JP2023504659A - 腫瘍細胞ワクチン - Google Patents
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Abstract
本開示は、がんを治療および予防するための組成物および方法を含む、同種全細胞がんワクチンプラットフォームを提供する。本明細書において、治療有効量の１つ以上のがん細胞株からの細胞を含む組成物が提供され、その一部またはすべてが、（Ｉ）細胞により１つ以上の免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させ、かつ／または（ＩＩ）細胞により１つ以上の免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、かつ／または（ＩＩＩ）１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（変異されているＴＡＡを含む）を発現するかもしくはその発現を増加させるように改変され、それには、腫瘍関連抗原および／またはネオ抗原の不均一性を天然に発現するがん細胞株が含まれる。また、本明細書において、ワクチン組成物の作製方法、調製方法、およびそれらの使用方法も提供される。
Description
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本開示の一部である配列表を明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「５４９０７Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは、２０２０年１１月２９日に作成され、３４３，８０１バイトのサイズである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
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がんは、主要な死因である。チェックポイント阻害剤を含む免疫療法アプローチにおける最近のブレイクスルーは、がんの治療を大幅に進歩させたが、これらのアプローチは、適応症全体もしくは適応症内のすべての患者にカスタマイズ可能でもなく、広く適用可能でもない。さらに、患者のサブセットのみがこれらの免疫療法アプローチに適格であり、それに反応する。治療用がんワクチンは、がん患者の臨床応答を誘発することができる抗腫瘍免疫応答を生成する可能性があるが、これらの療法の多くは、単一の標的を有するか、またはその他免疫調節標的の範囲および／もしくは抗原特異性の幅が制限される。個々の腫瘍内の細胞の不均一性を標的とする適応症のためにカスタマイズされた治療用ワクチンの開発は、依然として課題である。
治療用がんワクチンのプラットフォームの大部分は、本質的に、単一の製剤で標的化され得る抗原の数が制限されている。これらのワクチンの幅の欠如は、有効性に悪影響を及ぼし、抗原陰性腫瘍細胞の出現を伴う抗原回避と呼ばれる現象による臨床的再発につながる可能性がある。これらのアプローチは腫瘍負荷をいくらか減らし得、抗原陰性の腫瘍細胞やがん幹細胞を排除するものではない。患者自身の免疫系を利用して幅広く抗原を標的とすることで、腫瘍負荷を軽減するだけでなく、免疫応答の抗原の不均一性による再発を防ぐことができる。したがって、改善された全細胞のがんワクチンの必要性が存在する。本明細書において、この必要性に対処する方法および組成物が提供される。
様々な実施形態では、本開示は、同種全細胞がんワクチンのプラットフォームを提供し、がんを治療および予防するための組成物および方法を含む。本開示は、様々な固形腫瘍の適応症の治療がカスタマイズ可能であり、個々の腫瘍内の細胞の不均一性を標的とする、組成物および方法を提供する。本開示の実施形態の組成物および方法は、固形腫瘍の適応症全体およびかかる適応症に罹患した患者に広く適用可能である。一部の実施形態では、本開示は、（ｉ）本明細書に記載のように改変され、（ｉｉ）十分な数および量の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する、がん細胞株の組成物を提供し、がん（複数可）または癌性腫瘍に罹患した対象に投与した場合、ＴＡＡ特異的免疫応答が生成されるようになる。
一実施形態では、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、細胞株または細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、当該組成物は、少なくとも５つのＴＡＡに特異的な免疫応答を誘発することができる。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、細胞株または細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも１０の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、当該組成物は、少なくとも１０のＴＡＡに特異的な免疫応答を誘発することができる。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、細胞株または細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも１５の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、当該組成物は、少なくとも１５のＴＡＡに特異的な免疫応答を誘発することができる。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせが、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも１５の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせが、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている。さらに別の実施形態では、前述の組成物が本明細書に提供され、当該組成物は、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５倍以上のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる。
別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせが、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている。別の実施形態では、前述の組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせが、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＴＡＡを発現する細胞を含む。別の実施形態では、組成物は、２、３、４、５、または６つのがん細胞株を含む。さらに別の実施形態では、各細胞株または細胞株の組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、または８つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている。さらに別の実施形態では、各細胞株または細胞株の組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、または８つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている。
本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現またはその発現を増加させるように改変されている細胞を含む。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、細胞株のうちの少なくとも１つが、ＣＤ２７６、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２のうちの１つ以上をノックダウンまたはノックアウトするように改変されている。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、当該少なくとも１つの免疫刺激因子が、樹状細胞の成熟を増加させる。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、当該組成物は、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５倍以上のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、当該組成物は、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１．５倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、当該組成物は、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１．５倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる。さらに別の実施形態では、治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、当該組成物は、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１．７倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる。さらに別の実施形態では、治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、当該組成物は、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも２．０倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる。
一実施形態では、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む。
別の実施形態では前述の免疫原性組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ／あるいは（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のＴＡＡの発現を増加させるように改変されている。別の実施形態では、前述の免疫原性組成物が本明細書に提供され、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、または２倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる。
さらに別の実施形態では、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む。別の実施形態では、治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む。
一部の実施形態では、前述の免疫原性組成物が提供され、組成物は、４、５、または６つのがん細胞株を含む。一部の実施形態では、各細胞株または細胞株の組み合わせは、１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以上のＴＡＡの発現を増加させるように改変されている細胞を含む。別の実施形態では、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ／あるいは（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のＴＡＡの発現を増加させるように改変されている。
本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、各細胞株または細胞株の組み合わせは、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ／あるいは（ｉｉｉ）ＣＴ８３、ＭＳＬＮ、ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＴＢＸＴ、ＢＯＲＩＳ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＣ２、ＷＴ１、ＦＢＰ、ＴＤＧＦ１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＬＹＫ６Ｋ、ＦＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６／Ｅ７、もしくそれらの変異バージョンのうちの１つ以上を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含む。一部の実施形態では、変異バージョンは、（ｉ）ｍｏｄＴＥＲＴ、ｍｏｄＰＳＭＡ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＢＯＲＩＳ、ｍｏｄＦＳＨＲ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０、ｍｏｄＭＡＧＥＣ２、ｍｏｄＷＴ１、ｍｏｄＫＲＡＳ、ｍｏｄＦＢＰ、ｍｏｄＴＤＧＦ１、ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、ｍｏｄＬＹ６Ｋ、ｍｏｄＦＡＰ、およびｍｏｄＰＲＡＭＥからなる群から選択される改変バージョン、または（ｉｉ）ｍｏｄＣＴ８３－ＭＳＬＮ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｐｐ６５、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＢＯＲＩＳ、ｍｏｄＦＳＨＲ－ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＭＡＧＥＣ２、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１－ＫＲＡＳ、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＦＢＰ、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＴＤＧＦ１、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＬＹ６Ｋ、ｍｏｄＦＡＰ－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、およびｍｏｄＰＲＡＭＥ－ｍｏｄＴＢＸＴからなる群から選択される融合タンパク質を含む。さらに他の実施形態では、変異バージョンは、（ｉ）ｍｏｄＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（配列番号６２）、ｍｏｄＴＥＲＴ（配列番号３６）、ｍｏｄＰＳＭＡ（配列番号３８）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１（配列番号７３）、ｍｏｄＴＢＸＴ（配列番号７９）、ｍｏｄＢＯＲＩＳ（配列番号６０）、ｍｏｄＦＳＨＲ（配列番号９５）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０（配列番号９７）、ｍｏｄＭＡＧＥＣ２（配列番号８７）、ｍｏｄＷＴ１（配列番号８１）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（配列番号８３）もしくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（配列番号８５）、ｍｏｄＦＢＰ（配列番号９３）、ｍｏｄＴＤＧＦ１（配列番号８９）、ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８（配列番号１１０）、ｍｏｄＬＹＫ６Ｋ（配列番号１１２）、ｍｏｄＦＡＰ（配列番号１１５）、およびｍｏｄＰＲＡＭＥ（配列番号９９からなる群から選択される改変バージョン、または（ｉｉ）ＣＴ８３－ＭＳＬＮ（配列番号２２）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｐｐ６５（配列番号４０）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＢＯＲＩＳ（配列番号４２）、ｍｏｄＦＳＨＲ－ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０（配列番号４４）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＭＡＧＥＣ２（配列番号４６）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１（配列番号４８）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１（ＫＲＡＳ）（配列番号５０）、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＦＢＰ（配列番号５２）、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＴＤＧＦ１（配列番号５４）、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８（配列番号５６）、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＬＹ６Ｋ（配列番号５８）、およびｍｏｄＰＲＡＭＥ－ｍｏｄＴＢＸＴ（配列番号６６）からなる群から選択される融合タンパク質を含む。
本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、当該がん幹細胞株は、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている。別の実施形態では、治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、当該がん幹細胞株は、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている。別の実施形態では、治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、当該細胞株は、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）がん幹細胞株によって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡの発現を増加させるように改変されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのＴＡＡは、ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＴＢＸＴ、ＢＯＲＩＳ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＣ２、ＷＴ１、ＫＲＡＳ、ＦＢＰ、ＴＤＧＦ１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＬＹ６Ｋ、ＦＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６／Ｅ７、およびＦＡＰ、またはそれらの変異バージョンからなる群から選択される。
本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、当該がん幹細胞株は、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）がん幹細胞株によって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている。別の実施形態では、治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、当該がん幹細胞株は、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）がん幹細胞株によって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている。一部の実施形態では、がん幹細胞株は、ＪＨＯＭ－２Ｂ、ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶ５６、ＪＨＯＳ－４、ＪＨＯＣ－５、ＯＶＣＡＲ－４、ＪＨＯＳ－２、ＥＦＯ－２１、ＣＦＰＡＣ－１、Ｃａｐａｎ－１、Ｐａｎｃ０２．１３、ＳＵＩＴ－２、Ｐａｎｃ０３．２７、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＲＶＨ－４２１、Ｈｓ８９５．Ｔ、Ｈｓ ９４０．Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ｈｓ９３６．Ｔ、ＳＨ－４、ＣＯＬＯ８００、ＵＡＣＣ－６２、ＮＣＩ－Ｈ２０６６、ＮＣＩ－Ｈ１９６３、ＮＣＩ－Ｈ２０９、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＣＯＲ－Ｌ４７、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＮＣＩ－Ｈ１４３６、ＣＯＲ－Ｌ９５、ＣＯＲ－Ｌ２７９、ＮＣＩ－Ｈ１０４８、ＮＣＩ－Ｈ６９、ＤＭＳ５３、ＨｕＨ－６、Ｌｉ７、ＳＮＵ－１８２、ＪＨＨ－７、ＳＫ－ＨＥＰ－１、Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７、ＳＮＵ－１０６６、ＳＮＵ－１０４１、ＳＮＵ－１０７６、ＢＩＣＲ１８、ＣＡＬ－３３、ＹＤ－８、ＣＡＬ－２９、ＫＭＢＣ－２、２５３Ｊ、２５３Ｊ－ＢＶ、ＳＷ７８０、ＳＷ１７１０、ＶＭ－ＣＵＢ－１、ＢＣ－３Ｃ、ＫＮＳ－８１、ＴＭ－３１、ＮＭＣ－Ｇ１、ＧＢ－１、ＳＮＵ－２０１、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＹＫＧ－１、ＥＣＣ１０、ＲＥＲＦ－ＧＣ－１Ｂ、ＴＧＢＣ－１１－ＴＫＢ、ＳＮＵ－６２０、ＧＳＵ、ＫＥ－３９、ＨｕＧ１－Ｎ、ＮＵＧＣ－４、ＳＮＵ－１６、ＯＣＵＭ－１、Ｃ２ＢＢｅ１、Ｃａｃｏ－２、ＳＮＵ－１０３３、ＳＷ１４６３、ＣＯＬＯ ２０１、ＧＰ２ｄ、ＬｏＶｏ、ＳＷ４０３、ＣＬ－１４、ＨＣＣ２１５７、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１８０６、ＨＣＣ１５９９、ＭＤＡ－ＭＢ－４１５、ＣＡＬ－５１、ＫＯ５２、ＳＫＮＯ－１、Ｋａｓｕｍｉ－１、Ｋａｓｕｍｉ－６、ＭＨＨ－ＣＡＬＬ－３、ＭＨＨ－ＣＡＬＬ－２、ＪＶＭ－２、ＨＮＴ－３４、ＨＯＳ、ＯＵＭＳ－２７、Ｔ１－７３、Ｈｓ８７０．Ｔ、Ｈｓ７０６．Ｔ、ＳＪＳＡ－１、ＲＤ－ＥＳ、Ｕ２ＯＳ、ＳａＯＳ－２、ＳＫ－ＥＳ－１、ＭＫＮ－４５、ＨＳＣ－３、ＨＳＣ－４、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、およびＳＣＣ－９からなる群から選択される。
本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含む組成物が本明細書に提供され、当該細胞株ＤＭＳ５３は、（ｉ）ＴＧＦβ２をノックダウンし、（ｉｉ）ＣＤ２７６をノックアウトし、かつ（ｉｉｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の発現を上方制御するように改変されている。本開示の別の実施形態では、治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含む組成物が本明細書に提供され、当該細胞株ＤＭＳ５３は、（ｉ）ＴＧＦβ２をノックダウンし、（ｉｉ）ＣＤ２７６をノックアウトし、かつ（ｉｉｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を上方制御するように改変されている。本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含むワクチン組成物が本明細書に提供され、当該組成物は、当該細胞株ＤＭＳ５３によって発現される少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する。本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、細胞株のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、細胞株のうちの少なくとも１つは、小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３であり、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、または少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させるように改変されている細胞を含む。本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、少なくとも１つの細胞株は、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、１つの細胞株は、小細胞肺癌ＤＭＳ５３である。
本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含む組成物が本明細書に提供され、当該細胞株は、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている。本開示のさらに別の実施形態では、治療有効量の３つのがん細胞株を含む組成物が本明細書に提供され、各細胞株は、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、細胞株のうちの１つは、小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３である。
一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、当該組成物は、ワクチン組成物である。一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、当該組成物は、対象における免疫応答を誘発することができる。一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、当該組成物は、３、４、５、６、７、８、９、または１０のがん細胞株を含む。一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、当該組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるための改変を含む。一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、当該組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるための改変を含む。一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、当該組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＴＡＡを発現するかまたはその発現を増加させるための改変を含む。一実施形態では、ＴＡＡのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、変異またはネオエピトープを含むように改変されている。
本開示の一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、当該免疫応答は、自然免疫応答、適応免疫応答、細胞性免疫応答、および／または体液性応答である。一実施形態では、免疫応答は、適応免疫応答である。一部の実施形態では、適応免疫応答は、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、およびＢ細胞からなる群から選択される抗原特異的細胞の産生を含む。本開示の他の実施形態では、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、メモリー細胞、１型ヘルパーＴ細胞、９型ヘルパーＴ細胞、１７型ヘルパーＴ細胞、２２型ヘルパーＴ細胞、および濾胞性ヘルパーＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞は、メモリー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球を含む。他の実施形態では、抗原特異的Ｂ細胞は、メモリー細胞、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、および免疫グロブリンＡを含む。一部の実施形態では、各細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも１０のＴＡＡを発現する。他の実施形態では、ＴＡＡはまた、当該組成物を受けることが意図された対象のがんにおいても発現される。
一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、治療有効量は、約８×１０6細胞の各細胞株を含む。別の実施形態では、治療有効量は、約１×１０7細胞の各細胞株を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、約１．０×１０6～６．０×１０7細胞の各細胞株を含む。一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、治療有効量は、ほぼ等しい数の細胞の各細胞株を含む。一部の実施形態では、前述の組成物が本明細書に提供され、細胞株は、遺伝的に不均一な同種、遺伝的に均一な同種、遺伝的に不均一な異種、遺伝的に均一な異種、または同種および異種の組み合わせである。
様々な実施形態では、前述の組成物が本明細書に提供され、細胞株は、肺、前立腺、精巣、乳房、結腸、膀胱、胃腸系、脳、脊髄、尿路、結腸、直腸、胃、頭頸部、肝臓、腎臓、中枢神経系、内分泌系、中皮、卵巣、子宮内膜、膵臓、食道、神経内分泌系、子宮、または皮膚に由来する固形腫瘍の親細胞株に由来する。一部の実施形態では、親細胞株は、扁平上皮細胞、癌腫細胞、腺癌細胞、腺扁平上皮細胞、大細胞性細胞、小細胞性細胞、肉腫細胞、明細胞癌細胞、癌肉腫細胞、混合中胚葉細胞、および奇形癌細胞からなる群から選択される細胞を含む。一部の実施形態では、肉腫細胞は、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、中皮腫、線維肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、粘液肉腫、間葉性または混合中胚葉性を含む。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、非小細胞肺癌細胞株または小細胞肺癌細胞株である。他の実施形態では、細胞株は、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、小細胞肺癌細胞株である。他の実施形態では、細胞株は、ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ－Ｈ１９６、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＳＢＣ－５、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＮＣＩ－Ｈ１３４１、ＮＣＩＨ－１８７６、ＮＣＩ－Ｈ２０２９、ＮＣＩ－Ｈ８４１、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ１６９４からなる群から選択される。他の実施形態では、細胞株（複数可）は、前立腺癌細胞株または精巣癌細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＰＣ３、ＤＵ－１４５、ＬＮＣＡＰ、ＮＥＣ８、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、大腸癌細胞株である。他の実施形態では、細胞株は、ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、およびＬＳ４１１Ｎからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、乳房またはトリプルネガティブ乳癌細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、Ｈｓ５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄからなる群から選択される。他の実施形態では、細胞株（複数可）は、膀胱癌細胞株または尿路癌細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ、ＨＴ－１３７６、およびＳＣａＢＥＲからなる群から選択される。他の実施形態では、細胞株（複数可）は、頭頸部癌細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＨＳＣ－４、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＫＯＮ、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＯＳＣ－２０からなる群から選択される。他の実施形態では、細胞株（複数可）は、胃癌または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、Ｆｕ９７、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ４５、ＯＣＵＭ－１、およびＭＫＮ１からなる群から選択される。他の実施形態では、細胞株（複数可）は、肝臓癌または肝細胞癌株（ＨＣＣ）細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、Ｈｅｐ－Ｇ２、ＪＨＨ－２、ＪＨＨ－４、ＪＨＨ－５、ＪＨＨ－６、Ｌｉ７、ＨＬＦ、ＨｕＨ－１、ＨｕＨ－６、およびＨｕＨ－７からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、神経膠芽腫がん細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０からなる群から選択される。他の実施形態では、細胞株（複数可）は、卵巣癌細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＥＳ－２、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＭＣＡＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、食道癌細胞株である。他の実施形態では、細胞株は、ＴＥ－１０、ＴＥ－６、ＴＥ－４、ＥＣ－ＧＩ－１０、ＯＥ３３、ＴＥ－９、ＴＴ、ＴＥ－１１、ＯＥ１９、およびＯＥ２１からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、腎臓癌または腎細胞癌（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）癌細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、Ａ－４９８、Ａ－７０４、７６９－Ｐ、７８６－Ｏ、ＡＣＨＮ、ＫＭＲＣ－１、ＫＭＲＣ－２、ＶＭＲＣ－ＲＣＺ、およびＶＭＲＣ－ＲＣＷからなる群から選択される。他の実施形態では、１つ以上の細胞株は、膵臓癌細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１１からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、子宮内膜癌細胞株である。他の実施形態では、細胞株は、ＳＮＧ－Ｍ、ＨＥＣ－１－Ｂ、ＪＨＵＥＭ－３、ＲＬ９５－２、ＭＦＥ－２８０、ＭＦＥ－２９６、ＴＥＮ、ＪＨＵＥＭ－２、ＡＮ３－ＣＡ、およびＩｓｈｉｋａｗａからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞株（複数可）は、皮膚または黒色腫がん細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＲＰＭＩ－７９５１、ＭｅＷｏ、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、ＣＯＬＯ８２９、Ｃ３２、Ａ－３７５、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ８５２Ｔ、およびＡ２０５８からなる群から選択される。他の実施形態では、細胞株（複数可）は、中皮腫がん細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は、ＮＣＩ－Ｈ２８、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＩＳＴ－Ｍｅｓ１、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ２０５２、ＮＣＩ－Ｈ２４５２、ＭＰＰ８９、およびＩＳＴ－Ｍｅｓ２からなる群から選択される。
一部の実施形態では、本開示は、がん幹細胞株をさらに含む、前述の組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、細胞株ＤＭＳ５３をさらに含む、前述の組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、前述の組成物を提供し、細胞株のうちの１つが、他の細胞株のうちの少なくとも１つとは異なるがんの細胞株である。別の実施形態では、少なくとも３つの細胞株は、それぞれ同じタイプのがんである。一部の実施形態では、少なくとも３つの細胞株は、各々異なる細胞組織型または分子サブタイプである。一部の実施形態では、本開示は、前述の組成物を提供し、細胞組織型が、扁平上、癌腫、腺癌、大細胞、小細胞、および肉腫からなる群から選択される。
一部の実施形態では、本開示は、前述の組成物を提供し、少なくとも１つの免疫刺激因子の発現を増加させるための改変が、少なくとも１つの免疫刺激因子をコードするレンチウイルスベクター（複数可）の使用を含む。一実施形態では、少なくとも１つの免疫刺激因子は、未改変細胞株と比較して、少なくとも２．０倍高いレベルで発現される。別の実施形態では、少なくとも１つの免疫刺激因子は、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、およびＩＬ－１２からなる群から選択される。別の実施形態では、免疫刺激因子は、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２である。別の実施形態では、免疫刺激因子は、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１５である。別の実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号８を含む。別の実施形態では、膜結合ＣＤ４０Ｌは、配列番号３を含む。別の実施形態では、ＩＬ－１２は、配列番号１０を含む。
一部の実施形態では、本開示は、前述の組成物を提供し、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるための改変が、当該少なくとも１つの免疫抑制因子のノックアウトまたはノックダウンを含む。他の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現が、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、または３０％減少する。別の実施形態では、改変は、ノックダウンである。
一部の実施形態では、本開示は、前述の組成物を提供し、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるための改変が、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現をノックダウンすること、および異なる免疫抑制因子の発現をノックアウトすることの組み合わせを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制因子は、ＣＤ２７６、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３からなる群から選択される。別の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制因子は、ＣＤ２７６、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２からなる群から選択される。別の実施形態では、免疫抑制因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６である。さらに別の実施形態では、免疫抑制因子は、ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６である。本開示のさらに別の実施形態では、免疫抑制因子は、ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１は、配列番号２５を含むショートヘアピンＲＮＡを使用してノックダウンされる。他の実施形態では、ＴＧＦβ２は、配列番号２４を含むショートヘアピンＲＮＡを使用してノックダウンされる。さらに他の実施形態では、ＣＤ２７６は、配列番号２６を含むＣＤ２７６のゲノムＤＮＡ配列を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ対を使用してノックアウトされる。
一部の実施形態では、本開示は、前述の組成物を提供し、組成物が、ＨＬＡスーパータイプの不均一性を発現する細胞株を含み、少なくとも２つの異なるＨＬＡ－Ａおよび少なくとも２つのＨＬＡ－Ｂスーパータイプが表現される。一部の実施形態では、組成物は、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ０８、ＨＬＡ－Ｂ２７、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプの主要組織適合複合体分子を発現する。他の実施形態では、組成物は、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ２７、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプの主要組織適合複合体分子を発現する。さらに他の実施形態では、組成物は、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ０８、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプを発現する。一部の実施形態では、本開示は、細胞株が、遺伝的に均一な細胞株である、前述の組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、細胞株が、遺伝的に不均一な細胞株である、前述の組成物を提供する。
本開示によって、様々な方法が企図され、提供される。一実施形態では、本開示は、対象における免疫応答を刺激する方法を提供し、対象に、治療有効量の前述の組成物を投与することを含む。一実施形態では、本開示は、対象において、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、対象に、治療有効量の前述の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、対象における免疫応答を刺激する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の２つの前述の組成物を投与することを含む。一実施形態では、対象における免疫応答を刺激する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に記載の２つ以上の組成物を投与することを含み、組成物は、異なる組み合わせの細胞株を含む。一実施形態では、対象における免疫応答を刺激する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に記載の２つの組成物を投与することを含み、組成物が、各々、３つの異なる細胞株を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的またはワクチン特異的な免疫グロブリンＧ抗体の産生の増加を含む。他の実施形態では、免疫応答は、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＣＣＬ５、またはＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上の産生の増加を含む。一実施形態では、免疫応答は、ＩＦＮγの産生の増加を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、グランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン、およびＣＤ１０７ａの産生の増加を含む。他の実施形態では、免疫応答は、制御性Ｔ細胞、単核単球由来サプレッサー細胞、および多形核由来サプレッサー細胞のレベルの低下を含む。さらに他の実施形態では、免疫応答は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベル、好中球／リンパ球比（ＮＬＲ）、および血小板／リンパ球比（ＰＬＲ）の低下を含む。他の実施形態では、免疫応答は、腫瘍微小環境における免疫浸潤の変化を含む。
一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の２つ以上の本明細書に記載の組成物を投与することを含み、組成物が、異なる組み合わせの細胞株を含む。一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の２つの本明細書に記載の組成物を投与することを含み、組成物が、各々、３つの異なる細胞株を含む。一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含み、対象に、治療有効量の化学療法剤を投与することをさらに含む。一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に記載の１つ以上の組成物を投与することを含み、対象に、治療有効量のシクロホスファミドを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、治療有効量のシクロホスファミドは、治療有効量の組成物を投与する前の１～１０日間、５０ｍｇ／日を含む。
一実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含み、対象に、治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、および２Ｂ４の阻害剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、セトレリマブ、ドスタルリマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、デュルバルマブ、およびニボルマブからなる群から選択される。他の実施形態では、前述の方法が提供され、対象に、単離された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を投与することをさらに含む。一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含み、対象に、ＡＬＫ、ＰＡＲＰ、ＶＥＧＦＲｓ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１－３、ＨＩＦ１α、ＰＤＧＦＲ１－２、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－ＫＩＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＡＲ、ＰＲ、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＳＴＡＴ３、Ｒａｓ、ＨＤＡＣ１－１１、ｍＴＯＲ、およびＣＸＣＲ４の阻害剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を投与することをさらに含む。
一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に提供される組成物を投与することを含み、対象に、治療有効量の放射線療法を施すことをさらに含む。一実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が本明細書に提供され、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含み、患者に、癌治療手術を施すことをさらに含む。一実施形態では、対象における２つ以上のがんを同時に治療する方法が本明細書に提供され、対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物を調製する方法が本明細書に提供され、（ａ）少なくとも５、１０、１５、または２０以上のＴＡＡを発現する１つ以上のがん細胞株を選択するステップと、（ｂ）（ａ）の１つ以上のがん細胞株の各々を改変するステップであって、細胞株または細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ／あるいは（ｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡの発現を増加させるように改変されている細胞を含む、改変するステップと、を含む。一実施形態では、細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるようにさらに改変されている細胞を含む。別の実施形態では、改変するステップは、１つ以上のベクターを、細胞株のうちの１つ以上に導入することを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のベクターはレンチウイルスベクターである。さらに別の実施形態では、本方法は、改変された細胞株を異種不含培地に適合させるステップをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、細胞株を照射するステップをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、細胞を凍結保存培地に適合させるステップをさらに含む。
様々な実施形態では、本開示は、前述の方法を提供し、組成物（複数可）が、非経口、経腸、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、節内、鼻腔内、経皮、吸入、粘膜、および局所からなる群から選択される投与経路によって、対象に投与される。一実施形態では、経路は、皮内である。一部の実施形態では、組成物（複数可）は、腕（複数可）、大腿（複数可）、および背中からなる群から選択される対象の投与部位に投与される。別の実施形態では、組成物は、対象の異なる投与部位に皮内投与される。別の実施形態では、組成物は、投与部位の表面から５～１５度の角度で配置された注射器を用いる注射によって皮内投与される。一部の実施形態では、対象におけるがんを治療する方法が提供され、対象に、治療有効量の本明細書に提供される１つ以上の組成物の第１の用量および治療有効量のその後の用量を投与することを含み、１つ以上の組成物が、１年目に１～２４回、２年目に１～１６回、３年目に１～１４回投与される。別の実施形態では、本開示は、対象における免疫応答を刺激する方法を提供し、対象に、治療有効量の本明細書に提供される２つの組成物の第１の用量を投与することを含み、第１の用量が、６３日目まで２１日ごとに４回投与され、次いで、追加の用量が、１８９日目まで４２日ごとに３回投与される。一実施形態では、本方法は、追加の用量を、３９９日目まで４２日間隔で５回投与し、次いで、その後、８４日間隔で少なくとも２回投与することをさらに含む。
別の実施形態では、本開示は、対象における免疫応答を刺激する方法を提供し、対象に、治療有効量の本明細書に提供される２つの組成物の第１の用量およびその後の用量を投与することを含み、第１の用量が、４２日目まで１４日ごとに４回投与され、次いで、追加の用量が、１６８日目まで４２日ごとに３回投与される。一実施形態では、本方法は、対象に、追加の５回の用量を、３７８日目まで４２日間隔で投与し、次いで、その後、８４日間隔で少なくとも２回投与することをさらに含む。
別の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、対象に、治療有効量の２つの組成物を投与することを含み、各組成物が、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変された少なくとも２つのがん細胞株を含み、一方の組成物が、対象の上半身に投与され、他方の組成物が、対象の下半身に投与される。別の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、対象に、治療有効量の２つの組成物の第１の用量およびその後の用量を投与することを含み、各組成物が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌのうちの１つ以上を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６のうちの１つ以上の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡの発現を増加させるように改変された少なくとも２つのがん細胞株を含み、一方の組成物が、対象の上半身に投与され、他方の組成物が、対象の下半身に投与される。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、対象に、１つ以上の治療剤または治療を投与することをさらに含む。他の実施形態では、対象は、他のワクチンまたは治療剤による治療を控える。一部の実施形態では、治療剤または治療は、放射線療法、化学療法、手術、小分子阻害剤、およびチェックポイント阻害剤からなる群から選択される。一実施形態では、治療剤は、シクロホスファミドである。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、および２Ｂ４の阻害剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、セトレリマブ、ドスタルリマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、デュルバルマブ、またはニボルマブである。一部の実施形態では、１つ以上の治療剤または治療は、当該第１の用量および／または当該その後の用量を少なくとも１回投与する前に、投与される。他の実施形態では、１つ以上の治療剤または治療は、当該組成物の各投与の前、同時、または後に投与される。さらに他の実施形態では、第１の治療剤は、当該第１の用量の前に投与され、第２の治療剤は、当該第１の用量および当該その後の用量と同時に投与される。
別の実施形態では、本開示は、対象における免疫応答を刺激する方法を提供し、ａ．対象に、治療有効量の本明細書に提供される２つの組成物の第１の用量を投与することであって、当該２つの組成物が、異なる部位で同時に投与される、第１の用量を投与すること、および当該第１の用量を投与した後、対象に、当該２つの組成物のその後の用量を投与することであって、当該２つの組成物が、異なる部位で同時に投与される、その後の用量を投与することと、ｂ．任意選択的に、（ａ）の第１の用量を投与する前の１～１０日間、および任意選択的に、（ａ）の当該その後の用量を投与する前の１～１０日間、対象に、治療有効量のシクロホスファミドを投与することと、ｃ．任意選択的に、（ｉ）（ａ）の各用量と同時に、または（ｉｉ）（ａ）の第１の用量に続いて、１、２、３、もしくは４週間ごとに、対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む。別の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、ａ．対象に、治療有効量の本明細書に記載の２つの組成物の第１の用量を投与すること、および当該第１の用量を投与した後、対象に、当該２つの組成物のその後の用量を投与することであって、当該２つの組成物が、異なる部位で同時に投与される、投与することと、ｂ．任意選択的に、（ａ）の第１の用量を投与する前の１～１０日間、および任意選択的に、（ａ）の当該その後の用量を投与する前の１～１０日間、対象に、シクロホスファミドを投与することと、ｃ．任意選択的に、（ｉ）（ａ）の各用量と同時に、または（ｉｉ）（ａ）の第１の用量に続いて、１、２、３、もしくは４週間ごとに、対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む。別の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、ａ．対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物の第１の用量を投与すること、および当該第１の用量を投与した後、対象に、当該２つの組成物のその後の用量を投与することであって、当該２つの組成物が、異なる部位で同時に投与され、当該その後の用量が、当該第１の用量の投与の３、６、９、１５、２１、および２７週間後に投与される、投与することと、ｂ．（ａ）の当該第１の用量および当該その後の用量を投与する前の７日間、毎日、対象に、シクロホスファミドを投与することと、ｃ．（ａ）の当該第１の用量の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７週間後に、対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む。一実施形態では、シクロホスファミドは、経口投与され、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブであり、静脈内投与される。別の実施形態では、シクロホスファミドは、５０ｍｇの投与量で経口投与され、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブであり、２００ｍｇの投与量で静脈内投与される。
別の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、ａ．対象に、治療有効量の本明細書に提供される２つの組成物の第１の用量を投与すること、および当該第１の用量を投与した後、対象に、当該２つの組成物のその後の用量を投与することであって、当該２つの組成物が、異なる部位で同時に投与され、当該その後の用量が、当該第１の用量の投与の２、４，６、１２、１８、および２４週間後に投与される、投与することと、ｂ．（ａ）の当該第１の用量および当該その後の用量を投与する前の７日間、毎日、対象に、シクロホスファミドを投与することと、ｃ．（ａ）の当該第１の用量の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、および３０週間後に、対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む。一実施形態では、シクロホスファミドは、５０ｍｇの投与量で経口投与され、チェックポイント阻害剤は、デュルバルマブであり、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与される。他の実施形態では、本方法は、組成物の投与前の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間、および組成物の投与後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間、カンナビノイドの投与を控えるステップをさらに含む。
一部の実施形態では、各々が、グループまたは個別に包含され、対象は、肺癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、神経膠腫、子宮内膜癌、卵巣癌、膵臓癌、黒色腫、および中皮腫からなる群から選択されるがんに罹患している。一実施形態では、乳癌は、トリプルネガティブ乳癌である。別の実施形態では、神経膠腫は、星状細胞腫である。さらに別の実施形態では、星状細胞腫は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。
本開示はまた、キットを提供する。一実施形態では、本開示は、本明細書に提供される１つ以上の組成物を含むキットを提供する。別の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのバイアルを含むキットを提供し、当該バイアルは、本明細書に記載の組成物を含む。別の実施形態では、本開示は、第１のバイアルに第１のワクチン組成物を含み、第２のバイアルに第２のワクチン組成物を含む、キットを提供し、当該第１および第２のワクチン組成物が、各々、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている少なくとも２つのがん細胞株を含む。さらに別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むＡキットを提供し、バイアルは、各々、がん細胞株を含む組成物を含み、６つのバイアルのうちの少なくとも４つが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ／あるいは（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ／あるいは（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは細胞株の組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡの発現を増加させるように改変されているがん細胞株を含み、バイアルのうちの少なくとも４つが、異なる組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、使用説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、がんの治療に使用される。
本明細書に提供される組成物の単位用量も企図される。一実施形態では、本開示は、がんを治療するための薬剤の単位用量を提供し、異なるがん細胞株の６つの組成物を含み、少なくとも４つの組成物が、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞株を含む。一部の実施形態では、細胞株は、以下を含む：（ａ）非小細胞肺癌細胞株および／もしくは小細胞肺癌細胞株（ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３からなる群から選択される）、（ｂ）ＤＭＳ５３および５つの小細胞肺癌細胞株（ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ－Ｈ１９６、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＳＢＣ－５、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＮＣＩ－Ｈ１３４１、ＮＣＩＨ－１８７６、ＮＣＩ－Ｈ２０２９、ＮＣＩ－Ｈ８４１、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ１６９４からなる群から選択される）、（ｃ）ＤＭＳ５３および前立腺癌細胞株もしくは精巣癌細胞株（ＰＣ３、ＤＵ－１４５、ＬＮＣＡＰ、ＮＥＣ８、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１）、（ｄ）ＤＭＳ５３および大腸癌細胞株（ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、およびＬＳ４１１Ｎ）、（ｅ）ＤＭＳ５３および乳癌もしくはトリプルネガティブ乳癌細胞株（Ｈｓ５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄ）、（ｆ）ＤＭＳ５３および膀胱癌もしくは尿路癌細胞株（ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ、ＨＴ－１３７６、およびＳＣａＢＥＲ）、（ｇ）ＤＭＳ５３および頭頸部癌細胞株（ＨＳＣ－４、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＫＯＮ、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＯＳＣ－２０）、（ｈ）ＤＭＳ５３および胃癌もしくは胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）細胞株（Ｆｕ９７、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ４５、ＯＣＵＭ－１、およびＭＫＮ１）、（ｉ）ＤＭＳ５３および５つの肝臓癌もしくは肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株（Ｈｅｐ－Ｇ２、ＪＨＨ－２、ＪＨＨ－４、ＪＨＨ－５、ＪＨＨ－６、Ｌｉ７、ＨＬＦ、ＨｕＨ－１、ＨｕＨ－６、およびＨｕＨ－７からなる群から選択される）、（ｊ）ＤＭＳ５３および神経膠芽腫がん細胞株（ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０）、（ｋ）ＤＭＳ５３および卵巣癌細胞株（ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＥＳ－２、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＭＣＡＳからなる群から選択される）、（ｌ）ＤＭＳ５３および５つの食道癌細胞株（ＴＥ－１０、ＴＥ－６、ＴＥ－４、ＥＣ－ＧＩ－１０、ＯＥ３３、ＴＥ－９、ＴＴ、ＴＥ－１１、ＯＥ１９、およびＯＥ２１からなる群から選択される）、（ｍ）ＤＭＳ５３および５つの腎臓癌もしくは腎細胞癌がん細胞株（Ａ－４９８、Ａ－７０４、７６９－Ｐ、７８６－Ｏ、ＡＣＨＮ、ＫＭＲＣ－１、ＫＭＲＣ－２、ＶＭＲＣ－ＲＣＺ、およびＶＭＲＣ－ＲＣＷからなる群から選択される）、（ｎ）ＤＭＳ５３および膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１１）、（ｏ）ＤＭＳ５３および５つの子宮内膜癌細胞株（ＳＮＧ－Ｍ、ＨＥＣ－１－Ｂ、ＪＨＵＥＭ－３、ＲＬ９５－２、ＭＦＥ－２８０、ＭＦＥ－２９６、ＴＥＮ、ＪＨＵＥＭ－２、ＡＮ３－ＣＡ、およびＩｓｈｉｋａｗａからなる群から選択される）、（ｐ）ＤＭＳ５３および５つの皮膚癌もしくは黒色腫がん細胞株（ＲＰＭＩ－７９５１、ＭｅＷｏ、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、ＣＯＬＯ８２９、Ｃ３２、Ａ－３７５、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ８５２Ｔ、およびＡ２０５８からなる群から選択される）、または（ｑ）ＤＭＳ５３および５つの中皮腫がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ２８、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＩＳＴ－Ｍｅｓ１、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ２０５２、ＮＣＩ－Ｈ２４５２、ＭＰＰ８９、およびＩＳＴ－Ｍｅｓ２からなる群から選択される）。
別の実施形態では、本開示は、がんを治療するための薬剤の単位用量を提供し、異なるがん細胞株の６つの組成物を含み、各細胞株が、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させ、かつ／または（ｉｉｉ）がん細胞株によって発現されないかもしくは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡを発現するかもしくはその発現を増加させるように改変されている。一部の実施形態では、各々３つの細胞株を含む２つの組成物が混合される。
別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、およびＡ５４９を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、当該治療有効量が、各細胞株について、約１．０×１０7細胞または約６×１０7細胞である。さらに別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、（ａ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｃ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、（ａ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｃ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、当該治療有効量が、各細胞株について、約１．０×１０7細胞または約６×１０7細胞である。
別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、およびＳＦ－１２６を含み、（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、およびＨｕＴｕ－８０を含み、（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、（ｂ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１を含み、（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰを含み、（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｂ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄを含み、（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｂ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＤＥＴＲＯＩＴ５６２を含み、（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、（ｂ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４を含み、（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、およびＨＳ－５７８Ｔを含み、（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物を提供し、治療有効量のがん細胞株ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、前述のワクチン組成物を提供し、当該治療有効量が、各細胞株について、約１．０×１０7細胞または約６×１０7細胞である。
一実施形態では、本開示は、組成物を提供し、第１のカクテルおよび第２のカクテルを含み、当該第１のカクテルが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変された、治療有効量の少なくとも２つの照射がん細胞株を含み、当該第２のカクテルが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変された細胞株ＤＭＳ５３を含む。一実施形態では、当該第１のカクテルおよび／または当該第２のカクテルは、ＣＴ８３、ＭＳＬＮ、ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＴＢＸＴ、ＢＯＲＩＳ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＣ２、ＷＴ１、ＫＲＡＳ、ＦＢＰ、ＴＤＧＦ１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＬＹＫ６Ｋ、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ１６／１８Ｅ６／Ｅ７、もしくはそれらの変異バージョンを発現するかまたはその発現を増加させるように改変された１つ以上の細胞株を含む。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における神経膠芽腫と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６を含み、（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における神経膠芽腫を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６を含み、（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における大腸癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、およびＨｕＴｕ－８０を含み、（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における大腸癌を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、およびＨｕＴｕ－８０を含み、（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における前立腺癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１を含み、（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における前立腺癌を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１を含み、（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における膀胱癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰを含み、（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における膀胱癌を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰを含み、（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における卵巣癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄを含み、（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における卵巣癌を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄを含み、（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における頭頸部癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２を含み、（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における頭頸部癌を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２を含み、（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における胃癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４を含み、（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における胃癌を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４を含み、（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における乳癌にと関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。別の実施形態では、本開示は、ヒト対象における乳癌を治療する方法を提供し、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、およびＨＳ－５７８Ｔを含み、（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、第１のワクチン組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２のワクチン組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象におけるＮＳＣＬＣと関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、ｂ．（ａ）の当該１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、第１の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、第２の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させるように改変されている、第１の用量をさらに投与することと、ｃ．（ａ）の当該１週間後、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、ｄ．（ｂ）の当該第１の用量の投与の３、６、９、１５、２１、および２７週間後に、第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、ｅ．（ｃ）の当該第１の用量の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７週間後に、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、第１の組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２の組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
さらに別の実施形態では、本開示は、ヒト対象におけるがんと関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、ｂ．（ａ）の当該１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、第１の組成物が、本明細書に提供される組成物であり、第２の組成物が、本明細書に提供される異なる組成物である、第１の用量をさらに投与することと、ｃ．（ａ）の当該１週間後、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、ｄ．（ｂ）の当該第１の用量の投与の３、６、９、１５、２１、および２７週間後に、第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、ｅ．（ｃ）の当該第１の用量の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７週間後に、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、第１の組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２の組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象におけるＮＳＣＬＣと関連するＴＡＡに特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、ｂ．（ａ）の当該１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、第１の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、第２の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させるように改変されている、第１の用量をさらに投与することと、ｃ．（ａ）の当該１週間後、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、ｄ．（ｂ）の当該第１の用量の投与の２、４、１０、１６、２２、および２８週間後に、第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、ｅ．（ｃ）の当該第１の用量の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、および３０週間後に、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、第１の組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２の組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
別の実施形態では、本開示は、ヒト対象におけるＮＳＣＬＣと関連するＴＡＡに特異的な免疫応答を刺激する方法を提供し、ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、ｂ．（ａ）の当該１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、第１の組成物が、本明細書に適用される組成物であり、第２の組成物が、本明細書に適用される異なる組成物である、第１の用量をさらに投与することと、ｃ．（ａ）の当該１週間後、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、ｄ．（ｂ）の当該第１の用量の投与の２、４、１０、１６、２２、および２８週間後に、第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、ｅ．（ｃ）の当該第１の用量の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、および３０週間後に、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、第１の組成物が、対象の腕に皮内投与され、第２の組成物が、対象の大腿に皮内投与される。
さらに別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３の細胞を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
さらに別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変され、（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
さらに別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３の細胞をほぼ含み、（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つのバイアルを含むキットを提供し、各バイアルが、がん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含む肺癌ワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変され、（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
さらに別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
さらに別の実施形態では、本開示は、６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量を提供し、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている。
一部の実施形態では、前述の組成物が提供され、ＩＬ－１２の発現を増加させるために、ＤＭＳ５３がさらに改変されている。一部の実施形態では、本開示は、前述の単位用量を提供し、ＩＬ－１２の発現を増加させるために、ＤＭＳ５３がさらに改変されている。他の実施形態では、前述のキットが提供され、ＩＬ－１２の発現を増加させるために、ＤＭＳ５３がさらに改変されている。さらに他の実施形態では、本開示は、前述の方法を提供し、ＩＬ－１２の発現を増加させるために、ＤＭＳ５３がさらに改変されている。
本開示の実施形態は、がんワクチン接種へのプラットフォームアプローチを提供し、これは、開示される組成物、方法、およびレジメンによる治療に適したがんのタイプの点での幅と、開示される組成物、方法、およびレジメンによって誘発される免疫応答の点での大きさの両方を提供する。
本開示の様々な実施形態では、同種全がん細胞ワクチンの皮内注射は、注射部位に免疫細胞を動員する局所的な炎症反応を誘発する。いずれの理論やメカニズムに縛られることなく、ワクチンの投与後、ランゲルハンス細胞（ＬＣ）や真皮樹状細胞（ＤＣ）などの皮膚（ワクチン微小環境、ＶＭＥ）に局所的に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、貪食によってワクチン細胞成分を取り込み、次いで、真皮を通って流入領域リンパ節に移動する。流入領域リンパ節では、ワクチン細胞株の成分を貪食したＤＣまたはＬＣは、ナイーブＴ細胞およびＢ細胞を刺激することができる。ナイーブＴ細胞およびＢ細胞のプライミングは、ワクチン細胞株によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する適応免疫応答を開始する。本開示の一部の実施形態では、プライミングは、インビボで起こり、インビトロまたはエクスビボでは起こらない。本明細書に提供されるワクチン組成物の実施形態では、ワクチン細胞株によって発現される多数のＴＡＡもまた、対象の腫瘍で発現される。流入領域リンパ節での抗原特異的Ｔ細胞の増殖と、これらのＴ細胞の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への輸送は、ワクチン誘導性の抗腫瘍応答を開始することができる。
同種ワクチンの免疫原性は、ＴＡＡ（本明細書に記載のように天然／野生型または設計／変異）を導入するためのワクチン組成物を含む細胞株の遺伝子改変によって増強することができる。同種ワクチンの免疫原性は、ワクチン組成物を含む細胞株の遺伝子改変によってさらに増強され、免疫抑制因子の発現を減少させ、かつ／または免疫刺激シグナルの発現もしくは分泌を増加させ得る。これらの因子の調節は、真皮内のＬＣおよびＤＣによるワクチン細胞成分の取り込みを増強し、流入領域リンパ節へのＤＣおよびＬＣの輸送を促進し、流入領域リンパ節におけるエフェクターＴ細胞およびＢ細胞のプライミングを増強し、それによって、より強力な抗腫瘍応答が得られる。
様々な実施形態では、本開示は、同種全細胞がんワクチンのプラットフォームを提供し、がんを治療する、かつ／またはがんを予防する、かつ／または免疫応答を刺激するための組成物および方法を含む。本開示の実施形態による基準および方法には、限定されないが、（ｉ）ワクチン組成物に含めるための細胞株選択のための基準および方法、（ｉｉ）複数の細胞株を治療用ワクチン組成物へと組み合わせるための基準および方法、（ｉｉｉ）細胞株の改変を行うための基準および方法、ならびに（ｉｖ）追加の治療剤の有無にかかわらず治療用組成物を投与するための基準および方法が含まれる。一部の実施形態では、本開示は、同種全細胞がんワクチンプラットフォーム（限定されないが、１つの単位用量を一緒に含む細胞株の組み合わせを含む複数のカクテルの投与を含む）を提供し、単位用量が、経時的に戦略的に投与され、さらに、任意選択的に、シクロホスファミド、およびさらに、任意選択的に、チェックポイント阻害剤などの他の治療剤の投与を含む。
本開示は、一部の実施形態では、対象の腫瘍タイプに基づいて対象の治療レジメンを調整するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんワクチンのプラットフォームを提供し、それによって、同種細胞株が特定され、任意選択的に改変され、対象に投与される。様々な実施形態では、細胞株の腫瘍起源（原発部位）、細胞株によって発現されるＴＡＡの量および数、細胞株の改変の数、ならびに単位用量に含まれる細胞株の数は、各々、対象の腫瘍タイプ、がんの病期、および他の考慮事項に基づいてカスタマイズされる。本明細書に記載されるように、細胞株の腫瘍起源は、治療されることが意図される腫瘍と同じまたは異なる可能性がある。一部の実施形態では、がん細胞株は、がん幹細胞株であり得る。
定義
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味する。同様に、「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、米国特許法に帰する意味を有し、これらの用語は、オープンエンドであり、記載されているものの基本的なまたは新規の特徴である限り、記載されているものを超える存在を可能にし、記載されているものは、記載されているものを超える存在によって変化しないが、先行技術の実施形態を除外する。
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味する。同様に、「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、米国特許法に帰する意味を有し、これらの用語は、オープンエンドであり、記載されているものの基本的なまたは新規の特徴である限り、記載されているものを超える存在を可能にし、記載されているものは、記載されているものを超える存在によって変化しないが、先行技術の実施形態を除外する。
特に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、単数形または複数形であると理解される。
「細胞」、「細胞株」、「癌細胞株」、「腫瘍細胞株」などの用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載の癌性腫瘍に由来する細胞株、および／または特定の発生源／臓器／組織に由来する腫瘍の親細胞株に由来する細胞株を指す。一部の実施形態では、がん細胞株は、本明細書に記載されるがん幹細胞株である。特定の実施形態では、がん細胞株は、複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を発現することが知られているか、またはそれらを発現する。本開示の一部の実施形態では、がん細胞株は、１つ以上のＴＡＡを発現するように改変されているか、またはその発現を増加させるように改変されている。特定の実施形態では、がん細胞株は、任意の数の細胞継代、増殖培地または条件の任意の変化、細胞株の特徴を変化させ得る改変の導入（例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）不死化など）、異種移植技術の使用（例えば、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）もしくは次世代配列決定（ＮＧＳ）マウスなどの異種モデルの連続継代を含む）、および／または細胞株の混合集団を提供するための１つ以上の他の細胞株との共培養に続く細胞株を含む。本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語は、一部の実施形態では、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）配列決定によって決定されるか、またはその他当業者によって決定される、プロファイルもしくはセグメントに任意の重複を有すると特定されたすべての細胞株を含む。本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語はまた、細胞株を構成する細胞が、それらが遺伝的に同一であるように単一の細胞にクローン的に由来するという点で、任意の遺伝的に均一な細胞株を包含する。これは、例えば、不均一な細胞株の限界希釈サブクローニングによって達成することができる。「細胞株」という用語はまた、細胞株を構成する細胞が、遺伝的に同一であるとは予想されず、がん細胞の複数の亜集団を含むという点で、任意の遺伝的に不均一な細胞株を包含する。細胞株の様々な例が本明細書に記載されている。特に明記しない限り、「細胞株」または「がん細胞株」という用語は、複数の「細胞株」を包含する。
本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、異常な細胞の蓄積または集団を指す。腫瘍は、良性（非がん性）、前悪性（過形成、異型、化生、異形成および上皮内癌を含む前がん性）、または悪性（がん性）である可能性がある。腫瘍が、「ホット」または「コールド」であり得ることはよく知られている。例として、とりわけ、黒色腫および肺癌は、チェックポイント阻害剤に対して比較的高い応答率を示し、一般に「ホット」腫瘍と称される。これらは、「コールド」腫瘍と呼ばれる免疫浸潤の少ない腫瘍または非Ｔ細胞炎症性がん（とりわけ、前立腺癌、膵臓癌、神経膠芽腫、膀胱癌由来のものなど）とは対照的である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、関連するホット腫瘍を伴うがんを治療または予防するのに有用である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、コールド腫瘍を伴うがんを治療または予防するのに有用である。本開示のワクチン組成物の実施形態を使用して、コールド（すなわち、治療抵抗性または難治性）のがんまたは腫瘍を、ホット（すなわち、チェックポイント阻害に基づく治療を含む治療に適している）のがんまたは腫瘍に変換することができる。コールド腫瘍に対する免疫応答は、低い変異負荷と関連するネオエピトープが欠如しているために弱まる。様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物は、多数の外因性抗原エピトープを生成することができる点変異から生じる多数の潜在的なネオエピトープを含む。このように、患者の免疫系は、これらのエピトープを非自己として認識し、その後、自己寛容を破り、コールド腫瘍に対する抗腫瘍応答（広範囲の抗原に対する適応免疫応答の誘導を含む）を開始することができる（Ｌｅｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１９）を参照されたい）。
がん幹細胞は、腫瘍発生、細胞増殖、および転移の開始に関与し、化学療法および放射線療法後の再発の重要な要素である。特定の実施形態では、がん幹細胞株またはがん幹細胞の特徴を示す細胞株は、ワクチン組成物のうちの１つ以上に含まれる。本明細書で使用される場合、「がん幹細胞」（ＣＳＣ）または「がん幹細胞株」という語句は、自己再生し、腫瘍を含むがん細胞の不均一な系統を引き起こす能力を有する腫瘍内の細胞または細胞株を指す。ＣＳＣは、従来のがん療法に対して非常に耐性であり、転移および腫瘍再発の主要な推進力であると仮定されている。明確にするために、がん幹細胞の特徴を示す細胞株は、「がん幹細胞」の定義に含まれる。原発腫瘍部位によって特定された例示的ながん幹細胞マーカーは、表２に提供され、本明細書に記載されている。これらのマーカーのうちの１つ以上を発現する細胞株は、「がん幹細胞株」の定義に包含される。例示的ながん幹細胞株が本明細書に記載されており、それらの各々は、「がん幹細胞株」の定義に包含される。
本明細書で使用される場合、「各細胞株または細胞株の組み合わせ」という語句は、複数の細胞株が組み合わせて提供される場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の細胞株、または細胞株の組み合わせを指す。本明細書で使用される場合、「各細胞株または細胞株の組み合わせが改変された」という語句は、複数の細胞株が組み合わせて提供される場合、１つの、いくつかの、またはすべての細胞株の改変を指し、また、組み合わせに含まれるすべての細胞株が改変されているわけではない可能性も指す。例として、「治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または細胞株の組み合わせが改変された…」という語句は、２つの細胞株の各々が改変されているか、または２つの細胞株のうちの一方が改変されていることを意味する。別の例として、「治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または細胞株の組み合わせが改変された…」という語句は、各々（すなわち、３つすべての）細胞株が改変されているか、または３つの細胞株のうちの１つもしくは２つが改変されていることを意味する。
本明細書で使用される「がん遺伝子」という用語は、腫瘍形成に関与する遺伝子を指す。がん遺伝子は、がんの発症に寄与する変異遺伝子である。正常な変異していない状態では、がん遺伝子は、がん原遺伝子と呼ばれ、細胞分裂の調節に役割を果たす。
本明細書で使用される場合、例えば、本明細書に記載される免疫応答の刺激またはがんの治療に有用な組成物を調製するプロセスにおける「１つ以上の…変異を特定すること」という語句は、新たに特定すること、データベースもしくはデータセット内で、または本明細書に記載される一連の基準またはその１つ以上の構成要素を使用して他の方法で特定すること、および、任意選択的に、本明細書に記載されるワクチン組成物を使用するためにもしくはそれに含めるために、がん遺伝子または変異を選択することを指す。
本明細書で使用される「…当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも［ ］の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する…細胞」という語句は、天然にまたは遺伝子改変によって、指定された数のＴＡＡ（当該同じＴＡＡが、患者の腫瘍の細胞によって発現されるか、または発現されることが知られている）を発現する細胞を指す。患者の腫瘍の細胞による特定のＴＡＡの発現は、アッセイ、外科的処置（例えば、生検）、または当該技術分野で既知の他の方法によって決定することができる。他の実施形態では、臨床医は、がん細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）および他の既知のリソースを調べて、特定の腫瘍タイプの細胞によって発現されることが知られているＴＡＡのリストを特定することができる。
本明細書で使用される場合、「…発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである…」という語句は、参照される遺伝子またはタンパク質（例えば、ＴＡＡまたは免疫抑制タンパク質もしくは免疫刺激タンパク質）が、細胞株によって発現されないか、または低レベルで発現される（かかるレベルは、免疫原性に重要ではないか、またはそれに対する影響が限定的である）ことを意味する。例えば、ＴＡＡが、当該細胞株を含むワクチン組成物の治療効果に所望の影響を与えるのに不十分な量で細胞株に存在し得るか、または発現され得ることが当該技術分野では容易に理解される。このようなシナリオでは、本開示は、かかるＴＡＡの発現を増加させるための組成物および方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「等しい」という用語は、概して、同じ値＋／－１０％を意味する。一部の実施形態では、細胞の数などの測定値は、＋／－１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％であり得る。同様に、本明細書で使用される場合、アミノ酸位置またはヌクレオチド位置に関連して、「約」という用語は、１、２、３、４、または５つ以内のかかる残基を指す。細胞の数に関して、「約」という用語は、＋／－１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％を指す。
本明細書で使用される場合、「…当該組成物は、未改変がん細胞株と比較して、ＩＦＮγ産生の１．３倍の増加を刺激することができる…」という語句は、改変されていない同じ細胞株（複数可）の組成物と比較した場合、改変された細胞株（複数可）を含む組成物が、少なくとも１．３倍以上のＩＦＮγ産生を刺激することができることを意味する。この例では、「少なくとも１．３」とは、１．３、１．４、１．５など、またはそれ超を意味する。この定義は、ＩＦＮγ産生の他の値に関して本明細書で使用され、未改変がん細胞株と比較して（例えば、改変細胞株を改変細胞株と比較して、２もしくは３つの改変細胞株の組成物（例えば、ワクチン組成物）を未改変細胞株を含む同じ組成物と比較して、または６つの改変細胞株を含む単位用量を未改変細胞株を含む同じ単位用量と比較して）、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、４．０、もしくは５．０倍以上のＩＦＮγ産生の増加を含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、ＩＦＮγ産生が、未改変がん細胞株と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５倍以上増加する。同様に、様々な実施形態では、本開示は、改変細胞または改変細胞株の組成物を提供し、これらは、本明細書に提供される方法および当該技術分野で既知の方法（ＥＬＩＳＡ、ＩＦＮγ ＥＬＩスポット、およびフローサイトメトリーを含むが、これらに限定されない）を使用して、ＴＡＡの発現、免疫刺激因子の発現、免疫抑制因子の発現、および／または免疫応答の刺激に基づいて、未改変細胞または未改変細胞株と比較される。
本明細書で使用される場合、「倍率増加」という語句は、対照と比較した発現の単位または応答の単位の変化を指す。例として、ＥＬＩＳＡの倍率変化は、改変された細胞株について検出された分泌タンパク質のレベルを、未改変細胞株による検出された分泌タンパク質のレベル、または検出下限で割ったものを指す。別の例では、フローサイトメトリーによる抗原の発現の倍率変化は、改変細胞株によるタンパク質の発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、未改変細胞株によるタンパク質発現のＭＦＩで割ったものを指す。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔの倍率変化は、ＨＬＡの多様なドナー全体にわたる試験変数によって誘導される平均ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）を、対照変数によって誘導される平均ＩＦＮγ ＳＦＵで割ったものを指す。例えば、ドナー全体にわたる３つの改変細胞株の組成物による平均総抗原特異的ＩＦＮγ ＳＦＵを、同じドナー全体にわたる同じ３つの未改変細胞株の組成物によるＩＦＮγ ＳＦＵで割る。
一部の実施形態では、ＩＦＮγ産生の倍率増加は、各細胞株における改変の数（例えば、免疫刺激因子の数および免疫抑制因子の数）が増加するにつれて、増加するであろう。一部の実施形態では、ＩＦＮγ産生の倍率増加は、改変または未改変にかかわらず、細胞株の数（したがって、ＴＡＡの数）が増加するにつれて、増加するであろう。したがって、一部の実施形態では、ＩＦＮγ産生の倍率増加は、ＴＡＡの数および改変の数に起因する。
本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、１つ以上のタンパク質または核酸を発現、過剰発現する、その発現を増加、減少させる、または阻害するように遺伝子改変されていることを意味する。本明細書に記載されるように、例示的なタンパク質には、免疫刺激因子が含まれるが、これに限定されない。例示的な核酸には、免疫抑制因子をノックダウン（ＫＤ）する（すなわち、その発現を減少させる）か、またはノックアウト（ＫＯ）する（すなわち、その発現を完全に阻害する）ために使用することができる配列が含まれる。本明細書で使用される場合、「減少する」という用語は、「減少する」または「部分的な減少」と同義であり、遺伝子ノックダウンと関連して使用され得る。同様に、「阻害する」という用語は、「完全な減少」と同義であり、細胞からの遺伝子の完全な除去を説明するために遺伝子ノックアウトの文脈で使用され得る。
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、具体的に述べられているか、文脈から明らかでない限り、包含的であると理解される。
本明細書で使用される場合、「患者」、「対象」、「レシピエント」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物および家畜、ならびに他の動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、ヤギを含むが、これらに限定されない）を含む任意の哺乳動物を指す。例示的な対象は、成人、子供、および高齢者を含むヒトである。一部の実施形態では、対象は、ドナーであり得る。
本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、特に明記しない限り、かかる用語が適用される疾患、障害、もしくは状態の過程、またはかかる疾患、障害、もしくは状態の１つ以上の症状を、逆転、緩和、阻害することを指し、症状もしくは合併症の発症を予防し、症状もしくは合併症を軽減し、または疾患、状態、もしくは障害を排除するための本明細書に記載の組成物、薬学的組成物、もしくは剤形のいずれかの投与を含む。本明細書で使用される場合、治療は治癒的または寛解的であり得る。
本明細書で使用される場合、「予防する」とは、かかる用語が適用されるものもしくは事象（例えば、予防される疾患、障害、もしくは状態）の生成または発生を、全体的もしくは部分的に予防、制御、低減、または停止することを意味する。
本明細書に提供される方法および組成物の実施形態は、腫瘍またはがんを予防するために有用であり、これは、腫瘍の発生が予防されるか、または腫瘍の発症が著しく遅延されることを意味する。一部の実施形態では、本方法および組成物は、腫瘍またはがんを治療するために有用であり、これは、当該技術分野で周知の様々な技術によって（例えば、腫瘍体積の減少などによって）示されるように、腫瘍増殖が有意に阻害されることを意味する。腫瘍体積は、様々な既知の手順（例えば、ダイヤルキャリパーで二次元測定値を取得すること）によって、決定することができる。腫瘍の予防および／または治療は、治療されている対象の生存期間の延長をもたらす可能性がある。
本明細書で使用される場合、免疫応答に関して「刺激すること」という用語は、「促進すること」、「生成すること」、および「誘発すること」と同義であり、免疫応答の１つ以上の指標の生成を指す。免疫応答の指標は、本明細書に記載されている。免疫応答は、本明細書に記載のアッセイに従って、および当該技術分野で周知の方法によって、決定および測定することができる。
本明細書で使用される「治療有効量」、「有効量」、「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」などの語句は、対象に、または対象の細胞、組織、もしくは臓器に投与して、治療効果（例えば、改善効果または治癒効果）を達成するのに必要な量を示す。治療有効量は、研究者、獣医、医師、臨床医、または医療提供者が求めている細胞、組織、システム、動物、またはヒトの生物学的もしくは医学的応答を引き出すのに十分である。例えば、組成物の治療有効量は、本明細書に記載されるように、免疫応答を刺激するのに十分な細胞株（改変または未改変にかかわらない）の量である。特定の実施形態では、組成物の治療有効量は、本明細書に記載されるように、腫瘍の増殖を阻害するのに十分な細胞株（改変または未改変にかかわらない）の量である。有効量または治療有効量の決定は、特定の実施形態では、刊行物、データ、または他の情報（例えば、投薬レジメンおよび／または臨床医の経験など）に基づく。
本明細書で使用される場合、「投与すること」、「投与する」、「投与」などの用語は、治療剤を、かかる薬剤による治療を必要とする対象に、移送、送達、導入、または輸送する任意の様式を指す。かかる様式には、経口、局所、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、鼻腔内、および皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ワクチン組成物」という用語は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）の細胞株を含む本明細書に記載のワクチン組成物のうちのいずれかを指す。本明細書に記載されるように、ワクチン組成物中の１つ以上の細胞株は改変され得る。特定の実施形態では、ワクチン組成物中の細胞株のうちの１つ以上は、改変されない可能性がある。「ワクチン」、「腫瘍細胞ワクチン」、「がんワクチン」、「がん細胞ワクチン」、「全がん細胞ワクチン」、「ワクチン組成物」、「組成物」、「カクテル」、「ワクチンカクテル」などは、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、がんを治療または予防するのに有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、免疫応答を刺激または誘発するのに有用である。かか実施形態では、「免疫原性組成物」という用語が使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、当該レジメンの免疫原性を増加させるための治療レジメンの構成要素として有用である。
「用量」または「単位用量」という用語は、本明細書において互換的に使用され、治療有効量の１つ以上の細胞株を含む１つ以上のワクチン組成物を指す。本明細書に記載されるように、組成物の「用量」または「単位用量」は、１、２、３、４、５、またはそれ超の別個の組成物またはカクテルを指し得る。一部の実施形態では、組成物の単位用量は、実質的に同時に投与される２つの別個の組成物を指す（すなわち、即時シリーズ）。例示的な実施形態では、ワクチン組成物の１用量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の別々のバイアルを含み、各バイアルが、細胞株を含み、細胞株が、各々、別々のバイアルから、投与前に混合される。一部の実施形態では、用量または単位用量は、６つのバイアルを含み、各々が細胞株を含み、３つの細胞株が混合されて、ある部位に投与され、他の３つの細胞株が混合されて、第２の部位に投与される。その後の「用量」も同様に投与され得る。さらに他の実施形態では、対象の体の２つの部位に、２つのワクチンカクテルを、合計４回の同時注射で投与することが企図される。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、異常な細胞が制御なしに分裂し、他の組織に侵入することができる疾患を指す。したがって、本明細書で使用される場合、「…対象のがんと関連する」という語句は、対象のがん（複数可）の腫瘍関連抗原、ネオ抗原、または他の遺伝子型もしくは表現型の特性を指す。がんと関連するＴＡＡは、がんの大部分の細胞で検出可能なレベルで発現するＴＡＡである。発現レベルは、本明細書に記載の方法によって検出および決定することができる。がんには１００を超える異なるタイプがある。ほとんどのがんは、それらが始まる臓器または細胞のタイプにちなんで名付けられている。例えば、結腸で発生するがんは、結腸癌と呼ばれ、皮膚のメラノサイトで発生するがんは、黒色腫と呼ばれる。がんのタイプは、より広いカテゴリーに分類され得る。一部の実施形態では、がんは、固形（すなわち、腫瘍形成）癌および液体（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫などの血液の癌）癌として分類され得る。がんの他のカテゴリーには、以下が含まれる：癌腫（皮膚または内臓を裏打ちするかまたは覆う組織で発生するがん、およびそのサブタイプを意味し、腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、および移行上皮癌を含む）、肉腫（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、またはその他の結合組織もしくは支持組織で発生するがんを意味する）、白血病（造血組織（例えば、骨髄）で発生し、多数の異常な血液細胞が生成されて血液に入るがんを意味する）、リンパ腫および骨髄腫（免疫系の細胞から始まるがんを意味する）、ならびに中枢神経系のがん（脳および脊髄の組織で発生するがんを意味する）。骨髄異形成症候群という用語は、骨髄が健康な血液細胞（白血球、赤血球、血小板）を十分に作らず、血液および／または骨髄に異常な細胞があるがんのタイプを指す。骨髄異形成症候群は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）になる可能性がある。非限定的な例として、本明細書に記載の組成物および方法は、本明細書に記載のがんを治療および／または予防するために使用され、様々な実施形態では、肺癌（例えば、非小細胞肺癌または小細胞肺癌）、前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、転移性乳癌、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳癌、炎症性乳癌、パジェット病、乳房血管肉腫、葉状腫瘍、精巣癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、卵巣癌、神経内分泌癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、黒色腫、中皮腫、および／または肝細胞癌が含まれる。
癌腫の例としては、限定されないが、巨細胞癌および紡錘細胞癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮癌、リンパ上皮癌、基底細胞癌、石灰化上皮腫、移行上皮癌、乳頭状移行上皮癌、腺癌、ガストリノーマ、胆管癌、肝細胞癌、混合型肝細胞癌・胆管癌、小柱腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープの腺癌、腺癌、家族性大腸腺腫症、固形癌、カルチノイド腫瘍、気管支肺胞腺癌、乳頭状腺癌、嫌色素性癌、好酸性癌、好酸性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞性腺癌、非被包性硬化癌、副腎皮質癌、類内膜癌、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂腺癌、耳垢腺癌、粘表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭状嚢胞腺癌、乳頭状漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液性腺癌、印環細胞癌、浸潤性乳管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、パジェット病、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生を伴う腺癌、セルトリ細胞癌、胚性癌、および絨毛癌が挙げられる。
肉腫の例としては、限定されないが、グロムス血管肉腫、肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、間質性肉腫、癌肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、骨肉腫、傍骨性骨肉腫、軟骨肉腫、間葉性軟骨肉腫、骨巨細胞腫、ユーイング肉腫、悪性歯原性腫瘍、エナメル上皮歯牙腫、悪性エナメル上皮腫、エナメル上皮線維肉腫、骨髄性肉腫、肥満細胞肉腫が挙げられる。
白血病の例としては、限定されないが、白血病、リンパ性白血病、形質細胞性白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、肥満細胞性白血病、巨核芽球性白血病、有毛細胞性白血病が挙げられる。
リンパ腫および骨髄腫の例としては、限定されないが、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキン側肉芽腫、悪性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、悪性リンパ腫、大細胞リンパ腫、びまん性リンパ腫、悪性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、菌状息肉腫、他の特定の非ホジキンリンパ腫、悪性黒色腫、無色素性黒色腫、表在拡大型黒色腫、巨大色素性母斑内悪性黒色腫、類上皮細胞黒色腫、および多発性骨髄腫が挙げられる。
脳／脊髄癌の例としては、限定されないが、悪性松果体腫、脊索腫、神経膠腫、悪性神経膠肉腫、上衣腫、星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、線維性星細胞腫、星状芽細胞腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、乏突起神経膠芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、嗅覚神経原性腫瘍、悪性髄膜腫、神経線維肉腫、および悪性神経鞘腫が挙げられる。
他のがんの例としては、限定されないが、胸腺腫、卵巣間質腫瘍、莢膜細胞腫、顆粒膜細胞腫、アンドロブラストーマ、ライディッヒ細胞腫、脂質細胞腫、傍神経節腫、乳房外傍神経節腫、褐色細胞腫、悪性青色母斑、悪性線維性組織球腫、悪性混合腫瘍、ミュラー管混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、悪性間葉腫、悪性ブレンナー腫瘍、悪性葉状腫瘍、悪性中皮腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、悪性卵巣甲状腺腫、悪性中腎腫、悪性血管内皮腫、悪性血管周囲細胞腫、悪性軟骨芽細胞腫、悪性顆粒細胞腫、悪性組織球症、および免疫増殖性小腸疾患が挙げられる。
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、その全体が包含され得る。
ワクチン組成物
本開示は、がんワクチン接種へのプラットフォームアプローチを対象とし、開示される組成物、方法、およびレジメンによる治療に適したがんおよび腫瘍タイプの範囲に関して幅を、ならびに開示される組成物およびレジメンによって誘発される免疫応答のレベルに関して大きさを提供する。本開示の実施形態は、がん細胞株を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、細胞株は、本明細書に記載されるように改変されている。
本開示は、がんワクチン接種へのプラットフォームアプローチを対象とし、開示される組成物、方法、およびレジメンによる治療に適したがんおよび腫瘍タイプの範囲に関して幅を、ならびに開示される組成物およびレジメンによって誘発される免疫応答のレベルに関して大きさを提供する。本開示の実施形態は、がん細胞株を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、細胞株は、本明細書に記載されるように改変されている。
本開示の組成物は、免疫原性を増加させ、かつ／または免疫応答を刺激するように設計されている。例えば、一部の実施形態では、本明細書に提供されるワクチンは、ＩＦＮγ産生および複数のＴＡＡに対する免疫応答の幅を増加させ（例えば、ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以上のＴＡＡを標的とすることができる）、これらの抗ＴＡＡ Ｔ細胞前駆体のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの多様性を示す。一部の実施形態では、本明細書に提供されるワクチンによって生成される免疫応答は、所与のＴＡＡと関連する２つ以上のエピトープに対する応答であり（例えば、ワクチンは、所与のＴＡＡ上の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以上のエピトープを標的とすることができる）、これらの抗ＴＡＡ Ｔ細胞前駆体のＴＣＲレパートリーの多様性を示す。
これは、特定の実施形態では、以下によって達成され得る：治療されるがんと関連する多数のＴＡＡを発現する細胞株を選択すること；免疫系の監視からの腫瘍細胞の回避を促進する１つ以上の免疫抑制因子の発現をノックダウンまたはノックアウトすること；ワクチン微小環境（ＶＭＥ）内の免疫活性化を増加させるために、１つ以上の免疫刺激因子を発現させるかまたはその発現の増加させること；宿主免疫系に提示される関連する抗原標的の範囲を拡大するために、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させること（任意選択的に、ＴＡＡ（複数可）が設計または強化され（例えば、変異によって改変され）、例えば、非同義変異（ＮＳＭ）および／またはネオエピトープを含める）、少なくとも１つのがん幹細胞および／またはそれらの任意の組み合わせを含むワクチン組成物を投与すること。
ワクチン組成物の１つ以上の細胞株を改変して、複数の免疫抑制因子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の免疫抑制因子）の産生を減少させることができる。ワクチンの１つ以上の細胞株を改変して、複数の免疫刺激因子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の免疫刺激因子）の産生を増加させることができる。ワクチン組成物の１つ以上の細胞株は、複数のＴＡＡ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以上のＴＡＡ）を自然に発現するか、またはそれらを発現するように改変され得る。
ワクチン組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の細胞株からの細胞を含むことができる。さらに、本明細書に記載されるように、細胞株は、例えば、投与前に、組み合わせるか、または混合することができる。一部の実施形態では、１つ以上の細胞株または細胞株の組み合わせからの１つ以上の免疫抑制因子の産生が、減少または排除され得る。一部の実施形態では、１つ以上の細胞株または細胞株の組み合わせからの１つ以上の免疫刺激因子の産生が、追加または増加され得る。特定の実施形態では、１つ以上の細胞株または細胞株の組み合わせは、ＴＡＡの不均一性を発現するように選択され得る。一部の実施形態では、細胞株は、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、および／またはネオ抗原の産生を増加させるように改変され得る。一部の実施形態では、細胞株選択は、ＨＬＡスーパータイプの不均一性がワクチン組成物において表されることを提供する。一部の実施形態では、細胞株は、ワクチン組成物に含めるために、ＴＡＡの所望の補体が表されるように、選択される。
様々な実施形態では、ワクチン組成物は、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの細胞を含み、細胞株または細胞株の組み合わせが、表７～２３のＴＡＡのうちの２つ以上を発現する。一部の実施形態では、ワクチン組成物が提供され、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株からの細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせが、表７～２３のＴＡＡのうちの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０を発現する。一部の実施形態では、ワクチン組成物が提供され、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの細胞を含み、表４の免疫刺激因子のうちの少なくとも１つ、表４の免疫刺激因子のうちの少なくとも２つ、または表４の免疫刺激因子のうちの少なくとも３つを発現するように改変されている。さらなる実施形態では、ワクチン組成物が提供され、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせは、表６の免疫抑制因子のうちの少なくとも１つ、または表６の免疫抑制因子のうちの少なくとも２つを減少させるように改変されている。
１つ以上の細胞株が１つ以上のＴＡＡの産生を増加させるように改変されている実施形態では、発現されたＴＡＡは、ＤＮＡ／タンパク質の天然のコード配列を有しても、有さなくてもよい。すなわち、発現は、コドン最適化または改変され得る。このような最適化または改変は、特定の効果を増強することができる（例えば、ワクチン細胞膜からのＴＡＡタンパク質の脱落の減少につながり得る）。本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、発現されたＴＡＡタンパク質は、設計された抗原であり、がん患者で特定された１つ以上の非同義変異（ＮＳＭ）を含む。一部の実施形態では、ＮＳＭは、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ４およびＣＤ８ネオエピトープを導入する。
本明細書に記載のワクチン組成物のいずれも、がんを治療し、がんを予防し、がんを有する対象の生存を延長し、かつ／または対象における免疫応答を刺激するために、対象に投与することができる。
細胞株
本開示の様々な実施形態では、ワクチン組成物を含み、本明細書に記載の方法で使用される細胞株は、親がん細胞株に由来する。
本開示の様々な実施形態では、ワクチン組成物を含み、本明細書に記載の方法で使用される細胞株は、親がん細胞株に由来する。
細胞株は、本明細書に記載される多くの供給源から入手可能であり、当該技術分野で容易に知られている。例えば、がん細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ（ＪＣＲＢ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＬＳ，Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＲＣＢ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ，Ｓｅｏｕｌ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＩＨ－ＡＲＰ／Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＤ）、Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ，Ｈｓｉｎｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ）、Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＩＣＬＣ，Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＫＣＢ，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＩ－ＤＴＰ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＢＣＲＪ，Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ，Ｂｒａｚｉｌ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｚｏｏｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌｏｍｂａｒｄｙ ａｎｄ Ｅｍｉｌｉａ Ｒｏｍａｇｎａ（ＩＺＳＬＥＲ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）、Ｔｏｈｏｋｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃａｔａｌｏｇ（ＴＫＧ，Ｍｉｙａｇｉ，Ｊａｐａｎ）、およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｉｒａｎ（ＮＣＢＩ，Ｔｅｈｒａｎ，Ｉｒａｎ）から入手することができる。一部の実施形態では、細胞株は、ＴＡＡに関するＲＮＡ－ｓｅｑデータ、免疫抑制因子の発現、および／または当業者に容易に利用可能な他の情報を調べることによって特定される。
様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法における細胞株は、肺、前立腺、精巣、乳房、尿路、結腸、直腸、胃、頭頸部、肝臓、腎臓、神経系、内分泌系、中皮、卵巣、膵臓、食道、子宮、または皮膚に由来する固形腫瘍の親細胞株に由来する。特定の実施形態では、親細胞株は、扁平上皮細胞、腺癌細胞、腺扁平上皮細胞、大細胞性細胞、小細胞性細胞、肉腫細胞、癌肉腫細胞、混合中胚葉細胞、および奇形癌細胞からなる群から選択される同じまたは異なる組織学の細胞を含む。関連する実施形態では、肉腫細胞は、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、中皮腫、線維肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、粘液肉腫、間葉細胞、または混合中胚葉細胞を含む。
特定の実施形態では、細胞株は、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、前立腺癌、神経膠芽腫、大腸癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、膀胱癌または尿路癌、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肝臓肝細胞（ＨＣＣ）癌、腎臓癌または腎細胞癌（ＲＣＣ）癌、胃癌または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、食道癌、精巣癌、膵臓癌、中枢神経系癌、子宮内膜癌、黒色腫、および中皮癌に由来するがん細胞を含む。
様々な実施形態によれば、細胞株は同種細胞株である（すなわち、同じ種の個体に由来するが、遺伝的に異なり、したがって、免疫学的に不適合である細胞）。特定の実施形態では、細胞株は、遺伝的に不均一な同種である。他の実施形態では、細胞株は、遺伝的に均一な同種である。
同種細胞ベースのワクチンは、患者固有の腫瘍抗原を含まないという点で自家ワクチンとは異なる。本明細書に開示される同種ワクチン組成物の実施形態は、特定の腫瘍タイプのＴＡＡを発現することが知られている実験室で増殖したがん細胞株を含む。本開示の同種細胞株の実施形態は、ワクチン組成物において使用する前に、戦略的に選択され、供給され、改変されている。本開示の実施形態のワクチン組成物は、容易に大量生産することができる。開発、製造、保管、およびその他の分野におけるこの効率は、自家ベースの療法と比較して、コスト削減および経済的利益をもたらすことができる。
腫瘍は、典型的には、非常に不均一ながん細胞の集団で構成され、時間の経過とともに進化および変化する。したがって、このがんの進化および進行を標的としない自己細胞株のみを含むワクチン組成物は、効果的なワクチン接種に必要な広範な免疫応答の誘発において不十分である可能性があると仮定することができる。本明細書に開示されるワクチン組成物の実施形態に記載されるように、特定の遺伝子改変を伴う１つ以上の戦略的に選択された同種細胞株の使用は、この格差に対処する。
一部の実施形態では、同種細胞ベースのワクチンは、治療が求められるがんと同じタイプ（例えば、乳房、前立腺、肺）のがん細胞株に由来する。他の実施形態では、様々なタイプの細胞株（すなわち、異なる原発腫瘍起源からの細胞株）が組み合わされる（例えば、幹細胞、前立腺、精巣）。一部の実施形態では、ワクチン組成物中の細胞株は、治療が求められるがんと同じタイプの細胞株と、異なる原発腫瘍起源からの細胞株との混合物である。
例示的ながん細胞株（以下の表１に提供されるがん細胞株を含むが、これらに限定されない）は、本明細書に記載の組成物および方法における使用が企図される。本明細書で特定される細胞株の供給源は、単に例示的な目的のためである。本明細書の様々な実施形態に記載されている細胞株は、複数の供給源から入手可能であり得る。
表１で特定された細胞株に加えて、以下の細胞株もまた、様々な実施形態で企図される。
様々な実施形態では、１つ以上の非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下のＮＳＣＬＣ細胞株が企図される：ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３。追加のＮＳＣＬＣ細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、ＮＳＣＬＣ細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の前立腺癌細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の前立腺癌細胞株が企図される：ＰＣ３、ＤＵ－１４５、ＬＮＣＡＰ、ＮＥＣ８、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１。追加の前立腺癌細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、前立腺癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の大腸癌（ＣＲＣ）細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の大腸癌細胞株が企図される：ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、およびＬＳ４１１Ｎ。追加の大腸癌細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、ＣＲＣ細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の乳癌またはトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下のＴＮＢＣ細胞株が企図される：Ｈｓ５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄ。追加の乳癌細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、乳癌および／またはＴＮＢＣ癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の膀胱癌または尿路癌細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の尿路癌または膀胱癌細胞株が企図される：ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ、ＨＴ－１３７６、およびＳＣａｂＥＲ。追加の膀胱癌細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、膀胱癌または尿路癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の胃癌または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の胃癌または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞株が企図される：Ｆｕ９７、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ４５、ＯＣＵＭ－１、およびＭＫＮ１。追加の胃癌細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、胃癌または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下のＳＣＣＨＮ細胞株が企図される：ＨＳＣ－４、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＫＯＮ、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＯＳＣ－２０。追加のＳＣＣＨＮ細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、ＳＣＣＨＮ癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下のＳＣＬＣ細胞株が企図される：ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ－Ｈ１９６、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＳＢＣ－５、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＮＣＩ－Ｈ１３４１、ＮＣＩＨ－１８７６、ＮＣＩ－Ｈ２０２９、ＮＣＩ－Ｈ８４１、およびＮＣＩ－Ｈ１６９４。追加のＳＣＬＣ細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、ＳＣＬＣ細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の肝臓癌または肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下のＨＣＣ細胞株が企図される：Ｈｅｐ－Ｇ２、ＪＨＨ－２、ＪＨＨ－４、ＪＨＨ－６、Ｌｉ７、ＨＬＦ、ＨｕＨ－６、ＪＨＨ－５、およびＨｕＨ－７。追加のＨＣＣ細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、肝臓癌またはＨＣＣ癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞株などの１つ以上の腎臓癌が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下のＲＣＣ細胞株が企図される：Ａ－４９８、Ａ－７０４、７６９－Ｐ、７８６－Ｏ、ＡＣＨＮ、ＫＭＲＣ－１、ＫＭＲＣ－２、ＶＭＲＣ－ＲＣＺ、およびＶＭＲＣ－ＲＣＷ。追加のＲＣＣ細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、腎臓またはＲＣＣ癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の神経膠芽腫（ＧＢＭ）癌細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下のＧＢＭ細胞株が企図される：ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０。追加のＧＢＭ細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、ＧＢＭ癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の卵巣癌細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の卵巣細胞株が企図される：ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＥＳ－２、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＭＣＡＳ。追加の卵巣細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、卵巣癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の食道癌細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の食道細胞株が企図される：ＴＥ－１０、ＴＥ－６、ＴＥ－４、ＥＣ－ＧＩ－１０、ＯＥ３３、ＴＥ－９、ＴＴ、ＴＥ－１１、ＯＥ１９、ＯＥ２１。追加の食道細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、食道癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の膵臓癌細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の膵臓細胞株が企図される：ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１。追加の膵臓細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、膵臓癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の子宮内膜癌細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の子宮内膜細胞株が企図される：ＳＮＧ－Ｍ、ＨＥＣ－１－Ｂ、ＪＨＵＥＭ－３、ＲＬ９５－２、ＭＦＥ－２８０、ＭＦＥ－２９６、ＴＥＮ、ＪＨＵＥＭ－２、ＡＮ３－ＣＡ、およびＩｓｈｉｋａｗａ。追加の子宮内膜細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、子宮内膜癌細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の黒色腫がん細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の黒色腫細胞株が企図される：ＲＰＭＩ－７９５１、ＭｅＷｏ、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、ＣＯＬＯ８２９、Ｃ３２、Ａ－３７５、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ８５２Ｔ、およびＡ２０５８。追加の黒色腫細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、黒色腫がん細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
