-1細胞株亦經表現modPSMA抗原(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵CAMA1對modPSMA之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗小鼠IgG1抗PSMA抗體(Abcam，ab268061)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之山羊抗小鼠IgG1抗體(BioLegend #405322)染色。經修飾之細胞株(77,718 MFI)中modPSMA之表現比親本細胞株(4,269 MFI)增加17倍(圖124A)。AU565 細胞株穩定表現 modTERT
經修飾以減少TGFβ2分泌、減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的AU565細胞株亦經表現modTERT抗原(SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵AU565對modTERT之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.03微克/檢驗抗小鼠IgG1抗TERT抗體(Abcam，ab32020)染色，接著用0.125微克/檢驗驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(957,873 MFI)中modTERT之表現比未經修飾之細胞株(30,743 MFI)增加31倍(圖124B)。T47D 細胞株穩定表現 modTBXT 及 modBORIS
經修飾以減少CD276表現及表現GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12的T47D細胞株亦經表現modTBXT及modBORIS抗原(SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42)之慢病毒顆粒轉導。藉由流動式細胞測量術表徵T47D對modTBXT之表現。未經修飾及抗原修飾之細胞在細胞內用0.06微克/檢驗抗兔IgG1抗TBXT抗體(Abcam，ab209665)染色，接著用0.125微克/檢驗AF647結合之驢抗兔IgG1抗體(BioLegend #406414)染色。經修飾之細胞株(147,610 MFI)中modTBXT之表現比未經修飾之細胞株(0 MFI)增加147,610倍(圖124C)。如實例29及本文中所述，藉由RT-PCR測定SCaBER對BORIS之表現。正向引子經設計以在轉殖基因中之1119-1138 bp位置(TTCCAGTGCTGCCAGTGTAG(SEQ ID NO: 134))處退火且反向引子經設計以在轉殖基因中之1159-1178 bp位置(AGCACTTGTTGCAGCTCAGA(SEQ ID NO: 135))處退火，得到460 bp產物。實例29中描述β-微管蛋白之對照引子。在預期尺寸下偵測到modBORIS之基因產物(圖124D)，且相對於親本對照，mRNA增加2,198倍。BRC 疫苗 -A 中對 PSMA 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在BRC疫苗-A之情況下對PSMA之IFNγ反應。六個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表117中示出。如實例29中所述，藉由ELISpot，使用跨越天然PSMA抗原全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定IFNγ反應。相較於親本未經修飾之BRC疫苗-A(393 ± 210 SFU)，在經修飾之BRC疫苗-A(4,166 ± 1,647 SFU)下PSMA特異性IFNγ反應顯著增加(p=0.041，曼-惠特尼U檢驗)(n=6)(圖124E)。BRC 疫苗 -A 中對 TERT 之免疫反應
如實例29中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在BRC疫苗-A之情況下對TERT之IFNγ反應。六個供體每一者之HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因在表117中示出。藉由ELISpot，使用跨越天然TERT抗原全長重疊11個胺基酸之15聚體肽(JPT，PM-TERT)，測定IFNγ反應。相較於未經修飾之BRC疫苗-A(1,670 ± 918)SFU，在經修飾之BRC疫苗-A(3,807 ± 927 SFU)下對TERT之IFNγ反應增加(圖124F)。BRC 疫苗 -B 中對 TBXT 及 BORIS 之免疫反應
如實例32中及本文中所述，在六個HLA不同之供體(n=4/供體)中，評估在BRC疫苗-B之情況下對TBXT及BORIS之IFNγ反應(表117)。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原全長重疊11個胺基酸之15聚體肽(JPT，PM-BRAC)，測定針對TBXT之IFNγ反應。藉由ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白質全長重疊9個胺基酸之15聚體肽(購自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，測定針對BORIS之IFNγ反應。
相較於未經修飾之BRC疫苗-B(930 ± 496 SFU)，BRC疫苗-B使TBXT特異性IFNγ反應增加(1,102 ± 366 SFU)(n=6)(圖124G)。相較於未經修飾之BRC疫苗-B(1,757 ± 661 SFU)，BRC疫苗-B使BORIS特異性IFNγ反應增加(3,054 ± 1,155 SFU)(n=6)(圖124H)。表 117. 健康供體 MHC-I 特徵
供體 # HLA-A HLA-B HLA-C
1 *03:01 *07:02 *07:02 *35:01 *04:01 *07:02
2 *02:01 *03:01 *27:05 *27:05 *01:02 *01:02
3 *02:01 *33:01 *07:02 *14:02 *07:02 *08:02
4 *02:01 *02:01 *15:01 *44:02 *03:04 *14:02
5 *24:02 *02:01 *08:01 *51:01 *14:02 *03:04
6 *01:01 *02:01 *35:01 *50:01 *04:01 *06:02
混合物誘導針對相關 TAA 之免疫反應
藉由ELISpot量測BRC疫苗-A及BRC疫苗-B誘導針對十種BRC抗原之IFNγ產生的能力。將來自六個HLA不同之健康供體(表117)的PBMC與負載有BRC疫苗-A或BRC疫苗-B之自身DC共培養6天，接著用含有已知之MHC-I限制性抗原決定基之TAA特異性肽池刺激。在上文描述用於刺激CD14- PBMC以偵測針對PSMA、TERT、TBXT及BORIS之IFNγ反應的肽。額外的重疊11個胺基酸之15聚體肽的肽池來源如下：STEAP1(PM-STEAP1)、PRAME(JPT，PM-OIP4)、SCGB2A2(乳房珠蛋白-A)(JPT，PM-MamA)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、MUC1(JPT，PM-MUC1)及MMP11(JPT，PM-MMP11)。
圖126證明，在六個HLA不同之供體中BRC疫苗能夠誘導針對十種BRC抗原之抗原特異性IFNγ反應，其相較於未經修飾之親本對照(20,183 ± 7,978 SFU)穩固2.2倍(45,370 ± 9,212 SFU)(n=6)(圖136A)(表118)。在兩個供體中單位劑量之BRC疫苗-A及BRC疫苗-B引發針對九種抗原之IFNγ反應，且在四個供體中引發針對十種抗原之IFNγ反應(圖127)。分別相較於未經修飾之對照1,380 ± 697 SFU及1,601 ± 810 SFU，BRC疫苗使對PRAME之IFNγ反應增加2.2倍(3,049 ± 1,079 SFU)及對TBXT之IFNγ反應增加1.7倍(3,049 ± 1,079 SFU)，在乳癌之三陰性分子子集富含該兩種抗原。BRC疫苗-A及BRC疫苗-B獨立地證明，相較於親本對照，抗原特異性反應分別增加2.6倍及1.4倍。具體而言，相較於未經修飾之對照(9,197 ± 3,433 SFU)，BRC疫苗-A顯著增加抗原特異性反應23,944 ± 3,971 SFU(p=0.026，曼-惠特尼U檢驗)(圖127B)。對於BRC疫苗-A，兩個供體對九種抗原作出反應且四個供體對十種抗原作出反應。相較於親本對照(11,975 ± 4,510 SFU)，BRC疫苗-B引發17,032 ± 3,861 SFU(n=6)(圖127C)。對於BRC疫苗-B，一個供體對五種抗原作出反應，兩個供體對九種抗原作出反應，且三個供體對十種抗原作出反應。上文描述兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種細胞株，其中該單位劑量能夠引發超過未經修飾之組合物2.2倍的特異性針對至少九種在BRC患者腫瘤中表現之TAA的免疫反應。BRC疫苗-A使對至少九種TAA之IFNγ反應增加2.6倍且BRC疫苗-B使對至少五種TAA之IFNγ反應增加1.4倍。表 118. 對未經修飾及經修飾之 BRC 疫苗組分之 IFNγ 反應
供體 (n=4) 未經修飾 (SFU ± SEM) 經修飾 (SFU ± SEM)
BRC 疫苗 -A BRC 疫苗 -B BRC 疫苗 BRC 疫苗 -A BRC 疫苗 -B BRC 疫苗
1 2,590 ± 924 4,896 ± 2,759 14,248 ± 9,736 41,841 ± 10,934 29,895 ± 9,674 71,736 ± 19,975
2 2,134 ± 434 1,697 ± 197 4,061 ± 761 36,234 ± 4,700 31,114 ± 1,918 67,349 ± 6,540
3* 4,867 ± 4,503 11,522 ± 6,462 19,399 ± 14,052 6,345 ± 3,166 2,802 ± 1,446 12,196 ± 4,892
4 9,535 ± 7,710 14,104 ± 8,363 21,073 ± 16,703 23,510 ± 10,746 9,724 ± 5,389 33,234 ± 16,056
5 23,976 ± 17,601 38,089 ± 18,754 57,350 ± 38,795 17,257 ± 7,954 17,712 ± 11,548 36,268 ± 18,735
6 3,397 ± 992 659 ± 331 4,968 ± 2,159 30,599 ± 10,330 20,841 ± 5,625 51,440 ± 15,727
*供體3，n=3。所有其他供體，n=4。
混合物增加對 TAA 之 IFNγ 反應的廣度及量值
如實例9中所述，藉由IFNγ ELISpot，在供體2-6中評估相較於單個組分細胞株，如實例8中所述，BRC疫苗-A及BRC疫苗-B引發IFNγ產生之更大抗原廣度及量值的能力(表117)。BRC疫苗-A(圖128A)及BRC疫苗-B(圖128B)誘導更穩固之對乳癌抗原之反應。重要地，相較於單個組分細胞株，BRC疫苗-A及BRC疫苗-B誘導對更大數目之抗原的IFNγ反應。在五個供體之此子集中，在兩個供體中BRC疫苗-A誘導對九種抗原之IFNγ反應且在三個供體中誘導對十種抗原之IFNγ反應。在一個供體中單獨CAMA-1誘導對四種抗原之IFNγ反應，在兩個供體中誘導對六種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對八種抗原之IFNγ反應，且在一個供體中誘導對十種抗原之IFNγ反應。在一個供體中單獨AU565誘導對兩種抗原之IFNγ反應，在兩個供體中誘導對六種抗原之IFNγ反應，在1個供體中誘導對九種抗原之IFNγ反應，且在一個供體中誘導對十種抗原之IFNγ反應。在一個供體中單獨HS-578T誘導對零種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對三種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對五種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對九種抗原之IFNγ反應，且在一個供體中誘導對十種抗原之IFNγ反應(圖128C)。在五個供體之此子集中，在一個供體中BRC疫苗-B誘導對五種抗原之IFNγ反應，在兩個供體中誘導對九種抗原之IFNγ反應，且在兩個供體中誘導對十種抗原之IFNγ反應。在一個供體中單獨MCF-7誘導對三種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對五種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對七種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對八種抗原之IFNγ反應，且在一個供體中誘導對十種抗原之IFNγ反應。在一個供體中單獨T47D誘導對零種抗原之IFNγ反應，在一個供體中誘導對五種抗原之IFNγ反應，在兩個供體中誘導對七種抗原之IFNγ反應，且在一個供體中誘導對九種抗原之IFNγ反應(圖128D)。
基於本揭示案及本文提供之資料，表119中示出用於乳癌之包含來源於ATCC之六種癌細胞株(CAMA-1(ATCC，HTB-21)、AU565(ATCC，CRL-2351)、HS-578T(ATCC，HTB-126)、MCF-7(ATCC，HTB-22)、T47D(ATCC，HTB-133)及DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全細胞疫苗。細胞株代表五種乳癌細胞株及一種小細胞肺癌(SCLC)細胞株(DMS 53，ATCC CRL-2062)。細胞株已劃分成兩個分組：疫苗-A及疫苗-B。疫苗-A經設計以在上臂中皮內投與且疫苗-B經設計以在大腿中皮內投與。疫苗A及B一起構成單位劑量之癌症疫苗。表 119. 細胞株命名及修飾
混合物 細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276   KO GM-CSF CD40L IL-12 TAA
A CAMA-1 ND X X X X X X
A AU565 ND X X X X X X
A HS-578T X X X X X X ND
B MCF-7 X X X X X X ND
B T47D ND ND X X X X X
B DMS 53* ND X X X X X ND
   ND = 未進行。*鑑別為CSC樣細胞之細胞株。
在上表中指示的情況下，已使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導，減弱免疫抑制因子轉型生長因子-β1(TGFβ1)及轉型生長因子-β2(TGFβ2)之基因。CD276之基因藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)進行電穿孔來剔除，或使用利用慢病毒載體進行shRNA轉導來減弱。藉由慢病毒載體轉導添加顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modTERT(AU565)、modPSMA(CAMA-1)、modTBXT(T47D)及modBORIS(T47D)之基因。
本文提供兩種組合物，各包含治療有效量之三種癌細胞株，亦即單位劑量之六種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以減少至少一種免疫抑制因子之表現及表現至少兩種免疫刺激因子。一種組合物BRC疫苗-A經修飾以增加兩種TAA modTERT及modPSMA之表現。第二組合物BRC疫苗-B經修飾以表現兩種TAA modTBXT及modBORIS。單位劑量之六種癌細胞株表現至少15種與意欲接受該組合物之乳癌個體之子集的癌症相關之TAA且誘導超過未經修飾之組合物組分2.2倍之IFNγ反應。實例 37 ： GBM 疫苗組分細胞株適應無異種培養基中之生長 適應過程概述
將GBM疫苗組合物之五種組分細胞株(DBTRG-05MG、LN-229、GB1、KNS-60及SF-126)直接在無異種、無血清及缺乏非人類要素之培養基中培養(A1D、A2D)或相繼適應(A1W、A2W)在該培養基中生長。對於各細胞株，測試兩種培養基調配物。習知培養基由補充有10% FBS、L-麩醯胺酸、丙酮酸鈉、HEPES、MEM-NEAA(僅在DMEM中使用非必需胺基酸)及抗生素之RPMI(DBTRG-05MG，LN-229)或DMEM(GB1、KNS-60、SF-126)組成(表120)。無異種培養基含有15%無異種替代品(XFR)替換FBS，且抗生素濃度與習知培養基不同(A1-XFR培養基：基於RPMI或DMEM之培養基，與表121中所示之抗生素一起調配；A2-XFR培養基：基於RPMI或DMEM之培養基，與表122中所示之抗生素一起調配)。值得注意地，添加至培養基調配物中用於選擇轉殖基因之抗生素與培養基中存在之蛋白質結合。由於無異種培養基中與含FBS之培養基相比蛋白質濃度較低，所以將抗生素濃度降低以分別在A1-XFR及A2-XFR培養基中測試兩種不同濃度。針對在2種培養基調配物A1-XFR及A2-XFR以及兩種適應條件(比較直接塗鋪(A1D、A2D)與連續脫離(sequential weaning)(A1W、A2W))中之生長，篩選五種GBM疫苗組分細胞株每一者。
為證實適應無異種培養基調配物，監測細胞形態及增殖。終止顯示在錐蟲藍染色時無活性之非黏附漂浮細胞的培養條件。收穫與在含FBS之培養基中之對照具有類似形態的在無異種培養基中穩定生長且進行抗生素選擇至少3週的細胞株，且分析經修飾之基因之表現。表 120 ：用於選擇插入之轉殖基因的基礎培養基 ( 含有 FBS) 抗生素濃度
細胞株 彈力蛋白 潮黴素 嘌呤黴素
DBTRG-05MG 4 300 n/a
LN-229 4 300 2
GB1 4 500 n/a
KNS-60 4 500 2
SF-126 4 500 2
所有選擇抗生素濃度均以µg/mL為單位。n/a，細胞株不使用選擇抗生素。
表 121 用於選擇插入之轉殖基因的 A1-XFR 培養基抗生素濃度
細胞株 彈力蛋白 潮黴素 嘌呤黴素
DBTRG-05MG 1.25 100 n/a
LN-229 1.25 100 0.4
GB1 1.25 100 n/a
KNS-60 1.25 100 0.4
SF-126 1.25 100 0.4
所有選擇抗生素濃度均以µg/mL為單位。n/a，細胞株不使用選擇抗生素。
表 122 ：用於選擇插入之轉殖基因的 A2-XFR 培養基抗生素濃度
細胞株 彈力蛋白 潮黴素 嘌呤黴素
DBTRG-05MG 2 200 n/a
LN-229 2 200 1
GB1 2 200 n/a
KNS-60 2 200 1
SF-126 2 200 1
所有選擇抗生素濃度均以µg/mL為單位。n/a，細胞株不使用選擇抗生素。
在無異種培養基中生長之細胞株中之轉殖基因表現的分析
針對在2種培養基調配物A1-XFR及A2-XFR以及兩種適應條件(比較直接塗鋪(A1D)與連續脫離(A1W、A2W))中之生長，篩選五種GBM疫苗組分細胞株每一者。針對轉殖基因之表現，分析顯示穩定細胞生長、最小細胞死亡及形態與在FBS中生長之細胞相當的條件。
為獲得分泌之細胞介素之可再現量測，進行分泌分析。將細胞於無異種培養基中以0.75×106 及0.5×106 個細胞/孔一式兩份地接種於經玻璃連結蛋白塗佈之6孔盤中。在24小時後，培養基替換為新鮮的無異種培養基。在又48小時後，收穫上清液，用於藉由ELISA進行分析。同時，收穫細胞，用於藉由流動式細胞測量術評估CD40L表現。簡言之，在收穫之後，將細胞用藻紅素結合之抗人類CD40L(純系TRAP1)染色。藉由流動式細胞測量術，使用LSR Fortessa流式細胞儀分析經標記之細胞。使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)量測分泌之細胞介素。簡言之，對於各樣品，對上清液進行二-四倍稀釋。使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)(R&D Systems)測定TGFβ1及TGFβ2含量。TGFβ1及TGFβ2分泌以皮克/106 個細胞/24小時為單位報導。使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)，分別利用來自R&D Systems及Biolegend之套組來測定GM-CSF及IL-12含量。GM-CSF及IL-12分泌含量以奈克/106 個細胞/24小時為單位報導。在適應無異種培養基之後個別細胞株中之轉殖基因表現的結果
用於適應過程之DBTRG-05MG細胞經修飾以減少TGFβ1表現及表現CD40L及IL-12。當在4-6週過程中脫離在100% A1-XFR培養基中生長時細胞增殖穩定，但與在含FBS之培養基中生長的未經修飾之親本細胞之38.3小時相比，倍增時間增加至586.8小時(表123)。直接塗鋪在A1-XFR培養基中可導致增殖停滯及細胞死亡。對適應在A1-XFR培養基中生長之經修飾之DBTRG-05MG細胞的分析顯示，表現CD40L，且偵測到IL-12之分泌且定量為196.5奈克/106 /24小時，而與在FBS中生長之未經修飾之親本DBTRG-05MG細胞相比TGFβ1之分泌減少88%。未經修飾之DBTR-05MG細胞不表現CD40L或產生IL-12。
用於適應過程之LN-229細胞經修飾以減少TGFβ1表現及過度表現CD40L、GM-CSF及IL-12。當直接塗鋪在100% A1-XFR培養基中時細胞增殖穩定，其中與在含FBS之培養基中生長的未經修飾之親本細胞之34.5小時相比，倍增時間為59.7小時(表123)。當在4-6週過程中脫離在100% A2-XFR培養基中生長時，倍增時間為71小時(表4)。對適應在A1-XFR及A2-XFR培養基中生長之經修飾之LN-229細胞的分析顯示，表現CD40L，且偵測到IL-12之分泌且定量為527奈克/106 /24小時(A1D)及603奈克/106 /24小時(A2W)，偵測到GM-CSF且定量為2029.8奈克/106 /24小時(A1D)及2505.8奈克/106 /24小時(A2W)，且與在FBS中生長之未經修飾之親本細胞相比TGFβ1含量減少79.2%(A1D)或78.9%(A2W)。未經修飾之LN-229細胞不表現CD40L或產生IL-12或GM-CSF。
用於適應過程之GB1細胞經修飾以減少TGFβ1表現及過度表現CD40L及IL-12。當直接塗鋪在100% A1-XFR培養基中時細胞增殖穩定，其中與在含FBS之培養基中生長的未經修飾之親本細胞之37.9小時相比，倍增時間為144.1小時(表123)。當在4-6週過程中脫離在100% A1-XFR培養基中生長時，倍增時間為597.2小時，且在A2-XFR培養基中為266.8小時(表4)。對適應在A1-XFR及A2-XFR培養基中生長之經修飾之GB1細胞的分析顯示，表現CD40L，且偵測到IL-12之分泌且定量為117.5奈克/106 /24小時(A1D)、76.6奈克/106 /24小時(A1W)及72.0奈克/106 /24小時(A2W)，且與在FBS中生長之未經修飾之親本細胞相比TGFβ1含量減少64.3%(A1D)、74.6%(A1W)及90.8%(A2W)。未經修飾之GB1細胞不表現CD40L或產生IL-12。