一部の実施形態では、１つ以上の中皮腫がん細胞株が、本開示に従って調製および使用される。例として、以下の中皮腫細胞株が企図される：ＮＣＩ－Ｈ２８、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＩＳＴ－Ｍｅｓ１、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ２０５２、ＮＣＩ－Ｈ２４５２、ＭＰＰ８９、およびＩＳＴ－Ｍｅｓ２。追加の中皮腫細胞株もまた、本開示によって企図される。本明細書に記載されるように、中皮腫がん細胞株を含むワクチンに、ＤＭＳ５３などのがん幹細胞株を含めることも企図される。
本開示によるワクチン組成物の実施形態は、様々なタイプのがんを治療および／または予防するために使用される。一部の実施形態では、ワクチン組成物は、同じタイプのがんに由来するがん細胞株を含み得る。例えば、ワクチン組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮＳＣＬＣ細胞株を含み得、かかる組成物は、ＮＳＣＬＣを治療または予防するのに有用であり得る。特定の実施形態によれば、ＮＣＳＬＣ細胞株を含むワクチン組成物は、ＮＳＣＬＣ以外のがんを治療または予防するために使用することができ、その例が本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、異なるタイプのがんに由来するがん細胞株を含み得る。例えば、ワクチン組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮＳＣＬＣ細胞株、加えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＳＣＬＣ癌細胞株、加えて、任意選択的に、１つまたは他のがん細胞株（例えば、がん幹細胞株）などを含み得、かかる組成物は、ＮＳＣＬＣ、および／または前立腺癌、および／または乳癌などを治療または予防するのに有用であり得る。一部の実施形態によれば、本明細書に記載される異なるがん細胞株を含むワクチン組成物は、様々ながんを治療または予防するために使用され得る。一部の実施形態では、特定の腫瘍におけるＴＡＡまたは複数のＴＡＡの標的化は、生物学的システム内の異なる組織または臓器に由来する細胞株を使用して、同じシステム内の原発癌を標的化することによって最適化される。非限定的な例として、生殖器系（例えば、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精管、精嚢、および前立腺）の腫瘍に由来する細胞株を組み合わせることができ、消化器系（例えば、唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、直腸、および肛門）の腫瘍に由来する細胞株を組み合わせることができ、呼吸器系（例えば、咽頭、喉頭、気管支、肺、および横隔膜）の腫瘍の細胞株を組み合わせることができ、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、および尿道）の腫瘍に由来する細胞株を組み合わせることができる。
ワクチン組成物の様々な実施形態によれば、本開示は、細胞株の組み合わせを含む組成物を提供する。非限定的な例として、細胞株の組み合わせを以下に提供する。以下の各例では、細胞株ＤＭＳ５３（改変また未改変にかかわらない）が、関連するリストにおいて他の５つのがん細胞株と組み合わされている。列挙された各組み合わせ内の１つ以上の細胞株は、本明細書に記載されるように改変され得る。一部の実施形態では、細胞株の組み合わせのいずれの細胞株も改変されていない。
（１）ＮＳＣＬＣの治療および／または予防用：ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３；
（２）ＳＣＬＣの治療および／または予防用：ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ－Ｈ１９６、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＳＢＣ－５、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＮＣＩ－Ｈ１３４１、ＮＣＩＨ－１８７６、ＮＣＩ－Ｈ２０２９、ＮＣＩ－Ｈ８４１、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ１６９４；
（３）前立腺癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＰＣ３、ＤＵ－１４５、ＬＮＣＡＰ、ＮＣＣ－ＩＴ、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１；
（４）大腸癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、およびＬＳ４１１Ｎ；
（５）トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄ；
（６）膀胱癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ、ＨＴ－１３７６、およびＳＣａＢＥＲ；
（７）頭頸部癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＨＳＣ－４、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＫＯＮ、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＯＳＣ－２０；
（８）胃癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ｆｕ９７、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ４５、ＯＣＵＭ－１、およびＭＫＮ１；
（９）肝臓癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ｈｅｐ－Ｇ２、ＪＨＨ－２、ＪＨＨ－４、ＪＨＨ－６、Ｌｉ７、ＨＬＦ、ＨｕＨ－６、ＪＨＨ－５、およびＨｕＨ－７；
（１０）神経膠芽腫の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０；
（１１）卵巣癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＥＳ－２、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＭＣＡＳ；
（１２）食道癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＴＥ－１０、ＴＥ－６、ＴＥ－４、ＥＣ－ＧＩ－１０、ＯＥ３３、ＴＥ－９、ＴＴ、ＴＥ－１１、ＯＥ１９、およびＯＥ２１；
（１３）腎臓癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ａ－４９８、Ａ－７０４、７６９－Ｐ、７８６－Ｏ、ＡＣＨＮ、ＫＭＲＣ－１、ＫＭＲＣ－２、ＶＭＲＣ－ＲＣＺ、およびＶＭＲＣ－ＲＣＷ；
（１４）膵臓癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１；
（１５）子宮内膜癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＳＮＧ－Ｍ、ＨＥＣ－１－Ｂ、ＪＨＵＥＭ－３、ＲＬ９５－２、ＭＦＥ－２８０、ＭＦＥ－２９６、ＴＥＮ、ＪＨＵＥＭ－２、ＡＮ３－ＣＡ、およびＩｓｈｉｋａｗａ；
（１６）皮膚癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＲＰＭＩ－７９５１、ＭｅＷｏ、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、ＣＯＬＯ８２９、Ｃ３２、Ａ－３７５、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ８５２Ｔ、およびＡ２０５８；ならびに
（１７）中皮腫の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＮＣＩ－Ｈ２８、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＩＳＴ－Ｍｅｓ１、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ２０５２、ＮＣＩ－Ｈ２４５２、ＭＰＰ８９、およびＩＳＴ－Ｍｅｓ２。
（２）ＳＣＬＣの治療および／または予防用：ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ－Ｈ１９６、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＳＢＣ－５、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＮＣＩ－Ｈ１３４１、ＮＣＩＨ－１８７６、ＮＣＩ－Ｈ２０２９、ＮＣＩ－Ｈ８４１、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ１６９４；
（３）前立腺癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＰＣ３、ＤＵ－１４５、ＬＮＣＡＰ、ＮＣＣ－ＩＴ、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１；
（４）大腸癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、およびＬＳ４１１Ｎ；
（５）トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄ；
（６）膀胱癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ、ＨＴ－１３７６、およびＳＣａＢＥＲ；
（７）頭頸部癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＨＳＣ－４、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＫＯＮ、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＯＳＣ－２０；
（８）胃癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ｆｕ９７、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ４５、ＯＣＵＭ－１、およびＭＫＮ１；
（９）肝臓癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ｈｅｐ－Ｇ２、ＪＨＨ－２、ＪＨＨ－４、ＪＨＨ－６、Ｌｉ７、ＨＬＦ、ＨｕＨ－６、ＪＨＨ－５、およびＨｕＨ－７；
（１０）神経膠芽腫の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０；
（１１）卵巣癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＥＳ－２、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＭＣＡＳ；
（１２）食道癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＴＥ－１０、ＴＥ－６、ＴＥ－４、ＥＣ－ＧＩ－１０、ＯＥ３３、ＴＥ－９、ＴＴ、ＴＥ－１１、ＯＥ１９、およびＯＥ２１；
（１３）腎臓癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、Ａ－４９８、Ａ－７０４、７６９－Ｐ、７８６－Ｏ、ＡＣＨＮ、ＫＭＲＣ－１、ＫＭＲＣ－２、ＶＭＲＣ－ＲＣＺ、およびＶＭＲＣ－ＲＣＷ；
（１４）膵臓癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１；
（１５）子宮内膜癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＳＮＧ－Ｍ、ＨＥＣ－１－Ｂ、ＪＨＵＥＭ－３、ＲＬ９５－２、ＭＦＥ－２８０、ＭＦＥ－２９６、ＴＥＮ、ＪＨＵＥＭ－２、ＡＮ３－ＣＡ、およびＩｓｈｉｋａｗａ；
（１６）皮膚癌の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＲＰＭＩ－７９５１、ＭｅＷｏ、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、ＣＯＬＯ８２９、Ｃ３２、Ａ－３７５、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ８５２Ｔ、およびＡ２０５８；ならびに
（１７）中皮腫の治療および／または予防用：ＤＭＳ５３、ＮＣＩ－Ｈ２８、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＩＳＴ－Ｍｅｓ１、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ２０５２、ＮＣＩ－Ｈ２４５２、ＭＰＰ８９、およびＩＳＴ－Ｍｅｓ２。
一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物および方法における細胞株は、改変または未改変かにかかわらず、１つ以上のがん幹細胞（ＣＳＣ）の細胞株を含む。ＣＳＣ細胞株の一例は、小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３（改変または未改変かにかかわらない）である。ＣＳＣは、腫瘍の解剖学的起源に応じて異なる固有のマーカーを示す。例示的なＣＳＣマーカーには、プロミニン－１（ＣＤ１３３）、Ａ２Ｂ５、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ１）、ポリコームタンパク質（Ｂｍｉ－１）、インテグリン－β１（ＣＤ２９）、ヒアルロン酸受容体（ＣＤ４４）、Ｔｈｙ－１（ＣＤ９０）、ＳＣＦ受容体（ＣＤ１１７）、ＴＲＡ－１－６０、ネスチン、Ｏｃｔ－４、ステージ特異的胎児性抗原－１（ＣＤ１５）、ＧＤ３（ＣＤ６０ａ）、ステージ特異的胎児性抗原－１（ＳＳＥＡ－１）または（ＣＤ１５）、ステージ特異的胎児性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ステージ特異的胎児性抗原－５（ＳＳＥＡ－５）、およびトムセン－フリーデンライヒ抗原（ＣＤ１７６）が含まれる。
幹細胞のような特性を有する可能性がより高いがん細胞株を特定する発現マーカーは、原発腫瘍の解剖学的起源、臓器、組織を含む様々な要因に応じて異なる。原発腫瘍部位によって同定された例示的ながん幹細胞マーカーは、表２に提供されており、様々な参考文献（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ，ＣＡ ＆ Ｒｏｓｓ，ＡＨ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）、Ｋａｒｓｔｅｎ，Ｕ ＆ Ｇｏｌｅｔｚ，Ｓ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ（２０１３）、Ｚｈａｏ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．（２０１７））にわたって開示されている。
細胞株が由来する原発腫瘍の解剖学的部位に特異的ながん幹細胞様特性の１つ以上のマーカーを発現する例示的な細胞株が、表２に列挙されている。例示的ながん幹細胞株を、表３に提供する。ＣＳＣマーカーの発現は、がん細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）からのＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して決定された（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅから２０１９年１１月２３日に取得；Ｂａｒｒｅｔｉｎａ， Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．（２０１２））。ＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の遺伝子記号をＣＣＬＥ検索に入力し、各ＣＳＣマーカーのｍＲＮＡ発現をダウンロードした。ＲＮＡ－ｓｅｑ値（ＦＰＫＭ）が０より大きい場合、ＣＳＣマーカーの発現を陽性とみなした。
特定の実施形態では、細胞株の組み合わせを含むワクチン組成物は、免疫応答を刺激すること、および／またはがんを予防すること、および／またはがんを治療することができる。本開示は、治療有効量の細胞株を含む１つ以上のワクチン組成物を使用する組成物および方法を提供する。
カクテルまたはワクチン組成物中の様々な個々の細胞株からの細胞の量（例えば、数）は、（本明細書で定義されるように）等しいか、または異なり得る。様々な実施形態では、ワクチン組成物中の細胞株または各細胞株（複数の細胞株が投与される場合）からの細胞の数は、約１．０×１０6、２．０×１０6、３．０×１０6、４．０×１０6、５．０×１０6、６．０×１０6、７．０×１０6、８×１０6、９．０×１０6、１．０×１０7、２．０×１０7、３．０×１０7、４．０×１０7、５．０×１０7、６．０×１０7、８．０×１０7、または９．０×１０7細胞である。
例えば、投与部位ごとに、対象に投与される細胞の総数は、１．０×１０6～９．０×１０7個の範囲であり得る。例えば、２．０×１０6、３．０×１０6、４．０×１０6、５．０×１０6、６．０×１０6、７．０×１０6、８×１０6、９．０×１０6、１．０×１０7、２．０×１０7、３．０×１０7、４．０×１０7、５．０×１０7、６．０×１０7、８．０×１０7、８．６×１０7、８．８×１０7、または９．０×１０7細胞が投与される。
特定の実施形態では、ワクチン組成物の各投与に含まれる細胞株の数は、１～１０細胞株の範囲であり得る。一部の実施形態では、各細胞株からの細胞の数は等しくなく、異なる比率の細胞株が使用される。例えば、１つのカクテルに３つの異なる細胞株から合計５．０×１０7細胞が含まれている場合、１つの細胞株が３．３３×１０7細胞、および残りの２つの細胞株が８．３３×１０6細胞存在する可能性がある。
ＨＬＡ多様性
対象のＨＬＡ分子が、投与されたワクチン組成物の細胞によって発現されるものと異なる場合、ＨＬＡ不一致が発生する。ＨＬＡマッチングのプロセスは、５つの主要なＨＬＡ遺伝子座の特性評価を伴い、これには、３つのクラスＩ遺伝子座ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ、ならびに２つのクラスＩＩ遺伝子座ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１におけるＨＬＡアレルを含む。すべての個人が各遺伝子座で２つのアレルを発現するため、一致または不一致の程度は１０のスケールで計算され、１０／１０では、１０アレルすべて完全に一致している。
対象のＨＬＡ分子が、投与されたワクチン組成物の細胞によって発現されるものと異なる場合、ＨＬＡ不一致が発生する。ＨＬＡマッチングのプロセスは、５つの主要なＨＬＡ遺伝子座の特性評価を伴い、これには、３つのクラスＩ遺伝子座ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ、ならびに２つのクラスＩＩ遺伝子座ＨＬＡ－ＤＲＢ１およびＨＬＡ－ＤＱＢ１におけるＨＬＡアレルを含む。すべての個人が各遺伝子座で２つのアレルを発現するため、一致または不一致の程度は１０のスケールで計算され、１０／１０では、１０アレルすべて完全に一致している。
不一致ＨＬＡ遺伝子座への応答は、免疫系の自然細胞と適応細胞の両方によって媒介される。自然免疫系の細胞内では、ＨＬＡアレルの不一致の認識は単球によってある程度媒介される。いずれの理論やメカニズムに縛られることなく、単球による「非自己」の感知は、単球由来ＤＣの浸潤、続いて、それらの成熟を引き起こし、ナイーブＴ細胞への効率的な抗原提示をもたらす。同種抗原で活性化されたＤＣは、一致した同系抗原によって活性化されたＤＣと比較して、ＩＬ－１２の産生が増加し、この増加したＩＬ－１２の産生が、Ｔｈ１ Ｔ細胞に対する応答の偏向およびＩＦＮγの産生の増加をもたらす。適応免疫システムによるＨＬＡ不一致認識は、Ｔ細胞によってある程度促進される。いずれの理論やメカニズムに縛られることなく、すべての循環Ｔ細胞の１～１０％がアロ反応性であり、自己に存在しないＨＬＡ分子に応答する。これは、従来の外来抗原に反応する内因性Ｔ細胞の頻度よりも数桁大きい。ＨＬＡアレルのこれらの違いを認識し、免疫応答を生成する免疫系の能力は、ドナーと患者の間の移植を成功させるための障壁であり、がんワクチンの開発における障害とみなされている。
９４５もの異なるＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルを、エピトープアンカー残基に対するＨＬＡ分子の結合親和性に基づいて、９つのスーパータイプのうちの１つに割り当てることができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるワクチン組成物は、ＨＬＡスーパータイプの不均一性、例えば、ＨＬＡ－ＡスーパータイプとＨＬＡ－Ｂスーパータイプの混合物を示す。本明細書に記載されるように、個人の民族性（細胞ドナーおよびワクチンを受ける対象の両方に関して）を含むがこれらに限定されないワクチン組成物の所望の不均一性を確実にするために、様々な特徴および基準が考慮され得る。追加の基準が本明細書に記載されている（例えば、実施例２２）。特定の実施形態では、ワクチン組成物は、ＨＬＡスーパータイプの不均一性を発現し、少なくとも２つの異なるＨＬＡ－Ａスーパータイプと、少なくとも２つのＨＬＡ－Ｂスーパータイプとが表現される。
一部の実施形態では、治療有効量の複数の細胞株を含む組成物は、腫瘍細胞ワクチンとレシピエントとの間の複数のクラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡ分子における広範なＨＬＡ不一致を確実にするために提供される。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、ＨＬＡスーパータイプの不均一性を発現し、組成物は、例えば、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ａ０１スーパータイプのうちの２つ、ならびにＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ０８、ＨＬＡ－Ｂ２７、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプのうちの２つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の不均一性を発現する。一部の実施形態では、ワクチン組成物は、ＨＬＡスーパータイプの不均一性を発現し、組成物が、ＭＨＣ分子の不均一性を発現し、かつ少なくともＨＬＡ－Ａ２４が表される。一部の例示的な実施形態では、組成物は、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ２７、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプが表現されるようなＭＨＣ分子の不均一性を発現する。他の例示的な実施形態では、組成物は、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ０８、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプが表現されるようなＭＨＣ分子の遺伝的不均一性を発現する。
患者は、自己のマーカーとして機能する幅広いＨＬＡタイプを示す。非自己細胞に遭遇すると、局所的な炎症反応（ＩＦＮγやＩＬ－２などのサイトカインの放出を促進する）が始まる。一部の実施形態では、ワクチンがアジュバント効果を付与するように送達される場合、ワクチンカクテル内のＨＬＡスーパータイプの不均一性を増加させることで、局所的な炎症反応を増強する可能性がある。本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、がんワクチン組成物によってプライミングされる腫瘍反応性Ｔ細胞の幅、大きさ、および免疫原性の増加は、ＨＬＡタイプの不一致を有するように選択された（例えば、特定のＴＡＡの発現に基づいて）複数の細胞株を含めることによって達成される。本明細書に提供されるワクチン組成物の実施形態は、ＨＬＡ不一致によって生成される追加のアジュバント効果を伴う、対象における幅広く効果的な抗癌応答の効果的なプライミングを可能にする。ワクチン組成物における細胞株の組み合わせの様々な実施形態は、ＨＬＡ－ＡスーパータイプおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプを発現する。非限定的な例が、本明細書の実施例２２に提供されている。
細胞株の改変
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、改変された細胞を含む。改変細胞株は、クローン的に単一の改変細胞に由来し得、すなわち、遺伝的に均一であるか、または遺伝的に不均一な集団に由来し得る。
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、改変された細胞を含む。改変細胞株は、クローン的に単一の改変細胞に由来し得、すなわち、遺伝的に均一であるか、または遺伝的に不均一な集団に由来し得る。
細胞株は、１つ以上の免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、１つ以上の免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させ、かつ／または１つ以上のＴＡＡ（任意選択的に、ネオエピトープを提示するために変異導入されたＴＡＡ（例えば、本明細書に記載されるように、ＮＳＭを用いて設計または増強された抗原）を含む）を発現するかもしくはその発現を増加させるように改変することができる。さらに、細胞株は、マイクロＲＮＡの発現または阻害など、経路を間接的に調節することができる因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変することができる。さらに、細胞株は、非内因性または改変されたエクソソームを分泌するように改変することができる。
ＴＡＡまたは免疫刺激因子を発現するように細胞株を改変することに加えて、本開示はまた、１つ以上のＴＡＡ（例えば、単離されたＴＡＡもしくは精製されたＴＡＡおよび／または組換えＴＡＡ）または免疫刺激因子（例えば、組換え的に産生された治療用タンパク質）を、本明細書に記載のワクチンと同時投与することを企図する。
したがって、様々な実施形態では、本開示は、ワクチンの単位用量を提供し、（ｉ）第１の組成物であって、治療有効量の少なくとも１、２、３、４、５、または６つのがん細胞株を含み、細胞株または細胞株の組み合わせが、当該組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、組成物が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０のＴＡＡに特異的な免疫応答を誘発することができる、第１の組成物と、（ｉｉ）第２の組成物であって、１つ以上の単離されたＴＡＡを含む、第２の組成物と、を含む。他の実施形態では、第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、かつ／または（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させるようにさらに改変された細胞株（複数可）を含む。
免疫刺激因子
免疫刺激タンパク質は、エフェクターＴ細胞の応答および／または体液性免疫応答の有効性を増強および／または増加する、膜結合型、分泌型、またはその両方であるタンパク質である。理論に縛られることなく、免疫刺激因子は、抗腫瘍免疫を強化し、がんワクチンの免疫原性を高めることができる。免疫応答を強化する多くの因子が存在する。例えば、これらの因子は、抗原提示のメカニズムまたはＴ細胞のメカニズムに影響を与える可能性がある。これらの因子の遺伝子の挿入は、ワクチンを抗腫瘍応答の免疫刺激性にすることによって、ワクチン組成物に対する応答を増強することができる。
免疫刺激タンパク質は、エフェクターＴ細胞の応答および／または体液性免疫応答の有効性を増強および／または増加する、膜結合型、分泌型、またはその両方であるタンパク質である。理論に縛られることなく、免疫刺激因子は、抗腫瘍免疫を強化し、がんワクチンの免疫原性を高めることができる。免疫応答を強化する多くの因子が存在する。例えば、これらの因子は、抗原提示のメカニズムまたはＴ細胞のメカニズムに影響を与える可能性がある。これらの因子の遺伝子の挿入は、ワクチンを抗腫瘍応答の免疫刺激性にすることによって、ワクチン組成物に対する応答を増強することができる。
いずれの理論やメカニズムに縛られることなく、ワクチン微小環境（ＶＭＥ）における、ワクチンに含まれる細胞株の組み合わせによる免疫刺激因子の発現は、適応免疫応答の複数の様相を調節することができる。細胞株によるＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１５などの分泌型サイトカインの発現は、ワクチン送達部位の炎症性環境に動員された単球の樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導し、それによって、ＶＭＥにおける抗原提示細胞のプールを濃縮することができる。また、特定のサイトカインの発現は、既に存在するＤＣおよびランゲルハンス細胞（ＬＣ）を成熟させ、活性化することもできる。特定のサイトカインの発現は、Ｔ細胞をエフェクター表現型へとプライミングするように、ＤＣおよびＬＣを誘導することができる。ＤＣは、ＶＭＥでＩＬ－１２を発現するワクチン細胞に遭遇すると、流入領域リンパ節のエフェクターＴ細胞をプライミングし、より効率的な抗腫瘍応答を開始するべきである。ＤＣの成熟化を促進することに加えて、特定の免疫刺激因子がＤＣ上の受容体に結合すると、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のプライミングを抑制しながら、エフェクター表現型を有するＴ細胞のプライミングが促進され得る。特定の免疫刺激因子がＤＣ上の受容体に結合すると、ＤＣの遊走およびＴ細胞性獲得免疫が促進され得る。
本明細書に提供されるワクチン組成物の一部の実施形態では、免疫刺激因子を発現するための改変は、特定の細胞株、または他の実施形態では、ワクチン組成物中に存在するすべての細胞株に対して行われない。
ワクチン組成物の実施形態が本明細書に提供され、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株（例えば、ＧＢＭ細胞株）からの細胞を含み、細胞株が、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の免疫刺激因子の産生を増加させるように改変されている。一部の実施形態では、免疫刺激因子は、表４に提示されるものから選択される。また、例示的なＮＣＢＩ遺伝子ＩＤも提供され、これらは、本開示のワクチン組成物に導入される配列を決定するために、当業者によって利用され得る。これらのＮＣＢＩ遺伝子ＩＤは、単なる例示である。
一部の実施形態では、ワクチン組成物の細胞株は、表４から選択される１つ以上の免疫刺激因子を発現、過剰発現するか、またはその発現を増加させるように改変（例えば、遺伝子改変）され得る。特定の実施形態では、免疫刺激性配列は、天然のヒト配列であり得る。一部の実施形態では、免疫刺激配列は、遺伝子操作された配列であり得る。遺伝子操作された配列は、コドン最適化を介してタンパク質の発現を増加させるために、またはタンパク質の細胞内位置を改変するために（例えば、プロテアーゼ切断部位の変異を通して）改変され得る。
例えば、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかにおけるがん細胞株のうちの少なくとも１つ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）は、１つ以上の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように遺伝子改変され得る。組成物内の細胞によって発現される免疫刺激因子は、すべて同じであり得るか、すべて異なり得るか、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの細胞を含み、少なくとも１つの細胞株が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の表４の免疫刺激因子を発現するように改変されている。一部の実施形態では、組成物は、治療有効量の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のがん細胞株からの細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの細胞株は、表５の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の免疫刺激因子の産生を増加させるように改変されている。一部の実施形態では、組成物は、治療有効量の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のがん細胞株からの細胞を含み、各細胞株が、表４の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の免疫刺激因子の産生を増加させるように改変されている。
一部の実施形態では、組成物は、治療有効量の３つのがん細胞株からの細胞を含み、１、２、または３つすべての細胞株が、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている。
改変の例示的な組み合わせ、例えば、細胞株（複数可）は、他の可能な組み合わせの中でも、以下を含むがそれらに限定されない２つ以上の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている：ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ＋ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－１２＋ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－１５、ＣＤ４０Ｌ＋ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＣＤ４０Ｌ、およびＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－１５＋ＣＤ４０Ｌ。
特定の例では、腫瘍細胞は、ＩＬ－１２Ａ（ＩＬ－１２のｐ３５成分）、ＧＭ－ＣＳＦ（腎臓細胞株）およびＣＤ４０Ｌ（白血病細胞株）を含む免疫刺激因子を発現する。したがって、一部の実施形態では、細胞株はまた、１つ以上の免疫刺激因子の発現を増加させるように改変され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるように、１つ以上の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞株の組み合わせまたは細胞株は、１つ以上の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されていない同じ細胞株または細胞株の組み合わせと比較して、免疫刺激因子を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上発現するであろう。
本明細書に記載のワクチン組成物中の免疫刺激因子を増加させる方法には、ウイルスベクターまたはＤＮＡプラスミドによって発現されるヌクレオチド配列の導入が含まれるが、これらに限定されない。免疫刺激因子の発現またはその発現の増加は、安定的な発現または一過的な発現であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかにおけるがん細胞は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を発現するように遺伝子改変されている。一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、膜結合型である。一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、膜結合型ではない。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、ＣＤ４０Ｌは、膜結合ＣＤ４０Ｌを指す。一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかにおけるがん細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＩＬ－１２、および／またはＩＬ－１５を発現するように遺伝子改変されている。表５に、本明細書に提供される１つ以上の免疫刺激因子の発現に有用な例示的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が提示されている。
配列番号４のアミノ酸配列またはそれをコードする核酸配列（例えば、配列番号５）を含むＧＩＴＲタンパク質が本明細書に提供される。それを発現する１つ以上の細胞株を含むワクチン組成物が本明細書に提供される。
配列番号８のアミノ酸配列またはそれをコードする核酸配列（例えば、配列番号６または配列番号７）を含むＧＭ－ＣＳＦタンパク質が本明細書に提供される。それを発現する１つ以上の細胞株を含むワクチン組成物が本明細書に提供される。
配列番号１０のアミノ酸配列を含むＩＬ－１２タンパク質またはそれをコードする核酸配列（例えば、配列番号９）が本明細書に提供される。それを発現する１つ以上の細胞株を含むワクチン組成物が本明細書に提供される。
配列番号１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５タンパク質またはそれをコードする核酸配列（例えば、配列番号１１）が本明細書に提供される。それを発現する１つ以上の細胞株を含むワクチン組成物が本明細書に提供される。
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－２３タンパク質またはそれをコードする核酸配列（例えば、配列番号１３）が本明細書に提供される。それを発現する１つ以上の細胞株を含むワクチン組成物が本明細書に提供される。
配列番号１６のアミノ酸配列を含むＸＣＬ１タンパク質またはそれをコードする核酸配列（例えば、配列番号１５）が本明細書に提供される。それを発現する１つ以上の細胞株を含むワクチン組成物が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかにおけるがん細胞は、ＣＤ２８、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬＧ）、ＣＤ７０、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ９、ＬＦＡ－１（ＩＴＧＢ２）、ＳＥＬＰ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＥＮＴＰＤ１、ＧＺＭＡ、およびＰＥＲＦ１のうちの１つ以上を発現するように遺伝子改変されている。
一部の実施形態では、ベクターは、免疫刺激性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例示的な免疫刺激分子は、様々なサイトカインのいずれかを含み得る。本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエーターとして１つ以上の他の細胞に作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質を指す。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン）、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ））、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子－αおよびβ、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子（例えば、ＮＧＦ－β）、血小板増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ－αやＴＧＦ－β）、インスリン様増殖因子－ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン（例えば、インターフェロン－α、β、およびγ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ））、顆粒球マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、および顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＴＮＦを含むＩＬ－１からＩＬ－３６まで）、ならびに他のポリペプチド因子（ＬＩＦおよびＫｉｔリガンド（ＫＬ）が含まれる。本明細書での使用が企図される他の免疫調節分子には、ＩＲＦ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４－１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）などが含まれる。
特定の実施形態では、免疫刺激因子をコードするポリヌクレオチドは、コード配列の発現を指示する１つ以上の調節エレメントの制御下にある。様々な実施形態では、２つ以上の（すなわち、２、３、または４つの）免疫刺激因子が、１つの発現ベクター上にコードされる。一部の実施形態では、２つ以上（すなわち、２、３、４、５、または６）の免疫刺激因子が、別々の発現ベクター上にコードされる。目的の遺伝子（複数可）（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、またはＩＬ－１２、および本明細書に記載される他の免疫刺激分子）を含むレンチウイルスは、様々な実施形態において、ＬｉｐｏＤ２９３ＴＭインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、レンチウイルス導入ベクターおよびパッケージングプラスミド（ＯｒｉＧｅｎｅ）を用いて２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクションすることによって、産生される。
レンチウイルス感染の場合、一部の実施形態では、感染の日に５０～８０％細胞コンフルエンシーを達成するように、細胞株を、ウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル）にウェル当たり１～１０×１０5細胞の密度で播種する。播種して１８～２４時間後、細胞は１０μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下でレンチウイルスに感染させる。レンチウイルス感染の１８～２４時間後、細胞を剥離し、より大きい容器に移す。２４～１２０時間後、培地を除去し、抗生物質を補充した新しい培地と交換する。
免疫抑制因子
免疫抑制因子は、膜結合型、分泌型、またはその両方であり、細胞応答の欠損および減少に寄与することができるタンパク質である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）との関連で、様々な免疫抑制因子が特徴付けられている。加えて、特定の免疫抑制因子は、真皮から流入領域リンパ節へのＬＣおよびＤＣの遊走を、負に調節することができる。
免疫抑制因子は、膜結合型、分泌型、またはその両方であり、細胞応答の欠損および減少に寄与することができるタンパク質である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）との関連で、様々な免疫抑制因子が特徴付けられている。加えて、特定の免疫抑制因子は、真皮から流入領域リンパ節へのＬＣおよびＤＣの遊走を、負に調節することができる。
ＴＧＦβ１は、抑制性サイトカインであり、末梢ならびにＴＭＥにおいて複数の免疫細胞のサブセットに対して効果を発揮する。ＶＭＥでは、ＴＧＦβ１は真皮から流入領域リンパ節へのＬＣおよびＤＣの移動を負に調節する。同様に、ＴＧＦβ２は、ほとんどの腫瘍細胞によって分泌され、ＴＧＦβ１と同様の免疫抑制効果を発揮する。ＶＭＥにおいてＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌を減少させるためのワクチン細胞株の改変は、ワクチンがＴＧＦβを介してＬＣまたはＤＣの遊走をさらに抑制しないことを保証する。
ＴＭＥ内では、マクロファージの貪食および腫瘍のクリアランスを防ぐことによる腫瘍の回避様式として、腫瘍細胞上でＣＤ４７の発現が増加する。ＤＣはまた、ＳＩＲＰαも発現し、ＤＣへのＳＩＲＰαのライゲーションは、ＤＣの生存および活性化を抑制することができる。ＴＭＥおよびＶＭＥで役割を果たす可能性のあるワクチンの追加の免疫抑制因子としては、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）およびＣＴＬＡ４が挙げられる。ＴＭＥにおけるＣＤ２７６またはＣＴＬＡ４を発現する腫瘍細胞とのＤＣの接触により、細胞のプライミング、増殖の低減をもたらすＤＣ刺激能力を弱め、かつ／またはＴ細胞の増殖を促進する。ワクチン細胞株でのＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２７６の発現は、ＶＭＥのＤＣまたはＬＣに対して同様の抑制効果を付与する可能性がある。
ワクチン組成物の特定の実施形態では、１つ以上の免疫抑制因子の産生は、そこに含まれる細胞株の細胞において阻害または減少され得る。一部の実施形態では、１つ以上の免疫抑制因子の産生（すなわち、発現）は、ワクチン組成物に含まれる細胞株の細胞において阻害される（すなわち、ノックアウトされるか、または完全に排除される）。一部の実施形態では、細胞株は、免疫抑制因子の発現を低減する（すなわち、減少させる）または阻害するように遺伝子改変され得る。一部の実施形態では、免疫抑制因子は、細胞から完全に除かれる。一部の実施形態では、１つ以上の細胞株は、１つ以上の免疫抑制因子が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％（すなわち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）低減または減少したレベルで産生されるように改変されている。一部の実施形態では、１つ以上の免疫抑制因子は、表６に提示される群から選択される。
同時に、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、および／またはネオ抗原の産生は、本明細書に記載されるワクチン組成物において増加させることができる。ワクチン組成物の一部の実施形態では、細胞による１つ以上の免疫抑制因子の発現の部分的な減少または完全な阻害（例えば、除去および／または検出不可能なレベルでの発現）に加えて、組成物内の細胞型のうちの１つ以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）も、例えば、特定の免疫刺激因子および／またはＴＡＡの発現を確実にすることによって、ワクチンの免疫原性を高めるために遺伝子改変され得る。
これらの作用、改変、および／または因子の任意の組み合わせを使用して、本明細書に記載のワクチン組成物を生成することができる。非限定的な例として、未改変の細胞株よりも、免疫抑制因子の発現を少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％低減または減少させることと、免疫刺激因子の発現を少なくとも２倍高く増加させることの組み合わせは、腫瘍細胞ワクチンの抗腫瘍応答を改善するのに効果的であり得る。別の非限定的な例として、免疫抑制因子を少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％減少させることと、ワクチン組成物において特定のＴＡＡを発現するように細胞を改変することの組み合わせは、腫瘍細胞ワクチンの抗腫瘍応答を改善するのに効果的であり得る。
一部の実施形態では、がんワクチンは、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの細胞を含み、細胞株は、細胞株が少なくとも１つの免疫抑制因子の産生を減少させるように改変され、少なくとも１つの免疫抑制因子が、ＣＤ４７またはＣＤ２７６である。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＴＧＦβ１、および／またはＴＧＦβ２の発現もまた減少される。一部の実施形態では、ワクチン組成物中の１つ以上またはすべての細胞株は、ＣＤ２７６、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている。別の実施形態では、ＣＤ２７６の発現を阻害（例えば、ノックアウト）し、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の発現を減少（例えば、ノックダウン）させるように各々改変された３つの細胞株を含むワクチン組成物が提供される。
一部の実施形態では、がんワクチン組成物は、治療有効量のがん細胞株からの細胞を含み、細胞株が、少なくともＣＤ４７の発現を減少させるように改変されている。一部の実施形態では、ＣＤ４７が、細胞から除去されるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％（すなわち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）減少したレベルで産生される。一部の実施形態では、ＣＤ４７は、細胞から除去されるか、または少なくとも９０％減少したレベルで産生される。１つ以上の細胞株で、追加の免疫抑制因子の産生を減少させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ２７６、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＴＧＦβ１、および／またはＴＧＦβ２の発現もまた、減少または阻害される。これらのワクチン組成物中の１つ以上の細胞株において、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、またはネオ抗原の産生を増加させることができる。
一部の実施形態では、がんワクチン組成物が本明細書に提供され、治療有効量のがん細胞株からの細胞を含み、細胞株が、少なくともＣＤ２７６の産生を減少させるように改変されている。一部の実施形態では、ＣＤ２７６が、細胞から除去されるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％（すなわち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）減少したレベルで産生される。一部の実施形態では、ＣＤ２７６は、細胞から除去されるか、または少なくとも９０％減少したレベルで産生される。１つ以上の細胞株で、追加の免疫抑制因子の産生を減少させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＴＧＦβ１、および／またはＴＧＦβ２の発現もまた、減少または阻害される。これらのワクチン組成物中の１つ以上の細胞株において、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、またはネオ抗原の産生を増加させることができる。
一部の実施形態では、がんワクチン組成物が本明細書に提供され、治療有効量のがん細胞株からの細胞を含み、細胞株が、少なくともＨＬＡ－Ｇの産生を減少させるように改変されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇが、細胞から除去されるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％（すなわち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）減少したレベルで産生される。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、細胞から除去されるか、または少なくとも９０％減少したレベルで産生される。１つ以上の細胞株で、追加の免疫抑制因子の産生を減少させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４７、ＣＤ２７６、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＧＦβ１、および／またはＴＧＦβ２の発現もまた、減少または阻害される。これらのワクチン組成物中の１つ以上の細胞株において、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、またはネオ抗原の産生を増加させることができる。
一部の実施形態では、がんワクチン組成物が本明細書に提供され、治療有効量のがん細胞株からの細胞を含み、細胞株が、少なくともＣＴＬＡ４の産生を減少させるように改変されている。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４が、細胞から除去されるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％（すなわち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）減少したレベルで産生される。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４は、細胞から除去されるか、または少なくとも９０％減少したレベルで産生される。１つ以上の細胞株で、追加の免疫抑制因子の産生を減少させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４７、ＣＤ２７６、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＧＦβ１、および／またはＴＧＦβ２の発現もまた、減少または阻害される。これらのワクチン組成物中の１つ以上の細胞株において、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、またはネオ抗原の産生を増加させることができる。
一部の実施形態では、がんワクチン組成物が本明細書に提供され、治療有効量のがん細胞株からの細胞を含み、細胞株が、少なくともＨＬＡ－Ｅの産生を減少させるように改変されている。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅが、細胞から除去されるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％（すなわち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）減少したレベルで産生される。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、細胞から除去されるか、または少なくとも９０％減少したレベルで産生される。１つ以上の細胞株で、追加の免疫抑制因子の産生を減少させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４７、ＣＤ２７６、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦβ１、および／またはＴＧＦβ２の発現もまた、減少または阻害される。これらのワクチン組成物中の１つ以上の細胞株において、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、またはネオ抗原の産生を増加させることができる。
一部の実施形態では、がんワクチン組成物が本明細書に提供され、治療有効量のがん細胞株からの細胞を含み、細胞株が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の両方の産生を減少させるように改変されている。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の両方が、細胞から除去されるか、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％（すなわち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）減少したレベルで産生される。ワクチン組成物の一部の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の両方は、細胞から除去されるか、または少なくとも９０％減少したレベルで産生される。
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の両方の発現は、レンチウイルスベクターを使用して細胞に送達されるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を介して減少される。追加の免疫抑制因子の産生が減少され得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の両方の発現が減少される１つ以上の細胞株において、ＣＤ４７、ＣＤ２７６、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＨＬＡ－Ｇの発現もまた減少される。これらのワクチン組成物の実施形態の１つ以上の細胞株において、１つ以上の免疫刺激因子、ＴＡＡ、またはネオ抗原の産生もまた増加され得る。
一部の実施形態では、ノックダウンまたはノックアウトのために選択された免疫抑制因子は、複数の天然配列のバリアントによってコードされ得る。したがって、免疫抑制因子の減少または阻害は、当業者に既知の複数の遺伝子編集／ノックダウンのアプローチを使用して達成することができる。本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、１つ以上の免疫抑制因子の完全なノックアウトは、ノックダウンよりも望ましくない場合がある。例えば、ＴＧＦβ１は、上皮－間葉転換の調節に寄与するため、ＴＧＦβ１が（例えば、ノックアウトを介して）完全に欠如していると、腫瘍細胞の免疫原性がより低い表現型が誘導される可能性がある。
表６は、本明細書に記載されるように組み込まれるかまたは改変され得る例示的な免疫抑制因子、およびそれらの組み合わせを提供する。また、例示的なＮＣＢＩ遺伝子ＩＤも提供され、これらは、ノックダウン戦略の標的となる配列を決定するために、当業者によって利用され得る。これらのＮＣＢＩ遺伝子ＩＤは、単なる例示である。
例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ４７＋ＴＧＦβ１、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２。例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ２７６＋ＴＧＦβ１、ＣＤ２７６＋ＴＧＦβ２、またはＣＤ２７６＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２。例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＣＤ２７６、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６。例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６。例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＣＤ２７６＋ＢＳＴ２、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＢＳＴ２、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＢＳＴ２。例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４。例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４。
例示的な実施形態では、ワクチン組成物において、免疫抑制因子の以下の組み合わせの産生が、減少または阻害される：ＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＣＴＬＡ４、ＣＤ４７＋ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ１＋ＣＴＬＡ４、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＨＬＡ－ＥまたはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＨＬＡ－Ｇ、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＴＬＡ－４、またはＣＤ４７＋ＴＧＦβ１＋ＴＧＦβ２＋ＣＤ２７６＋ＨＬＡ－Ｅ＋ＣＴＬＡ－４。
当業者は、本明細書に記載のワクチン組成物の実施形態では、組成物内の細胞株のうちの少なくとも１つ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）が、少なくとも１つの免疫抑制因子（例えば、表６に列挙された因子のうちの１つ以上）のノックダウンまたはノックアウトを有することを認識するであろう。組成物内の細胞株は、各細胞株について、同じ免疫抑制因子もしくは異なる免疫抑制因子のノックダウンまたはノックアウト、またはそれらのいくつかの組み合わせを有し得る。
任意選択的に、組成物内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の細胞株を、１つ以上の追加の免疫抑制因子（例えば、表６に列挙されている１つ以上の因子）のノックダウンまたはノックアウトを有するようにさらに遺伝子改変することができる。例えば、組成物内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の細胞株を、各細胞株について、同じ追加の免疫抑制因子または異なる免疫抑制因子のノックダウンまたはノックアウト、またはそれらのいくつかの組み合わせを有するようにさらに遺伝子改変することができる。
一部の実施形態では、がんワクチン組成物が本明細書に提供され、治療有効量のがん細胞株からの細胞を含み、細胞株が、ＳＬＡＭＦ７、ＢＴＬＡ、ＥＤＮＲＢ、ＴＩＧＩＴ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２）、ＬＡＧ３、ＡＤＯＲＡ２Ａ、およびＡＲＧ１の産生を低減するように改変されている。
本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかの細胞のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載の免疫抑制因子の部分的または完全なノックダウン、ならびに／または本明細書に記載の免疫刺激因子、ＴＡＡ、および／もしくはネオ抗原の発現（もしくは、発現の増加）を達成するために、１つ以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の遺伝子改変を受ける場合がある。一部の実施形態では、ワクチン組成物中の少なくとも１つの細胞株は、５未満（すなわち、４未満、３未満、２未満、１、または０）の遺伝子改変を受ける。一部の実施形態では、ワクチン組成物中の少なくとも１つの細胞は、５つ以上の遺伝子改変を受ける。
１つ以上の免疫抑制因子の発現を低減または阻害する多くの方法が知られ、当業者に利用可能であり、その実施形態が、本明細書に記載されている。
がん細胞株は、免疫抑制因子の産生を阻害するかまたは減少させるために、一部の実施形態に従って改変されている。免疫抑制因子の産生を阻害する、かつ／または免疫抑制因子の産生を減少させるために用いられる適切な技術を選択するための方法および技術が本明細書に提供される。免疫抑制因子の発現レベルの部分的な阻害または減少は、当該技術分野で既知の技術を使用して達成することができる。
一部の実施形態では、がん株の細胞は、遺伝子構築物を細胞に導入するために組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作される。これらのＤＮＡ技術には、形質導入（例えば、ウイルスベクターを使用する）またはトランスフェクション手順（例えば、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、エレクトロポレーション、リポソームを使用する）が含まれるが、これらに限定されない。細胞による免疫抑制因子産生を部分的（例えば、発現レベルを少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０％減少させる）または完全に阻害するために、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を用いることができる。
一部の実施形態では、ゲノム編集は、ワクチン中の細胞による免疫抑制因子の産生を阻害するかまたは減少させるために使用される。ゲノム編集技術の非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが挙げられる。特定の実施形態では、遺伝子発現およびその後の生物学的活性タンパク質発現の減少は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介したヌクレオチドの挿入／欠失、または相同性指向修復（ＨＤＲ）を介した適切なドナーカセットの挿入（未熟終止コドンおよび非機能性タンパク質の発現につながる）、またはヌクレオチドの挿入によって、達成することができる。
一部の実施形態では、自発的部位特異的相同組換え技術が使用される（Ｃｒｅ－ＬｏｘおよびＦＬＰ－ＦＲＴ組換えシステムを含む場合または含まない場合がある）。一部の実施形態では、トランスポゾンを適用する方法（適切なドナーカセットをより高い頻度でゲノムＤＮＡに組み込む）は、部位／遺伝子特異性がほとんどないが、必要な選択技術および同定技術と組み合わせて使用される。非限定的な例は、ＰｉｇｇｙＢａｃおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムであり、これらは、組み込みのために、それぞれ、ＴＴＡＡおよびＴＡヌクレオチド配列を使用する。
さらに、メガヌクレアーゼおよびトランスポゾンからなる遺伝子編集法のコンビナトリアルアプローチを使用することができる。
特定の実施形態では、免疫抑制因子発現の阻害または低減のための技術は、免疫抑制因子のｍＲＮＡ転写物の翻訳を低減もしくは阻害するためのアンチセンスもしくはリボザイムアプローチ、免疫抑制因子の遺伝子の転写を阻害するための三重らせんアプローチ、または標的化相同組換えを使用することを含み得る。
アンチセンスアプローチには、免疫抑制因子のｍＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、免疫抑制因子の相補的なｍＲＮＡ転写産物に結合し、翻訳を阻止する。絶対的な相補性が望ましい場合もあるが、必須ではない。本明細書で言及されるように、ＲＮＡの一部分に「相補的」な配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することができるような十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖を試験するか、または三重鎖形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度とアンチセンス核酸の鎖長の両方に依存する。一部の実施形態では、免疫抑制因子の５’または３’－非翻訳、非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドを、アンチセンスアプローチで使用して、免疫抑制因子の内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。一部の実施形態では、免疫抑制因子の阻害または低減は、ショートヘアピンＲＮＡ内のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を使用して実行される。
一部の実施形態では、レンチウイルス媒介性ｓｈＲＮＡ干渉は、免疫抑制因子を発現する遺伝子をサイレンシングするために使用される。（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２ ３５（３）２６７－２７５（２０１２）を参照されたい、参照により本明細書に組み込まれる。）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、安定的に発現するＲＮＡｉヘアピンであり、遺伝子発現をノックダウンするためにも使用され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は、免疫抑制因子ｍＲＮＡの翻訳および発現を防ぐために使用される。特定の実施形態では、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムは、ｍＲＮＡを破壊するために使用され得る。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断するハンマーヘッド型リボザイムの使用が使用される。ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼも使用され得る。
一部の実施形態では、免疫抑制因子の内因性遺伝子発現は、例えば、標的化された相同組換えを使用することによって、遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって減少する。一部の実施形態では、内因性遺伝子発現は、免疫抑制因子のプロモーターおよび／またはエンハンサー遺伝子の調節領域に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的にして、標的細胞において免疫抑制因子遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって減少する。一部の実施形態では、プロモーター活性は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼデッドバージョン（ｄＣａｓ９）、および標的ＤＮＡを切断することができないＫＲＡＢ、ＶＰ６４、およびｐ６５とのその融合によって阻害される。ｄＣａｓ９分子は、標的化配列に基づいて標的ＤＮＡに結合する能力を保持している。転写開始部位へのｄＣａｓ９のこの標的化は、転写開始をブロックすることによって転写を低減またはノックダウンするのに十分である。
一部の実施形態では、免疫抑制因子の活性は、「ドミナントネガティブ」アプローチを使用して減少され、これは、欠陥のある免疫抑制因子をコードする遺伝子構築物を使用して、隣接細胞に対する免疫抑制活性を減少させる。
一部の実施形態では、可溶性ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、または他の任意の免疫抑制因子に結合して細胞内で「中和」する抗体をコードする遺伝子構築物の投与が使用される。この目的のために、免疫抑制因子受容体のドメイン、免疫抑制因子受容体の欠失変異体、または別のポリペプチド（例えば、ＩｇＦｃポリペプチド）に融合されたこれらの免疫抑制因子受容体のドメインもしくは変異体のいずれかに対応するペプチドをコードする遺伝子構築物を利用することができる。一部の実施形態では、免疫抑制因子受容体を模倣し、免疫抑制因子を中和する抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片をコードする遺伝子構築物が使用される。これらの免疫抑制因子受容体のペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗イディオタイプ抗体またはＦａｂをコードする遺伝子構築物を投与して、免疫抑制因子を中和することができる。
同様に、免疫抑制因子の１つ以上のエピトープ、または免疫抑制因子の保存されたバリアントのエピトープ、または免疫抑制因子のペプチド断片を特異的に認識する抗体をコードする遺伝子構築物を使用することもできる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、および上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知の任意の技術を使用して、好適な抗体をコードする遺伝子構築物を生成することができる。
一部の実施形態では、免疫抑制因子前駆体を活性アイソフォームに切断する酵素を阻害して、免疫抑制因子の活性化を遮断する。これらの酵素の転写または翻訳は、当該技術分野で既知の手段によって遮断することができる。
さらなる実施形態では、薬理学的阻害剤は、酵素活性（ＣＯＸ－２およびＩＤＯを含むが、これらに限定されない）を減少させて、特定の免疫抑制因子の量を減少させるために使用され得る。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）
ベクターベースおよびタンパク質ベースのワクチンのアプローチでは、単一の製剤で標的化され得るＴＡＡの数が制限されている。対照的に、本明細書に記載される同種全細胞ワクチンプラットフォームの実施形態は、多数の多様なＴＡＡの標的化を可能にする。様々なＴＡＡを発現する同種細胞株を選択し、任意選択的に、細胞株を遺伝子改変して、望ましい治療標的（例えば、がんのタイプ）のための目的の追加の抗原（ネオ抗原または非同義変異（ＮＳＭ）を含む）を発現させることによって、応答の幅を拡張および／または最適化することができる。
ベクターベースおよびタンパク質ベースのワクチンのアプローチでは、単一の製剤で標的化され得るＴＡＡの数が制限されている。対照的に、本明細書に記載される同種全細胞ワクチンプラットフォームの実施形態は、多数の多様なＴＡＡの標的化を可能にする。様々なＴＡＡを発現する同種細胞株を選択し、任意選択的に、細胞株を遺伝子改変して、望ましい治療標的（例えば、がんのタイプ）のための目的の追加の抗原（ネオ抗原または非同義変異（ＮＳＭ）を含む）を発現させることによって、応答の幅を拡張および／または最適化することができる。
本明細書で使用される場合、「ＴＡＡ」という用語は、腫瘍関連抗原を指し、腫瘍細胞から自然に発現される「野生型」抗原を指すことができるか、または任意選択的に、１つ以上の変異を含む変異抗原（例えば、設計抗原もしくは設計された抗原、または増強された抗原もしくは操作された抗原）（例えば、本明細書に記載されるネオエピトープまたは１つ以上のＮＳＭ）を指すことができる。
ＴＡＡは、正常組織および腫瘍組織において発現され得るタンパク質であるが、ＴＡＡタンパク質の発現が、健常な組織と比較して、腫瘍組織で有意に高くなっている。ＴＡＡには、がん精巣抗原（ＣＴ）が含まれ得る。これは、胚発生には重要であるが、健康な成人の雄性生殖細胞での発現に限定されている。ＣＴは、しばしば腫瘍細胞で発現する。
ネオ抗原またはネオエピトープは、がん細胞で発現する異常に変異した遺伝子である。多くの場合、ネオ抗原は、正常組織ではなく腫瘍組織によって発現されるため、ＴＡＡとみなすことができる。これらのネオエピトープは、真に腫瘍特異的であり、胸腺の中枢性免疫寛容を受けないため、ネオエピトープを標的化することには多くの利点がある。非同義変異（ＮＳＭ）から生じるネオエピトープを含む完全長ＴＡＡをコードするがんワクチンは、幅および大きさが改善された、より強力な免疫応答を誘発する可能性がある。
本明細書で使用される場合、非同義変異（ＮＳＭ）は、タンパク質のアミノ酸配列を改変するヌクレオチド変異である。一部の実施形態では、ミスセンス変異は、単一のヌクレオチドにおける点変異から生じる、タンパク質の１つのアミノ酸の変化である。ミスセンス変異は、ＤＮＡ配列における非同義置換の一種である。追加の変異も企図され、トランケーション、フレームシフト、または他の変異（アミノ酸配列を天然の抗原タンパク質とは異なるように改変する）を含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、抗原は、以下によって設計される：（ｉ）１つ以上の公開されているデータベースを参照して、選択されたＴＡＡ中のＮＳＭを特定すること、（ｉｉ）２人超の患者で生じるＮＳＭを特定すること、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で特定された各ＮＳＭを、関連するＴＡＡ配列に導入すること、（ｉｖ）ようやくＮＳＭを含むＴＡＡのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定ＭＨＣクラスＩエピトープを特定すること、ならびに（ｖ）新しいエピトープ（ＳＢおよび／またはＷＢ）を生成するかまたは最終的なＴＡＡ配列にペプチド－ＭＨＣ親和性を増加させるＮＳＭを含めること。ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定ネオエピトープを生成すると予測される例示的なＮＳＭを本明細書に提供する（表１３５）。
一部の実施形態では、１人の患者の腫瘍試料で特定されたＮＳＭは、設計された抗原（すなわち、１つ以上のＮＳＭの導入から生じる変異抗原）に含まれる。様々な実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＮＳＭが、設計された抗原を生成するＴＡＡに導入される。一部の実施形態では、標的抗原は、より少ない数のＮＳＭを有する可能性があり、天然抗原タンパク質の範囲に対する目標の相同性（９４～９７％）に到達するために、１回だけ発生するＮＳＭを使用する必要があり得る。他の実施形態では、標的抗原は、２回以上の発生のカットオフで発生する多数のＮＳＭを有する可能性があり、天然抗原タンパク質範囲（９４～９７％）に対する目標の相同性に到達するために３回発生するＮＳＭを使用する必要があり得る。設計された抗原に多数のＮＳＭを含めると、天然抗原に対する設計された抗原の相同性が目標の相同性の範囲（９４～９８％）未満に減少するであろう。
一部の実施形態では、本開示による腫瘍細胞ワクチンのうちの１、２、３、４、５、または６細胞株は、少なくとも１つのＴＡＡに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１を含む。１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＮＳＭ（したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の設計された抗原）を含む。
様々な実施形態では、天然の完全長タンパク質に対する変異体（例えば、設計された抗原）の配列相同性は、抗原の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である。
一部の実施形態では、設計された抗原は、治療用同種全細胞がんワクチンに組み込まれて、設計されたＴＡＡおよび既存のＴＡＡに対する抗原特異的免疫応答を誘導する。
一部の実施形態では、ワクチンは、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株から構成され得、細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも１つの設計されたＴＡＡを発現する。他の実施形態では、ワクチンは、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含み、細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の設計されたＴＡＡを発現する。
治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの細胞を含むワクチン組成物の実施形態が本明細書に提供され、少なくとも１つのがん細胞株は、１つ以上のＴＡＡ、ネオ抗原（１つ以上のＮＳＭを含むＴＡＡを含む）、ＣＴ、および／またはＴＡＡを発現する（天然に発現するか、または発現するように設計される）。一部の実施形態では、細胞は、ワクチン組成物中の細胞によって発現される１つ以上のＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭを含むＴＡＡを含む）をコードする組換えレンチベクターで形質導入される。
一部の実施形態では、１つ以上のＮＳＭもしくはネオエピトープおよび／または他の抗原を含むＴＡＡは、ワクチン組成物に含めるために選択された細胞上で内因的に発現され得る。一部の実施形態では、細胞株は、１つ以上のＮＳＭおよび／または他の抗原（例えば、ＣＴ、ＴＳＡ、ネオ抗原）を含む、選択されたＴＡＡを発現するように改変され得る（例えば、遺伝子改変され得る）。
本明細書に記載の腫瘍細胞ワクチン組成物のいずれも、１つ以上のＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭまたはネオエピトープを含むＴＡＡを含む）を提示し、対象において広範な抗腫瘍応答を誘導し得る。このような不均一な免疫応答を確保することで、一般に、特定のがんの単剤療法に付随する抗原回避などのいくつかの問題を解消し得る。
本明細書に提供されるワクチン組成物の様々な実施形態によれば、ワクチン組成物の少なくとも１つの細胞株は、１つ以上のネオ抗原、例えば、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、前立腺癌、神経膠芽腫、大腸癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、膀胱癌または尿路癌、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肝臓肝細胞（ＨＣＣ）癌、腎臓癌または腎細胞癌（ＲＣＣ）癌、胃癌または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、食道癌、精巣癌、膵臓癌、中枢神経系癌、子宮内膜癌、黒色腫、および中皮癌に関与するネオ抗原を発現するように改変され得る。一部の実施形態では、１つ以上の細胞株は、ネオ抗原タンパク質の未変異部分を発現する。一部の実施形態では、１つ以上の細胞株は、ネオ抗原タンパク質の変異部分を発現する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかにおけるがん細胞のうちの少なくとも１つは、１つ以上のＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭ、ＣＴ、またはＴＳＡ／ネオ抗原を含むＴＡＡを含む）を自然に発現するか、またはそれらを発現するように改変され得る。特定の実施形態では、ワクチン組成物中のがん細胞株のうちの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）は、１つ以上のＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭ、ＣＴ、またはＴＳＡ／ネオ抗原を含むＴＡＡを含む）を発現するか、またはそれを発現するように遺伝子改変され得る。組成物内の細胞株によって発現されるＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭ、ＣＴ、またはＴＳＡ／ネオ抗原を含むＴＡＡを含む）は、すべて同じであっても、すべて異なっていても、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
ワクチン組成物は、異なるタイプおよび組織学の複数（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）のがん細胞株を含み得るため、広範囲かつ多様なＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭおよび／またはネオ抗原を含むＴＡＡを含む）が組成物中に存在し得る（表７～２３）。細胞株の組み合わせ（例えば、５細胞株の組み合わせ、６細胞株の組み合わせ、７細胞株の組み合わせ、８細胞株の組み合わせ、９細胞株の組み合わせ、または１０細胞株の組み合わせ）を使用して標的化することができるＴＡＡの数およびＴＡＡの発現レベルは、組み合わせの個々の細胞株と比較して、細胞株の組み合わせの方がより高い。
本明細書に提供されるワクチン組成物の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかにおけるがん細胞のうちの少なくとも１つ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超）は、１つ以上のＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭまたはネオエピトープを含むＴＡＡを含む）を発現するか、またはそれらを発現するように改変され得る。組成物内の細胞によって発現されるＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭを含むＴＡＡを含む）は、すべて同じであっても、すべて異なっていても、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。以下の表７は、例示的な非小細胞肺癌ＴＡＡ、および例示的な肺癌のＴＡＡのサブセットを列挙する。一部の実施形態では、ＴＡＡは、ＮＳＣＬＣに特異的である。一部の実施形態では、ＴＡＡは、ＧＢＭに特異的である。他の実施形態では、ＴＡＡは、前立腺癌に特異的である。
一部の実施形態では、ワクチン組成物本明細書に提示され、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの操作された細胞を含み、細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以上の表７～２３のＴＡＡを発現する。他の実施形態では、表７～２３のＴＡＡは、本明細書に記載されるように、１つ以上のＮＳＭを含むように改変されている。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの操作された細胞を含み、細胞株は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０の表７～２３のＴＡＡ（または１つ以上のＮＳＭを含むように改変されている表７～２３のＴＡＡ）。本明細書に提供されるように、様々な実施形態では、細胞株は、表７～２３のＴＡＡ（または、１つ以上のＮＳＭを含むように改変されている表７～２３のＴＡＡ）のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０を発現し、かつ任意選択的に、表４の１つ以上の免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、かつ／または表６の１つ以上の免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させるように改変されている。
本明細書に提供されるワクチン組成物の一部の実施形態では、組成物内の細胞株のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超は、同じ免疫刺激因子、ＴＡＡ（１つ以上のＮＳＭを含むＴＡＡを含む）、および／もしくはネオ抗原；異なる免疫刺激因子、ＴＡＡ、および／もしくはネオ抗原；あるいはそれらのいくつかの組み合わせを発現するかまたはその発現を増加させるように遺伝子改変され得る。一部の実施形態では、ＴＡＡ配列は、天然の内因性のヒトＴＡＡ配列であり得る。一部の実施形態では、ＴＡＡ配列は、天然の内因性のヒトＴＡＡ配列の遺伝子操作された配列であり得る。遺伝子操作された配列は、コドン最適化を介してＴＡＡの発現を増加させるように改変され得るか、または遺伝子操作された配列は、ＴＡＡの細胞内位置を変更するように（例えば、プロテアーゼ切断部位の変異を介して）改変され得る。
例示的なＮＣＢＩ遺伝子ＩＤを、表７～２３に示す。本明細書に提供されるように、これらの遺伝子ＩＤは、本開示のワクチン組成物の１つ以上の細胞株において特定のＴＡＡを発現する（または過剰発現する）ために使用することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物中の細胞株のうちの１つ以上は、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＭＳＬＮ）、ＣＴ８３（ｋｉｔａ－ｋｙｕｓｈｕ肺癌抗原１）ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＴＢＸＴ、ＢＯＲＩＳ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＣ２、ＷＴ１、ＦＢＰ、ＴＤＧＦ１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＬＹ６Ｋ、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ１６／１８Ｅ６／Ｅ７、ＦＡＰ、またはそれらの変異バージョン（表２４）を発現するように改変されている。「またはその変異バージョン」という語句は、本明細書で記載されるように、ネオペピトープまたはＮＳＭを含む、１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の置換変異）を含む、本明細書に提供される、上述のＹＡＡまたは他のＴＡＡの配列を指す。したがって、様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物中の１つ以上の細胞株は、ｍｏｄＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ （ｍｏｄＭＳＬＮ）、ｍｏｄＴＥＲＴ、ｍｏｄＰＳＭＡ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｍｏｄＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｍｏｄｈＣＭＶ ｐｐ６５、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＢＯＲＩＳ、ｍｏｄＦＳＨＲ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０、ｍｏｄＭＡＧＥＣ２、ｍｏｄＷＴ１、ｍｏｄＫＲＡＳ、ｍｏｄＦＢＰ、ｍｏｄＴＤＧＦ１、ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、ｍｏｄＬＹ６Ｋ、ｍｏｄＦＡＰ、ｍｏｄＰＲＡＭＥ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ変異、および／またはｍｏｄＨＰＶ１６／１８Ｅ６／Ｅ７を発現するように改変されている。他の実施形態では、ＴＡＡまたは「その変異バージョン」は、本明細書に提供されるＴＡＡまたは変異バージョンのうちの１、２、もしくは３つ以上の融合物を含み得る。一部の実施形態では、融合物は、変異したＴＡＡと融合された天然または野生型の配列を含む。一部の実施形態では、融合構築物中の個々のＴＡＡは、フーリン切断部位などの切断部位によって分離されている。したがって、本開示は、ＴＡＡ融合タンパク質、例えば、ＣＴ８３－ＭＳＬＮまたはｍｏｄＣＴ８３－ＭＳＬＮ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｐｐ６５、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＢＯＲＩＳ、ｍｏｄＦＳＨＲ－ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＭＡＧＥＣ２、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１ （ＫＲＡＳ）、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＦＢＰ、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＴＤＧＦ１、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＬＹ６Ｋ、ｍｏｄＦＡＰ－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、およびｍｏｄＰＲＡＭＥ－ｍｏｄＴＢＸＴを提供する。天然ＴＡＡの配列は、ＮＣＢＩデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）から簡単に取得することができる。表２４に、前述のＴＡＡ、変異バージョン、および融合物の配列を示す。
一部の実施形態では、ワクチン組成物が本明細書に提供され、治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株からの細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせは、表７～２３の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＴＡＡを発現する。他の実施形態では、表７～２３のＴＡＡは、本明細書に記載されるように、１つ以上のＮＳＭを含むように改変されている。一部の実施形態では、少なくとも１つの細胞株は、少なくとも１、２、または３つの免疫刺激因子（例えば、表４からの免疫刺激因子）の産生を増加させるように改変されている。一部の実施形態では、ワクチン組成物が提供され、治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株からの細胞を含み、各細胞株または細胞株の組み合わせは、少なくとも１、２、または３つの免疫抑制因子（例えば、表６からの免疫抑制因子）を減少させるように改変されている。一部の実施形態では、２つのカクテルを含むワクチン組成物が提供され、各カクテルは、１、２、もしくは３つの免疫刺激因子を発現し、かつ１、２、もしくは３つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変された３つの細胞株を含み、細胞株は、少なくとも１０のＴＡＡもしくは１つ以上のＮＳＭを含むＴＡＡを発現する。
本開示による細胞株または対象からの腫瘍におけるＴＡＡの存在または発現レベルを決定するための方法およびアッセイは、当該技術分野で知られている。例として、Ｗａｒｂｕｒｇ－Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ法、Ｌｏｗｒｙアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）などの分光法、免疫ブロッティング、およびウエスタンブロットなどの抗体ベースの技術、ＥＬＩＳＡ、免疫電気泳動、タンパク質免疫沈降、フローサイトメトリー、およびタンパク質免疫染色は、すべて本開示によって企図されている。
患者の腫瘍によって呈示される抗原レパートリーは、一部の実施形態では、次世代配列決定および抗体ベースのアプローチを使用して、生検標本で評価することができる。同様に、一部の実施形態では、潜在的な転移巣の抗原レパートリーは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）によって発現される抗原を決定するために同じ技術を使用して評価することができる。腫瘍生検およびＣＴＣにおける抗原発現の評価は、発現された抗原のサブセットを表すことができる。一部の実施形態では、患者の原発腫瘍および／またはＣＴＣによって発現される抗原のサブセットが特定され、本明細書に記載されるように、患者の腫瘍および／または転移巣で発現する抗原との可能な限り最良の一致を提供するために、ワクチン組成物に含める細胞株の選択を通知する。
本開示の実施形態は、細胞株の組成物を提供し、これは、（ｉ）本明細書に記載されるように改変され、（ｉｉ）がん（複数可）または癌性腫瘍に罹患した患者に投与された場合、ＴＡＡ特異的免疫応答が生成されるように、十分な数および量のＴＡＡを発現する。
免疫応答の刺激方法と治療方法
本明細書に記載のワクチン組成物は、それを必要とする対象に、投与され得る。対象における免疫応答を誘導するための方法が本明細書に提供され、対象に、免疫学的に有効な量の遺伝子改変細胞を投与することを含む。また、抗腫瘍有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を投与することによって、対象における腫瘍を予防または治療するための方法も提供される。かかる組成物および方法は、対象の生存を延長するのに有効である可能性がある。
本明細書に記載のワクチン組成物は、それを必要とする対象に、投与され得る。対象における免疫応答を誘導するための方法が本明細書に提供され、対象に、免疫学的に有効な量の遺伝子改変細胞を投与することを含む。また、抗腫瘍有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を投与することによって、対象における腫瘍を予防または治療するための方法も提供される。かかる組成物および方法は、対象の生存を延長するのに有効である可能性がある。
様々な実施形態によれば、本明細書に提供されるワクチン組成物のうちのいずれか１つの投与は、白血球による炎症誘発性サイトカインの産生（例えば、ＩＦＮγの分泌）を増加させることができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるワクチン組成物のうちのいずれか１つの投与は、白血球による炎症誘発性サイトカインの産生（例えば、ＩＦＮγの分泌）を、少なくとも１．５倍、１．６倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍以上増加させることができる。他の実施形態では、ＩＦＮγ産生が、未改変がん細胞株と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５倍以上増加する。いずれの理論やメカニズムに縛られることなく、白血球による炎症誘発性サイトカインの産生（例えば、ＩＦＮγの分泌）の増加は、ワクチン組成物との間接的または直接的な相互作用の結果である。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の改変細胞株を含む本明細書に提供されるワクチン組成物のうちのいずれか１つの投与は、貪食細胞によるワクチン組成物の細胞の取り込みを、改変細胞を含まない組成物と比較して、例えば、少なくとも１．１倍、１．２倍増、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍以上増加させることができる。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、対象に、皮内注射によって提供される。いずれの理論やメカニズムに縛られることなく、皮内注射は、少なくとも一部の実施形態では、免疫細胞を注射部位に動員する局所的な炎症反応を生成する。ワクチンの投与後、ランゲルハンス細胞（ＬＣ）および真皮樹状細胞（ＤＣ）などの皮膚の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、貪食によってワクチン細胞株の成分を取り込み、次いで、真皮を通って流入領域リンパ節に移動する。流入領域リンパ節では、ワクチン細胞株の成分を貪食したＤＣまたはＬＣが、ナイーブＴ細胞およびＢ細胞をプライミングすると予想される。ナイーブＴ細胞およびＢ細胞のプライミングは、ワクチン細胞株の成分よって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する適応免疫応答を開始すると予想される。ワクチン細胞株の成分によって発現される特定のＴＡＡは、患者の腫瘍によっても発現される。流入領域リンパ節での抗原特異的Ｔ細胞の増殖、およびこれらのＴ細胞の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への輸送は、ワクチン誘導性の抗腫瘍応答を生成すると予想される。
様々な実施形態によれば、同種ワクチン組成物の免疫原性は、免疫刺激シグナルの発現または分泌を増加させながら免疫抑制因子の発現を減少させる遺伝子改変によって、さらに増強することができる。これらの因子の調節は、真皮のＬＣおよびＤＣによるワクチン細胞株の成分の取り込み、流入領域リンパ節へのＤＣおよびＬＣの輸送、流入領域リンパ節でのＴ細胞およびＢ細胞のプライミングを強化し、それによって、より強力な抗腫瘍応答をもたらすことを目的としている。
一部の実施形態では、ワクチン組成物において標的化されるＴＡＡの幅は、複数の細胞株を含めることによって増加させることができる。例えば、特定の腫瘍タイプ内の異なる組織学的サブセットは、異なるＴＡＡサブセットを発現する傾向がある。さらなる例として、ＮＳＣＬＣでは、腺癌および扁平上皮細胞癌は異なる抗原を発現する。本開示の一部の実施形態によれば、ワクチン組成物によって誘導される適応免疫応答の大きさおよび幅は、同じまたは異なる免疫刺激因子を発現する追加の細胞株を含めることによって増強することができる。例えば、３つの細胞株のカクテル内の１つの細胞株によるＩＬ－１２などの免疫刺激因子の発現は、同じ部位に送達されるすべての細胞株に対する免疫応答を増強するように、局所的に作用することができる。ＧＭ－ＣＳＦなどのカクテル内の複数の細胞株による免疫刺激因子の発現は、注射部位の免疫刺激因子の量を増加させ、それによって、カクテルのすべての成分に誘導される免疫応答を増強することができる。ワクチンカクテル内に存在するＨＬＡ不一致の程度は、そのカクテルによって誘導される免疫応答をさらに増強する可能性がある。
本明細書に記載されるように、様々な実施形態では、対象において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以上のＴＡＡに特異的な免疫応答を刺激する方法が提供され、治療有効量の改変がん細胞株を含むワクチン組成物を投与することを含む。
「免疫応答」は、免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球）の（例えば、抗原性組成物またはワクチンとして製剤化された）細胞または抗原などの刺激に対する応答である。免疫応答は、Ｂ細胞応答であってもよく、その結果、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体が産生される。免疫応答は、ＣＤ４＋応答およびＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答であってもよい。Ｂ細胞およびＴ細胞の応答は、「細胞性」免疫応答の態様である。免疫応答は、抗体によって媒介される「体液性」免疫応答であってもよい。場合によっては、応答は、特定の抗原（例えば、１つ以上のＴＡＡ）に特異的であり（すなわち、「抗原特異的応答」）、この特異性には、抗原特異的抗体の産生および／またはサイトカインの産生（例えば、インターフェロンγ、これは、Ｔｈ1 Ｔ細胞応答の生成に関与する重要なサイトカインであり、ＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリーによって測定可能である）が含まれ得る。
ワクチンの有効性は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、または他の当該技術分野で既知の方法を使用して、免疫接種後のＴ細胞応答ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を測定することによって試験することができる。細胞または抗原（例えば、抗原性組成物またはワクチンとして製剤化される）などの免疫原性刺激への対象の曝露は、刺激に特異的な一次免疫応答を誘発し、すなわち、曝露は、免疫応答を「プライミング」する。刺激へのその後の曝露（例えば、免疫接種による曝露）は、特定の免疫応答の大きさ（もしくは持続時間、またはその両方）を増加させるかまたは「ブースト」することができる。したがって、抗原性組成物を投与することによって既存の免疫応答を「ブースト」することで、抗原（または細胞）特異的応答の大きさが増加する（例えば、抗体の力価および／もしくは親和性を増加させることによって、抗原特異的Ｂ細胞もしくはＴ細胞の頻度を増大させることによって、成熟化エフェクター機能を誘導することによって、またはそれらの組み合わせによって）。
本明細書に記載の方法によって監視／アッセイまたは刺激される免疫応答には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ａ）抗原特異的またはワクチン特異的ＩｇＧ抗体、（ｂ）血清中サイトカインのレベルの変化（ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０を含むが、これらに限定されない）、（ｃ）ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞ワクチンについてＥＬＩＳｐｏｔによって決定されたＩＦＮγ応答および抗原特異的応答、（ｄ）ＴＡＡまたはワクチン細胞成分に対するＩＦＮγ応答の変化、（ｅ）抗原刺激に応答した細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２）のＴ細胞産生の増加および細胞溶解能の指標（グランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン、およびＣＤ１０７ａ）の増加、（ｆ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、単核単球由来サプレッサー細胞（Ｍ－ＭＤＳＣ）、および多形核由来サプレッサー細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）のレベルの低下、（ｇ）循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルの低下、（ｈ）好中球／リンパ球比（ＮＬＲ）および血小板／リンパ球比（ＰＬＲ）、（ｉ）ＴＭＥにおける免疫浸潤の変化、ならびに（ｊ）樹状細胞の成熟化。
免疫応答を決定するためのアッセイは、本明細書に記載されており、当該技術分野でよく知られている。ＤＣの成熟化は、ＤＣ成熟化マーカー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＭＨＣ ＩＩ）の存在についてアッセイすることによって評価することができる（Ｄｕｄｅｋ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：４３８（２０１３）を参照されたい）。抗原特異的またはワクチン特異的ＩｇＧ抗体は、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによって評価することができる。血清中サイトカインのレベルは、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ電気化学発光（ＭＳＤ）などのマルチプレックスアプローチを使用して測定することができる。Ｔ細胞の活性化およびリンパ球集団の変化は、フローサイトメトリーによって測定することができる。ＣＴＣは、ＲＴ－ＰＣＲベースのアプローチを使用してＰＢＭＣで測定することができる。ＮＬＲとＰＬＲの比率は、標準的な全血球数（ＣＢＣ）化学パネルを使用して決定することができる。ＴＭＥにおける免疫浸潤の変化は、フローサイトメトリー、腫瘍生検、および次世代配列決定（ＮＧＳ）、または対象の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンによって評価することができる。
がんと異なるタイプの腫瘍との間のＴＡＡ発現の重複を考慮すると、本開示は、特定の実施形態では、複数の異なるがんを治療することができる組成物を提供する。例えば、３つの細胞株の２つのカクテルを各々含む１つのワクチン組成物は、２つ以上のタイプのがんに罹患している対象に投与され得、当該ワクチン組成物は、両方の、追加の、またはすべてのタイプのがんを治療するのに有効である。例示的な実施形態では、ＴＡＡ発現プロファイルを考慮して、改変されたがん細胞株を含む同じワクチン組成物が、同じ患者（または別の患者）における前立腺癌および精巣癌、胃癌および食道癌、または子宮内膜癌、卵巣癌、および乳癌を治療するために使用される。ＴＡＡの重複は、ホット腫瘍またはコールド腫瘍のサブセット内で発生する可能性がある。例えば、ＴＡＡの重複は、ＧＢＭおよびＳＣＬＣで発生し、どちらもコールド腫瘍とみなされる。ワクチン組成物の実施形態に含まれる例示的なＴＡＡには、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１０、Ｓａｒｔ－１、Ｓａｒｔ－３、Ｔｒｐ－１、およびＳｏｘ２が含まれる。一部の実施形態では、ワクチン組成物に含まれる細胞株は、同じ個体の腫瘍タイプの一方または両方を治療するために、類似の免疫ランドスケープの２つの腫瘍タイプから選択することができる。
本明細書で使用される場合、例えば、ＩＦＮγなどのサイトカインの変化または「産生の増加」は、産生／分泌／発現の対照レベルもしくはベースラインレベルを超える変化または増加を指し、これは、抗原またはワクチン成分に対する免疫刺激応答の指標になる。
併用療法およびレジメン
製剤、アジュバント、および追加の治療剤
本明細書に記載の組成物は、薬学的組成物として製剤化することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各成分は、薬学的製剤の他の成分と適合性であるという意味で「薬学的に許容される」ものでなければならない。また、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、またはその他の問題もしくは合併症を伴わずに、組織、臓器、またはその他のヒト成分と接触して使用するのに好適でなければならない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００５、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａｓｈ ａｎｄ Ａｓｈ Ｅｄｓ．，Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｓｏｎ Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００４）を参照されたい）。
製剤、アジュバント、および追加の治療剤
本明細書に記載の組成物は、薬学的組成物として製剤化することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各成分は、薬学的製剤の他の成分と適合性であるという意味で「薬学的に許容される」ものでなければならない。また、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、またはその他の問題もしくは合併症を伴わずに、組織、臓器、またはその他のヒト成分と接触して使用するのに好適でなければならない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００５、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａｓｈ ａｎｄ Ａｓｈ Ｅｄｓ．，Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｓｏｎ Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００４）を参照されたい）。
本開示の薬学的組成物の実施形態は、その意図された投与経路（すなわち、非経口、静脈内、動脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、局所、腫瘍内、経粘膜、腹腔内もしくは胸膜内、および／または直腸投与）と適合性であるように製剤化される。非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：滅菌希釈剤（例えば、水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩）、および張性を調整するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸および水酸化ナトリウム）で調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはポリマー（例えば、ポリプロピレン）を含む１つ以上のバイアルに封入することができる。本明細書で使用される「バイアル」という用語は、本明細書に記載のワクチン組成物の実施形態を保存するように適合された任意の種類の容器（ｖｅｓｓｅｌ）、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、チューブ、ボトルなどを意味する。
一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本明細書で使用される「担体」という用語は、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびそれらの組み合わせを包含する。薬学的に許容される担体は当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい）。例示的な「希釈剤」には、滅菌液、例えば、滅菌水、生理食塩水溶液、および緩衝剤（例えば、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、ホウ酸塩、コハク酸塩、またはヒスチジン）が含まれる。例示的な「賦形剤」は、ワクチンの安定性を増強し得る不活性物質であり、これには、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、炭水化物（例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、またはセルロース）、およびアルコール（例えば、グリセロール、ソルビトール、またはキシリトール）が含まれるが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、ワクチン組成物およびその細胞株成分は、無菌であり、組成物および／または細胞株成分が１つ以上の注射器に装填され得る程度に流動性である。様々な実施形態では、組成物は、製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。一部の実施形態では、担体は、溶媒または分散媒であり得、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）を使用することによって、分散剤の場合、必要な粒径を維持することによって、界面活性剤を使用することによって、および当業者に既知の他の手段によって維持することができる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。一部の実施形態では、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マニトール、ソルビトール）、および／または塩化ナトリウムを組成物に含めることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上に列挙された成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせとともに適切な溶媒に組み込み、その後、必要に応じて、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒および上に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって、調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末剤の場合、調製方法の実施形態は、真空乾燥および凍結乾燥を含み、任意の追加の所望の成分が添加された活性成分の、事前に滅菌濾過されたそれらの溶液からの粉末剤が得られる。
自然免疫系は、他の生物による感染に対して非特異的な様式で防御を提供する細胞を含む。対象における自然免疫は即時防御であるが、長期的でもなく、将来の負荷に対して防御的でもない。一般に自然免疫において役割を果たす免疫系の細胞は、マクロファージや樹状細胞などの貪食性の細胞である。自然免疫系は、様々な方式で適応（後天性とも呼ばれる）免疫系と相互作用する。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、単独で、免疫応答（すなわち、自然免疫応答、適応免疫応答、および／または他の免疫応答）を活性化する。一部の実施形態では、１つ以上のアジュバントは、ワクチン組成物に任意選択的に含まれるか、またはワクチン組成物に関して同時にまたは戦略的に投与されて、ワクチン組成物の有効性を高めるために自然免疫の活性化を支持する薬剤を提供する。本明細書で使用される「アジュバント」は、ワクチン組成物に組み込まれるか、またはワクチン組成物の投与に対して同時にまたは選択された時点もしくは方法で投与される、「薬剤」または物質である。一部の実施形態では、アジュバントは、小分子、化学組成物、または治療用タンパク質（例えば、サイトカインもしくはチェックポイント阻害剤）である。異なる薬剤がどのように機能するかを説明するために、様々なメカニズムが提案されている（例えば、抗原デポ、樹状細胞、マクロファージの活性化因子）。薬剤は、様々な方法で獲得免疫応答を増強するように作用する可能性があり、多くのタイプの薬剤が自然免疫を活性化する可能性がある。細菌およびウイルスのような生物は、生物の成分、２’－５’オリゴＡなどの化学物質、細菌エンドトキシン、ＲＮＡ二重鎖、一本鎖ＲＮＡ、およびその他の組成物と同様に、自然免疫を活性化することができる。薬剤の多くは、本明細書で「トール様受容体」（ＴＬＲ）と称される分子のファミリーを介して作用する。ＴＬＲに結合すると、サイトカインおよびケモカインの産生、ならびに獲得免疫の発達に関与する成分である樹状細胞の活性化および成熟化がもたらされ得る。ＴＬＲファミリーは、リポタンパク質、ペプチドグリカン、フラジェリン、イミダゾキノリン、ＣｐＧ ＤＮＡ、リポ多糖、二本鎖ＲＮＡなどの様々な薬剤に応答することができる。これらのタイプの薬剤は、病原体（または微生物）関連の分子パターンと呼ばれることもある。一部の実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストである。
一部の実施形態では、ワクチン組成物に使用され得る１つのアジュバントは、一酸リピドＡ（ＭＡＬＡ）型の分子である。例示的なＭＡＬＡは、例えば、Ｕｌｒｉｃｈ Ｊ．Ｔ．ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２１ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄｓ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９５）に記載されているＭＰＬ（登録商標）アジュバントである。
他の実施形態では、アジュバントは、「ミョウバン」であり得、この用語は、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩を指す。
一部の実施形態では、アジュバントは、ワクチンアジュバント特性を有するエマルションであり得る。かかるエマルションには、水中油型エマルションが含まれる。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、かかるアジュバントの１つである。別の適切な水中油型エマルションは、ＭＦ－５９（商標）アジュバントであり、これには、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０界面活性剤としても知られている）、およびソルビタントリオレエートが含まれる。他の適切なエマルションアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ ＮＪ）であり、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５０Ｖ（これは、鉱油ベースのアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ２０６およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＭＳ１３１２である）を含む。鉱油は、アジュバント中に存在し得るが、一実施形態では、本開示の組成物の油成分は、すべて代謝可能な油である。
一部の実施形態では、アジュバントは、ＡＳ０２（商標）アジュバントまたはＡＳ０４（商標）アジュバントであり得る。ＡＳ０２（商標）アジュバントは、水中油型エマルションであり、これは、ＭＰＬ（商標）アジュバントとＱＳ－２１（商標）アジュバント（本明細書の他箇所で考察されるサポニンアジュバント）の両方を含む。ＡＳ０４（商標）アジュバントには、ＭＰＬ（商標）アジュバントおよびミョウバンが含まれている。アジュバントは、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ（商標）アジュバントであってもよい。アジュバントは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ樹種の樹皮に由来するものなどのサポニン、または変性サポニンであってもよい（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号、同第５，２７３，９６５号、同第５，３５２，４４９号、同第５，４４３，８２９号、および同第５，５６０，３９８号を参照されたい）。Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）によって販売されている製品ＱＳ－２１（商標）アジュバントは、例示的なサポニン含有補助アジュバントであり、本明細書に記載の組成物の実施形態とともに使用され得る。他の実施形態では、アジュバントは、ＩＳＣＯＭ（商標）ファミリーのアジュバントからの薬剤のうちの１つまたはそれらの組み合わせであり得、これは、元々Ｉｓｃｏｔｅｃ（Ｓｗｅｄｅｎ）によって開発され、典型的には、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａに由来するサポニンまたは合成類似体、コレステロール、およびリン脂質から形成され、ハニカム状の構造になる。
一部の実施形態では、アジュバントまたは薬剤は、アジュバントとして機能するサイトカインであってもよい（例えば、Ｌｉｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．２１（６）：１４３９－１４４９（１９９５）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｅ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３（９）：３２４１－３２４４（１９９５）、およびＥｇｉｌｍｅｚ，Ｎ．Ｋ．，Ｃｈａｐ．１４ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００７）を参照されたい）。様々な実施形態では、サイトカインは、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（例えば、Ｃｈａｎｇｅ Ｄ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９（３）：２０７－２１５（２００４）、Ｄｒａｎｏｆｆ， Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８８：１４７－１５４（２００２）、および米国特許第５，６７９，３５６号を参照されたい）、あるいはインターフェロン、例えば、Ｉ型インターフェロン（例えば、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）もしくはインターフェロンβ（ＩＦＮ－β））またはＩＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）（例えば、Ｂｏｅｈｍ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：７４９－７９５（１９９７）およびＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３０７－３３６ （２００５）を参照されたい））、インターロイキン（特に、インターロイキン１α（ＩＬ－１α）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン２（ＩＬ－２）（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｂ．Ｈ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（７）：３９８３－３９８８（２００４）を参照されたい）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）（例えば、Ｐｏｒｔｉｅｌｊｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２（３）：１３３－１４４（２００３）およびＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉ．Ｇ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（２）：１３３－１４６（２００３）を参照されたい）、インターロイキン１５（Ｉｌ－１５）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）を含む）、胎児肝臓チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、あるいは腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であり得る。
一部の実施形態では、アジュバントは、任意選択的に、本明細書に記載の抗原にコンジュゲートされた、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドであり得る。
本明細書にアジュバントとして記載されている組成物および方法の実施において使用され得る免疫増強剤の例としては、ＭＤＰ（商標）、ＭＤＰおよび誘導体、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、代替病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、サポニン、小分子免疫増強剤（ＳＭＩＰ）、サイトカイン、ならびにケモカインが挙げられる。
２つ以上のアジュバントまたは薬剤を組み合わせて利用する場合、複数のアジュバントの相対量を選択して、抗原のみと比較して、アジュバントを含む組成物の所望の性能特性を達成することができる。例えば、アジュバントの組み合わせは、抗原の抗体応答を増強するために、および／または対象の自然免疫系応答を増強するために選択され得る。自然免疫系を活性化すると、ケモカインおよびサイトカインが産生され、適応型（獲得）免疫応答が活性化される可能性がある。適応免疫応答を活性化する重要な結果は、記憶免疫細胞の形成であり、宿主が抗原に再遭遇したときに、免疫応答が、より速く、一般により良い質で起こるようになる。一部の実施形態では、アジュバントは、本明細書に記載の組成物とのそれらの組み合わせの前に、事前に製剤化され得る。
本明細書に記載のワクチン組成物の実施形態は、１つ以上の他のアジュバントまたは薬剤（治療剤を含む）の投与と同時に、投与前に、または投与後に投与することができる。特定の実施形態では、そのような薬剤は、特定のがんの標準的な治療または予防として当該技術分野で受け入れられ得る。企図される例示的な薬剤には、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、放射線療法剤、または他の活性剤および補助剤が含まれる。他の実施形態では、薬剤は、本明細書に記載される１つ以上の単離されたＴＡＡである。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるワクチン組成物は、以前に特定の治療、またはがんもしくは他の疾患もしくは障害の治療を受けたことがない対象に投与される。本明細書で使用される場合、「対象が他のワクチンまたは治療剤による治療を控える」という語句は、本開示のワクチンを受ける前にがん治療または他の治療もしくは手順を受けていない対象を指す。一部の実施形態では、対象は、本明細書の様々な実施形態に記載されるように、治療用ワクチンの投与前に、１つ以上の治療用ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン、ＡＺＤ１２２２、ＢＮＴ１６２ｂ２、ｍＲＮＡ－１２７３などのｃｏｖｉｄ－１９ワクチン）の接種を控える。一部の実施形態では、対象は、本明細書の様々な実施形態に記載されるように、治療用ワクチンの投与前に、１つ以上の抗生物質の投与を控える。「免疫寛容」とは、免疫応答を誘導する可能性のある物質、抗原、または組織に対する免疫系の無応答の状態である。本開示のワクチン組成物は、特定の実施形態では、免疫寛容の誘導を回避するために、または免疫寛容を逆転させるために投与される。
様々な実施形態では、ワクチン組成物は、１つ以上の化学療法剤を含む、がんの治療に使用される１つ以上の活性剤と組み合わせて投与される。このような活性剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン）、アジリジン（例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ）、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含む）、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）、抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）、抗代謝剤（例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、葉酸類似体（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）、プリン類似体（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）、ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ）、アンドロゲン（例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）、抗副腎剤（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）、葉酸補充剤（例えば、フロリン酸）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルミチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２、２’、２’’－トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ）およびパクリタキセルタンパク質結合粒子（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ｒｈｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）、クロラムブシル、ゲムシタビン、６－チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）、ビンブラスチン、ドセタキセル、白金、エトポシド（ＶＰ－１６）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロン酸塩、ＣＰＴ－１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチロミチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸誘導体（例えば、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（商標）（ベキサロテン）、ＰＡＮＲＥＴＩＮ（商標）（アリトレチノイン）およびＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス））、エスペラミシン、カペシタビン、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。また、この定義には、これは、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）および抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリン）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。さらなるがん活性剤には、ソラフェニブおよび他のプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、アファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、およびスニチニブ、シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムス、および他のＴＯＲ阻害剤）が挙げられる。
さらなる実施形態では、ワクチン組成物は、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストと組み合わせて投与される。かかるアゴニストは、ペプチドグリカン、ｐｏｌｙ：Ｃ、ＣｐＧ、３Ｍ００３、フラジェリン、および真核生物のリボソーム伸長因子および開始因子４ａ（ＬｅＩＦ）のＬｅｉｓｈｍａｎｉａホモログから選択することができる。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、本明細書に記載されるようにサイトカインと組み合わせて投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、以下のうちの１つ以上を標的とする分子と組み合わせて投与され得る：接着（ＭＡｄＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、ＣＤ１０３）、抑制性メディエーター（ＩＤＯ、ＴＤＯ）、ＭＤＳＣ／制御性Ｔ細胞（ＮＯＳ１、アルギナーゼ、ＣＳＦＲ１、ＦＯＸＰ３、シクロホスファミド、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、ＰＩ３Ｋδ、タスキニモド）、免疫抑制（ＴＧＦβ、ＩＬ－１０）、プライミングおよび提示（ＢＡＴＦ３、ＸＣＲ１／ＸＣＬ１、ＳＴＩＮＧ、ＩＮＦα）、アポトーシスのリサイクリング（ＩＬ－６、サバイビン、ＩＡＰ、ｍＴＯＲ、ＭＣＬ１、ＰＩ３Ｋ）、Ｔ細胞輸送（ＣＸＣＬ９／１０／１１、ＣＸＣＬ１／１３、ＣＣＬ２／５、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＣＣＲ５）、発がん性活性化（ＷＮＴ－βカテニン、ＭＥＫ、ＰＰＡＲγ、ＦＧＦＲ３、ＴＫＩ、ＭＥＴ）、エピジェネティックリプログラミング（ＨＤＡＣ、ＨＭＡ、ＢＥＴ）、血管新生免疫調節（ＶＥＧＦ（α、β、γ））、低酸素（ＨＩＦ１α、アデノシン、抗ＡＤＯＲＡ２Ａ、抗ＣＤ７３、および抗ＣＤ３９）。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と組み合わせて投与され得る。ＨＤＡＣ阻害剤には、ヒドロキサメート、環状ペプチド、脂肪族酸、およびベンズアミドが挙げられる。本明細書における使用が企図される例示的なＨＤＡＣ阻害剤には、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ／Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ／Ｚｏｌｉｎｚａ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＰＸＤ－１０１、デプシペプチド（ＦＫ２２８／ロミデプシン／ＩＳＴＯＤＡＸ（登録商標））、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、ＭＳ－２７５、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、ＡＣＹ－７３８、ＴＭＰ１９５、ツシジノスタット、バルプロン酸、フェニル酪酸ナトリウム、５－アザ－２’－デオキシシチジン（デシタビン）が挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｂａｅ， Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ ２０１１；３（２）：１６６－１７９、Ｏｄｕｎｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ １； ２（１）：３７－４９を参照されたい）。他のＨＤＡＣ阻害剤には、ボリノスタット（ＳＡＨＡ、ＭＫ０６８３）、エンチノスタット（ＭＳ－２７５）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、ＡＣＹ－７３８、ツシジノスタット（チダミド）、ＴＭＰ１９５、シタリノスタット（ＡＣＹ－２４１）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ロミデプシン（ＦＫ２２８、デプシペプチド）、ＭＣ１５６８、ツバスタチンＡ塩酸塩、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、ダシノスタッ（ＬＡＱ８２４）、ＣＵＤＣ－１０１、キシノスタット（ＪＮＪ－２６４８１５８５）二円酸塩、プラシノスタット（ＳＢ９３９）、ＰＣＩ－３４０５１、ドロキシノスタット、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１）、ＲＧＦＰ９６６、ＡＲ－４２、リコリノスタット（ＡＣＹ－１２１５）、バルプロ酸ナトリウム塩（バルプロ酸ナトリウム）、タセジナリン（ＣＩ９９４）、ＣＵＤＣ－９０７、酪酸ナトリウム、クルクミン、Ｍ３４４、ツバシン、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、レスミノスタット、ジバルプロエクスナトリウム、スクリプタイド、およびツバスタチンＡが挙げられる。
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、クロロキンと組み合わせて投与され、クロロキンは、エンドソームの酸性化を防ぎ、腫瘍細胞によって誘導されるオートファジーを阻害して、加速された細胞増殖および栄養枯渇に耐える、リソソーム指向性剤である。より一般的には、本明細書に記載されるヘテロ接合ウイルスベクターを含む組成物は、オートファジー阻害剤、放射線増感剤、化学増感剤（例えば、クロロキン、ミソニダゾール、メトロニダゾール、および低酸素細胞毒（例えば、チラパザミン）として作用する活性剤と組み合わせて投与することができる。これに関して、ヘテロ接合ウイルスベクターと、クロロキンまたは他の放射線増感剤もしくは化学増感剤、あるいはオートファジー阻害剤とのかかる組み合わせは、他のがん活性剤と、または放射線療法もしくは手術とさらに組み合わせて使用することができる。
他の実施形態では、ワクチン組成物は、「免疫原性細胞死」と称される免疫応答の活性化を伴う腫瘍細胞の死滅をもたらすことが知られている１つ以上の小分子薬（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、オキサリプラチン、およびミトキサントロン）と組み合わせて投与される。さらに、腫瘍細胞の免疫原性を増強することが知られている薬剤、例えば、パツピロン（エポチロンＢ）、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするモノクローナル抗体７Ａ７．２７、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタット、およびエンチノスタット）、ｎ３－多価不飽和脂肪酸ドコサヘキサエン酸、さらにプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、シコニン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根の主成分）、ならびに腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ＴＶｅｃ（タリモジーン・ラハーパレプベック））との組み合わせ。一部の実施形態では、本明細書に記載のヘテロ接合ウイルスベクターを含む組成物は、エピジェネティック療法（例えば、局所的または全身的に投与され得るＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、デシタビン、５－アザ－２’－デオキシシチジン））と組み合わせて投与され得る。
他の実施形態では、ワクチン組成物は、ＡＤＣＣ、ＤＣによる腫瘍の取り込みを増加させる１つ以上の抗体と組み合わせて投与される。したがって、本開示の実施形態は、がんワクチン組成物を、抗原提示細胞による腫瘍細胞またはその断片の摂取、およびその後の免疫系への腫瘍抗原の提示を誘導または増強する任意の分子と組み合わせることを企図する。これらの分子には、受容体結合（例えば、Ｆｃまたはマンノース受容体）を誘導し、かつ抗原提示細胞に輸送する薬剤（例えば、抗体、抗体様分子、多重特異性多価分子およびポリマー）が含まれる。そのような分子は、ヘテロ接合性ウイルスベクターを含む組成物とともに腫瘍内に投与されるか、または異なる経路によって投与され得る。例えば、本明細書に記載されるヘテロ接合ウイルスベクターを含む組成物は、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ、パニツムマブ、オファツムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、オビヌツズマブ、抗ＨＥＲ１、抗ＨＥＲ２、もしくは抗ＨＥＲ３抗体（例えば、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＭＭ－１１１、ＭＭ－１５１、ＭＭ－１２１、ＡＭＧ８８８）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、ニモツズマブ、ＡＢＴ－８０６）、または他の同様の抗体の腫瘍内注射と組み合わせて腫瘍内投与され得る。Ｆｃ受容体に結合することができる任意の多価スカフォールドおよびインターナリゼーションを誘導することができる他の受容体を、本明細書に記載の併用療法で使用することができる（例えば、受容体に結合することができるＦｃ断片もしくはポリマーに連結されている標的に結合することができるペプチドおよび／またはタンパク質）。
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、ＡＬＫ、ＰＡＲＰ、ＶＥＧＦＲｓ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１－３、ＨＩＦ１α、ＰＤＧＦＲ１－２、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－ＫＩＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＡＲ、ＰＲ、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＳＴＡＴ３、Ｒａｓ、ＨＤＡＣ１－１１、ｍＴＯＲ、および／またはＣＸＣＲ４の阻害剤とさらに組み合わせることができる。
特定の実施形態では、がんワクチン組成物は、（例えば、阻害経路を遮断することによって）共刺激シグナルを促進する抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４）、または共刺激経路を活性化する抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１２７、抗ＧＩＴＲ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、およびＩＮＦα抗体）と、さらに組み合わせることができる。
チェックポイント阻害剤
特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤分子は、本明細書に記載のワクチン組成物と組み合わせて投与される。免疫チェックポイントとは、自己寛容を維持するため、および免疫応答の持続時間および大きさを調節するために重要な、免疫系の様々な抑制経路を指す。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的であるＴ細胞に対する免疫耐性の主要なメカニズムとして、特定の免疫チェックポイント経路を使用する。（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２ Ｎａｔｕｒｅ １２：２５２；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｍｅｌｌｍａｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：１（２０１３）を参照されたい）。免疫チェックポイント阻害剤には、統計的に有意な様式で免疫系の抑制経路を遮断または阻害する任意の薬剤が含まれる。そのような阻害剤は、免疫チェックポイント受容体に結合して遮断もしくは阻害する抗体もしくはその抗原結合断片、または免疫チェックポイント受容体リガンドに結合して遮断もしくは阻害する抗体を含み得る。遮断または阻害の標的となり得る例示的な免疫チェックポイント分子には、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ、γδ、およびメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも称される）、およびＣＧＥＮ－１５０４９が含まれるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、２Ｂ４、ＣＤ１６０、およびＣＧＥＮ－１５０４９のうちの１つ以上に結合し、それらの活性を遮断もしくは阻害する、抗体もしくはその抗原結合断片または他の結合タンパク質が含まれる。
特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤分子は、本明細書に記載のワクチン組成物と組み合わせて投与される。免疫チェックポイントとは、自己寛容を維持するため、および免疫応答の持続時間および大きさを調節するために重要な、免疫系の様々な抑制経路を指す。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的であるＴ細胞に対する免疫耐性の主要なメカニズムとして、特定の免疫チェックポイント経路を使用する。（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２ Ｎａｔｕｒｅ １２：２５２；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｍｅｌｌｍａｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：１（２０１３）を参照されたい）。免疫チェックポイント阻害剤には、統計的に有意な様式で免疫系の抑制経路を遮断または阻害する任意の薬剤が含まれる。そのような阻害剤は、免疫チェックポイント受容体に結合して遮断もしくは阻害する抗体もしくはその抗原結合断片、または免疫チェックポイント受容体リガンドに結合して遮断もしくは阻害する抗体を含み得る。遮断または阻害の標的となり得る例示的な免疫チェックポイント分子には、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ、γδ、およびメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも称される）、およびＣＧＥＮ－１５０４９が含まれるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、２Ｂ４、ＣＤ１６０、およびＣＧＥＮ－１５０４９のうちの１つ以上に結合し、それらの活性を遮断もしくは阻害する、抗体もしくはその抗原結合断片または他の結合タンパク質が含まれる。
例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、および抗ＰＤＬ２剤、例えば、Ａ１６７、ＡＢ１２２、ＡＢＢＶ－１８１、ＡＤＧ－１０４、ＡＫ－１０３、ＡＫ－１０５、ＡＫ－１０６、ＡＧＥＮ２０３４、ＡＭ０００１、ＡＭＧ－４０４、ＡＮＢ－０３０、ＡＰＬ－５０２、ＡＰＬ－５０１、ジンベレリマブ、アテゾリズマブ、ＡＶＡ－０４０、ＡＶＡ－０４０－１００、アベルマブ、バルスチリマブ、ＢＡＴ－１３０６、ＢＣＤ－１３５、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＢＩ－７５４０９１、ブジガリマブ、カムレリズマブ、ＣＢ－２０１、ＣＢＴ－５０２、ＣＣＸ－４５０３、セミプリマブ、コシベリマブ、セトレリマブ、ＣＳ－１００１、ＣＳ－１００３、ＣＸ－０７２、ＣＸ－１８８、ドスタルリマブ、デュルバルマブ、エンバフォリマブ、スゲマリマブ、ＨＢＭ９１６７、Ｆ－５２０、ＦＡＺ－０５３、ゲノリムズマブ、ＧＬＳ－０１０、ＧＳ－４２２４、ｈＡＢ２１、ＨＬＸ－１０、ＨＬＸ－２０、ＨＳ－６３６、ＨＸ－００８、ＩＭＣ－００１、ＩＭＭ－２５、ＩＮＣＢ－８６５５０、ＪＳ－００３、ＪＴＸ－４０１４、ＪＹＯ－３４、ＫＬ－Ａ１６７、ＬＢＬ－００６、ロダポリマブ、ＬＰ－００２、ＬＶＧＮ－３６１６、ＬＹＮ－００１０２、ＬＭＺ－００９、ＭＡＸ－１０１８１、ＭＥＤＩ－０６８０、ＭＧＡ－０１２（レチファンリマブ）、ＭＳＢ－２３１１、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、プロルゴリマブ、プロロリマブ、サンサリマブ、ＳＣＴ－Ｉ１０Ａ、ＳＧ－００１、ＳＨＲ－１３１６、シンチリマブ、スパルタリズマブ、ＲＧ６０８４、ＲＧ６１３９、ＲＧ６２７９、ＣＡ－１７０、ＣＡ－３２７、ＳＴＩ－３０３１、トレラサイト、ｔｏｃａ ５２１、Ｓｙｍ－０２１、ＴＧ－１５０１、チスレリズマブ、トリパリマブ、ＴＴ－０１、ＺＫＡＢ－００１、ならびにリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２との相互作用を遮断することができる抗ＰＤ－１抗体（ＷＯ／２０１７／１２４０５０に記載されている）が含まれる。
少なくとも１つの標的が抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、または抗ＰＤＬ２である、例示的な多重特異性免疫チェックポイント阻害剤には、ＡＢＰ－１６０（ＣＤ４７×ＰＤ－Ｌ１）、ＡＫ－１０４（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＡＫ－１１２（ＰＤ－１×ＶＥＧＦ）、ＡＬＰＮ－２０２（ＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ－４×ＣＤ２８）、ＡＰ－２０１（ＰＤ－Ｌ１×ＯＸ－４０）、ＡＰ－５０５（ＰＤ－Ｌ１×ＶＥＧＦ）、ＡＶＡ－００１７（ＰＤ－Ｌ１×ＬＡＧ－３）、ＡＶＡ－００２１（ＰＤ－Ｌ１×ＬＡＧ－３）、ＡＵＰＭ－１７０（ＰＤ－Ｌ１×ＶＩＳＴＡ）、ＢＣＤ－２１７（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＢＨ－２９５０（ＰＤ－１×ＨＥＲ２）、ＢＨ－２９９６ｈ（ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１）、ＢＨ－２９ｘｘ（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ４７）、ビントラフスプアルファ（ＰＤ－Ｌ１×ＴＧＦβ）、ＣＢ－２１３（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、ＣＤＸ－５２７（ＣＤ２７×ＰＤ－Ｌ１）、ＣＳ－４１００（ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１）、ＤＢ－００１（ＰＤ－Ｌ１×ＨＥＲ２）、ＤＢ－００２（ＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ－４）、ＤＳＰ－１０５（ＰＤ－１×４－１ＢＢＬ）、ＤＳＰ－１０６、（ＰＤ－１×ＣＤ７０）、ＦＳ－１１８（ＬＡＧ－３×ＰＤ－Ｌ１）、ＦＳ－２２２（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＰＤ－Ｌ１）、ＧＥＮ－１０４６（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＩＢＩ－３１８（ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１）、ＩＢＩ－３２２（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ－４７）、ＫＤ－０３３（ＰＤ－Ｌ１×ＩＬ－１５）、ＫＮ－０４６（ＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ－４）、ＫＹ－１０４３（ＰＤ－Ｌ１×ＩＬ－２）、ＬＹ－３４３４１７２（ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１）、ＭＣＬＡ－１４５（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７）、ＭＥＤＩ－５７５２（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＭＧＤ－０１３（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、ＭＧＤ－０１９（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＮＤ－０２１（ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ×ＨＳＡ）、ＯＳＥ－２７９（ＰＤ－１×ＰＤ－Ｌ１）、ＰＲＳ－３３２（ＰＤ－１×ＨＥＲ２）、ＰＲＳ－３４４（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７）、ＰＳＢ－２０５（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、Ｒ－７０１５（ＰＤ－Ｌ１×ＴＧＦβ）、ＲＯ－７１２１６６１（ＰＤ－１×ＴＩＭ－３）、ＲＯ－７２４７６６９（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、ＳＨＲ－１７０１（ＰＤ－Ｌ１×ＴＧＦβ２）、ＳＬ－２７９２５２（ＰＤ－１×Ｏ×４０Ｌ）、ＴＳＲ－０７５（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、ＸｍＡｂ－２０７１７（ＣＴＬＡ－４×ＰＤ－１）、ＸｍＡｂ－２３１０４（ＰＤ－１×ＩＣＯＳ）、およびＹ－１１１（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ－３）が含まれる。
追加の例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＣＴＬＡ４剤、例えば、ＡＤＧ－１１６、ＡＧＥＮ－２０４１、ＢＡ－３０７１、ＢＣＤ－１４５、ＢＪ－００３、ＢＭＳ－９８６２１８、ＢＭＳ－９８６２４９、ＢＰＩ－００２、ＣＢＴ－５０９、ＣＧ－０１６１、Ｏｌｉｐａｓｓ－１、ＨＢＭ－４００３、ＨＬＸ－０９、ＩＢＩ－３１０、ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ＪＳ－００７、ＫＮ－０４４、ＭＫ－１３０８、ＯＮＣ－３９２、ＲＥＧＮ－４６５９、ＲＰ－２、トレメリムマブ、およびザリフレリマブが含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＣＴＬＡ４である、追加の例示的な多重特異性免疫チェックポイント阻害剤には、ＡＫ－１０４（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＡＬＰＮ－２０２（ＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ－４×ＣＤ２８）、ＡＴＯＲ－１０１５（ＣＴＬＡ－４×ＯＸ４０）、ＡＴＯＲ－１１４４（ＣＴＬＡ－４×ＧＩＴＲ）、ＢＣＤ－２１７（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＤＢ－００２（ＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ－４）、ＦＰＴ－１５５（ＣＤ２８×ＣＴＬＡ－４）、ＫＮ－０４６（ＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ－４）、）、ＭＥＤＩ－５７５２（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＭＧＤ－０１９（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＰＳＢ－２０５（ＰＤ－１×ＣＴＬＡ－４）、ＸｍＡｂ－２０７１７（ＣＴＬＡ－４×ＰＤ－１）、およびＸｍＡｂ－２２８４１（ＣＴＬＡ－４×ＬＡＧ－３）が含まれる。追加の例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＬＡＧ３剤、例えば、ＢＩ－７５４１１１、ＢＪ－００７、エフチラギモドアルファ、ＧＳＫ－２８３１７８１、ＨＬＸ－２６、ＩＢＩ－１１０、ＩＭＰ－７０１、ＩＭＰ－７６１、ＩＮＣＡＧＮ－２３８５、ＬＢＬ－００７、ＭＫ－４２８０、ＲＥＧＮ－３７６７、レラトリマブ、Ｓｙｍ－０２２、ＴＪ－Ａ３、およびＴＳＲ－０３３が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＬＡＧ３である、追加の例示的な多重特異性免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＢ－２１３（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、ＦＳ－１１８（ＬＡＧ－３×ＰＤ－Ｌ１）、ＭＧＤ－０１３（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、ＡＶＡ－００１７（ＰＤ－Ｌ１×ＬＡＧ－３）、ＡＶＡ－００２１（ＰＤ－Ｌ１×ＬＡＧ－３）、ＲＯ－７２４７６６９（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、ＴＳＲ－０７５（ＰＤ－１×ＬＡＧ－３）、およびＸｍＡｂ－２２８４１（ＣＴＬＡ－４×ＬＡＧ－３）が含まれる。追加の例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＴＩＧＩＴ剤、例えば、ＡＢ－１５４、ＡＳＰ８３７４、ＢＧＢ－Ａ１２１７、ＢＭＳ－９８６２０７、ＣＡＳＣ－６７４、ＣＯＭ－９０２、ＥＯＳ－８８４４４８、ＨＬＸ－５３、ＩＢＩ－９３９、ＪＳ－００６、ＭＫ－７６８４、ＮＢ－６２５３、ＲＸＩ－８０４、チラゴルマブ、およびＹＨ－２９１４３が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＴＩＧＩＴである、追加の例示的な多重特異性免疫チェックポイント阻害剤が企図される。追加の例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＴＩＭ３剤、例えば、ＢＧＢ－Ａ４２５、ＢＭＳ－９８６２５８、ＥＳ－００１、ＨＬＸ－５２、ＩＮＣＡＧＮ－２３９０、ＬＢＬ－００３、ＬＹ－３３２１３６７、ＭＢＧ－４５３、ＳＨＲ－１７０２、Ｓｙｍ－０２３、およびＴＳＲ－０２２が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＴＩＭ３である、追加の例示的な多重特異性免疫チェックポイント阻害剤には、ＡＵＰＭ－３２７（ＰＤ－Ｌ１×ＴＩＭ－３）、およびＲＯ－７１２１６６１（ＰＤ－１×ＴＩＭ－３）が含まれる。追加の例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＶＩＳＴＡ剤、例えば、ＨＭＢＤ－００２およびＰＭＣ－３０９が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＶＩＳＴＡである、追加の例示的な多重特異性免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＡ－１７０（ＰＤ－Ｌ１×ＶＩＳＴＡ）が含まれる。追加の例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗ＢＴＬＡ剤、例えば、ＪＳ－００４が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＢＴＬＡである、追加の例示的な多重特異性免疫チェックポイント阻害剤が企図される。例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＯＸ４０剤、例えば、ＡＢＢＶ－３６８、ＧＳＫ－３１７４９９８、ＨＬＸ－５１、ＩＢＩ－１０１、ＩＮＢＲＸ－１０６、ＩＮＣＡＧＮ－１９４９、ＩＮＶ－５３１、ＪＮＪ－６８９２、およびＫＨＫ－４０８３が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＯＸ４０である、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＡＰ－２０１（ＰＤ－Ｌ１×ＯＸ－４０）、ＡＰＶＯ－６０３（ＣＤ１３８／４－１ＢＢ×ＯＸ－４０）、ＡＴＯＲ－１０１５（ＣＴＬＡ－４×ＯＸ－４０）、およびＦＳ－１２０（ＯＸ４０×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）が含まれる。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＧＩＴＲ剤、例えば、ＢＭＳ－９８６２５６、ＣＫ－３０２、ＧＷＮ－３２３、ＩＮＣＡＧＮ－１８７６、ＭＫ－４１６６、ＰＴＺ－５２２、およびＴＲＸ－５１８が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＧＩＴＲである、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＡＴＯＲ－１１４４（ＣＴＬＡ－４×ＧＩＴＲ）が含まれる。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＣＤ１３７／４－１ＢＢ剤、例えば、ＡＤＧ－１０６、ＡＧＥＮ－２３７３、ＡＰ－１１６、ＡＴＯＲ－１０１７、ＢＣＹ－３８１４、ＣＴＸ－４７１、ＥＵ－１０１、ＬＢ－００１、ＬＶＧＮ－６０５１、ＲＴＸ－４－１ＢＢＬ、ＳＣＢ－３３３、ウレルマブ、ウトミルマブ、およびＷＴｉＮＴが含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＣＤ１３７／４－１ＢＢである、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＡＬＧ．ＡＰＶ－５２７（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×５Ｔ４）、ＡＰＶＯ－６０３（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＯＸ４０）、ＢＴ－７４８０（Ｎｅｃｔｉｎ－４×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＣＢ－３０７（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＰＳＭＡ）、ＣＵＥ－２０１（ＣＤ８０×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＤＳＰ－１０５（ＰＤ－１×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＦＳ－１２０（ＯＸ４０×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＦＳ－２２２（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＧＥＮ－１０４２（ＣＤ４０×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＧＥＮ－１０４６（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＩＮＢＲＸ－１０５（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＭＣＬＡ－１４５（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＭＰ－０３１０（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＦＡＰ）、ＮＤ－０２１（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＨＳＡ）、ＰＲＳ－３４３（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＨＥＲ２）、ＰＲＳ－３４２（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＧＰＣ３）、ＰＲＳ－３４４（ＣＤ１３７／４－１ＢＢ×ＰＤ－Ｌ１）、ＲＧ－７８２７（ＦＡＰ×４－１ＢＢＬ）、およびＲＯ－７２２７１６６（ＣＤ－１９×４－１ＢＢＬ）が含まれる。
追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＩＣＯＳ剤、例えば、ＢＭＳ－９８６２２６、ＧＳＫ－３３５９６０９、ＫＹ－１０４４、およびボプラテリマブが含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＩＣＯＳである、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＸｍＡｂ－２３１０４（ＰＤ－１×ＩＣＯＳ）が含まれる。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＣＤ１２７剤、例えば、ＭＤ－７０７およびＯＳＥ－７０３が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＣＤ１２７である、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントが企図される。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＣＤ４０剤、例えば、ＡＢＢＶ－４２８、ＡＢＢＶ－９２７、ＡＰＧ－１２３３、ＡＰＸ－００５Ｍ、ＢＩ－６５５０６４、ブレセルマブ、ＣＤ－４０ＧＥＸ、ＣＤＸ－１１４０、ＬＶＧＮ－７４０８、ＭＥＤＩ－５０８３、ミタザリマブ、およびセリクレルマブが含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＣＤ４０である、追加の例示的な複数特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＧＥＮ－１０４２（ＣＤ４０×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）が含まれる。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＣＤ２８剤、例えば、ＦＲ－１０４およびセラリズマブが含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＣＤ２８である、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＡＬＰＮ－１０１（ＣＤ２８×ＩＣＯＳ）、ＡＬＰＮ－２０２（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ２８）、ＣＵＥ－２０１（ＣＤ８０×ＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ＦＰＴ－１５５（ＣＤ２８×ＣＴＬＡ－４）、およびＲＥＧＮ－５６７８（ＰＳＭＡ×ＣＤ２８）が含まれる。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＣＤ２７剤、例えば、ＨＬＸ－５９およびバルリルマブが含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＣＤ２７である、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＤＳＰ－１６０（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ２７／ＣＤ７０）およびＣＤＸ－２５６（ＰＤ－Ｌ１×ＣＤ２７）が含まれる。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＩＬ－２剤、例えば、ＡＬＫＳ－４２３０、ＢＮＴ－１５１、ＣＵＥ－１０３、ＮＬ－２０１、およびＴＨＯＲ－７０７が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＩＬ－２である、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントには、ＣＵＥ－１０２（ＩＬ－２×ＷＴ１）が含まれる。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＩＬ－７剤、例えば、ＢＮＴ－１５２が含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＩＬ－７である、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントが企図される。追加の例示的な刺激性免疫チェックポイントには、抗ＩＬ－１２剤、例えば、ＡＫ－１０１、Ｍ－９２４１、およびウステキヌマブが含まれる。少なくとも１つの標的が抗ＩＬ－１２である、追加の例示的な多重特異性刺激性免疫チェックポイントが企図される。
本明細書に記載されるように、本開示は、ワクチン組成物、シクロホスファミド、チェックポイント阻害剤、および／または他の治療剤（例えば、Ｔｒｅｇ阻害剤）を投与する方法を提供する。Ｔｒｅｇ阻害剤は当該技術分野で知られており、例えば、ベンペガルデスロイキン、フルダラビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、シクロスポリンＡ、タクロリムス、パクリタキセル、イマチニブ、ダサチニブ、ベバシズマブ、イデラリシブ、抗ＣＤ２５、抗葉酸受容体４、抗ＣＴＬＡ４、抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＣＣＲ４、抗ＣＣＲ５、抗ＣＣＲ８、またはＴＬＲ８リガンドが含まれる。
投薬
本明細書で使用される「用量」または「単位用量」は、治療有効量の１つ以上の細胞株を含む１つ以上のワクチン組成物を指す。用量は、単一のワクチン組成物、２つの別個のワクチン組成物、または２つの別個のワクチン組成物、加えて、本明細書に記載の１つ以上の治療剤を含む１つ以上の組成物であり得る。別々の組成物にある場合、２つ以上の組成物の「用量」は、「同時に」投与されることを意味する。一部の実施形態では、２つ以上の組成物は、対象の異なる部位（例えば、腕、大腿、または背中）に投与される。本明細書で使用される場合、２つの組成物または治療剤の「同時」投与は、第１の組成物または治療剤の投与から約３０分以内に、第２の組成物または治療剤が投与されることを示す。２つ以上の組成物および／または治療剤が同時に投与される場合、各組成物または薬剤は、３０分以内に投与され、かかる投与のタイミングは、第１の組成物または薬剤の投与で始まり、最後の組成物または薬剤の投与の開始で終わる。場合によっては、同時投与は、第１の組成物または薬剤の投与開始から約３０分以内、もしくは１５分以内、もしくは１０分以内、もしくは５分以内に完了し得る（すなわち、最後の組成物または薬剤の投与が始まる）。第１の組成物の投与の「前」または「後」の第２の（もしくは複数の）治療剤または組成物の投与は、第１の組成物および別の治療剤の投与が、少なくとも３０分、例えば少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、もしくは少なくとも４８時間離れていることを意味する。
本明細書で使用される「用量」または「単位用量」は、治療有効量の１つ以上の細胞株を含む１つ以上のワクチン組成物を指す。用量は、単一のワクチン組成物、２つの別個のワクチン組成物、または２つの別個のワクチン組成物、加えて、本明細書に記載の１つ以上の治療剤を含む１つ以上の組成物であり得る。別々の組成物にある場合、２つ以上の組成物の「用量」は、「同時に」投与されることを意味する。一部の実施形態では、２つ以上の組成物は、対象の異なる部位（例えば、腕、大腿、または背中）に投与される。本明細書で使用される場合、２つの組成物または治療剤の「同時」投与は、第１の組成物または治療剤の投与から約３０分以内に、第２の組成物または治療剤が投与されることを示す。２つ以上の組成物および／または治療剤が同時に投与される場合、各組成物または薬剤は、３０分以内に投与され、かかる投与のタイミングは、第１の組成物または薬剤の投与で始まり、最後の組成物または薬剤の投与の開始で終わる。場合によっては、同時投与は、第１の組成物または薬剤の投与開始から約３０分以内、もしくは１５分以内、もしくは１０分以内、もしくは５分以内に完了し得る（すなわち、最後の組成物または薬剤の投与が始まる）。第１の組成物の投与の「前」または「後」の第２の（もしくは複数の）治療剤または組成物の投与は、第１の組成物および別の治療剤の投与が、少なくとも３０分、例えば少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、もしくは少なくとも４８時間離れていることを意味する。
ワクチン組成物中の様々な個々の細胞株からの細胞の量（例えば、数）は、（本明細書で定義されるように）等しい、（本明細書で定義されるように）ほぼ等しい、または異なり得る。様々な実施形態では、ワクチン組成物の各細胞株は、ほぼ等しい量で存在する。他の実施形態では、１つのワクチン組成物の２つまたは３つの細胞株がほぼ等しい量で存在し、第２の組成物の２つまたは３つの異なる細胞株がほぼ等しい量で存在する。
一部の実施形態では、（複数の細胞株が投与される場合）各細胞株からの細胞の数は、約５．０×１０5、１．０×１０6、２．０×１０6、３．０×１０6、４．０×１０6、５．０×１０6、６．０×１０6、７．０×１０6、８×１０6、９．０×１０6、１．０×１０7、２．０×１０7、３．０×１０7、４．０×１０7、５．０×１０7、６．０×１０7、８．０×１０7、９．０×１０7、１．０×１０8、２．０×１０8、３．０×１０8、４．０×１０8、または５．０×１０8細胞である。一実施形態では、約１０００万（例えば、１．０×１０7）個の１つの細胞株からの細胞が企図される。別の実施形態では、６つの別個の細胞株が投与され、約１０００万個の各細胞株からの細胞、または６０００万個（例えば、６．０×１０7）の総細胞が企図される。
投与されるワクチン組成物中の細胞の総数は、例えば、投与部位当たり１．０×１０6～３．０×１０8の範囲であり得る。例えば、一部の実施形態では、２．０×１０6、３．０×１０6、４．０×１０6、５．０×１０6、６．０×１０6、７．０×１０6、８×１０6、９．０×１０6、１．０×１０7、２．０×１０7、３．０×１０7、４．０×１０7、５．０×１０7、６．０×１０7、８．０×１０7、９．０×１０7、１．０×１０8、２．０×１０8、または３．０×１０8個の細胞が投与される。
本明細書に記載されるように、カクテルまたはワクチン組成物の各投与に含まれる細胞株の数は、１～１０の細胞株の範囲であり得る。一部の実施形態では、各細胞株からの細胞の数は等しくなく、カクテルまたはワクチン組成物中に、異なる比率の細胞株が含まれる。例えば、１つのカクテルに３つの異なる細胞株から合計５．０×１０7細胞が含まれている場合、１つの細胞株が３．３３×１０7細胞、および残りの２つの細胞株が８．３３×１０6細胞存在する可能性がある。
ワクチン組成物および追加の治療剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤など）を含む組成物は、経口、非経口、吸入スプレーによって、局所、直腸、鼻腔、口腔、膣内、または埋込型リザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、心臓内、動脈内、および舌下注射または注入技術を含む。また、ワクチン組成物および追加の治療剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤など）を含む組成物が、節内または腫瘍内に投与される実施形態も想定される。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は皮内投与される。関連する実施形態では、皮内注射は、カクテルまたはワクチン組成物を、５～１５度の投与角度で注射することを含む。
注射（例えば、皮内注射または皮下注射）は、単一の部位（例えば、大腿、大腿もしくは背中）で、または複数の部位（例えば、腕および大腿）で提供され得る。一部の実施形態では、ワクチン組成物は２つの部位で同時に投与され、各部位は、異なる組成物（例えば、カクテル）を含むワクチン組成物を受ける。例えば、一部の実施形態では、対象は、腕に、３つの細胞株を含む組成物を受け、大腿に、３つの異なる細胞株または部分的に重複する細胞株を含む組成物を受ける。一部の実施形態では、対象は、各腕および各大腿で、同時に１つ以上の細胞株を含む組成物を受ける。
一部の実施形態では、対象は、カクテルまたはワクチン組成物の複数回用量を受け、用量は、特定の（例えば、流入領域）リンパ節での潜在的な抗原競合を回避するために、対象の異なる部位に投与される。一部の実施形態では、複数回用量は、用量間で対象の投与部位（例えば、左腕および右腕、または左大腿および右大腿）を交互に変えるよって投与される。一部の実施形態では、複数回用量は、以下のように投与される：第１の用量が、一方の腕に投与され、第２の用量が、他方の腕に投与される。その後の用量は、投与される場合、この様式で交互に続けられる。一部の実施形態では、複数回用量は、以下のように投与される：第１の用量が、一方の大腿に投与され、第２の用量が、他方の大腿に投与される。その後の用量は、投与される場合、この様式で交互に続けられる。一部の実施形態では、複数回用量は、以下のように投与される：第１の用量が、一方の大腿に投与され、第２の用量が、一方の腕に投与される。その後の用量は、投与される場合、対象にとって安全かつ有効である任意の組み合わせで、交互に行われ得る。一部の実施形態では、複数回用量は、以下のように投与される：第１の用量が、一方の大腿および一方の腕に投与され、第２の用量が、他方の腕および他方の大腿に投与される。その後の用量は、投与される場合、対象にとって安全かつ有効である任意の組み合わせで、交互に行われ得る。
一部の実施形態では、対象は、皮内注射を介して、１つ、２つ以上の別個のカクテル中の合計６つの細胞株（例えば、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＡ５４９、または本明細書に記載の他の６つの細胞株の組み合わせ）を含むワクチン組成物を受け、各カクテルが、６つの細胞株のうちの１つ、または２つ以上の混合物を含む。一部の実施形態では、対象は、皮内注射を介して、３つの細胞株（例えば、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＡ５４９のうちの３つ、または本明細書に記載の他の６つの細胞株の組み合わせからの３つの細胞株）の混合物を含むワクチン組成物を受ける。一部の実施形態では、対象は、腕（例えば、上腕）に、皮内注射を介して、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含む３つの細胞株の混合物を含むワクチン組成物を受け、同時に、対象は、脚（例えば、大腿）に、皮内注射を介して、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含む３つの細胞株の混合物を含むワクチン組成物を受ける。
追加の治療剤が投与される場合、用量または複数回用量は、ワクチン組成物と同じまたは異なる経路を介して投与され得る。例として、一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む組成物は、静脈内注射を介して投与され、ワクチン組成物は、皮内注射を介して投与される。一部の実施形態では、シクロホスファミドは、経口投与され、ワクチン組成物は、皮内投与される。
レジメン
本開示によるワクチン組成物は、対象の様々な投与部位で、様々な時間に、様々な量で投与され得る。対象の免疫系が、抗腫瘍免疫応答の活性化に許容される状態にある場合、腫瘍細胞ワクチンの有効性が影響を受ける可能性がある。したがって、対象が放射線療法、化学療法、または他の以前の治療を受けているか、または受けたことがある場合、有効性が影響を受ける可能性もある。一部の実施形態では、これは、活性化およびエフェクター要素が完全に機能している間、免疫系の免疫抑制要素が阻害されることを必要とする。本明細書に記載の免疫抑制因子に加えて、抗腫瘍免疫を抑制する他の要素には、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１などのチェックポイント分子が含まれるが、これらに限定されない。
本開示によるワクチン組成物は、対象の様々な投与部位で、様々な時間に、様々な量で投与され得る。対象の免疫系が、抗腫瘍免疫応答の活性化に許容される状態にある場合、腫瘍細胞ワクチンの有効性が影響を受ける可能性がある。したがって、対象が放射線療法、化学療法、または他の以前の治療を受けているか、または受けたことがある場合、有効性が影響を受ける可能性もある。一部の実施形態では、これは、活性化およびエフェクター要素が完全に機能している間、免疫系の免疫抑制要素が阻害されることを必要とする。本明細書に記載の免疫抑制因子に加えて、抗腫瘍免疫を抑制する他の要素には、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１などのチェックポイント分子が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ワクチン投与前の対象の免疫系の免疫許容状態を最大化するために、以前の化学療法および放射線療法のサイクルと比較して、ワクチン投与のタイミングが設定される。本開示は、全細胞腫瘍ワクチンの有効性を高めるために、ワクチン接種の前にシクロホスファミドなどの化学療法剤の１回の用量または低用量の投与により、免疫系を調整するための方法を提供する。一部の実施形態では、メトロノミック化学療法（例えば、長期の休薬期間がない化学療法薬の頻繁な低用量投与）が、免疫系を調整するために使用される。一部の実施形態では、メトロノミック化学療法は、より高い用量でしばしば見られる毒性および副作用の合併症なしに、低レベルの薬物が血中に持続することを可能にする。例として、免疫系を調整するためのシクロホスファミドの投与は、一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞対制御性Ｔ細胞の比率を１未満のレベルに維持するために、ワクチン用量を受ける前の時点（例えば、ワクチン組成物の投与の１５日前から１時間前）での薬物の投与を含む。
一部の実施形態では、化学療法レジメン（例えば、骨髄破壊化学療法、シクロホスファミド、および／またはフルダラビンレジメン）は、本明細書に提供されるワクチン組成物の投与の一部またはすべての前に投与され得る。シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標）、ＮＥＯＳＡＲ（商標））は、よく知られたがん治療薬であり、体内のがん細胞の増殖および拡散を妨げる。シクロホスファミドは、ピル（経口）、液体、または静脈内注射で投与され得る。多くの研究から、シクロホスファミドがワクチンの有効性を高め得ることが示されている（例えば、Ｍａｃｈｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１：３６８９，２００１、Ｇｒｅｔｅｎ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１０，３３：２１１、Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５６：６４１ ２００７、Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，６１：３５３，２０１１、Ｌａｈｅｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：１４５５，２００８、およびＢｏｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌ，ｅ１２０７８４２，２０１６を参照されたい）。本明細書に記載される「低用量」のシクロホスファミドは、一部の実施形態では、Ｔｒｅｇを枯渇させ、Ｔｒｅｇ活性を弱め、およびエフェクターＴ細胞の機能を増強するのに効果的である。一部の実施形態では、シクロホスファミドの静脈内低用量投与は、２～５日間にわたる分割用量で４０～５０ｍｇ／ｋｇを含む。他の低用量レジメンには、７～１０日ごとに１～１５ｍｇ／ｋｇ、または週に２回３～５ｍｇ／ｋｇが含まれる。本開示の一部の実施形態による、低用量経口投与は、初期投薬および維持投薬の両方について、１日当たり１～５ｍｇ／ｋｇを含む。経口錠剤の剤形は、２５ｍｇおよび５０ｍｇである。一部の実施形態では、シクロホスファミドは、本明細書に記載のワクチン組成物の第１の用量、および、任意選択的に、各その後の用量に至るまでの７日間、経口５０ｍｇ錠剤として投与される。
一部の実施形態では、シクロホスファミドは、ワクチン組成物の第１に至るまでの７日間毎日、任意選択的に、ワクチン組成物の各その後の用量に先だつ７日間毎日、経口５０ｍｇ錠剤として投与される。別の実施形態では、患者は、単位用量のがんワクチンカクテルの各投与前の７日間、２５ｍｇのシクロホスファミドの経口用量を、１日２回服用するかまたは受け、１回目の用量が、朝の起床時であり、２回目の用量が、夜の就寝前である。特定の実施形態では、ワクチン組成物は、何年にもわたって複数回皮内投与される。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ワクチン組成物の投与後、２週間ごとまたは３週間ごとに投与される。
別の実施形態では、患者は、がんワクチンカクテルまたはワクチン組成物の単位用量の投与の少なくとも１日前に、２００、２５０、３００、５００、または６００ｍｇ／ｍ2のシクロホスファミドの単回静脈内用量を受ける。別の実施形態では、患者は、がんワクチンカクテルまたは単位用量の投与ワクチン用量番号４、８、１２の少なくとも１日前に、２００、２５０、３００、５００、または６００ｍｇ／ｍ2のシクロホスファミドの静脈内用量を受ける。別の実施形態では、患者は、がんワクチンカクテルまたは単位用量の投与の少なくとも１時間前に、静脈内注射として１０００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドの単回投与を受ける。一部の実施形態では、２００ｍｇ／ｋｇの経口高用量または５００～１０００ｍｇ／ｍ2のＩＶ高用量のシクロホスファミドが投与される。
シクロホスファミドの投与は、以下のいずれかを介して行うことができる：経口（例えば、カプセル、溶液用の粉末、または錠剤として）、静脈内（例えば、注射または注入によって静脈（ＩＶ）を介して投与される）、筋肉内（例えば、筋肉への注射（ＩＭ）を介して）、腹腔内（例えば、腹腔膜（ＩＰ）への注射による）、および胸膜内（例えば、胸膜への注射による）。
一部の実施形態では、免疫療法チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、ペムブロリズマブおよびニボルマブなどの抗ＰＤ－１抗体、デュルバルマブなどの抗ＰＤＬ１抗体）は、ワクチン組成物の前、同時、または後に投与され得る。特定の実施形態では、ペムブロリズマブは、６０分にわたる静脈内注入として、３週間ごとに２ｍｇ／ｋｇ投与される。一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、３０分間にわたる静脈内注入として、３週間ごとに２００ｍｇ投与される。一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、３０分間にわたる静脈内注入として、６週間ごとに４００ｍｇ投与される。一部の実施形態では、デュルバルマブは、２週間ごとに１０ｍｇ／ｋｇ投与される。一部の実施形態では、ニボルマブは、２週間ごとに２４０ｍｇ（または、４週間ごとに４８０ｍｇ）投与される。一部の実施形態では、ニボルマブは、１ｍｇ／ｋｇ投与され、続いて、イピリムマブが投与され、同じ日に、３週間ごとに４用量、次いで、２週間ごとに２４０ｍｇ（または、４週間ごとに４８０ｍｇ）投与される。一部の実施形態では、ニボルマブは、３ｍｇ／ｋｇ投与され、続いて、同じ日にイピリムマブが１ｍｇ／ｋｇ投与され、３週間ごとに４用量、次いで、２週間ごとに２４０ｍｇ（または、４週間ごとに４８０ｍｇ）投与される。一部の実施形態では、ニボルマブが投与されるか、または２週間ごとに３ｍｇ／ｋｇ投与される。
一部の実施形態では、デュルバルマブまたはペムブロリズマブは、２、３、４、５、６、７、または８週間ごとに最大８回の投与分が投与され、その後、必要に応じて、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間ごとに減らされる。
他の実施形態では、本開示は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１阻害剤が、固定された投薬レジメン（すなわち、体重ベースではない）で投与されることを提供する。非限定的な例では、ＰＤ－１阻害剤は、毎週または２、３、４、６、および８週目に、１００～１２００ｍｇの量で投与される。非限定的な例では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、毎週または２、３、４、６、および８週目に、２５０～２０００ｍｇの量で投与される。
一部の実施形態では、ワクチン組成物または本明細書に記載の組成物は、ＰＤ－１阻害剤と同時にまたはそれと組み合わせて投与され、ＰＤ－１阻害剤は、Ｑ１Ｗ、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ、Ｑ４Ｗ、Ｑ６Ｗ、もしくはＱ８Ｗのいずれかで、固定して１００ｍｇ～１５００ｍｇ、または体重に基づいて０．５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ投与される。別の実施形態では、ワクチン組成物または本明細書に記載の組成物は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせて同時に投与され、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ｑ１Ｗ、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ、もしくはＱ４Ｗのいずれかで、固定して２５０ｍｇ～２０００ｍｇ、または体重に基づいて２ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ投与される。他の実施形態では、前述のレジメンが投与されるが、患者が当来院中にワクチン組成物（複数可）とチェックポイント阻害剤とを受けるように、組成物が、短時間に順次または連続して投与される。
植物であるＣａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ Ｌは、何世紀にもわたってハーブ療法として使用されており、植物カンナビノイドの重要な供給源である。内因性カンナビノイド系（ＥＣＳ）は、受容体、内因性リガンド（内因性カンナビノイド）、および代謝酵素で構成され、様々な生理学的および病理学的プロセスにおいて役割を果たす。植物性カンナビノイドおよび合成カンナビノイドは、ＥＣＳまたは他の細胞経路の構成要素と相互作用する可能性があり、したがって、がんを含む疾患の発症または進行に影響を与える可能性がある。がん患者では、カンナビノイドを緩和ケアの一部として使用して、痛みを和らげ、吐き気を和らげ、食欲を刺激することができる。加えて、多くの細胞培養および動物試験により、様々なタイプのがんにおけるカンナビノイドの抗腫瘍効果が実証されている（概説については、Ｄａｒｉｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｓｎ．Ｊ．Ｂａｓｉｃ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，１９（１）：１４－２３（２０１９）を参照されたい）。植物カンナビノイドは、主にアサ属の植物によって生成されるＣ２１テルペンフェノール化合物のグループである。いくつかの異なるカンナビノイドおよび関連する分解生成物がある。これらの中には、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、Δ８－ＴＨＣ、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、およびカンナビゲロール（ＣＢＧ）がある。
本開示の特定の実施形態では、すべての植物カンナビノイドの使用は、シクロホスファミドなどのＴｒｅｇ細胞阻害剤の投与の前または投与と同時に中止し、かつ／またはそれ以外の場合、本開示に従って、ワクチン組成物の投与の前または投与と同時に中止する。一部の実施形態では、シクロホスファミドまたはワクチン組成物の複数回の投与が行われ、その中止は、任意選択的に、各投与の前または投与と同時に行われる。特定の実施形態では、植物カンナビノイドの使用は、ワクチン組成物の投与後の一定期間まで再開されない。例えば、シクロホスファミドまたはワクチン組成物の投与前の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間、および投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間、カンナビノイドの投与を控えることが企図される。
一部の実施形態では、患者は、化学療法の完了後、６～１２週間以内に、ワクチンの第１の用量を受ける。がん治療に使用される高用量の化学療法薬は、増殖している細胞を除去し、免疫細胞のサブセットを枯渇させる。化学療法が完了すると、免疫系は再構成を開始する。Ｔ細胞が再生するまでの期間は、約２～３週間である。Ｔ細胞は活性化の標的となる免疫学的細胞サブセットであるため、一部の実施形態では、がんワクチンは、プライミングするのに十分なＴ細胞が存在する枠内で投与されるが、対象はリンパ球が減少したままである。ニッチを占める細胞が少ないこの環境では、プライミングされたＴ細胞が急速に分裂し、利用可能なサイトカイン（例えば、ＩＬ７およびＩＬ１５）の増加に応じて、「恒常性増殖」を起こす。したがって、この枠でワクチンを投与することによって、本明細書に記載のがんワクチンプラットフォームの実施形態の潜在的有効性が最大化され、抗原特異的Ｔ細胞のプライミングおよびワクチン関連Ｔ細胞応答の拡張が可能になる。
細胞株の選択方法およびワクチンの調製方法
細胞株の選択
所与のがんに対して、または患者が複数のがんに罹患している場合、細胞株または細胞株の組み合わせが、いくつかの基準に基づいてワクチン組成物に含まれるように特定される。一部の実施形態では、細胞株の選択は、以下に提供されるように段階的に行われる。すべてのがんの適応症が、すべての選択ステップおよび／または基準を必要とするわけではない。
細胞株の選択
所与のがんに対して、または患者が複数のがんに罹患している場合、細胞株または細胞株の組み合わせが、いくつかの基準に基づいてワクチン組成物に含まれるように特定される。一部の実施形態では、細胞株の選択は、以下に提供されるように段階的に行われる。すべてのがんの適応症が、すべての選択ステップおよび／または基準を必要とするわけではない。
ステップ１．各適応症に対する細胞株は、例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）データベースなどのＲＮＡ－ｓｅｑデータの可用性に基づいて選択される。ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、対象となるがんの適応症に特異的な抗原の最大の幅を示す可能性のある候補細胞株の特定を可能にし、細胞株による免疫抑制因子の潜在的な発現に関する情報を提供する。ＣＣＬＥでのＲＮＡ－ｓｅｑデータの利用可能性が限られている場合、ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、欧州分子生物学研究所－欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）データベースまたは当該技術分野で既知の他の情報源から入手することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づく目的のタンパク質（例えば、ＴＡＡ）の潜在的な発現は、ＲＮＡ－ｓｅｑ値が＞０である場合、「陽性」とみなされる。
ステップ２．すべての適応症について、転移部位に由来する細胞株は、抗原性の幅を多様化し、転移を有する患者の後期疾患をより効果的に標的とするために優先される。原発腫瘍に由来する細胞株は、ワクチン組成物の幅をさらに多様化するため、一部の実施形態に含まれる。細胞株が由来する転移の位置もまた、一部の実施形態において考慮される。例えば、一部の実施形態では、肝臓転移部位に由来する３つの細胞株すべてを選択する代わりに、リンパ節、腹水、および肝臓転移部位に由来する細胞株を選択することができる。
ステップ３．細胞株は、がんのタイプの幅広い分類をカバーするように選択されている。例えば、管状腺癌は、胃癌の一般的に診断される分類である。したがって、この分類に一致する多数の細胞株を選択することができる。原発腫瘍部位が変化する適応症の場合、この多様性を満たすように細胞株を選択することができる。例えば、頭頸部の小細胞癌（ＳＣＣＨＮ）の場合、一部の実施形態では、口腔、頬粘膜、および舌に由来する腫瘍をカバーするように細胞株が選択された。これらの選択基準により、患者の腫瘍タイプの不均一な集団を標的とすることができる。一部の実施形態では、細胞株は、多様な組織学的および民族的背景に由来する細胞株候補プールを生成するために、民族的に多様な集団を包含するように選択される。
ステップ４．一部の実施形態では、細胞株は、追加の因子に基づいて選択される。例えば、転移性大腸癌（ｍＣＲＣ）には、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）とマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）の両方として報告されている細胞株が含まれる場合がある。別の例として、ウイルス駆動型の適応症の場合、ウイルスゲノムをコードする細胞株は、安全性および／または製造の複雑さの懸念から除外される場合がある。
ステップ５．一部の実施形態では、細胞株は、ドライバー変異または適応症関連変異における様々な程度の遺伝的複雑性をカバーするように選択される。細胞株の変異の不均一性は、抗原レパートリーを拡大して、１つ以上の腫瘍タイプの患者内のより多くの集団を標的とすることができる。例として、乳癌細胞株は、Ｈｅｒ２、プロゲステロン受容体、およびエストロゲン受容体の欠失状態に応じて多様化することができ、最終的な単位用量には、トリプルネガティブ、二重陰性、単一陰性、および野生型の組み合わせが含まれる。各がんのタイプには複雑なゲノムランドスケープがあり、その結果、特定の適応症の類似する遺伝子変異について細胞株が選択される。例えば、黒色腫腫瘍は、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＲＡＳ、およびＴＰ５３の変化を最も頻繁に保有しているため、一部の実施形態では、選択された黒色腫細胞株は、これらの遺伝子の１つ以上に遺伝的変化を含む。
ステップ６．一部の実施形態では、細胞株は、ＴＡＡ、ＴＳＡ、および／またはＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づくがん／精巣抗原発現に基づいてさらに絞られる。特定の腫瘍（複数可）と関連する抗原または抗原のコレクションは、当業者に明らかな検索アプローチを使用して特定される（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／およびｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照されたい）。一部の実施形態では、抗原が、陽性の臨床転帰と関連する場合、または正常組織においてより低いレベルで発現されるが、特定の腫瘍または腫瘍タイプによって高度に発現されていると特定された場合、抗原を含めることができる。
ステップ７．ステップ１～６が完了した後、一部の実施形態では、残りの細胞株候補のリストは、細胞培養特性、ならびに倍加時間、付着性、サイズ、および血清要件などの考慮事項に基づいて統合される。例えば、倍加時間が８０時間未満の細胞株、または培地血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）が１０％未満の細胞株を選択することができる。一部の実施形態では、凝集体を形成しない付着性または浮遊性の細胞株を選択して、適切な細胞数および生存率を確保することができる。
ステップ８．一部の実施形態では、細胞株は、免疫抑制因子の発現に基づいて（例えば、ステップ１に記載されるＣＣＬＥまたはＥＭＢＬから供給されたＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づいて）選択される。
一部の実施形態では、患者の腫瘍の生検およびその後の生検された試料のＴＡＡ発現プロファイルは、細胞株の選択を支援するであろう。したがって、本開示の実施形態は、ワクチン組成物を調製する方法を提供し、対象の腫瘍のＴＡＡ発現プロファイルを決定するステップと、がん細胞株を選択するステップと、がん細胞株を改変するステップと、患者への投与後の増殖を防ぐために、投与前に細胞株を照射するステップと、を含む。
ワクチン組成物の調製
特定の実施形態では、製造における増殖後、改変された細胞株中のすべての細胞は、照射、懸濁、および凍結保存される。一部の実施形態では、細胞は、１０，０００ｃＧｙ照射される。一部の実施形態によれば、細胞は、７，０００～１５，０００ｃＧｙで照射される。一部の実施形態によれば、細胞は、７，０００～１５，０００ｃＧｙで照射される。
特定の実施形態では、製造における増殖後、改変された細胞株中のすべての細胞は、照射、懸濁、および凍結保存される。一部の実施形態では、細胞は、１０，０００ｃＧｙ照射される。一部の実施形態によれば、細胞は、７，０００～１５，０００ｃＧｙで照射される。一部の実施形態によれば、細胞は、７，０００～１５，０００ｃＧｙで照射される。
特定の実施形態では、各バイアルは、１２０±１０μＬ（１．２×１０7細胞）の容量を含む。一部の実施形態では、部位当たりの注射される総量は、３００μＬ以下である。一部の実施形態では、部位当たりの注射される総量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００μＬである。例えば、注入される総量が３００μＬである場合、本開示は、一部の実施形態では、３×１００μＬまたは２×１５０μＬの容量が、３００μＬの総量で注入されることを提供する。
一部の実施形態では、成分細胞株のバイアルは、注射の準備ができるまで液体窒素気相で保存される。一部の実施形態では、成分細胞株の各々は、別々のバイアルに包装される。
本明細書に記載されるように、投与前に、一部の実施形態では、２つのバイアルの内容物が、針および注射器によって取り出され、混合用の第３のバイアルに注入される。一部の実施形態では、この混合は、カクテルごとに繰り返される。他の実施形態では、６つのバイアルの内容物は、２つのグループ（ＡおよびＢ）に分けられる。３つのバイアルの内容物が、任意選択的に、新しいバイアル（Ａ）に、合わされるかまたは混合され、残りの３つのバイアルの内容物が、任意選択的に、新しいバイアル（Ｂ）に、合わされるかまたは混合される。
特定の実施形態では、細胞は、患者への投与後の増殖を防ぐために、凍結保存の前に照射されるであろう。一部の実施形態では、細胞を増殖不能にするために、細胞は、７，０００～１５，０００ｃＧｙで照射される。
一部の実施形態では、細胞株は、別々に、同じ増殖培地で増殖される。一部の実施形態では、細胞株は、別々に、異なる細胞増殖培地で増殖される。
全腫瘍細胞ワクチン成分の細胞株の異種不含変換
全腫瘍細胞ワクチンで治療された対象における抗体反応の分析は、生存率とウシα－Ｇａｌ抗原に対するＩｇＧ抗体応答の発生との間の負の相関関係を示唆している。（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２３（１２）：１５１５－１５２５（２０１６）を参照されたい）。これは、ほとんどの全腫瘍細胞ワクチンが、ウシα－Ｇａｌ抗原を含むウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地で増殖および凍結保存された腫瘍細胞株から構成されているため重要である。
全腫瘍細胞ワクチンで治療された対象における抗体反応の分析は、生存率とウシα－Ｇａｌ抗原に対するＩｇＧ抗体応答の発生との間の負の相関関係を示唆している。（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２３（１２）：１５１５－１５２５（２０１６）を参照されたい）。これは、ほとんどの全腫瘍細胞ワクチンが、ウシα－Ｇａｌ抗原を含むウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地で増殖および凍結保存された腫瘍細胞株から構成されているため重要である。
一部の実施形態では、ＦＢＳに存在する外来抗原に対する免疫応答を防ぐために、本明細書に開示される細胞株は、大規模なｃＧＭＰの製造の前に、ヒトのソースからの細胞増殖に必須な増殖因子およびサプリメントから構成された異種不含培地に適合される。本明細書で使用される場合、「適合させること」および「変換すること」または「変換」という用語は、互換的に使用され、当業者によって理解されるように、細胞を異なる培地に移す／交換することを指す。選択された異種不含培地の製剤は、一部の実施形態では、すべての細胞株にわたって同じであり得るか、または他の実施形態では、異なる細胞株で異なり得る。一部の実施形態では、培地組成物は、非ヒト材料を含まず、ＦＢＳ代わりとしてヒトソースのタンパク質のみを含み得るか、またはヒトソースのタンパク質とヒトソースの組換えサイトカインおよび増殖因子（例えば、ＥＧＦ）との組み合わせを含み得る。追加的に、異種不含培地組成物は、一部の実施形態では、腫瘍細胞株の増殖を増強する追加のサプリメント（例えば、アミノ酸、エネルギー源）を含んでもよい。異種不含培地組成は、細胞株の形態とＦＢＳにおける倍加時間の２倍以下の倍加時間とを維持する能力、およびＦＢＳにおける導入遺伝子の発現と同等の発現を維持する能力について選択される。
ウシ抗原に対するＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体を誘導する可能性を最小化するために、いくつかの手順を設けることができる。これらには以下が含まれるが、これらに限定されない：異種不含培地での増殖に適合させた細胞株、ＦＢＳ中で増殖させ、回収前に一定期間（例えば、少なくとも３日間）異種不含培地に置いた細胞株、ＦＢＳで増殖させ、回収および凍結保存の前に異種不含培地で洗浄した細胞株、ＦＢＳの代わりとしてＢｕｍｉｎａｔｅ（ＵＳＰグレードの医薬用ヒト血清アルブミン）を含む培地で凍結保存された細胞株、および／または異種不含および動物成分不含である培地組成（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ）中に凍結保存された細胞株。一部の実施形態では、これらの手順のうちの１つ以上を実施することで、ワクチン組成物からウシ抗原を除去することによって、抗ウシ抗体を誘導するリスクを低減することができる。
一実施形態によれば、本明細書に記載のワクチン組成物は、非ヒト材料を含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞株は、異種不含培地で製剤化される。異種不含培地を使用することで、免疫優勢の異種抗原、およびＢＳＥプリオンなどの人獣共通感染症の可能性のある生物の使用を回避することができる。例として、遺伝子改変後、細胞株は、異種不含培地に移行され、シードバンクを生成するために増殖される。シードバンクは凍結保存され、液体窒素極低温冷凍庫で、気相で保存される。
例示的な異種不含変換は、本明細書において、ＮＳＣＬＣおよびＧＢＭワクチン調製物について提供される。
インビトロアッセイ
本明細書に記載されるような同種全細胞がんワクチンが、抗腫瘍免疫応答を誘発し、ワクチン細胞株への改変がワクチン関連免疫応答を増強することを実証する能力は、インビトロアッセイでモデル化することができる。いかなる理論にも縛られることなく、ワクチン細胞株成分になされた遺伝子改変は、ワクチン微小環境における樹状細胞（ＤＣ）の機能の強化を通して、適応免疫応答を増強する。ＴＡＡ、免疫抑制因子、および／または免疫刺激因子の発現の潜在的な影響は、例えば、フローサイトメトリーベースのアッセイおよびＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、インビトロでモデル化することができる。
本明細書に記載されるような同種全細胞がんワクチンが、抗腫瘍免疫応答を誘発し、ワクチン細胞株への改変がワクチン関連免疫応答を増強することを実証する能力は、インビトロアッセイでモデル化することができる。いかなる理論にも縛られることなく、ワクチン細胞株成分になされた遺伝子改変は、ワクチン微小環境における樹状細胞（ＤＣ）の機能の強化を通して、適応免疫応答を増強する。ＴＡＡ、免疫抑制因子、および／または免疫刺激因子の発現の潜在的な影響は、例えば、フローサイトメトリーベースのアッセイおよびＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、インビトロでモデル化することができる。
一部の実施形態では、インビトロでのワクチン細胞株成分への改変の影響をモデル化するために、ＤＣは、健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された単球に由来し、下流のアッセイで使用されて、１つ以上の免疫刺激因子または免疫抑制因子の存在下もしくは不在下での免疫応答が特徴付けられる。ワクチン細胞株成分は、改変されていない親ワクチン細胞株成分（対照）または改変されたワクチン細胞株成分との共培養中に、ドナー由来の未熟ＤＣによって貪食される。改変ワクチン細胞株成分がＤＣ成熟化に対する効果、およびその後のＴ細胞のプライミングは、フローサイトメトリーを使用して評価し、ＤＣ成熟化のマーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲなどの変化を検出することができる。あるいは、未熟ＤＣが、ワクチン細胞株成分との共培養後に成熟し、成熟ＤＣを、ワクチン細胞株成分から磁気的に分離し、次いで、自己ＣＤ１４－ＰＢＭＣと６日間共培養して、インビボでの提示およびＴ細胞の刺激を模倣する。ＩＦＮγの産生（Ｔ細胞の刺激活性の測定値）は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定されるか、または免疫細胞のサブセットの増殖および特性評価は、フローサイトメトリーによって評価される。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでは、ＰＢＭＣを、未改変親ワクチン細胞株成分が負荷された自己ＤＣで刺激して、インビボでの未改変腫瘍細胞に対する潜在的な応答を評価する。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ワクチン細胞株によって発現される臨床的に関連するＴＡＡに対して免疫応答を促進する同種ワクチンの潜在能力を評価するために使用することができる。ＤＣとの共培養後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでＴＡＡ特異的応答を評価するために、ＰＢＭＣを、目的のＴＡＡの既知の多様なＭＨＣ－Ｉエピトープを含むペプチドプールで刺激する。様々な実施形態では、ワクチン組成物は、ＩＦＮγ応答について評価された少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１の非ウイルス抗原、または少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％の抗原に対してＩＦＮγ応答を誘導する３つの細胞株を含み得る。一部の実施形態では、ワクチン組成物は、ＩＦＮγ応答について評価された少なくとも５、６、７、８、９、１０、もしくは１１の非ウイルス抗原、または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％の抗原に対してＩＦＮγ応答を誘導する６つの細胞株の単位用量であり得る。
インビボマウスモデル
同種全細胞ワクチンによる抗原特異的Ｔ細胞の誘導は、マウス腫瘍負荷モデルを使用して、インビボでモデル化され得る。本明細書の実施形態に提供されるワクチンは、マウスとヒト間のＴＡＡの多様な異種相同性のために、マウス腫瘍モデルに直接投与されない場合がある。しかしながら、マウス腫瘍細胞株を使用して、ワクチンのマウスホモログを、生成することができる。以下は、マウスモデルにおける追加の免疫読み出しの例である：ワクチンまたはＴＡＡに特異的な体液性免疫応答の特性評価、その後の免疫接種による細胞性免疫応答のブースト、ＤＣ輸送および流入領域リンパ節でのＤＣのサブセットの特性評価、細胞性および体液性メモリー応答の評価、腫瘍量の減少、ならびにＴＭＥにおけるワクチン関連の免疫学的変化（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）対Ｔｒｅｇの比率）の決定。ＥＬＩＳＡ、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ、およびフローサイトメトリーなどの標準的な免疫学的方法が使用される。
同種全細胞ワクチンによる抗原特異的Ｔ細胞の誘導は、マウス腫瘍負荷モデルを使用して、インビボでモデル化され得る。本明細書の実施形態に提供されるワクチンは、マウスとヒト間のＴＡＡの多様な異種相同性のために、マウス腫瘍モデルに直接投与されない場合がある。しかしながら、マウス腫瘍細胞株を使用して、ワクチンのマウスホモログを、生成することができる。以下は、マウスモデルにおける追加の免疫読み出しの例である：ワクチンまたはＴＡＡに特異的な体液性免疫応答の特性評価、その後の免疫接種による細胞性免疫応答のブースト、ＤＣ輸送および流入領域リンパ節でのＤＣのサブセットの特性評価、細胞性および体液性メモリー応答の評価、腫瘍量の減少、ならびにＴＭＥにおけるワクチン関連の免疫学的変化（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）対Ｔｒｅｇの比率）の決定。ＥＬＩＳＡ、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ、およびフローサイトメトリーなどの標準的な免疫学的方法が使用される。
キット
本明細書に記載のワクチン組成物は、薬剤（例えば、がんを有する対象を治療し延命するための薬剤）の製造に使用することができる。当該がんは、例えば、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、前立腺癌、神経膠芽腫、大腸癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、膀胱癌または尿路癌、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肝臓肝細胞（ＨＣＣ）癌、腎臓癌または腎細胞癌（ＲＣＣ）癌、胃癌または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、食道癌、精巣癌、膵臓癌、中枢神経系癌、子宮内膜癌、黒色腫、および中皮癌である。
本明細書に記載のワクチン組成物は、薬剤（例えば、がんを有する対象を治療し延命するための薬剤）の製造に使用することができる。当該がんは、例えば、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、前立腺癌、神経膠芽腫、大腸癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌、膀胱癌または尿路癌、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肝臓肝細胞（ＨＣＣ）癌、腎臓癌または腎細胞癌（ＲＣＣ）癌、胃癌または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、食道癌、精巣癌、膵臓癌、中枢神経系癌、子宮内膜癌、黒色腫、および中皮癌である。
また、がんを有する対象を治療または延命するためのキットも提供され、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれか、それとともに、任意選択的に、注射器、針、および／または使用説明書が含まれる。製品もまた提供され、がんを有する対象を治療または延命するための、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかを含む少なくとも１つの容器またはバイアルと、使用説明書と、を含む。本明細書に記載のワクチン組成物のいずれも、キット（説明書とともに、投与のための容器、パック、またはディスペンサーを含む）に含めることができる。
一部の実施形態では、少なくとも２つのバイアルを含むキットが本明細書に提供され、各バイアルは、ワクチン組成物（例えば、カクテルＡおよびカクテルＢ）を含み、各バイアルが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の細胞株を含み、細胞株が、１つ以上の免疫抑制因子の産生を阻害するかもしくは減少させ、かつ／または１つ以上の免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、かつ／または腫瘍関連抗原もしくはネオ抗原の不均一性を発現するように改変されている。
例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＡ５４９。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ－１４５、およびＬＮＣＡＰ。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＨＣＴ－１５、ＨｕＴｕ８０、ＬＳ４１１Ｎ、ＨＣＴ－１１６、およびＲＫＯ。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＴＯＶ－２１Ｇ、およびＥＳ－２。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＫＯＮ、およびＯＳＣ－２０。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、およびＵＭ－ＵＣ－３。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、およびＦｕ９７。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄ。別の例として、６つの別個のバイアルを含むキットが提供され、各バイアルは、以下の細胞株のうちの１つを含む：ＤＭＳ５３、ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１。
一部の実施形態では、少なくとも２つのバイアルを含むキットが本明細書に提供され、各バイアルは、ワクチン組成物（例えば、カクテルＡおよびカクテルＢ）を含み、各バイアルが、少なくとも３つの細胞株を含み、細胞株が、１つ以上の免疫抑制因子の産生もしくは発現減少させ、かつ／または１つ以上の免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、かつ／または腫瘍関連抗原もしくはネオ抗原の不均一性を発現するように改変されている。これらの実施形態における２つのバイアルは、ともに単位用量である。各単位用量は、バイアル当たり約５×１０6～約５×１０7細胞、例えば、バイアル当たり約５×１０6～約３×１０7細胞を有し得る。
一部の実施形態では、少なくとも６つのバイアルを含むキットが本明細書に提供され、各バイアルは、ワクチン組成物を含み、各ワクチン組成物が、１つの細胞株を含み、細胞株が、１つ以上の免疫抑制因子の産生を阻害するかもしくは減少させ、かつ／または１つ以上の免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、かつ／または腫瘍関連抗原もしくはネオ抗原の不均一性を発現するように改変されている。本明細書に提供される実施形態における少なくとも６つのバイアルの各々は、ワクチン組成物の単位用量であり得る。各単位用量は、バイアル当たり約２×１０6～約５０×１０6細胞、例えば、バイアル当たり約２×１０6～約１０×１０6細胞を有し得る。
一部の実施形態では、別個のバイアルを含むキットが本明細書に提供され、各バイアルは、ワクチン組成物を含み、各ワクチン組成物が、１つの細胞株を含み、細胞株が、１つ以上の免疫抑制因子の産生を阻害するかもしくは減少させ、かつ／または１つ以上の免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、かつ／または腫瘍関連抗原もしくはネオ抗原の不均一性を発現するように改変されている。本明細書に提供される実施形態における各バイアルは、ワクチン組成物の単位用量であり得る。各単位用量は、バイアル当たり約２×１０6～約５０×１０6細胞、例えば、バイアル当たり約２×１０6～約１０×１０6細胞を有し得る。
例示的な一実施形態では、キットが提供され、以下のように、各々、３つの細胞株の２つのカクテルを含む（すなわち、２つの異なるワクチン組成物中に合計６つの細胞株）：細胞株当たり８×１０6細胞、注射当たり２．４×１０7細胞、および総用量４．８×１０7細胞。別の例示的な実施形態では、：細胞株当たり１×１０7細胞、注射当たり３．０×１０7細胞、および総用量６．０×１０7細胞が提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示されるキットのいずれかのバイアルは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｍＬの本開示のワクチン組成物を含む。一部の実施形態では、バイアル中の細胞の濃度は、約５×１０7細胞／ｍＬ～約５×１０8／細胞ｍＬである。
本明細書に記載のキットは、投与用の針、注射器、および他の付属品をさらに含むことができる。
実施例１：肺のヒト腺癌細胞株におけるＨＬＡ－Ｇの発現の減少は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との共培養においてＩＦＮγの分泌を増加させる
腫瘍細胞によるＨＬＡ－Ｇの異常な発現は、腫瘍の免疫回避、転移、および予後不良と関連している。ＤＣ上のＨＬＡ－Ｇとその受容体（ＩＬＴ２およびＩＬＴ４）とのライゲーションは、免疫寛容、および免疫抑制表現型を有するＴ細胞のプライミングを促進することができる。全細胞ワクチンの細胞株成分でのＨＬＡ－Ｇ発現の減少は、ＶＭＥにおける免疫原性を改善する可能性がある。
腫瘍細胞によるＨＬＡ－Ｇの異常な発現は、腫瘍の免疫回避、転移、および予後不良と関連している。ＤＣ上のＨＬＡ－Ｇとその受容体（ＩＬＴ２およびＩＬＴ４）とのライゲーションは、免疫寛容、および免疫抑制表現型を有するＴ細胞のプライミングを促進することができる。全細胞ワクチンの細胞株成分でのＨＬＡ－Ｇ発現の減少は、ＶＭＥにおける免疫原性を改善する可能性がある。
ヒト腺癌細胞株におけるＨＬＡ－Ｇ発現の減少
ヒト腺癌細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１を、ＨＬＡ－Ｇ（成熟アンチセンス配列：ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧ）（配列番号２３）のノックダウンに特異的なショートヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。親細胞または対照（非サイレンシング）ｓｈＲＮＡで形質導入された細胞が、対照として機能した。ｓｈＲＮＡを介したＨＬＡ－Ｇのノックダウン後、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルは、ＡＰＣ結合マウスモノクローナル抗体ヒトＨＬＡ－Ｇ（クローン８７Ｇ）で染色し、次いで、ＦＡＣで選別して、低ＨＬＡ－Ｇ集団を濃縮することによって、サイトメトリーによって測定した。改変細胞および未改変細胞を分離し、ＡＰＣ結合マウスモノクローナル抗体ヒトＨＬＡ－Ｇ（クローン８７Ｇ）で染色した。ｓｈＲＮＡを安定的に発現する細胞を濃縮するためにピューロマイシンで選択した後、細胞を、ＨＬＡ－Ｇの発現について、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで分析し、フローサイトメトリーによってタンパク質レベルで分析した。ｑＰＣＲの場合、細胞を、Ｔｒｉｚｏｌに溶解し、全ＲＮＡを単離し、次いで、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写した。ΔΔＣｔ法を使用して、ＨＬＡ－ＧおよびＰＳＭＢ４（正規化用）の特異的プローブを用いて、相対的なＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡの発現を定量化した。ＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡの発現は、ＨＬＡ－ＧのｓｈＲＮＡで安定的に形質導入された細胞では、親（非形質導入）細胞および対照（非サイレンシング）ｓｈＲＮＡで形質導入された細胞と比較して、少なくとも７５％減少した（図１Ａ）。ｓｈＲＮＡを介したＨＬＡ－Ｇのノックダウン後、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルを、フローサイトメトリーによって決定した。改変細胞および未改変細胞を分離し、ＡＰＣ結合マウスモノクローナル抗体ヒトＨＬＡ－Ｇ（クローン８７Ｇ）で染色した。蛍光（発現）強度は、デルタ平均蛍光強度（ΔＭＦＩ＝ＭＦＩ抗HLA-G－ＭＦＩ未染色）として計算した。ＨＬＡ－Ｇの細胞表面での発現は、ＨＬＡ－ＧのｓｈＲＮＡで安定的に形質導入された細胞では、親（非形質導入）細胞と比較して、７０％減少した（図１Ｂ）。
ヒト腺癌細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１を、ＨＬＡ－Ｇ（成熟アンチセンス配列：ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧ）（配列番号２３）のノックダウンに特異的なショートヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。親細胞または対照（非サイレンシング）ｓｈＲＮＡで形質導入された細胞が、対照として機能した。ｓｈＲＮＡを介したＨＬＡ－Ｇのノックダウン後、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルは、ＡＰＣ結合マウスモノクローナル抗体ヒトＨＬＡ－Ｇ（クローン８７Ｇ）で染色し、次いで、ＦＡＣで選別して、低ＨＬＡ－Ｇ集団を濃縮することによって、サイトメトリーによって測定した。改変細胞および未改変細胞を分離し、ＡＰＣ結合マウスモノクローナル抗体ヒトＨＬＡ－Ｇ（クローン８７Ｇ）で染色した。ｓｈＲＮＡを安定的に発現する細胞を濃縮するためにピューロマイシンで選択した後、細胞を、ＨＬＡ－Ｇの発現について、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで分析し、フローサイトメトリーによってタンパク質レベルで分析した。ｑＰＣＲの場合、細胞を、Ｔｒｉｚｏｌに溶解し、全ＲＮＡを単離し、次いで、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写した。ΔΔＣｔ法を使用して、ＨＬＡ－ＧおよびＰＳＭＢ４（正規化用）の特異的プローブを用いて、相対的なＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡの発現を定量化した。ＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡの発現は、ＨＬＡ－ＧのｓｈＲＮＡで安定的に形質導入された細胞では、親（非形質導入）細胞および対照（非サイレンシング）ｓｈＲＮＡで形質導入された細胞と比較して、少なくとも７５％減少した（図１Ａ）。ｓｈＲＮＡを介したＨＬＡ－Ｇのノックダウン後、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルを、フローサイトメトリーによって決定した。改変細胞および未改変細胞を分離し、ＡＰＣ結合マウスモノクローナル抗体ヒトＨＬＡ－Ｇ（クローン８７Ｇ）で染色した。蛍光（発現）強度は、デルタ平均蛍光強度（ΔＭＦＩ＝ＭＦＩ抗HLA-G－ＭＦＩ未染色）として計算した。ＨＬＡ－Ｇの細胞表面での発現は、ＨＬＡ－ＧのｓｈＲＮＡで安定的に形質導入された細胞では、親（非形質導入）細胞と比較して、７０％減少した（図１Ｂ）。
混合リンパ球腫瘍反応（ＭＬＲ）におけるＩＦＮγ分泌の増加
健常ドナーの血液からＰＢＭＣを単離し、腺癌肺癌細胞株と共培養し、１０対１のＰＢＭＣ対腫瘍細胞の比率で、腫瘍細胞の増殖および増殖を防ぐために、マイトマイシンＣ（０．４μｇ／ｍｌで１６時間）で前処理した。共培養の３日目（および７日目）に、インターロイキン－２（ＩＬ２）を、様々な濃度で添加した。７日目および／または１０日目に、細胞培養上清を回収し、ＩＦＮγ分泌を、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＢＭＣとＨＬＡ－Ｇの発現が低下した腫瘍細胞との共培養におけるＩＦＮγの増加は、１０日目の親細胞および非サイレンシング腫瘍細胞と比較して、有意であった（ｐ＜０．０１）（Ｓｉｄａｋの多重比較検定を伴う２元配置分散分析）（図２Ａ）。加えて、ＩＦＮγ分泌の有意な増加は、共培養中のＩＬ－２濃度とは無関係であった（ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を伴う２元配置分散分析）（図２Ｂ）。
健常ドナーの血液からＰＢＭＣを単離し、腺癌肺癌細胞株と共培養し、１０対１のＰＢＭＣ対腫瘍細胞の比率で、腫瘍細胞の増殖および増殖を防ぐために、マイトマイシンＣ（０．４μｇ／ｍｌで１６時間）で前処理した。共培養の３日目（および７日目）に、インターロイキン－２（ＩＬ２）を、様々な濃度で添加した。７日目および／または１０日目に、細胞培養上清を回収し、ＩＦＮγ分泌を、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＢＭＣとＨＬＡ－Ｇの発現が低下した腫瘍細胞との共培養におけるＩＦＮγの増加は、１０日目の親細胞および非サイレンシング腫瘍細胞と比較して、有意であった（ｐ＜０．０１）（Ｓｉｄａｋの多重比較検定を伴う２元配置分散分析）（図２Ａ）。加えて、ＩＦＮγ分泌の有意な増加は、共培養中のＩＬ－２濃度とは無関係であった（ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を伴う２元配置分散分析）（図２Ｂ）。
例２：ＣＤ４７発現の減少は、抗原提示細胞による腫瘍細胞株の貪食を増加させ、免疫原性を増強する
ＣＤ４７は「自己」の細胞表面マーカーであり、それによって、健常細胞に対する免疫応答を防止する。原発腫瘍細胞および腫瘍細胞株は、高レベルのＣＤ４７を発現している可能性がある。
ＣＤ４７は「自己」の細胞表面マーカーであり、それによって、健常細胞に対する免疫応答を防止する。原発腫瘍細胞および腫瘍細胞株は、高レベルのＣＤ４７を発現している可能性がある。
ヒト腺癌細胞株におけるＣＤ４７発現の減少
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ４６０、およびＮＣＩ－Ｈ５２０を、以下のゲノムＤＮＡ配列：ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＴＡＣａｃｔｔｇｔＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＡＴＴＡ（配列番号２７）を標的とするＣＤ４７に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対でエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウト細胞は、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体（クローンＣＣ２Ｃ６）で染色した後、フローサイトメトリーで特定し、次いで、ＦＡＣＳで選別して、ＣＤ４７陰性集団を濃縮した。ＺＦＮによるＣＤ４７の遺伝子編集は、Ａ５４９（図３Ａ）、ＮＣＩ－Ｈ４６０（図３Ｂ）、およびＮＣＩ－Ｈ５２０（図３Ｃ）細胞株によるＣＤ４７の発現の９９％超の減少をもたらした。
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ４６０、およびＮＣＩ－Ｈ５２０を、以下のゲノムＤＮＡ配列：ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＴＡＣａｃｔｔｇｔＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＡＴＴＡ（配列番号２７）を標的とするＣＤ４７に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対でエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウト細胞は、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体（クローンＣＣ２Ｃ６）で染色した後、フローサイトメトリーで特定し、次いで、ＦＡＣＳで選別して、ＣＤ４７陰性集団を濃縮した。ＺＦＮによるＣＤ４７の遺伝子編集は、Ａ５４９（図３Ａ）、ＮＣＩ－Ｈ４６０（図３Ｂ）、およびＮＣＩ－Ｈ５２０（図３Ｃ）細胞株によるＣＤ４７の発現の９９％超の減少をもたらした。
ＣＤ４７の減少は、抗原提示細胞による腫瘍細胞株の貪食を増加させ、免疫原性を増強する
貪食および免疫原性に対するＣＤ４７発現の減少（ＣＤ４７ＫＯ）の効果は、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株を使用して決定した。具体的には、ＤＣおよびマクロファージの両方のヒト単球由来専門抗原提示細胞（ＡＰＣ）による貪食に対するＣＤ４７ＫＯの効果を、貪食アッセイを使用して決定した。ＮＣＩ－Ｈ５２０未改変親およびＣＤ４７ＫＯによって誘導される免疫応答を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した。
貪食および免疫原性に対するＣＤ４７発現の減少（ＣＤ４７ＫＯ）の効果は、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株を使用して決定した。具体的には、ＤＣおよびマクロファージの両方のヒト単球由来専門抗原提示細胞（ＡＰＣ）による貪食に対するＣＤ４７ＫＯの効果を、貪食アッセイを使用して決定した。ＮＣＩ－Ｈ５２０未改変親およびＣＤ４７ＫＯによって誘導される免疫応答を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した。
ヒト樹状細胞およびマクロファージの生成
ヒト未熟樹状細胞（ｉＤＣ）およびＭ１マクロファージ（ＭＤＭ）は、健常ドナーのロイコパック（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃７０５００）から、製造元の説明書に従って、磁気分離によって分離されたＣＤ１４+細胞に由来した。ｉＤＣは、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ樹状細胞分化サプリメント（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃１０９８８）の存在下、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ樹状細胞培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃１０９８６）で、製造元の説明書に従って、ＣＤ１４+細胞を培養することによって生成した。ｉＤＣは、貪食アッセイで使用する場合、３日目に回収し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで使用する場合、６日目に回収した。ＭＤＭは、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，＃３００－０３－１００ＵＧ）の存在下、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩで、ＣＤ１４+細胞を７日間培養することによって生成した。マクロファージをＭ１表現型に偏向するために、７日目に、ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ培地を、２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，＃ｔｌｒｌ－３ｐｅｌｐｓ）および２０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，３００－０２－１００ＵＧ）を含むマクロファージ－ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ，＃１２０６５０７４）に交換した。ＭＤＭは、貪食アッセイ用に９日目に回収した。
ヒト未熟樹状細胞（ｉＤＣ）およびＭ１マクロファージ（ＭＤＭ）は、健常ドナーのロイコパック（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃７０５００）から、製造元の説明書に従って、磁気分離によって分離されたＣＤ１４+細胞に由来した。ｉＤＣは、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ樹状細胞分化サプリメント（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃１０９８８）の存在下、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ樹状細胞培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃１０９８６）で、製造元の説明書に従って、ＣＤ１４+細胞を培養することによって生成した。ｉＤＣは、貪食アッセイで使用する場合、３日目に回収し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで使用する場合、６日目に回収した。ＭＤＭは、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，＃３００－０３－１００ＵＧ）の存在下、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩで、ＣＤ１４+細胞を７日間培養することによって生成した。マクロファージをＭ１表現型に偏向するために、７日目に、ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ培地を、２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，＃ｔｌｒｌ－３ｐｅｌｐｓ）および２０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，３００－０２－１００ＵＧ）を含むマクロファージ－ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ，＃１２０６５０７４）に交換した。ＭＤＭは、貪食アッセイ用に９日目に回収した。
貪食アッセイ
未改変親細胞およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞を、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で２時間処理し、一晩静置した後、１μＭのＣＳＦＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｃ３４５５４）で、３７℃で３０分間標識した。ｉＤＣおよびＭＤＭを、ＣＳＦＥで標識された未改変親細胞およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞と、３７℃で４時間共培養した。ｉＤＣおよび細胞株は、１：１のエフェクター対標的比で、９６ウェル低接着性Ｕ底プレートで共培養した。ＭＤＭは、１：４のエフェクター対標的比で、９６ウェルプレートで共培養した。４時間のインキュベーション後、共培養物を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ａｑｕａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃Ｌ２３１０５）、αＣＤ４５－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＨＩ３０）、およびｉＤＣの場合はαＣＤ１１ｃ－ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＢ－ｌｙ６）で、またはＭＤＭの場合はαＣＤ１１ｂ－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＩＣＲＦ４４）で表面染色した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用して分析した。ＭＤＭの貪食は、フローサイトメトリーによって、生存ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+細胞（ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ）陽性でもあった）の割合（％）として定義した。ｉＤＣの貪食は、フローサイトメトリーによって、生存ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｃ+細胞（ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ+）陽性でもあった）の割合（％）として定義した。未改変親細胞またはＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞と共培養されなかったＭＤＭおよびｉＤＣが、対照として機能した。
未改変親細胞およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞を、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で２時間処理し、一晩静置した後、１μＭのＣＳＦＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｃ３４５５４）で、３７℃で３０分間標識した。ｉＤＣおよびＭＤＭを、ＣＳＦＥで標識された未改変親細胞およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞と、３７℃で４時間共培養した。ｉＤＣおよび細胞株は、１：１のエフェクター対標的比で、９６ウェル低接着性Ｕ底プレートで共培養した。ＭＤＭは、１：４のエフェクター対標的比で、９６ウェルプレートで共培養した。４時間のインキュベーション後、共培養物を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ａｑｕａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃Ｌ２３１０５）、αＣＤ４５－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＨＩ３０）、およびｉＤＣの場合はαＣＤ１１ｃ－ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＢ－ｌｙ６）で、またはＭＤＭの場合はαＣＤ１１ｂ－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＩＣＲＦ４４）で表面染色した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用して分析した。ＭＤＭの貪食は、フローサイトメトリーによって、生存ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+細胞（ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ）陽性でもあった）の割合（％）として定義した。ｉＤＣの貪食は、フローサイトメトリーによって、生存ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｃ+細胞（ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ+）陽性でもあった）の割合（％）として定義した。未改変親細胞またはＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞と共培養されなかったＭＤＭおよびｉＤＣが、対照として機能した。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
未改変親細胞およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞は、ｉＤＣをロードする２４時間前に、１００Ｇｙ（Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ １８００Ｑ）でＸ線照射した。ｉＤＣをロードするために、照射した未改変親およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）を、ｉＤＣと１：１の比率で、２５μｇ／ｍＬのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃３７４８０７）および１μｇ／ｍＬの可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，＃ＡＦ３１００２１００ＵＧ）の存在下、２４時間共培養した。次いで、腫瘍細胞をロードしたｉＤＣを、１００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮγ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，３００－０２－１００ＵＧ）、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，＃ｔｌｒｌ－３ｐｅｌｐｓ）、および２．５μｇ／ｍＬのレシキモド（Ｒ８４８）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，＃ｔｌｒｌ－３ｒ８４８）を添加することによって、一晩成熟させた。成熟ＤＣ（ｍＤＣ）は、αＣＤ４５－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＨＩ３０）で標識し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓｅ ヒトＰＥ陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃１７６５４）を使用して、製造元の説明書に従って、共培養物から磁気的に分離した。次いで、単離されたｍＤＣを、自家ＣＤ１４-ＰＢＭＣと、１：１０のＤＣ対ＰＢＭＣ比で、６日間共培養した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（ＭａｂＴｅｃｈ，３４２０－４ＡＰＴ－１０）の場合、ＣＤ１４-ＰＢＭＣを、ｍＤＣとの共培養物から単離し、未改変親ＮＣＩ－Ｈ５２０をロードしたｍＤＣで、２４時間刺激した。ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）を、製造元の説明書に従って検出し、カウントし（Ｓ６ Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）、対照の数を上回るＳＦＵの数／１０6ＰＢＭＣとして表した。
未改変親細胞およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞は、ｉＤＣをロードする２４時間前に、１００Ｇｙ（Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ １８００Ｑ）でＸ線照射した。ｉＤＣをロードするために、照射した未改変親およびＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）を、ｉＤＣと１：１の比率で、２５μｇ／ｍＬのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃３７４８０７）および１μｇ／ｍＬの可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，＃ＡＦ３１００２１００ＵＧ）の存在下、２４時間共培養した。次いで、腫瘍細胞をロードしたｉＤＣを、１００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮγ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，３００－０２－１００ＵＧ）、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，＃ｔｌｒｌ－３ｐｅｌｐｓ）、および２．５μｇ／ｍＬのレシキモド（Ｒ８４８）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，＃ｔｌｒｌ－３ｒ８４８）を添加することによって、一晩成熟させた。成熟ＤＣ（ｍＤＣ）は、αＣＤ４５－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＨＩ３０）で標識し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓｅ ヒトＰＥ陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃１７６５４）を使用して、製造元の説明書に従って、共培養物から磁気的に分離した。次いで、単離されたｍＤＣを、自家ＣＤ１４-ＰＢＭＣと、１：１０のＤＣ対ＰＢＭＣ比で、６日間共培養した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（ＭａｂＴｅｃｈ，３４２０－４ＡＰＴ－１０）の場合、ＣＤ１４-ＰＢＭＣを、ｍＤＣとの共培養物から単離し、未改変親ＮＣＩ－Ｈ５２０をロードしたｍＤＣで、２４時間刺激した。ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）を、製造元の説明書に従って検出し、カウントし（Ｓ６ Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）、対照の数を上回るＳＦＵの数／１０6ＰＢＭＣとして表した。
単球由来樹状細胞およびマクロファージによるＮＣＩ－Ｈ５２０ ＣＤ４７ＫＯ細胞株の貪食の増加
ＣＤ４７の減少は、２人の健常ドナーに由来するＭＤＭによる貪食を、未改変親細胞株の貪食（７．０±１．２％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｂ+／ＣＦＳＥ+）と比較して、平均１．６倍（１１．１±１．９％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｂ+／ＣＦＳＥ+）増加させた。ＣＤ４７の減少はまた、２人の健常ドナーに由来するｉＤＣによる貪食も、未改変親細胞株の貪食（５．５±３．４％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｃ+／ＣＦＳＥ+）と比較して、平均２．２倍（１１．９±２．３％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｃ+／ＣＦＳＥ+）増加させた（図４Ａ）。
ＣＤ４７の減少は、２人の健常ドナーに由来するＭＤＭによる貪食を、未改変親細胞株の貪食（７．０±１．２％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｂ+／ＣＦＳＥ+）と比較して、平均１．６倍（１１．１±１．９％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｂ+／ＣＦＳＥ+）増加させた。ＣＤ４７の減少はまた、２人の健常ドナーに由来するｉＤＣによる貪食も、未改変親細胞株の貪食（５．５±３．４％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｃ+／ＣＦＳＥ+）と比較して、平均２．２倍（１１．９±２．３％ 生存／ＣＤ４５+／ＣＤ１１ｃ+／ＣＦＳＥ+）増加させた（図４Ａ）。
ＣＤ４７の減少は、ヒト扁平上皮腫瘍細胞株の免疫原性を改善する
ＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮγ応答は、自己ＰＢＭＣを、ＣＤ４７ＫＯ細胞をロードしたＤＣ（９，９８０±９０３ＳＦＵ）と共培養した場合、未改変親ＣＤ４７陽性細胞（５，２５３±１０９ＳＦＵ）をロードしたＤＣと比較して、１．９倍高かった（ｐ＝０．００７、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（ｎ＝３）（図４Ｂ）。
ＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮγ応答は、自己ＰＢＭＣを、ＣＤ４７ＫＯ細胞をロードしたＤＣ（９，９８０±９０３ＳＦＵ）と共培養した場合、未改変親ＣＤ４７陽性細胞（５，２５３±１０９ＳＦＵ）をロードしたＤＣと比較して、１．９倍高かった（ｐ＝０．００７、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（ｎ＝３）（図４Ｂ）。
例３：プログラム細胞死リガンド１発現の減少
ＤＣ上のＰＤ１が腫瘍細胞上のＰＤＬ１（ＣＤ２７４）に結合すると、ＤＣの機能が抑制され得、炎症性（Ｔｈ1）Ｔ細胞のプライミングが減少し、免疫抑制性（Ｔｈ2）Ｔ細胞のプライミングが促進される可能性がある。
ＤＣ上のＰＤ１が腫瘍細胞上のＰＤＬ１（ＣＤ２７４）に結合すると、ＤＣの機能が抑制され得、炎症性（Ｔｈ1）Ｔ細胞のプライミングが減少し、免疫抑制性（Ｔｈ2）Ｔ細胞のプライミングが促進される可能性がある。
ジンクフィンガーを介した遺伝子編集を使用して、ＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０によるＰＤＬ１の発現が減少した。細胞株を、以下のゲノムＤＮＡ配列：ＣＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧａａｃｔｇａＣＡＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴ（配列番号２８）を標的とするＰＤ－Ｌ１に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対をコードするＤＮＡプラスミドでエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウト細胞は、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ２７４モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ１）で染色した後、フローサイトメトリーで特定し、次いで、ＦＡＣＳで選別した。ＺＦＮによるＰＤ－Ｌ１の遺伝子編集により、選別後、９９％を超えるＰＤ－Ｌ１陰性ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞が得られたた（図５）。
実施例４：骨髄間質細胞抗原２（ｂｓｔ２）の発現の減少
ＢＳＴ２は、原発腫瘍細胞および腫瘍細胞株の細胞表面マーカーであり、形質細胞様樹状細胞上のＩＬＴ７（ＣＤ８５ｇ）との相互作用を通して、サイトカイン（Ｉ型インターフェロン）産生を阻害する。
ＢＳＴ２は、原発腫瘍細胞および腫瘍細胞株の細胞表面マーカーであり、形質細胞様樹状細胞上のＩＬＴ７（ＣＤ８５ｇ）との相互作用を通して、サイトカイン（Ｉ型インターフェロン）産生を阻害する。
ＮＣＩ－Ｈ２００９細胞株によるＢＳＴ２の発現の減少は、ＺＦＮ媒介性遺伝子編集を使用して完了した。細胞株を、以下のゲノムＤＮＡ配列：ＣＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＡＴｇｃａｇａｇＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＧ（配列番号３４）を標的とするＢＳＴ２に特異的なＺＦＮ対をコードするＤＮＡプラスミドでエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウト細胞は、ＢＶ４２１結合抗ヒトＢＳＴ２モノクローナル抗体（クローンＨＭ１．２４）で染色した後、フローサイトメトリーによって特定した。ＺＦＮによるＢＳＴ２の遺伝子編集は、ＮＣＩ－Ｈ２００９細胞によるＢＳＴ２の発現の９８．５％の減少をもたらした（図６）。その後、ＢＳＴ２－ＺＦＮで処理したＮＣＩ－Ｈ２００９細胞のＢＳＴ２陽性画分を、ＦＡＣＳで選別して精製した。
実施例５：肺癌細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、免疫監視を回避するために腫瘍細胞が分泌する高度に免疫抑制性の分子である。この実施例は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌が減少した、またはそれらを分泌しない肺癌細胞株を生成するための手順と、分泌の変化を検証する方法とについて説明する。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、免疫監視を回避するために腫瘍細胞が分泌する高度に免疫抑制性の分子である。この実施例は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌が減少した、またはそれらを分泌しない肺癌細胞株を生成するための手順と、分泌の変化を検証する方法とについて説明する。
細胞株、培養、および選択
肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）、ＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）、ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）、ＮＣＩ－Ｈ２０２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５９１２）、ＮＣＩ－Ｈ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８００）、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８８９）は、ＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。ＬＫ－２（ＪＣＲＢ０８２９）は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＪＣＲＢ）から入手し、ＪＣＲＢの推奨に従って培養した。レンチウイルス形質導入後の哺乳動物細胞株の選択には、２～８μｇ／ｍＬの範囲の濃度のピューロマイシンおよびブラストサイジンを選択および維持に使用した。
肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）、ＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）、ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）、ＮＣＩ－Ｈ２０２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５９１２）、ＮＣＩ－Ｈ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８００）、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８８９）は、ＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。ＬＫ－２（ＪＣＲＢ０８２９）は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＪＣＲＢ）から入手し、ＪＣＲＢの推奨に従って培養した。レンチウイルス形質導入後の哺乳動物細胞株の選択には、２～８μｇ／ｍＬの範囲の濃度のピューロマイシンおよびブラストサイジンを選択および維持に使用した。
ｓｈＲＮＡを介したＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ５２０、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３を、ＴＧＦβ１（ｓｈＴＧＦβ１、成熟アンチセンス配列：ＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＣＧＣＧＧＧ（配列番号２５））およびＴＧＦβ２（ｓｈＴＧＦβ２、成熟アンチセンス配列：ＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣＧ（配列番号２４））のノックダウンに特異的なショートヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。対照ｓｈＲＮＡ（ＮＳ）または未改変親細胞株で形質導入された細胞が、対照として機能した。ｓｈＲＮＡを安定的に発現する細胞を濃縮するための抗生物質選後、細胞をＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌について分析した。
細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ５２０、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３を、ＴＧＦβ１（ｓｈＴＧＦβ１、成熟アンチセンス配列：ＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＣＧＣＧＧＧ（配列番号２５））およびＴＧＦβ２（ｓｈＴＧＦβ２、成熟アンチセンス配列：ＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣＧ（配列番号２４））のノックダウンに特異的なショートヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。対照ｓｈＲＮＡ（ＮＳ）または未改変親細胞株で形質導入された細胞が、対照として機能した。ｓｈＲＮＡを安定的に発現する細胞を濃縮するための抗生物質選後、細胞をＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌について分析した。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックアウト
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびＺＦＮアプローチを使用して完了した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウトの場合、ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株を、Ｃａｓ９および以下のｇＤＮＡ配列：ＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧ（配列番号２９）を標的とするＴＧＦβ２に特異的なガイドＲＮＡまたは配列：ＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡ（配列番号３０）を標的とするコントロールガイドＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡでエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウトクローンを、ＥＬＩＳＡによってＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌についてスクリーニングした。ＺＦＮを介したノックアウトの場合、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を、以下のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列：ＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧａｇｃｃａＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧ（配列番号３１）を標的とするＴＧＦβ１に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対および以下のｇＤＮＡ配列：ＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＡａｇａｃｔａＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＣ（配列番号３２）を標的とするＴＧＦβ２に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対をコードするＲＮＡでエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウトクローンを、増殖した単一細胞のゲノムＤＮＡ配列決定によってスクリーニングし、次いで、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌について分析した。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびＺＦＮアプローチを使用して完了した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウトの場合、ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株を、Ｃａｓ９および以下のｇＤＮＡ配列：ＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧ（配列番号２９）を標的とするＴＧＦβ２に特異的なガイドＲＮＡまたは配列：ＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡ（配列番号３０）を標的とするコントロールガイドＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡでエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウトクローンを、ＥＬＩＳＡによってＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌についてスクリーニングした。ＺＦＮを介したノックアウトの場合、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を、以下のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列：ＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧａｇｃｃａＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧ（配列番号３１）を標的とするＴＧＦβ１に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対および以下のｇＤＮＡ配列：ＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＡａｇａｃｔａＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＣ（配列番号３２）を標的とするＴＧＦβ２に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対をコードするＲＮＡでエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウトクローンを、増殖した単一細胞のゲノムＤＮＡ配列決定によってスクリーニングし、次いで、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌について分析した。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌アッセイ
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウンまたはノックアウト細胞、および未改変または対照改変親細胞を、通常の増殖培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）中、２４ウェルプレートに、８．３３×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングして２４時間後、付着細胞を、完全に洗浄して、ＦＢＳを除去し、ＲＰＭＩ＋５％ ＣＴＳで培養を続けた。培地交換して４８時間後、細胞培養上清を回収し、製造元の説明書に従って、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌アッセイ（ＤＢ１００ＢおよびＤＢ２５０，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を開始するまで、－７０℃で保存した。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルは、ｐｇ／１０6細胞／２４時間として表される。ヒトＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の定量化下限は、それぞれ１５．４ｐｇ／ｍＬ（９２．４ｐｇ／１０6細胞／２４時間）および７．０ｐｇ／ｍＬ（４２．０ｐｇ／１０6細胞／２４時間）である。改変細胞株がアッセイの定量化下限を下回るレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌した場合、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を使用して、未改変親細胞株ｓｈＲＮＡと比較して、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の減少率を概算した。ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌が定量化下限を下回った場合、定量化下限を使用して、アッセイが完了したｎでの統計的有意性を決定した。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウンまたはノックアウト細胞、および未改変または対照改変親細胞を、通常の増殖培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）中、２４ウェルプレートに、８．３３×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングして２４時間後、付着細胞を、完全に洗浄して、ＦＢＳを除去し、ＲＰＭＩ＋５％ ＣＴＳで培養を続けた。培地交換して４８時間後、細胞培養上清を回収し、製造元の説明書に従って、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌アッセイ（ＤＢ１００ＢおよびＤＢ２５０，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を開始するまで、－７０℃で保存した。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルは、ｐｇ／１０6細胞／２４時間として表される。ヒトＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の定量化下限は、それぞれ１５．４ｐｇ／ｍＬ（９２．４ｐｇ／１０6細胞／２４時間）および７．０ｐｇ／ｍＬ（４２．０ｐｇ／１０6細胞／２４時間）である。改変細胞株がアッセイの定量化下限を下回るレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌した場合、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を使用して、未改変親細胞株ｓｈＲＮＡと比較して、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の減少率を概算した。ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌が定量化下限を下回った場合、定量化下限を使用して、アッセイが完了したｎでの統計的有意性を決定した。
ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌の減少
ＮＣＩ－Ｈ４６０におけるＴＧＦβ１のノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が６２％減少した。同様に、ＮＣＩ－Ｈ４６０におけるＴＧＦβ２のノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が８４％減少した。ＮＣＩ－Ｈ４６０におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が５７％減少し、ＴＧＦβ２の分泌が＞９８％減少した（表２６）（図７Ａ）。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞におけるＴＧＦβ２特異的ガイドＲＮＡを使用したＣａｓ９を介したノックアウトに由来するクローンは、そのクローンが、対照ガイドＲＮＡで処理したＮＣＩ－Ｈ４６０由来のクローンと比較して（３６８６±１４７８ｐｇ／１０6細胞／２４時間）、検出下限を上回るＴＧＦβ２を分泌しなかったこと（＞９９％の減少）を示した（図７Ｂ）。ＴＧＦβ１特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０に由来するクローンは、ＴＧＦβ２特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０由来のクローンと比較して、アッセイの検出下限を上回るＴＧＦβ１を分泌しなかった。ＴＧＦβ２特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０に由来するクローンは、ＴＧＦβ１特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０由来のクローンとは対照的に、検出下限を上回るＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＴＧＦβ１特異的ＺＦＮ対およびＴＧＦβ２特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０に由来するクローンは、検出下限を上回るＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった（図７Ｃ）。
ＮＣＩ－Ｈ４６０におけるＴＧＦβ１のノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が６２％減少した。同様に、ＮＣＩ－Ｈ４６０におけるＴＧＦβ２のノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が８４％減少した。ＮＣＩ－Ｈ４６０におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が５７％減少し、ＴＧＦβ２の分泌が＞９８％減少した（表２６）（図７Ａ）。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞におけるＴＧＦβ２特異的ガイドＲＮＡを使用したＣａｓ９を介したノックアウトに由来するクローンは、そのクローンが、対照ガイドＲＮＡで処理したＮＣＩ－Ｈ４６０由来のクローンと比較して（３６８６±１４７８ｐｇ／１０6細胞／２４時間）、検出下限を上回るＴＧＦβ２を分泌しなかったこと（＞９９％の減少）を示した（図７Ｂ）。ＴＧＦβ１特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０に由来するクローンは、ＴＧＦβ２特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０由来のクローンと比較して、アッセイの検出下限を上回るＴＧＦβ１を分泌しなかった。ＴＧＦβ２特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０に由来するクローンは、ＴＧＦβ１特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０由来のクローンとは対照的に、検出下限を上回るＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＴＧＦβ１特異的ＺＦＮ対およびＴＧＦβ２特異的ＺＦＮ対で処理されたＮＣＩ－Ｈ４６０に由来するクローンは、検出下限を上回るＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった（図７Ｃ）。
ＤＭＳ５３細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
ＤＭＳ５３におけるｓｈＲＮＡを介したＴＧＦβ１のノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が６６％減少した。同様に、ＤＭＳ５３におけるｓｈＲＮＡを介したＴＧＦβ２のノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が５３％減少した。ＤＭＳ５３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が７４％減少し、ＴＧＦβ２の分泌が３２％減少した（表２６）（図８Ａ）。
ＤＭＳ５３におけるｓｈＲＮＡを介したＴＧＦβ１のノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が６６％減少した。同様に、ＤＭＳ５３におけるｓｈＲＮＡを介したＴＧＦβ２のノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が５３％減少した。ＤＭＳ５３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が７４％減少し、ＴＧＦβ２の分泌が３２％減少した（表２６）（図８Ａ）。
ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
ＮＣＩ－Ｈ５２０におけるＴＧＦβ１のノックダウンは、親細胞株による検出可能なＴＧＦβ１の分泌の欠如のため、評価することができなかった。ＮＣＩ－Ｈ５２０におけるＴＧＦβ２のノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が９９％超減少した。ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が９９％超減少した（表２６）（図８Ｂ）。
ＮＣＩ－Ｈ５２０におけるＴＧＦβ１のノックダウンは、親細胞株による検出可能なＴＧＦβ１の分泌の欠如のため、評価することができなかった。ＮＣＩ－Ｈ５２０におけるＴＧＦβ２のノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が９９％超減少した。ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ２の分泌が９９％超減少した（表２６）（図８Ｂ）。
ＮＣＩ－Ｈ２０２３細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
ＮＣＩ－Ｈ２０２３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が定量化下限を下回り（ｎ＝８）、未改変親細胞株と比較して（９３３±１２５ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝８）、ＴＧＦβ１の分泌が推定９０％超減少した。ＴＧＦβ１の分泌は、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（ｐ＜０．０００２）。ＮＣＩ－Ｈ２０２３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（３４１±３２ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝８）、ＴＧＦβ２の分泌が６５％（１１８±４２ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝８）減少した。ＴＧＦβ２（ｐ＝０．００１０）の分泌は、未改変親細胞株（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）と比較して、有意に減少した（表２５）（図９Ａ）。
ＮＣＩ－Ｈ２０２３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、ＴＧＦβ１の分泌が定量化下限を下回り（ｎ＝８）、未改変親細胞株と比較して（９３３±１２５ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝８）、ＴＧＦβ１の分泌が推定９０％超減少した。ＴＧＦβ１の分泌は、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（ｐ＜０．０００２）。ＮＣＩ－Ｈ２０２３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（３４１±３２ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝８）、ＴＧＦβ２の分泌が６５％（１１８±４２ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝８）減少した。ＴＧＦβ２（ｐ＝０．００１０）の分泌は、未改変親細胞株（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）と比較して、有意に減少した（表２５）（図９Ａ）。
ＮＣＩ－Ｈ２３細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
ＮＣＩ－Ｈ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８００）におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（１，５７５±１２５ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝８）、ＴＧＦβ１の分泌が５９％減少した（６４４±１０２ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝８）。ＮＣＩ－Ｈ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８００）におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（５０６±４２ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝９）、ＴＧＦβ２の分泌が９０％減少した（４８±９ｐｇ／１０6細胞／２４時間（ｎ＝９）。ＴＧＦβ１（ｐ＝０．００１１）およびＴＧＦβ２（ｐ＜０．０００１）の分泌は、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（表２５）（図９Ｂ）。
ＮＣＩ－Ｈ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８００）におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（１，５７５±１２５ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝８）、ＴＧＦβ１の分泌が５９％減少した（６４４±１０２ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝８）。ＮＣＩ－Ｈ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８００）におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（５０６±４２ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝９）、ＴＧＦβ２の分泌が９０％減少した（４８±９ｐｇ／１０6細胞／２４時間（ｎ＝９）。ＴＧＦβ１（ｐ＝０．００１１）およびＴＧＦβ２（ｐ＜０．０００１）の分泌は、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（表２５）（図９Ｂ）。
Ａ５４９細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
Ａ５４９におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（５，７９６±３３９ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）、ＴＧＦβ１の分泌が８４％減少した（９１４±５４ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）。Ａ５４９におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（７７２±４９ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）、ＴＧＦβ２の分泌が９５％減少した（４２±７ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）。ＴＧＦβ１（ｐ＝０．０１２８）とＴＧＦβ２（ｐ＝０．００４２）の両方の分泌が、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（表２５）（図９Ｃ）。
Ａ５４９におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（５，７９６±３３９ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）、ＴＧＦβ１の分泌が８４％減少した（９１４±５４ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）。Ａ５４９におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（７７２±４９ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）、ＴＧＦβ２の分泌が９５％減少した（４２±７ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１１）。ＴＧＦβ１（ｐ＝０．０１２８）とＴＧＦβ２（ｐ＝０．００４２）の両方の分泌が、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（表２５）（図９Ｃ）。
ＬＫ－２細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
未改変親細胞株（ｎ＝９）もｓｈＲＮＡ改変細胞株（ｎ＝９）も、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を上回るＴＧＦβ１を分泌しなかった。ＬＫ－２におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（１９７±３４ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝１０）、ＴＧＦβ２の分泌が６１％減少した（７７±１２ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１０）。ＴＧＦβ２（ｐ＝０．００４２）の分泌は、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（表２５）（図９Ｄ）。
未改変親細胞株（ｎ＝９）もｓｈＲＮＡ改変細胞株（ｎ＝９）も、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を上回るＴＧＦβ１を分泌しなかった。ＬＫ－２におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（１９７±３４ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝１０）、ＴＧＦβ２の分泌が６１％減少した（７７±１２ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝１０）。ＴＧＦβ２（ｐ＝０．００４２）の分泌は、未改変親細胞株と比較して、有意に減少した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（表２５）（図９Ｄ）。
ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウン
ＮＣＩ－Ｈ１７０３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（１，７３６±１７７ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝３）、ＴＧＦβ１の分泌が７５％減少した（４２９±１３３ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝３）。未改変親（ｎ＝５）とｓｈＲＮＡ改変細胞株（ｎ＝５）の両方が、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を上回るＴＧＦβ２を分泌しなかった（表２５）（図９Ｅ）。
ＮＣＩ－Ｈ１７０３におけるＴＧＦβ１とＴＧＦβ２を組み合わせたノックダウンにより、未改変親細胞株と比較して（１，７３６±１７７ｐｇ／１０6細胞／２４ｈ）（ｎ＝３）、ＴＧＦβ１の分泌が７５％減少した（４２９±１３３ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝３）。未改変親（ｎ＝５）とｓｈＲＮＡ改変細胞株（ｎ＝５）の両方が、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を上回るＴＧＦβ２を分泌しなかった（表２５）（図９Ｅ）。
実施例６：ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の下方制御は細胞性免疫応答を増強する
未改変親細胞、ＴＧＦβ１ＫＤ、ＴＧＦβ２ＫＤ、またはＴＧＦβ１＋β２ＫＤ ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＭＣで２時間処理し、次いで、６ウェルプレートに播種し、２４時間後、健常ドナーのＰＢＭＣを添加した。ＰＢＭＣを、ＩＬ－２の存在下、ＭＭＣで処理したＮＣＩ－Ｈ４６０と、５～６日間共培養した。５日目または６日目に、ＰＢＭＣを共培養物から注意深く単離し、カウントし、プレコートされたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＭａｂＴｅｃｈ）にロードした。次いで、ＰＢＭＣを、ＭＭＣで処理した未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞、または既知のＭＨＣクラスＩ限定サバイビンエピトープを含む１１のペプチドの混合物で、３６～４８時間刺激した。ＩＦＮγ ＳＦＵは、製造元の説明書に従って、検出し、カウントし（ＣＴＬ ＣＲＯ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＳＦＵの数／１０6ＰＢＭＣとして表した。
未改変親細胞、ＴＧＦβ１ＫＤ、ＴＧＦβ２ＫＤ、またはＴＧＦβ１＋β２ＫＤ ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＭＣで２時間処理し、次いで、６ウェルプレートに播種し、２４時間後、健常ドナーのＰＢＭＣを添加した。ＰＢＭＣを、ＩＬ－２の存在下、ＭＭＣで処理したＮＣＩ－Ｈ４６０と、５～６日間共培養した。５日目または６日目に、ＰＢＭＣを共培養物から注意深く単離し、カウントし、プレコートされたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＭａｂＴｅｃｈ）にロードした。次いで、ＰＢＭＣを、ＭＭＣで処理した未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞、または既知のＭＨＣクラスＩ限定サバイビンエピトープを含む１１のペプチドの混合物で、３６～４８時間刺激した。ＩＦＮγ ＳＦＵは、製造元の説明書に従って、検出し、カウントし（ＣＴＬ ＣＲＯ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＳＦＵの数／１０6ＰＢＭＣとして表した。
ＴＧＦβ１ＫＤ ＮＣＩ－Ｈ４６０で感作された健常ドナー（ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２）由来ＰＢＭＣは、未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０による感作と比較して（５０７±１５２ＳＦＵ）、細胞性免疫応答（１６１３±１８７ＳＦＵ）を有意に増加させる（ｐ＜０．００１）。（図１０Ａ）。ＴＧＦβ１とＴＧＦβ２の両方のノックダウンも、未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０と比較して、ＩＦＮγ応答を有意に増加させた（１８２３±９３ＳＦＵ）（ｐ＜０．００１）。ＴＧＦβ２のノックダウンは、未改変親細胞株（３９０±１７０ＳＦＵ）と比較して、ＩＦＮγ産生を増加させなかった（ｐ＝０．６９２）。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックダウンによる免疫応答の増加は、ＴＧＦβ２のノックダウンだけでは免疫原性が増強されなかったため、ＴＧＦβ１のノックダウンの効果に起因している可能性がある。異なるドナー（ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１）に由来するＰＢＭＣでは、ＮＣＩ－Ｈ４６０におけるＴＧＦβ１のノックダウンは、未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０による感作と比較して（７７３±２３６ＳＦＵ）、細胞性免疫応答を有意に増加させた（１８８３±１４４ＳＦＵ）（ｐ＝０．０１３）（図１０Ｂ）。ＴＧＦβ２のみのノックダウン（１３１７±８５ＳＦＵ）（ｐ＞０．９９９）およびＴＧＦβ１とＴＧＦβ２の両方（１６３０±６２）（ｐ＝０．２４９）のノックダウンも、未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞による感作と比較して、ＩＦＮγ応答を増加させたが、統計的有意性には達しなかった。
サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５）は、十分に特徴付けられたＴＡＡであり、これは、複数の癌免疫療法の適応症で過剰発現している。図１０Ｃは、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ドナーＰＢＭＣがＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ２ＫＤ細胞で感作された場合（１９２±１２０ＳＦＵ）、未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞（２８±４４）と比較して、サバイビンに対するＭＨＣクラスＩ限定応答が有意により強化されることを示す（ｐ＝０．００５）。ＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ１ＫＤ（３０±６４）（ｐ＝０．９９９）またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤ（３０±３８）（ｐ＝０．９９９）によるＰＢＭＣの感作は、２つの独立した実験で、サバイビン特異的ＩＦＮγ産生の有意な増加を示しなかった。
このワクチンアプローチの免疫原性に対するＴＧＦβ１ＫＤの効果を、混合リンパ球共培養反応において、２人の健常ドナー（ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊３０）（ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８）から単離されたＰＢＭＣで、さらに特徴付けた（ｎ＝３／ドナー）。ＰＢＭＣは、単独で培養されたか、またはＩＬ－２の存在下、ＮＣＩ－Ｈ５２０ ＴＧＦβ１ナンセンス対照もしくはＴＧＦβ１ＫＤ細胞と１０日間共培養された。腫瘍細胞なしで培養されたＰＢＭＣは、追加の対照として機能した。ＩＦＮγの分泌は、１０日目にＥＬＩＳＡによって、共培養上清において測定された（図１１Ａ）。ＩＦＮγの分泌は、ＰＢＭＣ単独と比較して（８３±８６ｐｇ／ｍＬ）、ＮＣＩ－Ｈ５２０ ＴＧＦβ１ＫＤ細胞と共培養されたＰＢＭＣの上清で（２７２±２５９ｐｇ／ｍＬ）、有意に増加した（ｐ＝０．０４６）。ＮＣＩ－Ｈ５２０ ＴＧＦβ１ナンセンスＫＤの上清では（８６±３２ｐｇ／ｍＬ）、ＰＢＭＣ単独と比較して、ＩＦＮγ分泌の有意な増加はなかった（ｐ＝０．５１２）。
ＮＣＩ－Ｈ５２０の免疫原性に対するＴＧＦβ１ノックダウンの影響を、自家ＰＢＭＣ・ＤＣ共培養アッセイで、さらに評価した。健常ドナー（ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊３０）から単離された単球から分化したＤＣに、ＮＣＩ－Ｈ５２０未改変親細胞、ＴＧＦβ１ＫＤ、ＴＧＦβ２ＫＤ、またはＴＧＦβ１＋β２ＫＤ細胞からの細胞溶解物をロードした。自己ＰＢＭＣは、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２の存在下、溶解物をロードしたＤＣと、５～６日間共培養した。５日目または６日目に、ＰＢＭＣを共培養から注意深く単離し、カウントし、プレコートされたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＭａｂＴｅｃｈ）に、ウェル当たり１×１０5でプレーティングした次いで、ＰＢＭＣを、ＭＭＣ処理された未改変親ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞で、３６～４８時間刺激した。結果は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによってアッセイすると、未改変親ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞（９３±１６２ＳＦＵ）と比較して、ＴＧＦβ１ＫＤ（３５７±１８１ＳＦＵ）では、ＮＣＩ－Ｈ５２０未改変親細胞に対する細胞性免疫応答が増加する傾向があることを示した（ｐ＝０．１８１）（図１１Ｂ）。ＮＣＩ－Ｈ５２０ ＴＧＦβ２ＫＤ（１３±２３ＳＦＵ）（ｐ＝０．８９７）ならびにＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤ（２４０±１４２ＳＦＵ）（ｐ＝０．６０３）からの溶解物と共培養した自己ＰＢＭＣにおいて誘導された未改変親ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞に対するＩＦＮγ応答は、ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）未改変親溶解物をロードしたＤＣと共培養した自己ＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮγ応答を有意に増加させなかった。統計的有意性に達していないにもかかわらず、ＮＣＩ－Ｈ５２０ ＴＧＦβ１ＫＤならびにＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤをロードしたＤＣとの自己ＰＢＭＣの共培養によって誘導される細胞性免疫応答は、ＮＣＩ－Ｈ５２０ ＴＧＦβ２ＫＤおよび未改変親溶解物によるものよりも頑強であった。
実施例７：ＴＧＦβのｓｈＲＮＡ下方制御は、細胞株におけるＴＧＦβのノックアウトよりも強い免疫応答を誘導する
インビトロデータは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の完全なノックアウトが、２つの分子のｓｈＲＮＡノックダウンよりも腫瘍細胞に対する応答を誘導するのに効果が低かったことを示唆している。図１２に、代表的なアッセイを示す。正常ドナーＰＢＭＣを、ＴＧＦβ１／ＴＧＦβ２ ｓｈＲＮＡ改変またはＮＣＩ－Ｈ４６０またはＴＧＦβ１／ＴＧＦβ２ ＺＦＮノックアウトＮＣＩ－Ｈ４６０のいずれかと共培養した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで分析した。データは、ｓｈＲＮＡ改変細胞がＺＦＮノックアウト細胞よりも有意に良好なＩＦＮγの分泌を誘導したことを示す（ｐ＝０．０１４３、対応のないｔ検定）。この実験では、５人の個々のドナーを試験して、ｓｈＲＮＡ改変細胞について合計２４回試験し、ノックアウト細胞については３１回繰り返した。
インビトロデータは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の完全なノックアウトが、２つの分子のｓｈＲＮＡノックダウンよりも腫瘍細胞に対する応答を誘導するのに効果が低かったことを示唆している。図１２に、代表的なアッセイを示す。正常ドナーＰＢＭＣを、ＴＧＦβ１／ＴＧＦβ２ ｓｈＲＮＡ改変またはＮＣＩ－Ｈ４６０またはＴＧＦβ１／ＴＧＦβ２ ＺＦＮノックアウトＮＣＩ－Ｈ４６０のいずれかと共培養した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで分析した。データは、ｓｈＲＮＡ改変細胞がＺＦＮノックアウト細胞よりも有意に良好なＩＦＮγの分泌を誘導したことを示す（ｐ＝０．０１４３、対応のないｔ検定）。この実験では、５人の個々のドナーを試験して、ｓｈＲＮＡ改変細胞について合計２４回試験し、ノックアウト細胞については３１回繰り返した。
ＴＧＦβ１は、上皮－間葉転換を調節する上で重要な役割を果たしているため、ＴＧＦβ１の完全な欠如により、腫瘍細胞の免疫原性が低い表現型が誘導される（Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８）。これは、ノックアウトと比べたＮＣＩ－Ｈ４６０のＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ ｓｈＲＮＡノックダウンにおける重要な免疫応答関連タンパク質の発現の比率を比較すると、識別可能であった（図１３）。ノックダウン細胞は、ノックアウト細胞と比較して、高レベルの免疫原性タンパク質およびＴＡＡを発現した。
まとめると、実施例６および７に提示されたデータは、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の減少が、同種全細胞ワクチンの文脈で、未改変親腫瘍細胞および抗原に対する細胞性免疫応答を増加させ得ることを示す。さらに、これらのデータは、ｓｈＲＮＡを介したノックダウンが、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のノックアウトと比較して、より強力な免疫応答を誘導することを示す。
実施例８．ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌がｓｈＲＮＡを介して下方制御された細胞株の組み合わせの免疫原性
ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌が減少した細胞株の例示的な組み合わせの免疫原性は、実施例２に記載されているように、変更を加えたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。２つの異なる応答：１つ目は、細胞株の組み合わせ、ならびに２つ目は、既知の腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、およびがん精巣抗原（総称して、抗原）を評価した。細胞株の組み合わせによって生成される免疫応答を評価するために、ＤＣ対全細胞株の比率が１：１になるように、ＤＣを、１．０：０．３３のＤＣ対細胞株の比率でロードした。具体的には、１．５×１０6個のＤＣを、５．０×１０6個の細胞株１、５．０ｅ5個の細胞株２、および５．０ｅ5個の細胞株３と共培養した。
ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌が減少した細胞株の例示的な組み合わせの免疫原性は、実施例２に記載されているように、変更を加えたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。２つの異なる応答：１つ目は、細胞株の組み合わせ、ならびに２つ目は、既知の腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、およびがん精巣抗原（総称して、抗原）を評価した。細胞株の組み合わせによって生成される免疫応答を評価するために、ＤＣ対全細胞株の比率が１：１になるように、ＤＣを、１．０：０．３３のＤＣ対細胞株の比率でロードした。具体的には、１．５×１０6個のＤＣを、５．０×１０6個の細胞株１、５．０ｅ5個の細胞株２、および５．０ｅ5個の細胞株３と共培養した。
抗原に対する応答を評価するために、６日目にｍＤＣとの共培養物から単離されたＣＤ１４-ＰＢＭＣを、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、抗原特異的ペプチドプールで２４時間刺激した後、ＩＦＮγ ＳＦＵを検出した。抗原特異的応答は、対照の数を上回るＳＦＵの数／１０6ＰＢＭＣとして表される。抗原ペプチドプールは、以下のように商業的供給源から入手した：ＭａｇｅＡ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ１）、ＭａｇｅＡ３（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ３）、ＭａｇｅＡ４（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ４）、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡ）（ＪＰＴ，ＰＭ－ＣＥＡ）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＰＲＡＭＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９７－２８６）、ＷＴ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＷＴ１）、ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、ＳＴＥＡＰ（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、およびＨＥＲ２（ＪＰＴ，ＰＭ－ＥＲＢ＿ＥＣＤ）。免疫応答は、ＨＬＡ－Ａ０２（ドナー１～３）およびＨＬＡ－Ａ１１（ドナー４）の健常ドナー（ｎ＝２～３／細胞株／ドナー）に由来する細胞を使用して決定した。
３つのＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２改変細胞株の６つの例示的な組み合わせの免疫原性は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した（図１４）。
例示的なワクチン細胞株の組み合わせ１は、ＮＣＩ－２０２３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ならびにＬＫ－２ ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２改変細胞株で構成された。細胞株の組み合わせは、ＮＣＩ－２０２３に対して１，８００±５５３ＳＦＵ、ＮＣＩ－Ｈ２３に対して２，０６９±３９３ＳＦＵ、およびＬＫ－に対して１，６３０±１０２ＳＦＵからなる、５，４９９±１，０１６ＳＦＵ（ｎ＝９／３ドナー）の総ＩＦＮγ応答を誘発した。２（図１４Ａ）（表２６）。例示的なワクチンの組み合わせ２は、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＤＭＳ５３、ならびにＮＣＩ－Ｈ１７０３ ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２改変細胞株で構成された。この例示的なワクチンの組み合わせは、ＮＣＩ－Ｈ２３に対して１，７３８±５２９ＳＦＵ、ＤＭＳ５３に対して８２６±４５７ＳＦＵ、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３に対して１，０４１±５５５ＳＦＵからなる、３，６０４±１，４９１ＳＦＵ（ｎ＝９／３ドナー）の総ＩＦＮγ応答を誘発した。（図１４Ｂ）（表２６）。例示的なワクチンの組み合わせ３は、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＤＭＳ５３、ならびにＮＣＩ－Ｈ１７０３ ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２改変細胞株で構成された。この例示的な細胞株の組み合わせは、ＮＣＩ－Ｈ２０２３に対して２，８４７±４８４ＳＦＵ、ＤＭＳ５３に対して１，８２０±２６０ＳＦＵ、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３に対して１，３９８±３０９ＳＦＵからなる、６，０６５±９４１ＳＦＵ（ｎ＝９／３ドナー）の総ＩＦＮγ応答を誘導した。（図１４Ｃ）（表２６）。例示的なワクチンの組み合わせ４は、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＤＭＳ５３、ならびにＬＫ－２ ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２改変細胞株で構成された。この例示的な細胞株の組み合わせは、ＮＣＩ－Ｈ２３に対して２，６５４±１，０９１ＳＦＵ、ＤＭＳ５３に対して３，０１７±１，９１４ＳＦＵ、およびＬＫ－２に対して３，９４２±２，４７４ＳＦＵからなる、９，６１２±５，２９３ＳＦＵ（ｎ＝１２／４ドナー）の総ＩＦＮγ応答を誘導した。（図１４Ｄ）（表２６）。例示的なワクチンの組み合わせ５は、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＤＭＳ５３、ならびにＬＫ－２ ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２改変細胞株で構成された。この例示的な細胞株の組み合わせは、ＮＣＩ－Ｈ２０２３に対して２，８６９±１，１５０ＳＦＵ、ＤＭＳ５３に対して１，６９８±５６８ＳＦＵ、およびＬＫ－２に対して１，７９１±６３７ＳＦＵからなる、６，３５８±２，２７８ＳＦＵ（ｎ＝９／３ドナー）の総ＩＦＮγ応答を誘導した（図１４Ｅ）（表２６）。例示的なワクチンの組み合わせ６は、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ならびにＡ５４９ ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２改変細胞株で構成された。この例示的な細胞株の組み合わせは、ＮＣＩ－Ｈ４６０に対して２，３２０±６６６ＳＦＵ、ＮＣＩ－Ｈ５２０に対して２，７２３±６４４ＳＦＵ、およびＡ５４９に対して３，００５±４８７ＳＦＵからなる、８，４０７±１，５３５ＳＦＵ（ｎ＝１２／４ドナー）の総ＩＦＮγを誘導した（図１４Ｆ）（表２６）。
一部の例示的な細胞株の組み合わせついて、ＰＢＭＣが、３つのワクチン細胞株の組み合わせからの抗原を提示するＤＣと共培養された場合、単一のワクチン細胞株成分からの抗原を提示するＤＣと共培養されたＰＢＭＣと比較して、個々の未改変親細胞株に対するＩＦＮγ応答が増強された（表２６）。３つの細胞株の組み合わせによって誘導される免疫応答は、個々の細胞株によって誘導される応答よりも強力であった。
１１の抗原に対するＩＦＮγ応答は、例示的なワクチンの組み合わせ４（ＮＣＩ－Ｈ２３、ＤＭＳ５３、ならびにＬＫ－２ ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２改変細胞株）で決定された。抗原ＭａｇｅＡ１、ＭａｇｅＡ３、ＭａｇｅＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡ）、ＭＵＣ１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ、およびＨＥＲ２に対する応答は、３人のＨＬＡ－Ａ０２健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）で評価された。例示的なワクチンの組み合わせ４は、単一のワクチン成分であるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２改変細胞株ＮＣＩ－Ｈ２３（４，１１１５±２，１１８ＳＦＵ）、ＤＭＳ５３（３，６６１±１，９８２ＳＦＵ）、およびＬＫ－２（２，７７２±２，９３６ＳＦＵ）と比較して、大きさ５，４２３±４２７ＳＦＵ（図１５Ａ）および幅（図１５Ｂ）がより大きい抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導した。特定の抗原に対する応答は、図の凡例に示されている順序になっている。図１５Ｂに、単一成分および組み合わせの細胞株ワクチンによって誘導される各抗原に対する平均ＩＦＮγ応答を詳述する。
実施例９：ＨＬＡ－Ｅの発現の減少は細胞性免疫応答を改善する
ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡクラスＩの重鎖パラログに属する。ＨＬＡ－Ｅのヒト腫瘍細胞表面発現は、これらの免疫細胞のサブセット上のＮＫＧ２Ａ受容体への結合を介して、ＮＫ、ＤＣ、およびＣＤ８ Ｔ細胞の抗腫瘍機能を阻害する可能性がある。
ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡクラスＩの重鎖パラログに属する。ＨＬＡ－Ｅのヒト腫瘍細胞表面発現は、これらの免疫細胞のサブセット上のＮＫＧ２Ａ受容体への結合を介して、ＮＫ、ＤＣ、およびＣＤ８ Ｔ細胞の抗腫瘍機能を阻害する可能性がある。
ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１細胞株（ＪＣＲＢ１０２０）におけるＨＬＡ－Ｅの発現の減少
ヒト腺癌細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１を、以下のゲノムＤＮＡ配列：ＴＡＣＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧｇｃｃｃｔｔＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴ（配列番号３３）を標的とするＨＬＡ－Ｅに特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対でエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウト細胞は、ＰＥ結合抗ヒトＨＬＡ－Ｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローン３Ｄ１２）で染色した後、フローサイトメトリーによって特定し、次いで、ＦＡＣＳで選別した。選別後、細胞を増殖させ、ノックアウトの割合（％）を測定した。ＨＬＡ－ＥＫＯまたは未改変親細胞の未染色対照のＭＦＩを、ＰＥ結合抗ヒトＨＬＡ－Ｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローン３Ｄ１２）で染色されたＨＬＡ－ＥＫＯまたは未改変親細胞のＭＦＩから差し引いた。ＺＦＮによるＨＬＡ－Ｅの遺伝子編集は、ＦＡＣＳ選別後、９９％を超えるＨＬＡ－Ｅ陰性細胞をもたらした（図１６Ａ）。ノックアウト率は、（ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１ ＨＬＡ－ＥＫＯ ＭＦＩ／親ＭＦＩ）×１００として表される。
ヒト腺癌細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１を、以下のゲノムＤＮＡ配列：ＴＡＣＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧｇｃｃｃｔｔＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴ（配列番号３３）を標的とするＨＬＡ－Ｅに特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対でエレクトロポレーションした。完全アレルノックアウト細胞は、ＰＥ結合抗ヒトＨＬＡ－Ｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローン３Ｄ１２）で染色した後、フローサイトメトリーによって特定し、次いで、ＦＡＣＳで選別した。選別後、細胞を増殖させ、ノックアウトの割合（％）を測定した。ＨＬＡ－ＥＫＯまたは未改変親細胞の未染色対照のＭＦＩを、ＰＥ結合抗ヒトＨＬＡ－Ｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローン３Ｄ１２）で染色されたＨＬＡ－ＥＫＯまたは未改変親細胞のＭＦＩから差し引いた。ＺＦＮによるＨＬＡ－Ｅの遺伝子編集は、ＦＡＣＳ選別後、９９％を超えるＨＬＡ－Ｅ陰性細胞をもたらした（図１６Ａ）。ノックアウト率は、（ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１ ＨＬＡ－ＥＫＯ ＭＦＩ／親ＭＦＩ）×１００として表される。
ＨＬＡ－Ｅの発現の減少は免疫応答を改善する
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、１つの変更を加えて、実施例８に記載されているように完了した。この実験では、ｉＤＣに、１つの細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１親細胞株またはＨＬＡ－ＥＫＯ細胞株のみをロードした。ここでは、１．５×１０6個のＤＣに、１．５×１０6個のＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１親細胞またはＨＬＡ－ＥＫＯ細胞をロードした。自己ＰＢＭＣをＨＬＡ－Ｅ陰性細胞をロードしたＤＣと共培養した場合（５０８５±１１５７ＳＦＵ）、未改変親ＨＬＡ－Ｅ陽性細胞をロードしたＤＣ（２８１０±４９１ＳＦＵ）と比較して、ＩＦＮγ応答が１．８倍高かった（Ｓｔｕｄｅｎｔの検定、ｐ＝０．０１２、ｎ＝１２、３人のＨＬＡ－Ａ多様ドナー）（図１６Ｂ）。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、１つの変更を加えて、実施例８に記載されているように完了した。この実験では、ｉＤＣに、１つの細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１親細胞株またはＨＬＡ－ＥＫＯ細胞株のみをロードした。ここでは、１．５×１０6個のＤＣに、１．５×１０6個のＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１親細胞またはＨＬＡ－ＥＫＯ細胞をロードした。自己ＰＢＭＣをＨＬＡ－Ｅ陰性細胞をロードしたＤＣと共培養した場合（５０８５±１１５７ＳＦＵ）、未改変親ＨＬＡ－Ｅ陽性細胞をロードしたＤＣ（２８１０±４９１ＳＦＵ）と比較して、ＩＦＮγ応答が１．８倍高かった（Ｓｔｕｄｅｎｔの検定、ｐ＝０．０１２、ｎ＝１２、３人のＨＬＡ－Ａ多様ドナー）（図１６Ｂ）。
実施例１０：細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）発現の減少は細胞性免疫応答を増加させる
ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）は、免疫チェックポイントとして機能し、一部の腫瘍細胞で構成的に発現している。ＤＣの表面のＣＤ８０またはＣＤ８６へのＣＴＬＡ－４の結合は、ＤＣの成熟化を負に調節し、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を阻害する可能性がある。
ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）は、免疫チェックポイントとして機能し、一部の腫瘍細胞で構成的に発現している。ＤＣの表面のＣＤ８０またはＣＤ８６へのＣＴＬＡ－４の結合は、ＤＣの成熟化を負に調節し、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を阻害する可能性がある。
ヒト扁平上皮細胞株におけるＣＴＬＡ－４発現の減少
ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株を、ＣＴＬＡ－４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌ－０１６２６７－００－００５０）を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を、抗生物質不含培地中、６ウェルプレートの各ウェルに、６×１０5でプレーティングし、５％ ＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ ｓｉＲＮＡトランスフェクションのプロトコルに従って、各ウェルを、１ウェル当たり４ｕＬのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｔ－２０００１－０１）を使用して、最終濃度が２５ｎＭのＣＴＬＡ－４ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後、生細胞上のＣＴＬＡ－４の発現の減少を、フローサイトメトリーによって決定し、その後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。具体的には、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌ３４９６５）およびヒトα－ＣＴＬＡ４－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローンＬ３Ｄ１０）で染色した。ｓｉＲＮＡにより、未改変親ＮＣＩ－Ｈ５２０と比較して（７．５９％）、ＣＴＬＡ－４（３．５９％）のＮＣＩ－Ｈ５２０細胞表面での発現が、２．１倍減少した（図１７Ａ）。
ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株を、ＣＴＬＡ－４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌ－０１６２６７－００－００５０）を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を、抗生物質不含培地中、６ウェルプレートの各ウェルに、６×１０5でプレーティングし、５％ ＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ ｓｉＲＮＡトランスフェクションのプロトコルに従って、各ウェルを、１ウェル当たり４ｕＬのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｔ－２０００１－０１）を使用して、最終濃度が２５ｎＭのＣＴＬＡ－４ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後、生細胞上のＣＴＬＡ－４の発現の減少を、フローサイトメトリーによって決定し、その後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。具体的には、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌ３４９６５）およびヒトα－ＣＴＬＡ４－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローンＬ３Ｄ１０）で染色した。ｓｉＲＮＡにより、未改変親ＮＣＩ－Ｈ５２０と比較して（７．５９％）、ＣＴＬＡ－４（３．５９％）のＮＣＩ－Ｈ５２０細胞表面での発現が、２．１倍減少した（図１７Ａ）。
ＮＣＩ－Ｈ５２０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１８２）細胞株におけるＣＴＬＡ－４の発現の減少は、細胞性免疫応答を増加させる
細胞性免疫応答に対するＣＴＬＡ－４の細胞表面発現の減少の影響は、ＨＬＡ－Ａ０２：０１ドナーに由来する細胞を使用して、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後、ＥＬＩＳｐｏｔを開始し、実施例９に記載されているように実施した。ＮＣＩ－Ｈ５２０におけるＣＴＬＡ－４の発現の減少は、未改変親細胞株（１，７３０±２１０ＳＦＵ）（ｎ＝２）と比較したＩＦＮγ応答の１．６倍の増加（２，７７０±１８０ＳＦＵ）（ｎ＝２）と関連していた（図１７Ｂ）。
細胞性免疫応答に対するＣＴＬＡ－４の細胞表面発現の減少の影響は、ＨＬＡ－Ａ０２：０１ドナーに由来する細胞を使用して、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後、ＥＬＩＳｐｏｔを開始し、実施例９に記載されているように実施した。ＮＣＩ－Ｈ５２０におけるＣＴＬＡ－４の発現の減少は、未改変親細胞株（１，７３０±２１０ＳＦＵ）（ｎ＝２）と比較したＩＦＮγ応答の１．６倍の増加（２，７７０±１８０ＳＦＵ）（ｎ＝２）と関連していた（図１７Ｂ）。
実施例１１．Ａ５４９細胞株におけるＣＤ２７６の発現の減少は、細胞性免疫応答を増強する
ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）は、Ｂ７およびＣＤ２８ファミリーの免疫チェックポイントのメンバーである。ヒト固形癌におけるＣＤ２７６の過剰発現は、免疫抑制表現型を誘発し、Ｔｈ１を介した免疫応答を優先的に下方制御する可能性がある。
ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）は、Ｂ７およびＣＤ２８ファミリーの免疫チェックポイントのメンバーである。ヒト固形癌におけるＣＤ２７６の過剰発現は、免疫抑制表現型を誘発し、Ｔｈ１を介した免疫応答を優先的に下方制御する可能性がある。
Ａ５４９におけるＣＤ２７６の発現の減少は、ＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＣＴ（配列番号１１７）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）に特異的なガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して完了した。初期の不均一な集団には、ＣＤ２７６の発現が減少したＡ５４９細胞が７１％含まれた。不均一な集団は、ＢＢ７００結合α－ヒトＣＤ２７６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローン７－５１７）および細胞選別（ＢｉｏＲａｄ Ｓ３ｅセルソーター）によって濃縮された完全アレルノックアウト細胞で表面染色した。ＣＤ２７６の減少は、選別した濃縮Ａ５４０ ＣＤ２７６ＫＯ細胞および親Ａ５４９細胞を、ＰＥα－ヒトＣＤ２７６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローンＤＣＮ．７０）で細胞外染色することによって確認した。未染色対照およびアイソタイプ対照 ＰＥ α－マウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローンＭＯＰＣ－２１）で染色したＡ５４９ ＣＤ２７６ＫＯ細胞が、対照として機能した。ＣＤ２７６のＣａｓ９を介した遺伝子編集は、対照と比較して、ＣＤ２７６の９９％超の減少をもたらした（図１８Ａ）。
代表的な実験では、ｉＤＣに、Ａ５４９親細胞またはＡ５４９ ＣＤ２７６ＫＯ細胞をロードし、自己ＣＤ１４－ＰＢＭＣと６日間共培養した後、野生型Ａ５４９からの細胞溶解物をロードした自己ＤＣで刺激した。次いで、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、細胞を、野生型Ａ５４９細胞に対して、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。これらのデータは、ＣＤ２７６ＫＯ細胞が、野生型細胞よりも良好な刺激因子であることを示す（ｐ＝０．０１７；対応のないｔ検定）（図１８Ｂ）。
実施例１２：ＣＤ４７の発現ならびにＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ１を下方制御する方法ならびに分泌されたＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のレベルを決定する方法は、実施例５に記載されている。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ１を下方制御する方法ならびに分泌されたＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のレベルを決定する方法は、実施例５に記載されている。
ｓｈＲＮＡによるヒト肺癌株におけるＣＤ４７の発現の減少は、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２を下方制御した
ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されたＡ５４９、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３は、実施例２および本明細書の追加の方法に記載されているように、ＣＤ４７の発現を減少させるようにさらに改変された。ＺＦＮを介したＣＤ４７のノックアウトに続いて、細胞株を、ＦＩＴＣ結合α－ＣＤ４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＢ６Ｈ１２）で表面染色し、完全アレルノックアウト細胞を、細胞選別（ＢｉｏＲａｄ Ｓ３ｅセルソーター）によって濃縮した。ＣＤ４７陰性細胞のみを確実に回収するために、高純度選別戦略を使用して細胞を回収した。選別した細胞を、細胞数に基づいて適切なサイズの容器にプレーティングし、成長および増殖させた。完全アレルノックアウトのための細胞濃縮後、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞を、２～５回継代し、ＣＤ４７のノックアウト率を、フローサイトメトリー（ＢＶ４２１結合ヒトαＣＤ４７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＢ６Ｈ１２）によって測定した。改変または未改変親細胞の未染色対照のＭＦＩを、ＢＶ４２１結合ヒトα－ＣＤ４７で染色された改変または未改変親細胞のＭＦＩから差し引いた。ＣＤ４７のノックアウト率は、（１－（ＴＧＦβ１／ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ ＭＦＩ／親ＭＦＩ））×１００）として表される。
ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されたＡ５４９、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３は、実施例２および本明細書の追加の方法に記載されているように、ＣＤ４７の発現を減少させるようにさらに改変された。ＺＦＮを介したＣＤ４７のノックアウトに続いて、細胞株を、ＦＩＴＣ結合α－ＣＤ４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＢ６Ｈ１２）で表面染色し、完全アレルノックアウト細胞を、細胞選別（ＢｉｏＲａｄ Ｓ３ｅセルソーター）によって濃縮した。ＣＤ４７陰性細胞のみを確実に回収するために、高純度選別戦略を使用して細胞を回収した。選別した細胞を、細胞数に基づいて適切なサイズの容器にプレーティングし、成長および増殖させた。完全アレルノックアウトのための細胞濃縮後、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞を、２～５回継代し、ＣＤ４７のノックアウト率を、フローサイトメトリー（ＢＶ４２１結合ヒトαＣＤ４７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＢ６Ｈ１２）によって測定した。改変または未改変親細胞の未染色対照のＭＦＩを、ＢＶ４２１結合ヒトα－ＣＤ４７で染色された改変または未改変親細胞のＭＦＩから差し引いた。ＣＤ４７のノックアウト率は、（１－（ＴＧＦβ１／ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ ＭＦＩ／親ＭＦＩ））×１００）として表される。
ＺＦＮによるＣＤ４７の遺伝子編集により、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少を維持しながら（表２８）、細胞株のＦＡＣＳ選別後、９９％を超えるＣＤ４７陰性細胞が得られた（表２７）。ＣＤ４７の発現の減少を伴うＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の下方制御は、以下のように示されている：図１９のＮＣＩ－Ｈ２０２３、図２０のＮＣＩ－Ｈ２３、図２１のＡ５４９、図２２のＮＣＩ－Ｈ４６０、図２３のＮＣＩ－Ｈ１７０３、図２４のＬＫ－２、図２５のＤＭＳ５３、および図２６のＮＣＩ－Ｈ５２０。
実施例１３：ＣＤ２７６の発現ならびにＴＧＦβ１および／ＴＧＦβ２の分泌の減少は、細胞性免疫応答を増加させる
ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＤＭＳ５３、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌は、実施例５のｓｈＲＮＡによって減少している）を、ゲノムＤＮＡ配列：ＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧｇｇｔｇｔｇＣＡＴＧＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣ（配列番号２６）を標的とするＣＤ２７６に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対でエレクトロポレーションした。ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２ＫＤ株におけるＣＤ２７６のＺＦＮを介したノックアウトに続いて、細胞株を、ＢＢ７００結合α－ヒトＣＤ２７６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローン７－５１７）で表面染色し、完全アレルノックアウト細胞を、細胞選別（ＢｉｏＲａｄ Ｓ３ｅセルソーター）によって濃縮した。ＣＤ２７６陰性細胞のみを確実に回収するために、高純度選別戦略を使用して細胞を回収した。選別した細胞を、細胞数に基づいて適切なサイズの容器にプレーティングし、成長および増殖させた。完全アレルノックアウトのための細胞濃縮後、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ細胞を、２～５回継代し、ＣＤ２７６のノックアウト率を、フローサイトメトリー（ＢＶ４２１結合ヒト抗ＣＤ２７６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローン７－５１７）によって測定した。改変細胞または未改変親細胞の未染色対照のＭＦＩを、ＢＶ４２１結合ヒト抗ＣＤ２７６で染色された改変細胞または未改変親細胞のＭＦＩから差し引いた。減少率（％）は、（１－（ＴＧＦβ１／β２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ ＭＦＩ／親ＭＦＩ））×１００）として表される。
ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＤＭＳ５３、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌は、実施例５のｓｈＲＮＡによって減少している）を、ゲノムＤＮＡ配列：ＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧｇｇｔｇｔｇＣＡＴＧＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣ（配列番号２６）を標的とするＣＤ２７６に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対でエレクトロポレーションした。ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２ＫＤ株におけるＣＤ２７６のＺＦＮを介したノックアウトに続いて、細胞株を、ＢＢ７００結合α－ヒトＣＤ２７６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローン７－５１７）で表面染色し、完全アレルノックアウト細胞を、細胞選別（ＢｉｏＲａｄ Ｓ３ｅセルソーター）によって濃縮した。ＣＤ２７６陰性細胞のみを確実に回収するために、高純度選別戦略を使用して細胞を回収した。選別した細胞を、細胞数に基づいて適切なサイズの容器にプレーティングし、成長および増殖させた。完全アレルノックアウトのための細胞濃縮後、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ細胞を、２～５回継代し、ＣＤ２７６のノックアウト率を、フローサイトメトリー（ＢＶ４２１結合ヒト抗ＣＤ２７６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローン７－５１７）によって測定した。改変細胞または未改変親細胞の未染色対照のＭＦＩを、ＢＶ４２１結合ヒト抗ＣＤ２７６で染色された改変細胞または未改変親細胞のＭＦＩから差し引いた。減少率（％）は、（１－（ＴＧＦβ１／β２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ ＭＦＩ／親ＭＦＩ））×１００）として表される。
ＺＦＮによるＣＤ２７６の遺伝子編集により、細胞株で９９％を超えるＣＤ２７６陰性細胞（表２９）が得られ、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌が減少した（表３１）。ＣＤ２７６の発現の減少を伴うＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の下方制御は、以下のように示されている：図２７のＮＣＩ－Ｈ２０２３、図２８のＮＣＩ－Ｈ２３、図２９のＡ５４９、図３０のＮＣＩ－Ｈ４６０、図３１のＮＣＩ－Ｈ１７０３、図３２のＬＫ－２、図３３のＤＭＳ５３、および図３４のＮＣＩ－Ｈ５２０。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤならびにＣＤ２７６ＫＯは、細胞性免疫応答を増加させる
実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。ＨＬＡ－Ａ０２およびＨＬＡ－Ａ０３の健常ドナーに由来する細胞を使用して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌ならびにＣＤ２７６の発現の減少が、未改変親細胞株と比較して、免疫応答を改善することができるかどうかを評価した。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の改変により、未改変親細胞株（２５０±６３ＳＦＵ）（ｎ＝１１）と比較して、ＩＦＮγ応答が２．３倍（５６９±８７ＳＦＵ）（ｎ＝１１）増加した（ｐ＝０．００７８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図３５Ａ）。Ａ５４９細胞株では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の改変により、未改変親細胞株（１，８４８±５６９ＳＦＵ）（ｎ＝１１）と比較して、ＩＦＮγ応答が２２．２倍（８３±２９ＳＦＵ）（ｎ＝１１）増加した（ｐ＝０．００９１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図３５Ｂ）。
実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。ＨＬＡ－Ａ０２およびＨＬＡ－Ａ０３の健常ドナーに由来する細胞を使用して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌ならびにＣＤ２７６の発現の減少が、未改変親細胞株と比較して、免疫応答を改善することができるかどうかを評価した。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の改変により、未改変親細胞株（２５０±６３ＳＦＵ）（ｎ＝１１）と比較して、ＩＦＮγ応答が２．３倍（５６９±８７ＳＦＵ）（ｎ＝１１）増加した（ｐ＝０．００７８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図３５Ａ）。Ａ５４９細胞株では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の改変により、未改変親細胞株（１，８４８±５６９ＳＦＵ）（ｎ＝１１）と比較して、ＩＦＮγ応答が２２．２倍（８３±２９ＳＦＵ）（ｎ＝１１）増加した（ｐ＝０．００９１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図３５Ｂ）。
実施例１４：ＣＤ２７６およびＣＤ４７の発現ならびにＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌の減少は、細胞性免疫応答を増加させる
Ａ５４９細胞株は、ｓｈＲＮＡを使用して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ４７およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変された。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌およびレベルを決定するために使用した方法は、実施例５に記載されている。ＣＤ４７およびＣＤ２７６の発現を減少させ、発現レベルを決定するために用いた方法は、それぞれ実施例１２および実施例１３に記載されている。実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを完了した。
Ａ５４９細胞株は、ｓｈＲＮＡを使用して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ４７およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変された。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌およびレベルを決定するために使用した方法は、実施例５に記載されている。ＣＤ４７およびＣＤ２７６の発現を減少させ、発現レベルを決定するために用いた方法は、それぞれ実施例１２および実施例１３に記載されている。実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを完了した。
ＣＤ２７６およびＣＤ４７の発現が低下し、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌が減少したＡ５４９細胞の特性
ＣＤ４７の発現は、未改変親細胞株（１０４，４４２ＭＦＩ）と比較して、改変細胞株（１３６ＭＦＩ）で９９．９％減少した（図３６Ａ）（表３１）。ＣＤ２７６の発現は、未改変親細胞株（５３，１９６ＭＦＩ）と比較して、改変細胞株（０ＭＦＩ）で１００％減少した（図３６Ｂ）（表３１）。改変細胞株によるＴＧＦβ１の分泌（２０２７±３１ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝２）は、未改変親細胞株と比較して（９０９３±１７５ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝２）、７８％減少した（図３６Ｃ）。改変細胞株によるＴＧＦβ２の分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回り（ｎ＝２）、未改変親細胞株と比較して（６０７±７６ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝２）、分泌レベルが１００％減少した（図３６Ｄ）。
ＣＤ４７の発現は、未改変親細胞株（１０４，４４２ＭＦＩ）と比較して、改変細胞株（１３６ＭＦＩ）で９９．９％減少した（図３６Ａ）（表３１）。ＣＤ２７６の発現は、未改変親細胞株（５３，１９６ＭＦＩ）と比較して、改変細胞株（０ＭＦＩ）で１００％減少した（図３６Ｂ）（表３１）。改変細胞株によるＴＧＦβ１の分泌（２０２７±３１ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝２）は、未改変親細胞株と比較して（９０９３±１７５ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝２）、７８％減少した（図３６Ｃ）。改変細胞株によるＴＧＦβ２の分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回り（ｎ＝２）、未改変親細胞株と比較して（６０７±７６ｐｇ／１０6細胞／２４時間）（ｎ＝２）、分泌レベルが１００％減少した（図３６Ｄ）。
ＣＤ２７６およびＣＤ４７の発現ならびにＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌の減少は、細胞性免疫応答を増加させる
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ＨＬＡ－Ａ０２（図３７Ａ）、ＨＬＡ－Ａ０３（図３７Ａ）、およびＨＬＡ－Ａ２４（図３７Ｂ）の健常ドナーに由来する細胞を利用して、Ａ５４９細胞株におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２、ＣＤ２７６、ＣＤ４７の改変が、未改変親細胞株と比較して、免疫応答を増強したかどうかを決定した。実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを完了した。改変細胞株は、未改変親細胞株（２，２３３±４９３ＳＦＵ）（ｎ＝１１）と比較して、ＩＦＮγ応答を２６．８倍（８３±２９ＳＦＵ）（ｎ＝１１）増加させた（ｐ＝０．００９１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図３７Ａ）。１０の抗原に対する応答を、未改変親細胞株、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ、およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ ＣＤ４７ＫＯ Ａ５４９改変細胞株について評価した。未改変親細胞株（１５，１４０ＳＦＵ）（ｎ＝３）によって誘導される総ＴＡＡ応答と比較して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ４７の減少は、総抗原特異的応答を１．７倍増加させ（２５，８１３ＳＦＵ）（ｎ＝３）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の減少は、総抗原特異的応答を２．０倍増加させ（３０，６４０ＳＦＵ）（ｎ＝３）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＣＤ４７、およびＣＤ２７６の減少は、総ＴＡＡ応答を２．０倍増加させた（２９，９９３ＳＦＵ）（ｎ＝３）（図３７Ｂ）。特定の抗原に対する応答は、図の凡例に示されている順序になっている。データは、ＣＤ４７および／またはＣＤ２７６の減少と、それ同時のＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌の減少の両方が、ＴＡＡ特異的なＩＦＮγ産生の増加を促進し得ることを示唆している。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ＨＬＡ－Ａ０２（図３７Ａ）、ＨＬＡ－Ａ０３（図３７Ａ）、およびＨＬＡ－Ａ２４（図３７Ｂ）の健常ドナーに由来する細胞を利用して、Ａ５４９細胞株におけるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２、ＣＤ２７６、ＣＤ４７の改変が、未改変親細胞株と比較して、免疫応答を増強したかどうかを決定した。実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを完了した。改変細胞株は、未改変親細胞株（２，２３３±４９３ＳＦＵ）（ｎ＝１１）と比較して、ＩＦＮγ応答を２６．８倍（８３±２９ＳＦＵ）（ｎ＝１１）増加させた（ｐ＝０．００９１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図３７Ａ）。１０の抗原に対する応答を、未改変親細胞株、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ、およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ ＣＤ４７ＫＯ Ａ５４９改変細胞株について評価した。未改変親細胞株（１５，１４０ＳＦＵ）（ｎ＝３）によって誘導される総ＴＡＡ応答と比較して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ４７の減少は、総抗原特異的応答を１．７倍増加させ（２５，８１３ＳＦＵ）（ｎ＝３）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の減少は、総抗原特異的応答を２．０倍増加させ（３０，６４０ＳＦＵ）（ｎ＝３）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＣＤ４７、およびＣＤ２７６の減少は、総ＴＡＡ応答を２．０倍増加させた（２９，９９３ＳＦＵ）（ｎ＝３）（図３７Ｂ）。特定の抗原に対する応答は、図の凡例に示されている順序になっている。データは、ＣＤ４７および／またはＣＤ２７６の減少と、それ同時のＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌の減少の両方が、ＴＡＡ特異的なＩＦＮγ産生の増加を促進し得ることを示唆している。
実施例１５：膜結合ＣＤ１５４（膜結合ＣＤ４０リガンド）の発現は、細胞性免疫応答を増強する
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、炎症性条件下でＴ細胞および他の非免疫細胞で一時的に発現し、Ｂ細胞および専門抗原提示細胞の共刺激分子ＣＤ４０に結合する。ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合は、適応免疫、細胞性免疫、および体液性免疫の複数の様相を上方制御する。
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、炎症性条件下でＴ細胞および他の非免疫細胞で一時的に発現し、Ｂ細胞および専門抗原提示細胞の共刺激分子ＣＤ４０に結合する。ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合は、適応免疫、細胞性免疫、および体液性免疫の複数の様相を上方制御する。
Ａ５４９細胞株における膜結合ＣＤ４０Ｌの発現
ＡＤＡＭ１７による切断を減少させ、それによって、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を促進するように改変されたＣＤ４０Ｌ配列を発現するレンチウイルス粒子で、細胞株Ａ５４９細胞株を形質導入した。親未改変細胞株が、対照として機能した。ＣＤ４０Ｌを安定的に発現する細胞を濃縮するために、２００μｇ／ｍＬで抗生物質選択した後、フローサイトメトリーを使用して細胞表面でのＣＤ４０Ｌの発現を分析し、ＥＬＩＳＡによって可溶化ＣＤ４０Ｌを検出した。この実施例で使用された膜結合ＣＤ４０Ｌの配列は、配列番号１に示されている。
ＡＤＡＭ１７による切断を減少させ、それによって、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を促進するように改変されたＣＤ４０Ｌ配列を発現するレンチウイルス粒子で、細胞株Ａ５４９細胞株を形質導入した。親未改変細胞株が、対照として機能した。ＣＤ４０Ｌを安定的に発現する細胞を濃縮するために、２００μｇ／ｍＬで抗生物質選択した後、フローサイトメトリーを使用して細胞表面でのＣＤ４０Ｌの発現を分析し、ＥＬＩＳＡによって可溶化ＣＤ４０Ｌを検出した。この実施例で使用された膜結合ＣＤ４０Ｌの配列は、配列番号１に示されている。
膜結合ＣＤ４０Ｌの発現のレベルを決定するために、未改変親細胞と改変細胞をＰＥ結合ヒト抗ＣＤ４０Ｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＴＲＡＰ１）で染色した。未改変親Ａ５４９細胞株（１７０２ＭＦＩ）と比較して、細胞表面のＣＤ４０Ｌの発現が２５．５倍増加した（４３，４６６ＭＦＩ）（図３８Ａ）。
可溶化ＣＤ４０Ｌを、ＥＬＩＳＡによって定量化した。ＣＤ４０Ｌを形質導入した未改変親細胞を、通常の増殖培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）中、２４ウェルプレートに、８．３３×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングして２４時間後、付着細胞を、完全に洗浄して、ＦＢＳを除去し、ＲＰＭＩ＋５％ ＣＴＳで培養を続けた。培地交換して４８時間後、細胞培養上清を回収し、製造元の説明書に従って（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＤＣＤＬ４０）、アッセイが完了するまで、－７０℃で保存した。ヒトＣＤ４０Ｌの定量化下限は、６２．５ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．３７５ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。ＣＤ４０Ｌの過剰発現により、２．９３ｎｇ／１０6細胞／２４時間のｓＣＤ４０Ｌが得られた（図３８Ｂ）。
ＤＣ成熟化に対するＡ５４９ ＣＤ４０Ｌの発現の効果は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。ｉＤＣ、ならびにＡ５４９未改変親細胞、外因性ｓＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍＬ）を含む未改変親細胞（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，＃ＡＦ３１００２１００ＵＧ）、または膜結合ＣＤ４０Ｌを過剰発現するＡ５４９細胞を、１：１の比率で、９６ウェル低接着性Ｕ底プレートで共培養した。２４時間インキュベーションした後、共培養物を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ａｑｕａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃Ｌ２３１０５）、αＣＤ４５－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＨＩ３０）、およびαＣＤ１１ｃ－ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＢ－ｌｙ６）、およびαＣＤ８３－ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＨＢ１５ｅ）で表面染色した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用して分析した。ＤＣ成熟化の増加は、生存ＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＣＤ８３+ＤＣ（％）の増加として定義した。ＤＣの成熟化を、７人のＨＬＡ多様健常ドナーについて評価した。
Ａ５４９のＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株（１０±３）と比較して、生存ＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＣＤ８３+ＤＣの割合（％）を３．９倍（４０±５）有意に増加させた（ｐ＜０．００１、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝７）。外因性ｓＣＤ４０Ｌは、生存ＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＣＤ８３+（１６±３）ＤＣの割合（％）を有意に増加させなかった（ｐ＝０．４４０２、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝７）（図３８Ｃ）。
膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は細胞性免疫応答を増強する
細胞性免疫応答の誘導に対するＣＤ４０Ｌの過剰発現の効果は、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。ロードされたｉＤＣに、Ａ５４９細胞、１μｇ／ｍＬの外因性ｓＣＤ４０Ｌを含むＡ５４９細胞、またはＣＤ４０Ｌを過剰発現するＡ５４９細胞がロードされた。Ａ５４９細胞によるＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株（１５±１５ＳＦＵ）と比較して、ＩＦＮγ応答を８７倍（１，３０５±４３８ＳＦＵ）増加させた（ｐ＝０．０１９８、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝４）。外因性ｓＣＤ４０Ｌを共培養に含めても、未改変親細胞株と比較して、ＩＦＮγ応答は有意に増加しなかった（２５５±１０３ＳＦＵ）（ｐ＝０．５３０３、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝４）。Ａ５４９細胞上のＣＤ４０Ｌの過剰発現によって誘発されるＩＦＮγ応答は、外因性ｓＣＤ４０Ｌの添加による検出された応答よりも有意に大きかった（ｐ＝０．０３７５、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝４）（図３８Ｄ）。
細胞性免疫応答の誘導に対するＣＤ４０Ｌの過剰発現の効果は、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。ロードされたｉＤＣに、Ａ５４９細胞、１μｇ／ｍＬの外因性ｓＣＤ４０Ｌを含むＡ５４９細胞、またはＣＤ４０Ｌを過剰発現するＡ５４９細胞がロードされた。Ａ５４９細胞によるＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株（１５±１５ＳＦＵ）と比較して、ＩＦＮγ応答を８７倍（１，３０５±４３８ＳＦＵ）増加させた（ｐ＝０．０１９８、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝４）。外因性ｓＣＤ４０Ｌを共培養に含めても、未改変親細胞株と比較して、ＩＦＮγ応答は有意に増加しなかった（２５５±１０３ＳＦＵ）（ｐ＝０．５３０３、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝４）。Ａ５４９細胞上のＣＤ４０Ｌの過剰発現によって誘発されるＩＦＮγ応答は、外因性ｓＣＤ４０Ｌの添加による検出された応答よりも有意に大きかった（ｐ＝０．０３７５、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定）（ｎ＝４）（図３８Ｄ）。
実施例１６：ＧＭ－ＣＳＦの発現は細胞性免疫応答を増強する
未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、空のレンチウイルスベクター（対照）またはＧＭ－ＣＳＦを過剰発現するように設計されたレンチウイルスベクター（配列番号６）のいずれかでトランスフェクトした。対照細胞株およびＧＭ－ＣＳＦ過剰発現細胞株を、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。実施例６に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。図３９は、健常ドナー（ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２）由来ＰＢＭＣを、ＧＭ－ＣＳＦ過剰発現ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞で感作させると、対照ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞による感作と比較した場合（１１６３±１８３ＳＦＵ）、未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞に対する細胞性免疫応答が有意に増加することを示す（２６００±２０７ＳＦＵ）（ｐ＝０．００２）。
未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、空のレンチウイルスベクター（対照）またはＧＭ－ＣＳＦを過剰発現するように設計されたレンチウイルスベクター（配列番号６）のいずれかでトランスフェクトした。対照細胞株およびＧＭ－ＣＳＦ過剰発現細胞株を、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。実施例６に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。図３９は、健常ドナー（ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２）由来ＰＢＭＣを、ＧＭ－ＣＳＦ過剰発現ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞で感作させると、対照ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞による感作と比較した場合（１１６３±１８３ＳＦＵ）、未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞に対する細胞性免疫応答が有意に増加することを示す（２６００±２０７ＳＦＵ）（ｐ＝０．００２）。
実施例１７：インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）の発現は細胞性免疫応答を増強する
ＩＬ－１２は、炎症誘発性サイトカインであり、Ｔ細胞をエフェクター表現型へとプライミングするように、ＤＣおよびＬＣを誘導する。ＩＬ－１２は、ＤＣに直接作用して、免疫寛容の誘導を逆転または防止することもできる。
ＩＬ－１２は、炎症誘発性サイトカインであり、Ｔ細胞をエフェクター表現型へとプライミングするように、ＤＣおよびＬＣを誘導する。ＩＬ－１２は、ＤＣに直接作用して、免疫寛容の誘導を逆転または防止することもできる。
Ａ５４９細胞を、ＩＬ－１２のｐ４０鎖とｐ３５鎖の両方を発現するレンチウイルス粒子で形質導入して、機能的なＩＬ－１２ ｐ７０サイトカインタンパク質を形成した。ｐ４０およびｐ３５の配列は、Ｐ２Ａ切断配列によって分離される。この実施例で使用されたＩＬ－１２の配列は、配列番号９に示されている。未改変親、未改変細胞株が、対照として機能した。６００μｇ／ｍＬのゼオシンで抗生物質選択して、親細胞株およびＩＬ－１２改変細胞株によって生成されたＩＬ－１２免疫応答を安定的に発現する細胞を濃縮した後、実施例９に記載されているように決定した。未改変親細胞（５３±５３ＳＦＵ）によって誘導されるＩＦＮγ応答と比較して、ＩＬ－１２の発現によりＩＦＮγ ＳＦＵが１６倍増加した（８７３±１９９ＳＦＵ）（ｎ＝３）（ｐ＝０．０１６３、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝３）（図４０）。
実施例１８：グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）の発現は細胞性免疫応答を増強する
ＧＩＴＲは、表面受容体分子であり、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性の阻害およびエフェクターＴ細胞の延命に関与する。ＧＩＴＲがそのリガンドに結合すると、ＡＰＣ上のＧＩＴＲは、シグナル伝達を誘発し、これが、ＣＤ８+エフェクターＴ細胞およびＣＤ４+エフェクターＴ細胞の両方を共刺激し、Ｔｒｅｇの活性を抑制しながら、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を強化する。
ＧＩＴＲは、表面受容体分子であり、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性の阻害およびエフェクターＴ細胞の延命に関与する。ＧＩＴＲがそのリガンドに結合すると、ＡＰＣ上のＧＩＴＲは、シグナル伝達を誘発し、これが、ＣＤ８+エフェクターＴ細胞およびＣＤ４+エフェクターＴ細胞の両方を共刺激し、Ｔｒｅｇの活性を抑制しながら、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を強化する。
ＧＩＴＲの発現
コドン最適化配列は、ＧＩＴＲの天然の膜結合バリアント（ＮＰ＿００４１８６）に基づいて生成され、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｖ２６０２０）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングされた。この実施例で使用されたＧＩＴＲの配列は、配列番号４に示されている。ＧＩＴＲをコードするｐＶＡＸ１を使用した細胞のトランスフェクションの場合、Ａ５４９（５．３８×１０6細胞）、ＮＣＩ－Ｈ４６０（１．７９×１０7細胞）、ＬＫ－２（２．３９×１０7細胞）、またはＮＣＩ－Ｈ５２０（１．０２×１０7細胞）を、トランスフェクションの１８～２４時間前に、４５ｍＬの完全培地を使用して、Ｔ１７５フラスコにプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２に維持した。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２０７５０８４）を使用して、製造元の説明書に従って実施した。フローサイトメトリーによるＧＩＴＲ発現の評価の前に、細胞を、３７℃および５％ＣＯ2で７２時間インキュベートした。
コドン最適化配列は、ＧＩＴＲの天然の膜結合バリアント（ＮＰ＿００４１８６）に基づいて生成され、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｖ２６０２０）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングされた。この実施例で使用されたＧＩＴＲの配列は、配列番号４に示されている。ＧＩＴＲをコードするｐＶＡＸ１を使用した細胞のトランスフェクションの場合、Ａ５４９（５．３８×１０6細胞）、ＮＣＩ－Ｈ４６０（１．７９×１０7細胞）、ＬＫ－２（２．３９×１０7細胞）、またはＮＣＩ－Ｈ５２０（１．０２×１０7細胞）を、トランスフェクションの１８～２４時間前に、４５ｍＬの完全培地を使用して、Ｔ１７５フラスコにプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２に維持した。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２０７５０８４）を使用して、製造元の説明書に従って実施した。フローサイトメトリーによるＧＩＴＲ発現の評価の前に、細胞を、３７℃および５％ＣＯ2で７２時間インキュベートした。
ＧＩＴＲの細胞表面発現を測定するために、トランスフェクトされた細胞および未改変親対照を、ＢＶ４２１結合マウス抗ヒトＧＩＴＲ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＶ２７－５８０）で表面染色した。フローサイトメトリーのデータは、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＧＩＴＲの最小発現は、トランスフェクトされていない未改変親細胞株で検出された（各細胞株についてｎ＝３）（図４１）。ＧＩＴＲは、トランスフェクトされたＮＣＩ－Ｈ５２０細胞の１７．７±０．１％（ｎ＝３）（図４１Ａ）、トランスフェクトされたＬＫ－２細胞の２９．３±３．３％（ｎ＝３）（図４１Ｂ）、発現した。トランスフェクトされたＡ５４９細胞の７．７±０．２％（ｎ＝３）（図４１Ｃ）、およびトランスフェクトされたＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の１４．１±０．９％（ｎ＝３）（図４１Ｄ）で発現した。
ＧＩＴＲの発現は細胞性免疫応答を増強する
細胞免疫原性に対するＧＩＴＲの発現の効果は、２人のＨＬＡ－Ａ０２ドナーおよび１人のＨＬＡ－Ａ２４健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。Ａ５４９細胞株によるＧＩＴＲの発現は、未改変親Ａ５４９細胞株と比較して（１２８±３８ＳＦＵ）（ｎ＝９）、ＩＦＮγ産生を７．４倍有意に増加させた（９４７±２１７ＳＦＵ）（ｎ＝９）（ｐ＝０．０００３、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図４２Ａ）。未改変親細胞株と比較して（７７３±２５５ＳＦＵ）（ｎ＝９）、ＬＫ－２細胞株（１，０５３±４４９ＳＦＵ）（ｎ＝９）では、ＧＩＴＲの発現により、ＩＦＮγ産生が増加する傾向があった（図４２Ｂ）。未改変親、未改変細胞（１，９５３±３８５ＳＦＵ）（ｎ＝３）と比較して、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株（２，９５３±５０４ＳＦＵ）（ｎ＝３）では、ＧＩＴＲ発現により免疫原性が増加する傾向があった（図４２Ｃ）。未改変親細胞（３，４００±１８１ＳＦＵ）（ｎ＝３）と比較して、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株でも、ＧＩＴＲ発現により免疫原性が増加する傾向があった（４，９４０±５５７ＳＦＵ）（図４２Ｄ）。
細胞免疫原性に対するＧＩＴＲの発現の効果は、２人のＨＬＡ－Ａ０２ドナーおよび１人のＨＬＡ－Ａ２４健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。Ａ５４９細胞株によるＧＩＴＲの発現は、未改変親Ａ５４９細胞株と比較して（１２８±３８ＳＦＵ）（ｎ＝９）、ＩＦＮγ産生を７．４倍有意に増加させた（９４７±２１７ＳＦＵ）（ｎ＝９）（ｐ＝０．０００３、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図４２Ａ）。未改変親細胞株と比較して（７７３±２５５ＳＦＵ）（ｎ＝９）、ＬＫ－２細胞株（１，０５３±４４９ＳＦＵ）（ｎ＝９）では、ＧＩＴＲの発現により、ＩＦＮγ産生が増加する傾向があった（図４２Ｂ）。未改変親、未改変細胞（１，９５３±３８５ＳＦＵ）（ｎ＝３）と比較して、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株（２，９５３±５０４ＳＦＵ）（ｎ＝３）では、ＧＩＴＲ発現により免疫原性が増加する傾向があった（図４２Ｃ）。未改変親細胞（３，４００±１８１ＳＦＵ）（ｎ＝３）と比較して、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株でも、ＧＩＴＲ発現により免疫原性が増加する傾向があった（４，９４０±５５７ＳＦＵ）（図４２Ｄ）。
例１９：インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の発現は細胞性免疫応答を増強する
ＩＬ－１５は、サイトカインの４つのαヘリックスバンドルファミリーのメンバーであり、ＤＣを含む幅広い細胞によって産生され、ＣＤ８+メモリーＴ細胞の分化に不可欠である。２つの異なるＮ末端シグナルペプチドをコードする２つのアイソフォームのＩＬ－１５が天然に発現している。これらのシグナルペプチドは、腫瘍細胞からのＩＬ－１５タンパク質の分泌を減少させるかまたは阻害するように機能する。ＩＬ－１５のコドン最適化配列が生成され、天然ＩＬ－１５の長いシグナルペプチド領域がＩＬ－２シグナルペプチドに置き換えられ、ＩＬ－１５タンパク質（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の分泌が促進された。コドン最適化配列は、ｐＶＡＸ１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローにングされた。この実施例で使用されたＩＬ－１５の配列は、配列番号１１に示されている。
ＩＬ－１５は、サイトカインの４つのαヘリックスバンドルファミリーのメンバーであり、ＤＣを含む幅広い細胞によって産生され、ＣＤ８+メモリーＴ細胞の分化に不可欠である。２つの異なるＮ末端シグナルペプチドをコードする２つのアイソフォームのＩＬ－１５が天然に発現している。これらのシグナルペプチドは、腫瘍細胞からのＩＬ－１５タンパク質の分泌を減少させるかまたは阻害するように機能する。ＩＬ－１５のコドン最適化配列が生成され、天然ＩＬ－１５の長いシグナルペプチド領域がＩＬ－２シグナルペプチドに置き換えられ、ＩＬ－１５タンパク質（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の分泌が促進された。コドン最適化配列は、ｐＶＡＸ１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローにングされた。この実施例で使用されたＩＬ－１５の配列は、配列番号１１に示されている。
ＩＬ－１５の分泌の定量化
実施例１８に記載されているように、ＩＬ－１５をコードするプラスミドのトランスフェクションを完了した。ヒトＩＬ－１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ１５００）を使用し、製造元の説明書に従って、ＥＬＩＳＡにより、分泌されたＩＬ－１５の存在について上清をアッセイした。ＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡの定量化下限は、３．９８ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．０２３９ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＬＫ－２、ＮＣＩ－Ｈ４６０、およびＡ５４９細胞株は、それぞれ、９．０４、５．９９、５９．４３、および３４．７４ｎｇ／１０6細胞／２４時間のＩＬ－１５を発現した（図４３Ａ）。
実施例１８に記載されているように、ＩＬ－１５をコードするプラスミドのトランスフェクションを完了した。ヒトＩＬ－１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ１５００）を使用し、製造元の説明書に従って、ＥＬＩＳＡにより、分泌されたＩＬ－１５の存在について上清をアッセイした。ＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡの定量化下限は、３．９８ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．０２３９ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＬＫ－２、ＮＣＩ－Ｈ４６０、およびＡ５４９細胞株は、それぞれ、９．０４、５．９９、５９．４３、および３４．７４ｎｇ／１０6細胞／２４時間のＩＬ－１５を発現した（図４３Ａ）。
ＩＬ－１５は細胞性免疫応答を増強する
細胞性免疫応答に対するＩＬ－１５の効果を評価するためのＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、実施例９に記載されているように完了した。細胞性免疫応答に対するＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＩＬ－１５分泌の効果は、ＨＬＡ－Ａ０２の健常ドナー（ｎ＝３）に由来する免疫細胞を使用して評価した。未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株（４，３６０±８０６ＳＦＵ）と比較して、ＩＬ－１５過剰発現（５，５９３±４７４ＳＦＵ）によりＩＦＮγ産生が増加する傾向があった（図４３Ｂ）。
細胞性免疫応答に対するＩＬ－１５の効果を評価するためのＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、実施例９に記載されているように完了した。細胞性免疫応答に対するＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＩＬ－１５分泌の効果は、ＨＬＡ－Ａ０２の健常ドナー（ｎ＝３）に由来する免疫細胞を使用して評価した。未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株（４，３６０±８０６ＳＦＵ）と比較して、ＩＬ－１５過剰発現（５，５９３±４７４ＳＦＵ）によりＩＦＮγ産生が増加する傾向があった（図４３Ｂ）。
実施例２０：インターロイキン－２３（ＩＬ－２３）の発現は細胞性免疫応答を増強する
ＩＬ－２３は、４ヘリックスバンドルサイトカイン（ｐ１９）と可溶性クラスＩサイトカイン受容体ｐ４０のバイナリー複合体である。ＩＬ－２３は、炎症性サイトカインとして機能し、ＤＣの成熟化を促進し、ナイーブＴ細胞由来ＴｒｅｇのＤＣ活性化を抑制する。
ＩＬ－２３は、４ヘリックスバンドルサイトカイン（ｐ１９）と可溶性クラスＩサイトカイン受容体ｐ４０のバイナリー複合体である。ＩＬ－２３は、炎症性サイトカインとして機能し、ＤＣの成熟化を促進し、ナイーブＴ細胞由来ＴｒｅｇのＤＣ活性化を抑制する。
ＩＬ－２３の発現
ヒトコドン最適化ＩＬ－２３ｐ１９およびｐ４０配列が生成され、ｐＶＡＸ１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローニングされた。ｐ１９およびｐ４０配列は、柔軟なリンカーであるＧＳ3リンカーによって分離された。この実施例で使用されたＩＬ－２３の配列は、配列番号１３に示されている。実施例１８に記載されているようにトランスフェクションを完了した。
ヒトコドン最適化ＩＬ－２３ｐ１９およびｐ４０配列が生成され、ｐＶＡＸ１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローニングされた。ｐ１９およびｐ４０配列は、柔軟なリンカーであるＧＳ3リンカーによって分離された。この実施例で使用されたＩＬ－２３の配列は、配列番号１３に示されている。実施例１８に記載されているようにトランスフェクションを完了した。
ヒトＩＬ－２３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ２３００Ｂ）を使用し、製造元の説明書に従って、分泌される機能的なＩＬ－２３（ｐ１９とｐ４０のダイマー）の存在について上清をアッセイした。ＩＬ－２３ ＥＬＩＳＡの定量化下限は、３９．１ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．２３５ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。ＬＫ－２およびＡ５４９細胞株は、それぞれ１，５５９および１，９２９ｎｇ／１０6細胞／２４時間のＩＬ－２３を発現した（図４４Ａ）。
ＩＬ－２３の分泌は細胞性免疫応答を増加させる
細胞性免疫応答に対するＩＬ－２３の効果を評価するためのＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、実施例９に記載されているように完了した。細胞性免疫応答に対するＡ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株によるＩＬ－１５の分泌の効果は、ＨＬＡ－Ａ０２の健常ドナーに由来する免疫細胞を使用して評価された。未改変親Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株（５７３±４０１ＳＦＵ）と比較して、ＩＬ－２３過剰発現によるＩＦＮγ産生の有意な３．９倍の増加があった（２，２４７±５８０ＳＦＵ）（図４４Ｂ）（ｐ＝０．０２８４、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（ｎ＝３）。
細胞性免疫応答に対するＩＬ－２３の効果を評価するためのＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、実施例９に記載されているように完了した。細胞性免疫応答に対するＡ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株によるＩＬ－１５の分泌の効果は、ＨＬＡ－Ａ０２の健常ドナーに由来する免疫細胞を使用して評価された。未改変親Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株（５７３±４０１ＳＦＵ）と比較して、ＩＬ－２３過剰発現によるＩＦＮγ産生の有意な３．９倍の増加があった（２，２４７±５８０ＳＦＵ）（図４４Ｂ）（ｐ＝０．０２８４、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（ｎ＝３）。
実施例２１：Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＸＣＬ１）の発現
リンホタクチンとしても知られるサイトカインＸＣＬ１は、抗原交差提示ＤＣ上で選択的に発現されるケモカイン受容体ＸＣＲ１に結合する。ＸＣＬ１の発現は、皮内ワクチン投与のアジュバントとして機能する可能性がある。
リンホタクチンとしても知られるサイトカインＸＣＬ１は、抗原交差提示ＤＣ上で選択的に発現されるケモカイン受容体ＸＣＲ１に結合する。ＸＣＬ１の発現は、皮内ワクチン投与のアジュバントとして機能する可能性がある。
ＸＣＬ１の発現
ヒトＸＣＬ１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をコードするヒトコドン最適化配列が生成され、ｐＶＡＸ１プラスミドのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローニングされた。ＸＣＬ１の一過的な発現および分泌は、ＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。この実施例で使用されたＸＣＬ１の配列は、配列番号１５に示されている。
ヒトＸＣＬ１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をコードするヒトコドン最適化配列が生成され、ｐＶＡＸ１プラスミドのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローニングされた。ＸＣＬ１の一過的な発現および分泌は、ＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。この実施例で使用されたＸＣＬ１の配列は、配列番号１５に示されている。
ＸＣＬ１の分泌の定量化
ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＡ５４９細胞は、実施例１８に記載されているように、コドン最適化ＸＣＬ１をコードするｐＶＡＸ１でトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、細胞から上清を除去し、ＥＬＩＳＡによって分泌されたＸＣＬ１の存在についてアッセイした。製造元の説明書（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＤＸＣＬ１０）に従って、上清をＸＣＬ１分泌についてアッセイした。ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＡ５４９細胞株は、それぞれ４１８および１４４およびｎｇ／１０6細胞／２４時間のＸＣＬ１を一過的に発現した（図４５）。
ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＡ５４９細胞は、実施例１８に記載されているように、コドン最適化ＸＣＬ１をコードするｐＶＡＸ１でトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、細胞から上清を除去し、ＥＬＩＳＡによって分泌されたＸＣＬ１の存在についてアッセイした。製造元の説明書（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＤＸＣＬ１０）に従って、上清をＸＣＬ１分泌についてアッセイした。ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＡ５４９細胞株は、それぞれ４１８および１４４およびｎｇ／１０6細胞／２４時間のＸＣＬ１を一過的に発現した（図４５）。
実施例２２：メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）（ＭＳＬＮ）の発現
ＭＳＬＮは、多くの肺腺癌の表面に発現しており、その発現は予後不良と相関している。ＭＳＬＮに対する抗原特異的免疫応答は、卵巣癌、肺癌、黒色腫を含むいくつかの異なる原発腫瘍に起因する脳転移を有する患者の生存を予測することができるため、ＭＳＬＮは魅力的なＴＡＡ標的である。多くの患者の腫瘍でＭＳＬＮが発現しているにもかかわらず、肺癌細胞株の小さなサブセットでＭＳＬＮが発現している。実施例２２において、ＭＳＬＮの発現は、ＭＳＬＮを天然に発現しない例示的なワクチン細胞株に遺伝的に導入され、ＮＳＣＬＣの患者にとって潜在的に重要なＴＡＡの適用範囲を拡大した。
ＭＳＬＮは、多くの肺腺癌の表面に発現しており、その発現は予後不良と相関している。ＭＳＬＮに対する抗原特異的免疫応答は、卵巣癌、肺癌、黒色腫を含むいくつかの異なる原発腫瘍に起因する脳転移を有する患者の生存を予測することができるため、ＭＳＬＮは魅力的なＴＡＡ標的である。多くの患者の腫瘍でＭＳＬＮが発現しているにもかかわらず、肺癌細胞株の小さなサブセットでＭＳＬＮが発現している。実施例２２において、ＭＳＬＮの発現は、ＭＳＬＮを天然に発現しない例示的なワクチン細胞株に遺伝的に導入され、ＮＳＣＬＣの患者にとって潜在的に重要なＴＡＡの適用範囲を拡大した。
ＭＳＬＮの発現
細胞膜でのＭＳＬＮの保持を促進するために、ＡＤＡＭ１７切断部位が柔軟なリンカーで置き換えられたコドン最適化ヒトＭＳＬＮ配列が生成された（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。コドン最適化配列は、ｐＶＡＸ１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローにングされた。この実施例で使用されたＭＳＬＮの配列は、配列番号１７である。
細胞膜でのＭＳＬＮの保持を促進するために、ＡＤＡＭ１７切断部位が柔軟なリンカーで置き換えられたコドン最適化ヒトＭＳＬＮ配列が生成された（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。コドン最適化配列は、ｐＶＡＸ１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローにングされた。この実施例で使用されたＭＳＬＮの配列は、配列番号１７である。
ＭＳＬＮの発現の定量化
実施例１８に記載されているように、ＭＳＬＮをコードするプラスミドのトランスフェクションを完了した。ＭＳＬＮの細胞表面発現を測定するために、トランスフェクトされた細胞および未改変親対照を、ＰＥ結合ラット抗ヒトＭＳＬＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＡＢ３２６５２Ｐ）で表面染色した。フローサイトメトリーのデータは、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＭＳＬＮの最小発現は、トランスフェクトされていない、未改変親細胞株（ｎ＝３／細胞株）で検出された（図４６）。ＭＳＬＮは、トランスフェクトされたＮＣＩ－Ｈ５２０細胞の３４．７±２．２％（ｎ＝３）（図４６Ａ）、トランスフェクトされたＬＫ－２細胞の４１．４±０．７％（ｎ＝３）（図４６Ｂ）、トランスフェクトされたＡ５４９細胞の３４．６±０．７％（ｎ＝３）（図４６Ｃ）、およびトランスフェクトされたＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の４８．５±１．３％（ｎ＝３）で発現した（図４６Ｄ）。
実施例１８に記載されているように、ＭＳＬＮをコードするプラスミドのトランスフェクションを完了した。ＭＳＬＮの細胞表面発現を測定するために、トランスフェクトされた細胞および未改変親対照を、ＰＥ結合ラット抗ヒトＭＳＬＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＡＢ３２６５２Ｐ）で表面染色した。フローサイトメトリーのデータは、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＭＳＬＮの最小発現は、トランスフェクトされていない、未改変親細胞株（ｎ＝３／細胞株）で検出された（図４６）。ＭＳＬＮは、トランスフェクトされたＮＣＩ－Ｈ５２０細胞の３４．７±２．２％（ｎ＝３）（図４６Ａ）、トランスフェクトされたＬＫ－２細胞の４１．４±０．７％（ｎ＝３）（図４６Ｂ）、トランスフェクトされたＡ５４９細胞の３４．６±０．７％（ｎ＝３）（図４６Ｃ）、およびトランスフェクトされたＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の４８．５±１．３％（ｎ＝３）で発現した（図４６Ｄ）。
ＭＳＬＮ特異的ＩＦＮγ応答
過剰発現したＭＳＬＮ抗原に対する免疫応答は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって特徴付けられた。このアッセイでＭＳＬＮ特異的応答を検出するために、１１アミノ酸が重複する１５アミノ酸長のペプチドを生成して、天然タンパク質であるＭＳＬＮタンパク質をカバーし、実施例８に記載されているように、ＰＢＭＣを刺激するために使用した。ＬＫ－２で過剰発現されたＭＳＬＮタンパク質（２４０ＳＦＵ）に対するＩＦＮγ応答（図４６Ｅ）。
過剰発現したＭＳＬＮ抗原に対する免疫応答は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって特徴付けられた。このアッセイでＭＳＬＮ特異的応答を検出するために、１１アミノ酸が重複する１５アミノ酸長のペプチドを生成して、天然タンパク質であるＭＳＬＮタンパク質をカバーし、実施例８に記載されているように、ＰＢＭＣを刺激するために使用した。ＬＫ－２で過剰発現されたＭＳＬＮタンパク質（２４０ＳＦＵ）に対するＩＦＮγ応答（図４６Ｅ）。
実施例２３：北九州（Ｋｉｔａ－Ｋｙｕｓｈｕ）肺癌抗原１（ＣＴ８３）の発現
ＣＴ８３は、非小細胞肺癌組織の４０％、およびステージ１ＮＳＣＬＣの３１％で発現している。ＣＴ８３は、正常組織と比較して肺腫瘍で高度に発現している。ＣＴ８３の発現は、典型的に、予後不良とも関連している。実施例２３において、ＣＴ８３の発現は、ＣＴ８３を天然に発現しない例示的なワクチン細胞株に遺伝的に導入され、一部のＮＳＣＬＣ患者に潜在的に関連するＴＡＡの適用範囲を拡大した。
ＣＴ８３は、非小細胞肺癌組織の４０％、およびステージ１ＮＳＣＬＣの３１％で発現している。ＣＴ８３は、正常組織と比較して肺腫瘍で高度に発現している。ＣＴ８３の発現は、典型的に、予後不良とも関連している。実施例２３において、ＣＴ８３の発現は、ＣＴ８３を天然に発現しない例示的なワクチン細胞株に遺伝的に導入され、一部のＮＳＣＬＣ患者に潜在的に関連するＴＡＡの適用範囲を拡大した。
ＣＴ８３の発現
ヒトＣＴ８３のコドン最適化配列を生成し、コドン最適化ＭＳＬＮとインフレームでクローニングした（実施例１７）。配列番号２１を使用した。ＭＳＬＮおよびＣＴ８３のコード配列は、Ｐ２Ａ切断部位によって分離され、ｐＶＡＸ１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローニングされた。
ヒトＣＴ８３のコドン最適化配列を生成し、コドン最適化ＭＳＬＮとインフレームでクローニングした（実施例１７）。配列番号２１を使用した。ＭＳＬＮおよびＣＴ８３のコード配列は、Ｐ２Ａ切断部位によって分離され、ｐＶＡＸ１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位にクローニングされた。
ＣＴ８３の発現の特徴付け
ｐＶＡＸ１－ＭＳＬＮ－ＣＴ８３によるＣＴ８３の発現を、ウエスタンブロットによって決定した。実施例１８に記載されているようにトランスフェクションを完了した。トランスフェクトされた細胞は、１００μＬの１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃ＮＰ０００７）を添加することによって溶解し、室温で５分間インキュベートした。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、５分間超音波処理をして、粘度を下げた。試料を、７０℃で１０分間加熱し、次いで、４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした。ＢＬＵｅｌｆプレステインプロテインラダー（ＦｒｏｇｇａＢｉｏ，ＰＭ００８－０５００）は、タンパク質のサイズ標準として含まれた。１×ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００２）を使用して、還元条件下、ゲルを２００ボルトで約１時間電気泳動した。次いで、還元条件下、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）転写緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００６）、加えて２０％のメタノールを使用して、タンパク質をニトロセルロースに転写した。ブロッティングを、３０ボルトで１時間行った。ブロッティング後、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、加えてＴｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％のＢｌｏｔｔｏ（ＣｈｅｍＣｒｕｚ，ＤＣ２３２４）で、振盪（１００ｒｐｍ）しながら、室温で１時間ブロッキングした。次いで、ブロットを、ＴＢＳＴ－５％ Ｂｌｏｔｔｏ中の４μｇ／ｍＬの一次抗体抗ＣＴ８３ウサギポリクローナル（Ｓｉｇｍａ，ＨＰＡ００４７７３）で、４℃で一晩プローブした。翌日、ブロットを、ＴＢＳＴで５回洗浄し、次いで、ＴＢＳＴ－５％ Ｂｌｏｔｔｏ中の抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，４０３０－０５）の１：５，０００希釈液で、振とうしながら、室温で１時間プローブした。ブロットを、ＴＢＳＴで５回洗浄し、１ステップウルトラＴＭＢブロッティング溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３７５７４）を添加することによって発色させた（図４７）。
ｐＶＡＸ１－ＭＳＬＮ－ＣＴ８３によるＣＴ８３の発現を、ウエスタンブロットによって決定した。実施例１８に記載されているようにトランスフェクションを完了した。トランスフェクトされた細胞は、１００μＬの１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃ＮＰ０００７）を添加することによって溶解し、室温で５分間インキュベートした。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、５分間超音波処理をして、粘度を下げた。試料を、７０℃で１０分間加熱し、次いで、４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした。ＢＬＵｅｌｆプレステインプロテインラダー（ＦｒｏｇｇａＢｉｏ，ＰＭ００８－０５００）は、タンパク質のサイズ標準として含まれた。１×ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００２）を使用して、還元条件下、ゲルを２００ボルトで約１時間電気泳動した。次いで、還元条件下、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）転写緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００６）、加えて２０％のメタノールを使用して、タンパク質をニトロセルロースに転写した。ブロッティングを、３０ボルトで１時間行った。ブロッティング後、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、加えてＴｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％のＢｌｏｔｔｏ（ＣｈｅｍＣｒｕｚ，ＤＣ２３２４）で、振盪（１００ｒｐｍ）しながら、室温で１時間ブロッキングした。次いで、ブロットを、ＴＢＳＴ－５％ Ｂｌｏｔｔｏ中の４μｇ／ｍＬの一次抗体抗ＣＴ８３ウサギポリクローナル（Ｓｉｇｍａ，ＨＰＡ００４７７３）で、４℃で一晩プローブした。翌日、ブロットを、ＴＢＳＴで５回洗浄し、次いで、ＴＢＳＴ－５％ Ｂｌｏｔｔｏ中の抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，４０３０－０５）の１：５，０００希釈液で、振とうしながら、室温で１時間プローブした。ブロットを、ＴＢＳＴで５回洗浄し、１ステップウルトラＴＭＢブロッティング溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３７５７４）を添加することによって発色させた（図４７）。
実施例２４：免疫抑制因子の発現が減少したＡ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０における免疫刺激因子の発現
ＶＭＥにおける免疫抑制抑制因子の減少は、細胞性免疫応答を増強することができる。免疫抑制因子の産生が減少している状況でのＶＭＥにおける免疫刺激因子の発現は、強力な免疫応答を誘発するワクチンの能力をさらに増強するはずである。
ＶＭＥにおける免疫抑制抑制因子の減少は、細胞性免疫応答を増強することができる。免疫抑制因子の産生が減少している状況でのＶＭＥにおける免疫刺激因子の発現は、強力な免疫応答を誘発するワクチンの能力をさらに増強するはずである。
この実施例では、３つの免疫抑制因子の発現が低下したＡ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０成分ワクチン細胞株が、ＧＭ－ＣＳＦを分泌し、膜結合ＣＤ４０Ｌを発現し、かつ／または機能的なヘテロ二量体ＩＬ－１２ ｐ７０サイトカインを分泌するように改変された。ＧＭ－ＣＳＦが、インビトロでＩＦＮγ応答を増加させる能力は、実施例１６に記載されている。皮膚におけるＧＭ－ＣＳＦのインビボ発現は、ＤＣの活性化、成熟化、およびＤＣがより機能的なＴｈ１型免疫応答を促進する能力を強化する。単独で発現された場合の膜結合ＣＤ４０ＬおよびＩＬ－１２ ｐ７０の免疫刺激機能は、それぞれ、実施例１５および実施例１７に記載されている。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌のｓｈＲＮＡを介したノックダウン、ならびに得られる分泌レベルの決定に使用される方法は、実施例５に記載されている。ＣＤ４７およびＣＤ２７６のＺＦＮを介したノックアウト、ならびに得られる細胞表面発現レベルの決定に使用される方法は、それぞれ、実施例１２および実施例１３に記載されている。
一部の実施例では、３つの免疫抑制因子が減少した成分ワクチン細胞株を、ＧＭ－ＣＳＦを分泌し、かつ膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するように改変した。一部の実施例では、３つの免疫抑制因子が減少した成分ワクチン細胞株を、ＧＭ－ＣＳＦを分泌し、膜結合ＣＤ４０Ｌを発現し、かつ機能的なＩＬ－１２ ｐ７０サイトカインを分泌するように改変した。膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を定量化するために使用される方法は、本明細書に記載されている。
Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０によるＧＭ－ＣＳＦの分泌
ワクチン成分の細胞株Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０を、天然のヒトＧＭ－ＣＳＦを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。未改変親、未改変細胞株が、対照として機能した。１００μｇ／ｍＬで抗生物質選択して、ＧＭ－ＣＳＦを安定的に発現する細胞を濃縮した後、ＥＬＩＳＡによって、細胞のＧＭ－ＣＳＦの分泌を分析した。この実施例で使用されたＧＭ－ＣＳＦの配列は、配列番号６に示されている。
ワクチン成分の細胞株Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０を、天然のヒトＧＭ－ＣＳＦを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。未改変親、未改変細胞株が、対照として機能した。１００μｇ／ｍＬで抗生物質選択して、ＧＭ－ＣＳＦを安定的に発現する細胞を濃縮した後、ＥＬＩＳＡによって、細胞のＧＭ－ＣＳＦの分泌を分析した。この実施例で使用されたＧＭ－ＣＳＦの配列は、配列番号６に示されている。
分泌されたＧＭ－ＣＳＦの定量化
ＧＭ－ＣＳＦを形質導入した未改変親細胞を、通常の増殖培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）中、２４ウェルプレートに、８．３３×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングして２４時間後、付着細胞を、完全に洗浄して、ＦＢＳを除去し、ＲＰＭＩ＋５％ ＣＴＳで培養を続けた。培地交換して４８時間後、細胞培養上清を回収し、メーカーの仕様（ヒトＧＭ－ＣＳＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット＃ＤＧＭ００，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ＧＭ－ＣＳＦの分泌アッセイが完了するまで－７０℃で保存した。ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＧＭ－ＣＳＦの定量化下限は、３．０ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．０１８ｎｇ／１０6細胞／２４時間未満である。未改変親細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回った。
ＧＭ－ＣＳＦを形質導入した未改変親細胞を、通常の増殖培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）中、２４ウェルプレートに、８．３３×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングして２４時間後、付着細胞を、完全に洗浄して、ＦＢＳを除去し、ＲＰＭＩ＋５％ ＣＴＳで培養を続けた。培地交換して４８時間後、細胞培養上清を回収し、メーカーの仕様（ヒトＧＭ－ＣＳＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット＃ＤＧＭ００，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ＧＭ－ＣＳＦの分泌アッセイが完了するまで－７０℃で保存した。ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＧＭ－ＣＳＦの定量化下限は、３．０ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．０１８ｎｇ／１０6細胞／２４時間未満である。未改変親細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回った。
分泌されたＩＬ－１２ ｐ７０の定量化
ＩＬ－１２を形質導入した未改変親細胞を、通常の増殖培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）中、２４ウェルプレートに、８．３３×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングして２４時間後、付着細胞を、完全に洗浄して、ＦＢＳを除去し、ＲＰＭＩ＋５％ ＣＴＳで培養を続けた。培地交換して４８時間後、細胞培養上清を回収し、メーカーの仕様に従って（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ヒトＩＬ－１２ ｐ４０ ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ ＥＬＩＳＡキット＃４３０７０７およびヒトＩＬ－１２ ｐ７０ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ ＥＬＩＳＡキット ＃４３１７０７）、ｐ４０およびｐ７０のＩＬ－１２分泌アッセイが完了するまで－７０℃で保存した。ヒトＩＬ－１２ ｐ４０の定量化下限は、９．５ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．０５７ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。ヒトＩＬ－１２ ｐ７０の定量化下限は、１．２ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．００７ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。未改変親細胞株によるＩＬ－１２の分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回った。
ＩＬ－１２を形質導入した未改変親細胞を、通常の増殖培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ）中、２４ウェルプレートに、８．３３×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。プレーティングして２４時間後、付着細胞を、完全に洗浄して、ＦＢＳを除去し、ＲＰＭＩ＋５％ ＣＴＳで培養を続けた。培地交換して４８時間後、細胞培養上清を回収し、メーカーの仕様に従って（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ヒトＩＬ－１２ ｐ４０ ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ ＥＬＩＳＡキット＃４３０７０７およびヒトＩＬ－１２ ｐ７０ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ ＥＬＩＳＡキット ＃４３１７０７）、ｐ４０およびｐ７０のＩＬ－１２分泌アッセイが完了するまで－７０℃で保存した。ヒトＩＬ－１２ ｐ４０の定量化下限は、９．５ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．０５７ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。ヒトＩＬ－１２ ｐ７０の定量化下限は、１．２ｐｇ／ｍＬ、つまり、０．００７ｎｇ／１０6細胞／２４時間である。未改変親細胞株によるＩＬ－１２の分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回った。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が８６％（ｎ＝２）減少し（図４８Ａ）（表３２）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図４８Ｂ）（表３２）、ＣＤ４７の発現が９９．９％減少し（図４８Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが２，６５６±６９ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図４８Ｄ）（表３４）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が３８倍増加した（図４８Ｅ）（表３４）。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が＞９５％（ｎ＝２）減少し（図４９Ａ）（表３２）、ＴＧＦβ２の分泌が９３％（ｎ＝２）減少し（図４９Ｂ）（表３２）、ＣＤ４７の発現が９９．９％減少し（図４９Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが９４０±１９ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図４９Ｄ）（表３５）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が５倍増加した（図４９Ｅ）（表３４）。
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が８６％（ｎ＝２）減少し（図４８Ａ）（表３２）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図４８Ｂ）（表３２）、ＣＤ４７の発現が９９．９％減少し（図４８Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが２，６５６±６９ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図４８Ｄ）（表３４）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が３８倍増加した（図４８Ｅ）（表３４）。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が＞９５％（ｎ＝２）減少し（図４９Ａ）（表３２）、ＴＧＦβ２の分泌が９３％（ｎ＝２）減少し（図４９Ｂ）（表３２）、ＣＤ４７の発現が９９．９％減少し（図４９Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが９４０±１９ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図４９Ｄ）（表３５）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が５倍増加した（図４９Ｅ）（表３４）。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が＞９８％（ｎ＝２）減少し（図５０Ａ）（表３５）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図５０Ｂ）（表３５）、ＣＤ２７６の発現が９３．５％減少し（図５０Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが１，７０４±６０ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５０Ｄ）（表３４）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が４０倍増加した（図５０Ｅ）（表３４）。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が９３％（ｎ＝２）減少し（図５１Ａ）（表３２）、ＴＧＦβ２の分泌が８９％（ｎ＝２）減少し（図５１Ｂ）（表３２）、ＣＤ２７６の発現が９９．１％減少し（図５１Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが９４３±１３ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５１Ｄ）（表３４）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が７倍増加した（図５１Ｄ）（表３４）。
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が＞９８％（ｎ＝２）減少し（図５０Ａ）（表３５）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図５０Ｂ）（表３５）、ＣＤ２７６の発現が９３．５％減少し（図５０Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが１，７０４±６０ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５０Ｄ）（表３４）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が４０倍増加した（図５０Ｅ）（表３４）。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が９３％（ｎ＝２）減少し（図５１Ａ）（表３２）、ＴＧＦβ２の分泌が８９％（ｎ＝２）減少し（図５１Ｂ）（表３２）、ＣＤ２７６の発現が９９．１％減少し（図５１Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが９４３±１３ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５１Ｄ）（表３４）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が７倍増加した（図５１Ｄ）（表３４）。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯおよびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、細胞性免疫応答を増加させる
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯによるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、ならびにＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯによるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現の、Ａ５４９細胞株の細胞性免疫応答対する効果を評価した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、２人のＨＬＡ－Ａ０２健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように完了した。ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ（３，２１３±２８７）（ｎ＝６）（ｐ＝０．０３５７）およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ（３，２０７±６６３）（ｎ＝６）（ｐ＝０．０１４３）によるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親Ａ５４９細胞株（１，７９３±２１５ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、ＩＦＮγ応答を有意に増加させる（図５２Ａ）。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して決定された。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯによるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、ならびにＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯによるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現の、Ａ５４９細胞株の細胞性免疫応答対する効果を評価した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、２人のＨＬＡ－Ａ０２健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように完了した。ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ（３，２１３±２８７）（ｎ＝６）（ｐ＝０．０３５７）およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ（３，２０７±６６３）（ｎ＝６）（ｐ＝０．０１４３）によるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親Ａ５４９細胞株（１，７９３±２１５ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、ＩＦＮγ応答を有意に増加させる（図５２Ａ）。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して決定された。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現はＤＣの成熟化を増加させる
ｉＤＣの成熟は、実施例１５に記載されているようにフローサイトメトリーによって決定された。この例では、３人のＨＬＡ－Ａ０２ドナーに由来するｉＤＣを、未改変親Ａ５４９または未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株、あるいはＧＭ－ＣＳＦを分泌し、膜結合ＣＤ４０Ｌを発現する改変Ａ５４９またはＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯと共培養した。ＤＣ成熟化マーカーＣＤ８３の発現は、未改変親Ａ５４９細胞株と共培養したＤＣ（５３±３％）と比較して、改変Ａ５４９と共培養したＤＣ（７１±２％）で有意に増加した（ｐ＝０．００１５）（ｐ＝０．００１５）（図５２Ｂ）。同様に、ＣＤ８３は、未改変親Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株（５２±３％）と共培養したＤＣと比較して、改変ＮＣＩ－Ｈ４６０と共培養したＤＣ（７１±５％）で有意に増加した（ｐ＝０．０１２６）（図５２Ｃ）。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して決定された。