用於適應過程之KNS-60細胞經修飾以表現減少含量之TGFβ1及TGFβ2且過度表現CD40L、GM-CSF及IL-12。當脫離在100% A1-XFR培養基中生長時細胞增殖穩定，其中與在含FBS之培養基中生長的未經修飾之親本細胞之40.0小時相比，倍增時間為674.2小時(表123)。當在4-6週過程中脫離在100% A2-XFR培養基中生長時，倍增時間為303.8小時(表4)。對適應在A1-XFR及A2-XFR培養基中生長之經修飾之KNS-60細胞的分析顯示，表現CD40L，且偵測到IL-12之分泌且定量為700.0奈克/106 /24小時(A1W)及482.2奈克/106 /24小時(A2W)，偵測到GM-CSF之分泌且定量為182.5奈克/106 /24小時(A1W)及156.9奈克/106 /24小時(A2W)，且與在FBS中生長之未經修飾之親本細胞相比TGFβ1含量減少83.2%(A1W)及87.7%(A2W)且TGFβ2含量減少92.6%(A1W)及94.7%(A2W)。未經修飾之KNS-60細胞不表現CD40L或產生IL-12或GM-CSF。
用於適應過程之SF-126細胞經修飾以表現減少含量之TGFβ1及TGFβ2且過度表現CD40L、GM-CSF及IL-12。當脫離在100% A1-XFR培養基中生長時細胞增殖穩定，其中與在含FBS之培養基中生長的未經修飾之親本細胞之28.3小時相比，倍增時間為172.1小時(表123)。當在4-6週過程中脫離在100% A2-XFR培養基中生長時，倍增時間為456.6小時(表4)。對適應在A1-XFR及A2-XFR培養基中生長之經修飾之SF-126細胞的分析顯示，表現CD40L，且偵測到IL-12之分泌且定量為671.2奈克/106 /24小時(A1W)及684.9奈克/106 /24小時(A2W)，偵測到GM-CSF之分泌且定量為51.2奈克/106 /24小時(A1W)及39.3奈克/106 /24小時(A2W)，且與在FBS中生長之未經修飾之親本細胞相比TGFβ1含量減少86.9%(A1W)及91.2%(A2W)且TGFβ2含量減少80.4%(A1W)及98.8%(A2W)。未經修飾之SF-126細胞不表現CD40L或產生IL-12或GM-CSF。
總之，所有五種經修飾之GBM疫苗組分細胞株均穩定地適應無異種培養基調配物。細胞以穩定速率增殖，維持插入之轉殖基因之表現且亦保留TGFβ1及TGFβ2之減少。表 123 ：疫苗組分細胞株在含 FBS 之培養基及無異種培養基中之倍增時間
細胞株 親本細胞株之 DT [ 小時 ] DT [ 小時 ] A1 培養基，直接 (A1D) DT [ 小時 ] A1 培養基，脫離 (A1W) DT [ 小時 ] A2 培養基，脫離 (A2W)
DBTRG-05MG 38.3 n/a 586.8 n/a
LN-229 34.5 59.7 n/a 71
GB1 37.9 144.1 597.2 266.8
KNS-60 40 n/a 674.2 303.8
SF-126 28.3 n/a 172.1 456.6
DT：倍增時間；DT表示根據轉化報導之平均值
實例 38 ： NSCLC 疫苗組分細胞株適應無異種培養基中之生長 適應過程概述
將NSCLC疫苗組合物之六種組分細胞株(NCI-H23、A549、NCI-H460、DMS 53、LK-2及NCI-H520)相繼適應在無異種、無血清及缺乏非人類要素之培養基中生長。對於六種細胞株中之每一者，測試四種無異種培養基調配物。培養基調配物為KSC pH 7.2、KSC pH 6.8、KSR pH 7.2及KSR pH 6.8。亦維持細胞在常規培養基中之其他對照條件，該常規培養基由補充有10% FBS、L-麩醯胺酸、丙酮酸鈉及HEPES之RPMI構成。各無異種培養基調配物由不同基礎培養基(KSC或KSR)與作為無異種血清替代品之10%人類血清白蛋白(HSA)構成且添加抗生素至培養基以維持插入之轉殖基因的表現，如表124中所示。因為無異種培養基之總蛋白含量與含有FBS之培養基之總蛋白含量相當，所以使用選擇之抗生素含量與基於FBS之培養基中相同。另外，各培養基調配物在兩種氧含量下測試-正常21%氧及低3%氧。為證實適應無異種培養基調配物，觀測細胞在測試培養基中增殖之能力。終止基於目測到非黏附漂浮物而顯示細胞死亡的條件，該漂浮物在用活力染料染色時無活性。收穫具有類似於對照FBS孔之形態、在XF培養基中穩定生長及進行抗生素選擇至少3週之細胞，且分析插入之轉殖基因之表現。表 124 用於選擇插入之轉殖基因的 NSCLC 抗生素濃度
細胞株 Puro* Blast* Hygro* Neo* Zeo*
NCI-H23 1 2 300 600 50
A549 1 2 800 600 1200
NCI-H460 1 2 300 600 1200
DMS 53 n/a 4 200 600 n/a
LK-2 1 2 200 200 n/a
NCI-H520 1 2 300 600 n/a
*所有選擇抗生素濃度均以µg/mL為單位。n/a，細胞株不使用選擇抗生素。Puro，嘌呤黴素。Blast，殺稻瘟菌素(Blasticidin)。Hygro，潮黴素。Neo，新黴素(Neomycin，G418)。Zeo，博萊黴素(Zeocin)。
在無異種培養基中生長之細胞株中之轉殖基因表現的分析
針對在4種培養基調配物及2種氧含量中生長，篩選六種疫苗組分細胞株每一者。針對轉殖基因之表現，分析顯示穩定細胞生長、最小細胞死亡及形態與在FBS中生長之細胞相當的條件。使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)量測分泌之細胞介素。簡言之，對於各樣品，對上清液進行二-四倍稀釋，且所示資料為所測試之所有條件之平均值，針對稀釋因子及細胞計數正規化。使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)(R&D Systems)測定TGFβ1及TGFβ2含量。TGFβ1及TGFβ2分泌以皮克/毫升/106 個細胞為單位報導。使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)，分別利用來自R&D Systems及Biolegend之套組來測定GM-CSF及IL-12含量。GM-CSF及IL-12分泌含量以奈克/毫升/106 個細胞為單位報導。藉由流動式細胞測量術評估CD40L之表現。簡言之，在收穫之後，將細胞用藻紅素結合之抗人類CD40L(純系TRAP1)染色。藉由流動式細胞測量術，使用LSR Fortessa流式細胞儀分析經標記之細胞。在適應無異種培養基之後個別細胞株中之轉殖基因表現的結果
NCI-H23細胞顯示在處理培養基4(KSR pH 7.2)及5(KSR pH 6.8)中在正常21%氧條件下穩定生長。細胞在其他處理條件下無法增殖。發現表面蛋白質CD40L之表現穩定，且表現量與在FBS中生長之細胞相當。與FBS相比，發現在無異種培養基調配物中IL-12及GM-CSF之分泌分別增加1.7倍(IL-12培養基4及5)及2.3倍(GM-CSF培養基4及5)。與含FBS之培養基中之細胞相比，發現在XF培養基中TGFβ1及TGFβ2之減少更大，其中在培養基4中TGFβ1之含量小10倍且在培養基5中小7倍，而在XF培養基中TGFβ2無法偵測到。
A549細胞顯示在處理培養基4(KSR pH 7.2)及5(KSR pH 6.8)中在正常21%氧下以及在處理培養基5中在低3%氧條件下穩定生長。細胞在其他處理條件下無法增殖。發現表面蛋白質CD40L之表現穩定，且表現量與在FBS中生長之細胞相當。
發現在無異種培養基4中在正常21%氧下生長，IL-12之分泌與FBS相當，在培養基5中在正常21%氧條件下增加1.6倍，且在培養基5中在低3%氧條件下減少0.6倍。發現在無異種培養基4中在正常21%氧下生長，GM-CSF之分泌與FBS相當，在培養基5中在正常21%氧條件下增加1.4倍，且在培養基5中在低3%氧條件下減少0.6倍。與在含FBS之培養基中之細胞相比，發現在XF培養基中TGFβ1及TGFβ2之減少更大，其中在培養基4中在正常21%氧下TGFβ1含量小3.4倍，且在培養基5中在正常21%氧下小3.1倍，且在培養基5中在低3%氧下小2倍，而在培養基4中在正常21%氧下TGFβ2減少2.2倍，且在XF培養基5中在低3%或正常21%氧條件下無法偵測到。
NCI-H460細胞顯示在處理培養基4(KSR pH 7.2)及5(KSR pH 6.8)中在正常21%氧條件下穩定生長。細胞在其他處理條件下無法增殖。發現表面蛋白質CD40L之表現穩定，且表現量與在FBS中生長之細胞相當。與FBS相比，發現在無異種培養基調配物中IL-12之分泌增加，在培養基4中3.2倍及在培養基5中1.7倍。在無異種培養基中GM-CSF亦增加，在培養基4中3.5倍及在培養基5中1.8倍。與含FBS之培養基中之細胞相比，發現在XF培養基中TGFβ1及TGFβ2之減少更大，其中在XF培養基4及5中TGFβ1含量無法偵測到且在培養基4中TGFβ2減少1.6倍且在培養基5中減少3.4倍。
DMS 53細胞顯示在處理培養基4(KSR pH 7.2)及5(KSR pH 6.8)中在正常21%氧條件下穩定生長。細胞在其他處理條件下無法增殖。發現表面蛋白質CD40L之表現穩定，且表現量與在FBS中生長之細胞相當。在無異種培養基中GM-CSF分泌亦增加，在培養基4中3.5倍及在培養基5中1.8倍。與在含FBS之培養基中之細胞相比，發現在XF培養基4中TGFβ2含量大1.2倍，而在培養基5中減少1.8倍。細胞株不經修飾成過度表現IL-12或TGFβ1含量降低。
LK-2細胞顯示在處理培養基4(KSR pH 7.2)及5(KSR pH 6.8)中在正常21%氧條件下穩定生長。細胞在其他處理條件下無法增殖。發現表面蛋白質CD40L之表現穩定，且表現量與在FBS中生長之細胞相當。在無異種培養基中GM-CSF分泌亦增加，在培養基4中2.8倍及在培養基5中3.1倍。與含FBS之培養基中之細胞相比，在無異種培養基中TGFβ1含量無法偵測到，且在培養基4中TGFβ2含量減少6倍及在培養基5中減少2.3倍。細胞株不經修飾成過度表現IL-12。
NCI-H520細胞顯示在處理培養基4(KSR pH 7.2)及5(KSR pH 6.8)中在正常21%氧下以及在低3%氧條件下穩定生長。細胞在其他處理條件下無法增殖。發現表面蛋白質CD40L之表現穩定，且表現量與在FBS中生長之細胞相當。在無異種培養基4及5中在正常21%條件下生長，GM-CSF分泌分別增加1.5及1.3倍。在低3%氧條件下生長之細胞中GM-CSF分泌亦增加，在培養基4中2.1倍及在培養基5中2.2倍。在培養基4及5中在正常21%氧下TGFβ1分泌增加10倍，而當細胞在低3%氧下生長時無法偵測到。在培養基4及5中在正常21%氧下TGFβ2分泌減少3倍及1.2倍，而當細胞在低3%氧下生長時無法偵測到。細胞株不經修飾成過度表現IL-12。
總之，所有六種經修飾之NSCLC疫苗組分細胞株穩定地適應無異種培養基條件。細胞保留TGFβ1及TGFβ2分泌之減少，且與在FBS中生長之經修飾之細胞相比，發現在無異種調配物中GM-CSF及IL-12之分泌相當或增加。在所有測試條件下，偵測到與在FBS中生長之細胞類似的表面蛋白質CD40L之表現量。實例 39 ：同種異體腫瘤細胞疫苗平台
本實例提供使用多種同種異體腫瘤細胞疫苗治療及/或預防癌症及/或刺激免疫反應之組合物和方法。鑒於本文提供之傳授內容，在一些實施例中，本揭示案涵蓋以下細胞株組合及修飾。亦考慮其他實施例(例如如本文所提供之替代細胞株及/或修飾)。表 125. 小細胞肺癌疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.DMS 114 x ND x x * * **
2.NCI-H196 x x x x * * **
3.NCI-H1092 ND x x x * * **
4.SBC-5 x ND x x * * **
5.NCI-H510A x x x x * * **
6.NCI-H889 x x x x * * **
7.NCI-H1341 x ND x x * * **
8.NCIH-1876 x x x x * * **
9.NCI-H2029 ND x x x * * **
10.NCI-H841 x ND x x * * **
11.NCI-H1694 x ND x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，小細胞肺癌疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：MAGEA1及DLL3。表 126. 肝癌疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.Hep-G2 x ND x x * * **
2.JHH-2 x x x x * * **
3.JHH-4 x x x x * * **
4.JHH-6 x x x x * * **
5.Li7 x x x x * * **
6.HLF x x x x * * **
7.HuH-6 x ND x x * * **
8.JHH-5 x x x x * * **
9.HuH-7 x x x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，肝癌疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：CEA(CEACAM5)、MAGEA1、WT1及PSMA(FOLH1)。表 127. 腎癌疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.A-498 x x x x * * **
2.A-704 x x x x * * **
3.769-P x ND x x * * **
4.786-O x x x x * * **
5.ACHN x x x x * * **
6.KMRC-1 x x x x * * **
7.KMRC-2 x x x x * * **
8.VMRC-RCZ x x x x * * **
9.VMRC-RCW x x x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，腎癌疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：MAGEA1、DLL3、CEA(CEACAM5)及PSMA(FOLH1)表 128. 胰臟癌疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.PANC-1 x x x x * * **
4.KP-3 x x x x * * **
5.KP-4 x ND x x * * **
7.SUIT-2 x x x x * * **
8.AsPC-1 x x x x * * **
9.PSN1 x x x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，胰臟癌疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：PSMA(FOLH1)、BORIS(CTCFL)、DLL3表 129. 食道癌疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.TE-10 x x x x * * **
2.TE-6 x x x x * * **
3.TE-4 x x x x * * **
4.EC-GI-10 x x x x * * **
5.OE33 x x x x * * **
6.TE-9 x x x x * * **
7.TT x ND x x * * **
8.TE-11 x x x x * * **
9.OE19 x ND x x * * **
10.OE21 x x x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，食道癌疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：WT1及PSMA(FOLH1)。表 130. 子宮內膜癌疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.SNG-M x ND x x * * **
2.HEC-1-B x ND x x * * **
3.JHUEM-3 x x x x * * **
4.RL95-2 ND ND x x * * **
5.MFE-280 x ND x x * * **
6.MFE-296 x x x x * * **
7.TEN x ND x x * * **
8.JHUEM-2 x ND x x * * **
9.AN3-CA ND x x x * * **
10.石川 x x x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，子宮內膜癌疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：BORIS(CTCFL)、WT1、PSMA(FOLH1)表 131. 黑色素瘤癌症疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.RPMI-7951 x x x x * * **
2.MeWo x ND x x * * **
3.Hs 688(A).T x ND x x * * **
4.COLO 829 x ND x x * * **
5.C32 x x x x * * **
6.A-375 x ND x x * * **
7.Hs 294T x x x x * * **
8.Hs 695T x ND x x * * **
9.Hs 852T x ND x x * * **
10.A2058 x ND x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，黑色素瘤癌症疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：MART-1(MLANA)、TYRP1及PSMA(FOLH1)表 132. 間皮瘤癌症疫苗
細胞株 TGFβ1 KD TGFβ2 KD CD276 KO CD40L GM-CSF IL-12 TAAs
1.NCI-H28 x ND x x * * **
2.MSTO-211H x ND x x * * **
3.IST-Mes1 x x x x * * **
4.ACC-MESO-1 x x x x * * **
5.NCI-H2052 x x x x * * **
6.NCI-H2452 x ND x x * * **
7.MPP 89 x x x x * * **
8.IST-Mes2 x ND x x * * **
DMS 53 ND x x x x x ND
ND = 未進行 * = 在一些實施例中，一或多種細胞株將經轉導以產生至少15,000奈克GM-CSF/混合物及至少4,000奈克IL-12/混合物 ** = 在一些實施例中，間皮瘤癌症疫苗將經修飾以表現以下TAA中之一或多種：WT1、BORIS(CTCFL)及MAGEA1。實例 40 ：藉由引入非同義突變 (NSM) 至優先全長腫瘤相關抗原 (TAA) 中來改善疫苗誘導之細胞免疫反應之廣度及量值
經由誘導抗腫瘤細胞免疫之癌症免疫療法已變成靶向癌症之一種有前景之方法。許多治療性癌症疫苗平台靶向在腫瘤細胞中過度表現之腫瘤相關抗原(TAA)，然而，使用此等抗原之癌症疫苗必須足夠有效以打破耐受性。在本文中之各種實施例中描述的癌症疫苗經設計以能夠引發廣泛且穩固之針對腫瘤之細胞反應。新抗原決定基為由在腫瘤生長期間出現之體細胞突變產生的非自身抗原決定基。具有較高突變負荷之腫瘤類型對檢查點抑制劑療法起反應而與持久臨床益處相關。靶向新抗原決定基具有許多優點，因為此等新抗原決定基真正為腫瘤特異性的且不受胸腺中之中央耐受性影響。編碼具有由非同義突變(NSM)產生之新抗原決定基之全長TAA的癌症疫苗可能引發更有效免疫反應且改善廣度及量值。抗原設計過程 TAA選擇及優先化
TAA為自身抗原，其在腫瘤中優先或異常表現，但亦可在正常細胞中以一定水準表現。如本文所述，選擇及優先化TAA作為疫苗目標為癌症疫苗研發之關鍵步驟。多個標準用於TAA評估及選擇。首先，鑑別TAA且分為多個類別，包括： A. 增殖 B. 黏附、遷移及轉移 C. 血管生成 D. 癌症幹細胞目標 E. 未知功能
另外，評估各組中TAA之組織特異性且確定過度表現各TAA之腫瘤樣品之百分比。只要適用，較佳使用由IHC量測之蛋白質表現資料。在沒有可利用之表現資料下，收集來自The Human Protein Atlas之表現資料。最後，優先考慮各組中之TAA，且基於所述標準選擇TAA。作為實例，下表133中概述在TAA選擇及優先化之後的GBM TAA。 表133：GBM優先TAA
Figure 02_image001
組分腫瘤細胞株之表現概況及用於設計及插入之TAA鑑別
為確定所選優先TAA是否需要在構成疫苗組合物之組分細胞株中過度表現，創建針對各適應症之所有組分細胞株之表現概況以確定是否能夠發現所選TAA在此等細胞株中之內源性表現。使用在2019年10月7日至2020年5月20日之間自可公開獲得之癌細胞株百科全書(CCLE)資料庫下載的RNA-seq資料確定潛在組分細胞株中TAA之表現(www.broadinstitute.org/ccle；Barretina, J等人 《自然》.2012.)。HUGO基因命名委員會基因符號輸入至CCLE中且針對各TAA下載mRNA表現。若RNA-seq值(FPKM)超過0，則TAA表現視為陽性。在優先TAA當中，鑑別出不由任何細胞株表現或僅由構成細胞株治療組合之一種細胞株表現的TAA用於設計及插入。當抗原由超過一種細胞株表現但其RNA表現量僅在一種細胞株中超過1.0 FPKM時，亦可選擇其用於設計及插入。多種GBM細胞株之TAA表現概況(熱圖)之一實例在圖78中示出。
使用圖78中之資料測定表66中列出之優先TAA在GBM細胞株中的表現。如圖78中所指示，無細胞株展現陽性hTERT或PSMA表現(hTERT及PSMA之RNA-seq值均呈陰性)，而GB49為唯一表現MAGE-A1之細胞株。因此，在所選GBM細胞株中進行hTERT、PSMA及MAGE-A1之設計/增強及過度表現。 抗原設計方法
在選擇需要過度表現之TAA之後，為增加抗原特異性細胞免疫反應之廣度及量值，利用多階段設計策略來產生具有在癌症患者中經常出現之非同義突變的經修飾之TAA。
在2020年2月23日與2020年6月2日之間自以下可公開獲得之資料庫下載患者腫瘤樣品資料：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami, E.等人 《癌症研究》2012.；Gao, J.等人 《科學信號》2013.)。使用「精選之非冗餘研究集」資料集，且其含有176個研究，對來自44,354名癌症患者之46,706個腫瘤樣品進行全外顯子或轉錄組定序。表134列出名稱、原發性腫瘤之部位、樣品數目及所查詢176個研究之cBioPortal文獻引用。 表134.