ｉＤＣの成熟は、実施例１５に記載されているようにフローサイトメトリーによって決定された。この例では、３人のＨＬＡ－Ａ０２ドナーに由来するｉＤＣを、未改変親Ａ５４９または未改変親ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株、あるいはＧＭ－ＣＳＦを分泌し、膜結合ＣＤ４０Ｌを発現する改変Ａ５４９またはＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯと共培養した。ＤＣ成熟化マーカーＣＤ８３の発現は、未改変親Ａ５４９細胞株と共培養したＤＣ（５３±３％）と比較して、改変Ａ５４９と共培養したＤＣ（７１±２％）で有意に増加した（ｐ＝０．００１５）（ｐ＝０．００１５）（図５２Ｂ）。同様に、ＣＤ８３は、未改変親Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株（５２±３％）と共培養したＤＣと比較して、改変ＮＣＩ－Ｈ４６０と共培養したＤＣ（７１±５％）で有意に増加した（ｐ＝０．０１２６）（図５２Ｃ）。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して決定された。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０ワクチン成分細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が８４％（ｎ＝２）減少し（図５３Ａ）（表３６）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図５３Ｂ）（表３６）、ＣＤ４７の発現が９９．９％減少し（図５３Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが２，２９５±６０ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５３Ｄ）（表３７）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が５６倍増加し（図５３Ｅ）（表３７）、ＩＬ－１２ ｐ７０が３００±２４ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌された（図５３Ｆ）（表３７）。
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が８４％（ｎ＝２）減少し（図５３Ａ）（表３６）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図５３Ｂ）（表３６）、ＣＤ４７の発現が９９．９％減少し（図５３Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが２，２９５±６０ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５３Ｄ）（表３７）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が５６倍増加し（図５３Ｅ）（表３７）、ＩＬ－１２ ｐ７０が３００±２４ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌された（図５３Ｆ）（表３７）。
ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が＞９５％（ｎ＝２）減少し（図５４Ａ）（表３６）、ＴＧＦβ２の分泌が８６％（ｎ＝２）減少し（図５４Ｂ）（表３６）、ＣＤ４７の発現が＞９９．９％減少し（図５４Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが１，５８６±２４ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５４Ｃ）（表３７）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が９倍増加し（図５４Ｅ）（表３６）、ＩＬ－１２ ｐ７０が４３４±１５ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌された（図５４Ｆ）（表３６）。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）およびＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌は、ＴＡＡ特異的ＩＦＮγ応答を増加させる
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ Ａ５４９細胞株およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌の抗原へのＩＦＮγ応答に対する効果を評価した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、２人のＨＬＡ－Ａ０２健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように完了した。ＴＡＡであるＭＡＧＥＡ３、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＲＡＭＥ、Ｍｕｃ１、ＳＴＥＲＡＰ１、Ｈｅｒ２、およびＴＥＲＴに対する総ＩＦＮγ応答は、未改変親細胞株（３８２±９６ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、Ａ５４９ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞（１，５８６±８８７ＳＦＵ）（ｎ＝６）で増加した（ｐ＝０．５８８７）（図５５Ａ）。同様に、ＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞株（１７０２±６８２ＳＦＵ）（ｎ＝６）によって誘発される総抗原特異的ＩＦＮγ応答が、未改変親細胞株（２６２±１０５ＳＦＵ）と比較して増加した（ｎ＝６）（ｐ＝０．１３８５）（図５５Ｂ）。特定の抗原に対する応答は、図の凡例に示されている順序になっている。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ Ａ５４９細胞株およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌の抗原へのＩＦＮγ応答に対する効果を評価した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、２人のＨＬＡ－Ａ０２健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように完了した。ＴＡＡであるＭＡＧＥＡ３、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＲＡＭＥ、Ｍｕｃ１、ＳＴＥＲＡＰ１、Ｈｅｒ２、およびＴＥＲＴに対する総ＩＦＮγ応答は、未改変親細胞株（３８２±９６ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、Ａ５４９ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞（１，５８６±８８７ＳＦＵ）（ｎ＝６）で増加した（ｐ＝０．５８８７）（図５５Ａ）。同様に、ＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞株（１７０２±６８２ＳＦＵ）（ｎ＝６）によって誘発される総抗原特異的ＩＦＮγ応答が、未改変親細胞株（２６２±１０５ＳＦＵ）と比較して増加した（ｎ＝６）（ｐ＝０．１３８５）（図５５Ｂ）。特定の抗原に対する応答は、図の凡例に示されている順序になっている。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０ワクチン成分細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が９６％（ｎ＝２）減少し（図５６Ａ）（表３８）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図５６Ｂ）（表３８）、ＣＤ２７６の発現が９８．９％減少し（図５６Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが１，１１３±５１ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５６Ｄ）（表３７）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が３６倍増加し（図５６Ｅ）（表３７）、ＩＬ－１２ ｐ７０が２６３±２４ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌物された（図５６Ｆ）（表３７）。
Ａ５４９細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が９６％（ｎ＝２）減少し（図５６Ａ）（表３８）、ＴＧＦβ２の分泌が＞８９％（ｎ＝２）減少し（図５６Ｂ）（表３８）、ＣＤ２７６の発現が９８．９％減少し（図５６Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが１，１１３±５１ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌され（図５６Ｄ）（表３７）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が３６倍増加し（図５６Ｅ）（表３７）、ＩＬ－１２ ｐ７０が２６３±２４ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌物された（図５６Ｆ）（表３７）。
ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株を改変して、ＴＧＦβ１の分泌が＞９５％（ｎ＝２）減少し（図５７Ａ）（表３８）、ＴＧＦβ２の分泌が７８％（ｎ＝２）減少し（図５７Ｂ）（表３８）、ＣＤ２７６の発現が９８．２％減少し（図５７Ｃ）（表３３）、ＧＭ－ＣＳＦが１，２３４±２４ｎｇ／１０6細胞／２４時間発現され（図５７Ｄ）（表３７）、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が１６倍増加し（図５７Ｅ）（表３７）、ＩＬ－１２ ｐ７０が３１２±５０ｎｇ／１０6細胞／２４時間分泌された（図５７Ｆ）（表３７）。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌はＤＣの成熟化を増加させる
成分ワクチン細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌のＤＣの成熟化に対する効果は、実施例１５に記載されているように、フローサイトメトリーによって決定された。具体的には、３人のＨＬＡ－Ａ０２ドナーに由来するｉＤＣを、未改変親Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）またはＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株、あるいはＧＭ－ＣＳＦを分泌し、膜結合ＣＤ４０Ｌを発現し、ＩＬ－１２を分泌する改変ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）またはＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）と共培養した。ＤＣ成熟化マーカーＣＤ８３の発現は、未改変親Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株と共培養したＤＣ（５３±３％）と比較して、改変Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株と共培養したＤＣ（７１±３％）で有意に増加した。（ｐ＝０．００１４）（図５８Ａ）。同様に、ＣＤ８３は、未改変親Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株（５２±３％）と共培養したＤＣ（５２±３％）と比較して、改変ＮＣＩ－Ｈ４６０と共培養したＤＣ（６９±４％）で有意に増加した（ｐ＝０．００７７）（図５８Ｂ）。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して決定された。
成分ワクチン細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌のＤＣの成熟化に対する効果は、実施例１５に記載されているように、フローサイトメトリーによって決定された。具体的には、３人のＨＬＡ－Ａ０２ドナーに由来するｉＤＣを、未改変親Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）またはＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株、あるいはＧＭ－ＣＳＦを分泌し、膜結合ＣＤ４０Ｌを発現し、ＩＬ－１２を分泌する改変ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）またはＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）と共培養した。ＤＣ成熟化マーカーＣＤ８３の発現は、未改変親Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株と共培養したＤＣ（５３±３％）と比較して、改変Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）細胞株と共培養したＤＣ（７１±３％）で有意に増加した。（ｐ＝０．００１４）（図５８Ａ）。同様に、ＣＤ８３は、未改変親Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株（５２±３％）と共培養したＤＣ（５２±３％）と比較して、改変ＮＣＩ－Ｈ４６０と共培養したＤＣ（６９±４％）で有意に増加した（ｐ＝０．００７７）（図５８Ｂ）。統計的有意性は、一元配置分散分析およびＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して決定された。
ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）およびＮＣＩ－Ｈ４６０（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１７７）細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌は、ＴＡＡ特異的ＩＦＮγ応答を増加させる
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９細胞株およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌の抗原へのＩＦＮγ応答に対する効果を評価した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、２人のＨＬＡ－Ａ０２健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように完了した。抗原であるＭＡＧＥＡ３、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＲＡＭＥ、Ｍｕｃ１、ＳＴＥＲＡＰ１、Ｈｅｒ２、およびＴＥＲＴに対する総ＩＦＮγ応答は、未改変親細胞株（４２１±１４９ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、Ａ５４９ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞（１，４０８±７３８ＳＦＵ）（ｎ＝６）で増加した（ｐ＝０．１３８５）（図５８Ｃ）。同様に、ＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ２７６ＫＯＫＯ細胞株（１７２５±７３５ＳＦＵ）（ｎ＝６）によって誘発される総抗原特異的ＩＦＮγ応答が、未改変親細胞株（２６２±１０５ＳＦＵ）と比較して増加した（ｎ＝６）（ｐ＝０．１３８５）（図５８Ｄ）。特定の抗原に対する応答は、図の凡例に示されている順序になっている。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ Ａ５４９細胞株およびＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ２７６ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの分泌、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現、およびＩＬ－１２の分泌の抗原へのＩＦＮγ応答に対する効果を評価した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔは、２人のＨＬＡ－Ａ０２健常ドナー（ｎ＝３／ドナー）に由来する細胞を使用して、実施例９に記載されているように完了した。抗原であるＭＡＧＥＡ３、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＲＡＭＥ、Ｍｕｃ１、ＳＴＥＲＡＰ１、Ｈｅｒ２、およびＴＥＲＴに対する総ＩＦＮγ応答は、未改変親細胞株（４２１±１４９ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、Ａ５４９ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ＣＤ４７ＫＯ細胞（１，４０８±７３８ＳＦＵ）（ｎ＝６）で増加した（ｐ＝０．１３８５）（図５８Ｃ）。同様に、ＮＣＩ－Ｈ４６０ ＴＧＦβ１ ＴＧＦβ２ＫＤ ２７６ＫＯＫＯ細胞株（１７２５±７３５ＳＦＵ）（ｎ＝６）によって誘発される総抗原特異的ＩＦＮγ応答が、未改変親細胞株（２６２±１０５ＳＦＵ）と比較して増加した（ｎ＝６）（ｐ＝０．１３８５）（図５８Ｄ）。特定の抗原に対する応答は、図の凡例に示されている順序になっている。
実施例２５：ＨＬＡの不一致により免疫原性が増加する
免疫細胞は、免疫応答を生成することによって「非自己」タンパク質に応答する。ＨＬＡ不一致の場合、免疫応答は、個体の細胞で発現されていないＨＬＡタンパク質に対するものであり、この応答は、インターフェロンγの産生によって測定することができる。インターフェロンγは、Ｔｈ1Ｔ細胞の応答の生成に関与する重要なサイトカインであり、Ｔｈ1Ｔ細胞は抗がん応答の必須のメディエーターである。幹細胞または臓器移植とは異なり、ＨＬＡ不一致の免疫応答は、腫瘍ワクチン内で発現されたＴＡＡに対するＴ細胞のプライミングをブーストするアジュバントとして作用することによって、全細胞腫瘍ワクチンの免疫原性を高める上で非常に有益な役割を果たす。
免疫細胞は、免疫応答を生成することによって「非自己」タンパク質に応答する。ＨＬＡ不一致の場合、免疫応答は、個体の細胞で発現されていないＨＬＡタンパク質に対するものであり、この応答は、インターフェロンγの産生によって測定することができる。インターフェロンγは、Ｔｈ1Ｔ細胞の応答の生成に関与する重要なサイトカインであり、Ｔｈ1Ｔ細胞は抗がん応答の必須のメディエーターである。幹細胞または臓器移植とは異なり、ＨＬＡ不一致の免疫応答は、腫瘍ワクチン内で発現されたＴＡＡに対するＴ細胞のプライミングをブーストするアジュバントとして作用することによって、全細胞腫瘍ワクチンの免疫原性を高める上で非常に有益な役割を果たす。
本開示の様々な実施形態によれば、ワクチンと患者との間で最も免疫原性の高い２つのＨＬＡ遺伝子座（ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂ）においてＨＬＡ不一致を含むように、最終ワクチン産物を含む細胞株のカクテルを設計することにで、ワクチン部位で有益な炎症反応がもたらされ、その結果、ＤＣによるワクチンの取り込みおよび提示が増加し、より多数のＴ細胞が活性化され、したがって、最終的には、がんワクチンカクテルによってプライミングされる腫瘍反応性Ｔ細胞の幅、大きさ、および免疫原性が増加する。ＨＬＡタイプに不一致があるように選択し、主要なＴＡＡを発現するように選択された複数の細胞株を含めることで、ＨＬＡ不一致によって生成される追加のアジュバント効果に加えて、ワクチンは、幅広く効果的な抗がん応答の効果的なプライミングを可能にする。
一実施例では、本開示によるワクチン組成物は、複数の細胞株を含み、腫瘍に対して最大限に効果的な免疫応答を刺激するために、ＴＡＡの幅ならびに最も免疫原性の高いＨＬＡタンパク質（ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂ）の多様性を確実にするように選択される。ＨＬＡ不一致を含めることで、免疫応答が増強され、アジュバントとして作用して、ＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリーによって測定可能な総抗ＴＡＡインターフェロンγ産生が増加する。様々な実施形態によれば、以下の特徴および選択基準に従うことができる。
ＨＬＡ遺伝子は遺伝するため、異なる民族からの個体間で、ＨＬＡ不一致の程度が増加する。したがって、細胞株選択プロセスは、一部の実施形態では、ＨＬＡアレルの多様性を含むカクテルを設計するために、世界中のバンクから細胞を取得することを含み得る。
ＨＬＡ－Ｃ、－ＤＲＢ１、および－ＤＰＢ１の不一致は、潜在的に免疫原性がより低いことが確認されているため、一部の実施形態では、ワクチン組成物の細胞株は、免疫原性が高いＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルの少なくとも２つの不一致を確保するように選択され得る。
選択された細胞株間の不一致のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡＢ遺伝子座の数が増えると、一部の実施形態によれば、インターフェロンγＥＬＩＳｐｏｔによって測定可能なアジュバント効果を確実にするためにワクチンを受けるすべての患者にわたって、不一致の程度がより大きくなる可能性がある。
樹状細胞をがん細胞株とインキュベートして、抗原の取り込みおよびＤＣの成熟化を可能にした。次いで、ＤＣをドナーからのＰＢＭＣと共培養し、同じ細胞株で、またはＨＬＡサブタイプに不均一性を有するように、かつドナーＰＢＭＣのＨＬＡタイプとの不一致を生成するように選択された細胞株のカクテルで再刺激した。細胞を、ＥＬＩＳｐｏｔプレートにプレーティングし、活性化した。腫瘍特異的Ｔ細胞は、実施例６に記載されているように、インターフェロンγスポット／ウェルをカウントすることによって測定した。
図５９に示されるように、複数のＨＬＡ分子にわたってドナーとのＨＬＡ不一致の程度が高い肺癌細胞株の組み合わせを含めると、抗腫瘍Ｔ細胞応答が増加する。ＨＬＡ不一致による免疫応答は、全体的な応答をブーストするためのアジュバントとして機能する。これらのデータは、複数の細胞株を含めて、全腫瘍がんワクチンカクテルとレシピエントの間の複数のクラスＩおよびクラスＩＩＨＬＡ分子における広範なＨＬＡ不一致を確実にすることで、同種応答の増加が生成され得ることを示す。
実施例２６：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ワクチンの調製
腫瘍および腫瘍細胞株は、非常に不均一である。腫瘍内の亜集団は、異なる生物学的可能性および異なる抗原プロファイルを有する異なる表現型を発現する。全腫瘍細胞ワクチンの背後にある推進目的の１つは、免疫系に様々な腫瘍細胞を提示することである。これを行うことで、免疫応答が複数のＴＡＡに対して生成され、抗原回避（または免疫の再発）および患者の再発につながり得る、抗原の喪失に関連する問題を回避する（Ｋｅｅｎａｎ ＢＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２；３９：２７６－８６）。抗原回避は、抗イディオタイプモノクローナル抗体によるＢ細胞リンパ腫の治療で最初に観察され（Ｍｅｅｋｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９８５；３１２：１６５８－６５）、その後、ＣＡＲ－Ｔ療法などの他の免疫療法の治療で観察された（Ｍａｊｚｎｅｒ ＲＧ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８；８：１２１９－２６）。
腫瘍および腫瘍細胞株は、非常に不均一である。腫瘍内の亜集団は、異なる生物学的可能性および異なる抗原プロファイルを有する異なる表現型を発現する。全腫瘍細胞ワクチンの背後にある推進目的の１つは、免疫系に様々な腫瘍細胞を提示することである。これを行うことで、免疫応答が複数のＴＡＡに対して生成され、抗原回避（または免疫の再発）および患者の再発につながり得る、抗原の喪失に関連する問題を回避する（Ｋｅｅｎａｎ ＢＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２；３９：２７６－８６）。抗原回避は、抗イディオタイプモノクローナル抗体によるＢ細胞リンパ腫の治療で最初に観察され（Ｍｅｅｋｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９８５；３１２：１６５８－６５）、その後、ＣＡＲ－Ｔ療法などの他の免疫療法の治療で観察された（Ｍａｊｚｎｅｒ ＲＧ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８；８：１２１９－２６）。
ＮＳＣＬＣ ＴＡＡの発現
候補成分細胞株による２４のＴＡＡの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号は、ＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡ発現は、各ＴＡＡについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値（ＦＰＫＭ）が０．５より大きい場合、細胞株によるＴＡＡの発現を陽性とみなした。まとめると、６つの成分細胞株は、２４の同定されたＴＡＡのうちの２３個を、＞０．５ＦＰＫＭのｍＲＮＡレベルで発現した（図６０）。具体的には、５つのＴＡＡが１つの細胞株によって発現され、４つのＴＡＡが２つの細胞株によって発現され、４つのＴＡＡが３つの細胞株によって発現され、５つのＴＡＡが３つの細胞株によって発現され、６つのＴＡＡが８つの細胞株によって発現された。単一細胞株によって発現されるＴＡＡの最小数は１２（ＮＣＩ－Ｈ５２０）であり、単一細胞によって発現されるＴＡＡの最大数は１８（ＤＭＳ５３）であった。Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、ＮＣＩ－Ｈ２３からなる例示的な６つの細胞株の単位用量によって標的化され得る抗原の数は、個々の細胞株よりも多い。
候補成分細胞株による２４のＴＡＡの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号は、ＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡ発現は、各ＴＡＡについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値（ＦＰＫＭ）が０．５より大きい場合、細胞株によるＴＡＡの発現を陽性とみなした。まとめると、６つの成分細胞株は、２４の同定されたＴＡＡのうちの２３個を、＞０．５ＦＰＫＭのｍＲＮＡレベルで発現した（図６０）。具体的には、５つのＴＡＡが１つの細胞株によって発現され、４つのＴＡＡが２つの細胞株によって発現され、４つのＴＡＡが３つの細胞株によって発現され、５つのＴＡＡが３つの細胞株によって発現され、６つのＴＡＡが８つの細胞株によって発現された。単一細胞株によって発現されるＴＡＡの最小数は１２（ＮＣＩ－Ｈ５２０）であり、単一細胞によって発現されるＴＡＡの最大数は１８（ＤＭＳ５３）であった。Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、ＮＣＩ－Ｈ２３からなる例示的な６つの細胞株の単位用量によって標的化され得る抗原の数は、個々の細胞株よりも多い。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連のＴＡＡをさらに増強するために、本明細書に記載されているように、１つの細胞株（ＬＫ－２）はまた、ＣＴ８３およびメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）の遺伝子で形質導入された（図６５）。ＣＴ８３のｍＲＮＡは、６つの細胞株のうち２つで低レベルで内因的に発現され、メソテリンは６つの成分細胞株のうちの１つで内因的に発現された。
ＴＡＡの最大の不均一性を維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して確立された。
まとめると、本ワクチンの細胞は、より多くのＴＡＡを発現し、抗腫瘍免疫において重要であることが実証された。表３９の細胞株は、本ＮＳＣＬＣワクチンで使用されている。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２をノックダウンし、得られた分泌レベルを、実施例５に記載されているように決定した。カクテルＡの親細胞株のうち、ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＡ５４９は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌し、一方、ＬＫ－２は、ＴＧＦβ２を分泌するが、ＴＧＦβ１は分泌しない。カクテルＢの親細胞株のうち、ＮＣＩ－Ｈ２３は測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌し、ＬＫ－２は、ＴＧＦβ２を分泌するが、ＴＧＦβ１は分泌しない。ＤＭＳ５３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌するが、ＴＧＦβ１の分泌は少ない。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２をノックダウンし、得られた分泌レベルを、実施例５に記載されているように決定した。カクテルＡの親細胞株のうち、ＮＣＩ－Ｈ４６０およびＡ５４９は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌し、一方、ＬＫ－２は、ＴＧＦβ２を分泌するが、ＴＧＦβ１は分泌しない。カクテルＢの親細胞株のうち、ＮＣＩ－Ｈ２３は測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌し、ＬＫ－２は、ＴＧＦβ２を分泌するが、ＴＧＦβ１は分泌しない。ＤＭＳ５３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌するが、ＴＧＦβ１の分泌は少ない。
ＤＭＳ５３を除いて、成分細胞株は、すべてＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡおよびＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡで形質導入され、２つの分子の分泌をノックダウンした。ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡとＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡの両方で改変する複数の試みが成功しなかったため、ＤＭＳ５３は、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡで遺伝子改変された。この細胞株ではＴＧＦβ２の分泌レベルがすでに低かったため、進めるにあたって、ＴＧＦβ１のノックダウンを選択した。これらの細胞は、クローン名ＤＫ４で表される。残りの細胞株は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡで二重改変された。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。
表４０は、野生型細胞株と比較した遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦ－βの分泌を示す。ＴＧＦβ１の減少は、５９％～９０％の範囲であった。ＴＧＦβ２の減少は、４２％～９７％の範囲であった。
各成分細胞株の８×１０6の注入注射用量に基づいて、カクテルＡおよびＢのＴＧＦ－β総分泌量を、表４１に示す。カクテル中の野生型細胞における分泌も示されている。カクテルＡは、ＴＧＦβ１について９６７９ｐｇ／注射用量／２４時間、およびＴＧＦβ２について５６００ｐｇ／注射用量／２４時間の総分泌量を示す。カクテルＢは、ＴＧＦβ１について８２２０ｐｇ／注射用量／２４時間、およびＴＧＦβ２について１４１６３ｐｇ／注射用量／２４時間の総分泌量を示す。
ベラゲンプマツセル－Ｌは、１８，８１３ｐｇ／注射用量／２４時間の総ＴＧＦβ２分泌量を示した（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＪＣＯ．（２００６）２４：２９，４７２１－４７３０）（Ｆａｋｈｒａｉ，Ｈ ２０１０）。ＮＳＣＬＣワクチンの総ＴＧＦβ２分泌量（１９，７６３ｐｇ／注射用量／２４時間）は、ベラゲンプマツセル－Ｌの２．５×１０7細胞と比較して、ＮＳＣＬＣワクチンの注射細胞数が４．８×１０7細胞と多いにもかかわらず、ベラゲンプマツセル－ＬのＴＧＦβ２の分泌量とほぼ同等である。
ＮＳＣＬＣワクチンの総ＴＧＦβ１分泌量（１７，８９９ｐｇ／注射用量／２４時間）は、ベラゲンプマツセル－Ｌの推定ＴＧＦβ１分泌の３１％である。
ＣＤ２７６の発現
すべての成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現しており、ＣＤ２７６の発現を、実施例１３および本明細書に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。成分細胞株は、ＴＧＦβ２のみがノックダウンされたＤＭＳ５３を除いて（ＤＫ４と称される）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２をノックダウンするように、ｓｈＲＮＡにより、以前に遺伝子改変されていた（ＤＫ６と称される）。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションした細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、細胞をＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。表４２に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。ノックアウト細胞におけるタンパク質発現の不在は、使用したウエスタンブロット分析によっても確認された（データ未掲載）。これらのデータは、ＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つの成分細胞株すべてにおいて、９９％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
すべての成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現しており、ＣＤ２７６の発現を、実施例１３および本明細書に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。成分細胞株は、ＴＧＦβ２のみがノックダウンされたＤＭＳ５３を除いて（ＤＫ４と称される）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２をノックダウンするように、ｓｈＲＮＡにより、以前に遺伝子改変されていた（ＤＫ６と称される）。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションした細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、細胞をＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。表４２に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。ノックアウト細胞におけるタンパク質発現の不在は、使用したウエスタンブロット分析によっても確認された（データ未掲載）。これらのデータは、ＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つの成分細胞株すべてにおいて、９９％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
成分細胞株は、本明細書および実施例２４に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦで形質導入された。表４３に、結果を示す。
成分細胞株は、本明細書および実施例２４に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦで形質導入された。表４３に、結果を示す。
８×１０6個の各成分細胞株の注射用量に基づいて、カクテルＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、３３，７６０ｎｇ／注射用量／２４時間である。カクテルＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１９，８５６ｎｇ／注射用量／２４時間である。したがって、注射当たりの総分泌量は、２４時間当たり４３，６１６ｎｇである。
ＣＤ４０Ｌの発現
成分細胞株は、本明細書に記載されているように、また実施例１５に記載の方法によって、ＣＤ４０Ｌベクターで形質導入された。ＣＤ４０Ｌの発現は、実施例１５に記載されているように、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。図７４に示される結果は、６つの細胞株すべてにおいて有意なＣＤ４０Ｌの膜発現を実証した。
成分細胞株は、本明細書に記載されているように、また実施例１５に記載の方法によって、ＣＤ４０Ｌベクターで形質導入された。ＣＤ４０Ｌの発現は、実施例１５に記載されているように、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。図７４に示される結果は、６つの細胞株すべてにおいて有意なＣＤ４０Ｌの膜発現を実証した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株を、ＩＬ－１２ベクターで形質導入し、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現を、実施例２４および本明細書に記載されているように決定した。表４４に、その結果を示す。
成分細胞株を、ＩＬ－１２ベクターで形質導入し、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現を、実施例２４および本明細書に記載されているように決定した。表４４に、その結果を示す。
８×１０6個の各成分細胞株の注射用量に基づいて、カクテルＡの総ＩＬ－１２分泌量は、６８８０ｎｇ／注射用量／２４時間である。カクテルＢの総ＩＬ－１２分泌量は、５７６０ｎｇ／注射用量／２４時間である。したがって、注射当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり１２，６４０ｎｇである。
ＬＫ－２細胞株によるメソテリンおよびＣＴ８３の安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するように改変されたＬＫ－２細胞株は、ＣＴ８３およびメソテリン抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入された。ＣＴ８３およびメソテリン抗原は、Ｐ２Ａ切断部位（配列番号２１）によって連結されている。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するように改変されたＬＫ－２細胞株は、ＣＴ８３およびメソテリン抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入された。ＣＴ８３およびメソテリン抗原は、Ｐ２Ａ切断部位（配列番号２１）によって連結されている。
膜結合メソテリンおよびＣＴ８３の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変親細胞および改変細胞を、製造元の説明書に従って、抗メソテリン－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＦＡＢ３２６５２Ｐ）で細胞外染色した。未改変親細胞および改変細胞を、抗ＣＴ８３（Ａｂｃａｍ，ａｂ１２１２１９）、続いて、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ－１１０３４）で細胞内染色した。ＣＴ８３とメソテリンの両方について、染色されていない未改変親細胞のＭＦＩを、染色された未改変細胞のＭＦＩから差し引いた。ＣＴ８３とメソテリンの両方について、改変親細胞のＭＦＩを、改変細胞のＭＦＩから差し引いた。発現の増加率（％）は、（１－（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた未改変のＭＦＩ））×１００）として計算した。改変細胞株（９３４，９８５ＭＦＩ）におけるＣＴ８３の発現は、親細胞株のもの（３２３，８７８ＭＦＩ）と比べて３倍に増加した。改変細胞株（１２３，１２８ＭＦＩ）によるメソテリンの発現は、親細胞株のもの（１４４３ＭＦＩ）と比べて８５倍に増加した（図６５Ａ）。
自己ＤＣおよびＣＤ１４－ＰＢＭＣの共培養物によるＣＴ８３およびメソテリン抗原に対するＩＦＮγ応答は、実施例８に記載されているように、その後のＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。改変ＬＫ－２細胞株によって発現されるＣＴ８３およびメソテリン抗原に対するＩＦＮγ応答は、ＮＳＣＬＣワクチンＢとの関連で評価された。具体的には、５×１０5個の改変ＤＭＳ５３、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＬＫ－２細胞（１．５×１０6個の総改変細胞）を、３人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝３／ドナー）からの１．５×１０6個のｉＤＣと共培養した。６日目に、ｍＤＣとの共培養物から単離されたＣＤ１４－ＰＢＭＣを、ＩＦＮγのＳＦＵを検出する前に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、ＣＴ８３およびメソテリンのペプチドプール（天然タンパク質配列にまたがり１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒ）で２４時間刺激した。ＣＴ８３（２０５±１５８ＳＦＵ）（ｎ＝９）とメソテリン（３４４９±８８９ＳＦＵ）（ｎ＝９）の両方で、ＩＦＮγの産生が検出された（図６５Ｂ）。
ワクチンカクテルは、個々の成分細胞株と比較して、より強力で幅広い細胞性免疫応答を誘発した。
個々の細胞株に対してＩＦＮγ応答を誘導するＮＳＣＬＣワクチンカクテルの能力と比較して、それ自体に対してＩＦＮγ応答を誘導する個々のＮＳＣＬＣワクチン成分細胞株の能力を、実施例８および９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。図６２のデータは、カクテル（ＮＳＣＬＣ－ＡおよびＮＳＣＬＣ－Ｂ）が、６つの細胞株のうち４つについて、個々の成分細胞株よりも強い免疫応答を誘発したことを示す。
個々の細胞株に対してＩＦＮγ応答を誘導するＮＳＣＬＣワクチンカクテルの能力と比較して、それ自体に対してＩＦＮγ応答を誘導する個々のＮＳＣＬＣワクチン成分細胞株の能力を、実施例８および９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。図６２のデータは、カクテル（ＮＳＣＬＣ－ＡおよびＮＳＣＬＣ－Ｂ）が、６つの細胞株のうち４つについて、個々の成分細胞株よりも強い免疫応答を誘発したことを示す。
次いで、関連するＴＡＡに対するワクチンカクテルによって誘発される免疫応答を測定した。正常なドナーＰＢＭＣは、個々の成分細胞株またはＮＳＣＬＣ－ＡカクテルもしくはＮＳＣＬＣ－Ｂカクテルと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールをロードした自己ＤＣで刺激した。次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、細胞を、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。図６３に示されるデータは、ＮＳＣＬＣワクチン成分細胞株の各々が、ＴＡＡ特異的ＩＦＮγ応答を誘導し得ることを示す。さらに重要なことに、２つのＮＳＣＬＣワクチンカクテルは、個々の成分細胞株と比較して、より多くのＴＡＡに対してより強いＩＦＮγ応答を誘導した。これは、ワクチンカクテルが、より広範な免疫応答を誘導することができることを示す。
実施例２７：非小細胞肺癌（ＮＳＬＣ）ワクチン
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、以下の実施例は、以下の表４５に示される６つの肺癌細胞株から構成されているＮＳＣＬＣのための全細胞ワクチンを提供する。細胞株は、２つの腺癌（Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ２３）、２つの扁平上皮癌（ＮＣＩ－Ｈ５２０およびＬＫ－２）、１つの大細胞癌（ＮＣＩ－Ｈ４６０）、および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（ＤＭＳ５３）を表している。細胞株は、ワクチンカクテルＡおよびワクチンカクテルＢ（すなわち、ＮＳＣＬＣ－ＡおよびＮＳＣＬＣ－Ｂ）の２つのグループに分けられている。カクテルＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、カクテルＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。カクテルＡおよびＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、以下の実施例は、以下の表４５に示される６つの肺癌細胞株から構成されているＮＳＣＬＣのための全細胞ワクチンを提供する。細胞株は、２つの腺癌（Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ２３）、２つの扁平上皮癌（ＮＣＩ－Ｈ５２０およびＬＫ－２）、１つの大細胞癌（ＮＣＩ－Ｈ４６０）、および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（ＤＭＳ５３）を表している。細胞株は、ワクチンカクテルＡおよびワクチンカクテルＢ（すなわち、ＮＳＣＬＣ－ＡおよびＮＳＣＬＣ－Ｂ）の２つのグループに分けられている。カクテルＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、カクテルＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。カクテルＡおよびＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、エレクトロポレーションによってノックアウトされている。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、およびＣＴ８３の遺伝子が、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加されている。
６つの樹立肺癌細胞株のうち５つはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１つはＪａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ（ＪＣＲＢ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）から入手した。
実施例２８：ベラゲンプマツセル－ＬワクチンとＮＳＣＬＣワクチンの比較
ベラゲンプマツセル－Ｌの臨床試験の結果は、査読付き学術誌に発表され、ＮＳＣＬＣの２件の第ＩＩ相試験（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００６；２４：４７２１－３０、Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；１６：６２０－４）および１件の第ＩＩＩ相試験（Ｇｉａｃｃｏｎｅ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；５１：２３２１－９）が含まれた。
ベラゲンプマツセル－Ｌの臨床試験の結果は、査読付き学術誌に発表され、ＮＳＣＬＣの２件の第ＩＩ相試験（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００６；２４：４７２１－３０、Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；１６：６２０－４）および１件の第ＩＩＩ相試験（Ｇｉａｃｃｏｎｅ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；５１：２３２１－９）が含まれた。
ベラゲンプマツセル－Ｌは、４つの同種ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株におけるＴＧＦβ２の分泌が、ＴＧＦβ２アンチセンスプラスミドを使用して下方制御されたワクチンであった。しかし、ベラゲンプマツセル－Ｌは、ＴＧＦβ１分泌の課題に対処していなかった。最近の研究では、ＴＧＦβ１が免疫系で発現する主要なアイソフォームであることが示されている。ＴＧＦβ１は、ＴＧＦβＲＩＩ受容体に高親和性で結合するが、ＴＧＦβ２は、ＴＧＦβＲＩＩＩ共受容体（ベータグリカンとも呼ばれる）の存在下でのみ高親和性で結合する。ベータグリカンは、ＮＳＣＬＣで下方制御されるため、ＴＧＦβ１が主要なＴＧＦβアイソフォームになる。
実施例２７に記載されているＮＳＣＬＣワクチンは、他の改変および改善の中でも、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌と比較して、ベラゲンプマツセル－Ｌよりも大きな改善をもたらす。ＮＳＣＬＣワクチンにおいてＴＧＦβ２の分泌レベルが低いことが重要であるが、さらに重要なのは、ＴＧＦβ１のレベルの減少である。現在のＮＳＣＬＣワクチンはまた、以下の改善が導入されている：ｓｈＲＮＡのレンチウイルス形質導入の使用は、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ１の発現をノックダウンするために使用され、発現と安定性の両方でアンチセンスよりも大幅に改善されている；ＣＤ２７６の発現をノックアウトするためのジンクフィンガーヌクレアーゼのエレクトロポレーションの使用；免疫刺激分子ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、およびＣＤ４０Ｌの発現を誘導するためのレンチウイルス形質導入の使用；ＮＳＣＬＣ腫瘍には重要なＳＣＬＣ成分が含まれており、その成分が薬剤耐性、転移、および再発の原因であるという最近の観察に注目したＳＣＬＣ細胞株の使用；ならびに無血清培地組成の使用。
上記のように、ＮＳＣＬＣ患者に関連する抗腫瘍免疫応答を引き起こす可能性のある２４のＴＡＡが特定された。図６１Ａに、ＮＳＣＬＣワクチンおよびベラゲンプマツセル－Ｌにおけるこれらの２４の抗原のｍＲＮＡ発現を示す。図６１のデータは、それぞれベラゲンプマツセル－ＬおよびＮＳＣＬＣワクチン細胞株成分における各抗原のＬｏｇ10ＦＰＫＭ＋１４ ｍＲＮＡ発現の合計として示されている。ＦＰＫＭ ｍＲＮＡ値は、１４．０で調整され、負の基底値（－１３．００ＦＰＫＭ）を考慮して、正の値でｍＲＮＡレベルの追加を可能にした。ＮＳＣＬＣワクチン細胞成分によって発現される２３の優先順位付けされたＮＳＣＬＣ ＴＡＡの発現は、５７３のＮＳＣＬＣ患者試料において決定された。ＮＳＣＬＣ患者のデータは、公開されているデータベースｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）（Ｃｅｒａｍｉ， Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１２、Ｇａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３）から、２０２０年２月２３日から２０２０年７月２日までの間に、ダウンロードされた（図７８Ｃ）。ＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会（ＨＧＮＣ）の遺伝子記号が検索に含まれ、各ＴＡＡについて、ｍＲＮＡ発現がダウンロードされた。
ＮＳＣＬＣワクチンは、潜在的に中央値が２１のＴＡＡを標的とし（図６１Ｂ）、ベラゲンプマツセル－Ｌは、５７３人の患者の腫瘍試料によって発現される中央値が１７のＴＡＡを標的とする（図６１Ｃ）。ＮＳＣＬＣワクチンおよびベラゲンプマツセル－Ｌはどちらも、５７３人の患者すべてにおいて、少なくとも５つの抗原に対する抗腫瘍応答を誘発する可能性がある。ＮＳＣＬＣワクチンは、５７２人の患者において少なくとも１７の抗原（９９．８％）、５６５人の患者において少なくとも１８の抗原（９８．６％）、５３８人の患者において少なくとも１９の抗原（９３．９％）、４３８人の患者において少なくとも２０の抗原（７６．４％）、２９０人の患者において少なくとも２１の抗原（５０．６％）、１８３人の患者において少なくとも２２の抗原（３１．９％）、７３人の患者において少なくとも２３の抗原（１２．７％）に対して抗腫瘍応答を誘導する可能性がある。比較すると、ベラゲンプマツセル－Ｌは、５７２人の患者において少なくとも１４の抗原（９９．８％）、５５８人の患者において少なくとも１５の抗原（９７．４％）、５２５人の患者において少なくとも１６の抗原（９１．６％）、３５１人の患者において少なくとも１７の抗原（６１．３％）、２３３人の患者において少なくとも１８の抗原（４０．７％）、１２６人の患者において少なくとも１９の抗原（２２．０％）に対してのみ抗腫瘍応答を誘導することができた。上記の分析には、ＮＳＣＬＣ患者の抗腫瘍反応を誘導する優先順位付けされた抗原が含まれており、成分細胞株によって発現される追加の抗原、潜在的に臨床的に関連する抗原は考慮されていない。
本明細書に記載のＮＳＣＬＣワクチンに含まれる６つの細胞株は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。結果として、例示的な６つの細胞株組成物を使用して標的化することができるＴＡＡの数、および抗原の発現レベルは、ベラゲンプマツセル－Ｌよりも多い。前述のように、抗原の幅をさらに広げるために、１つの細胞株（ＬＫ－２）は、ＣＴ８３（配列番号１９、配列番号２０）およびメソテリン（配列番号１７、配列番号１８）の遺伝子でも形質導入され、２つのＴＡＡのｍＲＮＡが、６つの成分細胞株のいずれにおいても、低レベルで内因的に発現された。
この実施例は、２つのカクテルを含むＮＳＣＬＣワクチンのＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは、３つの細胞株成分（合計６つの成分細胞株）で構成され、ベラゲンプマツセル－Ｌと比較して、細胞性免疫応答の抗原性の幅および大きさを大幅に増加させる。
ベラゲンプマツセル－Ｌ細胞株におけるＴＧＦβ２の分泌の減少
ベラゲンプマツセル－Ｌのカクテル（ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、およびＲｈ２）の細胞株成分を、ＴＧＦβ２（配列番号２４）を特異的に標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス粒子で形質導入し、得られた改変細胞株のＴＧＦβ２のレベルを、実施例５に記載されているように決定した。改変細胞におけるＴＧＦβ２の分泌レベルは、ＮＣＩ－Ｈ５２０およびＳＫ－ＬＵ－１およびＭＤＤのＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回り（４２．０ｐｇ／１０6細胞／２４時間）、親細胞株と比較して減少率（％）を推定するために使用した。親未改変細胞株と比較して、ＴＧＦβ２の分泌が、ＮＣＩ－Ｈ４６０で８４％、ＮＣＩ－Ｈ５２０で９９％以上、ＳＫ－ＬＵ－１で８４％以上、Ｒｈ２で７４％減少した。表４１に、ＮＳＣＬＣカクテルＡおよびカクテルＢのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のレベルの減少を示す。ＮＳＣＬＣワクチンは、実施例２７に記載されているように調製した。
ベラゲンプマツセル－Ｌのカクテル（ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、およびＲｈ２）の細胞株成分を、ＴＧＦβ２（配列番号２４）を特異的に標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス粒子で形質導入し、得られた改変細胞株のＴＧＦβ２のレベルを、実施例５に記載されているように決定した。改変細胞におけるＴＧＦβ２の分泌レベルは、ＮＣＩ－Ｈ５２０およびＳＫ－ＬＵ－１およびＭＤＤのＥＬＩＳＡアッセイの定量化下限を下回り（４２．０ｐｇ／１０6細胞／２４時間）、親細胞株と比較して減少率（％）を推定するために使用した。親未改変細胞株と比較して、ＴＧＦβ２の分泌が、ＮＣＩ－Ｈ４６０で８４％、ＮＣＩ－Ｈ５２０で９９％以上、ＳＫ－ＬＵ－１で８４％以上、Ｒｈ２で７４％減少した。表４１に、ＮＳＣＬＣカクテルＡおよびカクテルＢのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２のレベルの減少を示す。ＮＳＣＬＣワクチンは、実施例２７に記載されているように調製した。
ＮＳＣＬＣワクチンＡ、ＮＳＣＬＣワクチンＢ、およびベラゲンプマツセル－Ｌに対する抗原特異的および腫瘍細胞特異的なＩＦＮγの産生
抗原および親未改変細胞に対する細胞性免疫応答は、自己ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養後、実施例８に記載されているように、以下に記載される変更を加えて、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。
抗原および親未改変細胞に対する細胞性免疫応答は、自己ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養後、実施例８に記載されているように、以下に記載される変更を加えて、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。
自己ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養は、ベラゲンプマツセル－ＬおよびＮＳＣＬＣワクチンのインビボ投与をモデル化するために調整された。ベラゲンプマツセル－Ｌは、単一部位に投与され、ＮＳＣＬＣワクチンＡおよびＮＳＣＬＣワクチンＢは２つの別々の注射部位に投与された。ベラゲンプマツセル－Ｌを表す自己ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養では、３．７５×１０5個のＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、Ｒｈ２改変細胞（合計１．５×１０6個の改変細胞）を、１．５×１０6個のｉＤＣと共培養した。ＮＳＣＬＣワクチンＡでは、５．００×１０5個の改変ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、Ａ５４９細胞（合計１．５×１０6個の改変細胞）を、１．５×１０6個のｉＤＣと共培養した。ＮＳＣＬＣワクチンＢの場合、５．０×１０5個の改変ＤＭＳ５３、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＬＫ－２細胞（合計１．５×１０6個の改変細胞）を、１．５×１０6個のｉＤＣと共培養した。共培養後、親腫瘍細胞株および抗原を対象とした細胞性免疫応答を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。ベラゲンプマツセル－Ｌ共培養からのＣＤ１４－ＰＢＭＣは、未改変ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、またはＲｈ２（ｎ＝４／細胞株／ドナー）で、別々のウェルで刺激した。ＮＳＣＬＣワクチンＡカクテルからのＣＤ１４-ＰＢＭＣ－は、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、またはＡ５４９（ｎ＝４／細胞株／ドナー）のいずれかで、別々のウェルで刺激した。ＮＳＣＬＣワクチンＢカクテルからのＣＤ１４-ＰＢＭＣは、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、またはＮＣＩ－Ｈ２３（ｎ＝４／細胞株／ドナー）のいずれかで、別々のウェルで刺激した。抗原特異的応答は、同じベラゲンプマツセル－Ｌ、ＮＳＣＬＣワクチンＡ、およびＮＳＣＬＣワクチンＢの共培養から単離されたＣＤ１４-ＰＢＭＣを使用して決定した（ｎ＝４／ドナー／抗原）。ＩＦＮγ産生の応答は、ベラゲンプマツセル－Ｌワクチン、ＮＳＣＬＣワクチンＡ、およびＮＳＣＬＣワクチンＢを含む親未改変細胞株に対して、ならびに例示的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、およびがん精巣抗原（ＣＴＡ）に対して決定した。
６つの成分細胞株の２つのカクテルアプローチにおけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現によるＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少は、４つの成分細胞株の単一カクテル免疫療法アプローチにおけるＴＧＦβ２の減少と比較して、細胞性免疫応答を有意に増加させる。
親腫瘍細胞および抗原に対するベラゲンプマツセル－Ｌ、カクテルＡおよびカクテルＢによって誘導されるＩＦＮγ応答は、８人の健常ＨＬＡ多様ドナーに由来するＣＤ１４－ＰＢＭＣおよびＤＣの以下の共培養により決定された。改変ベラゲンプマツセル－Ｌ、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、Ｒｈ２成分細胞株がロードされたＤＣと共培養したＰＢＭＣを、親細胞、未改変細胞、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、Ｒｈ２細胞（ｎ＝４／ドナー／細胞株）で刺激した。カクテルＡがロードされたＤＣと共培養したＰＢＭＣを、親未改変ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、Ａ５４９細胞（ｎ＝４／ドナー／細胞株）で刺激した。カクテルＢがロードされたＤＣと共培養したＰＢＭＣを、親未改変ＤＭＳ５３、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＬＫ－２細胞（ｎ＝４／ドナー／細胞株）で刺激した。各ドナー変数の反復の平均ＳＦＵ（ｎ＝４）は、±ＳＥＭで報告される。ＮＳＣＬＣワクチンの単位用量は、ベラゲンプマツセル－Ｌ（１，８５０±７６４ＳＦＵ）（ｎ＝８）と比較して、有意に強力な腫瘍細胞特異的ＩＦＮγ応答（７，６１３±１，７６３ＳＦＵ）（ｎ＝８）を誘発した（ｐ＝０．０１４８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図６６Ａ）。ベラゲンプマツセル－Ｌ、ＮＳＣＬＣワクチンカクテルＡ、ＮＳＣＬＣワクチンカクテルＢ、およびＮＳＣＬＣワクチンの単位用量に対するドナー特異的ＩＦＮγ応答を図６７Ａに示す。
親腫瘍細胞および抗原に対するベラゲンプマツセル－Ｌ、カクテルＡおよびカクテルＢによって誘導されるＩＦＮγ応答は、８人の健常ＨＬＡ多様ドナーに由来するＣＤ１４－ＰＢＭＣおよびＤＣの以下の共培養により決定された。改変ベラゲンプマツセル－Ｌ、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、Ｒｈ２成分細胞株がロードされたＤＣと共培養したＰＢＭＣを、親細胞、未改変細胞、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＬＵ－１、Ｒｈ２細胞（ｎ＝４／ドナー／細胞株）で刺激した。カクテルＡがロードされたＤＣと共培養したＰＢＭＣを、親未改変ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、Ａ５４９細胞（ｎ＝４／ドナー／細胞株）で刺激した。カクテルＢがロードされたＤＣと共培養したＰＢＭＣを、親未改変ＤＭＳ５３、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＬＫ－２細胞（ｎ＝４／ドナー／細胞株）で刺激した。各ドナー変数の反復の平均ＳＦＵ（ｎ＝４）は、±ＳＥＭで報告される。ＮＳＣＬＣワクチンの単位用量は、ベラゲンプマツセル－Ｌ（１，８５０±７６４ＳＦＵ）（ｎ＝８）と比較して、有意に強力な腫瘍細胞特異的ＩＦＮγ応答（７，６１３±１，７６３ＳＦＵ）（ｎ＝８）を誘発した（ｐ＝０．０１４８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図６６Ａ）。ベラゲンプマツセル－Ｌ、ＮＳＣＬＣワクチンカクテルＡ、ＮＳＣＬＣワクチンカクテルＢ、およびＮＳＣＬＣワクチンの単位用量に対するドナー特異的ＩＦＮγ応答を図６７Ａに示す。
表４６は、カクテルＡおよびカクテルＢに対するＩＦＮγ応答の分布が、ドナーごとに異なることを示し、細胞株成分の細胞株および送達部位の数を増やすと、４つの細胞株の単一の組成物よりも広範な集団に到達する可能性があることを強調している。
ＮＳＣＬＣワクチンカクテルＡおよびカクテルＢはまた、ＮＳＣＬＣおよびその他の固形腫瘍の適応症と関連する抗原の例示的なパネルに対して、より強力な抗原特異的ＩＦＮγ応答も誘導した。ベラゲンプマツセル－Ｌ、ＮＳＣＬＣワクチンカクテルＡ、またはＮＳＣＬＣワクチンカクテルＢがロードされたＤＣと共培養したＰＢＭＣを、広範囲のＨＬＡハプロタイプ（ｎ＝４／ドナー／抗原）の既知の抗原特異的Ｔ細胞エピトープを含むペプチドプールで刺激した。各抗原およびドナー（ｎ＝４）の反復の平均ＳＦＵは、表４７および図６７Ｂに±ＳＥＭで報告されている。ＮＳＣＬＣワクチンの単位用量は、８人のドナーにおいて、ベラゲンプマツセル－Ｌ（３９２±１５７ＳＦＵ）比較して、抗原特異的なＩＦＮγの産生の平均の大きさおよび幅を有意に増加させた（６，５７６±２，１４７ＳＦＵ）（ｎ＝８）（ｐ＝０．０００２、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図６６Ｂ）。
実施例２９：多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＧＢＭ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＧＢＭワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＬＮ－２２９、細胞株ＧＢ－１、およびｍｏｄＴＥＲＴも発現するように改変された細胞株ＳＦ－１２６から構成されている。第２のカクテルであるＧＢＭワクチンＢは、細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩも発現するように改変された細胞株ＫＮＳ６０、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６成分細胞株は、抗ＧＢＭ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２２の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＧＢＭ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＧＢＭワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＬＮ－２２９、細胞株ＧＢ－１、およびｍｏｄＴＥＲＴも発現するように改変された細胞株ＳＦ－１２６から構成されている。第２のカクテルであるＧＢＭワクチンＢは、細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩも発現するように改変された細胞株ＫＮＳ６０、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６成分細胞株は、抗ＧＢＭ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２２の抗原をまとめて発現する。
多形神経膠芽腫ワクチン成分の特定
最初の細胞株の選択基準は、ＧＢＭワクチンに含まれる可能性のある１７のワクチン成分細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、１７の候補細胞株を８つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＧＢＭ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＧＢＭ特異的ＣＳＣマーカーの発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、ＧＢＭの組織学的および分子サブタイプ（利用可能な場合）、ならびにＯ6－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）プロモーターのメチル化状態（利用可能な場合）が含まれた。
最初の細胞株の選択基準は、ＧＢＭワクチンに含まれる可能性のある１７のワクチン成分細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、１７の候補細胞株を８つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＧＢＭ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＧＢＭ特異的ＣＳＣマーカーの発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、ＧＢＭの組織学的および分子サブタイプ（利用可能な場合）、ならびにＯ6－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）プロモーターのメチル化状態（利用可能な場合）が含まれた。
ＧＢＭ腫瘍は、多様なＣＳＣマーカーを発現するＣＳＣの不均一な集団が濃縮されている（表２）。ＧＢＭ腫瘍による１３のＧＢＭ関連ＣＳＣマーカー：ＡＢＣＧ２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＭＩ－１、ＦＵＴ４、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ９０、ＰＲＯＭ１、ＣＸＣＲ４、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＹＣ、およびＳＯＸ２の発現は、公開されているデータベースｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）（Ｃｅｒａｍｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１２．、Ｇａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３．）から、２０２０年２月２３日から２０２０年７月２日までの間にダウンロードされた患者腫瘍試料データにおいて確認された（図６８Ｃ）。ＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会（ＨＧＮＣ）の遺伝子記号が検索に含まれ、各ＣＳＣマーカーについて、ｍＲＮＡ発現がダウンロードされた。
候補成分細胞株によるＴＡＡおよびＣＳＣマーカーの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号がＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡの発現が各ＴＡＡまたはＣＳＣマーカーについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値（ＦＰＫＭ）が１より大きい場合、細胞株によるＴＡＡまたはＣＳＣマーカーの発現を陽性とみなした。１７のＧＢＭワクチン候補成分のうち８つが、さらなる評価のために特定された：上記の選択基準に基づいて、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、Ａ－１７２、ＹＫＧ－１、Ｕ－２５１ＭＧ、ＧＢ－１、ＫＮＳ６０、およびＳＦ－１２６。８つの候補成分細胞株は、７～１０のＣＳＣマーカー（図６８Ｂ）および１１～１４のＴＡＡ（図６８Ａ）を発現した。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様の細胞株であるＤＭＳ５３は、６つの細胞株のうちの１つとして含まれている。
未改変ＧＢＭ成分細胞株候補の免疫原性は、３人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）について、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂのアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊３５：０１およびＡ＊３１：０１ Ｂ＊３５：０３；ドナー２、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊３０：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１２：０２；ドナー３、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０７およびＡ２４：０２ Ｂ＊１８：０１。ＬＮ－２２９（５，０３９±６３７ＳＦＵ）およびＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ（６，０９４±７３４ＳＦＵ）は、Ａ－１７２（８０８±１５２ＳＦＵ）、ＹＫＧ－１（５７６±１５４）、Ｕ－２５１ＭＧ（２，３１４±４３４）、ＧＢ－１（９０８±２８４ＳＦＵ）、ＫＮＳ－６０（２，１７７±４１５ＳＦＵ）、およびＳＦ－１２６（１，７１６±３３２ＳＦＵ）よりも免疫原性が高かった。（図６９Ａ）本明細書でさらに記載されるように、ＬＮ－２２９は、ワクチンカクテルＡに含まれるように選択され、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧは、ワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧおよびＬＮ－２２９の免疫原性は、３つの成分細胞株の８つの異なる組み合わせで評価され、４つの組み合わせに、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが含まれ、４つの組み合わせに、ＬＮ－２２９が含まれた（図６９Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、上記の同じ３人の健常ドナー（ｎ＝４／ドナー）を使用して、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、８つの潜在的なワクチンカクテル内の３つの成分細胞株に対して決定された。ＩＦＮγ応答は、８つのカクテルすべてについて、および各カクテルの各細胞株成分に対して検出された。個々のカクテルの成分細胞株に対する応答は、単一細胞株成分について検出されたＩＦＮγ応答と比較して、著しく減少した。評価された８つの組み合わせすべてにおいて、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧおよびＬＮ－２２９は、依然として最も免疫原性が高かった（図６９Ｂ）。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、多様なＴＡＡを発現するように選択され、ＧＢＭ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ（例えば、ＩＬ１３Ｒα２）、ならびにＧＢＭおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含まれる。本明細書に示されるように、一連のＴＡＡをさらに増強するために、本明細書に記載されているように、ＬＮ－２２９は、ｍｏｄＰＳＭＡをコードする遺伝子で形質導入され、ＳＦ－１２６は、ｍｏｄＴＥＲＴをコードする遺伝子で形質導入され、ＫＮＳ－６０は、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲの活性化変異型をもたらす、ＥＧＦＲの２６７アミノ酸のインフレーム欠失にまたがる１４アミノ配列）をコードする遺伝子で形質導入された。
ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、およびＭＡＧＥＡ１は、６つの成分細胞のうちの１つで内因的に発現され、活性化変異ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＧＢＭ関連ウイルス抗原ｈＣＭＶ ｐｐ６５は、以下に記載されるように、１つ以上の細胞株において、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現されなかった（図７０）。ＳＦ－１２６による形質導入された抗原ｍｏｄＴＥＲＴ（配列番号３５；配列番号３６）の発現（図７１Ａ）、ＬＮ－２２９による形質導入された抗原ｍｏｄＰＳＭＡ（配列番号３７；配列番号３８）の発現（図７１Ｂ）、ＫＮＳ６０による形質導入された抗原ｍｏｄＭＡＧＥＡ１（配列番号３９；配列番号４０）の発現（図７１Ｃ）、ＫＮＳ６０による形質導入された抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３９；配列番号４０）の発現（図７１Ｄ）、およびＫＮＳ６０による形質導入された抗原ｈＣＭＶ ｐｐ６５（配列番号３９；配列番号４０）の発現（図７１Ｅ）は、本明細書に記載されているように、フローサイトメトリーによって検出された。ＫＮＳ６０によるＥＧＦＲｖＩＩＩおよびｈＣＭＶ ｐｐ６５の発現もまた、本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって検出された（図７１Ｆ）。ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５の遺伝子は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されている。形質導入された抗原に対するＩＦＮγ産生は、本明細書に記載されている。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
図７０Ａに、本ワクチンにおける代表的なＴＡＡのｍＲＮＡ発現を示す。本ワクチンは、ＧＢＭ抗腫瘍応答を誘導するために一般に標的化され、臨床的に関連する可能性のある、特定された２２のＴＡＡをすべて高度に発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＧＢＭ腫瘍で豊富であることが知られており、また、いくつかは、ＧＢＭおよび他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘導することもできる。２２の優先順位付けされたＧＢＭのＴＡＡの発現は、同じ方法を使用して、１７０のＧＢＭ患者試料で決定され、１７０の患者試料は、上記のＧＢＭのＣＳＣマーカーの発現を確認するために使用された。優先順位付けされたＧＢＭのＴＡＡのうち、１８のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１９のＴＡＡが９７．２％の試料で発現され、２０のＴＡＡが７９．４％の試料で発現され、２１のＴＡＡが３２．９％の試料で発現され、２２のＴＡＡが１．８％の試料で発現された（図７０Ｂ）。本明細書に提示される発現および免疫原性データに基づいて、表４８で特定される細胞株が、本ＧＢＭワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現
ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６、ＫＮＳ－６０、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧを、ＣＤ２７６のノックダウンに特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈＣＤ２７６、ｃｃｇｇｔｇｃｔｇｇａｇａａａｇａｔｃａａａｃａｇｃｔｃｇａｇｃｔｇｔｔｔｇａｔｃｔｔｔｃｔｃｃａｇｃａｔｔｔｔｔｔ（配列番号７１）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。
ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６、ＫＮＳ－６０、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧを、ＣＤ２７６のノックダウンに特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈＣＤ２７６、ｃｃｇｇｔｇｃｔｇｇａｇａａａｇａｔｃａａａｃａｇｃｔｃｇａｇｃｔｇｔｔｔｇａｔｃｔｔｔｃｔｃｃａｇｃａｔｔｔｔｔｔ（配列番号７１）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。
ＣＤ２７６の発現は、改変細胞株および親細胞株を、１日目（照射前）および３日目（照射後４８時間）に、ＰＥ抗ヒトＣＤ２７６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローンＤＣＮ．７０）で細胞外染色することによって決定した。照射は、ＣＤ２７６の発現レベルに影響を与えず、１日目のＭＦＩ値が報告されている。未染色細胞およびアイソタイプ対照、ＰＥα－マウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローンＭＯＰＣ－２１）で染色された親細胞およびＣＤ２７６ＫＯ細胞が対照として機能した。アイソタイプ対照のＭＦＩは、親細胞株と改変細胞株の両方の報告された値から差し引かれた。ＣＤ２７６の発現の減少率（％）は、１－（ＣＤ２７６ＫＯ細胞株のＭＦＩ／親のＭＦＩ））×１００）として表される。ＭＦＩは、１００，０００細胞に正規化されている。表４９に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ｓｈＲＮＡまたはＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、５８．５％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイ
細胞株を、１００ＧｙでＸ線照射した後、２つの細胞密度（５．０ｅ５および７．５ｅ５）で、６ウェルプレートに、二重にプレーティングした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を分泌アッセイ培地（基本培地＋５％ ＣＴＳ）に交換した。４８時間後、ＥＬＩＳＡ用に培地を回収した。１ウェル当たりの細胞数は、Ｌｕｎａ細胞カウンター（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してカウントした。総細胞数および生細胞数を記録した。ＥＬＩＳＡによって決定された培地中のサイトカインの分泌量は、記録された総細胞数に対して正規化された。
細胞株を、１００ＧｙでＸ線照射した後、２つの細胞密度（５．０ｅ５および７．５ｅ５）で、６ウェルプレートに、二重にプレーティングした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を分泌アッセイ培地（基本培地＋５％ ＣＴＳ）に交換した。４８時間後、ＥＬＩＳＡ用に培地を回収した。１ウェル当たりの細胞数は、Ｌｕｎａ細胞カウンター（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してカウントした。総細胞数および生細胞数を記録した。ＥＬＩＳＡによって決定された培地中のサイトカインの分泌量は、記録された総細胞数に対して正規化された。
ＴＧＦβ１分泌は、ＥＬＩＳＡによって、製造元の説明書に従って決定された（ヒトＴＧＦβ１ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＳＢ１００Ｂ）。上清試料ごとに、４つの希釈液を二重にプレーティングした。ＥＬＩＳＡアッセイの結果がＬＬＤを下回った場合、親細胞株と比較した減少率（％）は、アッセイから回収された細胞の数および検出下限１５．４ｐｇ／ｍＬによって推定された。ＴＧＦβ１が２を超える試料または希釈液で検出された場合、正の値の平均が、実行された試料のｎとともに報告された。
ＴＧＦβ２の分泌は、ＥＬＩＳＡによって、製造元の説明書に従って決定された（ヒトＴＧＦβ２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＳＢ２５０）。上清試料ごとに、４つの希釈液を二重にプレーティングした。ＥＬＩＳＡアッセイの結果がＬＬＤを下回った場合、親細胞株と比較した減少率（％）は、アッセイから回収された細胞の数および検出下限７．０ｐｇ／ｍＬによって推定された。ＴＧＦβ２が２を超える試料または希釈液で検出された場合、正の値の平均が、実行された試料のｎとともに報告された。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＥＬＩＳＡによって、製造元の説明書に従って決定された（ＧＭ－ＣＳＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＳＧＭ００）。上清試料ごとに、４つの希釈液を二重にプレーティングした。ＥＬＩＳＡアッセイの結果がＬＬＤを下回った場合、親細胞株と比較した増加率（％）は、アッセイから回収された細胞の数および検出下限３．０ｐｇ／ｍＬによって推定された。ＧＭ－ＣＳＦが２を超える試料または希釈液で検出された場合、正の値の平均が、実行された試料のｎとともに報告された。
ＩＬ－１２の分泌は、製造元の説明書に従って、ＥＬＩＳＡによって決定された（ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１２（ｐ７０）ＥＬＩＳＡ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４３１７０７）。上清試料ごとに、４つの希釈液を二重にプレーティングした。ＥＬＩＳＡアッセイの結果がＬＬＤを下回った場合、増加率（％）は、アッセイから回収された細胞の数および検出下限１．２ｐｇ／ｍＬによって推定された。ＩＬ－１２が２を超える試料または希釈液で検出された場合、正の値の平均が、実行された試料のｎとともに報告された。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを上記のように決定した。ＧＢＭワクチンＡの親細胞株のうち、ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、およびＳＦ－１２６は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＧＢＭワクチンＢの親細胞株のうち、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例５に記載されており、得られたレベルを上記のように決定した。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを上記のように決定した。ＧＢＭワクチンＡの親細胞株のうち、ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、およびＳＦ－１２６は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＧＢＭワクチンＢの親細胞株のうち、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例５に記載されており、得られたレベルを上記のように決定した。
ＧＢＭ起源の５成分細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１の分泌を減少させた。ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子は、異なるプロモーターの制御下で膜結合ＣＤ４０Ｌを発現する遺伝子もコードしていた。これにより、ＴＧＦβ１の同時減少および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が可能になった。続いて、ＳＦ－１２６およびＫＮＳ６０を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡおよびＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）をコードするレンチウイルス粒子で形質導入した。これにより、両方の細胞株で、ＴＧＦβ２の同時減少およびＧＭ－ＣＳＦの発現が可能になった。
ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧおよびＧＢ－１は、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡのみで遺伝子改変された。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、細胞の増殖および生存を促進する。一部の細胞株では、一部の腫瘍と同様に、ＴＧＦβシグナル伝達の低下が、増殖停止を誘導し、細胞死を引き起こす可能性がある。ＧＢＭなどの神経細胞では、ＴＧＦβシグナル伝達の喪失が細胞死にも関連している。ＴＧＦβ１のノックダウンを、改変用に選択した。これは、ＴＧＦβ２と比較して、ＴＧＦβ１がより強力な免疫抑制因子であり、ある程度ＴＧＦβシグナル伝達を維持することが、これらの細胞株の増殖および生存に必要である可能性が高いと考えられているためである。ＬＮ－２２９は、低いが検出可能なレベルでＴＧＦβ２を分泌し、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡで改変されなかった。これらの細胞は、クローン名ＤＫ２で表される。実施例２６に記載されているように、ＤＭＳ５３は、ＴＧＦβ１ではなく、ＴＧＦβ２の分泌を減少させるようにｓｈＲＮＡで改変された。これらの細胞は、クローン名ＤＫ４で表される。残りの細胞株は、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡおよびＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡで二重改変された。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。
表５０は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率（％）を示す。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が４９％～８０％減少した。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が５１％～９９％減少した。ＴＧＦβ１ ｓｈＲＮＡ改変ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧは、未改変親細胞株よりも少なくＴＧＦβ２を分泌した。改変細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の低下は、複数の独立した実験で確認された。ＴＧＦβ１のノックダウン後のＴＧＦβ２の分泌の低下は、他の成分細胞株では観察されなかった。
表５１に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＧＢＭワクチンＡおよびＧＢＭワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＧＢＭワクチンＡにより、ＴＧＦβ１の分泌が７５％、ＴＧＦβ２では６２％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＧＢＭワクチンＢにより、ＴＧＦβ１の分泌が５１％、ＴＧＦβ２では７４％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
２つのＧＢＭ成分細胞であるＫＮＳ６０およびＳＦ－１２６を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと異なるプロモーターの制御下でＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。これにより、ＴＧＦβ２の分泌およびＧＭ－ＣＳＦの発現を同時に減少させることができた。ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、およびＧＢ－１細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表５２に示され、以下に記載される。
２つのＧＢＭ成分細胞であるＫＮＳ６０およびＳＦ－１２６を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと異なるプロモーターの制御下でＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。これにより、ＴＧＦβ２の分泌およびＧＭ－ＣＳＦの発現を同時に減少させることができた。ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、およびＧＢ－１細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表５２に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも１９，０００倍増加した。ＧＢＭワクチンＡ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＬＮ－２２９で、親細胞株（≦０．００２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３０３，０００倍増加し、ＧＢ－１で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４０９，０００倍増加し、ＳＦ－１２６で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１９，０００倍増加した。ＧＢＭワクチンＢ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧで、親細胞株（≦０．００２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１，２０９，５００倍増加し、ＫＮＳ６０で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１０９，６６７倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（≦０．００４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３９，４５０倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＧＢＭワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、５３７ｎｇ／用量／２４時間であった。ＧＢＭワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１，４５４ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり１，９９１ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＧＢＭ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法が本明細書に記載されている。ＣＤ４０Ｌを発現するようにＤＭＳ５３を変更するために使用される方法は、例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＧＢＭ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法が本明細書に記載されている。ＣＤ４０Ｌを発現するようにＤＭＳ５３を変更するために使用される方法は、例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。
ＣＤ４０Ｌの発現は、実施例１５に記載されているように、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ４０Ｌの発現は、１日目（照射前）と３日目（照射後）に測定された。照射は発現レベルに影響を与えず、１日目のＣＤ４０Ｌの発現が報告されている。アイソタイプ対照のＭＦＩを差し引くと負の値になる場合、１．０のＭＦＩを使用して、未改変細胞株と比較した改変成分細胞株によるＣＤ４０Ｌの発現の増加倍率を計算した。図７２に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌの膜発現が、６つの細胞ＧＢＭワクチン成分細胞株すべてで実質的に増加したことを示す。
図７２は、ＧＢＭワクチン成分細胞株による膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を示す。膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも１７２倍増加した。ＧＢＭワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現が、ＬＮ－２２９（１１，６２８ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１１，６２８倍増加し、ＧＢ－１（４，４６４ＭＦＩ）で、親細胞株（１９ＭＦＩ）と比較して、２３３倍増加し、ＳＦ－１２６（５，５２６）で、親細胞株（３２ＭＦＩ）と比較して、１７２倍増加した。ＧＢＭワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧで、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、２０，５１０倍増加し、ＫＮＳ６０で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、５，５９９倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１－増加した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表５３に示され、以下に記載される。
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表５３に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも４５，０００倍増加した。ＧＢＭワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、ＬＮ－２２９で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、８１，０００倍増加し、ＧＢ－１で、親細胞株（≦０．０００２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、５０，０００倍増加し、ＳＦ－１２６で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４５，０００倍した。ＧＢＭワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧで、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３３，５６０倍増加し、ＫＮＳ６０で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１１６，０００倍増加した。ＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＧＢＭワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、６９ｎｇ／用量／２４時間であった。ＧＢＭワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、１２５ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり１９４ｎｇであった。
ＬＮ－２２９細胞株によるｍｏｄＰＳＭＡの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、ＧＢＭ抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＬＮ－２２９細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、ＧＢＭ抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＬＮ－２２９細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。
ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変親細胞および改変細胞を、０．０６μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ２６８０６１，クローンＦＯＬＨ１／３７３４）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。アイソタイプ対照で染色された親細胞および改変細胞のＭＦＩは、抗ＰＳＭＡで染色された細胞のＭＦＩから差し引いた。ＭＦＩは、１００，０００事象に正規化された。抗原の発現の増加倍率は、（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた親のＭＦＩ）として計算した。ＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（５３３，５７７ＭＦＩ）で、親細胞株（１４，００８ＭＦＩ）の発現よりも３８倍増加した（図７１Ｂ）。
ＫＮＳ６０細胞株によるｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ－ｐｐ６５の安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＫＮＳ６０細胞株は、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入された。ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原は、フーリン切断部位（配列番号３９、配列番号４０）によって連結されている。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＫＮＳ６０細胞株は、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入された。ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原は、フーリン切断部位（配列番号３９、配列番号４０）によって連結されている。
ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、およびＥＧＦＲｖＩＩＩの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変親細胞および改変細胞を細胞内で染色して、以下のように各抗原の発現を検出した。ｍｏｄＭＡＧＥＡ１を検出するために、細胞を、最初に、マウスＩｇＧ１抗ＭＡＧＥＡ１抗体（ＳＣ－７１５３９，クローン３Ｆ２５６）（０．０３ｕｇ／試験）で染色し、続いて、ＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）（０．１２５ｕｇ／試験）で染色した。ｈＣＭＶｐｐ６５を検出するために、細胞を、最初に、マウスＩｇＧ１抗ｐｐ６５抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ３１６２４，クローン１－Ｌ－１１）（０．０６ｕｇ／試験）で染色し、続いて、ＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）（０．１２５ｕｇ／試験）で染色した。ＥＧＦＲｖＩＩＩを検出するために、細胞を、最初に、マウスＩｇＧ１抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（Ｎｏｖｕｓ ＮＢＰ２－５０５９９，クローンＤＨ８．３）（０．０６ｕｇ／試験）で染色し、続いて、ＡＦ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）（０．１２５ｕｇ／試験）で染色した。アイソタイプ対照で染色された細胞のＭＦＩは、ＭＡＧＥＡ１、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、またはＥＧＦＲｖＩＩＩで染色された細胞のＭＦＩから差し引いた。ＭＦＩは、１００，０００事象に正規化された。抗原の発現の増加倍率は、（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた親のＭＦＩ）として計算した。
ｈＣＭＶ ｐｐ６５およびＥＧＦＲｖＩＩＩの発現はまた、ＲＴ－ＰＣＲによって確認された（図８１Ｆ）。ＲＮＡの単離には、１．０～３．０×１０6細胞を使用した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌＴＭ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，カタログ番号：Ｒ２０５１）を使用して、製造元の説明書に従って、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの定量化は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＯｎｅＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、カタログ番号１３－４００－５１９）を使用して行った。逆転写の場合、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ，カタログ番号：９５０４８－０２５）を使用して、製造元の説明書に従って、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ合成が完了した後、反応物を２倍に希釈し、２μＬのｃＤＮＡを増幅に使用した。ｈＣＭＶ ｐｐ６５の場合、フォワードプライマー（ＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＡＡＧＡＧ（配列番号１１８））は、導入遺伝子の１９２５～１９４５塩基対（ｂｐ）の位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴＣＣ（配列番号１１９））は、導入遺伝子の２４１４～２４３５ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、５１１ｂｐの産物を生成する。ＥＧＦＲｖＩＩＩの場合、フォワードプライマー（ＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＧ（配列番号１２０））は、導入遺伝子の８３９～８５８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＧＣＣＧＧＴＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＴＧＣＴ（配列番号１２１））は、導入遺伝子の１２５２～１２７１ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、４３３ｂｐの産物を生成する。バリアント１、エキソン１（ＴＧＴＣＴＡＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＧ（配列番号１２２））およびエキソン４（ＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＡＣ（配列番号１２３））にアニーリングするβ－チューブリンプライマーを、対照として使用した。ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびβ－チューブリンを検出するためのＰＣＲは、以下のように完了した：９８℃で３０秒間の最初の変性、続いて、２５サイクルの、９８℃で５～１０秒間の変性、５８℃で１０～３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長。２５サイクル後、７２℃で２分間の最終伸長を完了した。反応物は、ゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の検出まで、１０℃で保持した。ＰＣＲの完了後、Ｌｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ Ｐｕｒｐｌｅ（６×）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，＃Ｂ７０２４Ｓ）を、１×濃度で添加した。次いで、ＰＣＲ産物を、８μＬのｅｘＡＣＴ Ｇｅｎｅ１００ｂｐラダー（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，＃ＢＰ２５７３１００）とともに、２％のアガロースゲル（Ｌｏｎｚａ ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＬＥアガロース，＃５０００４）で泳動し、バンドのサイズを推定した。バンドを適切に分離した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像システム（ＢｉｏＲＡＤ，＃１７００１４０１）を使用して、ゲルを撮像した。β－チューブリン遺伝子による相対的な定量化には、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ６．０（ＢｉｏＲＡＤ）を使用した。
ｍｏｄＭＡＧＥＡ１の発現は、改変細胞株（１４０，３４２ＭＦＩ）で、親細胞株（３，４６０ＭＦＩ）の発現の４１倍増加した（図７１Ｃ）。改変細胞株（９，５４５ＭＦＩ）によるｈＣＭＶ ｐｐ６５の発現は、親細胞株（０ＭＦＩ）の発現の９，５４５倍に増加した。ｐｐ６５で染色された親ＫＮＳ６０のＭＦＩからアイソタイプ対照のＭＦＩを差し引くと、負の値になった。改変細胞株におけるｐｐ６５の発現の増加倍率は、１ＭＦＩを使用して計算した（図７１Ｅ）。改変細胞株（４，９２５ＭＦＩ）によるＥＧＦＲｖＩＩＩの発現は、親細胞株（１，０５３ＭＦＩ）の発現よりも５倍増加した（図７１Ｄ）。
ＳＦ－１２６細胞株によるｍｏｄＴＥＲＴの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＳＦ－１２６細胞株を、ｍｏｄＴＥＲＴ抗原（配列番号３５、配列番号３６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＳＦ－１２６細胞株を、ｍｏｄＴＥＲＴ抗原（配列番号３５、配列番号３６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。
ｍｏｄＴＥＲＴの発現はフローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変親細胞および改変細胞を、抗ウサギＩｇＧ１抗ＴＥＲＴ抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ３２０２０，クローンＹ１８２）（０．０３μｇ／試験）、続いて、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）（０．１２５ｕｇ／試験）で細胞内染色した。ＭＦＩは、１００，０００事象に正規化された。アイソタイプ対照、染色された親細胞および改変細胞のＭＦＩは、親細胞および改変細胞について染色された細胞のＭＦＩから差し引いた。抗原の発現の増加倍率は、（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた親のＭＦＩ）として計算した。ｍｏｄＴＥＲＴの発現は、改変細胞株（２８１，９０４ＭＦＩ）で、親細胞株（１０，５７８ＭＦＩ）の発現よりも２７倍増加した（図７１Ａ）。
ＧＢＭワクチンＢにおけるＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５に対する免疫応答
ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５抗原に対するＩＦＮγ応答は、ＧＢＭワクチンＢとの関連で評価された。具体的には、５×１０5個の改変ＤＭＳ５３、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、およびＫＮＳ６０細胞株（合計１．５×１０6の改変細胞）を、８人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）からの１．５×１０6個のｉＤＣと共培養した。表５４に、８人のドナーの各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＭＨＣクラスＩ多様ドナーにおいて免疫応答を生成する能力は、ＧＢＭワクチンが、多様な患者集団でＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する可能性があり、特定のＭＨＣアレルにクラスが限定されないことを示す。ＣＤ１４－ＰＢＭＣは、６日目に、ＤＣとの共培養から単離され、ＩＦＮγ産生細胞を検出する前の２４時間、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ペプチドプール（天然タンパク質配列にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒ、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒ）で刺激された。ペプチドは、以下のように調達された。ＥＧＦＲｖＩＩＩ、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＭＡＧＥＡ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ１）およびｈＣＭＶ ｐｐ６５（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＰ６５－１）から購入した。ＭＡＧＥＡ１に対するＩＦＮγ応答は、未改変ＧＢＭワクチンＢ（２２５±６４ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＢ（１，３２３±４４２ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．００５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図７１Ｉ）。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＢＭワクチンＢ（１６５±９３ＳＦＵ）と比較して、改変されたＧＢＭワクチンＢ（８５５±２３１ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０４９、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図７１Ｊ）。ｈＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＢＭワクチンＢ（８１４±２２９ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＢ（５，２８３±１，４３４ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図７１Ｋ）。
ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５抗原に対するＩＦＮγ応答は、ＧＢＭワクチンＢとの関連で評価された。具体的には、５×１０5個の改変ＤＭＳ５３、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、およびＫＮＳ６０細胞株（合計１．５×１０6の改変細胞）を、８人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）からの１．５×１０6個のｉＤＣと共培養した。表５４に、８人のドナーの各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＭＨＣクラスＩ多様ドナーにおいて免疫応答を生成する能力は、ＧＢＭワクチンが、多様な患者集団でＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する可能性があり、特定のＭＨＣアレルにクラスが限定されないことを示す。ＣＤ１４－ＰＢＭＣは、６日目に、ＤＣとの共培養から単離され、ＩＦＮγ産生細胞を検出する前の２４時間、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ペプチドプール（天然タンパク質配列にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒ、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒ）で刺激された。ペプチドは、以下のように調達された。ＥＧＦＲｖＩＩＩ、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＭＡＧＥＡ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ１）およびｈＣＭＶ ｐｐ６５（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＰ６５－１）から購入した。ＭＡＧＥＡ１に対するＩＦＮγ応答は、未改変ＧＢＭワクチンＢ（２２５±６４ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＢ（１，３２３±４４２ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．００５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図７１Ｉ）。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＢＭワクチンＢ（１６５±９３ＳＦＵ）と比較して、改変されたＧＢＭワクチンＢ（８５５±２３１ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０４９、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図７１Ｊ）。ｈＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＢＭワクチンＢ（８１４±２２９ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＢ（５，２８３±１，４３４ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図７１Ｋ）。
ＧＢＭワクチンＡにおけるＰＳＭＡおよびＴＥＲＴに対する免疫応答
ＰＳＭＡおよびＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、ＧＢＭワクチンＡとの関連で評価された。具体的には、５×１０5個の改変ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、およびＳＦ－１２６細胞株（合計１．５×１０6の改変細胞）を、８人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）からの１．５×１０6個のｉＤＣと共培養し（表５４）、ＩＦＮγ応答を、上記のように、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。天然抗原の長さにまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのＰＳＭＡペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。完全長の天然抗原をカバーするＴＥＲＴペプチドは、ＪＰＴ（ＰＭ－ＴＥＲＴ）から購入した。ＴＥＲＴ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＧＢＭワクチンＡ（２３１±１０２ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＡ（１，２８４±２５８ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図７１Ｇ）。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＧＢＭワクチンＡ（１５４±２２ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＡ（１，２１０±３４８ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０２８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図７１Ｈ）。
ＰＳＭＡおよびＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、ＧＢＭワクチンＡとの関連で評価された。具体的には、５×１０5個の改変ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、およびＳＦ－１２６細胞株（合計１．５×１０6の改変細胞）を、８人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）からの１．５×１０6個のｉＤＣと共培養し（表５４）、ＩＦＮγ応答を、上記のように、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。天然抗原の長さにまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのＰＳＭＡペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。完全長の天然抗原をカバーするＴＥＲＴペプチドは、ＪＰＴ（ＰＭ－ＴＥＲＴ）から購入した。ＴＥＲＴ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＧＢＭワクチンＡ（２３１±１０２ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＡ（１，２８４±２５８ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図７１Ｇ）。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＧＢＭワクチンＡ（１５４±２２ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＡ（１，２１０±３４８ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０２８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図７１Ｈ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
関連するＧＢＭ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導する個々の成分細胞株および２つのＧＢＭワクチンカクテルの能力をＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。８人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表５４）を、ＧＢＭ－ＡカクテルまたはＧＢＭ－Ｂカクテルと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールをロードした自己ＤＣで刺激した。ＣＤ１４－ＰＢＭＣを刺激するためのペプチドは、以下のように供給された。９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのカスタムペプチドライブラリーは、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、およびＥＧＦＲｖＩＩＩについてＰｉｅｒｃｅから注文した。１１アミノ酸が重複する追加の１５ｍｅｒのペプチドプールは、以下のように供給された：ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、ＭＡＧＥＡ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ１）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＷＴ１（ＨＥＲ２（ＪＰＴ，ＰＭ－ＥＲＢ＿ＥＣＤ）、ＳＴＥＡＰ（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＰ６５－１）。次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、細胞を、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。
関連するＧＢＭ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導する個々の成分細胞株および２つのＧＢＭワクチンカクテルの能力をＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。８人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表５４）を、ＧＢＭ－ＡカクテルまたはＧＢＭ－Ｂカクテルと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールをロードした自己ＤＣで刺激した。ＣＤ１４－ＰＢＭＣを刺激するためのペプチドは、以下のように供給された。９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのカスタムペプチドライブラリーは、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、およびＥＧＦＲｖＩＩＩについてＰｉｅｒｃｅから注文した。１１アミノ酸が重複する追加の１５ｍｅｒのペプチドプールは、以下のように供給された：ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、ＭＡＧＥＡ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ１）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＷＴ１（ＨＥＲ２（ＪＰＴ，ＰＭ－ＥＲＢ＿ＥＣＤ）、ＳＴＥＡＰ（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＰ６５－１）。次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、細胞を、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。
先進国の人口の約６０～７０％がｈＣＭＶ陽性（Ｈｙｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７）であり、健常ドナーのｈＣＭＶ状態は不明である。ＧＢＭワクチン中のｈＣＭＶ ｐｐ６５抗原は、健常ドナーＰＢＭＣの既存のメモリー応答をブーストし、デノボ応答をプライミングしなかった可能性がある。このため、ｈＣＭＶに対する応答は、他の９つの優先順位付けされたＴＡＡとは別に示され、図７３、図７４、または表５５に示されるＴＡＡ応答には含まれていない。図７１Ｊに、親対照またはＧＢＭワクチンで刺激した場合のドナーＰＢＭＣのｈＣＭＶ ｐｐ６５抗原に対する応答を示す。ｐｐ６５に対するＩＦＮγ応答は、親対照と比較して、８人のドナーのうち７人で、ＧＢＭワクチンにより有意に増加した。具体的には、ＫＮＳ６０によるｈＣＭＶ ｐｐ６５の発現は、親未改変ＧＢＭワクチンＡ（８１４±２２９ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＢＭワクチンＡ（５，２８３±１，４３４ＳＦＵ）との関連で、ｐｐ６５特異的なＩＦＮγ応答を有意に増加させた（ｐ＝０．００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
図７３は、ＧＢＭワクチンが、８人のＨＬＡ多様ドナーで抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導し、未改変親対照（２，７６９±６９１ＳＦＵ）と比較して、有意に強力であることを示す（ｐ＝０．００４、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図７３Ａ）。ＧＢＭワクチンＡおよびＧＢＭワクチンＢは、独立して、親対照と比較して、有意に大きい抗原特異的応答を示した。具体的には、ＧＢＭワクチンＡは、未改変対照（１，７１８±５５６ＳＦＵ）と比較して、７，７１６±２，３０８ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．０３８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図７３Ｂ）。ＧＢＭワクチンＡの場合、ｈＣＭＶ（ｎ＝９抗原）を除いて、１人のドナーが４つの抗原に応答し、３人のドナーが７つの抗原に応答し、１人のドナーが８つの抗原に応答し、３人のドナーが９つの抗原に応答した。ＧＢＭワクチンＢは、親対照（１，０５１±３６５ＳＦＵ）と比較して、９，６０１±２，４１３ＳＦＵを誘発した（ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図７３Ｃ）。ＧＢＭワクチンＢの場合、ｈＣＭＶ（ｎ＝９抗原）を除いて、２人のドナーが７つの抗原に応答し、３人のドナーが８つの抗原に応答し、３人のドナーが９つの抗原に応答した。ＧＢＭワクチン（ワクチンＡおよびワクチンＢ）は、８人のドナーのうちの７人の９つの非ウイルス抗原すべてに対してＩＦＮγ産生を誘導した（図７４）（表５５）。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣまたはＪＣＲＢから供給される６つのがん細胞株ＬＮ－２２９（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２６１１）、ＧＢ－１（ＪＣＲＢ，ＩＦＯ５０４８９）、ＳＦ－１２６（ＪＣＲＢ，ＩＦＯ５０２８６）、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０２０）、ＫＮＳ６０（ＪＣＲＢ，ＩＦＯ５０３５７）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む多形神経膠芽腫のための全細胞ワクチンを、表５６に示す。細胞株は、５つの神経膠芽腫細胞株および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用してエレクトロポレーションによってノックアウトされるか、またはレンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡ形質導入を使用してノックダウンされる。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ｍｏｄＰＳＭＡ（ＬＮ－２２９）、ｍｏｄＴＥＲＴ（ＳＦ－１２６）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１（ＫＮＳ６０）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＫＮＳ６０）、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５（ＫＮＳ６０）の遺伝子は、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加された。
実施例３０：大腸癌（ＣＲＣ）ワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＣＲＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＣＲＣワクチンＡは、細胞株ＨＣＴ－１５、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＨｕＴｕ－８０、および細胞株ＬＳ４１１Ｎから構成されている。第２のカクテルであるＣＲＣワクチンＢは、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ならびにＫＲＡＳ変異Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖも発現するように改変された細胞株ＨＣＴ－１１６、細胞株ＲＫＯ、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＣＲＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＣＲＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＣＲＣワクチンＡは、細胞株ＨＣＴ－１５、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＨｕＴｕ－８０、および細胞株ＬＳ４１１Ｎから構成されている。第２のカクテルであるＣＲＣワクチンＢは、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ならびにＫＲＡＳ変異Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖも発現するように改変された細胞株ＨＣＴ－１１６、細胞株ＲＫＯ、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＣＲＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の抗原をまとめて発現する。
大腸ワクチン成分の特定
ＣＲＣワクチンに含まれる可能性のある最初の細胞株選択基準を使用して、１６のワクチン成分細胞株が特定された。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、１６の候補細胞株を８つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＣＲＣ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＣＲＣ関連ＣＳＣマーカーＡＬＤＨ１、ｃ－ｍｙｃ、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、ＥｐＣＡＭ、Ｌｇｒ－５、およびＳＡＬＬ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、マイクロサテライト不安定性、ならびにＣＲＣ組織学的サブタイプが含まれた。
ＣＲＣワクチンに含まれる可能性のある最初の細胞株選択基準を使用して、１６のワクチン成分細胞株が特定された。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、１６の候補細胞株を８つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＣＲＣ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＣＲＣ関連ＣＳＣマーカーＡＬＤＨ１、ｃ－ｍｙｃ、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、ＥｐＣＡＭ、Ｌｇｒ－５、およびＳＡＬＬ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、マイクロサテライト不安定性、ならびにＣＲＣ組織学的サブタイプが含まれた。
ＣＳＣは、大腸癌の転移および再発に重要な役割を果たす（表２）。ＣＲＣ腫瘍による９つのＣＲＣ関連ＣＳＣマーカーの発現は、公開されているデータベースｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）（Ｃｅｒａｍｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１２．、Ｇａｏ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３．）から、２０１９年１０月１日から２０２０年１０月２０日までの間にダウンロードされた患者腫瘍試料データにおいて確認された（図７５Ｃ）。ＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会（ＨＧＮＣ）の遺伝子記号が検索に含まれ、各ＣＳＣマーカーについて、ＲＳＥＭで正規化されたｍＲＮＡの存在量がダウンロードされた。１，５３４人のＣＲＣ患者試料のうち、５９２人の試料が、上記の１０のＣＳＣマーカーについて利用可能なｍＲＮＡ発現データを有した。試料は、Ｌｏｇ10（ＲＳＥＭ＋１）＞０の場合、ＣＲＣのＣＳＣマーカーの発現を陽性とみなした。５９２試料内の０．８％が８つのＣＳＣマーカーを発現し（ｎ＝５）、４３．９％が９つのＣＳＣマーカーを発現し（ｎ＝２６０）、５５．２％が１０のＣＳＣマーカーを発現した。
候補成分細胞株によるＴＡＡおよびＣＳＣマーカーの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号がＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡの発現が各ＴＡＡまたはＣＳＣマーカーについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値（ＦＰＫＭ）が１より大きい場合、細胞株によるＴＡＡまたはＣＳＣマーカーの発現を陽性とみなした。上記の選択基準に基づいて、１６のＣＲＣワクチン候補成分のうちの９つが、さらなる評価のために特定された：ＨＣＴ－１５、ＳＷ１４６３、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ８０、ＨＣＴ－１１６、ＬｏＶｏ、Ｔ８４、ＬＳ４１１Ｎ、およびＳＷ４８。９つの候補成分細胞株は、４～８つのＣＳＣマーカー（図７５Ｂ）および７～１２のＴＡＡ（図７５Ａ）を発現した。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様細胞株のＤＭＳ５３は、６つの細胞株のうちの１つとして含まれ、１５のＣＲＣのＴＡＡを発現した。
未改変ＣＲＣ成分細胞株候補の免疫原性は、２人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）について、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ドナー１のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊４０：０１およびＡ＊３０：０１Ｂ Ｂ＊５７：０１であった。ドナー２のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊２４：０２ Ｂ＊１８：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０７であった。ＨＣＴ－１５（２，３７５±７７４ＳＦＵ）およびＬｏＶｏ（１，７５８±３１１ＳＦＵ）は、ＳＷ１４６３（１７０±９０ＳＦＵ）、ＲＫＯ（２８０±１０２）、ＨｕＴｕ８０（８０±４７）、ＨＣＴ－１１６（９８１±４３３）、Ｔ８４（４０６±１８５ＳＦＵ）、ＬＳ４１１Ｎ（４９６±２１３）、およびＳＷ４８（６３６±２８９ＳＦＵ）よりも免疫原性が高かったＳＦＵ）（図７６Ａ）。ＨＣＴ－１５およびＬｏＶｏは、本明細書にさらに記載されるように、ワクチンカクテルＡまたはワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
ＨＣＴ－１５およびＬｏＶｏの免疫原性は、３つの成分細胞株の８つの異なる組み合わせで評価され、４つの組み合わせに、ＨＣＴ－１５が含まれ、４つの組み合わせに、ＬｏＶｏが含まれた（図７６Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、上記の同じ２人のドナー（ｎ＝４／ドナー）を使用して、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、８つの潜在的なワクチンカクテル内の３つの成分細胞株に対して決定された。ＩＦＮγ応答は、８つのカクテルすべてについて、および各カクテル中の各細胞株成分に対して検出された（図７６Ｂ）。
個々の細胞株に対してＩＦＮγ応答を誘導する潜在的なＣＲＣワクチンカクテルの能力と比較して、それ自体に対してＩＦＮγ応答を誘導する個々のＣＲＣワクチン成分細胞株の能力を、実施例８および９に記載されるように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。図７７のデータは、カクテルＣＲＣ－Ａ、ＣＲＣ－Ｂ、ＣＲＣ－Ｃ、ＣＲＣ－Ｄ、ＣＲＣ－Ｅ、ＣＲＣ－Ｆ、ＣＲＣ－Ｇ、およびＣＲＣ－Ｈ（図７６Ｃ）が、場合によっては、個々の成分細胞株よりも良好な抗腫瘍免疫の刺激因子の傾向を示すか、または有意に良好な抗腫瘍免疫の刺激因子であることを示し、一度に複数の細胞株を投与することによって、応答の幅が広がることを示唆する。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、多様なＴＡＡを発現するように選択され、ＣＲＣ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ（例えば、ＣＥＡ）、ならびにＣＲＣおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含まれる。本明細書に示されるように、一連のＴＡＡをさらに増強するために、本明細書に記載されているように、ＨｕＴｕ８０は、ｍｏｄＰＳＭＡをコードする遺伝子で形質導入され、ＨＣＴ－１１６は、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ならびにそれぞれＫＲＡＳ変異Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖ（ＫＲＡＳの活性化変異型をもたらす）にまたがる２８アミノ酸も発現するように改変された。ＫＲＡＳ変異は、ＣＲＣ患者の約３５％～４５％で発生する。ＫＲＡＳ Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ｄは、ＣＲＣ患者で最も頻繁に発生する複数のＫＲＡＳ変異である。
ＰＳＭＡは、以下に記載されるように、６つの成分細胞株のうちの１つで、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現された。ＴＢＸＴおよびＷＴ１は、６つの成分細胞株のいずれにおいても、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現されなかった（図７８Ａ）。ＫＲＡＳ変異Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖは、６つの成分細胞株のいずれによっても、内因的に発現されなかった。ＫＲＡＳ変異の内因性発現は、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを使用して決定された。細胞株データセットは、ＨＧＮＣ遺伝子記号（ＫＲＡＳ）で検索され、各細胞株は、「変異」データセット内で検索された。ＣＲＣ腫瘍において頻繁に発現されるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ変異は、ＨＣＴ－１５およびＨＣＴ－１１６によって内因的に発現された。
図７８Ａに、本ワクチンにおける代表的なＴＡＡのｍＲＮＡ発現を示す。本ワクチンは、ＣＲＣ抗腫瘍応答を誘発するために一般に標的化され、臨床的に関連する可能性のある、特定された２０のＴＡＡをすべて高度に発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＣＲＣ腫瘍で豊富であることが知られており、また、いくつかは、ＣＲＣおよび他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘導することもできる。２０の優先順位付けされたＣＲＣのＴＡＡのＲＮＡ存在量は、上記のように、すべてのＴＡＡで利用可能な発現データを用いて、３６５のＣＲＣ患者試料で決定され、患者試料のＣＳＣマーカーの発現が決定された。優先順位付けされたＣＲＣのＴＡＡのうち、１４のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１５のＴＡＡが９４．５％の試料で発現され、１６のＴＡＡが６５．８％の試料で発現され、１７のＴＡＡが４２．２％の試料で発現され、１８のＴＡＡが２５．８％の試料で発現され、１９のＴＡＡが１１．５％の試料で発現され、２０のＴＡＡが１．４％の試料で発現された（図７８Ｂ）。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（ｎ＝４０）またはＧ１２Ｖ（ｎ＝３７）変異は、３６５のＣＲＣ患者腫瘍試料の２１．１％（ｎ＝７７）で発現された。ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ変異は、２つの成分細胞株によって内因的に発現され、３６５人のＣＲＣ患者の腫瘍試料の７．７％（ｎ＝２８）で発現された。したがって、治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物が本明細書に提供され、細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図されたＣＲＣがん対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１４のＴＡＡを発現する。
ＨｕＴｕ８０による形質導入された抗原ｍｏｄＰＳＭＡ（配列番号３７；配列番号３８）（図７９Ａ）の発現、ならびにＨＣＴ－１１６による形質導入された抗原ｍｏｄＴＢＸＴ（配列番号４９；配列番号５０）（図７９Ｂ）およびｍｏｄＷＴ１（配列番号４９；配列番号５０）（図７９Ｃ）の発現は、本明細書に記載されているように、フローサイトメトリーによって検出された。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（配列番号４９；配列番号５０）（図８９Ｄ）およびＧ１２Ｖ（配列番号４９；配列番号５０）（図７９Ｄ）をコードする遺伝子は、本明細書の実施例２９に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって検出された。ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖをコードする遺伝子は、フーリン切断部位（配列番号Ｘ）によって分離された同じレンチウイルス導入ベクターにサブクローニングされる。形質導入された抗原に対するＩＦＮγ産生は、本明細書に記載されている。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
本明細書に提示される発現および免疫原性データに基づいて、表５７で特定される細胞株が、本ＣＲＣワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現の減少
ＨＣＴ－１５、ＨｕＴｕ－８０、ＬＳ４１１Ｎ、ＨＣＴ－１１６、ＲＫＯ、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表５８に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９９．６％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＨＣＴ－１５、ＨｕＴｕ－８０、ＬＳ４１１Ｎ、ＨＣＴ－１１６、ＲＫＯ、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表５８に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９９．６％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイ
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＣＲＣワクチンＡのすべての親細胞株－分泌された測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＨｕＴｕ８０も測定可能なレベルのＴＧＦβ２を分泌した。ＣＲＣワクチンＢの親細胞株のうち、ＨＣＴ－１１６およびＲＫＯは、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例５に記載されており、得られたレベルを上記のように決定した。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＣＲＣワクチンＡのすべての親細胞株－分泌された測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＨｕＴｕ８０も測定可能なレベルのＴＧＦβ２を分泌した。ＣＲＣワクチンＢの親細胞株のうち、ＨＣＴ－１１６およびＲＫＯは、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例５に記載されており、得られたレベルを上記のように決定した。
ＣＲＣ起源の５つの成分細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。これらの細胞は、クローン名ＤＫ２で表される。続いて、ＨｕＴｕ８０を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡおよびＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）をコードするレンチウイルス粒子で形質導入した 実施例２９。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。実施例２６に記載されているように、ＤＭＳ５３は、ＴＧＦβ１ではなく、ＴＧＦβ２の分泌を減少させるようにｓｈＲＮＡで改変された。これらの細胞は、クローン名ＤＫ４で表される。残りの細胞株は、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡおよびＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡで二重改変された。
表５９は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率を示す。ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌が、ＥＬＩＳＡアッセイで実行された１６回の反復のうちの１回でのみ検出された場合、その値は、平均の標準誤差なしで報告される。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が、少なくとも４９％減少した。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が、少なくとも５１％減少した。
表６０に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＣＲＣワクチンＡおよびＣＲＣワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＣＲＣワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、８２％減少し、ＴＧＦβ２は、９５％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＣＲＣワクチンＢによるＴＧＦβ１の分泌は、５９％減少し、ＴＧＦβ２は、４９％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
ＨｕＴｕ８０細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと異なるプロモーターの制御下でＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＨＣＴ－１５、ＬＳ４１１Ｎ、ＨＣＴ－１１６、およびＲＫＯ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表６１に示され、以下に記載される。
ＨｕＴｕ８０細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと異なるプロモーターの制御下でＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＨＣＴ－１５、ＬＳ４１１Ｎ、ＨＣＴ－１１６、およびＲＫＯ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表６１に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも９，１８２倍増加した。ＣＲＣワクチンＡ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＨＣＴ－１５で、親細胞株（≦０．００２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２９，５００倍増加し、ＨｕＴｕ８０で、親細胞株（≦０．０１１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、９，１８２倍増加し、ＬＳ４１１Ｎで、親細胞株（≦０．００４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３６，２５０倍増加した。ＣＲＣワクチンＢ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＨＣＴ－１１６で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１１４，０００倍増加し、ＲＫＯで、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４３，６６７倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（≦０．００４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３９，４５０倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＣＲＣワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１５４ｎｇ／用量／２４時間であった。ＣＲＣワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、３１６ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり４７０ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＣＲＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。ＣＤ４０Ｌを発現するようにＤＭＳ５３を変更するために使用される方法は、例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図８０に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌの膜発現が、６つの細胞ＣＲＣワクチン成分細胞株すべてで実質的に増加したことを示す。
成分細胞株を、上記のように膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＣＲＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。ＣＤ４０Ｌを発現するようにＤＭＳ５３を変更するために使用される方法は、例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図８０に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌの膜発現が、６つの細胞ＣＲＣワクチン成分細胞株すべてで実質的に増加したことを示す。
図８０は、ＣＲＣワクチン成分細胞株による膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を示す。膜結合ＣＤ４０Ｌは、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも６６９倍増加した。ＣＲＣワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現が、ＨＣＴ－１５（６６９ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、６６９倍増加し、ＨｕＴｕ８０（５，８９０ＭＦＩ）で、親細胞株（５ＭＦＩ）と比較して、１，１７８倍増加し、ＬＳ４１１Ｎ（４，７０３）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、４，７０３倍増加した。ＣＲＣワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＨＣＴ－１１６で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、２１，５４９倍増加し、ＲＫＯで、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、７，１０７倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１倍増加した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表５２に示され、以下に記載される。
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表５２に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも１０，２００倍増加した。ＣＲＣワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、ＨＣＴ－１５で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２７，０００倍増加し、ＨｕＴｕ８０で、親細胞株（≦０．００５ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１０，２００倍増加し、ＬＳ４１１Ｎで、親細胞株（≦０．００２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３，０００倍増加した。ＣＲＣワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＨＣＴ－１１６で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１８６，０００倍増加し、ＲＫＯで、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４３，０００倍増加した。ＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＣＲＣワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、５２ｎｇ／用量／２４時間であった。ＣＲＣワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、１１５ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり１６７ｎｇであった。
ＨｕＴｕ８０細胞株によるｍｏｄＰＳＭＡの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、ＣＲＣ抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨｕＴｕ８０細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２（未改変の抗原）を発現するように改変された細胞株、ならびにＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－１２、およびｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変された細胞株を、０．０６μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ２６８０６１，クローンＦＯＬＨ１／３７３４）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。アイソタイプ対照で染色されたＰＳＭＡ未改変細胞およびＰＳＭＡ改変細胞のＭＦＩを、ＰＳＭＡで染色された細胞のＭＦＩから差し引いた。ＭＦＩは、１００，０００事象に正規化された。抗原の発現の増加倍率は、（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた親のＭＦＩ）として計算した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（７５６，９０８ＭＦＩ）で、ＰＳＭＡ未改変細胞株（８２，９９３ＭＦＩ）よりも９．１倍増加した（図７９Ａ）。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、ＣＲＣ抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨｕＴｕ８０細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２（未改変の抗原）を発現するように改変された細胞株、ならびにＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－１２、およびｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変された細胞株を、０．０６μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ２６８０６１，クローンＦＯＬＨ１／３７３４）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。アイソタイプ対照で染色されたＰＳＭＡ未改変細胞およびＰＳＭＡ改変細胞のＭＦＩを、ＰＳＭＡで染色された細胞のＭＦＩから差し引いた。ＭＦＩは、１００，０００事象に正規化された。抗原の発現の増加倍率は、（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた親のＭＦＩ）として計算した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（７５６，９０８ＭＦＩ）で、ＰＳＭＡ未改変細胞株（８２，９９３ＭＦＩ）よりも９．１倍増加した（図７９Ａ）。
ＨＣＴ－１１６細胞株によるｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨＣＴ－１１６細胞株も、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ抗原を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。抗原未改変細胞および抗原改変細胞を、細胞内染色して、以下のように各抗原の発現を検出した。ｍｏｄＴＢＸＴの検出では、細胞を、最初に、ウサギＩｇＧ１抗ＴＢＸＴ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ２０９６６５，クローンＥＰＲ１８１１３）（０．０６μｇ／試験）で染色し、続いて、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）（０．１２５μｇ／試験）で染色した。ｍｏｄＷＴ１の検出では、細胞を、最初に、ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ８９９０１，クローンＣＡＮ－Ｒ９）（０．０６ｕｇ／試験）で染色し、続いて、ＡＦ６４７標識ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）（０．１２５μｇ／試験）で染色した。アイソタイプ対照で染色された細胞のＭＦＩは、ＴＢＸＴまたはＷＴ１で染色された細胞のＭＦＩから差し引いた。ＭＦＩは、１００，０００事象に正規化された。抗原の発現の増加倍率は、（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた親のＭＦＩ）として計算した。ｍｏｄＴＢＸＴの発現は、改変細胞株（３５６，６９１ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）のものよりも３５６，６９１倍増加した（図７９Ｂ）。アイソタイプ対照のＭＦＩを、ＴＢＸＴで染色された未改変ＨＣＴ－１１６細胞株のＭＦＩから差し引くと、負の値になった。改変細胞株におけるＴＢＸＴの発現の増加倍率は、１ＭＦＩを使用して計算された。改変細胞株（３６２，６９８ＭＦＩ）によるｍｏｄＷＴ１の発現は、未改変細胞株（５，２３５ＭＦＩ）の発現よりも６９．３倍増加した（図７９Ｃ）。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨＣＴ－１１６細胞株も、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ抗原を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。抗原未改変細胞および抗原改変細胞を、細胞内染色して、以下のように各抗原の発現を検出した。ｍｏｄＴＢＸＴの検出では、細胞を、最初に、ウサギＩｇＧ１抗ＴＢＸＴ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ２０９６６５，クローンＥＰＲ１８１１３）（０．０６μｇ／試験）で染色し、続いて、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）（０．１２５μｇ／試験）で染色した。ｍｏｄＷＴ１の検出では、細胞を、最初に、ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ８９９０１，クローンＣＡＮ－Ｒ９）（０．０６ｕｇ／試験）で染色し、続いて、ＡＦ６４７標識ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）（０．１２５μｇ／試験）で染色した。アイソタイプ対照で染色された細胞のＭＦＩは、ＴＢＸＴまたはＷＴ１で染色された細胞のＭＦＩから差し引いた。ＭＦＩは、１００，０００事象に正規化された。抗原の発現の増加倍率は、（バックグラウンドを差し引いた改変のＭＦＩ／バックグラウンドを差し引いた親のＭＦＩ）として計算した。ｍｏｄＴＢＸＴの発現は、改変細胞株（３５６，６９１ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）のものよりも３５６，６９１倍増加した（図７９Ｂ）。アイソタイプ対照のＭＦＩを、ＴＢＸＴで染色された未改変ＨＣＴ－１１６細胞株のＭＦＩから差し引くと、負の値になった。改変細胞株におけるＴＢＸＴの発現の増加倍率は、１ＭＦＩを使用して計算された。改変細胞株（３６２，６９８ＭＦＩ）によるｍｏｄＷＴ１の発現は、未改変細胞株（５，２３５ＭＦＩ）の発現よりも６９．３倍増加した（図７９Ｃ）。
ＨＣＴ－１１６によるＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲを使用して決定された。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの場合、フォワードプライマー（ＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＧＧ（配列番号１２４））は、導入遺伝子の２７８６～２８０７塩基対（ｂｐ）の位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＣＴＧＡＡＴＴＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＴＣ（配列番号１２５））は、導入遺伝子の２９６６～２９８４ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、１９９ｂｐの産物を生成する。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの場合、フォワードプライマー（ＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣ（配列番号１２６））は、導入遺伝子の２８６１～２８８２ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＧＡＧＴＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴ（配列番号１２７））は、導入遺伝子の３０７１～３０９４ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、２３８ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤとＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの両方の遺伝子産物は、予想されるサイズ（それぞれ、１９９ｂｐおよび２３８ｂｐ）で検出された（図７９Ｄ）。親対照と比較して、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤのｍＲＮＡは、３，１２７倍増加し、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＶのｍＲＮＡは、４，０９５倍増加した（図７９Ｅ）。
ＣＲＣワクチンＡにおけるＰＳＭＡに対する免疫応答
ＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、４人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）（表６３のドナー１、３、５、および６）において、ＣＲＣワクチンＡとの関連で評価され、ＩＦＮγ応答は、以下に記載されるように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。天然抗原配列にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのＰＳＭＡペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＣＲＣワクチンＡ（３５０±２６０ＳＦＵ）（ｎ＝４）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＡ（１，８３２±６２７ＳＦＵ）で増加した（図７９Ｆ）。
ＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、４人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）（表６３のドナー１、３、５、および６）において、ＣＲＣワクチンＡとの関連で評価され、ＩＦＮγ応答は、以下に記載されるように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。天然抗原配列にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのＰＳＭＡペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＣＲＣワクチンＡ（３５０±２６０ＳＦＵ）（ｎ＝４）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＡ（１，８３２±６２７ＳＦＵ）で増加した（図７９Ｆ）。
ＣＲＣワクチンＢにおけるＴＢＸＴ、ＷＴ１、およびＫＲＡＳ変異に対する免疫応答
ＴＢＸＴ、ＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原に対するＩＦＮγ応答は、４人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）（表６３のドナー１、３、５、および６）において、例２９に記載されているように、ＣＲＣワクチンＢとの関連で評価された。ペプチドは、以下のように供給された：ＴＢＸＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）、ＷＴ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＷＴ１）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、および９アミノ酸が重複したＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの１５ｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（１５４±１１１ＳＦＵ）（ｎ＝４）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（５１１±２０３ＳＦＵ）で増加した（図７９Ｇ）。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（２０８±２０８ＳＦＵ）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（１，２７８±３０３ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０２７、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（図７９Ｈ）。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（１５３±１５３ＳＦＵ）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（１，７１６±４２０ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１３、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（図７９Ｉ）。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（２５４±５２５ＳＦＵ）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（２，０４７±４２０ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１８、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（図７９Ｊ）。
ＴＢＸＴ、ＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原に対するＩＦＮγ応答は、４人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）（表６３のドナー１、３、５、および６）において、例２９に記載されているように、ＣＲＣワクチンＢとの関連で評価された。ペプチドは、以下のように供給された：ＴＢＸＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）、ＷＴ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＷＴ１）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、および９アミノ酸が重複したＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの１５ｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（１５４±１１１ＳＦＵ）（ｎ＝４）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（５１１±２０３ＳＦＵ）で増加した（図７９Ｇ）。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（２０８±２０８ＳＦＵ）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（１，２７８±３０３ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０２７、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（図７９Ｈ）。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（１５３±１５３ＳＦＵ）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（１，７１６±４２０ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１３、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（図７９Ｉ）。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＣＲＣワクチンＢ（２５４±５２５ＳＦＵ）と比較して、改変ＣＲＣワクチンＢ（２，０４７±４２０ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１８、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定）（図７９Ｊ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
関連するＣＲＣ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導する個々の成分細胞株および２つのＣＲＣワクチンカクテルの能力を、６人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣを使用して、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した（表６３）。ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＴＢＸＴ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖのペプチドは、上記のように供給された。残りの抗原のペプチドは、以下のように供給された：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＰＲＡＭＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０９７－２８６）、ＳＴＥＡＰ（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡ）（ＪＰＴ，ＰＭ－ＣＥＡ）。次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、細胞を、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。
関連するＣＲＣ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導する個々の成分細胞株および２つのＣＲＣワクチンカクテルの能力を、６人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣを使用して、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した（表６３）。ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＴＢＸＴ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖのペプチドは、上記のように供給された。残りの抗原のペプチドは、以下のように供給された：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＰＲＡＭＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０９７－２８６）、ＳＴＥＡＰ（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡ）（ＪＰＴ，ＰＭ－ＣＥＡ）。次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、細胞を、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。
図８１は、ＣＲＣワクチンが、６人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導することができることを示し、これは、未改変親対照（６，４７０±３，３６１ＳＦＵ）と比較して、有意に強力であった（３０，４８０±９，９８０ ＳＦＵ）（ｐ＝０．００９、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝８）（図８１Ａ）。ＣＲＣワクチンＡおよびＣＲＣワクチンＢは、独立して、親対照と比較して、有意に大きい抗原特異的応答を示した。具体的には、ＣＲＣワクチンＡは、未改変対照（３，６６５±１，８４９ＳＦＵ）と比較して、１２，０８０±３，５６９ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．０４１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図８１Ｂ）。ＣＲＣワクチンＡの場合、１人のドナーが５つの抗原に応答し、１人のドナーが９つの抗原に応答し、２人のドナーが１０の抗原に応答し、２人のドナーが１１つの抗原に応答した。ＣＲＣワクチンＢ（ｎ＝１１抗原）は、親対照（２，８０５±１，５４９ＳＦＵ）と比較して、１５，４１７±４，１２７ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．００４、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図８１Ｃ）。ＣＲＣワクチンＢ（ｎ＝１１抗原）の場合、１人のドナーが９つの抗原に応答し、２人のドナーが１０の抗原に応答し、３人のドナーが１１の抗原に応答した。ＣＲＣワクチン（ワクチンＡおよびワクチンＢ）は、６人のドナーのうちの２人で１０の抗原、６人のドナーのうちの４人で１１の抗原すべてに対して、ＩＦＮγ産生を誘導した（図８２）（表６４）。したがって、治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（例えば、６つの細胞株の単位用量）が本明細書に提供され、当該単位用量は、ＣＲＣ患者の腫瘍で発現する少なくとも１０のＴＡＡに特異的な、未改変組成物よりも４．７倍大きい免疫応答を誘発することができる。ＣＲＣワクチンＡは、少なくとも５つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を４．１倍増加させ、ＣＲＣワクチンＢは、少なくとも９つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を５．５倍増加させた。
ＣＲＣワクチンＡおよびＣＲＣワクチンＢによって誘導されるＴＡＡに対するＩＦＮγ応答は、個々の改変ＣＲＣ細胞株成分によって誘導される応答と比較して、より頑強であった。具体的には、１１のアッセイされた抗原（１８，９１０±８，８５２ＳＦＵ）に対するＣＲＣワクチンＡ関連の応答は、改変ＨＣＴ－１５（１１，２５５±６，３５４ＳＦＵ）、ＨｕＴｕ８０（７，３３２±２，８１４ＳＦＵ）、およびＬＳ４１１Ｎ（８，２７７±３，１８７ＳＦＵ）によって誘導される応答よりも大きかった。同様に、１１のアッセイされた抗原（１７，６３５±６，０５６ＳＦＵ）に対するＣＲＣワクチンＢ関連の応答は、改変ＨＣＴ－１１６（１１，９８４±５，０８５ＳＦＵ）およびＲＫＯ（１０，７４０±５，２１６ＳＦＵ）によって誘導される応答よりも大きかった（図８３）。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣから供給される６つのがん細胞株ＨＣＴ－１５（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ－２２５）、ＨｕＴｕ８０（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－４０）、ＬＳ４１１Ｎ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２１５９）、ＨＣＴ－１１６（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ－２４７）、ＲＫＯ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２５７７）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む大腸癌のための全細胞ワクチンを、表６５に示す。細胞株は、５つの大腸細胞株および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、エレクトロポレーションによってノックアウトされている。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ｍｏｄＰＳＭＡ（ＨｕＴｕ８０）、ｍｏｄＴＢＸＴ（ＨＣＴ－１１６）、ｍｏｄＷＴ１（ＨＣＴ－１１６）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（ＨＣＴ－１１６）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（ＨＣＴ－１１６）の遺伝子が、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加されている。
治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を低減し、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するように改変されている、６つのがん細胞株の単位用量）が本明細書に提供される。１つの組成物であるＣＲＣワクチンＡは、１つのＴＡＡ（ｍｏｄＰＳＭＡ）の発現を増加させるように改変され、第２の組成物であるＣＲＣワクチンＢは、４つのＴＡＡ（ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ）を発現するように改変された。６つのがん細胞株の単位用量は、ＣＲＣ患者の腫瘍において、少なくとも１５のＴＡＡを発現し、未改変組成成分よりも４．７倍大きいＩＦＮγ応答を誘導する。
実施例３１：前立腺癌（ＰＣａ）ワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは、３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＰＣａ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＰＣａワクチンＡは、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変された細胞株ＰＣ３、細胞株ＮＥＣ８、および細胞株ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１から構成されている。第２のカクテルであるＰＣａワクチンＢは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＤＵ１４５、細胞株ＬＮＣａＰ、および細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＰＣａ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２２の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは、３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＰＣａ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＰＣａワクチンＡは、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変された細胞株ＰＣ３、細胞株ＮＥＣ８、および細胞株ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１から構成されている。第２のカクテルであるＰＣａワクチンＢは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＤＵ１４５、細胞株ＬＮＣａＰ、および細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＰＣａ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２２の抗原をまとめて発現する。
ＰＣａワクチン成分の特定
最初の細胞株選択基準により、ＰＣａワクチンに含まれる可能性のある１６のワクチン成分細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、１４の候補細胞株を６つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＰＣａ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、細胞株が原発腫瘍または転移部位および組織学的サブタイプに由来する場合、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、細胞株が由来する患者の民族性および年齢が含まれた。
最初の細胞株選択基準により、ＰＣａワクチンに含まれる可能性のある１６のワクチン成分細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、１４の候補細胞株を６つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＰＣａ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、細胞株が原発腫瘍または転移部位および組織学的サブタイプに由来する場合、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、細胞株が由来する患者の民族性および年齢が含まれた。
候補成分細胞株によるＴＡＡの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）および欧州分子生物学研究所－欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）（ＮＣＣＩＴ、ＮＥＣ８、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１について）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号は、ＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡ発現は、各ＴＡＡについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値が１より大きい（ＣＣＬＥ、ＦＰＫＭ）または０（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ、ＴＰＭ）場合、細胞株によるＴＡＡの発現を陽性とみなした。上記の選択基準に基づいて、１４のＰＣａワクチン候補成分のうち６つが、さらなる評価のために特定された：ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＮＣＣＩＴ、ＮＥＣ８、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１。６つの候補成分細胞株は、１２～１９のＴＡＡを発現した（図８４）。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様細胞株ＤＭＳ５３は、６つの細胞株のうちの１つとして含まれ、１６のＰＣａ ＴＡＡを発現した。
未改変ＰＣａの個々の成分細胞株候補の免疫原性は、４人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）について、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊３５：０１およびＡ＊３１：０１ Ｂ＊３５：０３；ドナー２、Ａ＊０２：０２ Ｂ＊１５：０３およびＡ＊３０：０２ Ｂ＊５７：０３；ドナー３、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊４０：０１およびＡ＊３０：０１ Ｂ＊５７：０１；ドナー４、Ａ＊２４：０２ Ｂ＊１８：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０７。ＰＣ３（３，４０９±６７２ＳＦＵ）およびＤＵ１４５（１，４９７±２３１ＳＦＵ）は、ＬＮＣａＰ（４２８±２０４ＳＦＵ）、ＮＣＣＩＴ（２５±１１ＳＦＵ）、ＮＥＣ８（８０±４７ＳＦＵ）、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１（１８８±９３ＳＦＵ）よりも免疫原性が高かった（図８６Ａ）。ＮＣＣＩＴは、免疫原性が低く、さらなる分析から除外された。ＰＣ３およびＤＵ１４５は、本明細書でさらに記載されるように、それぞれワクチンカクテルＡおよびワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
５つの選択されたＰＣａ細胞株およびＣＳＣ細胞株ＤＭＳ５３の免疫原性を、３つの成分細胞株の２つの異なる組み合わせで評価した（図８６Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、５人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）において、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、２つの潜在的なワクチンカクテル内の３つの成分細胞株に対して決定された。ドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊０８：０１およびＡ＊０３：０１ Ｂ＊５１：０１；ドナー２、Ａ＊３０：０２ Ｂ＊１８：０１およびＡ＊３０：０４ Ｂ＊５８：０２；ドナー３、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊１８：０１およびＡ＊２５：０１ Ｂ＊２７：０５；ドナー４、Ａ＊０３：０１ Ｂ＊０７：０２およびＡ＊２５：０１ Ｂ＊１８：０１；ドナー５、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊０７：０２およびＡ＊３３：０１ Ｂ＊１４：０２。ＩＦＮγ応答は、カクテルと各カクテルの各細胞株成分の両方で検出された（図８６Ｂ）。
個々の細胞株に対してＩＦＮγ応答を誘導する潜在的なＰＣａワクチンカクテルの能力と比較して、それ自体に対してＩＦＮγ応答を誘導する個々のＰＣａワクチン成分細胞株の能力も、実施例８および９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。ＰＣａ－ＡにおけるＮＥＣ８細胞株に対するＩＦＮγ応答（１，９６３±８６３ＳＦＵ）は、細胞株のみの応答（２８３±１０１ＳＦＵ）と比較して、有意に増加した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、ｐ＝０．０３２）。同様に、ＰＣａ－ＡにおけるＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１細胞株に対するＩＦＮγ応答（６３０±２８０ＳＦＵ）は、細胞株のみの応答（２８３±１０１ＳＦＵ）と比較して、有意に増加した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、ｐ＝０．０３２）。ＰＣａ－ＢにおけるＬＮＣａＰ細胞株に対するＩＦＮγ応答（６２４±２５４ＳＦＵ）は、細胞株のみの応答（１３９±１１１ＳＦＵ）と比較して、有意に増加した。（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、ｐ＝０．０３２）。図８６Ｄのデータは、カクテルＰＣａ－ＡおよびＰＣａ－Ｂが、場合によっては、個々の成分細胞株よりも良好な抗腫瘍免疫の刺激因子の傾向を示すか、または有意に良好な抗腫瘍免疫の刺激因子であることを示し、異なるＨＬＡスーパータイプを有する複数の細胞株を投与することによって、応答の幅が広がることを示唆する。具体的には、ＰＣａ－Ａ細胞株は、以下のＨＬＡスーパータイプである：ＰＣ３は、Ａ０１Ａ２４およびＢ０７；ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１は、Ａ０１、Ｂ０８、およびＢ４４。ＮＥＣ８のＨＬＡタイプは、利用不可能である。ＰＣａ－Ｂ細胞株は、以下のＨＬＡスーパータイプである：ＤＵ１４５は、Ａ０３、Ｂ４４、およびＢ５８。ＬＮＣａＰは、Ａ０１、Ａ０２Ｂ０８、Ｂ４４；ＤＭＳ５３は、Ａ０３、Ｂ０８、およびＢ０７。上記のデータは、カクテルを含む細胞株のＨＬＡ不一致が、個々の細胞株成分に対する免疫応答を改善し得ることを裏付けている。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、多様なＴＡＡを発現するように選択され、ＰＳＡまたはＰＡＰなどのＰＣａ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ、ならびにＰＣａおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含まれる。本明細書に示されるように、一連のＴＡＡをさらに増強するために、ＤＵ１４５は、ｍｏｄＰＳＭＡをコードする遺伝子で形質導入され、ＰＣ３は、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変された。ＰＳＭＡは、６つの成分細胞株のうちの３つで、＞１．０ＦＰＫＭまたは＞０ＴＰＭで内因的に発現された。ＴＢＸＴおよびＭＡＧＥＣ２は、６つの成分細胞株のうちの２つで、＞１．０ＦＰＫＭまたは＞０ＴＰＭで内因的に存在した（図８４）。
ＰＣ３による形質導入された抗原ｍｏｄＴＢＸＴ（図８７Ａ）およびｍｏｄＭＡＧＥＣ２（図８７Ｂ）（配列番号４５；配列番号４６）の発現、ならびにＤＵ１４５による形質導入された抗原ｍｏｄＰＳＭＡ（図８７Ｃ）（配列番号３７；配列番号３８）の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、フローサイトメトリーまたはＲＴ－ＰＣＲによって検出された。ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２をコードする遺伝子は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されている。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
図８４に、本ワクチンにおける２２の代表的なＴＡＡのｍＲＮＡ発現を示す。ＮＣＣＩＴは、本ワクチンに含まれていない図８４の唯一の細胞株である。本ワクチンは、ＰＣａ抗腫瘍応答を誘導するために、一般に標的化され、臨床的に関連する可能性のある、特定された２２のＴＡＡをすべて高度に発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＰＣａ腫瘍で豊富であることが知られており、ＰＣａおよび他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘導することもできる。２２の優先順位付けされたＰＣａのＴＡＡのＲＮＡ存在量は、実施例２９に記載されているように、すべてのＴＡＡについて利用可能な発現データを用いて、４６０のＰＣａ患者試料で決定された（図８５Ａ）。優先順位付けされたＰＣａのＴＡＡのうち、１８のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１９のＴＡＡが９９．３％の試料で発現され、２０のＴＡＡが７５．４％の試料で発現され、２１のＴＡＡが２１．１％の試料で発現され、２２のＴＡＡが１．５％の試料で発現された（図８５Ｂ）。治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物が本明細書に提供され、細胞株の組み合わせは、当該組成物を受けることが意図されたＰＣａ癌対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１８のＴＡＡを発現する細胞を含む。本明細書に提示された発現データおよび免疫原性データに基づいて、表６６で特定される細胞株が、本発明のＰＣａワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現の減少
ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、発現が、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトされた。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表６７に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９８．７％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、発現が、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトされた。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表６７に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９８．７％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイ
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＰＣａワクチンＡ中のＰＣ３およびＮＥＣ８親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＰＣ３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＮＥＣ８は、比較的低レベルのＴＧＦβ１を分泌し、測定可能なレベルのＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＰＣａワクチンＢの親細胞株のうち、ＤＵ１４５は、比較的低いレベルではあるが、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌し、しかし、ＬＮＣａＰは、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルを上記のように決定した。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＰＣａワクチンＡ中のＰＣ３およびＮＥＣ８親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＰＣ３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＮＥＣ８は、比較的低レベルのＴＧＦβ１を分泌し、測定可能なレベルのＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＰＣａワクチンＢの親細胞株のうち、ＤＵ１４５は、比較的低いレベルではあるが、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌し、しかし、ＬＮＣａＰは、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルを上記のように決定した。
ＰＣ３成分細胞株は、実施例２９に記載されているように、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させるＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入され、続いて、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡおよびＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）をコードするレンチウイルス粒子で形質導入された。実施例２９。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。実施例２６に記載されているように、ＤＭＳ５３は、ＴＧＦβ１ではなく、ＴＧＦβ２の分泌を減少させるようにｓｈＲＮＡで改変された。これらの細胞は、クローン名ＤＫ４で表される。残りの細胞株は、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡでも、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡでも改変されていない。
表６８は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率（％）を示す。ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌が、ＥＬＩＳＡアッセイで実行された１６回の反復のうちの１回でのみ検出された場合、その値は、平均の標準誤差なしで報告される。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が、８２％減少した。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が、少なくとも５１％減少した。
表６９に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＰＣａワクチンＡおよびＰＣａワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＰＣａワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、５２％ ｐｇ／用量／２４時間減少し、ＴＧＦβ２は、８７％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＰＣａワクチンＢによるＴＧＦβ２の分泌は、２６％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
ＰＣ３細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと異なるプロモーターの制御下でＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ１４５、およびＬＮＣａＰ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表７０に示され、以下に記載される。
ＰＣ３細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと異なるプロモーターの制御下でＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ１４５、およびＬＮＣａＰ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表７０に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも６８倍増加した。ＰＣａワクチンＡ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＰＣ３で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、６７，９８７倍増加し、ＮＥＣ－８で、親細胞株（≦０．００２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１２８，５４３倍増加し、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１で、親細胞株（≦０．０５９ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、６８倍増加した。ＰＣａワクチンＢ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＤＵ１４５で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１１９，６４５倍増加し、ＬＮＣａＰで、親細胞株（≦０．０１２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１０，１５１倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（≦００４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３９，４５０倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＰＣａワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２００ｎｇ／用量／２４時間であった。ＰＣａワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、３３４ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり５３４ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＰＣａ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。ＣＤ４０Ｌを発現するようにＤＭＳ５３を変更するために使用される方法は、例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図８８に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌの膜発現が、６つの細胞ＰＣａワクチン成分細胞株すべてで実質的に増加したことを示す。
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＰＣａ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。ＣＤ４０Ｌを発現するようにＤＭＳ５３を変更するために使用される方法は、例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図８８に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌの膜発現が、６つの細胞ＰＣａワクチン成分細胞株すべてで実質的に増加したことを示す。
図８８に、ＰＣａワクチン細胞株による膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を示す。膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも９，０１９倍増加した。ＰＣａワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＰＣ３（９，０１９ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、９，０１９倍増加し、ＮＥＣ８（１１，５７１ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１１，５７１倍増加し、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１（１５，６０９ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１５，６０９倍増加した。ＰＣａワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＤＵ１４５で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１８，６９９倍増加し、ＬＮＣａＰで、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、３０，２４３倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１倍増加した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表７１に示され、以下に記載される。
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表７１に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも５０７倍増加した。ＰＣａワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、ＰＣ３で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４２，７２７倍増加し、ＮＥＣ８で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３０，７６９倍増加し、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１で、親細胞株（≦０．０２４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、５０７倍増加した。ＰＣａワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＤＵ１４５で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３，１７８倍増加し、ＬＮＣａＰで、親細胞株（≦０．００５ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３，９０１倍増加した。ＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＰＣａワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、４０ｎｇ／用量／２４時間であった。ＰＣａワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、１９ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり５９ｎｇであった。
ＰＣ３細胞株によるｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２の安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＰＣ３細胞株を、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２抗原をコードする遺伝子は、フーリン切断部位（配列番号４５、配列番号４６）によって連結されている。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＰＣ３細胞株を、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２抗原をコードする遺伝子は、フーリン切断部位（配列番号４５、配列番号４６）によって連結されている。
ＰＣ３によるｍｏｄＴＢＸＴの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。ｍｏｄＴＢＸＴの発現の検出では、細胞を、最初に、ウサギＩｇＧ１抗ＴＢＸＴ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ２０９６６５，クローンＥＰＲ１８１１３）（０．０６μｇ／試験）、続いて、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４４０６４１４）（０．１２５μｇ／試験）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＢＸＴの発現は、改変細胞株（１，２０９，６１３ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）のものよりも１，２０９，６１３倍増加した（図８７Ａ）。ＰＣ３によるｍｏｄＭＡＧＥＣ２の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲを使用して決定された。フォワードプライマー（ＧＡＴＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＡＧ（配列番号１２８））は、導入遺伝子の６０４～６３１塩基対（ｂｐ）の位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＣＴ（配列番号１２９））は、導入遺伝子の１０７２～１０９４ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、４９１ｂｐの産物を生成する。対照プライマーおよび得られたβ－チューブリンの生成物は、実施例２９に記載されている。ＭＡＧＥＣ２の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出された（図９７Ｂ）。ｍｏｄＭＡＧＥＣ２のｍＲＮＡは、親対照と比較して、３，９１４倍増加した（図８７Ｂ）。
ＤＵ１４５細胞株によるｍｏｄＰＳＭＡの安定的な発現
ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＤＵ１４５細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。抗原未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０６μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ２６８０６１，クローンＦＯＬＨ１／３７３４）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（２４９，６３２ＭＦＩ）で、親細胞株（４２，１９６ＭＦＩ）のものよりも６倍増加した（図８７Ｃ）。
ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＤＵ１４５細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。抗原未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０６μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（ＡｂＣａｍ ａｂ２６８０６１，クローンＦＯＬＨ１／３７３４）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（２４９，６３２ＭＦＩ）で、親細胞株（４２，１９６ＭＦＩ）のものよりも６倍増加した（図８７Ｃ）。
ＰＣａワクチンＡにおけるＴＢＸＴおよびＭＡＧＥＣ２に対する免疫応答
ＴＢＸＴおよびＭＡＧＥＣ２抗原に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、改変ＰＣａワクチンＡとの関連で評価された。表７２に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、天然ＴＢＸＴ抗原の全長にまたがる１１アミノ酸（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＰＣａワクチンＡ（７３±７０ＳＦＵ）と比較して、改変ＰＣａワクチンＢ（６０５±６１５ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０３３、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図８７Ｄ）。ＭＡＧＥＣ２に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＭＡＧＥＣ２に対するＩＦＮγ応答は、未改変ＰＣａワクチンＢ（ＳＦＵ）と比較して、改変ＰＣａワクチンＢ（６９７±５３６ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図８７Ｅ）。
ＴＢＸＴおよびＭＡＧＥＣ２抗原に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、改変ＰＣａワクチンＡとの関連で評価された。表７２に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、天然ＴＢＸＴ抗原の全長にまたがる１１アミノ酸（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＰＣａワクチンＡ（７３±７０ＳＦＵ）と比較して、改変ＰＣａワクチンＢ（６０５±６１５ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０３３、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図８７Ｄ）。ＭＡＧＥＣ２に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＭＡＧＥＣ２に対するＩＦＮγ応答は、未改変ＰＣａワクチンＢ（ＳＦＵ）と比較して、改変ＰＣａワクチンＢ（６９７±５３６ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１８、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図８７Ｅ）。
ＰＣａワクチンＢにおけるＰＳＭＡに対する免疫応答
ＰＳＭＡ抗原に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＰＣａ－ワクチンＢとの関連で評価された（表７２）。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。天然抗原配列にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのＰＳＭＡペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＰＣａワクチンＡ（３２７±３３ＳＦＵ）と比較して、改変ＰＣａワクチンＢ（１，５８０±８４７ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図８７Ｆ）。
ＰＳＭＡ抗原に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＰＣａ－ワクチンＢとの関連で評価された（表７２）。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。天然抗原配列にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのＰＳＭＡペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＰＣａワクチンＡ（３２７±３３ＳＦＵ）と比較して、改変ＰＣａワクチンＢ（１，５８０±８４７ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図８７Ｆ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
関連するＰＣａ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導する２つのＰＣａワクチンカクテルの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表７２）を、ＰＣＡワクチンＡまたはＰＣａワクチンＢカクテルと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールをロードした自己ＤＣで刺激した。ＴＢＸＴ、ＭＡＧＥＣ２、およびＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する追加の１５ｍｅｒのペプチドプールは、以下のように供給された：ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＨＥＲ２（ＪＰＴ，ＰＭ－ＥＲＢ＿ＥＣＤ）、ＳＴＥＡＰ（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、ＰＡＰ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＡＰ）、およびＰＳＡ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＳＡ）。次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、細胞を、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。
関連するＰＣａ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導する２つのＰＣａワクチンカクテルの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表７２）を、ＰＣＡワクチンＡまたはＰＣａワクチンＢカクテルと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールをロードした自己ＤＣで刺激した。ＴＢＸＴ、ＭＡＧＥＣ２、およびＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する追加の１５ｍｅｒのペプチドプールは、以下のように供給された：ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＨＥＲ２（ＪＰＴ，ＰＭ－ＥＲＢ＿ＥＣＤ）、ＳＴＥＡＰ（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、ＰＡＰ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＡＰ）、およびＰＳＡ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＰＳＡ）。次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、細胞を、ＩＦＮγの分泌についてアッセイした。
図８９は、ＰＣａワクチンが、７人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、１０のＰＣａ抗原に対して抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導することができることを示し、これは、未改変親対照（３，２５９±１，０４６ＳＦＵ）と比較して、有意に強力であった（１９，９８２±５，４８０ ＳＦＵ）（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図８９Ａ）。ＰＣａワクチンＡおよびＰＣａワクチンＢの単位用量は、７人のドナーのうちの１人で８つの抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発し、７人のドナーのうち６人で１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した。ＰＣａワクチンＡおよびＰＣａワクチンＢは、独立して、親対照と比較して、有意に大きい抗原特異的応答を示した。ＰＣａワクチンＡの場合、１人のドナーが３つの抗原に応答し、１人のドナーが８つの抗原に応答し、１人のドナーが９つの抗原に応答し、４人のドナーが１０の抗原に応答した。具体的には、ＰＣａワクチンＡは、未改変対照（１，４３０±９１１ＳＦＵ）と比較して、９，４１２±６，１７０ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．０２６、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図８９Ｂ）。ＰＣａワクチンＢの場合、１人のドナーが６つの抗原に応答し、３人のドナーが９つの抗原に応答し、３人のドナーが１０の抗原に応答した。ＰＣａワクチンＢは、親対照（１，８３０±３７１ＳＦＵ）と比較して、１０，５７０±２，９１３ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．００４、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図８９Ｃ）。ＰＣＡワクチン（ワクチンＡおよびワクチンＢ）は、７人のドナーのうちの１人で９つの抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導し、７人のドナーのうち６人で１０の抗原すべてに対してＩＦＮγ産生を誘導した（図９０）（表７３）。治療有効量の３つのがん細胞株含む２つの組成物（６つの細胞株の単位用量）が上に記載されており、当該単位用量は、ＰＣＡ患者の腫瘍において発現された少なくとも８つのＴＡＡに特異的な、未改変組成物よりも６．１倍大きい免疫応答を誘発することができる。ＰＣＡワクチンＡは、少なくとも３つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を６．６倍増加させ、ＰＣＡワクチンＢは、少なくとも６つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を５．８倍増加させ。
個々の改変ＰＣａワクチン成分の細胞株が一致する未改変細胞株成分に対してＩＦＮγ応答を誘導する能力を、４人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）について、実施例８および９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した（表７３、ドナー１、２、４、および５）。ＩＦＮγ応答は、カクテルと各カクテルの各改変細胞株成分の両方について、親未改変細胞株に対して検出された。個々の改変細胞株と比較して、ＰＣａワクチンＡおよびＰＣａワクチンＢのＩＦＮγ産生が増加する傾向があったが、ドナーのｎが少なかったため（ｎ＝４）（すべての比較についてＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）、この傾向は統計的有意性に達しなかった（図９１Ａ）。
ＰＣａワクチンＡと個々の改変細胞株成分の間で、ＩＦＮγ産生に有意差があった（ｐ＝０．０３６、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定）。具体的には、ＰＣａワクチンＡは、改変ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１（２５３±１３６）（ｐ＝０．０１９）成分細胞株よりも有意に高いＩＦＮγ産生（５，６８５±２，０６０ＳＦＵ）を誘導したが、ＮＥＣ８（１，１５１±７３５ＳＦＵ）（ｐ＝０．３０７）およびＰＣ３成分細胞株（１，８９８±９４７ＳＦＵ）では誘導しなかった（ｐ＝０．６２１）（多重比較のための事後Ｄｕｎｎの検定）（図９１Ｂ）。ＰＣａワクチンＢと個々の改変細胞株成分の間でも、ＩＦＮγ産生に有意差があった（ｐ＝０．００６、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定）。具体的には、ＰＣａワクチンＢは、改変ＬＮＣａＰ（２４０±１２２ＳＦＵ）（ｐ＝０．０４３）およびＤＭＳ５３（２２２±１１３）（ｐ＝０．０２８）成分細胞株よりも有意に高いＩＦＮγ産生（５，６８６±１，８６６ＳＦＵ）を誘導したが、ＤＵ１４５成分細胞株（１，９４３±１，２９１ＳＦＵ）では誘導しなかった（ｐ＝０．７０４）（多重比較のための事後Ｄｕｎｎの検定）（図９１Ｃ）。
１０のＰＣａ抗原に対する抗原特異的応答は、ＰＣａワクチンＡおよびＰＣａワクチンＢを含む個々の改変細胞株について、上記の同じ４人のドナーについて決定された（表７３、ドナー１、２、４、および５）。ＰＣａワクチンＡおよびＰＣａワクチンＢによって誘導されるＴＡＡに対するＩＦＮγ応答は、個々の改変ＰＣａ細胞株成分によって誘導される応答と比較して、より頑強であった。具体的には、１０のアッセイされた抗原（９，４１２±６，１７０ＳＦＵ）に対するＰＣａワクチンＡ関連の応答は、改変ＰＣ３（２，３５７±１，０７６ＳＦＵ）、ＮＥＣ８（３，４９１±１，１９６ＳＦＵ）、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１（１，３８１±４２９ＳＦＵ ＳＦＵ）によって誘導される応答よりも大きかった。個々の改変細胞株と比較して、ＰＣａワクチンＡのＩＦＮγ産生が増加する傾向があったが、ドナーのｎが少なかったため（ｎ＝４）、この傾向は統計的有意性に達しなかった（図１００Ｄ）。１０のアッセイされた抗原（１２，０６７±６，６９４ＳＦＵ）に対するＰＣａワクチンＢ誘導性の応答は、個々の成分細胞株とは有意に異なっていた（ｐ＝０．０４７、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定）。具体的には、ＰＣａワクチンＢの抗原特異的応答は、改変ＤＵ１４５（２，０６４±１，６０４ＳＦＵ）（ｐ＝０．０３４５）によって誘導される応答よりも有意に大きかったが、ＬＮＣａＰ（１，４１９±１８９ＳＦＵ）（ｐ＝０．１１３）またはＤＭＳ５３（２，６１５±１，０４４ＳＦＵ）（ｐ＝０．５４４）ではそうでなかった（多重比較のための事後Ｄｕｎｎの検定）（図９１Ｅ）。まとめると、上記のデータは、治療有効量の３つのがん細胞株を含む組成物が、単一の細胞株組成物よりも、未改変親細胞株およびＰＣａ抗原に対してより強力なＩＦＮγ応答を誘導することを示す。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣまたはＪＣＲＢから供給される６つのがん細胞株ＰＣ－３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１４３５）、ＮＥＣ－８（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０２５０）、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１９７３）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－８１）、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０２３）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む前立腺癌のための全細胞ワクチンを、表７４に示す。細胞株は、５つの前立腺癌および精巣癌細胞株ならびに１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用してエレクトロポレーションによってノックアウトされるか、またはレンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡ形質導入を使用してノックダウンされる。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ｍｏｄＴＢＸＴ（ＰＣ３）、ｍｏｄＭＡＧＥＣ２（ＰＣ３）、およびｍｏｄＰＳＭＡ（ＤＵ１４５）の遺伝子が、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加されている。
したがって、本実施例は、治療有効量の３つのがん細胞株を各々含む２つの組成物（すなわち、６つのがん細胞株の単位用量）を提供し、がん細胞株が、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を低減し、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するように改変されている。１つの組成物であるＰＣａワクチンＡは、２つのＴＡＡ（ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２）の発現を増加させるように改変された。第２の組成物であるＰＣａワクチンＢは、１つのＴＡＡ（ｍｏｄＰＳＭＡ）を発現するように改変された。６つのがん細胞株の単位用量は、当該組成物を受けることが意図されたＰＣａがん対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１８のＴＡＡを発現し、未改変組成物成分より６．１倍大きいＩＦＮγ応答を誘導する。
実施例３２：膀胱癌（ＵＢＣ）ワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＵＢＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＵＢＣワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１（ｍｏｄＴＤＧＦ１）を発現するように改変された細胞株Ｊ８２、細胞株ＨＴ－１３７６、および細胞株ＴＣＣＳＵＰから構成されている。第２のカクテルであるＵＢＣワクチンＢは、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）も発現するように改変された細胞株ＳＣａＢＥＲ、細胞株ＵＭ－ＵＣ－３、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＵＢＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２４の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＵＢＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＵＢＣワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１（ｍｏｄＴＤＧＦ１）を発現するように改変された細胞株Ｊ８２、細胞株ＨＴ－１３７６、および細胞株ＴＣＣＳＵＰから構成されている。第２のカクテルであるＵＢＣワクチンＢは、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）も発現するように改変された細胞株ＳＣａＢＥＲ、細胞株ＵＭ－ＵＣ－３、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＵＢＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２４の抗原をまとめて発現する。
ＵＢＣワクチン成分の特定
最初の細胞株選択基準により、ＵＢＣワクチンに含まれる可能性のある２６のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、２６の細胞株を８つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＵＢＣ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＵＢＣ関連ＣＳＣ様マーカーＹＡＰ１、ＡＬＤＨ１Ａ、ＣＤ４４、ＣＥＡＣＡＭ６、およびＯｃｔ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、膀胱癌の部位および病期、ならびに組織学的サブタイプが含まれた。
最初の細胞株選択基準により、ＵＢＣワクチンに含まれる可能性のある２６のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、２６の細胞株を８つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＵＢＣ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＵＢＣ関連ＣＳＣ様マーカーＹＡＰ１、ＡＬＤＨ１Ａ、ＣＤ４４、ＣＥＡＣＡＭ６、およびＯｃｔ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、膀胱癌の部位および病期、ならびに組織学的サブタイプが含まれた。
ＣＳＣは、膀胱がんの転移、治療抵抗性、および再発において重要な役割を果たす（表２）。候補成分細胞株によるＴＡＡおよびＵＢＣ特異的ＣＳＣ様マーカーの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号は、ＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡ発現は、各ＴＡＡについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値が１より大きい場合、細胞株によるＴＡＡまたはＣＳＣマーカーの発現を陽性とみなした。選択基準により、さらなる評価のために８つの候補ＵＢＣワクチン成分が特定された：ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、Ｔ２４、ＨＴ－１３７６、ＨＴ－１１９７、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、およびＲＴ－４。８つの候補成分細胞株は、９～１７のＴＡＡ（図９２Ａ）および２つまたは３つのＣＳＣマーカー（図９２Ｂ）を発現した。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様細胞株ＤＭＳ５３は、６つのワクチン細胞株のうちの１つとして含まれ、１５のＵＢＣのＴＡＡおよび３つのＵＢＣのＣＳＣ様マーカーを発現した。
８つの未改変ＵＢＣワクチン成分候補の免疫原性は、３人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）を使用して、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ドナー１のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊３５：０２およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊４９：０１であった。ドナー２のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊３２：０１ Ｂ＊２７：０５およびＡ＊６８：０５ Ｂ＊３９：０８であった。ドナー３のＨＬＡ－Ａアレルは、Ａ＊０１：０１およびＡ＊０３：０１であった。ドナー３では、ＨＬＡ－Ｂタイピングが利用できなかった。Ｊ８２（５，４２０±５７７ＳＦＵ）、ＴＣＣＳＵＰ（３，５０４±７０２ＳＦＵ）、およびＳＣａＢＥＲ（２，９０３±６５４ＳＦＵ）は、ＵＭ－ＵＣ－３（１，０２２±２８４ＳＦＵ）、Ｔ２４（１，４９２±２１１ＳＦＵ）、ＨＴ－１３７６（９２２±２３０ＳＦＵ）、ＨＴ－１１９７（６３±６３ＳＦＵ）、およびＲＴ－４（１３±１３ＳＦＵ）よりも免疫原性が高かった（図９３Ａ）。
Ｊ８２およびＴＣＣＳＵＰの免疫原性は、３つの成分細胞株の８つの異なる組み合わせで評価され、４つの組み合わせに、Ｊ８２が含まれ、４つの組み合わせに、ＴＣＣＳＵＰが含まれた（図９３Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、３人の健常ドナー（ｎ＝４／ドナー）を使用して、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、８つの潜在的なワクチンカクテル内の３つの成分細胞株に対して決定された。ドナー１のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊０８：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０１であった。ドナー２のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊０３：０１ Ｂ＊１５：０１およびＡ＊２４：０２ Ｂ＊０７：０２であった。ＨＬＡタイピングは、ドナー３の１つのＨＬＡ－Ａアレルでのみ利用可能であり、これは、Ａ＊０２：０１であった。ドナー３のＨＬＡ－Ｂアレルは、Ｂ＊１５：０１と Ｂ＊５１：０１であった。ＩＦＮγ応答は、８つのカクテルすべてについて、および各カクテルの各細胞株成分に対して検出された。個々のカクテル成分細胞株に対する応答は、単一細胞株成分について検出されたＩＦＮγ応答と比較して、著しく減少した（図９３Ｂ）。評価された８つの組み合わせすべてにおいて、ＴＣＣＳＵＰは、依然として最も免疫原性が高かった。ＨＴ－１１９７は、単独および３つの細胞株成分カクテルでは、免疫原性が低く、したがって、ＵＢＣワクチンには含まれなかった。Ｊ８２、Ｔ２４、およびＳＣａＢＥＲの免疫原性は、３つの細胞株成分カクテルで評価した場合と同様であった。これらの３つの細胞株のうち、Ｔ２４は、最小数のＴＡＡを内因的に発現し（９つのＴＡＡ、＞１．０ＦＰＫＭ）（図９２Ａ）、ＵＢＣワクチンから除外された。Ｊ８２およびＳＣａＢＥＲは、上記のようにレンチウイルス形質導入によってＵＢＣ抗原を発現するように選択され、同じワクチンカクテルで送達された際の潜在的な抗原競合を軽減するために、別々のワクチンカクテルに入れられた。ＴＣＣＳＵＰおよびＪ８２は、ワクチンカクテルＡに含まれるように選択され、ＳＣａｂＥＲは、上記および本明細書でさらに記載されるように、ワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、多様なＴＡＡを発現するように選択され、Ｃｒｉｐｔｏ１またはＤＥＰＤＣ１などのＵＢＣ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ、ならびにＵＢＣおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含も含まれる。本明細書に示されるように、一連のＴＡＡをさらに増強するために、Ｊ８２は、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１（ＴＤＧＦ１）を発現するように改変され、ＳＣａＢＥＲは、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）を発現するように改変された。Ｃｒｉｐｔｏ１（ＴＤＧＦ１）は、＞１．０ＦＰＫＭで６つの成分細胞のいずれにおいても内因的に発現されなかった。ＰＳＭＡ、ＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）、およびＷＴ１は、６つの成分細胞株のうちの１つで、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現された（図９４Ａ）。
Ｊ８２による形質導入された抗原ｍｏｄＰＳＭＡ（図９５Ａ）およびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１（ｍｏｄＴＤＧＦ１）（図９５Ｂ）（配列番号５３；配列番号５４）の発現、ならびにＳＣａｂＥＲによる形質導入された抗原ｍｏｄＷＴ１（図９５Ｃ）およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）（図９４Ｄ）（配列番号５１；配列番号５２）の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、フローサイトメトリーまたはＲＴ－ＰＣＲによって検出された。ｍｏｄＰＳＭＡおよびＣｒｉｐｔｏ１（ＴＤＧＦ１）抗原は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されている（配列番号５３；配列番号５４）。ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されている（配列番号５２）。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
図９４Ａに、本ワクチンにおける２４の代表的なＵＢＣのＴＡＡの内因性ｍＲＮＡ発現を示す。本ワクチンは、上記の抗原の導入後、ＵＢＣ抗腫瘍応答を誘導することができる、一般に標的化され、臨床的に関連する可能性のある、特定された２４のＴＡＡをすべて発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＵＢＣ腫瘍で豊富であることが知られており、また、いくつかは、ＵＢＣおよび他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘導することもできる。２４の優先順位付けされたＵＢＣのＴＡＡのＲＮＡ存在量は、実施例２９に記載されているように、利用可能なｍＲＮＡデータ発現を用いて、４０７のＵＢＣ患者試料で決定された（図９４Ｂ）。優先順位付けされたＵＢＣのＴＡＡのうち、１５のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１６のＴＡＡが９９．３％の試料で発現され、１７のＴＡＡが９６．８％の試料で発現され、１８のＴＡＡが９０．７％の試料で発現され、１９のＴＡＡが８０．３％の試料で発現され、２０のＴＡＡが６８．６％の試料で発現され、２１のＴＡＡが５６．３％の試料で発現され、２２のＴＡＡが４１．３％の試料で発現され、２３のＴＡＡが２７．５％の試料で発現され、２４のＴＡＡが９．１％の試料で発現された（図９４Ｃ）。したがって、治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物が本明細書に提供され、細胞株の組み合わせ（６つの細胞株の単位用量）は、当該組成物を受けることが意図されたＵＢＣがん対象のサブセットと関連する少なくとも１５のＴＡＡを発現する細胞を含む。本明細書に提示される発現および免疫原性データに基づいて、表７５で特定される細胞株が、本ＵＢＣワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現の減少
Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによって、発現をノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表７６に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９９．８％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによって、発現をノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表７６に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９９．８％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＵＢＣワクチンＡ中のＪ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰ親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。Ｊ８２は、低レベルのＴＧＦβ１を分泌し、ＴＧＦβ１分泌を減少させるように改変されなかった。ＵＢＣワクチンＢのＳＣａＢＥＲおよびＵＭ－ＵＣ－３成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＳＣａＢＥＲは、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＵＢＣワクチンＡ中のＪ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰ親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。Ｊ８２は、低レベルのＴＧＦβ１を分泌し、ＴＧＦβ１分泌を減少させるように改変されなかった。ＵＢＣワクチンＢのＳＣａＢＥＲおよびＵＭ－ＵＣ－３成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＳＣａＢＥＲは、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ成分細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、その導入遺伝子と同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲはまた、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子で形質導入され、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。ＵＭ－ＵＣ－３細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。これらの細胞は、ＴＧＦβ２の分泌ではなく、ＴＧＦβ１の分泌を減少させるように改変されており、クローン名ＤＫ２で表される。Ｊ８２を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子で形質導入して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。ＤＭＳ５３を、実施例２６に記載されているように、ｓｈＲＮＡで改変して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させた。Ｊ８２およびＤＭＳ５３細胞は、ＴＧＦβ１ではなく、ＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されており、クローン名ＤＫ４で表される。
表７７は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率（％）を示す。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が、少なくとも７８％減少した。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が、少なくとも５１％減少した。
表７８に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＵＢＣワクチンＡおよびＵＢＣワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＵＢＣワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、９３％ ｐｇ／用量／２４時間減少し、ＴＧＦβ２は、９５％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＵＢＣワクチンＢによるＴＧＦβ１の分泌は、６４％ ｐｇ／用量／２４時間減少し、ＴＧＦβ２は、８１％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、およびＪ８２細胞株を、上記のように、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＵＭ－ＵＣ－３細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表７９に示され、以下に記載される。
ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、およびＪ８２細胞株を、上記のように、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＵＭ－ＵＣ－３細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２４および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表７９に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも２，７００倍増加した。ＵＢＣワクチンＡ成分細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの発現の増加倍率は、以下のとおりであった：Ｊ８２は、未改変細胞株（≦０．０１０ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２，７００倍増加し、ＨＴ－１３７６は、未改変細胞株（≦０．０３０ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、６，５００倍増加し、ＴＣＣＳＵＰは、未改変細胞株（≦０．０１２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２，５００倍増加した。ＵＢＣワクチンＢ成分細胞株によるＧＭ－ＣＳＦの発現の増加倍率は、以下のとおりであった：ＳＣａＢＥＲは、未改変細胞株（≦０．００９ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１２，５５６倍増加し、ＵＭ－ＵＣ－３は、未改変細胞株（≦０．００８ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１５，５００倍増加し、ＤＭＳ５３は、未改変細胞株（≦０．００４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３９，４５０倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＵＢＣワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１２７ｎｇ／用量／２４時間であった。ＵＢＣワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１９８ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり３２５ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＵＢＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図９６に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌの膜発現が、６つのＵＢＣワクチン成分細胞株すべてで実質的に増加したことを示す。
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＵＢＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図９６に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌの膜発現が、６つのＵＢＣワクチン成分細胞株すべてで実質的に増加したことを示す。
膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも８５１倍増加した。ＵＢＣワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、Ｊ８２（３７，１９６ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、３７，１９６倍増加し、ＨＴ－１３７６（３７，４４４ＭＦＩ）で、親細胞株（４４ＭＦＩ）と比較して、８５１倍増加し、ＴＣＣＳＵＰ（１９９，６８７ＭＦＩ）で、親細胞株（１８８ＭＦＩ）と比較して、１，０６２倍増加した。ＵＢＣワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＳＣａＢＥＲ（１３，７７２ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１３，７７２倍増加し、ＵＭ－ＵＣ－３（１１，３０１ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１１，３０１倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１倍増加した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表８０に示され、以下に記載される。
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表８０に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも１，４００倍増加した。ＵＢＣワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、Ｊ８２で、親細胞株（≦０．００４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３，５００倍増加し、ＨＴ－１３７６で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、６０９，０００倍増加し、ＴＣＣＳＵＰで、親細胞株（≦０．００５ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１，４００倍増加した。ＵＢＣワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＳＣａＢＥＲで、親細胞株（≦０．００４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、６，７５０倍増加し、ＵＭ－ＵＣ－３で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、６，０００倍増加した。ＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＵＢＣワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、３１６ｎｇ／用量／２４時間であった。ＵＢＣワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、２３ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり３３９ｎｇであった。
Ｊ８２細胞株によるｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１（ｍｏｄＴＤＧＦ１）の安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＪ８２細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１抗原をコードする遺伝子は、フーリン切断部位によって連結されている（配列番号５３、配列番号５４）。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＪ８２細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１抗原をコードする遺伝子は、フーリン切断部位によって連結されている（配列番号５３、配列番号５４）。
Ｊ８２によるｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２６８０６１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（２４９，６３２ＭＦＩ）で、親細胞株（１６，４８１ＭＦＩ）のものよりも６０倍増加した（図９５Ａ）。Ｊ８２によるｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１の発現は、フローサイトメトリーによっても特徴付けられた。細胞を、最初に、ウサギＩｇＧ抗Ｃｒｉｐｔｏ１抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１０８３９１）（０．０３μｇ／試験）、続いて、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）（０．１２５μｇ／試験）で細胞内染色した。ｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１の発現は、改変細胞株（３，３３０，４００ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１３，０４２ＭＦＩ）よりも２５５倍増加した（図９４Ｂ）。
ＳＣａＢＥＲ細胞株によるｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）の安定的な発現
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＳＣａＢＥＲ細胞株を、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（配列番号５１、配列番号５２）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＳＣａＢＥＲによるｍｏｄＷＴ１の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９９０１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＷＴ１の発現は、改変細胞株（４，１２１，０２８ＭＦＩ）で、未改変細胞株（４６，０１２ＭＦＩ）のものよりも９０倍増加した（図９４Ｃ）。ＳＣａＢＥＲによるｍｏｄＦＯＬＲ１の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＡＴＣＧ（配列番号１３０））は、導入遺伝子の５６～７６ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＴＣＴＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＧ（配列番号：１３１））は、導入遺伝子の５８８～６０９ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、５５４ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＦＯＬＲ１の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出された（図９５Ｄ）。ｍＲＮＡは、親対照と比較して、２４９，８１０倍増加した。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＳＣａＢＥＲ細胞株を、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（配列番号５１、配列番号５２）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＳＣａＢＥＲによるｍｏｄＷＴ１の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９９０１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＷＴ１の発現は、改変細胞株（４，１２１，０２８ＭＦＩ）で、未改変細胞株（４６，０１２ＭＦＩ）のものよりも９０倍増加した（図９４Ｃ）。ＳＣａＢＥＲによるｍｏｄＦＯＬＲ１の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＡＴＣＧ（配列番号１３０））は、導入遺伝子の５６～７６ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＴＣＴＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＧ（配列番号：１３１））は、導入遺伝子の５８８～６０９ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、５５４ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＦＯＬＲ１の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出された（図９５Ｄ）。ｍＲＮＡは、親対照と比較して、２４９，８１０倍増加した。
ＵＢＣワクチンＡにおけるＰＳＭＡおよびＣｒｉｐｔｏ１（ＴＤＧＦ１）に対する免疫応答
ＰＳＭＡおよびＣｒｉｐｔｏ１に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＵＢＣワクチンＡとの関連で評価された。表８１に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。
ＰＳＭＡおよびＣｒｉｐｔｏ１に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＵＢＣワクチンＡとの関連で評価された。表８１に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。
ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＵＢＣワクチンＡ（４５０±１７９ＳＦＵと比較して、改変ＵＢＣワクチンＡ（７５７±２７８ＳＦＵ）で増加した（図９５Ｅ）。Ｃｒｉｐｔｏ１に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然Ｃｒｉｐｔｏ１抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。Ｃｒｉｐｔｏ１に対するＩＦＮγ応答は、未改変ＵＢＣワクチンＡ（６７±４７ＳＦＵ）と比較して、改変ＵＢＣワクチンＡ（４２０±１３２ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０２３、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図９５Ｆ）。
ＵＢＣワクチンＢにおけるＷＴ１およびＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）に対する免疫応答
ＷＴ１およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＵＢＣワクチンＢとの関連で評価された（表８１）。ＷＴ１およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＵＢＣワクチンＢ（６５±２３ＳＦＵ）と比較して、ＵＢＣワクチンＢ（６５４±２６８ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１７、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図９５Ｇ）。ＦＯＬＲ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＵＢＣワクチンＢ（９５±５１ＳＦＵ）と比較して、ＵＢＣワクチンＢ（６４３±２４４ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図９５Ｈ）。
ＷＴ１およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＵＢＣワクチンＢとの関連で評価された（表８１）。ＷＴ１およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＵＢＣワクチンＢ（６５±２３ＳＦＵ）と比較して、ＵＢＣワクチンＢ（６５４±２６８ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１７、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図９５Ｇ）。ＦＯＬＲ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＵＢＣワクチンＢ（９５±５１ＳＦＵ）と比較して、ＵＢＣワクチンＢ（６４３±２４４ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図９５Ｈ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
１０のＵＢＣ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＵＢＣワクチンＡおよびＵＢＣワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表８１）は、ＵＢＣワクチンＡまたはＵＢＣワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ１、ＷＴ１、およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する追加の１５ｍｅｒペプチドのペプチドプールは、以下のように供給された：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、ＭＡＧＥＡ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ１）、ＭＡＧＥＡ３（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ３）、ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、およびＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）。
１０のＵＢＣ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＵＢＣワクチンＡおよびＵＢＣワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表８１）は、ＵＢＣワクチンＡまたはＵＢＣワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ１、ＷＴ１、およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する追加の１５ｍｅｒペプチドのペプチドプールは、以下のように供給された：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、ＭＡＧＥＡ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ１）、ＭＡＧＥＡ３（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ３）、ＴＥＲＴ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）、およびＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）。
図９７は、ＵＢＣワクチンが、７人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、１０のＵＢＣ抗原に対して抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導することができることを示し、これは、未改変親対照（２，９８６±８１３ＳＦＵ）と比較して、４．３倍より強力であった（１２，７０６±３，２２３ ＳＦＵ）（ｐ＝０．００７、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図９７Ａ）。ＵＢＣワクチンＡおよびＵＢＣワクチンＢの単位用量は、２人のドナーで８つの抗原、１人のドナーで９つの抗原、４人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した（図９８）。ＵＢＣワクチンＡおよびＵＢＣワクチンＢは、親対照と比較して、それぞれ２．５倍および７．９倍の抗原特異的応答の増加を示した。具体的には、ＵＢＣワクチンＡは、未改変対照（２，０２７±５７３ＳＦＵ）と比較して、５，１４０±１，４２２ＳＦＵを誘発した（図９７Ｂ）。ＵＢＣワクチンＡの場合、１人のドナーが４つの抗原に応答し、１人のドナーが６つの抗原に応答し、１人のドナーが７つの抗原に応答し、１人のドナーが７つの抗原に応答し、３人のドナーが１０の抗原に応答した。ＵＢＣワクチンＢは、親対照（９５９±３３１ＳＦＵ）と比較して、７，５６５±１，９３３ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図９７Ｃ）。ＵＢＣワクチンＢの場合、１人のドナーが４つの抗原に応答し、１人のドナーが８つの抗原に応答し、１人のドナーが９つの抗原に応答し、４人のドナーが１０の抗原に応答した。治療有効量の３つのがん細胞株含む２つの組成物（６つの細胞株の単位用量）が上に記載されており、当該単位用量は、ＵＢＣ患者の腫瘍において発現された少なくとも８つのＴＡＡに特異的な、未改変組成物よりも４．３倍大きい免疫応答を誘発することができる。ＵＢＣワクチンＡは、少なくとも４つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を２．５倍増加させ、ＵＢＣワクチンＢは、少なくとも４つのＴＡＡに対して、ＦＮγ応答を７．９倍Ｉ増加させた。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣから供給される６つのがん細胞株Ｊ８２（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－１）、ＨＴ－１３７６（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１４７２）、ＴＣＣＳＵＰ（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－５）、ＳＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－３）、ＵＭ－ＵＣ－３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１７４９）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む膀胱癌のための全細胞ワクチンを、表８３に示す。細胞株は、５つの膀胱癌細胞株および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用してエレクトロポレーションによってノックアウトされるか、またはレンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡ形質導入を使用してノックダウンされる。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ，ｍｏｄＰＳＭＡ（Ｊ８２）、ｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１（ｍｏｄＴＤＧＦ１）（Ｊ８２）、ｍｏｄＷＴ１（ＳＣａＢＥＲ）、ｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）（ＳＣａＢＥＲ）の遺伝子が、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加されている。