研究名稱 癌症類型 / 原發器官部位 樣品數目 cBioPortal 研究引用
腺樣囊性癌項目 腎上腺 1049 多研究所，2019
腎上腺皮質癌 腎上腺 92 TCGA，《泛癌症圖譜(PanCancer Atlas)》
壺腹癌 乏特氏壺腹(Ampulla of Vater) 160 Baylor，《細胞報導(Cell Reports)》2016
膽管癌 膽道 15 National Cancer Center of Singapore，《自然-遺傳學》2013
膽管癌 膽道 8 National University of Singapore，《自然-遺傳學》2013
膽管癌 膽道 36 TCGA，《泛癌症圖譜》
肝內膽管癌 膽道 40 JHU，《自然-遺傳學》2013
肝內膽管癌 膽道 103 Shanghai，《自然-通訊(Nat Commun)》2014
膽囊癌 膽道 32 Shanghai，《自然-遺傳學》2014
膀胱癌 膀胱/尿道 109 MSKCC，《歐洲泌尿科(Eur Urol)》2014
膀胱癌 膀胱/尿道 97 MSKCC，《臨床腫瘤學雜誌(J Clin Onco)》2013
膀胱尿道上皮癌 膀胱/尿道 99 BGI，《自然-遺傳學》2013
膀胱尿道上皮癌 膀胱/尿道 50 DFCI/MSKCC 《癌症發現》 2014
膀胱尿道上皮癌 膀胱/尿道 411 TCGA，《泛癌症圖譜》
尿道上皮癌 膀胱/尿道 72 Cornell/Trento，《自然-遺傳學》2016
上尿道上皮癌 膀胱/尿道 85 MSK，《歐洲泌尿科》2015
上尿道上皮癌 膀胱/尿道 47 Cornell/Baylor/MDACC，《自然-通訊》2019
尤文氏肉瘤(Ewing Sarcoma) 骨 112 Institute Curie，《癌症發現》2014
兒科尤文氏肉瘤 骨 107 DFCI，《癌症發現》2014
大腸直腸腺癌 腸 619 DFCI，《細胞報導》2016
大腸直腸腺癌 腸 74 Genentech，《自然》2012
大腸直腸腺癌 腸 594 TCGA，《泛癌症圖譜》
大腸腺癌三聯體 腸 138 MSKCC，《基因體生物學(Genome Biol )》2014
結腸腺癌 腸 29 CaseCCC，《美國國家科學院院刊(PNAS)》2015
結腸癌 腸 110 CPTAC-2 《細胞展望(Prospective, Cell)2019
乳房纖維上皮腫瘤 乳房 22 Duke-MUS，《自然-遺傳學》2015
乳癌 乳房 2509 METRABRIC，《自然》2012與《自然通訊》2016
乳癌 乳房 70 MSKCC，2019
乳房侵襲性癌瘤 乳房 65 British Columbia，《自然》2012
乳房侵襲性癌瘤 乳房 103 Broad，《自然》2012
乳房侵襲性癌瘤 乳房 100 Sanger，《自然》2012
乳房侵襲性癌瘤 乳房 1084 TCGA，《泛癌症圖譜》
轉移性乳癌 乳房 216 INSERM，《公共科學圖書館：醫學(PLoS Med)》2016
轉移性乳癌項目 乳房 237 MBCP臨時數據集，2020年2月
乳房腺樣囊性癌 乳房 12 MSKCC，《病理學雜誌(J Pathol)》2015
腦低級別神經膠質瘤 CNS/腦 514 TCGA，《泛癌症圖譜》
神經膠質瘤 CNS/腦 91 MSK，2018
低級別神經膠質瘤 CNS/腦 61 UCSF，《科學》2014
多形性膠質母細胞瘤 CNS/腦 592 TCGA，《泛癌症圖譜》
神經管胚細胞瘤 CNS/腦 92 Broad，《自然》2012
神經管胚細胞瘤 CNS/腦 37 PCGP，《自然》2012
神經管胚細胞瘤 CNS/腦 46 Sickkids，《自然》2016
子宮頸鱗狀細胞癌 子宮頸 297 TCGA，《泛癌症圖譜》
食道鱗狀細胞癌 食道/胃 88 ICGC，《自然》2014
食道鱗狀細胞癌 食道/胃 139 UCLA，《自然-遺傳學》2014
胃腺癌 食道/胃 78 TMUCIH，《美國國家科學院院刊》2015
食道腺癌 食道/胃 151 DFCI，《自然-遺傳學》2013
食道腺癌 食道/胃 182 TCGA，《泛癌症圖譜》
胃腺癌 食道/胃 100 Pfizer及UHK，《自然-遺傳學》2014
食道腺癌 食道/胃 440 TCGA，《泛癌症圖譜》
食道腺癌 食道/胃 30 U Tokyo，《自然-遺傳學》2014
葡萄膜黑色素瘤 眼睛 28 QIMR，《腫瘤目標(Oncotarget)》2016
葡萄膜黑色素瘤 眼睛 80 TCGA，《泛癌症圖譜》
頭頸部鱗狀細胞癌 頭頸 74 Broad，《科學》2011
頭頸部鱗狀細胞癌 頭頸 32 Johns Hopkins，《科學》2011
頭頸部鱗狀細胞癌 頭頸 523 TCGA，《泛癌症圖譜》
口腔鱗狀細胞癌 頭頸 40 MD Anderson，《癌症發現》2013
鼻咽癌 頭頸 56 Singapore，《自然-遺傳學》2014
腺樣囊性癌 頭頸 28 FMI，《美國外科病理學雜誌(Am J Surg Pathl)》2014
腺樣囊性癌 頭頸 25 JHU，《癌症預防研究》2016
腺樣囊性癌 頭頸 102 MDA，《臨床癌症研究》2015
腺樣囊性癌 頭頸 10 MGH，《自然-遺傳學》2016
腺樣囊性癌 頭頸 60 MSKCC，《自然-遺傳學》2013
腺樣囊性癌 頭頸 24 Sanger/MDA，《美國醫學會雜誌》2013
透明細胞腎細胞癌 腎 35 DFCI，《科學》2019
腎部腎透明細胞癌 腎 98 BGI，《自然-遺傳學》2012
腎部腎透明細胞癌 腎 78 IRC，《自然-遺傳學》2014
腎部腎透明細胞癌 腎 512 TCGA，《泛癌症圖譜》
腎透明細胞癌 腎 106 U Tokyo，《自然-遺傳學》2013
腎嫌色細胞癌 腎 65 TCGA，《泛癌症圖譜》
腎部腎乳頭狀細胞癌 腎 283 TCGA，《泛癌症圖譜》
腎非透明細胞癌 腎 146 Genentech，《自然-遺傳學》2014
未分類之腎細胞癌 腎 62 MSK，《自然》2016
兒科橫紋肌瘤 腎 72 TARGET，2018
橫紋肌樣癌 腎 40 BCGSC，《癌細胞》2016
兒科威爾姆斯氏瘤(Wilms' Tumor) 腎 657 TARGET，2018
肝細胞腺瘤 肝 46 INSERM，《癌細胞》2014
肝細胞癌 肝 243 INSERM，《自然-遺傳學》2015
肝部肝腺瘤及癌瘤 肝 19 MSK，《公共科學圖書館：綜合(PLoS One)》2018
肝細胞癌 肝 231 AMC，《肝臟學》2014
肝細胞癌 肝 27 RIKEN，《自然-遺傳學》2012
肝細胞癌 肝 372 TCGA，《泛癌症圖譜》
胸腔PDX 肺 139 MSK，臨時
小細胞肺癌 肺 80 Johns Hopkins，《自然-遺傳學》2012
小細胞肺癌 肺 110 U Cologne，《自然》2015
小細胞肺癌 肺 20 多機構，《癌細胞》2017
非小細胞肺癌 肺 75 MSK，《癌細胞》2018
非小細胞肺癌 肺 327 TRACERx，《新英格蘭醫學雜誌(NEJM)》2017
非小細胞肺癌 肺 41 University of Turin，《肺癌(Lung Cancer)》 2017
肺腺癌 肺 183 Broad，《細胞(Cell)》2012
肺腺癌 肺 566 TCGA，《泛癌症圖譜》
肺腺癌 肺 163 TSP，《自然》2008
肺鱗狀細胞癌 肺 487 TCGA，《泛癌症圖譜》
急性淋巴白血病 淋巴 73 St. Jude，《自然-遺傳學》，2016
兒科急性淋巴白血病-II期 淋巴 1978 TARGET，2018
慢性淋巴球性白血病 淋巴 160 Broad，《細胞》2013
慢性淋巴球性白血病 淋巴 537 Broad，《自然》2015
慢性淋巴球性白血病 淋巴 506 IUOPA，《自然》2015
慢性淋巴球性白血病 淋巴 105 ICGC，《自然-遺傳學》2011
皮膚T細胞淋巴瘤 淋巴 43 Columbia U，《自然-遺傳學》2015
彌漫性大B細胞淋巴瘤 淋巴 135 DFCI，《自然-醫學(Nat Med)》2018
彌漫性大B細胞淋巴瘤 淋巴 1001 Duke，《細胞》2017
彌漫性大B細胞淋巴瘤 淋巴 48 TCGA，《泛癌症圖譜》
彌漫性大B細胞淋巴瘤 淋巴 53 BCGSC，《血液》2013
套細胞淋巴瘤 淋巴 29 IDIBIPS，《美國國家科學院院刊》2013
多發性骨髓瘤 淋巴 211 Broad，《癌細胞》2014
非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma) 淋巴 14 BCGSC，《自然》2011
原發性中樞神經系統淋巴瘤 淋巴 19 Mayo Clinic，《臨床癌症研究》2015
急性骨髓性白血病或骨髓化生不良症候群 骨髓 136 WashU，2016
急性骨髓性白血病 骨髓 672 OHSU，《自然》2018
急性骨髓性白血病 骨髓 200 TCGA，《泛癌症圖譜》
兒科急性骨髓性白血病 骨髓 1025 TARGET，2018
組織細胞增多病考比替尼(Cobimetinib) 骨髓 52 MSK，2019
骨髓化生不良 骨髓 29 UTokyo，《自然》2011
骨髓增生性贅瘤 骨髓 151 CIMR，《新英格蘭醫學雜誌》2013
MSK-IMPACT 混合癌症類型 10,945 MSKCC，《自然-醫學》2017
MSS混合實體腫瘤 混合癌症類型 249 Broad/Dana-Farber，《自然-遺傳學》2018
轉移性實體癌 混合癌症類型 500 UMich，《自然》2017
兒科泛癌 混合癌症類型 961 DKFZ，《自然》2017
兒科泛癌 混合癌症類型 103 Columbia U，《基因體醫學(Genome Med )》2016
兒科臨床前測試聯盟 混合癌症類型 261 Maris，2019
SUMMIT-奈拉替尼籃式研究(Neratinib Basket Study) 混合癌症類型 141 多機構，《自然》2018
卵巢漿液性膀胱腺癌 卵巢/輸卵管 585 TCGA，《泛癌症圖譜》
卵巢小細胞癌 卵巢/輸卵管 12 MSKCC，《自然-遺傳學》2014
胰臟腺泡細胞癌 胰臟 23 JHU，《病理學雜誌》2014
胰臟囊性腫瘤 胰臟 32 Johns Hopkins，《美國國家科學院院刊》2011
胰腺癌 胰臟 456 QCMG，《自然》2016
胰腺癌 胰臟 184 TCGA，《泛癌症圖譜》
胰臟癌 胰臟 109 UTSW，《自然-通訊》2015
胰島素瘤 胰臟 10 Shanghai，《自然-通訊》2013
胰臟神經內分泌腫瘤 胰臟 10 Johns Hopkins，《科學》2011
胰臟神經內分泌腫瘤 胰臟 98 多機構，《自然》2017
惡性周邊神經鞘瘤 周邊神經 15 MSKCC，《自然-遺傳學》2014
神經母細胞瘤 周邊神經 87 AMC Amsterdam，《自然》2012
神經母細胞瘤 周邊神經 56 Broad，《自然》2015
兒科神經母細胞瘤 周邊神經 1089 TARGET，2018
間皮瘤 胸膜 87 TCGA，《泛癌症圖譜》
胸膜間皮瘤 胸膜 22 NYU，《癌症研究》2015
前列腺癌 前列腺 18 MSK，2019
轉移性前列腺腺癌 前列腺 61 MCTP，《自然》2012
轉移性前列腺腺癌 前列腺 444 SU2C/PCF Dream Team，《美國國家科學院院刊》2019
神經內分泌前列腺癌 前列腺 114 多機構，《自然-醫學》2016
前列腺腺癌 前列腺 112 Broad/Cornell，《自然-遺傳學》2012
前列腺腺癌 前列腺 176 Fred Hutchinson CRC，《自然-醫學》2016
前列腺腺癌 前列腺 240 MSKCC，《癌細胞》2010
前列腺腺癌 前列腺 65 SMMU，《歐洲泌尿科》2017
前列腺腺癌 前列腺 494 TCGA，《泛癌症圖譜》
前列腺腺癌類器官 前列腺 12 MSKCC，《細胞》2014
轉移性前列腺癌項目 前列腺 75 臨時，2019年11月
底細胞癌 皮膚 293 UNIGE，《自然-遺傳學》2016
皮膚鱗狀細胞癌 皮膚 29 DFCI，《臨床癌症研究》2015
皮膚鱗狀細胞癌 皮膚 39 MD Anderson，《臨床癌症研究》2014
肢端黑色素瘤 皮膚 38 TGEN，《基因體研究》2017
轉移性黑色素瘤 皮膚 38 UCLA，《細胞》2016
黑色素瘤 皮膚 64 MSKCC，《新英格蘭醫學雜誌》2014
轉移性黑色素瘤 皮膚 110 DFCI，《科學》2015
轉移性黑色素瘤 皮膚 66 MSKCC，《臨床腫瘤學雜誌之精確腫瘤學(JCO Precis Oncol)》2017
皮膚之皮膚黑色素瘤 皮膚 121 Broad，《細胞》2012
皮膚之皮膚黑色素瘤 皮膚 448 TCGA，《泛癌症圖譜》
皮膚之皮膚黑色素瘤 皮膚 147 Yale，《自然-遺傳學》2012
皮膚之皮膚黑色素瘤 皮膚 78 Broad，《癌症發現》2014
促纖維增生性黑色素瘤 皮膚 20 Broad Institute，《自然-遺傳學》2015
嗜鉻細胞瘤及副神經節瘤 軟組織 178 TCGA，《泛癌症圖譜》
肉瘤 軟組織 216 MSKCC/Broad，《自然-遺傳學》2010
肉瘤 軟組織 255 TCGA，《泛癌症圖譜》
血管肉瘤項目 軟組織 48 臨時，2018年9月
橫紋肌肉瘤 軟組織 43 NIH，《癌症發現》2014
睾丸生殖細胞腫瘤 睾丸 149 TCGA，《泛癌症圖譜》
胸腺上皮腫瘤 胸腺 32 NCI，《自然-遺傳學》2014
胸腺瘤 胸腺 123 TCGA，《泛癌症圖譜》
甲狀腺癌 甲狀腺 500 TCGA，《泛癌症圖譜》
子宮體子宮內膜癌 子宮 529 TCGA，《泛癌症圖譜》
子宮癌肉瘤 子宮 22 Johns Hopkins，《自然-通訊》2014
子宮癌肉瘤 子宮 57 TCGA，《泛癌症圖譜》
子宮透明細胞癌 子宮 16 NIH，《癌症》2017
外陰鱗狀細胞癌 外陰/陰道 15 CUK，《實驗與分子醫學(Exp Mol Med)》2018
針對所關注之抗原，使用HUGO基因命名委員會基因符號查詢非冗餘資料集。下載目標抗原中發生之錯義突變，且按發生頻率分類。使用可公開獲得之NetMHCpan 4.0資料庫，鑑別出≥2個患者樣品中發生之錯義突變，且評估誘導新抗原決定基之潛力(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.0)(Jurtz V等人, 《免疫學雜誌(J Immunol.)》2017)。所包括之HLA超型為HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-A*26:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-B*27:05、HLA-B*39:01、HLA-B*40:01、HLA-B*58:01及HLA-B*15:01。 表135.
超型 代表
A01 HLA-A*01:01
A02 HLA-A*02:01
A03 HLA-A*03:01
A24 HLA-A*24:02
A26 HLA-A*26:01
B07 HLA-B*07:02
B08 HLA-B*08:01
B27 HLA-B*27:05
B39 HLA-B*39:01
B44 HLA-B*40:01
B58 HLA-B*58:01
B62 HLA-B*15:01
將強結合物之閾值設置為建議閾值0.5，此意謂預測秩%低於0.5之任何肽均將被標註為強結合物。將弱結合物之閾值設置為建議2.0，此意謂預測秩%低於2.0但高於0.5之任何肽均將被標註為弱結合物。
為確定將在≥2個患者樣品中出現之NSM引入人類天然抗原中是否會產生新抗原決定基或將弱結合物變為強結合物，首先使用人類天然TAA蛋白序列產生包括強結合物與弱結合物之HLA-A及HLA-B超型限制性9聚體抗原決定基的清單(清單#1)。接著，自人類天然抗原之5'端起始，藉由用NSM替換相同位置之天然殘基，將各特異性NSM引入人類天然抗原中。用NSM得到之抗原用於產生包括強結合物與弱結合物之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基之新清單(清單#2)。藉由比較清單#2與清單#1，計算新抗原決定基(強結合物及弱結合物)及消除之抗原決定基的數目。若一種特異性NSM之引入產生更多新抗原決定基，則此NSM將包括在人類天然TAA中。若一種特異性NSM之引入創建相同數目之新抗原決定基及消除之抗原決定基，但其將更多弱結合物變為強結合物，則仍決定將此NSM包括在人類天然TAA中。若兩種NSM之間的胺基酸殘基少於9個，則亦對每個個別NSM以及兩個NSM之組合進行評估。一旦評估完成，就進行序列比對以確定人類天然TAA與具有NSM之人類TAA之間的蛋白質序列一致性。若序列一致性低於90%，則僅包括在≥2個患者樣品中出現的會產生新抗原決定基或將弱結合物變為強結合物的NSM。
作為實例，使用上述方法設計具有NSM之PSMA。圖129示出人類天然PSMA(NCBI基因ID: 2346)與所設計之具有NSM之PSMA(modPSMA；SEQ ID NO: 38)之間的序列比對。NSM(在huPSMA與modPSMA之間不同的殘基)以灰色突出。huPSMA與modPSMA之間的序列一致性為96.4%。
表136中概述huPSMA及modPSMA之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對PSMA鑑別出49種出現≥2次之NSM，27種包括在modPSMA抗原序列中。與天然PSMA相比，modPSMA含有因NSM引入而產生之其他41種新抗原決定基。 表136.天然及設計(mod)PSMA中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 3 16 19 3 17 20
A02 6 11 17 6 13 19
A03 6 9 15 7 12 19
A24 7 12 19 8 14 22
A26 8 28 36 10 24 34
B07 6 9 15 9 8 17
B08 4 17 21 4 25 29
B27 5 16 21 8 16 24
B39 8 16 24 9 26 35
B44 5 12 17 7 13 20
B58 9 10 19 9 13 22
B62 10 15 25 11 17 28
總抗原決定基 77 171 248 91 198 289
表137中概述人類WT1(NCBI基因ID: 7490)及modWT1(SEQ ID NO: 81)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對WT1鑑別出46種出現≥2次之NSM，且28種包括在modWT1抗原序列中。與天然WT1相比，modWT1還含有因NSM引入而產生之其他33種新抗原決定基。 表137.天然及設計(mod)WT1中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 1 7 8 2 9 11
A02 3 3 6 3 5 8
A03 4 4 8 4 6 10
A24 0 5 5 0 7 7
A26 7 5 12 8 8 16
B07 3 11 14 2 15 17
B08 0 6 6 0 8 8
B27 4 6 10 4 6 10
B39 6 15 21 6 17 23
B44 1 10 11 2 11 13
B58 2 6 8 4 11 15
B62 6 6 12 6 10 16
總抗原決定基 37 84 121 41 113 154
表138中概述人類FSHR(NCBI基因ID: 2492)及modFSHR(SEQ ID NO: 95)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對FSHR鑑別出70種出現≥2次之NSM，且26種包括在modFSHR抗原序列中。與天然FSHR相比，modFSHR還含有因NSM引入而產生之47種新抗原決定基。 表138.天然及設計(mod)FSHR中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 4 12 16 5 17 22
A02 12 24 36 14 28 42
A03 7 7 14 8 8 16
A24 12 18 30 12 19 31
A26 10 15 25 10 21 31
B07 7 16 23 8 15 23
B08 7 28 35 9 27 36
B27 6 10 16 7 12 19
B39 17 23 40 19 30 49
B44 3 13 16 4 15 19
B58 6 24 30 6 26 32
B62 13 14 27 15 20 35
總抗原決定基 104 204 308 117 238 355
表139中概述人類TERT(NCBI基因ID: 7015)及modTERT(SEQ ID NO: 36)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對TERT鑑別出75種出現≥2次之NSM，且43種包括在modTERT抗原序列中。與天然TERT相比，modTERT還含有因NSM引入而產生之47種新抗原決定基。 表139.天然及設計(mod)TERT中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 4 15 19 4 15 19
A02 12 25 37 16 26 42
A03 9 18 27 9 19 28
A24 11 20 31 12 24 36
A26 9 21 30 10 24 34
B07 21 48 69 18 47 65
B08 28 39 67 30 42 72
B27 23 39 62 27 35 62
B39 24 43 67 22 59 81
B44 8 15 23 8 15 23
B58 10 16 26 10 18 28
B62 12 35 47 12 37 49
總抗原決定基 171 334 505 178 361 539
T表140中概述BORIS(NCBI基因ID: 140690)及modBORIS(SEQ ID NO: 60)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對BORIS鑑別出51種出現≥2次之NSM，且33種包括在modBORIS抗原序列中。與天然BORIS相比，modBORIS還含有因NSM引入而產生之27種新抗原決定基。 表140.天然及設計(mod)BORIS(CTCFL)中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 2 10 12 2 11 13
A02 0 5 5 1 4 5
A03 4 12 16 6 16 22
A24 2 4 6 5 3 8
A26 3 10 13 5 15 20
B07 1 10 11 2 9 11
B08 6 14 20 8 14 22
B27 1 10 11 1 13 14
B39 10 15 25 9 18 27
B44 9 16 25 6 18 24
B58 1 10 11 2 11 13
B62 4 13 17 4 16 20
總抗原決定基 43 129 172 51 148 199
表141中概述MSLN(NCBI基因ID: 10232)及modMSLN(SEQ ID NO: 62)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對MSLN鑑別出23種出現≥2次之NSM，且13種包括在modMSLN抗原序列中。與天然MSLN相比，modMSLN還含有因NSM引入而產生之23種新抗原決定基。 表141.天然及設計(mod)MSLN中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 3 10 13 3 12 15
A02 5 12 17 6 12 18
A03 4 6 10 4 6 10
A24 4 8 12 6 11 17
A26 11 14 25 11 14 25
B07 11 16 27 9 19 28
B08 5 13 18 6 13 19
B27 2 6 8 2 8 10
B39 12 18 30 12 20 32
B44 4 12 16 6 14 20
B58 3 7 10 3 12 15
B62 4 14 18 4 14 18
總抗原決定基 68 136 204 72 155 227
表142中概述TBXT(NCBI基因ID: 6862)及modTBXT(SEQ ID NO: 79)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對TBXT鑑別出44種出現≥2次之NSM，且16種包括在modTBXT抗原序列中。與天然TBXT相比，modTBXT還含有因NSM引入而產生之34種新抗原決定基。 表142.天然及設計(mod)TBXT中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 6 4 10 8 5 13
A02 4 5 9 4 9 13
A03 2 4 6 3 6 9
A24 5 6 11 5 7 12
A26 2 5 7 2 8 10
B07 5 14 19 4 12 16
B08 4 6 10 5 9 14
B27 5 2 7 6 3 9
B39 6 18 24 9 23 32
B44 3 7 10 4 6 10
B58 6 2 8 7 4 11
B62 4 12 16 8 14 22
總抗原決定基 52 85 137 65 106 171
表143中概述PRAME(NCBI基因ID: 23532)及modPRAME(SEQ ID NO: 99)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對PRAME鑑別出27種出現≥2次之NSM，且20種包括在modPRAME抗原序列中。與天然PRAME相比，modPRAME還含有因NSM引入而產生之35種新抗原決定基。 表143.天然及設計(mod)PRAME中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 5 14 19 5 14 19
A02 16 20 36 17 25 42
A03 5 14 19 5 14 19
A24 5 18 23 7 22 29
A26 2 20 22 3 23 26
B07 9 17 26 9 18 27
B08 13 33 46 17 37 54
B27 4 10 14 3 10 13
B39 13 23 36 16 24 40
B44 7 15 22 7 16 23
B58 2 19 21 1 21 22
B62 8 22 30 12 23 35
總抗原決定基 89 225 314 102 247 349
表144中概述TDGF1(NCBI基因ID: 6997)及modTDGF1(SEQ ID NO: 89)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對TDGF1鑑別出9種出現≥2次之NSM，且7種包括在modTDGF1抗原序列中。與天然TDGF1相比，modTDGF1還含有因NSM引入而產生之11種新抗原決定基。 表144.天然及設計(mod)TDGF1中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 0 1 1 0 1 1
A02 2 5 7 2 4 6
A03 1 1 2 1 1 2
A24 1 5 6 1 5 6
A26 0 7 7 2 6 8
B07 5 6 11 6 8 14
B08 2 11 13 3 10 13
B27 1 3 4 2 5 7
B39 2 4 6 2 7 9
B44 1 1 2 2 1 3
B58 2 6 8 2 7 9
B62 2 4 6 2 4 6
總抗原決定基 19 54 73 25 59 84
表145中概述FOLR1(NCBI基因ID: 2348)及modFOLR1(SEQ ID NO: 93)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對FOLR1鑑別出15種出現≥2次之NSM，且9種包括在modFOLR1抗原序列中。與天然FOLR1相比，modFOLR1還含有因NSM引入而產生之7種新抗原決定基。 表145.天然及設計(mod)FOLR1中之抗原決定基
HLA超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 1 4 5 0 5 5
A02 3 8 11 4 8 12
A03 2 2 4 3 4 7
A24 2 6 8 2 8 10
A26 1 4 5 1 5 6
B07 5 5 10 5 3 8
B08 5 5 10 4 4 8
B27 1 2 3 2 1 3
B39 5 6 11 5 8 13
B44 1 3 4 1 3 4
B58 7 9 16 7 11 18
B62 2 5 7 2 5 7
總抗原決定基 35 59 94 36 65 101
表146中概述CLDN18(NCBI基因ID: 51208)及modCLDN18(SEQ ID NO: 110)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對CLDN18鑑別出22種出現≥2次之NSM，且11種包括在modCLDN18抗原序列中。與天然CLDN18相比，modCLDN18還含有因NSM引入而產生之22種新抗原決定基。 表146.天然及設計(mod)CLDN18中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 5 3 8 5 3 8
A02 7 10 17 6 17 23
A03 3 6 9 4 4 8
A24 3 8 11 3 10 13
A26 9 13 22 9 17 26
B07 0 1 1 0 1 1
B08 0 3 3 0 5 5
B27 2 0 2 1 0 1
B39 2 6 8 2 8 10
B44 2 2 4 2 5 7
B58 7 6 13 6 10 16
B62 5 11 16 4 14 18
總抗原決定基 45 69 114 42 94 136
表147中概述Ly6K(NCBI基因ID: 54742)及modLy6K(SEQ ID NO: 112)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對Ly6K鑑別出9種出現≥2次之NSM，且7種包括在modLy6K抗原序列中。與天然Ly6K相比，modLy6K還含有因NSM引入而產生之6種新抗原決定基。 表147.天然及設計(mod)Ly6K中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 1 4 5 0 6 6
A02 6 3 9 6 2 8
A03 0 2 2 0 2 2
A24 0 5 5 1 7 8
A26 0 7 7 0 6 6
B07 2 2 4 3 1 4
B08 1 7 8 2 7 9
B27 2 1 3 2 1 3
B39 0 2 2 0 2 2
B44 1 2 3 1 1 2
B58 2 4 6 2 6 8
B62 1 8 9 1 10 11
總抗原決定基 16 47 63 18 51 69
表148中概述MAGEA10(NCBI基因ID: 4109)及modMAGEA10(SEQ ID NO: 97)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對MAGEA10鑑別出38種出現≥2次之NSM，且13種包括在modMAGEA10抗原序列中。與天然MAGEA10相比，modMAGEA10還含有因NSM引入而產生之29種新抗原決定基。 表148.天然及設計(mod)MAGEA10中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 7 13 20 7 15 22
A02 2 8 10 4 8 12
A03 2 6 8 2 9 11
A24 0 4 4 2 4 6
A26 4 12 16 4 15 19
B07 2 7 9 2 8 10
B08 2 3 5 2 5 7
B27 1 3 4 1 3 4
B39 4 12 16 5 17 22
B44 5 6 11 5 9 14
B58 0 13 13 2 14 16
B62 3 9 12 5 9 14
總抗原決定基 32 96 128 41 116 157
表149中概述MAGEC2(NCBI基因ID: 51438)及modMAGEC2(SEQ ID NO: 87)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對MAGEC2鑑別出45種出現≥2次之NSM，且8種包括在modMAGEC2抗原序列中。與天然MAGEC2相比，modMAGEC2還含有因NSM引入而產生之14種新抗原決定基。 表149.天然及設計(mod)MAGEC2中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 4 14 18 6 13 19
A02 9 10 19 8 11 19
A03 3 3 6 4 5 9
A24 5 13 18 5 14 19
A26 10 19 29 10 21 31
B07 5 15 20 5 14 19
B08 4 10 14 5 12 17
B27 2 0 2 3 1 4
B39 5 11 16 7 10 17
B44 7 13 20 7 12 19
B58 5 17 22 7 18 25
B62 8 12 20 8 12 20
總抗原決定基 67 137 204 75 143 218
表150中概述FAP(NCBI基因ID: 2191)及modFAP(SEQ ID NO: 115)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對FAP鑑別出59種出現≥2次之NSM，且25種包括在modFAP抗原序列中。與天然FAP相比，modFAP還含有因NSM引入而產生之22種新抗原決定基。 表150.天然及設計(mod)FAP中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 15 38 53 14 40 54
A02 11 14 25 16 13 29
A03 11 18 29 14 17 31
A24 12 36 48 15 36 51
A26 24 35 59 27 37 64
B07 7 13 20 7 11 18
B08 14 21 35 16 20 36
B27 9 13 22 9 12 21
B39 9 34 43 8 36 44
B44 6 15 21 6 15 21
B58 12 32 44 13 34 47
B62 17 28 45 17 33 50
總抗原決定基 147 297 444 162 304 466
表151中概述MAGEA1(NCBI基因ID: 4100)及modMAGEA1(SEQ ID NO: 73)之HLA-A及HLA-B超型限制性抗原決定基。針對MAGEA1鑑別出16種出現≥2次之NSM，且10種包括在modMAGEA1抗原序列中。與天然MAGEA1相比，modMAGEA1還含有因NSM引入而產生之7種新抗原決定基。 表151.天然及設計(mod)MAGEA1中之抗原決定基
HLA 超型 天然 設計
SB WB 總 SB WB 總
A01 5 7 12 6 6 12
A02 3 8 11 5 7 12
A03 2 3 5 2 4 6
A24 3 3 6 4 4 8
A26 2 13 15 3 16 19
B07 3 4 7 2 2 4
B08 3 4 7 3 3 6
B27 2 3 5 1 3 4
B39 2 8 10 2 10 12
B44 4 7 11 4 6 10
B58 2 11 13 2 12 14
B62 1 6 7 2 7 9
總抗原決定基 32 77 109 36 80 116
表152.設計(mod)抗原之天然序列
TAA 名稱 NCBI 基因符號 ( 基因 ID)
TERT TERT(7015)
PSMA(FOLH1) FOLH1(2346)
MAGE A1 MAGEA1(4100)
TBXT TBXT(6862)
BORIS CTCFL(140690)
FSHR FSHR(2492)
MAGEA10 MAGEA10(4109)
MAGEC2 MAGEC2(51438)
WT1 WT1(7490)
FBP FOLR1(2348)
TDGF1 TDGF1(6997)
緊密連接蛋白18 CLDN18(51208)
LY6K LY6K(54742)
間皮素 MSLN(10232)
FAP FAP(2191)
PRAME PRAME(23532)
下表描述GBM中示例性TAA組合之HLA-A及HLA-B超型的預測抗原決定基。PSMA(SEQ ID NO: 70)、modPSMA(SEQ ID NO: 38)、天然TERT(基因ID 7015)、modTERT(SEQ ID NO: 36)、天然MAGEA1(基因ID 4100)及modMAGEA1(SEQ ID NO: 73)之預測抗原決定基由HLA-A及HLA -B超型指示。表153證明設計抗原之組合產生總共82種新抗原決定基：modPSMA產生41種新抗原決定基，modTERT產生34種新抗原決定基且modMAGEA1產生7種新抗原決定基。圖130A展示在可自美國四個主要人種及種族普查類別之國家骨髓供體計劃資料庫(L Maiers, M.等人,(2007))中之供體獲得的28,034個高解析度HLA對偶基因及單純型頻率資料子集中HLA-A及HLA-B超型對之頻率。根據Lundt等人(2004)，HLA-A及HLA-B超型被分配給在各種族亞組中HLA-A及HLA-B單純型對之前第25百分位中出現的HLA-A及HLA-B對偶基因對(圖130B)。若HLA A或B單純型均未分類為超型，則其不包括在分析內(離群值)。在2020年3月15日自可公開獲得之資料庫下載HLA-A及HLA-B對之資料https://bioinformatics.bethematchclinical.org/hla-resources/haplotype-frequencies/high-resolution-hla-alleles-and-haplotypes-in-the-us-population/。若根據Lundt等人，資料集中之HLA-A或HLA-B對偶基因不屬於HLA-A及HLA-B超型，則自資料子集中排除其(圖130C)。 表153.