したがって、本実施例は、少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を低減し、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するように改変された、治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（６つのがん細胞株の単位用量）を提供する。１つの組成物であるＵＢＣワクチンＡは、２つのＴＡＡ（ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＣｒｉｐｔｏ１（ｍｏｄＴＤＧＦ１））の発現を増加させるように改変された。第２の組成物であるＵＢＣワクチンＢは、２つのＴＡＡ（ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ））を発現するように改変された。６つのがん細胞株の単位用量は、当該組成物を受けることが意図された膀胱癌対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１５のＴＡＡを発現し、未改変組成物成分よりも４．３倍大きいＩＦＮγ応答を誘導する。
実施例３３：卵巣癌（ＯＣ）ワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＯＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＯＣワクチンＡは、細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ｍｏｄＴＥＲＴも発現するように改変された細胞株ＭＣＡＳ、ならびにｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０も発現するように改変された細胞株ＴＯＶ－１１２Ｄから構成されている。第２のカクテルであるＯＣワクチンＢは、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）も発現するように改変された細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ｍｏｄＢＯＲＩＳも発現するように改変された細胞株ＥＳ－２、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＯＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＯＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＯＣワクチンＡは、細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ｍｏｄＴＥＲＴも発現するように改変された細胞株ＭＣＡＳ、ならびにｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０も発現するように改変された細胞株ＴＯＶ－１１２Ｄから構成されている。第２のカクテルであるＯＣワクチンＢは、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）も発現するように改変された細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ｍｏｄＢＯＲＩＳも発現するように改変された細胞株ＥＳ－２、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＯＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の抗原をまとめて発現する。
ＯＣワクチン成分の特定
最初の細胞株選択基準により、ＯＣワクチンに含まれる可能性のある３６のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、本明細書に記載の追加の選択基準を適用して、３６の細胞株を１０の細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＯＣ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＯＣ関連ＣＳＣ様マーカーＡＬＤＨ１Ａ、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＡＬ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、細胞株が原発腫瘍または転移部位に由来する場合、ならびに卵巣の組織学的サブタイプが含まれる。
最初の細胞株選択基準により、ＯＣワクチンに含まれる可能性のある３６のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、本明細書に記載の追加の選択基準を適用して、３６の細胞株を１０の細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＯＣ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＯＣ関連ＣＳＣ様マーカーＡＬＤＨ１Ａ、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＡＬ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、細胞株が原発腫瘍または転移部位に由来する場合、ならびに卵巣の組織学的サブタイプが含まれる。
ＣＳＣは、卵巣癌の転移、治療抵抗性、および再発において重要な役割を果たす（表２）。候補成分細胞株によるＴＡＡおよびＣＳＣ様マーカーの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号がＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡの発現が各ＴＡＡまたはＣＳＣマーカーについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値が１より大きい場合、細胞株によるＴＡＡまたはＣＳＣマーカーの発現を陽性とみなした。選択基準により、さらなる評価のために１０の候補ＯＣワクチン成分が特定された：ＯＶＣＡＲ－３、ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ、ＭＣＡＳ、ＴＹＫ－ｎｕ、ＯＶＳＡＨＯ、ＯＶＴＯＫＯ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、ＯＶＭＡＮＡ、およびＴＯＶ－１１２Ｄ。１０の候補成分細胞株は、６～１４のＴＡＡ（図９９Ａ）および２～５つのＣＳＣ様マーカー（図９９Ｂ）を発現した。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様細胞株ＤＭＳ５３は、６つのワクチン細胞株のうちの１つとして含まれ、１２のＯＣのＴＡＡおよび５つのＯＣのＣＳＣ様マーカーを発現した。
１０の未改変ＯＣワクチン成分候補の免疫原性は、３人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）について、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。３人のドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊３５：０１およびＡ＊３１：０１ Ｂ＊３５：０３；ドナー２、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊０７：０２およびＡ＊３０：０１ Ｂ＊１２：０２；ドナー３、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０７およびＡ＊２４：０２ Ｂ＊１８：０１。ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ（１，８９６±４２１ＳＦＵ）、ＯＶＴＯＫＯ（２，１２４±５９１ＳＦＵ）、およびＴＯＶ－２１Ｇ（１，５５９±２７３ＳＦＵ）は、ＯＶＣＡＲ－３（５４±２４ＳＦＵ）、ＭＣＡＳ（４２０±２１８ＳＦＵ）、ＴＹＫ－ｎｕ（３３９±１０９ＳＦＵ）、ＯＶＳＡＨＯ（４０４±１６３ＳＦＵ）、ＥＳ－２（２１５±１１７ＳＦＵ）、ＯＶＭＡＮＡ（４６±２９）、およびＴＯＶ－１１２Ｄ（８９±６２）よりも免疫原性が高かった（図１００Ａ）。
ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＴＯＶ－２１Ｇの免疫原性は、３成分細胞株の１１の異なる組み合わせ（ＫＵＲＡＭＯＣＨＩを含む３つの組み合わせ、ＯＶＴＯＫＯを含む４つの組み合わせ、およびＴＯＶ－２１Ｇを含む４つの組み合わせ）で評価された（図１００Ｃ）。ＯＶＭＡＮＡ（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ１０４５）は、本明細書に記載の実験が完了する前に、ＪＣＲＢによって指摘された凍結保存後の生存率の低さが確認されたため、１１つのカクテルには含まれなかった。ＩＦＮγ応答は、３人の健常ドナー（ｎ＝４／ドナー）について、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、１１の潜在的なワクチンカクテル中の３つの成分細胞株に対して決定された。ドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊０７：０２およびＡ＊２３：０１ Ｂ＊１４：０２；ドナー２、Ａ＊３２：０１ Ｂ＊２７：０５およびＡ＊６８：０５ Ｂ＊３９：０８；ドナー３、Ａ＊０２：０２ Ｂ＊１５：０３およびＡ＊３０：０２ Ｂ＊５７：０３。ＩＦＮγ応答は、１１つのカクテルすべてについて、および各カクテルの各細胞株成分に対して検出された。ほとんどのカクテル成分細胞株に対するＩＦＮγ応答は、単一細胞株で検出された応答と比較して、同様であったか、または著しく増加していた。評価された１１の組み合わせすべてにおいて、ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＴＯＶ－２１Ｇは、依然として最も免疫原性が高かった（図１００Ｂ）。ＫＵＲＡＭＯＣＨＩは、遺伝子改変後の増殖形態に基づく潜在的な大規模製造上の懸念のため、最終的なＯＣワクチンに含めるために選択されなかった。ＯＶＴＯＫＯおよびＴＯＶ－２１Ｇは、本明細書でさらに記載されるように、それぞれ、ワクチンカクテルＡおよびワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、様々なＴＡＡを発現するように選択され、ＦＯＬＲ１またはＦＳＨＲなどのＯＣ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ、ならびにＯＣおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含まれる。
本明細書に示されるように、一連のＴＡＡをさらに増強するために、ＭＣＡＳは、ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、ＴＯＶ－１１２Ｄは、ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変され、ＴＯＶ－２１Ｇは、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）を発現するように改変され、ＥＳ－２は、ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変された。ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＷＴ１、ＦＯＬＲ１、およびＢＯＲＩＳは、６つの成分細胞株において、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現されなかった。ＴＥＲＴは、６つの成分細胞株のうちの２つで、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現された（図１０１Ａ）。
ＭＣＡＳによる形質導入された抗原ｍｏｄＴＥＲＴ（図１０２Ａ）（配列番号３５；配列番号３６）の発現、ＴＯＶ－１１２Ｄによる形質導入された抗原ｍｏｄＦＳＨＲ（図１１２Ｂ）およびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０（図１０２Ｃ）（配列番号４３；配列番号４４）の発現、ＴＯＶ－２１Ｇによる形質導入された抗原ｍｏｄＷＴ１（図１０２Ｄ）およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）（図１０２Ｅ）（配列番号５１；配列番号５２）の発現、ＥＳ－２によるによる形質導入された抗原ｍｏｄＢＯＲＩＳ（図１０２Ｆ）（配列番号５９；配列番号６０）の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、フローサイトメトリーまたはＲＴ－ＰＣＲによって検出された。ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されたていた。ｍｏｄＷＴ１とｍｏｄＦＯＬＲ１も、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されていた。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
図１０１Ａに、本ワクチンにおける２０の代表的なＯＣのＴＡＡの内因性ｍＲＮＡ発現を示す。本ワクチンは、上記の抗原の導入後、ＯＣ抗腫瘍応答を誘導することができる、一般に標的化され、または臨床的に関連する可能性のある、特定された２０のＴＡＡをすべて発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）およびＦＳＨＲなどのＯＣ腫瘍で豊富であることが知られており、また、いくつかは、ＯＣおよびＴＥＲＴなどの他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘発することもある。２０の優先順位付けされたＯＣのＴＡＡのＲＮＡ存在量は、実施例２９に記載されているように、利用可能なｍＲＮＡデータ発現を用いて、３０７のＯＣ患者試料で決定された（図１０１Ｂ）。優先順位付けされたＯＣのＴＡＡのうち、１５のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１６のＴＡＡが９８．０％の試料で発現され、１７のＴＡＡが７９．８％の試料で発現され、１８のＴＡＡが４３．３％の試料で発現され、１９のＴＡＡが１６．６％の試料で発現され、２０のＴＡＡが３．９％の試料で発現された（図１０１Ｃ）。したがって、本実施例は、治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物を提供し、細胞株の組み合わせ（６つの細胞株の単位用量）は、当該組成物を受けることが意図されたＯＣがん対象のサブセットと関連する少なくとも１５のＴＡＡを発現する細胞を含む。本明細書に提示される発現および免疫原性データに基づいて、表８４で特定される細胞株が、本ＯＣワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現の減少
ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表８５に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９８．１％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表８５に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９８．１％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイ
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＯＣワクチンＡ中のＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、およびＴＯＶ－１１２Ｄ親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＯＣワクチンＢのＴＯＶ－２１ＧおよびＥＳ－２成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例５に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＯＣワクチンＡ中のＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、およびＴＯＶ－１１２Ｄ親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＯＣワクチンＢのＴＯＶ－２１ＧおよびＥＳ－２成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例５に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、およびＥＳ－２成分細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、その導入遺伝子と同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、およびＥＳ－２はまた、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子で形質導入され、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。ＯＶＴＯＫＯおよびＴＯＶ－２１Ｇ細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。これらの細胞は、ＴＧＦβ２の分泌ではなく、ＴＧＦβ１の分泌を減少させるように改変されており、クローン名ＤＫ２で表される。ＤＭＳ５３を、実施例２６に記載されているように、ｓｈＲＮＡで改変して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させた。Ｊ８２およびＤＭＳ５３細胞は、ＴＧＦβ１ではなく、ＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されており、クローン名ＤＫ４で表される。
ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡによるＴＯＶ－２１Ｇの改変は、最初、ＴＧＦβ１の分泌を減少させたが、ＴＧＦβ１の分泌が、潜在的に細胞増殖および生存を維持するための代償メカニズムを介して、さらなる遺伝子改変後に増加した。ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡによる形質導入の結果、ＥＳ－２細胞株によるＴＧＦβ２の分泌が１９％減少した。ＯＣワクチンＢ成分細胞株ＴＯＶ－２１ＧおよびＥＳ－２の免疫原性を、実施例９に記載されているように、５人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、未改変対照の免疫原性と比較した。表７４に、ドナー１～３のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルを示す。他の２人のドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった；ドナー７、Ａ＊０３：０１ Ｂ＊０７：０２およびＡ＊２５：０１ Ｂ＊１８：０１；ドナー８、Ａ＊３０：０２ Ｂ＊１５：１０およびＡ＊３０：０４ Ｂ＊５８：０２。データは、ＴＯＶ－２１Ｇ ＯＣワクチンＢ成分細胞株（４，３９０±５１７ＳＦＵ）が、未改変ＴＯＶ－２１Ｇ（３４９±１２１ＳＦＵ）よりも免疫原性が高いことを示した（図１０３Ａ）。データはさらに、ＯＣワクチンＢ成分細胞株ＥＳ－２（１，５０５±３９４ＳＦＵ）が、未改変ＥＳ－２（２３８±１００ＳＦＵ）よりも有意に免疫原性が高いことを示した（ｐ＝０．０１６、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ）（図１０３Ｂ）。上記のデータは、複数の改変を通して得られた免疫学的な利益を示す。
表８６は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変された成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率（％）を示す。ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌が、ＥＬＩＳＡアッセイで実行された１６回の反復のうちの１回でのみ検出された場合、その値は、平均の標準誤差なしで報告される。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が、少なくとも７０％減少した（ＴＯＶ－２１Ｇを除く）。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が少なくとも１９％減少した。
表８７に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＯＣワクチンＡおよびＯＣワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＯＣワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、８５％ ｐｇ／用量／２４時間減少し、ＴＧＦβ２は、９４％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＯＣワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、３１％ ｐｇ／用量／２４時間減少し、ＯＣワクチンＢによるＴＧＦβ２の分泌は、２３％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、およびＥＳ－２細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、上記のようにＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＯＶＴＯＫＯおよびＴＯＶ－２１Ｇ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表８７に示され、以下に記載される。
ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、およびＥＳ－２細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、上記のようにＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＯＶＴＯＫＯおよびＴＯＶ－２１Ｇ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表８７に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも６５６倍増加した。ＯＣワクチンＡ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＯＶＴＯＫＯで、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、６５６倍増加し、ＭＣＡＳで、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３，２８０倍増加し、ＴＯＶ－１１２Ｄで、親細胞株（≦０．０１４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１，８７５倍増加した。ＯＣワクチンＢ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＴＯＶ－２１Ｇで、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４２６，６６０倍増加し、ＥＳ－２で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２２，０４７倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（≦０．００３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４９，３１３倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＯＣワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、３６ｎｇ／用量／２４時間であった。ＯＣワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、８０２ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり８３８ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＯＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１０４に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＯＣワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
成分細胞株を、上記のように膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＯＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１０４に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＯＣワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも２８８倍増加した。ＯＣワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＯＶＴＯＫＯ（１３，６６１ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１８，０４６倍増加し、ＭＣＡＳ（１８，１５０ＭＦＩ）で、親細胞株（１７ＭＦＩ）と比較して、１．０６８倍増加し、ＴＯＶ－１１２Ｄ（２８８ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、２８８倍増加した。ＴＯＶ－１１２Ｄは、その後、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を濃縮するために選別された。選別後、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、親細胞株と比較して、７２８倍増加した。膜結合ＣＤ４０Ｌの発現が２８８倍に増加したＴＯＶ－１１２Ｄ成分細胞株を使用して、本明細書に記載のものを生成し、図１０４に示されている。ＯＣワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＴＯＶ－２１Ｇで、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１８，８７４倍増加し、ＥＳ－２（２，８２３ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、２，８２３倍増加し、ＤＭＳ５３（８８，２６１ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１倍増加した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表８９に示され、以下に記載される。
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表８９に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも１，７３９倍増加した。ＯＣワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、ＯＶＴＯＫＯで、親細胞株（≦０．００１４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３５倍増加し、ＭＣＡＳで、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１１倍増加し、ＴＯＶ－１１２Ｄで、親細胞株（≦０．００６ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１，７３９倍増加した。未改変ＴＯＶ－１１２Ｄ細胞株によるＩＬ－１２の発現は、改変された細胞株によるＩＬ－１２の分泌とは別の実験で決定された。ＯＣワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＴＯＶ－２１Ｇで、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３７倍増加し、ＥＳ－２で、親細胞株（≦０．００１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）で、４３倍増加した。ＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＯＣワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、２９ｎｇ／用量／２４時間であった。ＯＣワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、３２ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり６１ｎｇであった。
ＭＣＡＳ細胞株によるｍｏｄＴＥＲＴの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン成分中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＭＣＡＳ細胞株を、ｍｏｄＴＥＲＴ抗原（配列番号３５、配列番号３６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＭＣＡＳによるｍｏｄＴＥＲＴの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ抗ＴＥＲＴ（Ａｂｃａｍ ａｂ３２０２０）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＥＲＴの発現は、改変細胞株（１，５５８，５２８ＭＦＩ）で、未改変細胞株（２２７，７２４ＭＦＩ）の６．８倍増加した（図１０２Ａ）。
上記のように、本明細書に記載のワクチン成分中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＭＣＡＳ細胞株を、ｍｏｄＴＥＲＴ抗原（配列番号３５、配列番号３６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＭＣＡＳによるｍｏｄＴＥＲＴの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ抗ＴＥＲＴ（Ａｂｃａｍ ａｂ３２０２０）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＥＲＴの発現は、改変細胞株（１，５５８，５２８ＭＦＩ）で、未改変細胞株（２２７，７２４ＭＦＩ）の６．８倍増加した（図１０２Ａ）。
ＴＯＶ－１１２Ｄ細胞株によるｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０の安定的な発現
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＴＯＶ－１１２Ｄ細胞株を、ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０抗原（配列番号４３、配列番号４４）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＴＯＶ－１１２ＤによるｍｏｄＦＳＨＲの発現は、フローサイトメトリーによって決定された。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＦＳＨＲ抗体（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢＰ２－３６４８９）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＦＳＨＲの発現は、改変細胞株（８６，７９６ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１３，２４９ＭＦＩ）のものよりも６．６倍増加した（図１０２Ｂ）。ＴＯＶ－１１２ＤによるｍｏｄＭＡＧＥＡ１０の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧ（配列番号１３２））は、導入遺伝子の２４～５０ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＴ（配列番号：１３３））は、導入遺伝子の６３７～６５９ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、６３４ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１０２Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、１４１，４７６倍増加した。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＴＯＶ－１１２Ｄ細胞株を、ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０抗原（配列番号４３、配列番号４４）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＴＯＶ－１１２ＤによるｍｏｄＦＳＨＲの発現は、フローサイトメトリーによって決定された。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＦＳＨＲ抗体（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢＰ２－３６４８９）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＦＳＨＲの発現は、改変細胞株（８６，７９６ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１３，２４９ＭＦＩ）のものよりも６．６倍増加した（図１０２Ｂ）。ＴＯＶ－１１２ＤによるｍｏｄＭＡＧＥＡ１０の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧ（配列番号１３２））は、導入遺伝子の２４～５０ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＴ（配列番号：１３３））は、導入遺伝子の６３７～６５９ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、６３４ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１０２Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、１４１，４７６倍増加した。
ＴＯＶ－２１Ｇ細胞株によるｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）の安定的な発現
ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＴＯＶ－２１Ｇ細胞株を、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１抗原（配列番号５１、配列番号５２）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＴＯＶ－２１ＧによるｍｏｄＷＴ１の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９９０１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＷＴ１の発現は、改変細胞株（６８７，５８２ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１４０，７７０ＭＦＩ）のものよりも４．９倍増加した（図１０２Ｃ）。
ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＴＯＶ－２１Ｇ細胞株を、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１抗原（配列番号５１、配列番号５２）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＴＯＶ－２１ＧによるｍｏｄＷＴ１の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９９０１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＷＴ１の発現は、改変細胞株（６８７，５８２ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１４０，７７０ＭＦＩ）のものよりも４．９倍増加した（図１０２Ｃ）。
ＴＯＶ－２１ＧによるｍｏｄＦＯＬＲ１の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＡＴＣＧ（配列番号１３０））は、導入遺伝子の５６～７６ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＴＣＴＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＧ（配列番号：１３１））は、導入遺伝子の５８８～６０９ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、５５４ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＦＯＬＲ１の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１０２Ｅ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、１７０，８５５倍増加した。
ＥＳ－２細胞株によるｍｏｄＢＯＲＩＳの安定的な発現
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＥＳ－２細胞株を、ｍｏｄＢＯＲＩＳ抗原（配列番号５９、配列番号６０）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＥＳ－２によるｍｏｄＢＯＲＩＳの発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧ（配列番号１３４））は、導入遺伝子の１１１９～１１３８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＡＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡ（配列番号：１３５））は、導入遺伝子の１５５９～１５７８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、４６０ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＢＯＲＩＳの遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１０２Ｆ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、４，１９６倍増加した。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＥＳ－２細胞株を、ｍｏｄＢＯＲＩＳ抗原（配列番号５９、配列番号６０）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＥＳ－２によるｍｏｄＢＯＲＩＳの発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧ（配列番号１３４））は、導入遺伝子の１１１９～１１３８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＡＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡ（配列番号：１３５））は、導入遺伝子の１５５９～１５７８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、４６０ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＢＯＲＩＳの遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１０２Ｆ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、４，１９６倍増加した。
ＯＣワクチンＡにおけるＴＥＲＴに対する免疫応答
ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＯＣワクチンＡとの関連で評価された。表９０に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、天然ＴＥＲＴ抗原（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＡ（７０７±３１４ＳＦＵ）と比較して、改変ＯＣワクチンＡ（１０４７±３１３ＳＦＵ）で増加したが、統計的有意性（ｎ＝７）には達しなかった（図１０２Ｇ）。
ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＯＣワクチンＡとの関連で評価された。表９０に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、天然ＴＥＲＴ抗原（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＡ（７０７±３１４ＳＦＵ）と比較して、改変ＯＣワクチンＡ（１０４７±３１３ＳＦＵ）で増加したが、統計的有意性（ｎ＝７）には達しなかった（図１０２Ｇ）。
ＯＣワクチンＡにおけるＦＳＨＲおよびＭＡＧＥＡ１０に対する免疫応答
ＦＳＨＲおよびＭＡＧＥＡ１０抗原に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＯＣワクチンＡとの関連で評価された。表９０に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＦＳＨＲに対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然ＦＳＨＲ抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。改変ＯＣワクチンＡ（３，３７９±１，９２３ＳＦＵ）によって誘導されるＦＳＨＲ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＯＣワクチンＡ（７０９±４８２ＳＦＵ）と比較して、増加したが、統計的有意性には達しなかった（ｎ＝７）（図１０２Ｈ）。ＭＡＧＥＡ１０に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然ＭＡＧＥＡ１０抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＭＡＧＥＡ１０に対するＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＡ（６３０±１５６ＳＦＵ）と比較して、改変ＯＣワクチンＡ（８９３±４９５ＳＦＵ）で増加したが、統計的有意性（ｎ＝７）には達しなかった（図１０２Ｉ）。
ＦＳＨＲおよびＭＡＧＥＡ１０抗原に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＯＣワクチンＡとの関連で評価された。表９０に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＦＳＨＲに対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然ＦＳＨＲ抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。改変ＯＣワクチンＡ（３，３７９±１，９２３ＳＦＵ）によって誘導されるＦＳＨＲ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＯＣワクチンＡ（７０９±４８２ＳＦＵ）と比較して、増加したが、統計的有意性には達しなかった（ｎ＝７）（図１０２Ｈ）。ＭＡＧＥＡ１０に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然ＭＡＧＥＡ１０抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＭＡＧＥＡ１０に対するＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＡ（６３０±１５６ＳＦＵ）と比較して、改変ＯＣワクチンＡ（８９３±４９５ＳＦＵ）で増加したが、統計的有意性（ｎ＝７）には達しなかった（図１０２Ｉ）。
ＯＣワクチンＢにおけるＷＴ１およびＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）に対する免疫応答
ＷＴ１およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書記載されているように、ＯＣワクチンＢとの関連で評価された（表９０）。ＷＴ１およびＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＢ（１３２±７４ＳＦＵ）（ｎ＝７）と比較して、ＯＣワクチンＢ（５１６±２４１ＳＦＵ）によって増加したが、統計的有意性（ｎ＝７）には達しなかった（図１０２Ｋ）。ＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＢ（１６８±６５ＳＦＵ）と比較して、ＯＣワクチンＢ（４６７±１７５ＳＦＵ）によって増加したが、統計的有意性には達しなかった（ｎ＝７）（図１０２Ｊ）。
ＷＴ１およびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書記載されているように、ＯＣワクチンＢとの関連で評価された（表９０）。ＷＴ１およびＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＢ（１３２±７４ＳＦＵ）（ｎ＝７）と比較して、ＯＣワクチンＢ（５１６±２４１ＳＦＵ）によって増加したが、統計的有意性（ｎ＝７）には達しなかった（図１０２Ｋ）。ＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＢ（１６８±６５ＳＦＵ）と比較して、ＯＣワクチンＢ（４６７±１７５ＳＦＵ）によって増加したが、統計的有意性には達しなかった（ｎ＝７）（図１０２Ｊ）。
ＯＣワクチンＢにおけるＢＯＲＩＳに対する免疫応答
ＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＯＣワクチンＢとの関連で評価された（表９０）。ＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＢＯＲＩＳ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＢ（１２１±６５ＳＦＵ）と比較して、ＯＣワクチンＢ（２，２３４±１，０１１ＳＦＵ）で優位に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図１０２Ｌ）。
ＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、７人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＯＣワクチンＢとの関連で評価された（表９０）。ＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＢＯＲＩＳ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＯＣワクチンＢ（１２１±６５ＳＦＵ）と比較して、ＯＣワクチンＢ（２，２３４±１，０１１ＳＦＵ）で優位に増加した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図１０２Ｌ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
１０のＯＣ抗原に対してＩＦＮγ応答を誘導するＯＣワクチンＡおよびＯＣワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表９０）は、ＯＣワクチンＡまたはＯＣワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＴＥＲＴ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＷＴ１、ＦＯＬＲ１、およびＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下から供給された：ＭＳＬＮ（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｉｐｔカスタムライブラリ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＰＲＡＭＥ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＯＩＰ４）、およびＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）。
１０のＯＣ抗原に対してＩＦＮγ応答を誘導するＯＣワクチンＡおよびＯＣワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表９０）は、ＯＣワクチンＡまたはＯＣワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＴＥＲＴ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＷＴ１、ＦＯＬＲ１、およびＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下から供給された：ＭＳＬＮ（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｉｐｔカスタムライブラリ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＰＲＡＭＥ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＯＩＰ４）、およびＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）。
図１０５は、ＯＣワクチンが、７人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、１０のＯＣ抗原に対して抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導することができることを示し、これは、未改変親対照（７，４９５±２，３１７ＳＦＵ）と比較して、３．３倍より強力であった（２４，９４２±１０，１３８ ＳＦＵ）（ｐ＝Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝７）（図９７Ａ）。ＯＣワクチンＡおよびＯＣワクチンＢの単位用量は、１人のドナーで７つの抗原、２人のドナーで９つの抗原、４人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した（図１０６）。ＯＣワクチンＡおよびＯＣワクチンＢは、親対照と比較して、それぞれ２．２倍および６．１倍の抗原特異的応答の増加を示した。具体的には、ＯＣワクチンＡは、未改変対照（５，３８５±１，８９２ＳＦＵ）と比較して、１２，１１６±５，８１３ＳＦＵを誘発した（図１０５Ｂ）。ＯＣワクチンＡの場合、１人のドナーが６つの抗原に応答し、２人のドナーが７つの抗原に応答し、２人のドナーが８つの抗原に応答し、１人のドナーが７つの抗原に応答し、２人のドナーが１０の抗原に応答した。ＯＣワクチンＢは、親対照（２，１１０±５２９ＳＦＵ）と比較して、１２，８２６±４，７８０ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．０１１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図１０５Ｃ）。ＯＣワクチンＢの場合、１人のドナーが６つの抗原に応答し、１人のドナーが７つの抗原に応答し、２人のドナーが８つの抗原に応答し、３人のドナーが１０の抗原に応答した。したがって、本実施例は、治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（６つの細胞株の単位用量）を提供し、当該単位用量は、ＯＣ患者の腫瘍で発現された少なくとも７つのＴＡＡに特異的な、未改変組成物よりも３．３倍大きい免疫応答を誘発することができる。ＯＣワクチンＡは、少なくとも６つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を２．２倍増加させ、ＯＣワクチンＢは、少なくとも６つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を６．１倍増加させた。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣまたはＪＣＲＢから供給される６つのがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ１０４８）、ＭＣＡＳ（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０２４０）、ＴＯＶ－１１２Ｄ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１１７３１）、ＴＯＶ－２１Ｇ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１１７３０）、ＥＳ－２（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１９７８）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む卵巣癌の全細胞ワクチンを、表９２に示す。細胞株は、５つの卵巣癌細胞株および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用してエレクトロポレーションによってノックアウトされるか、またはレンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡ形質導入を使用してノックダウンされる。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ｍｏｄＴＥＲＴ（ＭＣＡＳ）、ｍｏｄＦＳＨＲ（ＴＯＶ－１１２Ｄ）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０（ＴＯＶ－１１２Ｄ）、ｍｏｄＷＴ１（ＴＯＶ－２１Ｇ）、ｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）（ＴＯＶ－２１Ｇ）、およびｍｏｄＢＯＲＩＳ（ＥＳ－２）の遺伝子が、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加されている。
治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を低減し、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するように改変されている、６つのがん細胞株の単位用量）が本明細書に提供される。１つの組成物であるＯＣワクチンＡは、３つのＴＡＡ（ｍｏｄｈＴＥＲＴ、ｍｏｄＦＳＨＲ、およびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０）の発現を増加させるように改変された。第２の組成物であるＯＣワクチンＢは、３つのＴＡＡ（ｍｏｄＷＴ１、ｍｏｄＦＯＬＲ１（ｍｏｄＦＢＰ）、およびｍｏｄＢＯＲＩＳ）を発現するように改変された。６つのがん細胞株の単位用量は、当該組成物を受けることが意図された卵巣癌対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１５のＴＡＡを発現し、未改変組成物成分よりも２．２倍大きいＩＦＮγ応答を誘導する。
実施例３４：頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）がんワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＨＮ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＨＮワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＨＳＣ－４、ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴも発現するように改変された細胞株ＨＯ－１－Ｎ－１、ならびにＤＥＴＲＯＩＴ５６２細胞株から構成されている。第２のカクテルであるＨＮワクチンＢは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７も発現するように改変された細胞株ＫＯＮ、細胞株ＯＳＣ－２０、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＨＮ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の非ウイルス抗原、および少なくとも２４の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＨＮ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＨＮワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＨＳＣ－４、ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴも発現するように改変された細胞株ＨＯ－１－Ｎ－１、ならびにＤＥＴＲＯＩＴ５６２細胞株から構成されている。第２のカクテルであるＨＮワクチンＢは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７も発現するように改変された細胞株ＫＯＮ、細胞株ＯＳＣ－２０、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＨＮ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の非ウイルス抗原、および少なくとも２４の抗原をまとめて発現する。
ＨＮワクチン成分の特定
最初の細胞株選択基準により、ＨＮワクチンに含まれる可能性のある３５のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、本明細書に記載の追加の選択基準を適用して、３５の細胞株を６つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＨＮ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、関連するＣＳＣ様マーカーＣＤ４４、ｃＭＥＴ、ＡＢＣＧ２、ＬＲＧ５、ＡＬＤＨ１、およびＢＭＩ－１の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、ＨＮがんの原発部位および病期、ならびに細胞株が由来する部位（原発性または転移性）が含まれた。
最初の細胞株選択基準により、ＨＮワクチンに含まれる可能性のある３５のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、本明細書に記載の追加の選択基準を適用して、３５の細胞株を６つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＨＮ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、関連するＣＳＣ様マーカーＣＤ４４、ｃＭＥＴ、ＡＢＣＧ２、ＬＲＧ５、ＡＬＤＨ１、およびＢＭＩ－１の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、ＨＮがんの原発部位および病期、ならびに細胞株が由来する部位（原発性または転移性）が含まれた。
ＣＳＣは、頭頸部癌の転移、治療抵抗性、および再発に重要な役割を果たす（表２）。候補成分細胞株によるＴＡＡおよびＣＳＣ様マーカーの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）および欧州分子生物学研究所－欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）（ＯＳＣ－２０，ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＫＯＮ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号は、ＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡ発現は、各ＴＡＡについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値が１（ＣＣＬＥ、ＦＰＫＭ）または０（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ、ＴＰＭ）より大きい場合、細胞株によるＴＡＡまたはＣＳＣ様マーカーの発現を陽性とみなした。選択基準により、さらなる評価のために６つの候補ＨＮワクチン成分が特定された：ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＳＣＣ－９、ＨＳＣ－４、ＯＳＣ－２０、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＫＯＮ。６つの候補成分細胞株は、９～１７のＴＡＡ（図１０７Ａ）および４～６つのＣＳＣ様マーカー（図１０７Ｂ）を発現した。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様細胞株ＤＭＳ５３は、６つのワクチン細胞株のうちの１つとして含まれ、１５のＨＮのＴＡＡおよび３つのＨＮのＣＳＣ様マーカーを発現した。
６つの未改変ＨＮワクチン成分候補の免疫原性は、３人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）を使用して、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。３人のドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊０８：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０１；ドナー２、Ａ＊０３：０１ Ｂ＊１５：０１およびＡ＊２４：０２ Ｂ＊０７：０２；ドナー３、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊０７：０２およびＡ＊３０：０１ Ｂ＊１２：０２。ＫＯＮ（１，６４５±２１５ＳＦＵ）およびＨＳＣ－４（１，１２４±３９４ＳＦＵ）は、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２（３７２±１３２ＳＦＵ）、ＳＣＣ－９（０±０ＳＦＵ）、ＯＳＣ－２０（９８５±２６５ＳＦＵ）、およびＨＯ－１－Ｎ－１（４８６±１３７ＳＦＵ）よりも免疫原性が高かった。（図１０９Ａ）。ＳＣＣ－９は、免疫原性が低く、さらなる分析から除外された。ＨＳＣ－４およびＫＯＮは、本明細書でさらに記載されるように、それぞれワクチンカクテルＡおよびワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
５つの選択されたＨＮ細胞株およびＣＳＣ様細胞株ＤＭＳ５３の免疫原性を、３つの成分細胞株の２つの異なる組み合わせで評価した（図１０９Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、５人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）において、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、２つの潜在的なワクチンカクテル内の３つの成分細胞株に対して決定された（表９９、ドナー１～３、５、および６）。ＩＦＮγ応答は、カクテルと各カクテルの各細胞株成分の両方で検出された（図１０９Ｂ）。個々の細胞株に対してＩＦＮγ応答を誘導する潜在的なＨＮワクチンカクテルの能力と比較して、それ自体に対してＩＦＮγ応答を誘導する個々のＨＮワクチン成分細胞株の能力も、実施例８および９に記載されるように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。細胞株のみに対する応答と比較して、ＨＳＣ－４を除いて、ワクチンカクテルに含まれる各ＨＮ細胞株に対するＩＦＮγ応答が増加する傾向があった（図１０９Ｄ）。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、様々なＴＡＡを発現するように選択され、ＮＵＦ２またはＰＳＭＡなどのＨＮ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ、ならびにＨＮおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含まれる。さらに、ＨＮＣの約２５～５０％がＨＰＶ駆動型であり、高リスク株ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８が世界中のＨＰＶ+ＨＮＣ症例の大部分（～８５％）に寄与するため、６つの細胞株のうちの１つも、ＨＰＶ１６および１８のウイルス抗原Ｅ６およびＥ７を発現するように改変された。ウイルス性腫瘍性タンパク質であるＥ６およびＥ７は、腫瘍細胞によって継続的に発現され、ＨＰＶ＋がん細胞の形質転換状態を維持するために不可欠であるため、免疫療法の優れた標的となる。本明細書に示されるように、一連のＴＡＡおよびＨＰＶウイルス抗原をさらに増強するために、ＨＳＣ－４は、ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、ＨＯ－１－Ｎ－１は、ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、ＫＯＮは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７を発現するように改変された。ＴＢＸＴは、６つの成分細胞株で、＞１．０ＦＰＫＭまたは＞０ＴＰＭで内因的に発現されなかった。ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７またはＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７は、ＡＴＣＣまたはＪＣＲＢによって提供された製品情報によると、ＨＮワクチン成分細胞株によって発現されなかった。ＨＰＶ１６または１８ウイルス抗原の発現データは、ＣＣＬＥまたはＥＭＢＬでは利用できなかった。ＰＳＭＡは、６つの成分細胞のうちの１つで、＞１．０ＦＰＫＭまたは＞０ＴＰＭで内因的に発現された。ＰＲＡＭＥは、６つの成分細胞のうちの２つで、＞１．０ＦＰＫＭまたは＞０ＴＰＭで内因的に発現された（図１０７Ａ）。
ＨＳＣ－４（配列番号３７；配列番号３８）による形質導入された抗原ｍｏｄＰＳＭＡ（図１１０Ａ）（配列番号３７；配列番号３８）の発現、ＨＯ－１－Ｎ－１による形質導入された抗原ｍｏｄＰＲＡＭＥ（図１１０Ｂ）およびＴＢＸＴ（図１２０Ｃ）（配列番号６５；配列番号６６）の発現、ならびにＫＯＮによる形質導入された抗原ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７（図１１０Ｄ）（配列番号６７；配列番号６８）の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲフローサイトメトリーによって検出された。ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴ抗原は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位（配列番号６５および配列番号６６）によって分離されている。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
図１０７Ａに、本ワクチンにおける２０の代表的なＨＮのＴＡＡの内因性ｍＲＮＡ発現を示す。ＳＣＣ－９は、本ワクチンに含まれていない図１０７の唯一の細胞株である。本ワクチンは、上記の抗原の導入後、ＨＮ抗腫瘍応答を誘導することができる、一般に標的化され、臨床的に関連する可能性のある、特定された２０のＴＡＡをすべて発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＨＮ腫瘍で豊富であることが知られており、また、いくつかは、ＨＮおよび他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘導することもできる。２４の優先順位付けされたＨＮのＴＡＡのＲＮＡ存在量は、実施例２９に記載されているように、利用可能なｍＲＮＡデータ発現を用いて、５１５のＨＮ患者試料で決定された（図１０８Ａ）。優先順位付けされたＴＡＡのうち、１４のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１５のＴＡＡが９７．５％の試料で発現され、１６のＴＡＡが８９．５％の試料で発現され、１７のＴＡＡが７９．８％の試料で発現され、１８のＴＡＡが６１．０％の試料で発現され、１９のＴＡＡが３５．１％の試料で発現され、２０のＴＡＡが１０．９％の試料で発現された（図１０８Ｂ）。治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物が本明細書に提供され、細胞株の組み合わせ（６つの細胞株の単位用量）は、当該組成物を受けることが意図されたＨＮがん対象のサブセットと関連する少なくとも１４のＴＡＡを発現する細胞を含む。本明細書に提示される発現および免疫原性データに基づいて、表９３で特定される細胞株が、本ＨＮワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現の減少
ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＫＯＮ、ＯＳＣ－２、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表９４に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９８．９％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＫＯＮ、ＯＳＣ－２、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表９４に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９８．９％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイ
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＨＮワクチンＡ中のＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＤＥＴＲＯＩＴ５６２親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＨＮワクチンＢのＫＯＮおよびＯＳＣ－２成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＯＳＣ－２は、低レベルのＴＧＦβ１を分泌し、ＴＧＦβ１分泌を減少させるように改変されなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＨＮワクチンＡ中のＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＤＥＴＲＯＩＴ５６２親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＨＮワクチンＢのＫＯＮおよびＯＳＣ－２成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＯＳＣ－２は、低レベルのＴＧＦβ１を分泌し、ＴＧＦβ１分泌を減少させるように改変されなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、およびＫＯＮ成分細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡを形質導入して、ＴＧＦβ１分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、およびＫＯＮをまた、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子を形質導入して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡによるＨＳＣ－４の改変は、最初、ＴＧＦβ１の分泌を減少させた。その後のＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡによるＨＳＣ－４の改変は、ＴＧＦβ２の分泌を減少させたが、ＴＧＦβ１の分泌レベルは親細胞株と同様であった（表９５）。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、細胞の増殖と生存を促進し、ある程度ＴＧＦβシグナル伝達を維持することが、一部の細胞株の増殖と生存に必要である可能性が高い。個々の未改変および改変ＨＮ細胞ワクチン細胞株成分の免疫原性を、実施例９に記載されているように、５人のＨＬＡ多様ドナー（表９９、ドナー１～３、５、および６）で評価した。改変ＨＳＣ－４細胞株は、未改変細胞株と同様のＴＧＦβ１レベルを分泌するにもかかわらず、未改変細胞株（４００±１８３ＳＦＵ）よりも免疫原性が高いまま（１，１０８±６２８ＳＦＵ）であった（図１０９Ｅ）。ＨＳＣ－４細胞株におけるＴＧＦβ２の減少に続くＴＧＦβ１の分泌の増加は、代償的な生存メカニズムである可能性があった。ＯＳＣ－２０を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子で形質導入して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。続いて、ＯＳＣ－２０を、レンチウイルス粒子で形質導入して、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。ＤＭＳ５３を、実施例２６に記載されているように、ｓｈＲＮＡで改変して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させた。ＯＣＳ－２０およびＤＭＳ５３細胞は、ＴＧＦβ１ではなく、ＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されており、クローン名ＤＫ４で表される。
表９５は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率（％）を示す。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が、少なくとも７９％減少した。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が、少なくとも５１％減少した。
表９６に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＨＮワクチンＡおよびＨＮワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＨＮワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、６１％減少し、ＴＧＦβ２は、９３％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＨＮワクチンＢによるＴＧＦβ１の分泌は、６７％減少し、ＴＧＦβ２は、７５％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、およびＫＯＮ細胞株を、上記のように、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表９６に示され、以下に記載される。
ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、およびＫＯＮ細胞株を、上記のように、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表９６に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも９，５７８倍増加した。ＨＮワクチンＡ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＨＳＣ－４で、親細胞株（≦０．００４２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、５３，７９４倍増加し、ＨＯ－１－Ｎ－１で、親細胞株（≦０．００３９ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３，７０３倍増加し、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２で、親細胞株（≦０．００３８ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３，２３５倍増加した。ＨＮワクチンＢ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＫＯＮで、親細胞株（≦０．００４７ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１４，８６７倍増加し、ＯＳＣ－２で、親細胞株（≦０．００３９ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、９，５７８倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（≦０．００３２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４９，３１３倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＨＮワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１６５ｎｇ／用量／２４時間であった。ＨＮワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１３３ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり２９８ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＨＮ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１１１に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＨＮワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＨＮ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１１１に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＨＮワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも２，１４４倍増加した。ＨＮワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＨＳＣ－４（１８，０４６ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１８，０４６倍増加し、ＨＯ－１－Ｎ－１（９，７９６ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、９，７９６倍増加し、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２（１８，３７４ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１８，３７４倍増加した。ＨＮワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＫＯＮで、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１５，６０３倍増加し、ＯＳＣ－２０（４０，７３８ＭＦＩ）で、親細胞株（１９ＭＦＩ）と比較して、２，１４４倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１倍増加した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表９８に示され、以下に記載される。
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表９８に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも１１，２７４倍増加した。ＨＮワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、ＨＳＣ－４で、親細胞株（≦０．００１７ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１４８，０１７倍増加し、ＨＯ－１－Ｎ－１で、親細胞株（≦０．００１６ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３３，２７１倍増加し、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２で、親細胞株（≦０．００１５ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２１，２７２倍増加した。ＨＮワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＫＯＮで、親細胞株（≦０．００１９ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１１，２７４倍増加し、ＯＳＣ－２で、親細胞株（≦０．００１６ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２２，６４１倍増加した。ＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＨＮワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、１６７ｎｇ／用量／２４時間であった。ＨＮワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、２９ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり１９６ｎｇであった。
ＨＳＣ－４細胞株によるｍｏｄＰＳＭＡの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨＳＣ－４細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨＳＣ－４細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。
ＨＳＣ－４によるｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２６８０６１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（４，４７３，９８１ＭＦＩ）で、親細胞株（１７４，５４５ＭＦＩ）のものよりも２５倍増加した（図１１０Ａ）。
ＨＯ－１－Ｎ－１細胞株によるｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴの安定的な発現
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨＯ－１－Ｎ－１細胞株を、ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴ抗原（配列番号６５、配列番号６６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＨＯ－１－Ｎ－１によるｍｏｄＰＲＡＭＥの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０１５μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＲＡＭＥ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ５－３１９０９）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＲＡＭＥの発現は、改変細胞株（２９０，４３６ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１０，８４６ＭＦＩ）のものよりも２７倍増加した（図１１０Ｂ）。ＨＯ－１－Ｎ－１によるｍｏｄＴＢＸＴの発現は、フローサイトメトリーによっても特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０６μｇ／試験のウサギ抗ＴＢＸＴ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０９６６５）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＢＸＴの発現は、改変細胞株（３，３３８，３２４ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）のものよりも３，３３８，３２４倍増加した（図１１０Ｃ）。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＨＯ－１－Ｎ－１細胞株を、ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴ抗原（配列番号６５、配列番号６６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＨＯ－１－Ｎ－１によるｍｏｄＰＲＡＭＥの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０１５μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＲＡＭＥ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ５－３１９０９）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＲＡＭＥの発現は、改変細胞株（２９０，４３６ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１０，８４６ＭＦＩ）のものよりも２７倍増加した（図１１０Ｂ）。ＨＯ－１－Ｎ－１によるｍｏｄＴＢＸＴの発現は、フローサイトメトリーによっても特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０６μｇ／試験のウサギ抗ＴＢＸＴ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０９６６５）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＢＸＴの発現は、改変細胞株（３，３３８，３２４ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）のものよりも３，３３８，３２４倍増加した（図１１０Ｃ）。
ＫＯＮ細胞株によるＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７ ＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７の安定的な発現
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＫＯＮ細胞株を、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７抗原（配列番号６７、配列番号６８）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。ＫＯＮによるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。ＨＰＶ１６ Ｅ６を検出するためのフォワードプライマー（ＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧ（配列番号１３６））は、導入遺伝子の３３～５４ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡ（配列番号１３７））は、導入遺伝子の１６０～１８２ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、１５０ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１６ Ｅ６の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、８，４２２倍増加した。ＨＰＶ１６ Ｅ７を検出するためのフォワードプライマー（ＣＡＣＧＧＣＧＡＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＴＧ（配列番号１３８））は、導入遺伝子の１～２１ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴ（配列番号１３９））は、導入遺伝子の２２８～２５０ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、２５０ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１６ Ｅ７の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、７，８１６倍増加した。ＨＰＶ１８ Ｅ６を検出するためのフォワードプライマー（ＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣ（配列番号１４０））は、導入遺伝子の５９～８１ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＴＡＣＡＧＧＣ（配列番号１４１））は、導入遺伝子の２８７～３１２ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、２５４ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１８ Ｅ６の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、１，２２４倍増加した。ＨＰＶ１８ Ｅ７を検出するためのフォワードプライマー（ＴＧＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＡＣＴ（配列番号１４２））は、導入遺伝子の７４～９７ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＡＡＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＡ（配列番号１４３））は、導入遺伝子の２３２～２５４ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、１８１ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１８ Ｅ７の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、１，６８４倍増加した。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。
ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＫＯＮ細胞株を、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７抗原（配列番号６７、配列番号６８）を発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。ＫＯＮによるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。ＨＰＶ１６ Ｅ６を検出するためのフォワードプライマー（ＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧ（配列番号１３６））は、導入遺伝子の３３～５４ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡ（配列番号１３７））は、導入遺伝子の１６０～１８２ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、１５０ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１６ Ｅ６の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、８，４２２倍増加した。ＨＰＶ１６ Ｅ７を検出するためのフォワードプライマー（ＣＡＣＧＧＣＧＡＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＴＧ（配列番号１３８））は、導入遺伝子の１～２１ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴ（配列番号１３９））は、導入遺伝子の２２８～２５０ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、２５０ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１６ Ｅ７の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、７，８１６倍増加した。ＨＰＶ１８ Ｅ６を検出するためのフォワードプライマー（ＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣ（配列番号１４０））は、導入遺伝子の５９～８１ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＴＡＣＡＧＧＣ（配列番号１４１））は、導入遺伝子の２８７～３１２ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、２５４ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１８ Ｅ６の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、１，２２４倍増加した。ＨＰＶ１８ Ｅ７を検出するためのフォワードプライマー（ＴＧＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＡＣＴ（配列番号１４２））は、導入遺伝子の７４～９７ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＡＡＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＡ（配列番号１４３））は、導入遺伝子の２３２～２５４ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、１８１ｂｐの産物を生成する。ＨＰＶ１８ Ｅ７の遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１１０Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、１，６８４倍増加した。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。
ＨＮワクチンＡにおけるＰＳＭＡに対する免疫応答
ＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例３２および本明細書に記載されているように、ＨＮワクチンＡとの関連で評価された。表９９に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＨＮワクチンＡ（６３７±３６９ＳＦＵと比較して、改変ＨＮワクチンＡ（１，４３３±４７９ＳＦＵ）で増加した（図１１０Ｅ）。
ＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例３２および本明細書に記載されているように、ＨＮワクチンＡとの関連で評価された。表９９に、７人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＨＮワクチンＡ（６３７±３６９ＳＦＵと比較して、改変ＨＮワクチンＡ（１，４３３±４７９ＳＦＵ）で増加した（図１１０Ｅ）。
ＨＮワクチンにおけるＰＲＡＭＥおよびＴＢＸＴに対する免疫応答－Ａ
ＰＲＡＭＥおよびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９に記載されているように、ＨＮワクチンＡとの関連で評価された（表９９）。ｍｏｄＰＲＡＭＥに対するＩＦＮγ応答は、天然抗原タンパク質ＰＲＡＭＥ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＯＩＰ４）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ｍｏｄＰＲＡＭＥ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＨＮワクチンＡ（３７５±３１４ＳＦＵ）と比較して、ＨＮワクチンＡ（６８７±３３３ＳＦＵ）によって増加した（図１１０Ｆ）。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、天然ＴＢＸＴ抗原の全長にまたがる１１アミノ酸（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ｍｏｄＴＢＸＴ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＨＮワクチンＡ（５５９±２８９ＳＦＵ）と比較して、ＨＮワクチンＡ（１，０７１±４５５ＳＦＵ）によって増加した（図１１０Ｇ）。
ＰＲＡＭＥおよびＦＯＬＲ１に対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９に記載されているように、ＨＮワクチンＡとの関連で評価された（表９９）。ｍｏｄＰＲＡＭＥに対するＩＦＮγ応答は、天然抗原タンパク質ＰＲＡＭＥ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＯＩＰ４）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ｍｏｄＰＲＡＭＥ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＨＮワクチンＡ（３７５±３１４ＳＦＵ）と比較して、ＨＮワクチンＡ（６８７±３３３ＳＦＵ）によって増加した（図１１０Ｆ）。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、天然ＴＢＸＴ抗原の全長にまたがる１１アミノ酸（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ｍｏｄＴＢＸＴ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＨＮワクチンＡ（５５９±２８９ＳＦＵ）と比較して、ＨＮワクチンＡ（１，０７１±４５５ＳＦＵ）によって増加した（図１１０Ｇ）。
ＨＮワクチンＢにおけるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７に対する免疫応答
ＫＯＮ細胞株に導入されたＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７抗原に対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＨＮワクチンＢとの関連で評価された（表９９）。これらの研究を完了するために、免疫細胞が由来する健常ドナーは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８についてスクリーニングされず、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７抗原に対する応答は、ブーストされたメモリー応答の可能性があり、ドナーがＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８陽性であった場合、デノボでプライミングされない可能性がある。
ＫＯＮ細胞株に導入されたＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７抗原に対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＨＮワクチンＢとの関連で評価された（表９９）。これらの研究を完了するために、免疫細胞が由来する健常ドナーは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８についてスクリーニングされず、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７抗原に対する応答は、ブーストされたメモリー応答の可能性があり、ドナーがＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８陽性であった場合、デノボでプライミングされない可能性がある。
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７抗原に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入したＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７に対する平均ＩＦＮγ応答は、未改変ＨＮワクチンＢ（１，８４５±８７８ＳＦＵ）と比較して、改変ＨＮワクチンＢ（１，９７４±５３７ＳＦＵ）と同様であった（図１１０Ｈ）。ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７応答は、未改変ＨＮワクチンＢと比較して、ＨＮワクチンＢでプライミングされた６人のドナーのうちの２人（ドナー２およびドナー６）で減少した（図１１０Ｉ）。ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７応答は、ＨＮワクチンＢにより、他の４人のドナーで増加した。ドナー２およびドナー６は、ＨＰＶ１６陽性であった可能性があり、継続的な刺激が（ＨＮワクチンＢによって発現されるＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７とのインビトロ共培養アッセイとの関連で）、Ｔ細胞の枯渇を誘発し、それによって、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ペプチドで刺激された際に、ＩＦＮγ産生が減少した可能性がある。ＨＮワクチンは、インビトロおよびインビボで免疫応答を誘導するメカニズムが異なるため、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８陽性の患者でＴ細胞の枯渇を誘発するはずはない。ＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７に対する平均ＩＦＮγ応答は、未改変ＨＮワクチンＢ（８２２±３４２ＳＦＵ）と比較して、改変ＨＮワクチンＢ（２，１９５±７５７ＳＦＵ）で増加した（図１１０Ｊ）。ＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７応答は、ＨＮワクチンＢでプライミングした場合、未改変ＨＮワクチンＢと比較して、ドナー６で減少したが、他の５人のドナーでは増加した（図１１０Ｋ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
１０のＨＮ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＨＮワクチンＡおよびＨＮワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。６人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表９９）を、ＨＮワクチンＡまたはＨＮワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ、ＴＢＸＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７、およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７に対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下のように供給された：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）。
１０のＨＮ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＨＮワクチンＡおよびＨＮワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。６人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表９９）を、ＨＮワクチンＡまたはＨＮワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ、ＴＢＸＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７、およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７に対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下のように供給された：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）。
図１１２は、ＨＮワクチンが、６人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、１０のＨＮ抗原に対して抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導することができることを示し、これは、未改変親対照（１１，５３７±５，２８１ＳＦＵ）と比較して、１．６倍より強力であった（１８，９０１±３，９６３ ＳＦＵ）（図１０９Ａ）（表１００）。ＨＮワクチンはまた、非ウイルス性抗原に対するＩＦＮγ応答を、未改変親対照（６，５６８±３，１１２ＳＦＵ）と比較して、１．６倍（１０，３３１±２，３４２ＳＦＵ）増加させた（図１１２Ｄ）。ＨＮワクチンＡおよびＨＮワクチンＢの単位用量は、１人のドナーで９つの抗原、および５人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した（図１１３Ａおよび１１３Ｂ、上のパネル）。ＨＮワクチンＡおよびＨＮワクチンＢの単位用量は、１人のドナーで５つの非ウイルス抗原、および５人のドナーで６つの非ウイルス抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した（図１１３Ａおよび１１３Ｂ、下のパネル）（表１０１）。ＨＮワクチンＡおよびＨＮワクチンＢは、独立して、すべての抗原に対して、親対照と比較して、それぞれ１．７倍および１．６倍の抗原特異的応答の増加を示した。
ＨＮワクチンＡおよびＨＮワクチンＢは、独立して、親対照と比較して、非ウイルス抗原特異的応答の１．５倍および１．６倍の増加をそれぞれ示した。具体的には、ＨＮワクチンＡは、すべての抗原に対して、未改変対照（５，８４８±３，２２２ＳＦＵ）と比較して、９，８４３±２，５３９ＳＦＵを誘発し（図１１２Ｂ）（表１００）、非ウイルス抗原に対して、未改変対照（３，５４７±１，９９０ＳＦＵ）と比較して、５，４４１±１，６９４ＳＦＵを誘発した（図１１２Ｅ）（表１０１）。ＨＮワクチンＡの場合、１人のドナーが７つの抗原に反応し、２人のドナーが９つの抗原に反応し、３人のドナーが１０の抗原に反応した。ＨＮワクチンＡは、１人のドナーで４つの非ウイルス抗原、２人のドナーで５つの非ウイルス抗原、および３人のドナーで６つの非ウイルス抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した。ＨＮワクチンＢは、すべての抗原に対して、未改変対照（５，６８８±２，４７２ＳＦＵ）をと比較して、９，０５８±１，７１５ＳＦＵを誘発し（図１１２Ｃ）（表１００）、非ウイルス抗原に対して、未改変対照（３，０２２±１，３３３ＳＦＵ）と比較して、４，８９０±９３２ＳＦＵを誘発した（図１１２Ｆ）（表１０１）。ＨＮワクチンＢの場合、１人のドナーが６つの抗原に応答し、１人のドナーが７つの抗原に応答し、２人のドナーが９つの抗原に応答し、２人のドナーが１０の抗原に応答した。ＨＮワクチンＡは、１人のドナーで３つの非ウイルス抗原、１人のドナーで４つの非ウイルス抗原、２人のドナーで５つの非ウイルス抗原、２人のドナーで６つの非ウイルス抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した。
治療有効量の３つのがん細胞株含む２つの組成物（６つの細胞株の単位用量）が上に記載されており、当該単位用量は、ＨＮ患者の腫瘍において発現された少なくとも９つのＴＡＡに特異的な、未改変組成物よりも１．６倍大きい免疫応答を誘発することができる。ＨＮワクチンＡは、少なくとも７つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を１．７倍増加させ、ＨＮワクチンＢは、少なくとも６つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を１．６倍増加させた。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣまたはＪＣＲＢから供給される６つのがん細胞株ＨＳＣ－４（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０６２４）、ＨＯ－１－Ｎ－１（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０８３１）、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ－１３８）、ＫＯＮ（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０１９４）、ＯＳＣ－２０（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０１９７）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む頭頸部癌の全細胞ワクチンを、表１０１Ａを示す。細胞株は、５つの頭頸部癌細胞株および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用してエレクトロポレーションによってノックアウトされるか、またはレンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡ形質導入を使用してノックダウンされる。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ｍｏｄＰＳＭＡ（ＨＳＣ－４）、ｍｏｄＰＲＡＭＥ（ＨＯ－１－Ｎ－１）、ｍｏｄＴＢＸＴ（ＨＯ－１－Ｎ－１）、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７（ＫＯＮ）、およびＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７（ＫＯＮ）の遺伝子は、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加された。
治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を低減し、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するように改変されている、６つのがん細胞株の単位用量）が本明細書に提供される。１つの組成物であるＨＮワクチンＡは、３つのＴＡＡ（ｍｏｄＰＳＭＡ、ｍｏｄＰＲＡＭＥ、およびｍｏｄＴＢＸＴ）の発現を増加させるように改変された。第２の組成物であるＨＮワクチンＢは、４つのウイルス性腫瘍関連抗原、ＨＰＶ１６ Ｅ６とＥ７、およびＨＰＶ１８ Ｅ６とＥ７を発現するように改変された。６つのがん細胞株の単位用量は、当該組成物を受けることが意図された頭頸部癌対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１４の非ウイルスＴＡＡを発現し、未改変組成物成分よりも１．６倍大きいＩＦＮγ応答を誘導する。
実施例３５：胃癌ワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＧＣＡ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＧＣＡワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変された細胞株ＭＫＮ－１、細胞株ＭＫＮ－４５、および細胞株ＭＫＮ－７４から構成されている。第２のカクテルであるＧＣＡワクチンＢは、細胞株ＯＣＵＭ－１、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８（Ｃｌａｕｄｉｎ １８）も発現するように改変された細胞株Ｆｕ９７、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＧＣＡ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＧＣＡ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＧＣＡワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変された細胞株ＭＫＮ－１、細胞株ＭＫＮ－４５、および細胞株ＭＫＮ－７４から構成されている。第２のカクテルであるＧＣＡワクチンＢは、細胞株ＯＣＵＭ－１、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８（Ｃｌａｕｄｉｎ １８）も発現するように改変された細胞株Ｆｕ９７、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＧＣＡ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２０の抗原をまとめて発現する。
ＧＣＡワクチン成分の特定
最初の細胞株選択基準により、ＧＣＡワクチンに含まれる可能性のある３６のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、本明細書に記載の追加の選択基準を適用して、３６の細胞株を７の細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＧＣＡ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＧＣＡ関連ＣＳＣ様マーカーＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２、ＡＬＤＨ１Ａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、ＦＵＴ４、ＬＧＲ５、ＣＤ４４、ＭＵＣ１、およびＤＬＬ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、細胞株が由来するがんの病期および部位、ならびに組織学的サブタイプが含まれる。
最初の細胞株選択基準により、ＧＣＡワクチンに含まれる可能性のある３６のワクチン成分の細胞株を特定した。免疫原性アッセイでさらに評価するために、本明細書に記載の追加の選択基準を適用して、３６の細胞株を７の細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＧＣＡ関連抗原の発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＧＣＡ関連ＣＳＣ様マーカーＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２、ＡＬＤＨ１Ａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、ＦＵＴ４、ＬＧＲ５、ＣＤ４４、ＭＵＣ１、およびＤＬＬ４の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、細胞株が由来するがんの病期および部位、ならびに組織学的サブタイプが含まれる。
ＣＳＣは、胃癌の転移、治療抵抗性、および再発において重要な役割を果たす（表２）。候補成分細胞株によるＴＡＡおよびＧＣＡ特異的ＣＳＣ様マーカーの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号は、ＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡ発現は、各ＴＡＡについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値が１より大きい場合、細胞株によるＴＡＡまたはＣＳＣ様マーカーの発現を陽性とみなした。選択基準により、さらなる評価のために７つの候補ＧＣＡワクチン成分が特定された：ＲＥＲＦ－ＧＣ－１Ｂ、ＭＫＮ－７４、ＭＫＮ－４５、ＯＣＵＭ－１、ＭＫＮ－１、Ｆｕ９７、およびＮＣＩ－Ｎ８７。７つの候補成分細胞株は、１０～１４のＴＡＡ（図１１４Ａ）および２～６つのＣＳＣマーカー（図１１４Ｂ）を発現した。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様細胞株ＤＭＳ５３は、６つのワクチン細胞株の１つとして含まれ、１４のＧＣＡのＴＡＡおよび７つのＧＣＡのＣＳＣ様マーカーを発現した。
７つの未改変ＧＣＡワクチン成分候補の免疫原性は、３人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）を使用して、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊０８：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０１；ドナー２、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊０８：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊５７：０３；ならびにドナー３、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊４０：０１およびＡ＊３０：０１ Ｂ＊５７：０１。ＭＫＮ－１（５，４１７±１５２ＳＦＵ）およびＯＣＵＭ－１（１，１２３±２５８ＳＦＵ）は、ＲＥＲＦ－ＧＣ－１Ｂ（１２０±５６ＳＦＵ）、ＭＫＮ－７４（２４１±１０７ＳＦＵ）、ＭＫＮ－４５（０±０ＳＦＵ）、Ｆｕ９７（５７８±２０９ＳＦＵ）、およびＮＣＩ－Ｎ８７（０±０ＳＦＵ）よりも免疫原性が高かった（図１１５Ａ）。
ＭＫＮ－１およびＯＣＵＭ－１の免疫原性は、３つの成分細胞株の８つの異なる組み合わせで評価され、４つの組み合わせに、ＭＫＮ－１が含まれ、４つの組み合わせに、ＯＣＵＭ－１が含まれた（図１１５Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、３人の健常ドナー（ｎ＝４／ドナー）を使用して、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、８つの潜在的なワクチンカクテル内の３つの成分細胞株に対して決定された。ドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０２：０６ Ｂ＊１５：０１およびＡ＊３４：０２ Ｂ＊５１：０１；ドナー２、Ａ＊０３：０１ Ｂ＊０７：０２およびＡ＊２４：０２ Ｂ＊１５：０９；ならびにドナー３、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊４０：０１およびＡ＊３０：０１ Ｂ＊５７：０１。ＩＦＮγ応答は、８つのカクテルすべてについて、および各カクテルの各細胞株成分に対して検出された。個々のカクテル成分細胞株に対する応答は、単一細胞株成分で検出されたＩＦＮγ応答と比較して、ほとんどの細胞株で顕著に増加した（図１１５Ｂ）。評価された８つの組み合わせすべてにおいて、ＭＫＮ－１は依然として最も免疫原性が高かった。上記および本明細書でさらに記載されるように、ＭＫＮ－１は、ワクチンカクテルＡに含まれるように選択され、ＯＣＵＭ－１は、ワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、多様なＴＡＡを発現するように選択され、ＬＹ６ＫまたはＭＵＣ１などのＧＣＡ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ、ならびにＧＣＡおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含も含まれる。本明細書に示されるように、一連のＴＡＡをさらに増強するために、ＭＫＮ－１は、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋを発現するように改変され、Ｆｕ９７は、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変された。ＰＳＭＡ、ＣＬＤＮ１８、およびＷＴ１は、６つの成分細胞株のうちの１つによって内因的に発現され、ＬＹ６Ｋは、６つの成分細胞株のうちの２つで、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現された（図１１６Ａ）。
ＭＫＮ－１による形質導入された抗原ｍｏｄＰＳＭＡ（図１１７Ａ）およびｍｏｄＬＹ６Ｋ（図１１７Ｂ）（配列番号５７；配列番号５８）の発現、ならびにＦｕ９７による形質導入された抗原ｍｏｄＷＴ１（図１１４Ｃ）およびｍｏｄＣＬＤＮ１８（図１１４Ｄ）（配列番号５５；配列番号５６）の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、フローサイトメトリーによって検出された。ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋ抗原は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されている。ｍｏｄＷＴ１とｍｏｄＣＬＤＮ１８は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位によって分離されている。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
図１１６Ａに、本ワクチンにおける２０の代表的なＧＣＡのＴＡＡの内因性ｍＲＮＡ発現を示す。本ワクチンは、上記の抗原の導入後、ＧＣＡ抗腫瘍応答を誘導することができる、一般に標的化され、臨床的に関連する可能性のある、特定された２０のＴＡＡをすべて発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＧＣＡ腫瘍で豊富であることが知られており、また、いくつかは、ＧＣＡおよび他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘導することもできる。２０の優先順位付けされたＧＣＡのＴＡＡのＲＮＡ存在量は、実施例２９に記載されているように、利用可能なｍＲＮＡデータ発現を用いて、３７１のＧＣＡ患者試料で決定された（図１１６Ｂ）。優先順位付けされたＧＣＡのＴＡＡのうち、１１のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１２のＴＡＡが９９．５％の試料で発現され、１３のＴＡＡが９８．９％の試料で発現され、１４のＴＡＡが９４．９％の試料で発現され、１５のＴＡＡが８３．０％の試料で発現され、１６のＴＡＡが６７．１％の試料で発現され、１７のＴＡＡが４３．４％の試料で発現され、１８のＴＡＡが２４．５％の試料で発現され、１９のＴＡＡが８．６％の試料で発現され、２０のＴＡＡが０．３％の試料で発現された（図１１６Ｃ）。治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物が本明細書に提供され、細胞株の組み合わせ（６つの細胞株の単位用量）は、当該組成物を受けることが意図されたＧＣＡがん対象のサブセットと関連する少なくとも１１のＴＡＡを発現する細胞を含む。本明細書に提示される発現および免疫原性データに基づいて、表１０２で特定される細胞株が、本ＧＣＡワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現の減少
ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、ＦＵ９７、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表１０３に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いるＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、８３．３％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、ＦＵ９７、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表１０３に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いるＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、８３．３％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイ
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２６に記載されているように決定した。ＧＣＡワクチンＡ中のＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＭＫＮ－１は、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＧＣＡワクチンＢのＦｕ９７およびＤＭＳ５３成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＤＭＳ５３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＯＣＵＭ－１は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２６に記載されているように決定した。ＧＣＡワクチンＡ中のＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＭＫＮ－１は、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＧＣＡワクチンＢのＦｕ９７およびＤＭＳ５３成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１を分泌した。ＤＭＳ５３は、測定可能なレベルのＴＧＦβ２も分泌した。ＯＣＵＭ－１は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＭＫＮ－１成分細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、その導入遺伝子と同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。ＭＫＮ－１を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子でも形質導入して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、およびＦｕ９７細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。これらの細胞は、ＴＧＦβ２の分泌ではなく、ＴＧＦβ１の分泌を減少させるように改変されており、クローン名ＤＫ２で表される。ＤＭＳ５３を、実施例２６に記載されているように、ｓｈＲＮＡで改変して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させた。ＴＧＦβ１ではなくＴＧＦβ２の分泌を減少させるためのＤＭＳ５３細胞の改変は、クローン名ＤＫ４で表される。ＯＣＵＭ－１は、親株が検出レベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかったため、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されなかった。
表１０４は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率を示す。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が、少なくとも７２％減少した。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が、少なくとも５１％減少した。
表１０５に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＧＣＡワクチンＡおよびＧＣＡワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＧＣＡワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、８９％減少し、ＴＧＦβ２は、９８％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＧＣＡワクチンＢによるＴＧＦβ１の分泌は、５４％減少し、ＴＧＦβ２は、４９％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
ＭＫＮ－１細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、上記のようにＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、およびＦｕ９７細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表１０６に示され、以下に記載される。
ＭＫＮ－１細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、上記のようにＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子で形質導入した。ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、およびＦｕ９７細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表１０６に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも３，９４１倍増加した。ＧＣＡワクチンＡ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＭＫＮ－１で、親細胞株（≦０．００２８ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４６，４１９倍増加し、ＭＫＮ－４５で、親細胞株（≦０．００５１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）比較して、３，９４１倍増加し、ＭＫＮ－７４で、親細胞株（≦０．００２７ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２４２，１５５倍増加した。ＧＣＡワクチンＢ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＯＣＵＭ－１で、親細胞株（≦０．００４３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、７，８６６倍増加し、Ｆｕ９７で、親細胞株（≦０．００４６ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１９３，２４８倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（≦０．００３２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４９，３１３倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＧＣＡワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、４０７ｎｇ／用量／２４時間であった。ＧＣＡワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、５４３ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり９５０ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＧＣＡ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１１８に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＧＣＡワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＧＣＡ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１１８に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＧＣＡワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも３７４倍増加した。ＧＣＡワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＭＫＮ－１（１５，９４１ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、１５，９４１倍増加し、ＭＫＮ－４５（３，３９７ＭＦＩ）で、親細胞株（９ＭＦＩ）と比較して、３７４倍増加し、ＭＫＮ－７４（４，９１４ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、４，９１４倍増加した。ＧＣＡワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＯＣＵＭ－１（３，７４１ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、３，７４１倍増加し、ＦＵ９７（２６，４４９ＭＦＩ）で、親細胞株（１７ＭＦＩ）と比較して、１，５６９倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１倍増加した。
ＩＬ－１２の発現
ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、およびＦｕ９７成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表１０７に示され、以下に記載される。
ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、およびＦｕ９７成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表１０７に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも１，７１５倍増加した。ＧＣＡワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、ＭＫＮ－１で、親細胞株（≦０．００１１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、５３，１８５倍増加し、ＭＫＮ－４５で、親細胞株（≦０．００２１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１，７１５倍増加し、ＭＫＮ－７４で、親細胞株（≦０．００１１ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、５６，７４３倍増加した。ＧＣＡワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＦＵ９７で、親細胞株（≦０．００３７ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１３，０７８倍増加した。ＯＣＵＭ－１およびＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
各成分細胞株の５×１０5個の用量に基づいて、ＧＣＡワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、６３ｎｇ／用量／２４時間であった。ＧＣＡワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、２４ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり８７ｎｇであった。
ＭＫＮ－１細胞株によるｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＭＫＮ－１細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋ抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＣＣＬＥから供給されたＲＮＡ発現データは、ＭＫＮ－１がＬＹＫ６を内因的に発現したが（図１１６Ａ）、未改変ＭＫＮ－１細胞では、ＬＹＫ６タンパク質がフローサイトメトリーによって検出されなかった（図１１７Ｂ）ことを示唆した。ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋ抗原をコードする遺伝子（配列番号５７、配列番号５８）は、フーリン切断部位によって連結されている。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＭＫＮ－１細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋ抗原を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＣＣＬＥから供給されたＲＮＡ発現データは、ＭＫＮ－１がＬＹＫ６を内因的に発現したが（図１１６Ａ）、未改変ＭＫＮ－１細胞では、ＬＹＫ６タンパク質がフローサイトメトリーによって検出されなかった（図１１７Ｂ）ことを示唆した。ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋ抗原をコードする遺伝子（配列番号５７、配列番号５８）は、フーリン切断部位によって連結されている。