HLA 超型 PSMA TERT MAGE A1
天然 設計 天然 設計 天然 設計
A01 19 20 19 19 12 12
A02 17 19 37 42 11 12
A03 15 19 27 28 5 6
A24 19 22 31 36 6 8
A26 36 34 30 34 15 19
B07 15 17 69 65 7 4
B08 21 29 67 72 7 6
B27 21 24 62 62 5 4
B39 24 35 67 81 10 12
B44 17 20 23 23 11 10
B58 19 22 26 28 13 14
B62 25 28 47 49 7 9
總抗原決定基 248 289 505 539 109 116
在一例示性實施例中，表154中提供存在於疫苗組合物之細胞株中且藉由GBM中之設計誘導的新抗原決定基。 表154.
超 型 Mod PSMA Mod TERT Mod MAGE A1 LN 229 A 172 YKG1 KNS60 SF 126 DMS 53 設計總數 現有總數 總
A01 2 0 1 1 0 0 0 1 0 3 2 5
A02 2 5 1 0 0 1 1 0 0 8 2 10
A03 4 3 2 0 0 0 2 0 0 9 2 11
A24 3 5 2 1 0 1 0 0 2 10 4 14
A26 2 5 3 0 0 0 0 0 0 10 0 10
B07 2 2 2 0 1 0 0 1 2 6 4 10
B08 9 6 0 0 0 0 1 1 0 15 2 17
B27 4 3 0 0 0 0 0 0 0 7 0 7
B39 12 16 4 0 0 1 0 0 0 32 1 33
B44 3 1 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4
B58 3 2 0 1 0 1 0 0 0 5 2 7
B62 3 3 1 1 0 0 1 0 0 7 2 9
總 49 51 16 4 1 4 5 3 4 116 21 137
131示出存在於疫苗組合物之細胞株中且藉由GBM中之設計產生的新抗原決定基的數目，該等新抗原決定基由本文實例29中所述之群體子集內的表現HLA-A及HLA-B超型對的供體所識別。在四個種族亞群中識別出之新抗原決定基的中位數為20。
圖132描繪由四種不同mRNA免疫療法靶向之新抗原決定基之數目。一種mRNA免疫療法靶向總共34種新抗原決定基且其他三種mRNA療法靶向總共20種新抗原決定基。人類表現兩對HLA-A及HLA-B對偶基因。在疫苗組合物之細胞株中存在且由GBM中之設計產生的新抗原決定基中，在HLA-A3 HLA-B7及HLA-A1 HLA-B-8超型中表現HLA-A及HLA-B對偶基因對之示例性患者將識別的新抗原決定基數目為四十三。疫苗組合物GBM中存在之二十種優先TAA中由所有HLA-A及HLA-B超型對識別的抗原決定基數目在1,500至2,000範圍內。實例 41 ：臨床方案 以下實例提供示例性臨床方案。
劑型：如本文所揭示之實施例中所述，疫苗組合物呈含有六個小瓶之包裝提供至臨床位點，各小瓶包含治療有效量之來自癌細胞株之細胞，(因此總共六種細胞株)。細胞株中之三種構成混合物A且其他三種細胞株構成混合物B，因此產生三個混合物A小瓶及三個混合物B小瓶。在投與時，自冷凍機中取出小瓶且室溫下解凍約5至約15分鐘。兩個混合物A小瓶之內含物用針頭及注射器取出且注射至第三個混合物A小瓶中。類似地，兩個混合物B小瓶之內含物用針頭及注射器取出且注射至第三個混合物B小瓶中。
投藥途徑：在混合之後，將0.3 mL混合物A吸取至注射器中且呈皮內注射液投與上臂中。類似且同時，將0.3 mL混合物B吸取至注射器中且呈皮內注射液投與大腿中。投與劑量為各細胞株約8×106 (或視情況1×107 )，在各注射部位之總劑量為約2.4×107 (或視情況3×107 )個細胞。投與多劑，且在左右臂及左右大腿之間交替投與。如本文所述，0.3 mL注射體積可分為3×0.1 mL或2×0.15 mL。
在一個實施例中，混合物A及混合物B包含如表45、56、65、74、83、92、101、110、119中所闡述之經修飾之細胞株。如本文所述，根據一些實施例，該臨床方案可用於其他適應症及使用細胞株組合之其他混合物。
給藥方案：在各種實施例中，三個隊列將接受疫苗與諸如派姆單抗之檢查點抑制劑(CPI)的組合投與。在此等隊列中，疫苗將在21天週期內投與以匹配CPI之投與。前四劑將每21天投與(直至第63天)且接著其他三劑每42天投與(直至第189天)。繼續自治療中受益之患者將被允許繼續以42天時間間隔(直至第399天)且接著以84天時間間隔接受與CPI組合之其他五劑疫苗。
在第四隊列中，疫苗將與德瓦魯單抗組合投與。疫苗將在14天、21天或28天週期內投與以匹配德瓦魯單抗之投與。例如，前三劑將每14天投與(直至第28天)且接著其他四劑每42天投與(直至第196天)。繼續自治療中受益之患者將被允許繼續以42天時間間隔(直至第406天)且接著以84天時間間隔接受與德瓦魯單抗組合之其他五劑疫苗。作為另一實例，前三劑將每28天投與。
在研究產品每次投與之前，所有患者將接受50毫克/天(或100毫克/天)口服劑量之環磷醯胺，歷時七天。
已描述多個實施例。然而，應瞭解，在不背離本揭示案之精神及範疇下，可進行各種修改。因此，其他實施例在所附申請專利範圍之範疇內。
圖 1 A 及 B 示出與對照相比在經減弱HLA-G之shRNA穩定轉導的細胞中HLA-G mRNA及蛋白質表現之減少。
圖 2 A 及 B 示出HLA-G表現之減少增加IFNγ產生。
圖 3 A-C 示出鋅指核酸酶(ZFN)介導之基因編輯使A549(圖3A)、NCI-H460(圖3B)及NCI-H520(圖3C)細胞株中之CD47表現減少。
圖 4 A 及 B 示出在ELISpot分析中NCI-H520細胞株中CD47之減少增加單核球衍生之樹突狀細胞及巨噬細胞之吞噬作用(圖4A)及增加IFNγ反應(圖4B)。
圖 5 示出NCI-H460細胞株中ZFN介導之PD-L1基因編輯引起PD-L1表現減少99%。
圖 6 示出NCI-H2009細胞株中ZFN介導之BST2基因編輯引起BST2表現減少98.5%。
圖 7 A-C 示出NCI-H460細胞株中shRNA(圖7A)、Cas9(圖7B)及ZFN介導(圖7C)之基因編輯使TGFβ1及TGFβ2減少。
圖 8 A 及 B 示出DMS 53(圖8A)細胞株及NCI-H520(圖8B)細胞株中shRNA介導之TGFβ1及/或TGFβ2減弱。
圖 9 A-E 示出NCI-H2023(圖9A)、NCI-H23(圖9B)、A549(圖9C)、LK-2(圖9D)及NCI-H1703(圖9E)細胞株中TGFβ1及/或TGFβ2之減少。
圖 10 A-C 示出NCI-H460細胞株中TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1及TGFβ2之減弱增加針對親本NCI-H460細胞及存活素(BIRC5)抗原之IFNγ反應。
圖 11 A 及 B 示出在IFNγ ELISpot分析中及在混合淋巴球共培養分析中在再刺激時用來自NCI-H520 TGFβ1 KD細胞之溶解產物負載樹突狀細胞(DC)增加針對親本NCI-H460細胞之IFNγ反應。
圖 12 示出TGFβ1 TGFβ2減弱與剔除之間的IFNγ反應比較。
圖 13 示出TGFβ1 TGFβ2減弱與剔除之間的蛋白質組比較。
圖 14 A-F 示出經TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株的示例性組合誘導的針對未經修飾之親本細胞株之IFNγ反應。
圖 15 A 及 B 示出經TGFβ1及/或TGFβ2修飾之細胞株的示例性組合誘導的針對癌症抗原之IFNγ反應。
圖 16 A 及 B 示出RERF-LC-Ad1細胞株中HLA-E表現之減少增加細胞免疫反應。
圖 17 A 及 B 示出NCI-H520細胞株中CTLA-4表現之減少增加細胞免疫反應。
圖 18 A 及 B 示出A549細胞株中CD276之減少增加細胞免疫反應。
圖 19 A-D 示出NCI-H2023細胞株中CD47表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 20 A-D 示出NCI-H23細胞株中CD47表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 21 A-D 示出A549細胞株中CD47表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 22 A-D 示出NCI-H460細胞株中CD47表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 23 A-C 示出NCI-H1703細胞株中CD47表現及TGFβ1分泌之減少。
圖 24 A-C 示出LK-2細胞株中CD47表現及TGFβ2分泌之減少。
圖 25 A-C 示出DMS 53細胞株中CD47表現及TGFβ2分泌之減少。
圖 26 A-C 示出NCI-H520細胞株中CD47表現及TGFβ2分泌之減少。
圖 27 A-D 示出NCI-H2023細胞株中CD276表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 28 A-D 示出NCI-H23細胞株中CD276表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 29 A-D 示出A549細胞株中CD276表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 30 A-D 示出NCI-H460細胞株中CD276表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 31 A-C 示出NCI-H1703細胞株中CD276表現及TGFβ1分泌之減少。
圖 32 A-C 示出LK-2細胞株中CD276表現及TGFβ2分泌之減少。
圖 33 A-C 示出DMS 53細胞株中CD276表現TGFβ2分泌之減少。
圖 34 A-C 示出NCI-H520細胞株中CD276表現及TGFβ2分泌之減少。
圖 35 A 及 B 示出NCI-H460(圖35A)及A549(圖35B)細胞株中CD276表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少增加細胞免疫反應。
圖 36 A-D 示出A549細胞株中CD47及CD276表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少。
圖 37 A 及 B 示出CD47及CD276表現及TGFβ1及TGFβ2分泌之減少增加免疫原性。
圖 38 A-D 示出A549細胞株中膜結合之CD40L之表現增加樹突狀細胞(DC)成熟及細胞免疫反應。
圖 39 示出NCI-H460細胞株中GM-CSF之過度表現增加細胞免疫反應。
圖 40 示出A549細胞株中IL-12之表現增加細胞免疫反應。
圖 41 A-D 示出NCI-H520(圖41A)、A549(圖41B)、LK-2(圖41C)及NCI-H460(圖41D)細胞株中GITR之表現。
圖 42 A-D 示出GITR之表現增強細胞免疫反應。
圖 43 A 及 B 示出IL-15之表現增強細胞免疫反應。
圖 44 A 及 B 示出IL-23之表現增強細胞免疫反應。
圖 45 示出XCL1之表現。
圖 46 A-D 示出NCI-H520細胞株(圖46A)、LK-2細胞株(圖46B)、A549細胞株(圖46C)及NCI-H460細胞株(圖46 D)中間皮素之表現及增加之間皮素特異性IFNγ反應。
圖 47 示出CT83之表現。
圖 48 A-E 示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞株中GM-CSF之分泌及膜結合之CD40L之表現。
圖 49 A-E 示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞株中GM-CSF之分泌及膜結合之CD40L之表現。
圖 50 A-E 示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO細胞株中GM-CSF之分泌及膜結合之CD40L之表現。
圖 51 A-E 示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO細胞株中GM-CSF之分泌及膜結合之CD40L之表現。
圖 52 A-C 示出TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO或TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO細胞株中GM-CSF之分泌及膜結合之CD40L之表現增加細胞免疫反應及DC成熟。
圖 53 A-E 示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞株中GM-CSF之分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12之分泌。
圖 54 A-F 示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞株中GM-CSF之分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12之分泌。
圖 55 A 及 B 示出A549(圖55A)及NCI-H460(圖55B)TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO細胞株之GM-CSF之分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12之分泌增加抗原特異性反應。
圖 56 示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO細胞株中GM-CSF之分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12之分泌。
圖 57A-F 示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO細胞株中GM-CSF之分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12之分泌。
圖 58 A-D 示出A549及NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO細胞株之GM-CSF之分泌、膜結合之CD40L之表現及IL-12之分泌增加DC成熟及抗原特異性反應。
圖 59 示出HLA錯配引起免疫原性增加。
圖 60 示出某些細胞株中NSCLC抗原之表現。
圖 61 A-C 示出NSCLC疫苗及貝拉金普(Belagenpumatucel-L)之內源性TAA表現圖譜之比較。
圖 62 A 及 B 示出與細胞株之混合物相比單個細胞株所引發之IFNγ反應。
圖 63 示出針對所選抗原之IFNγ反應。
圖 64 示出NSCLC疫苗細胞株上膜結合之CD40L之表現。
圖 65 A 及 B 示出LK-2細胞株之CT83及間皮素之表現及對CT83及間皮素抗原之IFNγ反應。
圖 66 A 及 B 示出由貝拉金普及NSCLC疫苗產生之IFNγ反應的比較。
圖 67 A 及 B 示出個別供體中由貝拉金普及NSCLC疫苗產生之IFNγ反應的比較。
圖 68 A-C 示出GBM抗原(圖68A)及候選疫苗細胞株(圖68B)及GBM患者腫瘤樣品(圖68C)中GBM CSC樣標記物之表現。
圖 69 A-C 示出單個候選GBM疫苗細胞株(圖69A)及細胞株混合物中引發之IFNγ反應(圖69B-C)。
圖 70 A 及 B 示出GBM疫苗細胞株之GBM抗原之內源性表現(圖70A)及由該等疫苗細胞株表現之在GBM患者腫瘤中亦表現之GBM抗原數目(圖70B)。
圖 71 A-K 示出相較於未經修飾之對照，GBM疫苗細胞株中引入之抗原之表現及針對該等抗原之IFNγ反應。SF-126之modTERT之表現(圖71A)及GBM-疫苗A中對TERT之IFNγ反應(圖71G)。LN-229之modPSMA之表現(圖71B)及GBM-疫苗A中對PSMA之IFNγ反應(圖71H)。KNS 60之modMAGEA1、EGFRvIII及pp65之表現(圖71C-F)及GBM-疫苗B中對MAGEA1、EGFRvIII及pp65之IFNγ反應(圖71I-K)。
圖 72 示出GBM疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 73 A-C 示出相較於未經修飾之對照，由GBM疫苗(圖73A)、GBM疫苗-A(圖73B)及GBM疫苗-B(圖73C)之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 74 示出相較於未經修飾之對照，個別供體中由GBM疫苗之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 75 A-C 示出所選細胞株(圖75B)及CRC患者腫瘤樣品(圖75C)中CRC抗原(圖75A)及CRC CSC樣標記物之內源性表現。
圖 76 A-C 示出單個候選CRC疫苗細胞株(圖76A)及混合物中引發之IFNγ反應(圖76B及C)。
圖 77 示出相較於細胞株混合物，由單獨單個候選CRC疫苗細胞株引發之IFNγ反應。
圖 78 A 及 B 示出CRC疫苗細胞株之CRC抗原之內源性表現(圖78A)及由該等疫苗細胞株表現之在CRC患者腫瘤中亦表現之CRC抗原數目(圖78B)。
圖 79 A-K 示出相較於未經修飾之對照，CRC疫苗細胞株中引入之抗原之表現及針對該等抗原之IFNγ反應。HuTu80之modPSMA之表現(圖79A)及CRC-疫苗A中對PSMA之IFNγ反應(圖79F)。HCT-116之modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V之表現(圖79B-C)及CRC-疫苗B中對TBXT(圖79G)、WT1(圖79H)、KRAS G12D(圖79I)及KRAS G12D(圖79J)之IFNγ反應。
圖 80 示出CRC疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 81 A-C 示出相較於未經修飾之對照，由CRC疫苗(圖81A)、CRC疫苗-A(圖81B)及CRC疫苗-B(圖81C)之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 82 示出相較於未經修飾之對照，個別供體中由CRC疫苗之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 83 示出單獨CRC疫苗細胞株及細胞株混合物中誘導之抗原特異性IFNγ反應。
圖 84 示出候選及最終PCa疫苗細胞株組分中PCa抗原之內源性表現。
圖 85 A 及 B 示出PCa患者腫瘤中由PCa疫苗表現之抗原(圖85A)及由該等疫苗細胞株表現之亦在PCa患者腫瘤中表現的PCa抗原數目(圖85B)。
圖 86 A-D 示出單獨個別PCa候選疫苗細胞株(圖86A)及該等細胞株之混合物中引發之IFNγ反應(圖86B-C)且混合物中未經修飾之LNCaP、NEC8及NTERA-2cl-D1細胞株免疫原性更大(圖86D)。
圖 87 A-F 示出相較於未經修飾之對照，PCa疫苗細胞株中引入之抗原之表現及針對該等抗原之IFNγ反應。PC3之modTBXT之表現(圖87A)及PCa-疫苗A中對TBXT之IFNγ反應(圖87D)。PC3之modMAGEC2之表現(圖87B)及PCa-疫苗A中對MAGEC2之IFNγ反應(圖87E)。DU145之modPSMA之表現(圖87C)及PCa-疫苗B中對PSMA之IFNγ反應(圖87F) 。
圖 88 示出PCa疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 89 A-C 示出相較於未經修飾之對照，由PCa疫苗(圖89A)、PCa疫苗-A(圖89B)及PCa疫苗-B(圖89C)之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 90 示出相較於未經修飾之對照，個別供體中由PCa疫苗之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 91A-E 示出作為細胞株混合物之Pca疫苗細胞株比單個細胞株免疫原性更大。圖91A示出對個別PCA疫苗-A細胞株之IFNγ反應。Pca疫苗-A(圖91B及圖91D)及PCa疫苗-B(圖91C及圖91E)比單個組分細胞株誘導更穩固之針對親本細胞株及PCa抗原之IFNγ反應。
圖 92 A 及 B 示出候選UBC疫苗細胞株之膀胱癌抗原(圖92A)及膀胱癌CSC樣標記物(圖92B)之內源性表現。
圖 93 A-C 示出由單獨個別UBC候選疫苗細胞株(圖93A)及混合物中(圖93B及圖93C)所引發之IFNγ反應。
圖 94 A-C 示出UBC疫苗細胞株之膀胱癌抗原之內源性表現(94A)、患者腫瘤中此等抗原之表現(圖94B)及由UBC疫苗細胞株表現之亦在膀胱癌患者腫瘤中表現之膀胱癌抗原數目(圖94C)。
圖 95 A-H 示出相較於未經修飾之對照，UBC疫苗細胞株中引入之抗原之表現及針對該等抗原之IFNγ反應。J82之modPSMA(圖95A)及modCripto1(圖95B)之表現及由UBC-疫苗A誘導之針對PSMA(圖95E)及Cripto1(圖95F)之IFNγ反應。SCaBER之modWT1(圖95C)及modFOLR1 (圖95D)之表現及UBC-疫苗B中針對WT1之IFNγ反應(圖95G)及FOLR1 (圖95H)。
圖 96 示出UBC疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 97 A-C 示出相較於未經修飾之對照，由UBC疫苗(圖97A)、UBC疫苗-A(圖97B)及UBC疫苗-B(圖97C)之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 98 示出相較於未經修飾之對照，個別供體中由UBC疫苗之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 99 A 及 B 示出候選卵巢癌疫苗組分細胞株之卵巢癌抗原(圖99A)及卵巢癌CSC樣標記物(圖99B)之內源性表現。
圖 100 A-C 示出由單獨個別OC候選疫苗細胞株(圖100A)及混合物中(圖100B及圖100C)所引發之IFNγ反應。
圖 101 A-C 示出所選OC疫苗組分細胞株之內源性抗原表現(圖101A)、患者腫瘤中此等抗原之表現(圖101B)及由OC疫苗細胞株表現之亦在卵巢癌患者腫瘤中表現之卵巢癌抗原數目(圖101C)。
圖 102 A-L 示出相較於未經修飾之對照，OC疫苗細胞株中引入之抗原之表現及針對該等抗原之IFNγ反應。MCAS之modTERT之表現(圖102A)及OC-疫苗A之對TERT之IFNγ反應(圖102G)，TOV-112D之modFSHR(圖102B)及modMAGEA10(圖102D)之表現及OC-疫苗A之對FSHR(圖102H)及MAGEA10(圖102I)之IFNγ反應。TOV-21G之modWT1 (圖102C)及modFOLR1(圖102E)之表現及OC疫苗-B之對WT1(圖102K)及FOLR1(圖102J)之IFNγ反應。ES -2(圖102F)之modBORIS之表現及OC疫苗-B之對BORIS之IFNγ反應(圖102L)。
圖 103 示出對未經修飾及疫苗組分細胞株TOV-21G(圖103A)及ES-2(圖103B)細胞株之IFNγ反應。
圖 104 示出OC疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 105 A-C 示出相較於未經修飾之對照，由OC疫苗(圖105A)、OC疫苗-A(圖105B)及OC疫苗-B(圖105C)之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 106 示出相較於未經修飾之對照，個別供體中由OC疫苗之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 107 A 及 B 示出候選及所選頭頸癌疫苗組分細胞株之頭頸癌抗原(圖107A)及頭頸癌CSC樣標記物(圖107B)之內源性表現。
圖 108 A 及 B 示出患者腫瘤中亦由所選HN疫苗組分細胞株表現之抗原之表現(圖108A)及由HN疫苗細胞株表現之亦在頭頸癌患者腫瘤中表現之頭頸癌抗原數目(圖108B)。
圖 109A-E 示出由單獨個別HN候選疫苗細胞株(圖109A)及細胞株混合物(圖109B及圖109C)中所引發之IFNγ反應，大部分HN細胞株在混合物中免疫原性更大(圖109D)，且經修飾之HN疫苗組分細胞株比親本細胞株免疫原性更大(圖109E)。
圖 110A-K 示出HSC-4之modPSMA之表現(圖110A)及對PSMA之IFNγ反應(圖110E)，HO-1-N-1(圖110A)之modPRAME(圖110B)及modTBXT(圖110C)之表現及對PRAME(圖110F)及TBXT(圖110G)之IFNγ反應，KON之HPV16及HPV18 E6及E7之表現(圖110D)及所有供體(圖110H)及個別供體(圖110I)中對HPV16 E6及E7之IFNγ反應，及所有供體(圖110J)及個別供體(圖110K)中對HPV18 E6及E7之IFNγ反應。
圖 111 示出HN疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 112 A-F 示出相較於未經修飾之對照，由HN疫苗之單位劑量(圖112A)誘導之針對所有HN抗原及非病毒HN抗原(圖112D)、由HN疫苗-A(圖112B)誘導之針對所有HN抗原及非病毒HN抗原(圖112E)及由HN疫苗-B誘導之針對所有HN抗原(圖112C)及非病毒HN抗原(圖112F)的抗原特異性IFNγ反應。
圖 113 A 及 B 示出個別供體中針對所有HN抗原(上圖)及非病毒HN抗原(下圖)之抗原特異性反應。
圖 114 A 及 B 示出候選卵巢癌疫苗組分細胞株之胃癌抗原(圖114A)及胃癌CSC樣標記物(圖114B)之內源性表現。
圖 115 A-C 示出由單獨個別GCA候選疫苗細胞株(圖115A)及混合物中(圖115B及圖115C)所引發之IFNγ反應。
圖 116 A-C 示出所選GCA疫苗組分細胞株之內源性抗原表現(圖116A)、患者腫瘤中此等抗原之表現(圖116B)及由GCA疫苗細胞株表現之亦在胃癌患者腫瘤中表現之胃癌抗原數目(圖116C)。
圖 117A-H 示出MKN-1之modPSMA(圖117A)及modLY6K (圖117B)之表現及針對PSMA(圖117E)及LY6K(圖117F)之IFNγ反應，示出Fu97之modWT1(圖117C)及modCLDN18(圖117D)之表現及針對WT1 (圖117G)及CLDN18(圖117H)之IFNγ反應。
圖 118 示出GCA疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 119 A-C 示出相較於未經修飾之對照，由GCA疫苗(圖119A)、GCA疫苗-A(圖119B)及GCA疫苗-B(圖119C)之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 120 示出相較於未經修飾之對照，個別供體中由GCA疫苗之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 121 A 及 B 示出候選乳癌疫苗組分細胞株之乳癌抗原(圖121A)及乳癌CSC樣標記物(圖121B)之內源性表現。
圖 122 A-D 示出由單獨個別BRC候選疫苗細胞株(圖122A及圖122C)及混合物中(圖122B、圖122C及圖122D)所引發之IFNγ反應。
圖 123 A-C 示出所選BRC疫苗組分細胞株之內源性抗原表現(圖123A)，患者腫瘤(圖123B)及乳癌患者腫瘤(圖123C)中此等抗原之表現。
圖 124 A-H 示出CAMA-1(圖124A)之modPSMA之表現及針對PSMA之IFNγ反應(圖124E)，示出AU565之modTERT之表現(圖124B)及針對TERT之IFNγ反應(圖124F)，且示出T47D之modTBXT(圖124C)及ModBORIS(圖124D)之表現及針對TBXT(圖124G)及BORIS(圖124H)之IFNγ反應。
圖 125 示出BRC疫苗組分細胞株之膜結合之CD40L的表現。
圖 126 A-C 示出相較於未經修飾之對照，由BRC疫苗(圖126A)、BRC疫苗-A(圖126B)及BRC疫苗-B(圖126C)之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 127 示出相較於未經修飾之對照，個別供體中由BRC疫苗之單位劑量誘導的抗原特異性IFNγ反應。
圖 128 A-D 示出相較於單個組分細胞株，BRC疫苗-A(圖128A及圖128C)及BRC疫苗-B(圖128B及圖128D)組合物誘導更大廣度及量值之抗原特異性反應。
圖 129 示出人類原生PSMA(huPSMA；SEQ ID NO:70)與經設計之具有非同義突變(NSM)之PSMA(PSMAmod；SEQ ID NO: 38)之間的序列比對。
圖 130 A-C 示出群體中之HLA超型頻率。
圖 131 示出疫苗組合物之細胞株中存在之新抗原決定基及GBM中由圖131中所述之群體子集內表現HLA-A及HLA-B超型對之供體識別的經設計之新抗原決定基之數目。
圖 132 示出四種不同mRNA免疫療法所靶向之新抗原決定基之數目。
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Claims (299)

  1. 一種組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中該組合物能夠引發特異性針對該至少5種TAA之免疫反應。
  2. 一種組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少10種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中該組合物能夠引發特異性針對該至少10種TAA之免疫反應。
  3. 一種組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少15種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中該組合物能夠引發特異性針對該至少15種TAA之免疫反應。
  4. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現。
  5. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少15種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍數。
  7. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。
  8. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含表現至少5種與意欲接受該組合物之個體之癌症相關的腫瘤相關抗原(TAA)的細胞，且其中各細胞株或該等細胞株之該組合經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。
  9. 如請求項1及4至8中任一項之組合物，其中各細胞株或該等細胞株之該組合包含表現5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種或30種與意欲接受該組合物之該個體之該癌症相關的TAA的細胞。
  10. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中該組合物包含2種、3種、4種、5種或6種癌細胞株。
  11. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以表現或增加表現1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種免疫刺激因子。
  12. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以抑制或減少1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種免疫抑制因子之表現。
  13. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現之細胞。
  14. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中該等細胞株中之至少1種經修飾以減弱或剔除CD276、TGFβ1及TGFβ2中之一或多者。
  15. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中該至少1種免疫刺激因子增加樹突狀細胞成熟。
  16. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍數。
  17. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1.5倍。
  18. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1.5倍。
  19. 一種組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1.7倍。
  20. 一種組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，且其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少2.0倍。
  21. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  22. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  23. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  24. 如請求項21至23中任一項之免疫原性組合物，其中各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以(i)表現3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子或增加其表現，及/或(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種TAA之表現。
  25. 如請求項21至23中任一項之組合物，其中相較於包含未經修飾之癌細胞株之組合物，該組合物能夠刺激IFNγ產生增加至少1倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍或2倍。
  26. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少1種癌細胞株，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  27. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  28. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  29. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  30. 如請求項21至29中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物包含4種、5種或6種癌細胞株。
  31. 如請求項21至29中任一項之免疫原性組合物，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種或更多種TAA之表現。
  32. 如請求項26至29中任一項之免疫原性組合物，其中各細胞株或該等細胞株之組合經修飾以(i)表現3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種TAA之表現。
  33. 一種免疫原性組合物，其包含治療有效量之至少3種癌細胞株，其中各細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)表現CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、FBP、TDGF1、緊密連接蛋白18、LYK6K、FAP、PRAME、HPV16/18 E6/E7或其突變型式中之一或多者或增加該等因子表現。
  34. 如請求項33之免疫原性組合物，其中該等突變型式包含： (i)選自由以下組成之群組的經修飾型式：modTERT、modPSMA、modMAGEA1、modTBXT、modBORIS、modFSHR、modMAGEA10、modMAGEC2、modWT1、modKRAS、modFBP、modTDGF1、mod緊密連接蛋白18、modLY6K、modFAP及modPRAME；或 (ii)選自由以下組成之群組的融合蛋白：modCT83-MSLN、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65、modTBXT-modBORIS、modFSHR-modMAGEA10、modTBXT-modMAGEC2、modTBXT-modWT1、modTBXT-modWT1-KRAS、modWT1-modFBP、modPSMA-modTDGF1、modWT1-mod緊密連接蛋白18、modPSMA-modLY6K、modFAP-mod緊密連接蛋白18及modPRAME-modTBXT。
  35. 如請求項34之免疫原性組合物，其中該等突變型式包含： (i)選自由以下組成之群組的經修飾型式：mod間皮素(SEQ ID NO: 62)、modTERT(SEQ ID NO: 36)、modPSMA(SEQ ID NO: 38)、modMAGEA1(SEQ ID NO: 73)、modTBXT(SEQ ID NO: 79)、modBORIS(SEQ ID NO: 60)、modFSHR(SEQ ID NO: 95)、modMAGEA10(SEQ ID NO: 97)、modMAGEC2(SEQ ID NO: 87)、modWT1(SEQ ID NO: 81)、KRAS G12D(SEQ ID NO: 83)or KRAS G12V(SEQ ID NO:85)、modFBP(SEQ ID NO: 93)、modTDGF1(SEQ ID NO: 89)、mod緊密連接蛋白18(SEQ ID NO: 110)、modLYK6K(SEQ ID NO: 112)、modFAP(SEQ ID NO: 115)及modPRAME(SEQ ID NO:99)；或 (ii)選自由以下組成之群組的融合蛋白：CT83-MSLN(SEQ ID NO: 22)、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65(SEQ ID NO: 40)、modTBXT-modBORIS(SEQ ID NO:42)、modFSHR-modMAGEA10(SEQ ID NO: 44)、modTBXT-modMAGEC2(SEQ ID NO: 46)、modTBXT-modWT1(SEQ ID NO: 48)、modTBXT-modWT1(KRAS)(SEQ ID NO: 50)、modWT1-modFBP(SEQ ID NO: 52)、modPSMA-modTDGF1(SEQ ID NO: 54)、modWT1-mod緊密連接蛋白18(SEQ ID NO: 56)、modPSMA-modLY6K(SEQ ID NO: 58)及modPRAME-modTBXT(SEQ ID NO: 66)。
  36. 一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現。
  37. 一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。
  38. 一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)增加該癌幹細胞株不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  39. 如請求項38之組合物，其中該至少1種TAA係選自由以下組成之群組：TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、緊密連接蛋白18、LY6K、FAP、PRAME、HPV16/18 E6/E7及FAP或其突變型式。
  40. 一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加該癌幹細胞株不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  41. 一種組合物，其包含治療有效量之癌幹細胞株，其中該癌幹細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加該癌幹細胞株不表現或表現極低之至少2種腫瘤相關抗原(TAA)之表現。
  42. 如請求項36至41中任一項之組合物，其中該癌幹細胞株係選自由以下組成之群組：JHOM-2B、OVCAR-3、OV56、JHOS-4、JHOC-5、OVCAR-4、JHOS-2、EFO-21、CFPAC-1、Capan-1、Panc 02.13、SUIT-2、Panc 03.27、SK-MEL-28、RVH-421、Hs 895.T、Hs 940.T、SK-MEL-1、Hs 936.T、SH-4、COLO 800、UACC-62、NCI-H2066、NCI-H1963、NCI-H209、NCI-H889、COR-L47、NCI-H1092、NCI-H1436、COR-L95、COR-L279、NCI-H1048、NCI-H69、DMS 53、HuH-6、Li7、SNU-182、JHH-7、SK-HEP-1、Hep 3B2.1-7、SNU-1066、SNU-1041、SNU-1076、BICR 18、CAL-33、YD-8、CAL-29、KMBC-2、253J、253J-BV、SW780、SW1710、VM-CUB-1、BC-3C、KNS-81、TM-31、NMC-G1、GB-1、SNU-201、DBTRG-05MG、YKG-1、ECC10、RERF-GC-1B、TGBC-11-TKB、SNU-620、GSU、KE-39、HuG1-N、NUGC-4、SNU-16、OCUM-1、C2BBe1、Caco-2、SNU-1033、SW1463、COLO 201、GP2d、LoVo、SW403、CL-14、HCC2157、HCC38、HCC1954、HCC1143、HCC1806、HCC1599、MDA-MB-415、CAL-51、KO52、SKNO-1、Kasumi-1、Kasumi-6、MHH-CALL-3、MHH-CALL-2、JVM-2、HNT-34、HOS、OUMS-27、T1-73、Hs 870.T、Hs 706.T、SJSA-1、RD-ES、U2OS、SaOS-2、SK-ES-1、MKN-45、HSC-3、HSC-4、DETROIT 562及SCC-9。
  43. 一種組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該細胞株DMS 53經修飾以(i)減弱TGFβ2，(ii)剔除CD276，及(iii)上調GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12之表現。
  44. 一種組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該細胞株DMS 53經修飾以(i)減弱TGFβ2，(ii)剔除CD276，及(iii)上調GM-CSF及膜結合之CD40L之表現。
  45. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該組合物刺激特異性針對由該細胞株DMS 53表現之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)的免疫反應。
  46. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中該等細胞株中之至少1種包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中該等細胞株中之至少1種為小細胞肺癌細胞株DMS 53且包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現或者抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現的細胞。
  47. 一種組合物，其包含治療有效量之至少2種癌細胞株，其中至少1種細胞株包含經修飾以表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現之細胞，且其中1種細胞株為小細胞肺癌細胞株DMS 53。
  48. 一種組合物，其包含治療有效量之小細胞肺癌細胞株DMS 53，其中該細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，且(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現。
  49. 一種組合物，其包含治療有效量之3種癌細胞株，其中各細胞株所包含的細胞經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，且(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，且其中該等細胞株中之1種為小細胞肺癌細胞株DMS 53。
  50. 如請求項1至44及46至49中任一項之組合物，其中該組合物為疫苗組合物。
  51. 如請求項4至49中任一項之組合物，其中該組合物能夠引發個體中之免疫反應。
  52. 如請求項1至29及31至49中任一項之組合物，其中該組合物包含3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種癌細胞株。
  53. 6、13至17、21、25、26、36至48中任一項之組合物，其中該組合物包含經修飾以表現2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫刺激因子或增加其表現之細胞株。
  54. 6、13至17、21、25、26、36至48中任一項之組合物，其中該組合物包含抑制或減少2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種免疫抑制因子之表現的修飾。
  55. 如請求項26至30、40及41中任一項之組合物，其中該組合物包含表現2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種TAA或增加其表現之修飾。
  56. 如請求項55之組合物，其中該等TAA中之一或多者之胺基酸序列已經修飾以包括突變及/或新抗原決定基。
  57. 如請求項1至3及51中任一項之組合物，其中該免疫反應為先天性免疫反應、適應性免疫反應、細胞免疫反應及/或體液反應。
  58. 如請求項57之組合物，其中該免疫反應為適應性免疫反應。
  59. 如請求項58之組合物，其中該適應性免疫反應包含選自由CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、γ-δ T細胞、自然殺手T細胞及B細胞組成之群組之抗原特異性細胞的產生。
  60. 如請求項59之組合物，其中該抗原特異性CD4+ T細胞包含記憶細胞、T輔助1型細胞、T輔助9型細胞、T輔助17型細胞、T輔助22型細胞及T濾泡性輔助細胞。
  61. 如請求項59之組合物，其中該抗原特異性CD8+ T細胞包含記憶細胞及細胞毒性T淋巴球。
  62. 如請求項59之組合物，其中該抗原特異性B細胞包含記憶細胞、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E及免疫球蛋白A。
  63. 如請求項1及4至62中任一項之組合物，其中各細胞株或該等細胞株之組合表現至少10種TAA。
  64. 如請求項63之組合物，其中該等TAA亦在意欲接受該組合物之個體之癌症中表現。
  65. 如請求項1至64中任一項之組合物，其中該治療有效量包含大約8×106 個細胞之各細胞株。
  66. 如請求項1至64中任一項之組合物，其中該治療有效量包含大約1×107 個細胞之各細胞株。
  67. 如請求項1至64中任一項之組合物，其中該治療有效量包含大約1.0×106 -6.0×107 個細胞之各細胞株。
  68. 如請求項1至67中任一項之組合物，其中該治療有效量包含大約相同數目細胞之各細胞株。
  69. 如請求項1至68中任一項之組合物，其中該等細胞株係遺傳異質性同種異體、遺傳同質性同種異體、遺傳異質性異種、遺傳同質性異種或同種異體與異種之組合。
  70. 如請求項1至68中任一項之組合物，其中該等細胞株來自起源於以下之實體腫瘤之親本細胞株：肺、前列腺、睪丸、乳房、結腸、膀胱、胃腸道系統、腦、脊髓、泌尿道、結腸、直腸、胃、頭頸部、肝臟、腎臟、中樞神經系統、內分泌系統、間皮、卵巢、子宮內膜、胰臟、食道、神經內分泌系統、子宮或皮膚。
  71. 如請求項70之組合物，其中該等親本細胞株包含選自由以下組成之群組的細胞：鱗狀細胞、癌細胞、腺癌細胞、腺鱗細胞、大細胞細胞、小細胞細胞、肉瘤細胞、透明細胞癌細胞、癌肉瘤細胞、混合間皮細胞及畸胎癌細胞。
  72. 如請求項71之組合物，其中該等肉瘤細胞包含骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、間皮瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、神經膠質瘤、神經膠質肉瘤、星形細胞瘤、黏液肉瘤、間葉或混合間皮。
  73. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為非小細胞肺癌細胞株或小細胞肺癌細胞株。
  74. 如請求項73之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23。
  75. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為小細胞肺癌細胞株。
  76. 如請求項75之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53及NCI-H1694。
  77. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為前列腺癌細胞株或睪丸癌細胞株。
  78. 如請求項77之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：PC3、DU-145、LNCAP、NEC8及NTERA-2cl-D1。
  79. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為大腸直腸癌細胞株。
  80. 如請求項79之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116及LS411N。
  81. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為乳癌或三陰性乳癌細胞株。
  82. 如請求項81之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7及T-47D。
  83. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為膀胱或泌尿道癌細胞株。
  84. 如請求項83之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376及SCaBER。
  85. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為頭頸癌細胞株。
  86. 如請求項85之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1及OSC-20。
  87. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為胃(gastric/stomach)癌細胞株。
  88. 如請求項87之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1及MKN1。
  89. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為肝癌或肝細胞癌(HCC)細胞株。
  90. 如請求項89之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6及HuH-7。
  91. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為神經膠母細胞瘤癌細胞株。
  92. 如請求項91之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1及KNS-60。
  93. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為卵巢癌細胞株。
  94. 如請求項93之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO及MCAS。
  95. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為食道癌細胞株。
  96. 如請求項95之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19及OE21。
  97. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為腎或腎細胞癌癌細胞株。
  98. 如請求項97之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ及VMRC-RCW。
  99. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為胰臟癌細胞株。
  100. 如請求項99之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2及PSN11。
  101. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為子宮內膜癌細胞株。
  102. 如請求項101之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA及石川(Ishikawa)。
  103. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為皮膚或黑色素瘤癌細胞株。
  104. 如請求項103之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T及A2058。
  105. 如請求項1至69中任一項之組合物，其中該細胞株或該等細胞株為間皮瘤癌細胞株。
  106. 如請求項105之組合物，其中該等細胞株係選自由以下組成之群組：NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89及IST-Mes2。
  107. 如請求項77至106中任一項之組合物，其進一步包含癌幹細胞株。
  108. 如請求項77至106中任一項之組合物，其進一步包含細胞株DMS 53。
  109. 5、7、8、13至20、22、23、27至29、33至35及108中任一項之組合物，其中該等細胞株中之1種屬於與該等其他細胞株中之至少1種不同的癌症。
  110. 5、7、8、13至20、22、23、27至29、33至35及108中任一項之組合物，其中至少3種細胞株各自為相同類型癌症。
  111. 5、7、8、13至20、22、23、27至29、33至35及108中任一項之組合物，其中至少3種細胞株各自為不同細胞組織學類型或分子亞型。
  112. 如請求項111之組合物，其中該細胞組織學類型係選自由以下組成之群組：鱗狀、癌瘤、腺癌、大細胞、小細胞及肉瘤。
  113. 5、8、13-42、46-49及53中任一項之組合物，其中增加該至少1種免疫刺激因子之表現的該修飾包含使用編碼該至少1種免疫刺激因子之慢病毒載體。
  114. 如請求項113之組合物，其中該至少1種免疫刺激因子以相較於未經修飾之細胞株高至少2.0倍之水準表現。
  115. 如請求項114之組合物，其中該至少1種免疫刺激因子係選自由以下組成之群組：GM-CSF、膜結合之CD40L、GITR、IL-15、IL-23及IL-12。
  116. 如請求項115之組合物，其中該等免疫刺激因子為GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-12。
  117. 如請求項115之組合物，其中該等免疫刺激因子為GM-CSF、膜結合之CD40L及IL-15。
  118. 如請求項116或117之組合物，其中該GM-CSF包含SEQ ID NO: 8。
  119. 如請求項116或117之組合物，其中該膜結合之CD40L包含SEQ ID NO: 3。
  120. 如請求項116之組合物，其中該IL-12包含SEQ ID NO: 10。
  121. 如請求項54之組合物，其中抑制或減少該至少1種免疫抑制因子之表現的該修飾包含該至少1種免疫抑制因子之剔除或減弱。
  122. 如請求項121之組合物，其中該至少1種免疫抑制因子之表現減少至少大約5%、10%、15%、20%、25%或30%。
  123. 如請求項122之組合物，其中該修飾為減弱。
  124. 如請求項20、27、28、32、33、34、35、41、43、44及54中任一項之組合物，其中抑制或減少該至少1種免疫抑制因子之表現的該等修飾包含減弱該至少1種免疫抑制因子之表現與剔除不同免疫抑制因子之表現的組合。
  125. 如請求項122之組合物，其中該至少1種免疫抑制因子係選自由以下組成之群組：CD276、CD47、CTLA4、HLA-E、HLA-G、IDO1、IL-10、TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3。
  126. 如請求項125之組合物，其中該至少1種免疫抑制因子係選自由以下組成之群組：CD276、HLA-E、HLA-G、TGFβ1及TGFβ2。
  127. 如請求項126之組合物，其中該等免疫抑制因子為TGFβ1、TGFβ2及CD276。
  128. 如請求項126之組合物，其中該等免疫抑制因子為TGFβ2及CD276。
  129. 如請求項126之組合物，其中該等免疫抑制因子為TGFβ1及CD276。
  130. 如請求項125、126或127中任一項之組合物，其中使用包含SEQ ID NO: 25之短髮夾RNA減弱TGFβ1。
  131. 如請求項125、126、127或128中任一項之組合物，其中使用包含SEQ ID NO: 24之短髮夾RNA減弱TGFβ2。
  132. 如請求項125至128中任一項之組合物，其中使用靶向包含SEQ ID NO: 26之CD276基因體DNA序列之鋅指核酸酶對剔除CD276。
  133. 如請求項1至132中任一項之組合物，其中該組合物包含表現異質HLA超型之細胞株，且其中呈現至少2種不同HLA-A及至少2種HLA-B超型。
  134. 如請求項133之組合物，其中該組合物表現HLA-A24、HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B27及HLA-B44超型中之主要組織相容性複合體分子。
  135. 如請求項133之組合物，其中該組合物表現HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01、HLA-B07、HLA-B27及HLA-B44超型中之主要組織相容性複合體分子。
  136. 如請求項133之組合物，其中該組合物表現HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08及HLA-B44超型。
  137. 如請求項1至136中任一項之組合物，其中該(等)細胞株為遺傳同質性細胞株。
  138. 如請求項1至136中任一項之組合物，其中該(等)細胞株為遺傳異質性細胞株。
  139. 一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物。
  140. 一種刺激個體中特異性針對至少5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種或30種或更多種腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物。
  141. 一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種或更多種如請求項1至138中任一項之組合物。
  142. 一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種或更多種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該等組合物包含細胞株之不同組合。
  143. 一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該等組合物各自包含3種不同細胞株。
  144. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該免疫反應包含抗原特異性或疫苗特異性免疫球蛋白G抗體之產生增加。
  145. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該免疫反應包含IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A、IL-20、IL-22、TNFα、IFNγ、CCL5或CXCL10中之一或多者之產生增加。
  146. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該免疫反應包含IFNγ之產生增加。
  147. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該免疫反應包含顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素及CD107a之產生增加。
  148. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該免疫反應包含調節T細胞、單核單核球衍生之抑制細胞及多形核衍生之抑制細胞之含量減少。
  149. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該免疫反應包含循環腫瘤細胞(CTC)、嗜中性球與淋巴球之比率(NLR)及血小板與淋巴球之比率(PLR)的水準降低。
  150. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該免疫反應包含腫瘤微環境中免疫浸潤之變化。
  151. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物。
  152. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種或更多種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該等組合物包含細胞株之不同組合。
  153. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之2種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該等組合物各自包含3種不同細胞株。
  154. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之化學治療劑。
  155. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之一或多種如請求項1至138中任一項之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之環磷醯胺。
  156. 如請求項155之方法，其中環磷醯胺之該治療有效量包含50毫克/天，持續1-10天，接著投與該治療有效量之該組合物。
  157. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之檢查點抑制劑。
  158. 如請求項157之方法，其中該檢查點抑制劑係選自由以下組成之群組：CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9及2B4之抑制劑。
  159. 如請求項158之方法，其中該檢查點抑制劑係選自由以下組成之群組：派姆單抗(pembrolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、西利單抗(cetrelimab)、多斯利單抗(dostarlimab)、賽咪單抗(cemiplimab)、斯巴達珠單抗(spartalizumab)、坎立珠單抗(camrelizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及納武單抗(nivolumab)。
  160. 如請求項139至159中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與經分離之腫瘤相關抗原(TAA)。
  161. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物，且進一步包含向該個體投與一或多種選自由以下組成之群組的抑制劑：ALK、PARP、VEGFRs、EGFR、FGFR1-3、HIF1α、PDGFR1-2、c-Met、c-KIT、Her2、Her3、AR、PR、RET、EPHB4、STAT3、Ras、HDAC1-11、mTOR及CXCR4之抑制劑。
  162. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物，且進一步包含向該個體投與治療有效量之放射線療法。
  163. 一種治療個體之癌症之方法，其包含投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物，且進一步包含向該患者投與癌症治療手術。
  164. 一種同時治療個體之兩種或更多種癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至138中任一項之組合物。
  165. 一種製備如請求項1至138中任一項之疫苗組合物之方法，其包含以下步驟： (a)選擇表現至少5種、10種、15種或20種或更多種TAA之一或多種癌細胞株；以及 (b)修飾(a)之該一或多種癌細胞株中之每一者，其中該細胞株或該等細胞株之組合所包含的細胞經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，及/或(ii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種TAA之表現。
  166. 如請求項165之方法，其中該細胞株或該等細胞株之組合包含另外經修飾以抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現的細胞。
  167. 如請求項165之方法，其中該修飾步驟包含將一或多種載體引入至該等細胞株中之一或多者中。
  168. 如請求項167之方法，其中該一或多種載體為慢病毒載體。
  169. 如請求項166之方法，其進一步包含使該等經修飾之細胞株適應無異種培養基之步驟。
  170. 如請求項166之方法，其進一步包含輻照該等細胞株之步驟。
  171. 如請求項166之方法，其進一步包含使該等細胞適應冷凍保存培養基之步驟。
  172. 如請求項139至165中任一項之方法，其中該組合物或該等組合物藉由選自由以下組成之群組的途徑投與該個體：非經腸、經腸、經口、肌肉內、皮內、皮下、瘤內、結節內、鼻內、經皮、吸入、黏膜及局部。
  173. 如請求項172之方法，其中該途徑係皮內。
  174. 如請求項139至165中任一項之方法，其中該組合物或該等組合物投與該個體上選自由手臂、大腿及背部組成之群組的投與部位。
  175. 如請求項141至143中任一項之方法，其中該等組合物皮內投與該個體上之不同投與部位上。
  176. 如請求項174之方法，其中該組合物藉由用位於自該投與部位之表面5°與15°之間的角度下的注射器注射而皮內投與。
  177. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之第一劑量及治療有效量之後續劑量的一或多種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該一或多種組合物在第一年投與1-24次、在第二年投與1-16次及在第三年投與1-14次。
  178. 一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該最初四劑每21天投與，至第63天，且接著每42天投與另外三劑，至第189天。
  179. 如請求項178之方法，其進一步包含以42天時間間隔投與另外五劑，至第399天，且接著隨後至少以兩個84天時間間隔投與。
  180. 一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與第一劑量及後續劑量之治療有效量的兩種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該最初四劑每14天投與，至第42天，且接著每42天投與另外三劑，至第168天。
  181. 如請求項180之方法，其進一步包含以42天時間間隔投與另外五劑，至第378天，且接著隨後至少以兩個84天時間間隔投與。
  182. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之兩種組合物，其中各組合物包含至少2種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以(i)表現至少1種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少1種免疫抑制因子之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種腫瘤相關抗原(TAA)的表現，其中一種組合物投與該個體之上半身，且另一組合物投與該個體之下半身。
  183. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與第一劑量及後續劑量之治療有效量之兩種組合物，其中各組合物包含至少2種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以(i)表現GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L中之一或多者或增加其表現，(ii)抑制或減少TGFβ1、TGFβ2及CD276中之一或多者之表現，及(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種TAA的表現，其中一種組合物投與該個體之上半身，且另一組合物投與該個體之下半身。
  184. 如請求項177至183中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該個體投與一或多種治療劑或治療。
  185. 如請求項177至183中任一項之方法，其中該個體避免用其他疫苗或治療劑治療。
  186. 如請求項184之方法，其中該治療劑或治療係選自由以下組成之群組：放射線療法、化學療法、手術、小分子抑制劑及檢查點抑制劑。
  187. 如請求項184之方法，其中該治療劑為環磷醯胺。
  188. 如請求項186之方法，其中該檢查點抑制劑係選自由以下組成之群組：CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9及2B4之抑制劑。
  189. 如請求項188之方法，其中該檢查點抑制劑為派姆單抗、阿維魯單抗、阿特珠單抗、西利單抗、多斯利單抗、賽咪單抗、斯巴達珠單抗、坎立珠單抗、德瓦魯單抗或納武單抗。
  190. 如請求項184之方法，其中該一或多種治療劑或治療在該第一劑量及/或該等後續劑量之至少1次投與之前投與。
  191. 如請求項184之方法，其中該一或多種治療劑或治療在該組合物之每次投與之前、同時或之後投與。
  192. 如請求項184之方法，其中第一治療劑在該第一劑量之前投與，且其中第二治療劑與該第一劑量及該等後續劑量同時投與。
  193. 一種刺激個體中之免疫反應之方法，其包含： a.  向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種如請求項1至138中任一項之組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與；以及 b.  視情況，在投與(a)之該第一劑量之前向該個體投與治療有效劑量之環磷醯胺1-10天，及視情況在投與(a)之該等後續劑量之前投與治療有效劑量之環磷醯胺1-10天； c.  視情況，(i)與(a)之每個劑量同時，或(ii)在(a)之該第一劑量之後每一週、兩週、三週或四週，向該個體投與檢查點抑制劑。
  194. 一種治療個體之癌症之方法，其包含： a.  向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種如請求項1至138中任一項之組合物，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與； b.  視情況，在投與(a)之該第一劑量之前向該個體投與環磷醯胺1-10天，及視情況在投與(a)之該等後續劑量之前投與環磷醯胺1-10天； c.  視情況，(i)與(a)之每個劑量同時，或(ii)在(a)之該第一劑量之後每一週、兩週、三週或四週，向該個體投與檢查點抑制劑。
  195. 一種治療個體之癌症之方法，其包含： a.  向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種如請求項1至138中任一項之組合物，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與，且其中該等後續劑量在投與該第一劑量之後3週、6週、9週、15週、21週及27週投與； b.  在投與(a)之該第一劑量及該等後續劑量之前每日向該個體投與環磷醯胺7天； c.  在(a)之該第一劑量之後3週、6週、9週、12週、15週、18週、21週、24週及27週向該個體投與檢查點抑制劑。
  196. 如請求項195之方法，其中環磷醯胺經口投與且該檢查點抑制劑為派姆單抗且靜脈內投與。
  197. 如請求項195之方法，其中環磷醯胺以50 mg之劑量經口投與且該檢查點抑制劑為派姆單抗且以200 mg之劑量靜脈內投與。
  198. 一種治療個體之癌症之方法，其包含： a.  向該個體投與第一劑量之治療有效量的兩種如請求項1至138中任一項之組合物，且在投與該第一劑量之後向該個體投與後續劑量之該兩種組合物，其中該兩種組合物在不同部位同時投與，且其中該等後續劑量在投與該第一劑量之後2週、4週、6週、12週、18週及24週投與； b.  在投與(a)之該第一劑量及該等後續劑量之前每日向該個體投與環磷醯胺7天；以及 c.  在(a)之該第一劑量之後2週、4週、6週、8週、10週、12週、14週、16週、18週、20週、22週、24週、26週、28週及30週向該個體投與檢查點抑制劑。
  199. 如請求項198之方法，其中環磷醯胺以50 mg之劑量經口投與且該檢查點抑制劑為德瓦魯單抗且以10 mg/kg之劑量靜脈內投與。
  200. 如請求項177至199中任一項之方法，其進一步包含以下步驟：在投與該等組合物之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天及在投與該等組合物之後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天禁止投與大麻鹼。
  201. 如請求項151至200中任一項之方法，其中該個體罹患選自由以下組成之群組之癌症：肺癌、前列腺癌、乳癌、食道癌、大腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、腎癌、神經膠質瘤、子宮內膜癌、卵巢癌、胰臟癌、黑色素瘤及間皮瘤。
  202. 如請求項201之方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌。
  203. 如請求項201之方法，其中該肺癌為小細胞肺癌。
  204. 如請求項201之方法，其中該癌症為前列腺癌。
  205. 如請求項201之方法，其中該癌症為乳癌。
  206. 如請求項205之方法，其中該乳癌為三陰性乳癌。
  207. 如請求項201之方法，其中該癌症為食道癌。
  208. 如請求項201之方法，其中該癌症為大腸直腸癌。
  209. 如請求項201之方法，其中該癌症為膀胱癌。
  210. 如請求項201之方法，其中該癌症為胃癌。
  211. 如請求項201之方法，其中該癌症為頭頸癌。
  212. 如請求項201之方法，其中該癌症為肝癌。
  213. 如請求項201之方法，其中該癌症為腎癌。
  214. 如請求項201之方法，其中該癌症為神經膠質瘤。
  215. 如請求項201之方法，其中該癌症為神經膠質肉瘤。
  216. 如請求項214之方法，其中該神經膠質瘤為星形細胞瘤。
  217. 如請求項216之方法，其中該星形細胞瘤為多形性神經膠母細胞瘤(GBM)。
  218. 如請求項201之方法，其中該癌症為子宮內膜癌。
  219. 如請求項201之方法，其中該癌症為卵巢癌。
  220. 如請求項201之方法，其中該癌症為胰臟癌。
  221. 如請求項201之方法，其中該癌症為黑色素瘤。
  222. 如請求項201之方法，其中該癌症為間皮瘤。
  223. 一種套組，其包含一或多種如請求項1至138中任一項之組合物。
  224. 一種套組，其包含至少1個小瓶，該小瓶包含如請求項1至138中任一項之組合物。
  225. 一種套組，其包含第一小瓶中之第一疫苗組合物及第二小瓶中之第二疫苗組合物，其中該第一疫苗組合物及該第二疫苗組合物各包含至少2種癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現。
  226. 一種套組，其包含6個小瓶，其中該等小瓶各含有包含癌細胞株之組合物，且其中該6個小瓶中之至少4個包含如下癌細胞株，該癌細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及/或(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)增加1種細胞株或該等細胞株之該組合不表現或表現極低之至少1種TAA之表現，其中該等小瓶中之至少4個含有不同組合物。
  227. 如請求項223至226中任一項之套組，其進一步包含使用說明書。
  228. 如請求項223至226中任一項之套組，其中該套組用於治療癌症。
  229. 一種用於治療癌症之藥劑之單位劑量，該藥劑包含不同癌細胞株之6種組合物，其中至少4種組合物所包含的細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，及(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現。
  230. 如請求項229之單位劑量，其中該等細胞株包含： (a)選自由NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23組成之群組的非小細胞肺癌細胞株及/或小細胞肺癌細胞株； (b) DMS 53及選自由DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53及NCI-H1694組成之群組的五種小細胞肺癌細胞株； (c) DMS 53及前列腺癌細胞株或睪丸癌細胞株PC3、DU-145、LNCAP、NEC8及NTERA-2cl-D1； (d) DMS 53及大腸直腸癌細胞株HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116及LS411N； (e) DMS 53及乳癌或三陰性乳癌細胞株Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7及T-47D； (f) DMS 53及膀胱或泌尿道癌細胞株UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376及SCaBER； (g) DMS 53及頭或頸部癌細胞株HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1及OSC-20； (h) DMS 53及胃或胃癌細胞株Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1及MKN1； (i) DMS 53及選自由Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6及HuH-7組成之群組的五種肝癌或肝細胞癌(HCC)細胞株； (j) DMS 53及神經膠母細胞瘤癌細胞株DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1及KNS-60； (k) DMS 53及選自由TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO及MCAS組成之群組的卵巢癌細胞株； (l) DMS 53及選自由TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19及OE21組成之群組的五種食道癌細胞株； (m) DMS 53及選自由A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ及VMRC-RCW組成之群組的五種腎癌或腎細胞癌癌細胞株； (n) DMS 53及胰臟癌細胞株PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2及PSN11； (o) DMS 53及選自由SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA及石川組成之群組的五種子宮內膜癌細胞株； (p) DMS 53及選自由RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T及A2058組成之群組的五種皮膚或黑色素瘤癌細胞株；或 (q) DMS 53及選自由NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89及IST-Mes2組成之群組的五種間皮瘤癌細胞株。
  231. 一種用於治療癌症之藥劑之單位劑量，該藥劑包含不同癌細胞株之6種組合物，其中各細胞株經修飾以(i)表現至少2種免疫刺激因子或增加其表現，(ii)抑制或減少至少2種免疫抑制因子之表現，及/或(iii)表現該等癌細胞株不表現或表現極低之至少1種TAA或增加其表現。
  232. 如請求項229至231中任一項之單位劑量，其中混合各包含3種細胞株之兩種組合物。
  233. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中 (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
  234. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCIH520及A549；其中 (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 其中該治療有效量為各細胞株大約1.0×107 個細胞或大約6×107 個細胞。
  235. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23，其中 (a) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (b) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現，及(iii)表現MSLN及CT83；且 (c) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
  236. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中 (a) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (b) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現，及(iii)表現MSLN及CT83；且 (c) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；其中該治療有效量為各細胞株大約1.0×107 個細胞或大約6×107 個細胞。
  237. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株LN-229、GB-1及SF-126，其中 (a) LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT。
  238. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53，其中： (a) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (b) DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65。
  239. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株HCT-15、RKO及HuTu-80，其中： (a) HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA。
  240. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株HCT-116、LS411N及DMS 53，其中： (a) HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V； (b) LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  241. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中： (a) PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2； (b) NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (c) NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現。
  242. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株DU-145、LNCaP及DMS 53，其中： (a) DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (c) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  243. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株J82、HT-1376及TCCSUP，其中： (a) J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
  244. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中： (a) SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (b) UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  245. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中： (a) OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT； (c) TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10。
  246. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中： (a) TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (b) ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且 (c) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  247. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1及DETROIT 562，其中： (a) HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且 (c) DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
  248. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株KON、OSC-20及DMS 53，其中： (a) KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7； (b) OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且 (c) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  249. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株MKN-1、MKN-45及MKN-74，其中： (a) MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6； (b) MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現。
  250. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中： (a) OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現； (b) Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且 (c) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  251. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株CAMA-1、AU565及HS-578T，其中： (a) CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且 (c) HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
  252. 一種疫苗組合物，其包含治療有效量之癌細胞株MCF-7、T47D及DMS 53，其中： (a) MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且 (c) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  253. 如請求項237至251中任一項之疫苗組合物，其中該治療有效量為各細胞株大約1.0×107 個細胞或大約6×107 個細胞。
  254. 一種組合物，其包含第一混合物及第二混合物；其中該第一混合物包含治療有效量之至少2種經輻照之癌細胞株，該等癌細胞株經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 其中該第二混合物包含細胞株DMS 53，該細胞株經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現，及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  255. 如請求項254之組合物，其中該第一混合物及/或該第二混合物包含一或多種經修飾以表現以下或增加以下表現之細胞株：CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、緊密連接蛋白18、LYK6K、PRAME、HPV16/18 E6/E7或其突變型式。
  256. 一種刺激人類個體中的特異性針對與非小細胞肺癌(NSCLC)相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中 (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中 (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且 (f) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  257. 一種治療人類個體之非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中 (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中 (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且 (f) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  258. 一種刺激人類個體中的特異性針對與神經膠母細胞瘤相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126；其中： (a) LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53；其中： (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  259. 一種治療人類個體之神經膠母細胞瘤之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126；其中： (a) LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53；其中： (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  260. 一種刺激人類個體中的特異性針對與大腸直腸癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-15、RKO及HuTu-80，其中： (a) HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-116、LS411N及DMS 53；其中： (d) HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V； (e) LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  261. 一種治療人類個體之大腸直腸癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-15、RKO及HuTu-80，其中： (a) HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (c) HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HCT-116、LS411N及DMS 53；其中： (d) HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V； (e) LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現， 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  262. 一種刺激人類個體中的特異性針對與前列腺癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中： (a) PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2； (b) NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (c) NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DU-145、LNCaP及DMS 53，其中： (d) DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (e) LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  263. 一種治療人類個體之前列腺癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中： (a) PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2； (b) NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (c) NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株DU-145、LNCaP及DMS 53，其中： (d) DU 145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (e) LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  264. 一種刺激人類個體中的特異性針對與膀胱癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株J82、HT-1376及TCCSUP，其中： (a) J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中： (d) SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  265. 一種治療人類個體之膀胱癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株J82、HT-1376及TCCSUP，其中： (a) J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中： (d) SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  266. 一種刺激人類個體中的特異性針對與卵巢癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中： (a) OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT； (c) TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中： (d) TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  267. 一種治療人類個體之卵巢癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中： (a) OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT； (c) TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中： (d) TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  268. 一種刺激人類個體中的特異性針對與頭頸癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中： (a) HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且 (c) DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株KON、OSC-20及DMS 53，其中： (d) KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7； (e) OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  269. 一種治療人類個體之卵巢癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中： (a) HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT；且 (c) DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株KON、OSC-20及DMS 53，其中： (d) KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7； (e) OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  270. 一種刺激人類個體中的特異性針對與胃癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MKN-1、MKN-45及MKN-74；其中： (a) MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6； (b) MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及 (ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中 (d) OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現； (e) Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  271. 一種治療人類個體之胃癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MKN-1、MKN-45及MKN-74；其中 (a) MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6； (b) MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及 (ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中 (d) OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現； (e) Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  272. 一種刺激人類個體中的特異性針對與乳癌相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D及DMS 53，其中： (a) CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且 (c) HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MCF-7、T47D及DMS 53，其中： (d) MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (e) T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  273. 一種治療人類個體之乳癌之方法，其包含投與(i)治療有效量之第一疫苗組合物，該第一疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株CAMA-1、AU565及HS-578T，其中 (a) CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且 (c) HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 及(ii)治療有效量之第二疫苗組合物，該第二疫苗組合物包含治療有效量之癌細胞株MCF-7、T47D及DMS 53，其中： (d) MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (e) T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； 其中該第一疫苗組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二疫苗組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  274. 一種刺激人類個體中的特異性針對與NSCLC相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含： a.  每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週； b.  在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中 (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 且該第二組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中 (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且 (f) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現； c.  在(a)中之該一週之後，經由注射以200 mg之劑量進一步投與第一劑量之包含派姆單抗之組合物； d.  在(b)中該第一劑量投與之後3週、6週、9週、15週、21週及27週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量； e.  在(c)中該第一劑量之後3週、6週、9週、12週、15週、18週、21週、24週及27週以200 mg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含派姆單抗之組合物； 其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  275. 一種刺激人類個體中的特異性針對與癌症相關之腫瘤相關抗原(TAA)之免疫反應的方法，其包含： a.  每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週； b.  在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物係選自由如請求項246、248、250、252、254、256、258或260之組合物組成之群組； 且該第二組合物係選自由如請求項247、249、251、253、255、257、259或261之組合物組成之群組； c.  在(a)中之該一週之後，經由注射以200 mg之劑量進一步投與第一劑量之包含派姆單抗之組合物； d.  在(b)中該第一劑量投與之後3週、6週、9週、15週、21週及27週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量； e.  在(c)中該第一劑量之後3週、6週、9週、12週、15週、18週、21週、24週及27週以200 mg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含派姆單抗之組合物； 其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  276. 一種刺激人類個體中的特異性針對與NSCLC相關之TAA之免疫反應的方法，其包含： a.  每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週； b.  在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物包含治療有效量之肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H520及A549；其中 (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；且 (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； 且該第二組合物包含治療有效量之肺癌細胞株DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中 (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且 (f) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現； c.  在(a)中之該一週之後，以10 mg/kg之劑量經由注射進一步投與第一劑量之包含德瓦魯單抗之組合物； d.  在(b)中該第一劑量投與之後2、4、10、16、22及28週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量； e.  在(c)中該第一劑量之後2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28及30週以10 mg/kg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含德瓦魯單抗之組合物； 其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  277. 一種刺激人類個體中的特異性針對與NSCLC相關之TAA之免疫反應的方法，其包含： a.  每日以50毫克/天之劑量經口投與環磷醯胺，歷時一週； b.  在(a)中之該一週之後，進一步投與第一劑量之包含第一組合物及第二組合物之疫苗，其中該第一組合物係選自由如請求項246、248、250、252、254、256、258或260之組合物組成之群組； 且該第二組合物係選自由如請求項247、249、251、253、255、257、259或261之組合物組成之群組； c.  在(a)中之該一週之後，以10 mg/kg之劑量經由注射進一步投與第一劑量之包含德瓦魯單抗之組合物； d.  在(b)中該第一劑量投與之後2、4、10、16、22及28週，進一步投與後續劑量之該第一組合物及該第二組合物，且其中經口投與50 mg環磷醯胺，歷時7天，直至各後續劑量； e.  在(c)中該第一劑量之後2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28及30週以10 mg/kg之劑量進一步靜脈內投與後續劑量之該包含德瓦魯單抗之組合物； 其中該第一組合物經皮內投與該個體之手臂中，且該第二組合物經皮內投與該個體之大腿中。
  278. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含肺癌細胞株NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23之細胞，且其中： (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且 (f) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
  279. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53之細胞，其中： (a) LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT； (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65。
  280. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株HCT -15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N及DMS 53之細胞，其中： (a) HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (d) HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V； (e) LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  281. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP及DMS 53之細胞，其中： (a) PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2； (b) NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現； (c) NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現； (d) DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (e) LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  282. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3及DMS 53之細胞，其中： (a) J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (c) TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  283. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2及DMS 53之細胞，其中： (a) OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT； (c) TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10； (d) TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  284. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20及DMS 53之細胞，其中： (a) HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT； (c) DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7； (e) OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  285. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含近似癌細胞株MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97及DMS 53之細胞，其中： (a) MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6； (b) MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (d) OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現； (e) Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  286. 一種套組，其包含六個小瓶，其中各小瓶包含癌細胞株CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D及DMS 53之細胞，其中： (a) CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且 (c) HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (e) T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  287. 一種肺癌疫苗之單位劑量，該肺癌疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之肺癌細胞株NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2及NCI-H23；其中： (a) NCI-H460經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (b) NCI-H520經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (c) A549經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) LK-2經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；(iii)表現MSLN及CT83；且 (f) NCI-H23經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現。
  288. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60及DMS 53，其中： (a) LN-229經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) GB-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) SF-126經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modhTERT； (d) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現； (e) DBTRG-05MG經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) KNS 60經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modMAGEA1、EGFRvIII及hCMV pp65。
  289. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N及DMS 53，其中： (a) HCT-15經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) RKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) HuTu-80經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (d) HCT-116經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT、modWT1、KRAS G12D及KRAS G12V； (e) LS411N經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  290. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP及DMS 53，其中： (a) PC3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modMAGEC2； (b) NEC8經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現； (c) NTERA-2cl-D1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現； (d) DU-145經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (e) LNCaP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  291. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3及DMS 53，其中： (a) J82經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HT-1376經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (c) TCCSUP經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) SCaBER經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) UM-UC-3經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  292. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2及DMS 53，其中： (a) OVTOKO經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (b) MCAS經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT； (c) TOV-112D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modFSHR及modMAGEA10； (d) TOV-21G經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modFOLR1； (e) ES2經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  293. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20及DMS 53，其中： (a) HSC-4經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) HO-1-N-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPRAME及modTBXT； (c) DETROIT 562經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) KON經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現HPV16 E6及E7及HPV18 E6及E7； (e) OSC-20經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  294. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97及DMS 53，其中： (a) MKN-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA及modLYK6； (b) MKN-45經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (c) MKN-74經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現； (d) OCUM-1經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少CD276之表現； (e) Fu97經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modWT1及modCLDN18；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  295. 一種癌症疫苗之單位劑量，該癌症疫苗包含六種組合物，其中各組合物包含大約1.0×107 個細胞之癌細胞株CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D及DMS 53，其中： (a) CAMA-1經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modPSMA； (b) AU565經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；(ii)減少TGFβ2及CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTERT；且 (c) HS-578T經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (d) MCF-7經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ1、TGFβ2及CD276之表現； (e) T47D經修飾以(i)增加GM-CSF、IL-12及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少CD276之表現；及(iii)經修飾以表現modTBXT及modBORIS；且 (f) DMS 53經修飾以(i)增加GM-CSF及膜結合之CD40L的表現；及(ii)減少TGFβ2及CD276之表現。
  296. 如請求項235、236、238、240、242、244、246、248、250或252中任一項之組合物，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。
  297. 如請求項287至1295中任一項之單位劑量，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。
  298. 如請求項278至286中任一項之套組，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。
  299. 如請求項256至277中任一項之方法，其中DMS 53進一步經修飾以提高IL-12之表現。
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