ＭＫＮ－１によるｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２６８０６１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（６９７，７４４ＭＦＩ）で、親細胞株（４６，９５５ＭＦＩ）のものよりも１５倍増加した（図１１７Ａ）。ＭＫＮ－１によるｍｏｄＬＹ６Ｋの発現は、フローサイトメトリーによっても特徴付けられた。細胞を、最初に、ウサギＩｇＧ抗ＬＹ６Ｋ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２４６４８６）（０．０３μｇ／試験）、続いて、ＡＦ６４７標識ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）（０．１２５μｇ／試験）で細胞内染色した。ｍｏｄＬＹ６Ｋの発現は、改変細胞株（２，８９０，３１５ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）よりも２，８９０，３１５倍増加した（図１１７Ｂ）。
Ｆｕ９７細胞株によるｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８の安定的な発現
ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＦｕ９７細胞株を、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８抗原（配列番号５５、配列番号５６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。Ｆｕ９７によるｍｏｄＷＴ１の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９９０１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＷＴ１の発現は、改変細胞株（７，４１８，３６５ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１２９，６１１ＭＦＩ）のものよりも５７倍増加した（図１１７Ｃ）。Ｆｕ９７によるｍｏｄＣＬＤＮ１８の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＣＬＤＮ１８抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０３５６３）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＣＬＤＮ１８の発現は、改変細胞株（３，１６８，５６３ＭＦＩ）で、未改変細胞株（５５８，２１１ＭＦＩ）のものよりも５．７倍増加した（図１１７Ｄ）。
ＴＧＦβ１の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＦｕ９７細胞株を、ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８抗原（配列番号５５、配列番号５６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。Ｆｕ９７によるｍｏｄＷＴ１の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＷＴ１抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９９０１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＷＴ１の発現は、改変細胞株（７，４１８，３６５ＭＦＩ）で、未改変細胞株（１２９，６１１ＭＦＩ）のものよりも５７倍増加した（図１１７Ｃ）。Ｆｕ９７によるｍｏｄＣＬＤＮ１８の発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＣＬＤＮ１８抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０３５６３）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＣＬＤＮ１８の発現は、改変細胞株（３，１６８，５６３ＭＦＩ）で、未改変細胞株（５５８，２１１ＭＦＩ）のものよりも５．７倍増加した（図１１７Ｄ）。
ＧＣＡワクチンＡにおけるＰＳＭＡおよびＬＹ６Ｋに対する免疫応答
ＰＳＭＡおよびＬＹ６Ｋに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＧＣＡワクチンＡとの関連で評価された。表１０８に、６人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。
ＰＳＭＡおよびＬＹ６Ｋに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＧＣＡワクチンＡとの関連で評価された。表１０８に、６人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、実施例２９に記載されているように、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。
ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＧＣＡワクチンＡ（１３７±８２ＳＦＵと比較して、改変ＧＣＡワクチンＡ（２，４１３±８２９ＳＦＵ）で増加した（図１１７Ｅ）。ＬＹ６Ｋに対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然ＬＹ６Ｋ抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＬＹ６Ｋに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＧＣＡワクチンＡ（６３±３０ＳＦＵ）と比較して、改変ＧＣＡワクチンＡ（１，５９８±６３９ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．００２、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝６）（図１１７Ｆ）。
ＧＣＡワクチンＢにおけるＷＴ１およびＣＬＤＮ１８に対する免疫応答
ＷＴ１およびＣＬＤＮ１８に対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＧＣＡワクチンＢとの関連で評価された（表１０８）。ＷＴ１およびＣＬＤＮ１８に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＣＡワクチンＢ（３７±２２ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、ＧＣＡワクチンＢ（６８６±３３０ＳＦＵ）で増加した（図１１７Ｇ）。ＣＬＤＮ１８特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＣＡワクチンＢ（１１３±６５ＳＦＵ）と比較して、ＧＣＡワクチンＢ（１，６８２±７７３ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０２６、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝６）（図１１７Ｈ）。
ＷＴ１およびＣＬＤＮ１８に対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＧＣＡワクチンＢとの関連で評価された（表１０８）。ＷＴ１およびＣＬＤＮ１８に対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＷＴ１特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＣＡワクチンＢ（３７±２２ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、ＧＣＡワクチンＢ（６８６±３３０ＳＦＵ）で増加した（図１１７Ｇ）。ＣＬＤＮ１８特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＧＣＡワクチンＢ（１１３±６５ＳＦＵ）と比較して、ＧＣＡワクチンＢ（１，６８２±７７３ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０２６、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝６）（図１１７Ｈ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
１０のＧＣＡ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＧＣＡワクチンＡおよびＧＣＡワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表１０８）は、ＧＣＡワクチンＡまたはＧＣＡワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、ＬＹ６Ｋ、ＷＴ１、およびＣＬＤＮ１８に対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下のように供給された：ＭＳＬＮ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカスタムペプチドライブラリー）、ＭＡＧＥＡ３（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ３）、ＣＥＡ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＣＥＡ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、およびＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）。
１０のＧＣＡ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＧＣＡワクチンＡおよびＧＣＡワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。７人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表１０８）は、ＧＣＡワクチンＡまたはＧＣＡワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、ＬＹ６Ｋ、ＷＴ１、およびＣＬＤＮ１８に対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下のように供給された：ＭＳＬＮ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカスタムペプチドライブラリー）、ＭＡＧＥＡ３（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＡＧＥＡ３）、ＣＥＡ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＣＥＡ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、およびＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）。
図１１９は、ＧＣＡワクチンが、６人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、１０のＧＣＡ抗原に対して抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導することができることを示し、これは、未改変親対照（１，８７９±４６３ＳＦＵ）と比較して、１７．５倍より強力であった（３２，８９８±１３，６１７ ＳＦＵ）（ｐ＝０．００９、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝６）（図１１９Ａ）（表１０９）。ＧＣＡワクチンＡおよびＧＣＡワクチンＢの単位用量は、２人のドナーで８つの抗原、１人のドナーで９つの抗原、４人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した（図１２０）。ＧＣＡワクチンＡおよびＧＣＡワクチンＢは、親対照と比較して、それぞれ１７．４倍および１７．７倍の抗原特異的応答の増加を示した。具体的には、ＧＣＡワクチンＡは、未改変対照（１，０５５±５１８ＳＦＵ）と比較して、１８，３３２±６，８２３ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．００４、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図１１９Ｂ）。ＧＣＡワクチンＡの場合、１人のドナーが５つの抗原に反応し、２人のドナーが９つの抗原に反応し、３人のドナーが１０の抗原に反応した。ＧＣＡワクチンＢは、親対照（８２３±２８７ＳＦＵ）と比較して、１４，５６６±７，４９９ＳＦＵを誘発した（ｐ＝０．０１５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図１１９Ｃ）。ＧＣＡワクチンＢの場合、１人のドナーが５つの抗原に反応し、２人のドナーが９つの抗原に反応し、３人のドナーが１０の抗原に反応した。治療有効量の３つのがん細胞株含む２つの組成物（６つの細胞株の単位用量）が上に記載されており、当該単位用量は、ＧＣＡ患者の腫瘍において発現された少なくとも８つのＴＡＡに特異的な、未改変組成物よりも１７．５倍大きい免疫応答を誘発することができる。ＧＣＡワクチンＡは、少なくとも５つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を１７．４増加させ、ＧＣＡワクチンＢは、少なくとも５つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を１７．７増加させた。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣまたはＪＣＲＢから供給される６つのがん細胞株ＭＫＮ－１（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０２５２）、ＭＫＮ－４５（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０２５４）、ＭＫＮ－７４（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０２５５）、ＯＣＵＭ－１（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ０１９２）、Ｆｕ９７（ＪＣＲＢ，ＪＣＲＢ１０７４）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む胃癌の全細胞ワクチンを、表１１０に示す。細胞株は、５つの胃癌細胞株および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用してエレクトロポレーションによってノックアウトされるか、またはレンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡ形質導入を使用してノックダウンされる。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ｍｏｄＰＳＭＡ（ＭＫＮ－１）、ｍｏｄＬＹ６Ｋ（ＭＫＮ－１）、ｍｏｄＷＴ１（Ｆｕ９７）、ｍｏｄＣＬＤＮ１８（Ｆｕ９７）の遺伝子が、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加されている。
治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を低減し、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するように改変されている、６つのがん細胞株の単位用量）が本明細書に提供される。１つの組成物であるＧＣＡワクチンＡは、２つのＴＡＡ（ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹ６Ｋ）の発現を増加させるように改変された。第２の組成物であるＧＣＡワクチンＢは、２つのＴＡＡ（ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８）を発現するように改変された。６つのがん細胞株の単位用量は、当該組成物を受けることが意図された胃癌対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１１のＴＡＡを発現し、未改変組成物成分よりも１７．５倍大きいＩＦＮγ応答を誘導する。
実施例３６：乳癌（ＢＲＣＡ）ワクチンの調製
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＢＲＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＢＲＣワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＣＡＭＡ－１、ｍｏｄＴＥＲＴも発現するように改変された細胞株ＡＵ５６５、および細胞株ＨＳ－５７８Ｔから構成されている。第２のカクテルであるＢＲＣワクチンＢは、細胞株ＭＣＦ－７、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳも発現するように改変された細胞株Ｔ４７Ｄ、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＢＲＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２２の抗原をまとめて発現する。
この実施例は、２つのカクテルのワクチン組成物におけるＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の同時過剰発現を伴うＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現の減少を示す。各カクテルは３つの細胞株から構成され（合計６つの細胞株）、ＨＬＡ多様集団において、少なくとも１０のＢＲＣ関連抗原に対する細胞性免疫応答の大きさを大幅に増加させた。本明細書に記載されるように、第１のカクテルであるＢＲＣワクチンＡは、ｍｏｄＰＳＭＡも発現するように改変された細胞株ＣＡＭＡ－１、ｍｏｄＴＥＲＴも発現するように改変された細胞株ＡＵ５６５、および細胞株ＨＳ－５７８Ｔから構成されている。第２のカクテルであるＢＲＣワクチンＢは、細胞株ＭＣＦ－７、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳも発現するように改変された細胞株Ｔ４７Ｄ、ならびに細胞株ＤＭＳ５３から構成されている。６つの成分細胞株は、抗ＢＲＣ腫瘍応答を提供することができる少なくとも２２の抗原をまとめて発現する。
ＢＲＣワクチン成分の特定
最初の細胞株選択基準により、ＢＲＣワクチンに含まれる可能性のある２９のワクチン成分の細胞株が特定された。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、２９の細胞株を７つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＢＲＣ関連抗原の発現、トリプルネガティブ乳癌で豊富な抗原の内因性発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＢＲＣ関連ＣＳＣ様マーカーＡＢＣＧ２、ＡＬＤＨ１Ａ、ＢＭＩ１、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＩＴＧＡ６、ＣＤ９０、ｃ－ｍｙｃ、ＣＸＣＲ１ＣＸＣＲ４、ＥＰＣＡＭ、ＫＬＦ４、ＭＵＣ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬ４、ＳＯＸ２の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、乳癌の部位および病期、分子サブタイプおよび組織学的サブタイプが含まれた。
最初の細胞株選択基準により、ＢＲＣワクチンに含まれる可能性のある２９のワクチン成分の細胞株が特定された。免疫原性アッセイでさらに評価するために、追加の選択基準を適用して、２９の細胞株を７つの細胞株に絞り込んだ。これらの基準には、内因性ＢＲＣ関連抗原の発現、トリプルネガティブ乳癌で豊富な抗原の内因性発現、追加の免疫抑制因子（例えば、ＩＬ－１０またはＩＤＯ１）の発現の欠如、ＢＲＣ関連ＣＳＣ様マーカーＡＢＣＧ２、ＡＬＤＨ１Ａ、ＢＭＩ１、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＩＴＧＡ６、ＣＤ９０、ｃ－ｍｙｃ、ＣＸＣＲ１ＣＸＣＲ４、ＥＰＣＡＭ、ＫＬＦ４、ＭＵＣ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬ４、ＳＯＸ２の発現、細胞株が由来する患者の民族性および年齢、乳癌の部位および病期、分子サブタイプおよび組織学的サブタイプが含まれた。
ＣＳＣは、乳癌の転移、治療抵抗性、および再発において重要な役割を果たす（表２）。候補成分細胞株によるＴＡＡおよびＢＲＣ特異的ＣＳＣ様マーカーの発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）から供給されたＲＮＡ発現データによって決定された。ＨＧＮＣ遺伝子記号は、ＣＣＬＥ検索に含まれ、ｍＲＮＡ発現は、各ＴＡＡについてダウンロードされた。ＲＮＡ－ｓｅｑ値が１より大きい場合、細胞株によるＴＡＡまたはＣＳＣマーカーの発現を陽性とみなした。選択基準により、さらなる評価のために７つの候補ＢＲＣワクチン成分が特定された：ＢＴ２０、ＨＳ－５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＺＲ７５１、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１、およびＴ４７Ｄ。７つの候補成分細胞株は、７～１１のＴＡＡ（図１２１Ａ）および６～９つのＣＳＣマーカー（図１２１Ｂ）を発現した。本明細書に記載されるように、ＣＳＣ様細胞株ＤＭＳ５３は、６つのワクチン細胞株のうちの１つとして含まれ、１５のＢＲＣのＴＡＡおよび３つのＢＲＣのＣＳＣ様マーカーを発現した。
７つの未改変ＢＲＣワクチン成分候補の免疫原性は、３人のＨＬＡ多様健常ドナー（ドナー当たりｎ＝４）を使用して、実施例９に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ドナー１のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊０２：０１ Ｂ＊５７：０３およびＡ＊０１：０１ Ｂ＊０８：０１であった。ドナー２のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、Ａ＊３０：０１ Ｂ＊５７：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊４０：０１であった。ドナー３のＨＬＡ－Ａアレルは、Ａ＊０１：０１とＡ＊０２：０１であった。ドナー３では、ＨＬＡ－Ｂタイピングが利用できなかった。Ｔ４７Ｄの免疫原性は、５人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、別々に評価された（表１１７、ドナー２～６）。ＭＣＦ－７（２，３１４±４４８ＳＦＵ）およびＣＡＭＡ－１（９９０±２２３ＳＦＵ）は、ＡＵ５６５（２７４±８７ＳＦＵ）、ＺＲ７５１（２９２±１３３ＳＦＵ）、ＢＴ２０（５２４±１９２ＳＦＵ）、ＨＳ－５７８Ｔ（２８１±８１ＳＦＵ）（図１２２Ａ）、およびＴ４７Ｄ（４９１±２０２ＳＦＵ）よりも免疫原性が高かった（図１２２Ｃ）。
ＭＣＦ－７およびＣＡＭＡ－１の免疫原性は、３つの成分細胞株の８つの異なる組み合わせで評価され、４つの組み合わせに、ＭＣＦ－７が含まれ、４つの組み合わせに、ＣＡＭＡ－１が含まれた（図１２２Ｄ）。ＩＦＮγ応答は、３人の健常ドナー（ｎ＝４／ドナー）を使用して、実施例８に記載されているように、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって、８つの潜在的なワクチンカクテル内の３つの成分細胞株に対して決定された。ドナーのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレルは、以下のとおりであった：ドナー１、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊０８：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１５：０１；ドナー２、Ａ＊０３：０１ Ｂ＊１５：０１およびＡ＊２４：０２ Ｂ＊０７：０２；ドナー３、Ａ＊０１：０１ Ｂ＊３０：０１およびＡ＊０２：０１ Ｂ＊１２：０２。Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ－７、およびＤＭＳ５３ Ｔ４７Ｄを含む３つの成分細胞株の１つの追加のカクテルの組み合わせも、同じ５人のＨＬＡ多様ドナー（表１１７、ドナー２～６）で評価された（図１２２Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、９つのカクテルすべてについて、および各カクテルの各細胞株成分に対して検出された。
評価された８つの組み合わせすべてにおいて、ＭＣＦ－７およびＣＡＭＡ－１は、依然として最も免疫原性が高かった。個々のカクテル成分細胞株に対する応答は、ＣＡＭＡ－１とＺＲ７５１を除いて同様であった。ＣＡＭＡ－１に対するＩＦＮγ応答は、３成分細胞株の組み合わせでわずかに減少した。ＺＲ７５１に対するＩＦＮγ応答も３つの細胞株成分カクテルでわずかに減少したため、ＺＲ７５１は、ＢＲＣワクチンに含めなかった（図１２２Ｂ－Ｃ）。トリプルネガティブ乳癌は、乳癌の約１５％を構成する。このような理由で、組成物のワクチンに、１つのトリプルネガティブ乳癌細胞株を含めた（ＢＲＣワクチンの単位用量の１７％）。トリプルネガティブ乳癌細胞株ＢＴ２０およびＨＳ－５７８Ｔの免疫原性は、３つの細胞株成分カクテルで評価した場合と同様であった。これらの２つの細胞株のうち、ＨＳ－５７８Ｔは、ＢＴ２０（９つのＴＡＡが＞１．０ＦＰＫＭ）よりも多くのＴＡＡ（１１のＴＡＡが＞１．０ＦＰＫＭ）を内因的に発現し（図１２１Ａ）、ＢＲＣワクチンに含めるために選択された。上記および本明細書でさらに記載されるように、ＣＡＭＡ－１は、ワクチンカクテルＡに含まれるように選択され、ＭＣＦ－７は、ワクチンカクテルＢに含まれるように選択された。
本明細書に記載のワクチン中の細胞は、多様なＴＡＡを発現するように選択され、ＢＲＣ抗腫瘍応答に特に重要であることが知られているＴＡＡ（例えば、ＴＢＸＴおよびＮＹ－ＥＳＯ－１）、トリプルネガティブ乳癌で豊富なＴＡＡ（例えば、マンマグロビンＡ（ＳＣＧＢ２Ａ２）およびＭＵＣ１）、ならびにＢＲＣおよび他の固形腫瘍（例えば、ＴＥＲＴ）の標的に重要であることが知られているＴＡＡも含まれる。本明細書に示されるように、一連のＴＡＡをさらに増強するために、ＣＡＭＡ－１は、ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、ＡＵ５６５は、ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、Ｔ４７Ｄもまた、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変された。
ＴＢＸＴおよびＢＯＲＩＳは、６つの成分細胞株のいずれにおいても、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現されなかった。ＴＥＲＴおよびＰＳＭＡは、６つの成分細胞株のうちの１つで、＞１．０ＦＰＫＭで内因的に発現された（図１２３Ａ）。
ＣＡＭＡ－１による形質導入された抗原ｍｏｄＰＳＭＡ（図１２４Ａ）（配列番号３７；配列番号３８）の発現、ＡＵ５６５による形質導入された抗原ｍｏｄＴＥＲＴ（図１２４Ｂ）（配列番号３５；配列番号３６）の発現、ならびにＴ４７Ｄによる形質導入された抗原ｍｏｄＴＢＸＴ（図１２４Ｃ）およびｍｏｄＢＯＲＩＳ（図１２４Ｄ）（配列番号４１；配列番号４２）の発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、フローサイトメトリーまたはＲＴ－ＰＣＲによって検出された。ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳ抗原は、同じレンチウイルス導入ベクターにコードされ、フーリン切断部位（配列番号４１および配列番号４２）によって分離されている。
各細胞株を含む抗原およびクローン亜集団の不均一性を最大限に維持する必要があるため、本ワクチンで利用される遺伝子改変細胞株は、限界希釈サブクローニングを介してではなく、抗生物質選択およびフローサイトメトリーを使用して樹立された。
図１２３Ａに、本ワクチンにおける２２の代表的なＢＲＣのＴＡＡの内因性ｍＲＮＡ発現を示す。本ワクチンは、上記の抗原の導入後、ＢＲＣ抗腫瘍応答を誘導することができる、一般に標的化され、臨床的に関連する可能性のある、特定された２２のＴＡＡをすべて発現する。これらのＴＡＡのいくつかは、主にＢＲＣ腫瘍で豊富であることが知られており、また、いくつかは、ＢＲＣおよび他の固形腫瘍に対する免疫応答を誘導することもできる。２２の優先順位付けされたＢＲＣのＴＡＡのＲＮＡ存在量は、実施例２９に記載されているように、利用可能なｍＲＮＡデータ発現を用いて、１０８２のＢＲＣ患者試料で決定された（図１２３Ｂ）。優先順位付けされたＢＲＣのＴＡＡのうち、１５のＴＡＡが１００％の試料で発現され、１６のＴＡＡが試料の９９．９％で発現され、１７のＴＡＡが９９．３％の試料で発現され、１８のＴＡＡが９５．１％の試料で発現され、１９のＴＡＡが７９．９％の試料で発現され、２０のＴＡＡが４７．６％の試料で発現され、２１のＴＡＡが１７．１％の試料で発現され、２２のＴＡＡが３．４％の試料で発現された（図１２３Ｃ）。治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物が本明細書に提供され、細胞株の組み合わせ（６つの細胞株の単位用量）は、当該組成物を受けることが意図されたＢＲＣがん対象のサブセットと関連する少なくとも１５のＴＡＡを発現する細胞を含む。本明細書に提示される発現および免疫原性データに基づいて、表１１１で特定される細胞株が、本ＢＲＣワクチンを構成するように選択された。
ＣＤ２７６の発現の減少
ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表１１２に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９５．２％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３成分細胞株は、ＣＤ２７６を発現し、その発現を、実施例１３および本明細書の他箇所に記載されているように、ＺＦＮを用いて、エレクトロポレーションによってノックアウトした。可能な限り多くの腫瘍の不均一性を維持することが望ましいため、エレクトロポレーションしたｓｈＲＮＡ改変細胞を限界希釈によってクローン化しなかった。代わりに、実施例１３に記載されているように、細胞を、ＦＡＣＳによる複数ラウンドの細胞選別にかけた。ＣＤ２７６の発現は、実施例２９に記載されているように決定した。表１１２に、ＣＤ２７６の発現の減少を示す。これらのデータは、ＺＦＮを用いたＣＤ２７６の遺伝子編集により、６つのワクチン成分細胞株すべてにおいて、９５．２％を超えるＣＤ２７６陰性細胞が得られたことを示す。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイ
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２のサイトカイン分泌アッセイは、実施例２９に記載されているように完了した。
ｓｈＲＮＡはＴＧＦ－βの分泌を下方制御する
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＢＲＣワクチンＡ中のＡＵ５６５およびＨＳ－５７８Ｔ親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＣＡＭＡ－１は、検出可能なレベルのＴＧＦβ２を分泌したが、ＴＧＦβ１は分泌しなかった。ＢＲＣワクチンＢのＭＣＦ－７成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。Ｔ４７Ｄは、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかったため、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
ＣＤ２７６のノックアウトに続いて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌レベルを、ｓｈＲＮＡを使用して減少させ、得られたレベルを、実施例２９に記載されているように決定した。ＢＲＣワクチンＡ中のＡＵ５６５およびＨＳ－５７８Ｔ親細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。ＣＡＭＡ－１は、検出可能なレベルのＴＧＦβ２を分泌したが、ＴＧＦβ１は分泌しなかった。ＢＲＣワクチンＢのＭＣＦ－７成分細胞株は、測定可能なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を分泌した。Ｔ４７Ｄは、測定可能なレベルのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２を分泌しなかったため、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されなかった。ＤＭＳ５３細胞株によるＴＧＦβ２の分泌の減少は、実施例２６に記載されており、得られたレベルは、上記および本明細書に記載されているように決定された。
成分ＨＳ－５７８ＴおよびＭＣＦ－７細胞株を、ＴＧＦβ１のｓｈＲＮＡで形質導入して、ＴＧＦβ１分泌を減少させ、その導入遺伝子と同時に、実施例２９に記載されているように、膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させた。ＨＳ－５７８ＴおよびＭＣＦ－７はまた、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子で形質導入され、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。これらの細胞は、クローン名ＤＫ６で表される。ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１、およびＡＵ５６５細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子で形質導入して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、同時に、実施例２９に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）の発現を増加させた。ＤＭＳ５３を、実施例２６に記載されているように、ｓｈＲＮＡで改変して、ＴＧＦβ２の分泌を減少させた。ＴＧＦβ１ではなくＴＧＦβ２の分泌を減少させるように改変されている細胞株は、クローン名ＤＫ４で表される。
表１１３は、未改変親細胞株と比較した、遺伝子改変成分細胞株におけるＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ２の分泌の減少率を示す。ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２の分泌が、ＥＬＩＳＡアッセイで実行された１６回の反復のうちの１回でのみ検出された場合、その値は、平均の標準誤差なしで報告される。遺伝子改変により、ＴＧＦβ１の分泌が、少なくとも４４％減少した。ＴＧＦβ２の遺伝子改変により、ＴＧＦβ２の分泌が、少なくとも５１％減少した。
表１１４に、５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、改変ＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢ、ならびにそれぞれの未改変親細胞株によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の総分泌量を示す。ＢＲＣワクチンＡによるＴＧＦβ１の分泌は、４９％減少し、ＴＧＦβ２は、８７％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。ＢＲＣワクチンＢによるＴＧＦβ１の分泌は、６７％減少し、ＴＧＦβ２は、７１％ ｐｇ／用量／２４時間減少した。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌
ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１、およびＡＵ５６５細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子を上記のように形質導入した。Ｔ４７Ｄ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表１１５に示され、以下に記載される。
ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１、およびＡＵ５６５細胞株を、ＴＧＦβ２のｓｈＲＮＡと、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号６）を発現する遺伝子の両方を含むレンチウイルス粒子を上記のように形質導入した。Ｔ４７Ｄ細胞株を、レンチウイルス粒子で形質導入して、ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号７）のみを発現させた。ＤＭＳ５３は、実施例２６および本明細書の他箇所に記載されているように、ＧＭ－ＣＳＦを分泌するように改変された。その結果が表１１５に示され、以下に記載される。
ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、未改変親細胞株と比較して、すべての改変成分細胞株で少なくとも１５，７１４倍増加した。ＢＲＣワクチンＡ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＣＡＭＡ－１で、親細胞株（≦０．００３９ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３６，９９０倍増加し、ＡＵ５６５で、親細胞株（≦０．００４２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１５，７１４倍増加し、ＨＳ－５７８Ｔで、親細胞株（≦０．００６４ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２１，０６１倍増加した。ＢＲＣワクチンＢ成分細胞株では、ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、ＭＣＦ－７で、親細胞株（≦０．０１１８ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、２５，５２８倍増加し、Ｔ４７Ｄで、親細胞株（≦０．００６３ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３３，９２０倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（≦０．００３２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４９，３１３倍増加した。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＢＲＣワクチンＡの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、１７４ｎｇ／用量／２４時間であった。ＢＲＣワクチンＢの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、３３６ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＧＭ－ＣＳＦ分泌量は、２４時間当たり５１０ｎｇであった。
膜結合ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＢＲＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１２５に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＢＲＣワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
成分細胞株を、上記のように、膜結合ＣＤ４０Ｌベクターを発現するレンチウイルス粒子で形質導入した。５つのＢＲＣ細胞株成分によるＣＤ４０Ｌの発現を検出する方法は、実施例２９に記載されている。膜結合ＣＤ４０Ｌを発現するためのＤＭＳ５３の改変は、実施例１５に記載されている。６つのワクチン成分の細胞株すべてによる膜結合ＣＤ４０Ｌの評価を以下に説明する。図１２５に示され、以下に記載される結果は、ＣＤ４０Ｌ膜の発現が、６つのＢＲＣワクチン成分の細胞株すべてで大幅に増加したことを示す。
膜結合ＣＤ４０Ｌの発現は、未改変親細胞株と比較して、すべての成分細胞株で、少なくとも３，４１７倍増加した。ＢＲＣワクチンＡ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＣＡＭＡ－１（３，４１７ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、３，４１７倍増加し、ＡＵ５６５（６，５２７ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、６，５２７倍増加し、ＨＳ－５７８Ｔ（６，５６０ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、６，５６０倍増加した。ＢＲ－ＢＴワクチンＢ成分細胞株では、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＭＣＦ－７（５，９８６ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、５，９８６倍増加し、Ｔ４７Ｄ（４５，０７１ＭＦＩ）で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、４５，０７１倍増加し、ＤＭＳ５３で、親細胞株（０ＭＦＩ）と比較して、８８，２６１倍増加した。
ＩＬ－１２の発現
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表１１６に示され、以下に記載される。
成分細胞株は、実施例１７に記載されているように、ＩＬ－１２ベクターで形質導入され、得られたＩＬ－１２ ｐ７０の発現は、上記および本明細書に記載されているように決定された。その結果が表１１６に示され、以下に記載される。
ＩＬ－１２の分泌は、未改変親細胞株と比較して、ＩＬ－１２ ｐ７０を分泌するように改変されたすべての成分細胞株で、少なくとも４，０３４倍増加した。ＢＲＣワクチンＡ成分細胞株では、ＩＬ－１２の分泌は、ＣＡＭＡ－１で、親細胞株（≦０．００１６ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、３９，４９０倍増加し、ＡＵ５６５で、親細胞株（≦０．００１７ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１４，７９３倍増加し、ＨＳ－５７８Ｔで、親細胞株（≦０．００２６ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、１９，１４１倍増加した。ＢＲＣワクチンＢ成分細胞株では、ＩＬ－１２の発現は、ＭＣＦ－７で、親細胞株（≦０．００４７ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４，０３４倍増加し、Ｔ４７Ｄで、親細胞株（≦０．００２ｎｇ／１０6細胞／２４時間）と比較して、４３，６５５倍増加した。ＤＭＳ５３は、ＩＬ－１２を分泌するように改変されなかった。
５×１０5個の各成分細胞株の用量に基づいて、ＢＲＣワクチンＡの総ＩＬ－１２分泌量は、６９ｎｇ／用量／２４時間であった。ＢＲＣワクチンＢの総ＩＬ－１２分泌量は、５３ｎｇ／用量／２４時間であった。したがって、用量当たりの総ＩＬ－１２分泌量は、２４時間当たり１２２ｎｇであった。
ＣＡＭＡ－１細胞株によるｍｏｄＰＳＭＡの安定的な発現
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＣＡＭＡ－１細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＣＡＭＡ１によるｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２６８０６１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（７７，７１８ＭＦＩ）で、親細胞株（４，２６９ＭＦＩ）のものよりも１７倍増加した（図１２４Ａ）。
上記のように、本明細書に記載のワクチン中の細胞は、抗腫瘍免疫に重要であることが知られているものを含めて、様々なＴＡＡを発現するように選択された。一連の抗原をさらに増強するために、ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＣＡＭＡ－１細胞株を、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原（配列番号３７、配列番号３８）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＣＡＭＡ１によるｍｏｄＰＳＭＡの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変細胞および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＰＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２６８０６１）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０５３２２）で細胞内染色した。ｍｏｄＰＳＭＡの発現は、改変細胞株（７７，７１８ＭＦＩ）で、親細胞株（４，２６９ＭＦＩ）のものよりも１７倍増加した（図１２４Ａ）。
ＡＵ５６５細胞株によるｍｏｄＴＥＲＴの安定的な発現
ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＡＵ５６５細胞株を、ｍｏｄＴＥＲＴ抗原（配列番号３５、配列番号３６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＡＵ５６５によるｍｏｄＴＥＲＴの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＴＥＲＴ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ３２０２０）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＥＲＴの発現は、改変細胞株（９５７，８７３ＭＦＩ）で、未改変細胞株（３０，７４３ＭＦＩ）の３１倍増加した（図１２４Ｂ）。
ＴＧＦβ２の分泌を減少させ、ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＡＵ５６５細胞株を、ｍｏｄＴＥＲＴ抗原（配列番号３５、配列番号３６）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。ＡＵ５６５によるｍｏｄＴＥＲＴの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変および抗原改変細胞を、０．０３μｇ／試験の抗マウスＩｇＧ１抗ＴＥＲＴ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ３２０２０）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＥＲＴの発現は、改変細胞株（９５７，８７３ＭＦＩ）で、未改変細胞株（３０，７４３ＭＦＩ）の３１倍増加した（図１２４Ｂ）。
Ｔ４７Ｄ細胞株によるｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳの安定的な発現
ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＴ４７Ｄ細胞株を、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳ抗原（配列番号４１、配列番号４２）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。Ｔ４７ＤによるｍｏｄＴＢＸＴの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変および抗原改変細胞を、０．０６μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＴＢＸＴ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０９６６５）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＢＸＴの発現は、改変細胞株（１４７，６１０ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）の発現の１４７，６１０倍増加した（図１２４Ｃ）。ＳＣａｂＥＲによるＢＯＲＩＳの発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧ（配列番号１３４））は、導入遺伝子の１１１９～１１３８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＡＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡ（配列番号：１３５））は、導入遺伝子の１１５９～１１７８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、４６０ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＢＯＲＩＳの遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１２４Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、２，１９８倍増加した。
ＣＤ２７６の発現を減少させ、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２を発現するように改変されたＴ４７Ｄ細胞株を、ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳ抗原（配列番号４１、配列番号４２）を発現するレンチウイルス粒子でも形質導入した。Ｔ４７ＤによるｍｏｄＴＢＸＴの発現は、フローサイトメトリーによって特徴付けられた。未改変および抗原改変細胞を、０．０６μｇ／試験の抗ウサギＩｇＧ１抗ＴＢＸＴ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０９６６５）、続いて、０．１２５ｕｇ／試験のＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４０６４１４）で細胞内染色した。ｍｏｄＴＢＸＴの発現は、改変細胞株（１４７，６１０ＭＦＩ）で、未改変細胞株（０ＭＦＩ）の発現の１４７，６１０倍増加した（図１２４Ｃ）。ＳＣａｂＥＲによるＢＯＲＩＳの発現は、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＲＴ－ＰＣＲによって決定された。フォワードプライマー（ＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧ（配列番号１３４））は、導入遺伝子の１１１９～１１３８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、リバースプライマー（ＡＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡ（配列番号：１３５））は、導入遺伝子の１１５９～１１７８ｂｐの位置でアニーリングするように設計され、４６０ｂｐの産物を生成する。β－チューブリンの対照プライマーは、実施例２９に記載されている。ｍｏｄＢＯＲＩＳの遺伝子産物は、予想されるサイズで検出され（図１２４Ｄ）、ｍＲＮＡは、親対照と比較して、２，１９８倍増加した。
ＢＲＣワクチンＡにおけるＰＳＭＡに対する免疫応答
ＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＢＲＣワクチンＡとの関連で評価された。表１１７に、６人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然ＦＳＨＲ抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、実施例２９に記載されているようにＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＢＲＣワクチンＡ（３９３±２１０ＳＦＵ）と比較して、改変ＢＲＣワクチンＡ（４，１６６±１，６４７ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０４１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝６）（図１２４Ｅ）。
ＰＳＭＡに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＢＲＣワクチンＡとの関連で評価された。表１１７に、６人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然ＦＳＨＲ抗原の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、実施例２９に記載されているようにＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ応答は、親未改変ＢＲＣワクチンＡ（３９３±２１０ＳＦＵ）と比較して、改変ＢＲＣワクチンＡ（４，１６６±１，６４７ＳＦＵ）で有意に増加した（ｐ＝０．０４１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（ｎ＝６）（図１２４Ｅ）。
ＢＲＣワクチンＡにおけるＴＥＲＴに対する免疫応答
ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＢＲＣワクチンＡとの関連で評価された。表１１７に、６人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、天然ＴＥＲＴ抗原（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＢＲＣワクチンＡ（１，６７０±９１８）ＳＦＵと比較して、改変ＢＲＣワクチンＡ（３，８０７±９２７ＳＦＵ）で増加した（図１２４Ｆ）。
ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例２９および本明細書に記載されているように、ＢＲＣワクチンＡとの関連で評価された。表１１７に、６人のドナー各々のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃアレルを示す。ＩＦＮγ応答は、天然ＴＥＲＴ抗原（ＪＰＴ，ＰＭ－ＴＥＲＴ）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＴＥＲＴに対するＩＦＮγ応答は、未改変ＢＲＣワクチンＡ（１，６７０±９１８）ＳＦＵと比較して、改変ＢＲＣワクチンＡ（３，８０７±９２７ＳＦＵ）で増加した（図１２４Ｆ）。
ＢＲＣワクチンＢにおけるＴＢＸＴおよびＢＯＲＩＳに対する免疫応答
ＴＢＸＴおよびＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例３２および本明細書に記載されているように、ＢＲＣワクチンＢとの関連で評価された（表１１７）。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、天然抗原（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。
ＴＢＸＴおよびＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、６人のＨＬＡ多様ドナー（ｎ＝４／ドナー）において、実施例３２および本明細書に記載されているように、ＢＲＣワクチンＢとの関連で評価された（表１１７）。ＴＢＸＴに対するＩＦＮγ応答は、天然抗原（ＪＰＴ，ＰＭ－ＢＲＡＣ）の全長にまたがる１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。ＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅから購入した天然抗原タンパク質の全長にまたがる９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定された。
ＴＢＸＴ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＢＲＣワクチンＢ（９３０±４９６ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、ＢＲＣワクチンＢ（１，１０２±３６６ＳＦＵ）で増加した（図１２４Ｇ）。ＢＯＲＩＳ特異的ＩＦＮγ応答は、未改変ＢＲＣワクチンＢ（１，７５７±６６１ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、ＢＲＣワクチンＢ（３，０５４±１，１５５ＳＦＵ）で増加した（図１２４Ｈ）。
カクテルは、関連するＴＡＡに対して免疫応答を誘導する
１０のＢＲＣ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。６人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表１１７）を、ＢＲＣワクチンＡまたはＢＲＣワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、ＴＥＲＴ、ＴＢＸＴ、およびＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下のように供給された：ＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＰＲＡＭＥ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＯＩＰ４）、ＳＣＧＢ２Ａ２（Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ－Ａ）（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭａｍＡ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびＭＭＰ１１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＭＰ１１）。
１０のＢＲＣ抗原に対してＩＦＮγ産生を誘導するＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢの能力を、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。６人のＨＬＡ多様健常ドナーからのＰＢＭＣ（表１１７）を、ＢＲＣワクチンＡまたはＢＲＣワクチンＢをロードした自己ＤＣと６日間共培養した後、既知のＭＨＣ－Ｉ限定エピトープを含むＴＡＡ特異的な特異的ペプチドプールで刺激した。ＰＳＭＡ、ＴＥＲＴ、ＴＢＸＴ、およびＢＯＲＩＳに対するＩＦＮγ応答を検出するためのＣＤ１４－ＰＢＭＣの刺激用ペプチドは、上記のとおりである。１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチドの追加のペプチドプールは、以下のように供給された：ＳＴＥＡＰ１（ＰＭ－ＳＴＥＡＰ１）、ＰＲＡＭＥ（ＪＰＴ，ＰＭ－ＯＩＰ４）、ＳＣＧＢ２Ａ２（Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ－Ａ）（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭａｍＡ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓ，７７６９＿００１－０１１）、ＭＵＣ１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＵＣ１）、およびＭＭＰ１１（ＪＰＴ，ＰＭ－ＭＭＰ１１）。
図１２６は、ＢＲＣワクチンが、６人のＨＬＡ多様ドナーにおいて、１０のＢＲＣ抗原に対して抗原特異的ＩＦＮγ応答を誘導することができることを示し、これは、未改変親対照（２０，１８３±７，９８７ＳＦＵ）（ｎ＝６）と比較して、２．２倍より強力であった（４５，３７０±９，２１２ ＳＦＵ）（図１３６Ａ）（表１１８）。ＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢの単位用量は、２人のドナーで９つの抗原、および４人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘発した（図１２７）。ＢＲＣワクチンは、トリプルネガティブ乳癌の分子サブセットで豊富な２つの抗原に対するＩＦＮγ応答を、未改変対照（それぞれ１，３８０±６９７ＳＦＵおよび１，６０１±８１０ＳＦＵ）と比較して、ＰＲＡＭＥに対して２．２倍（３，０４９±１，０７９ＳＦＵ）およびＴＢＸＴに対して１．７倍（３，０４９±１，０７９ＳＦＵ）増加させる。ＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢは、親対照と比較して、それぞれ２．６倍および１．４倍の抗原特異的応答の増加を示した。具体的には、ＢＲＣワクチンＡは、未改変対照（９，１９７±３，４３３ＳＦＵ）と比較して、２３，９４４±３，９７１ＳＦＵの抗原特異的応答を有意に増加させる（ｐ＝０．０２６、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）（図１２７Ｂ）。ＢＲＣワクチンＡの場合、２人のドナーが９つの抗原に反応し、４人のドナーが１０の抗原に反応した。ＢＲＣワクチンＢは、親対照（１１，９７５±４，５１０ＳＦＵ）と比較して、１７，０３２±３，８６１ＳＦＵを誘発した（ｎ＝６）（図１２７Ｃ）。ＢＲＣワクチンＢの場合、１人のドナーが５つの抗原に反応し、２人のドナーが９つの抗原に反応し、３人のドナーが１０の抗原に反応した。治療有効量の３つのがん細胞株含む２つの組成物（６つの細胞株の単位用量）が上に記載されており、当該単位用量は、ＢＲＣ患者の腫瘍において発現された少なくとも９つのＴＡＡに特異的な、未改変組成物よりも２．２倍大きい免疫応答を誘発することができる。ＢＲＣワクチンＡは、少なくとも９つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を２．６倍増加させ、ＢＲＣワクチンＢは、少なくとも５つのＴＡＡに対して、ＩＦＮγ応答を１．４倍増加させた。
カクテルは、ＴＡＡに対するＩＦＮγ応答の幅と大きさを増加させる
実施例９に記載される単一成分細胞株と比較して、実施例８に記載される、より大きな抗原性の幅および大きさのＩＦＮγ産生を誘発するＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢの能力を、ドナー２～６において、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した（表１１７）。ＢＲＣワクチンＡ（図１２８Ａ）およびＢＲＣワクチンＢ（図１２８Ｂ）は、乳癌抗原に対してより強力な応答を誘導した。重要なことに、ＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢは、単一成分細胞株と比較して、より多数の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した。この５人のドナーのサブセットでは、ＢＲＣワクチンＡは、２人のドナーで９つの抗原、および３人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した。ＣＡＭＡ－１単独では、１人のドナーで４つの抗原、２人のドナーで６つの抗原、１人のドナーで８つの抗原、１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された。ＡＵ５６５単独では、１人のドナーで２つの抗原、２人のドナーで６つの抗原、１人のドナーで９つの抗原、および１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された。ＨＳ－５７８Ｔ単独では、１人のドナーでゼロ抗原、１人のドナーで３つの抗原、１人のドナーで５つの抗原、１人のドナーで９つの抗原、および１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した（図１２８Ｃ）。この５人のドナーのサブセットでは、ＢＲＣワクチンＢは、１人のドナーで５つの抗原、２人のドナーで９つの抗原、および２人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した。ＭＣＦ－７単独では、１人のドナーで３つの抗原、１人のドナーで５つの抗原、１人のドナーで７つの抗原、１人のドナーで８つの抗原、および１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された。Ｔ４７Ｄ単独では、１人のドナーでゼロ抗原、１人のドナーで５つの抗原、２人のドナーで７つの抗原、および１人のドナーで９つの抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された（図１２８Ｄ）。
実施例９に記載される単一成分細胞株と比較して、実施例８に記載される、より大きな抗原性の幅および大きさのＩＦＮγ産生を誘発するＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢの能力を、ドナー２～６において、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した（表１１７）。ＢＲＣワクチンＡ（図１２８Ａ）およびＢＲＣワクチンＢ（図１２８Ｂ）は、乳癌抗原に対してより強力な応答を誘導した。重要なことに、ＢＲＣワクチンＡおよびＢＲＣワクチンＢは、単一成分細胞株と比較して、より多数の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した。この５人のドナーのサブセットでは、ＢＲＣワクチンＡは、２人のドナーで９つの抗原、および３人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した。ＣＡＭＡ－１単独では、１人のドナーで４つの抗原、２人のドナーで６つの抗原、１人のドナーで８つの抗原、１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された。ＡＵ５６５単独では、１人のドナーで２つの抗原、２人のドナーで６つの抗原、１人のドナーで９つの抗原、および１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された。ＨＳ－５７８Ｔ単独では、１人のドナーでゼロ抗原、１人のドナーで３つの抗原、１人のドナーで５つの抗原、１人のドナーで９つの抗原、および１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した（図１２８Ｃ）。この５人のドナーのサブセットでは、ＢＲＣワクチンＢは、１人のドナーで５つの抗原、２人のドナーで９つの抗原、および２人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答を誘導した。ＭＣＦ－７単独では、１人のドナーで３つの抗原、１人のドナーで５つの抗原、１人のドナーで７つの抗原、１人のドナーで８つの抗原、および１人のドナーで１０の抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された。Ｔ４７Ｄ単独では、１人のドナーでゼロ抗原、１人のドナーで５つの抗原、２人のドナーで７つの抗原、および１人のドナーで９つの抗原に対するＩＦＮγ応答が誘導された（図１２８Ｄ）。
本開示および本明細書に提供されるデータに基づいて、ＡＴＣＣから供給される６つのがん細胞株ＣＡＭＡ－１（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２１）、ＡＵ５６５（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２３５１）、ＨＳ－５７８Ｔ（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－１２６）、ＭＣＦ－７（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２２）、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－１３３）、およびＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２０６２）を含む乳癌のための全細胞ワクチンを、表１１９に示す。細胞株は、５つの乳癌細胞株および１つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＤＭＳ５３ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）を表している。細胞株は、ワクチンＡとワクチンＢの２つのグループに分けられている。ワクチンＡは、上腕に皮内投与されるように設計されており、ワクチンＢは、大腿に皮内投与されるように設計されている。ワクチンＡおよびワクチンＢは、一緒に、がんワクチンの単位用量を構成する。
上記の表に示されている場合、免疫抑制因子であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）およびトランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの形質導入を使用してノックダウンされている。ＣＤ２７６の遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用してエレクトロポレーションによってノックアウトされるか、またはレンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡ形質導入を使用してノックダウンされる。顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ｍｏｄＴＥＲＴ（ＡＵ５６５）、ｍｏｄＰＳＭＡ（ＣＡＭＡ－１）、ｍｏｄＴＢＸＴ（Ｔ４７Ｄ）、およびｍｏｄＢＯＲＩＳ（Ｔ４７Ｄ）の遺伝子が、レンチウイルスベクターの形質導入によって追加されている。
治療有効量の３つのがん細胞株を含む２つの組成物（少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を低減し、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するように改変されている、６つのがん細胞株の単位用量）が本明細書に提供される。１つの組成物であるＢＲＣワクチンＡは、２つのＴＡＡ（ｍｏｄＴＥＲＴおよびｍｏｄＰＳＭＡ）の発現を増加させるように改変された。第２の組成物であるＢＲＣワクチンＢは、２つのＴＡＡ（ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳ）を発現するように改変された。６つのがん細胞株の単位用量は、当該組成物を受けることが意図された乳癌対象のサブセットのがんと関連する少なくとも１５のＴＡＡを発現し、未改変組成物成分よりも２．２倍大きいＩＦＮγ応答を誘導する。
実施例３７：異種不含培地におけるＧＢＭワクチン成分細胞株の増殖への適応
適応プロセスの概要
ＧＢＭワクチン組成物の５つの成分細胞株（ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＧＢ１、ＫＮＳ－６０、およびＳＦ－１２６）は、異種不含、無血清で、非ヒト要素を含まない培地に直接培養されたか（Ａ１Ｄ、Ａ２Ｄ）、またはその培地での増殖に順次適応（Ａ１Ｗ、Ａ２Ｗ）された。各細胞株について、２つの培地組成を試験した。従来の培養培地は、１０％のＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（ＤＭＥＭでのみ使用される非必須アミノ酸）、および抗生物質を補充したＲＰＭＩ（ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９）またはＤＭＥＭ（ＧＢ１、ＫＮＳ－６０、ＳＦ－１２６）からなった（表１２０）。異種不含培地には、ＦＢＳを置き換える１５％の異種不含代替物（ＸＦＲ）および従来の培地とは異なる濃度の抗生物質が含まれた（Ａ１－ＸＦＲ培地：表１２１に示される抗生物質が配合されたＲＰＭＩまたはＤＭＥＭベースの培地；Ａ２－ＸＦＲ培地：表１２２に示される抗生物質が配合されたＲＰＭＩまたはＤＭＥＭベースの培地）。特に、導入遺伝子を選択するために培地組成に添加される抗生物質は、培地に存在するタンパク質に結合する。ＦＢＳ含有培地と比較して、異種不含培地のタンパク質濃度が低いため、Ａ１－ＸＦＲ培地およびＡ２－ＸＦＲ培地における抗生物質濃度を下げて、２つの異なる濃度をそれぞれ試験した。５つのＧＢＭワクチン成分細胞株の各々を、２つの培地組成Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲにおける増殖、および２つの適応条件（直接プレーティング（Ａ１Ｄ、Ａ２Ｄ）と連続ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）（Ａ１Ｗ、Ａ２Ｗ）の比較）についてスクリーニングした。
適応プロセスの概要
ＧＢＭワクチン組成物の５つの成分細胞株（ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＧＢ１、ＫＮＳ－６０、およびＳＦ－１２６）は、異種不含、無血清で、非ヒト要素を含まない培地に直接培養されたか（Ａ１Ｄ、Ａ２Ｄ）、またはその培地での増殖に順次適応（Ａ１Ｗ、Ａ２Ｗ）された。各細胞株について、２つの培地組成を試験した。従来の培養培地は、１０％のＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（ＤＭＥＭでのみ使用される非必須アミノ酸）、および抗生物質を補充したＲＰＭＩ（ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９）またはＤＭＥＭ（ＧＢ１、ＫＮＳ－６０、ＳＦ－１２６）からなった（表１２０）。異種不含培地には、ＦＢＳを置き換える１５％の異種不含代替物（ＸＦＲ）および従来の培地とは異なる濃度の抗生物質が含まれた（Ａ１－ＸＦＲ培地：表１２１に示される抗生物質が配合されたＲＰＭＩまたはＤＭＥＭベースの培地；Ａ２－ＸＦＲ培地：表１２２に示される抗生物質が配合されたＲＰＭＩまたはＤＭＥＭベースの培地）。特に、導入遺伝子を選択するために培地組成に添加される抗生物質は、培地に存在するタンパク質に結合する。ＦＢＳ含有培地と比較して、異種不含培地のタンパク質濃度が低いため、Ａ１－ＸＦＲ培地およびＡ２－ＸＦＲ培地における抗生物質濃度を下げて、２つの異なる濃度をそれぞれ試験した。５つのＧＢＭワクチン成分細胞株の各々を、２つの培地組成Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲにおける増殖、および２つの適応条件（直接プレーティング（Ａ１Ｄ、Ａ２Ｄ）と連続ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）（Ａ１Ｗ、Ａ２Ｗ）の比較）についてスクリーニングした。
異種不含培地組成への適応を確認するために、細胞の形態および増殖を監視した。トリパンブルー染色で生存不能であった非接着性浮遊細胞を示した培養条件は終了させた。異種不含培地で安定して増殖した、ＦＢＳ含有培地で対照と同様の形態を有する細胞株を、少なくとも３週間抗生物質選択下に置き、回収し、改変遺伝子の発現について分析した。
異種不含培地で増殖した細胞株における導入遺伝子発現の分析
５つの改変ＧＢＭワクチン成分細胞株の各々を、２つの培地組成Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲにおける増殖、および２つの適応条件（直接プレーティング（Ａ１Ｄ）と連続ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）（Ａ１Ｗ、Ａ２Ｗ）の比較）についてスクリーニングした。安定した細胞増殖、最小限の細胞死、およびＦＢＳで増殖した細胞と同等の形態を示した条件を、導入遺伝子の発現について分析した。
５つの改変ＧＢＭワクチン成分細胞株の各々を、２つの培地組成Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲにおける増殖、および２つの適応条件（直接プレーティング（Ａ１Ｄ）と連続ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）（Ａ１Ｗ、Ａ２Ｗ）の比較）についてスクリーニングした。安定した細胞増殖、最小限の細胞死、およびＦＢＳで増殖した細胞と同等の形態を示した条件を、導入遺伝子の発現について分析した。
分泌されたサイトカインの再現性のある測定値を得るために、分泌アッセイを実施した。細胞は、ビトロネクチンでコーティングされた６ウェルプレートの１ウェル当たり０．７５×１０6および０．５×１０6個の細胞で、異種不含培地に、二重でプレーティングされた。２４時間後、培地を新鮮な異種不含培地と交換した。さらに４８時間後、ＥＬＩＳＡによる分析のために、上清を回収した。同時に、フローサイトメトリーによるＣＤ４０Ｌの発現の評価のために、細胞を回収した。簡単には、回収後、細胞を、フィコエリトリン結合抗ヒトＣＤ４０Ｌ（クローンＴＲＡＰ１）で染色した。標識された細胞を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーによって分析した。分泌されたサイトカインは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡単には、各試料について、２～４つの上清の希釈液を実行した。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌は、ｐｇ／１０6細胞／２４時間の単位で報告される。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２レベルは、それぞれＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＢｉｏｌｅｇｅｎｄのキットを使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２の分泌レベルは、ｎｇ／１０6細胞／２４時間の単位で報告される。
異種不含培地への適応後の個々の細胞株における導入遺伝子の発現の結果
適応プロセスに使用されるＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞は、ＴＧＦβ１の発現を減少させ、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ－１２を発現するように改変された。細胞は、１００％のＡ１－ＸＦＲ培地で増殖するように４～６週間かけてウィーニングさせると、安定して増殖したが、倍加時間が、ＦＢＳ含有培地で増殖させた未改変親細胞の３８．３時間と比較して、５８６．８時間に増加した（表１２３）。Ａ１－ＸＦＲ培地に直接プレーティングすると、増殖停止および細胞死が起こった。Ａ１－ＸＦＲ培地で増殖するように適合された改変ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞の分析により、ＣＤ４０Ｌが発現し、ＩＬ－１２の分泌が検出され、１９６．５ｎｇ／１０6／２４時間であると定量化され（未改変ＤＢＴＲ－０５ＭＧ細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現せず、ＩＬ－１２を産生しない）、一方、ＴＧＦβ１の分泌が、ＦＢＳで増殖させた未改変親ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞と比較して、８８％減少することが示された。
適応プロセスに使用されるＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞は、ＴＧＦβ１の発現を減少させ、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ－１２を発現するように改変された。細胞は、１００％のＡ１－ＸＦＲ培地で増殖するように４～６週間かけてウィーニングさせると、安定して増殖したが、倍加時間が、ＦＢＳ含有培地で増殖させた未改変親細胞の３８．３時間と比較して、５８６．８時間に増加した（表１２３）。Ａ１－ＸＦＲ培地に直接プレーティングすると、増殖停止および細胞死が起こった。Ａ１－ＸＦＲ培地で増殖するように適合された改変ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞の分析により、ＣＤ４０Ｌが発現し、ＩＬ－１２の分泌が検出され、１９６．５ｎｇ／１０6／２４時間であると定量化され（未改変ＤＢＴＲ－０５ＭＧ細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現せず、ＩＬ－１２を産生しない）、一方、ＴＧＦβ１の分泌が、ＦＢＳで増殖させた未改変親ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞と比較して、８８％減少することが示された。
適応プロセスに使用されるＬＮ－２２９細胞は、ＴＧＦβ１の発現を減少させ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２を過剰発現するように改変された。細胞は、１００％のＡ１－ＸＦＲ培地に直接プレーティングすると、安定して増殖し、倍加時間が、ＦＢＳ含有培地で増殖させた未改変親細胞の３４．５時間と比較して、５９．７時間であった（表１２３）。４～６週間かけて１００％のＡ２－ＸＦＲ培地で増殖するようにウィーニングした場合、倍加時間が、７１時間であった（表４）。Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲ培地で増殖するように適合された改変ＬＮ－２２９細胞の分析により、ＣＤ４０Ｌが発現し、ＩＬ－１２の分泌が検出され、５２７ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ１Ｄ）および６０３ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ２Ｗ）であると定量化され、ＧＭ－ＣＳＦが検出され、２０２９．８ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ１Ｄ）および２５０５．８ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ２Ｗ）であると定量化され、ＴＧＦβ１のレベルが、ＦＢＳで増殖させた未改変親細胞と比較して、７９．２％（Ａ１Ｄ）または７８．９％（Ａ２Ｗ）減少したことが示された。未改変ＬＮ－２２９細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現せず、ＩＬ－１２またはＧＭ－ＣＳＦを産生しない。
適応プロセスに使用されるＧＢ１細胞は、ＴＧＦβ１の発現を減少させ、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ－１２を過剰発現するように改変された。細胞は、１００％のＡ１－ＸＦＲ培地に直接プレーティングすると、安定して増殖し、倍加時間が、ＦＢＳ含有培地で増殖させた未改変親細胞の３７．９時間と比較して、１４４．１時間であった（表１２３）。４～６週間かけて１００％のＡ１－ＸＦＲ培地で増殖するようにウィーニングした場合、倍加時間が、５９７．２時間であり、Ａ２－ＸＦＲ培地では、２６６．８時間であった（表４）。Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲ培地で増殖するように適合された改変ＧＢ１細胞の分析により、ＣＤ４０Ｌが発現し、ＩＬ－１２の分泌が検出され、１１７．５ｎｇ／１０6細胞／２４時間（Ａ１Ｄ）、７６．６ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ１Ｗ）、および７２．０ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ２Ｗ）であると定量化され、ＴＧＦβ１のレベルが、ＦＢＳで増殖させた未改変親細胞と比較して、６４．３％（Ａ１Ｄ）、７４．６％（Ａ１Ｗ）、および９０．８％（Ａ２Ｗ）減少したことが示された。未改変ＧＢ１細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現せず、ＩＬ－１２を産生しない。
適応プロセスに使用されるＫＮＳ－６０細胞は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の発現レベルを減少させ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２を過剰発現するように改変された。細胞は、１００％のＡ１－ＸＦＲ培地で増殖するようにウィーニングすると、安定して増殖し、倍加時間が、ＦＢＳ含有培地で増殖させた未改変親細胞の４０．０時間と比較して、６７４．２時間であった（表１２３）。４～６週間かけて１００％のＡ２－ＸＦＲ培地で増殖するようにウィーニングした場合、倍加時間が、３０３．８時間であった（表４）。Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲ培地で増殖するように適合された改変ＫＮＳ－６０細胞の分析により、ＣＤ４０Ｌが発現し、ＩＬ－１２の分泌が検出され、７００．０ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ１Ｗ）および４８２．２ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ２Ｗ）であると定量化され、ＧＭ－ＣＳＦの分泌が検出され、１８２．５ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ１Ｗ）および１５６．９ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ２Ｗ）であると定量化され、ＴＧＦβ１のレベルが、ＦＢＳで増殖させた未改変親細胞と比較して、８３．２％（Ａ１Ｗ）および８７．７％（Ａ２Ｗ）減少し、ＴＧＦβ２のレベルが、９２．６％（Ａ１Ｗ）および９４．７％（Ａ２Ｗ）減少したことが示された。未改変ＫＮＳ－６０細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現せず、ＩＬ－１２またはＧＭ－ＣＳＦを産生しない。
適応プロセスに使用されるＳＦ－１２６細胞は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の発現レベルを減少させ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１２を過剰発現するように改変された。細胞は、１００％のＡ１－ＸＦＲ培地で増殖するようにウィーニングすると、安定して増殖し、倍加時間が、ＦＢＳ含有培地で増殖させた未改変親細胞の２８．３時間と比較して、１７２．１時間であった（表１２３）。４～６週間かけて１００％のＡ２－ＸＦＲ培地で増殖するようにウィーニングした場合、倍加時間が、４５６．６時間であった（表４）。Ａ１－ＸＦＲおよびＡ２－ＸＦＲ培地で増殖するように適合された改変ＳＦ－１２６細胞の分析により、ＣＤ４０Ｌが発現し、ＩＬ－１２の分泌が検出され、６７１．２ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ１Ｗ）および６８４．９ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ２Ｗ）であると定量化され、ＧＭ－ＣＳＦの分泌が検出され、５１．２ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ１Ｗ）および３９．３ｎｇ／１０6／２４時間（Ａ２Ｗ）であると定量化され、ＴＧＦβ１のレベルが、ＦＢＳで増殖させた未改変親細胞と比較して、８６．９％（Ａ１Ｗ）および９１．２％（Ａ２Ｗ）減少し、ＴＧＦβ２のレベルが、８０．４％（Ａ１Ｗ）および９８．８％（Ａ２Ｗ）減少したことが示された。未改変ＳＦ－１２６細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現せず、ＩＬ－１２またはＧＭ－ＣＳＦを産生しない。
結論として、５つすべての改変ＧＢＭワクチン成分細胞株は、異種不含培地組成に安定して適応した。細胞は、一定の速度で増殖し、挿入された導入遺伝子の発現が維持され、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の減少も維持された。
実施例３８：異種不含培地におけるＮＳＣＬＣワクチン成分細胞株の増殖への適応
適応プロセスの概要
ＮＳＣＬＣワクチン組成物の６成分細胞株（ＮＣＩ－Ｈ２３、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ５２０）は、異種不含、無血清で、非ヒト要素を含まない培地での増殖に順次適応された。６つの細胞株の各々について、４つの異種不含培地組成を試験した。培地組成は、ＫＳＣ（ｐＨ７．２）、ＫＳＣ（ｐＨ６．８）、ＫＳＲ（ｐＨ７．２）、およびＫＳＲ（ｐＨ６．８）である。１０％のＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩから構成される通常の培養培地における細胞の追加の対照条件も維持された。各異種不含培地組成は、異種不含血清代替物として１０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む異なる基本培地（ＫＳＣまたはＫＳＲ）から構成され、表１２４に示される挿入された導入遺伝子の発現を維持するために、抗生物質が培地に添加された。異種不含培地の総タンパク質含有量は、ＦＢＳを含む培地のものと同等であったため、選択に使用した抗生物質のレベルは、ＦＢＳベースの培地と同じであった。さらに、各培地組成を、通常の２１％の酸素および３％の低酸素の２つの酸素レベルで試験した。異種不含培地組成への適応を確認するために、細胞が試験培地で増殖する能力について観察した。生存性色素で染色した際に生存不能であった非接着性浮遊物の目視観察に基づいて、細胞死を示した条件は終了した。対照のＦＢＳウェルと同様の形態を有し、ＸＦ培地で安定して増殖し、少なくとも３週間抗生物質選択下に置かれた細胞を回収し、挿入された導入遺伝子の発現を分析した。
適応プロセスの概要
ＮＳＣＬＣワクチン組成物の６成分細胞株（ＮＣＩ－Ｈ２３、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ５２０）は、異種不含、無血清で、非ヒト要素を含まない培地での増殖に順次適応された。６つの細胞株の各々について、４つの異種不含培地組成を試験した。培地組成は、ＫＳＣ（ｐＨ７．２）、ＫＳＣ（ｐＨ６．８）、ＫＳＲ（ｐＨ７．２）、およびＫＳＲ（ｐＨ６．８）である。１０％のＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩから構成される通常の培養培地における細胞の追加の対照条件も維持された。各異種不含培地組成は、異種不含血清代替物として１０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む異なる基本培地（ＫＳＣまたはＫＳＲ）から構成され、表１２４に示される挿入された導入遺伝子の発現を維持するために、抗生物質が培地に添加された。異種不含培地の総タンパク質含有量は、ＦＢＳを含む培地のものと同等であったため、選択に使用した抗生物質のレベルは、ＦＢＳベースの培地と同じであった。さらに、各培地組成を、通常の２１％の酸素および３％の低酸素の２つの酸素レベルで試験した。異種不含培地組成への適応を確認するために、細胞が試験培地で増殖する能力について観察した。生存性色素で染色した際に生存不能であった非接着性浮遊物の目視観察に基づいて、細胞死を示した条件は終了した。対照のＦＢＳウェルと同様の形態を有し、ＸＦ培地で安定して増殖し、少なくとも３週間抗生物質選択下に置かれた細胞を回収し、挿入された導入遺伝子の発現を分析した。
異種不含培地で増殖した細胞株における導入遺伝子発現の分析
６つのワクチン成分細胞株の各々を、４つの培地組成および２つの酸素レベルでの増殖についてスクリーニングした。安定した細胞増殖、最小限の細胞死、およびＦＢＳで増殖した細胞と同等の形態を示した条件を、導入遺伝子の発現について分析した。分泌されたサイトカインは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡単には、各試料について、上清の２～４つの希釈液を実行した。示されるデータは、試験したすべての条件の平均であり、希釈係数および細胞数に対して正規化されている。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌は、ｐｇ／ｍｌ／１０6細胞の単位で報告される。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２レベルはそれぞれＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＢｉｏｌｅｇｅｎｄのキットを使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２の分泌レベルは、ｎｇ／ｍｌ／１０6細胞の単位で報告される。ＣＤ４０Ｌの発現は、フローサイトメトリーによって評価された。簡単には、回収後、細胞を、フィコエリトリン結合抗ヒトＣＤ４０Ｌ（クローンＴＲＡＰ１）で染色した。標識された細胞を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーによって分析した。
６つのワクチン成分細胞株の各々を、４つの培地組成および２つの酸素レベルでの増殖についてスクリーニングした。安定した細胞増殖、最小限の細胞死、およびＦＢＳで増殖した細胞と同等の形態を示した条件を、導入遺伝子の発現について分析した。分泌されたサイトカインは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡単には、各試料について、上清の２～４つの希釈液を実行した。示されるデータは、試験したすべての条件の平均であり、希釈係数および細胞数に対して正規化されている。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌は、ｐｇ／ｍｌ／１０6細胞の単位で報告される。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２レベルはそれぞれＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＢｉｏｌｅｇｅｎｄのキットを使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２の分泌レベルは、ｎｇ／ｍｌ／１０6細胞の単位で報告される。ＣＤ４０Ｌの発現は、フローサイトメトリーによって評価された。簡単には、回収後、細胞を、フィコエリトリン結合抗ヒトＣＤ４０Ｌ（クローンＴＲＡＰ１）で染色した。標識された細胞を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーによって分析した。
異種不含培地への適応後の個々の細胞株における導入遺伝子の発現の結果
ＮＣＩ－Ｈ２３細胞は、通常の２１％の酸素条件下で、処理培地４（ＫＳＲ ｐＨ７．２）および処理培地５（ＫＳＲ ｐＨ６．８）で安定した増殖を示した。細胞は、他の処理条件では増殖できなかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は安定しており、ＦＢＳで増殖した細胞と同等のレベルで発現していることがわかった。ＩＬ－１２およびＧＭ－ＣＳＦの分泌は、異種不含培地組成において、ＦＢＳと比較して、それぞれ１．７倍（ＩＬ－１２、培地４および５）および２．３倍（ＧＭ－ＣＳＦ、培地４および５）増加することがわかった。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の減少は、ＸＦ培地でより大きく、ＦＢＳ含有培地における細胞と比較して、ＴＧＦβ１のレベルが、培地４で１０分の１、培地５で７分の１であり、一方、ＴＧＦβ２は、ＸＦ培地では検出できなかった。
ＮＣＩ－Ｈ２３細胞は、通常の２１％の酸素条件下で、処理培地４（ＫＳＲ ｐＨ７．２）および処理培地５（ＫＳＲ ｐＨ６．８）で安定した増殖を示した。細胞は、他の処理条件では増殖できなかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は安定しており、ＦＢＳで増殖した細胞と同等のレベルで発現していることがわかった。ＩＬ－１２およびＧＭ－ＣＳＦの分泌は、異種不含培地組成において、ＦＢＳと比較して、それぞれ１．７倍（ＩＬ－１２、培地４および５）および２．３倍（ＧＭ－ＣＳＦ、培地４および５）増加することがわかった。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の減少は、ＸＦ培地でより大きく、ＦＢＳ含有培地における細胞と比較して、ＴＧＦβ１のレベルが、培地４で１０分の１、培地５で７分の１であり、一方、ＴＧＦβ２は、ＸＦ培地では検出できなかった。
Ａ５４９細胞は、通常の２１％の酸素下で、処理培地４（ＫＳＲ ｐＨ７．２）および処理培地５（ＫＳＲ ｐＨ６．８）で、ならびに３％の低酸素条件下の処理培地５で、安定した増殖を示した。細胞は、他の処理条件では増殖できなかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は安定しており、ＦＢＳで増殖した細胞と同等のレベルで発現していることがわかった。
ＩＬ－１２の分泌は、通常の２１％の酸素で増殖させた場合、異種不含培地４のＦＢＳと同等であり、通常の２１％の酸素条件では、培地５で１．６倍増加し、３％の低酸素条件下では、培地５で０．６倍減少することがわかった。ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、通常の２１％の条件で増殖させた場合、異種不含培地４のＦＢＳと同等であり、通常の２１％の酸素条件では、培地５で１．４倍増加し、３％の低酸素条件下では、培地５で０．６倍減少することがわかった。ＴＧＦβ１とＴＧＦβ２の減少は、ＦＢＳ含有培地における細胞と比較した場合、ＸＦ培地でより大きく、ＴＧＦβ１のレベルは、通常の２１％の酸素下では、培地４で３．４倍少なく、通常の２１％の酸素下では、培地５で３．１倍少なく、３％の低酸素下では、培地５で２倍少なく、一方、ＴＧＦβ２は、通常の２１％の酸素下では、処理培地４で２．２倍減少し、３％の低酸素条件または通常の２１％の酸素条件では、ＸＦ培地５では検出されないことがわかった。
ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞は、通常の２１％の酸素条件下で、処理培地４（ＫＳＲ ｐＨ７．２）および処理培地５（ＫＳＲ ｐＨ６．８）で安定した増殖を示した。細胞は、他の処理条件では増殖できなかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は安定しており、ＦＢＳで増殖した細胞と同等のレベルで発現していることがわかった。ＩＬ－１２の分泌は、ＦＢＳと比較した場合、異種不含培地組成で増加し、培地４で３．２倍、培地５で１．７倍増加することがわかった。ＧＭ－ＣＳＦは、異種不含培地でも増加し、培地４では３．５倍、培地５では１．８倍増加した。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の減少は、ＦＢＳ含有培地における細胞と比較した場合、ＸＦ培地でより大きく、ＴＧＦβ１のレベルは、ＸＦ培地４および５では検出されず、ＴＧＦβ２は、培地４で１．６倍、培地５で３．４倍減少した。
ＤＭＳ５３細胞は、通常の２１％の酸素条件下で、処理培地４（ＫＳＲ ｐＨ７．２）および５（ＫＳＲ ｐＨ６．８）で安定した増殖を示した。細胞は、他の処理条件では増殖できなかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は安定しており、ＦＢＳで増殖した細胞と同等のレベルで発現していることがわかった。ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、異種不含培地で増加し、培地４で３．５倍、培地５で１．８倍増加した。ＴＧＦβ２レベルは、ＦＢＳ含有培地における細胞と比較した場合、ＸＦ培地４で１．２倍高く、培地５で１．８倍減少することがわかった。細胞株は、ＩＬ－１２を過剰発現するか、またはＴＧＦβ１のレベルをノックダウンするように改変されなかった。
ＬＫ－２細胞は、通常の２１％の酸素条件下で、処理培地４（ＫＳＲ ｐＨ７．２）および処理培地５（ＫＳＲ ｐＨ６．８）で安定した増殖を示した。細胞は、他の処理条件では増殖できなかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は安定しており、ＦＢＳで増殖した細胞と同等のレベルで発現していることがわかった。ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、異種不含培地で増加し、培地４で２．８倍、培地５で３．１倍増加した。ＴＧＦβ１のレベルは、異種不含培地では検出されず、ＴＧＦβ２のレベルは、ＦＢＳ含有培地における細胞と比較した場合、培地４で６倍、培地５で２．３倍減少した。細胞株は、ＩＬ－１２を過剰発現するように改変されなかった。
ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞は、通常の２１％の酸素条件および３％の低酸素条件下で、処理培地４（ＫＳＲ ｐＨ７．２）および５（ＫＳＲ ｐＨ６．８）で安定した増殖を示した。細胞は、他の処理条件では増殖できなかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は安定しており、ＦＢＳで増殖した細胞と同等のレベルで発現していることがわかった。ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、通常の２１％条件で増殖させた場合、異種不含培地４および５で、それぞれ１．５倍および１．３倍増加した。ＧＭ－ＣＳＦの分泌は、３％の低酸素条件で増殖させた細胞でも増加し、培地４で２．１倍、培地５で２．２倍増加した。ＴＧＦβ１の分泌は、通常の２１％の酸素下で、培地４および５で１０倍増加し、細胞を３％の低酸素で増殖させた場合は検出されなかった。ＴＧＦβ２の分泌は、通常の２１％の酸素下で、培地４および５で３倍および１．２倍減少し、細胞を３％の低酸素で増殖させた場合は検出されなかった。細胞株は、ＩＬ－１２を過剰発現するように改変されなかった。
結論として、６つすべての改変ＮＳＣＬＣワクチン成分細胞株は、異種不含培地条件での増殖に安定して適応した。細胞はＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の分泌の減少を保持し、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２の分泌は、ＦＢＳで増殖させた改変細胞と比較した場合、異種不含組成と同等であるか、または増加することがわかった。表面タンパク質ＣＤ４０Ｌの発現は、試験したすべての条件で、ＦＢＳで増殖させた細胞と同様のレベルで検出された。
実施例３９：同種腫瘍細胞ワクチンプラットフォーム
この実施例は、がんの治療および／もしくは予防のための、ならびに／または免疫応答を刺激するための、様々な同種腫瘍細胞ワクチンを使用する組成物および方法を提供する。本明細書に提供される教示を考慮して、一部の実施形態では、以下の細胞株の組み合わせおよび改変が本開示に含まれる。他の実施形態（例えば、本明細書に提供される代替の細胞株および／または改変）もまた企図される。
この実施例は、がんの治療および／もしくは予防のための、ならびに／または免疫応答を刺激するための、様々な同種腫瘍細胞ワクチンを使用する組成物および方法を提供する。本明細書に提供される教示を考慮して、一部の実施形態では、以下の細胞株の組み合わせおよび改変が本開示に含まれる。他の実施形態（例えば、本明細書に提供される代替の細胞株および／または改変）もまた企図される。
実施例４０：優先順位付けされた完全長腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に非同義変異（ＮＳＭ）を導入することによって、ワクチンで誘導される細胞性免疫応答の幅および大きさを改善する
抗腫瘍細胞性免疫の誘導によるがん免疫療法は、がんを標的とする有望なアプローチになっている。多くの治療用がんワクチンプラットフォームは、腫瘍細胞で過剰発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的としているが、これらの抗原を使用するがんワクチンは、寛容性を破るのに十分強力でなければならない。本明細書の様々な実施形態に記載されているがんワクチンは、腫瘍に対して広く強力な細胞応答を誘発する能力を有するように設計されている。ネオエピトープは、腫瘍の増殖中に生じる体細胞変異から生成される非自己エピトープである。変異負荷が高い腫瘍タイプは、チェックポイント阻害剤療法に応じた永続的な臨床的利益と相関している。これらのネオエピトープは、真に腫瘍特異的であり、胸腺の中枢性免疫寛容を受けないため、ネオエピトープを標的化することには多くの利点がある。非同義変異（ＮＳＭ）から生じるネオエピトープを含む完全長ＴＡＡをコードするがんワクチンは、幅および大きさが改善された、より強力な免疫応答を誘発する可能性がある。
抗腫瘍細胞性免疫の誘導によるがん免疫療法は、がんを標的とする有望なアプローチになっている。多くの治療用がんワクチンプラットフォームは、腫瘍細胞で過剰発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的としているが、これらの抗原を使用するがんワクチンは、寛容性を破るのに十分強力でなければならない。本明細書の様々な実施形態に記載されているがんワクチンは、腫瘍に対して広く強力な細胞応答を誘発する能力を有するように設計されている。ネオエピトープは、腫瘍の増殖中に生じる体細胞変異から生成される非自己エピトープである。変異負荷が高い腫瘍タイプは、チェックポイント阻害剤療法に応じた永続的な臨床的利益と相関している。これらのネオエピトープは、真に腫瘍特異的であり、胸腺の中枢性免疫寛容を受けないため、ネオエピトープを標的化することには多くの利点がある。非同義変異（ＮＳＭ）から生じるネオエピトープを含む完全長ＴＡＡをコードするがんワクチンは、幅および大きさが改善された、より強力な免疫応答を誘発する可能性がある。
抗原設計プロセス
ＴＡＡの選択および優先順位付け
ＴＡＡは、腫瘍で優先的または異常に発現している自己抗原であるが、正常細胞でもある程度発現している可能性がある。本明細書に記載されているように、ワクチン標的としてＴＡＡを選択し、優先順位を付けることは、がんワクチンの開発のための重要なステップである。ＴＡＡの評価および選択には複数の基準が利用された。まず、ＴＡＡが特定され、次のような複数のカテゴリにグループ化された。
ＴＡＡの選択および優先順位付け
ＴＡＡは、腫瘍で優先的または異常に発現している自己抗原であるが、正常細胞でもある程度発現している可能性がある。本明細書に記載されているように、ワクチン標的としてＴＡＡを選択し、優先順位を付けることは、がんワクチンの開発のための重要なステップである。ＴＡＡの評価および選択には複数の基準が利用された。まず、ＴＡＡが特定され、次のような複数のカテゴリにグループ化された。
Ａ．増殖
Ｂ．接着、遊走、および転移
Ｃ．血管新生
Ｄ．がん幹細胞の標的
Ｅ．未知の機能
さらに、各グループのＴＡＡの組織特異性を評価し、各ＴＡＡの過剰発現を伴う腫瘍試料の割合を決定した。ＩＨＣによって測定されたタンパク質発現データは、該当する場合は常に優先される。発現データが利用できない場合、ヒトタンパク質アトラス（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ）からの発現データが収集された。最後に、各グループのＴＡＡに優先順位が付けられ、記載された基準に基づいてＴＡＡが選択された。例として、ＧＢＭのＴＡＡは、ＴＡＡの選択と優先順位付けの後、以下の表１３３に要約されている。
Ｂ．接着、遊走、および転移
Ｃ．血管新生
Ｄ．がん幹細胞の標的
Ｅ．未知の機能
さらに、各グループのＴＡＡの組織特異性を評価し、各ＴＡＡの過剰発現を伴う腫瘍試料の割合を決定した。ＩＨＣによって測定されたタンパク質発現データは、該当する場合は常に優先される。発現データが利用できない場合、ヒトタンパク質アトラス（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ）からの発現データが収集された。最後に、各グループのＴＡＡに優先順位が付けられ、記載された基準に基づいてＴＡＡが選択された。例として、ＧＢＭのＴＡＡは、ＴＡＡの選択と優先順位付けの後、以下の表１３３に要約されている。
成分腫瘍細胞株の発現プロファイルならびに設計および挿入のためのＴＡＡの特定
選択された優先順位付けされたＴＡＡがワクチン組成物を構成する成分細胞株で過剰発現される必要があるかどうかを判断するために、各適応症のすべての成分細胞株の発現プロファイルを作成して、これらの細胞株で選択されたＴＡＡの内因性発現を見つけることができるかどうかを判断した。潜在的な成分細胞株におけるＴＡＡの発現は、公開されている癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）データベース（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ；Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２）から、２０１９年１０月７日から２０２０年５月２０日までの間にダウンロードされたＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して決定された。ＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会の遺伝子記号をＣＣＬＥ検索に入力し、各ＴＡＡのｍＲＮＡ発現をダウンロードした。ＲＮＡ－ｓｅｑ値（ＦＰＫＭ）が０より大きい場合、ＴＡＡの発現を陽性とみなした。優先順位付けされたＴＡＡの中で、いずれの細胞株でも発現されなかったもの、または細胞株の治療的組み合わせを含む１つの細胞株でのみ発現されたものが設計および挿入のために特定された。抗原は、複数の細胞株で発現しているが、１つの細胞株でのみＲＮＡ発現レベルが１．０ＦＰＫＭを上回る場合、設計および挿入のために選択することもできる。図７８に、様々なＧＢＭ細胞株のＴＡＡ発現プロファイル（ヒートマップ）の例を示す。
選択された優先順位付けされたＴＡＡがワクチン組成物を構成する成分細胞株で過剰発現される必要があるかどうかを判断するために、各適応症のすべての成分細胞株の発現プロファイルを作成して、これらの細胞株で選択されたＴＡＡの内因性発現を見つけることができるかどうかを判断した。潜在的な成分細胞株におけるＴＡＡの発現は、公開されている癌細胞株エンサイクロペディア（ＣＣＬＥ）データベース（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ；Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２）から、２０１９年１０月７日から２０２０年５月２０日までの間にダウンロードされたＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して決定された。ＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会の遺伝子記号をＣＣＬＥ検索に入力し、各ＴＡＡのｍＲＮＡ発現をダウンロードした。ＲＮＡ－ｓｅｑ値（ＦＰＫＭ）が０より大きい場合、ＴＡＡの発現を陽性とみなした。優先順位付けされたＴＡＡの中で、いずれの細胞株でも発現されなかったもの、または細胞株の治療的組み合わせを含む１つの細胞株でのみ発現されたものが設計および挿入のために特定された。抗原は、複数の細胞株で発現しているが、１つの細胞株でのみＲＮＡ発現レベルが１．０ＦＰＫＭを上回る場合、設計および挿入のために選択することもできる。図７８に、様々なＧＢＭ細胞株のＴＡＡ発現プロファイル（ヒートマップ）の例を示す。
表６６に列挙されているＧＢＭ細胞株の優先順位付けされたＴＡＡの発現は、図７８のデータを使用して決定された。図７８に示されるように、正のｈＴＥＲＴまたはＰＳＭＡの発現を示す細胞株はないが（ｈＴＥＲＴおよびＰＳＭＡのＲＮＡ－ｓｅｑ値はすべて負である）、ＧＢ４９はＭＡＧＥ－Ａ１を発現する唯一の細胞株である。その結果、選択されたＧＢＭ細胞株におけるｈＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、およびＭＡＧＥ－Ａ１の設計／増強および過剰発現が実施された。
抗原の設計方法
過剰発現させる必要のあるＴＡＡを選択した後、抗原特異的細胞性免疫応答の幅および大きさを増やすために、多段階の設計戦略を利用して、がん患者で頻繁に発生する非同義変異を含む改変ＴＡＡを生成した。
過剰発現させる必要のあるＴＡＡを選択した後、抗原特異的細胞性免疫応答の幅および大きさを増やすために、多段階の設計戦略を利用して、がん患者で頻繁に発生する非同義変異を含む改変ＴＡＡを生成した。
患者の腫瘍試料のデータは、公開されているデータベースｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）データベース（Ｃｅｒａｍｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１２、Ｇａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３）から、２０２０年２月２３日から２０２０年７月２日までの間に、ダウンロードされた。「非冗長研究の精選されたセット」のデータセットが使用され、これには、４４，３５４人のがん患者に由来する４６，７０６の腫瘍試料の全エクソームまたはトランスクリプトーム配列を含む１７６件の研究が含まれた。表１３４に、名称、原発腫瘍の部位、試料の数、および照会された１７６件の研究のｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ引用文献を示す。
非冗長データセットは、目的の抗原のＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会の遺伝子記号を用いて照会された。標的抗原で発生するミスセンス変異をダウンロードし、発生頻度で選別した。公開されているＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０）（Ｊｕｒｔｚ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７）を使用して、２人以上の患者試料で発生するミスセンス変異を特定し、ネオエピトープを誘導する可能性について評価した。ＨＬＡスーパータイプには、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、およびＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１が含まれる。
強いバインダー（ｓｔｒｏｎｇ ｂｉｎｄｅｒ）のしきい値は、推奨される閾値である０．５に設定された。これは、予測される％ランクが０．５未満の任意のペプチドには、強いバインダーとして注釈が付けられることを意味する。弱いバインダー（ｗｅａｋ ｂｉｎｄｅｒ）のしきい値は推奨される２．０に設定された。これは、予測される％ランクが２．０未満で、０．５を超えるペプチドはすべて弱いバインダーとして注釈が付けられることを意味する。
２人以上の患者試料で発生するＮＳＭをヒト天然抗原に導入することで、新しいエピトープが生成されるか、または弱いバインダーが強いバインダーに変わるかを判断するために、最初に、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂのスーパータイプ限定９ｍｅｒエピトープのリスト（強いバインダーと弱いバインダーの両方を含む）を、ヒト天然ＴＡＡタンパク質配列を使用して生成した（リスト＃１）。次いで、ヒト天然抗原の５’末端から開始して、同じ位置の天然残基をＮＳＭで置き換えることによって、各特定のＮＳＭをヒト天然抗原に導入した。ＮＳＭで得られた抗原を使用して、強いバインダーと弱いバインダーの両方を含むＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープの新しいリストを生成した（リスト＃２）。リスト＃２とリスト＃１を比較することによって、新しいエピトープ（強いバインダーおよび弱いバインダー）および取り消されたエピトープの数を計算した。１つの特定のＮＳＭを導入することで、より多くの新しいエピトープが生じた場合、このＮＳＭをヒトの天然ＴＡＡに含めることになる。１つの特定のＮＳＭを導入することで、同じ数の新しいエピトープおよび取り消されたエピトープが生成されるが、より多くの弱いバインダーが強いバインダーに変わった場合も、このＮＳＭをヒト天然ＴＡＡに含めることになる。２つのＮＳＭの間に９未満のアミノ酸残基がある場合、個々のＮＳＭおよび２つのＮＳＭの組み合わせごとに評価が行われた。評価が完了したら、配列アラインメントを行って、ヒト天然ＴＡＡとＮＳＭを含むヒトＴＡＡとの間のタンパク質配列の同一性を決定した。配列同一性が９０％未満の場合、２つ以上の患者試料で発生し、新しいエピトープを作成するかまたは弱いバインダーを強いバインダーに変えるＮＳＭのみが含まれた。
例として、ＮＳＭを含むＰＳＭＡは、上記の方法を使用して設計された。図１２９は、ヒト天然ＰＳＭＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２３４６）とＮＳＭを含む設計されたＰＳＭＡ（ｍｏｄＰＳＭＡ；配列番号３８）との間の配列アラインメントを示す。ＮＳＭ（ｈｕＰＳＭＡとｍｏｄＰＳＭＡの間で異なる残基）は、灰色で強調表示されている。ｈｕＰＳＭＡとｍｏｄＰＳＭＡの間の配列同一性は、９６．４％である。
表１３６に、ｈｕＰＳＭＡおよびｍｏｄＰＳＭＡのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＰＳＭＡ２７について、２回以上発生する４９のＮＳＭが特定され、ｍｏｄＰＳＭＡ抗原配列に含まれた。天然ＰＳＭＡと比較して、ｍｏｄＰＳＭＡには、ＮＳＭの導入により、さらに４１のネオエピトープが含まれている。
表１３７に、ヒトＷＴ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４９０）およびｍｏｄＷＴ１（配列番号８１）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＷＴ１について、２回以上発生する４６のＮＳＭが特定され、２８がｍｏｄＷＴ１抗原配列に含まれた。天然ＷＴ１と比較した場合、ｍｏｄＷＴ１には、ＮＳＭの導入により、さらに３３のネオエピトープが含まれている。
表１３８に、ヒトＦＳＨＲ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２４９２）およびｍｏｄＦＳＨＲ（配列番号９５）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＦＳＨＲについて、２回以上発生する７０のＮＳＭが特定され、２６がｍｏｄＦＳＨＲ抗原配列に含まれた。天然ＦＳＨＲと比較した場合、ｍｏｄＦＳＨＲには、ＮＳＭの導入により、さらに４７のネオエピトープが含まれている。
表１３９に、ヒトＴＥＲＴ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７０１５）およびｍｏｄＴＥＲＴ（配列番号３６）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＴＥＲＴについて、２回以上発生する７５のＮＳＭが特定され、４３がｍｏｄＴＥＲＴ抗原配列に含まれた。天然ＴＥＲＴと比較した場合、ｍｏｄＴＥＲＴには、ＮＳＭの導入により、さらに４７のネオエピトープが含まれている。
表１４０に、ＢＯＲＩＳ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１４０６９０）およびｍｏｄＢＯＲＩＳ（配列番号６０）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＢＯＲＩＳについて、２回以上発生する５１のＮＳＭが特定され、３３がｍｏｄＢＯＲＩＳ抗原配列に含まれた。天然ＢＯＲＩＳと比較した場合、ｍｏｄＢＯＲＩＳには、ＮＳＭの導入により、２７のネオエピトープが含まれている。
表１４１に、ＭＳＬＮ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０２３２）およびｍｏｄＭＳＬＮ（配列番号６２）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＭＳＬＮについて、２回以上発生する２３のＮＳＭが特定され、１３がｍｏｄＭＳＬＮ抗原配列に含まれた。天然ＭＳＬＮと比較した場合、ｍｏｄＭＳＬＮには、ＮＳＭの導入により、さらに２３のネオエピトープが含まれている。
表１４２に、ＴＢＸＴ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６８６２）およびｍｏｄＴＢＸＴ（配列番号７９）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＴＢＸＴについて、２回以上発生する４４のＮＳＭが特定され、１６がｍｏｄＴＢＸＴ抗原配列に含まれた。天然ＴＢＸＴと比較した場合、ｍｏｄＴＢＸＴには、ＮＳＭの導入により、３４のネオエピトープが含まれている。
表１４３に、ＰＲＡＭＥ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２３５３２）およびｍｏｄＰＲＡＭＥ（配列番号９９）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＰＲＡＭＥについて、２回以上発生する２７のＮＳＭが特定され、２０がｍｏｄＰＲＡＭＥ抗原配列に含まれた。天然ＰＲＡＭＥと比較した場合、ｍｏｄＰＲＡＭＥには、ＮＳＭの導入により、さらに３５のネオエピトープが含まれている。
表１４４に、ＴＤＧＦ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６９９７）およびｍｏｄＴＤＧＦ１（配列番号８９）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＴＤＧＦ１について、２回以上発生する９つのＮＳＭが特定され、７つがｍｏｄＴＤＧＦ１抗原配列に含まれた。天然ＴＤＧＦ１と比較した場合、ｍｏｄＴＤＧＦ１には、ＮＳＭの導入により、さらに１１のネオエピトープが含まれている。
表１４５に、ＦＯＬＲ１（ＦＢＰ）（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２３４８）およびｍｏｄＦＯＬＲ１（配列番号９３）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＦＯＬＲ１について、２回以上発生する１５のＮＳＭが特定され、９がｍｏｄＦＯＬＲ１抗原配列に含まれた。天然ＦＯＬＲ１と比較した場合、ｍｏｄＦＯＬＲ１には、ＮＳＭの導入により、さらに７つのネオエピトープが含まれている。
表１４７に、Ｌｙ６Ｋ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５４７４２）およびｍｏｄＬｙ６Ｋ（配列番号１１２）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。Ｌｙ６Ｋについて、２回以上発生する９つのＮＳＭが特定され、７つがｍｏｄＬｙ６Ｋ抗原配列に含まれた。天然のＬｙ６Ｋと比較した場合、ｍｏｄＬｙ６Ｋには、ＮＳＭの導入により、さらに６つのネオエピトープが含まれている。
表１４８に、ＭＡＧＥＡ１０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４１０９）およびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０（配列番号９７）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＭＡＧＥＡ１０について、２回以上発生する３８のＮＳＭが特定され、１３がｍｏｄＭＡＧＥＡ１０抗原配列に含まれた。天然ＭＡＧＥＡ１０と比較した場合、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０には、ＮＳＭの導入により、２９のネオエピトープが含まれている。
表１４９に、ＭＡＧＥＣ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１４３８）およびｍｏｄＭＡＧＥＣ２（配列番号８７）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＭＡＧＥＣ２について、２回以上発生する４５のＮＳＭが特定され、８つがｍｏｄＭＡＧＥＣ２抗原配列に含まれた。天然ＭＡＧＥＣ２と比較した場合、ｍｏｄＭＡＧＥＣ２には、ＮＳＭの導入により、さらに１４のネオエピトープが含まれている。
表１５０に、ＦＡＰ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２１９１）およびｍｏｄＦＡＰ（配列番号１１５）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＦＡＰについて、２回以上発生する５９のＮＳＭが特定され、２５がｍｏｄＦＡＰ抗原配列に含まれた。天然ＦＡＰと比較した場合、ｍｏｄＦＡＰには、ＮＳＭの導入により、さらに２２のネオエピトープが含まれている。
表１５１に、ＭＡＧＥＡ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４１００）およびｍｏｄＭＡＧＥＡ１（配列番号７３）のＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ限定エピトープをまとめている。ＭＡＧＥＡ１について、２回以上発生する１６のＮＳＭが特定され、１０がｍｏｄＭＡＧＥＡ１抗原配列に含まれた。天然ＭＡＧＥＡ１と比較した場合、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１には、ＮＳＭの導入により、さらに７つのネオエピトープが含まれている。
次の表は、ＧＢＭにおけるＴＡＡの例示的な組み合わせのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプの予測エピトープを示す。ＰＳＭＡ（配列番号７０）、ｍｏｄＰＳＭＡ（配列番号３８）、天然ＴＥＲＴ（遺伝子ＩＤ ７０１５）、ｍｏｄＴＥＲＴ（配列番号３６）、天然ＭＡＧＥＡ１（遺伝子ＩＤ ４１００）、およびｍｏｄＭＡＧＥＡ１（配列番号ＩＤ７３）は、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプで示されている。表１５３は、設計された抗原の組み合わせにより、合計８２つのネオエピトープが生成されることを示す：ｍｏｄＰＳＭＡは、４１のネオエピトープ、ｍｏｄＴＥＲＴは、３４のネオエピトープ、およびｍｏｄＭＡＧＥＡ１は、７つのネオエピトープを生成する。図１３０Ａは、人種および民族の４つの主要な米国国勢調査カテゴリーからの全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｒｏｗ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍ）データベースのドナーから入手可能な２８，０３４の高解像度ＨＬＡアレルおよびハプロタイプ頻度のデータのサブセットにおけるＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ対の頻度を示している（Ｌ Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００７））。Ｌｕｎｄｔら（２００４）によると、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプは、各民族サブグループのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂハプロタイプ対の上位２５パーセンタイルで発生するＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレル対に割り当てられた（図１３０Ｂ）。ＨＬＡ－ＡまたはＢハプロタイプのいずれかがスーパータイプに分類されなかった場合、分析に含まれなかったた（外れ値）。ＨＬＡ－ＡとＨＬＡ－Ｂの対のデータは、２０２０年３月１５日、公開されているデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ／ｈｌａ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｈｌａ－ａｌｌｅｌｅｓ－ａｎｄ－ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ－ｉｎ－ｔｈｅ－ｕｓ－ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ／）からダウンロードされた。Ｌｕｎｄｔらによると、データセットのＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ｂアレルが、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプに分類されなかった場合、データサブセットから除外された（図１３０Ｃ）。
表１５４に、例示的な一実施形態では、ワクチン組成物の細胞株に存在し、ＧＢＭにおける設計によって誘導されるネオエピトープが提供されている。
図１３１は、本明細書の実施例２９に記載の集団サブセット内でＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ対を発現するドナーによって認識される、ワクチン組成物の細胞株に存在するネオエピトープの数、およびＧＢＭにおける設計によって生成されたネオエピトープの数を示す。４つの民族の亜集団において認識されるネオエピトープの中央値は２０である。
図１３２は、４つの異なるｍＲＮＡ免疫療法の標的となるネオエピトープの数を示す。１つのｍＲＮＡ免疫療法は、合計３４のネオエピトープを標的とし、他の３つのｍＲＮＡ療法は、合計２０のネオエピトープを標的とする。ヒトは、ＨＬＡ－ＡとＨＬＡ－Ｂの２対のアレルを発現する。ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレル対のＨＬＡ－Ａ３ ＨＬＡ－Ｂ７およびＨＬＡ－Ａ１ ＨＬＡ－Ｂ－８スーパータイプを発現する例示的な患者が、ワクチンの細胞株に存在するネオエピトープおよびＧＢＭにおける設計によって生成されたネオエピトープを認識するであろうネオエピトープの数は、４３である。すべてのＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂスーパータイプ対によって、ワクチン組成物ＧＢＭに存在する２０の優先順位付けされたＴＡＡにおいて、認識されるエピトープの数は、１，５００～２，０００の範囲である。
実施例４１：臨床プロトコル
例示的な臨床プロトコルは、以下の実施例で提供される。
剤形：ワクチン組成物は、本明細書に開示される実施形態に記載されているように、６つのバイアルを含むパッケージで臨床部位に提供され、各バイアルは、治療有効量のがん細胞株（したがって、合計６つの細胞株）からの細胞を含む。細胞株のうちの３つは、カクテルＡを構成し、他の３つの細胞株は、カクテルＢを構成する。したがって、３つのカクテルＡバイアルおよび３つのカクテルＢバイアルになる。投与時、バイアルを冷凍庫から取り出し、室温で約５～約１５分間解凍する。カクテルＡバイアルのうちの２つの内容物は、針および注射器で取り出され、３番目のカクテルＡバイアルに注入される。同様に、カクテルＢバイアルのうちの２つの内容物が、針および注射器で取り出され、３番目のカクテルＢバイアルに注入される。
例示的な臨床プロトコルは、以下の実施例で提供される。
剤形：ワクチン組成物は、本明細書に開示される実施形態に記載されているように、６つのバイアルを含むパッケージで臨床部位に提供され、各バイアルは、治療有効量のがん細胞株（したがって、合計６つの細胞株）からの細胞を含む。細胞株のうちの３つは、カクテルＡを構成し、他の３つの細胞株は、カクテルＢを構成する。したがって、３つのカクテルＡバイアルおよび３つのカクテルＢバイアルになる。投与時、バイアルを冷凍庫から取り出し、室温で約５～約１５分間解凍する。カクテルＡバイアルのうちの２つの内容物は、針および注射器で取り出され、３番目のカクテルＡバイアルに注入される。同様に、カクテルＢバイアルのうちの２つの内容物が、針および注射器で取り出され、３番目のカクテルＢバイアルに注入される。
投与経路：混合後、０．３ｍＬのカクテルＡを注射器に吸引し、上腕に皮内注射として投与する。同様に、同時に、０．３ｍＬのカクテルＢを注射器に吸引し、大腿部に皮内注射として投与する。投与される用量は、各注射部位で、各細胞株が約８×１０6個（または任意選択的に、１×１０7個）、総用量が約２．４×１０7個（または任意選択的に、３×１０7個）である。複数回用量が投与され、左右の腕および左右の大腿の間で交互に投与される。本明細書に記載のように、０．３ｍＬの注射量は、０．１ｍＬで３回、または０．１５ｍＬで２回に分割され得る。
一実施形態では、カクテルＡおよびカクテルＢは、表４５、５６、６５、７４、８３、９２、１０１、１１０、１１９に記載の改変細胞株を含む。一部の実施形態によれば、臨床プロトコルは、本明細書に記載されているように、細胞株の組み合わせの他のカクテルを使用して、他の適応症のために使用することができる。
投薬レジメン：様々な実施形態では、３つのコホートは、ペムブロリズマブなどのチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）と組み合わせて、ワクチンの投与を受ける。これらのコホートでは、ＣＰＩの投与に合わせて、ワクチンが２１日サイクルで投与される。最初の４回の投与は２１日ごとに（６３日目まで）投与され、次いで、追加の３回の用量が、４２日ごとに（１８９日目まで）投与される。治療の恩恵を受け続ける患者は、追加の５回の用量を、４２日間隔で（３９９日目まで）、次いで、８４日間隔で、ＣＰＩと組み合わせて、ワクチンを継続して受けることができる。
第４のコホートでは、ワクチンは、デュルバルマブと組み合わせて投与される。ワクチンは、デュルバルマブの投与に合わせて、１４日、２１日、または２８日のサイクルで投与される。例えば、最初の３回の用量は、１４日ごとに（２８日目まで）投与され、次いで、追加の４回の用量が、４２日ごとに（１９６日目まで）投与される。治療の恩恵を受け続ける患者は、追加の５回の用量を、４２日間隔で（４０６日目まで）、次いで、８４日間隔で、デュルバルマブと組み合わせて、ワクチンを継続して受けることができる。別の実施例として、最初の３回の用量は、２８日ごとに投与される。
すべての患者は、治験薬の各投与の前に、７日間、５０ｍｇ／日（または１００ｍｇ／日）のシクロホスファミドの経口投与を受ける。
いくつかの実施形態について説明されている。それにもかかわらず、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
Claims (299)
- 治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む組成物であって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、前記組成物が、前記少なくとも５つのＴＡＡに特異的な免疫応答を誘発することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む組成物であって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも１０の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、前記組成物が、前記少なくとも１０のＴＡＡに特異的な免疫応答を誘発することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む組成物であって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも１５の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、前記組成物が、前記少なくとも１５のＴＡＡに特異的な免疫応答を誘発することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または前記細胞株の前記組み合わせが、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも１５の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または前記細胞株の前記組み合わせが、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている、組成物。
- 前記組成物が、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５倍以上のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または前記細胞株の前記組み合わせが、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんと関連する少なくとも５つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を含み、各細胞株または前記細胞株の前記組み合わせが、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている、組成物。
- 各細胞株または前記細胞株の前記組み合わせが、前記組成物を受けることが意図された前記対象のがんと関連する５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＴＡＡを発現する細胞を含む、請求項１および４～８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、２、３、４、５、または６つのがん細胞株を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
- 各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
- 各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含む、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、前記細胞株のうちの少なくとも１つが、ＣＤ２７６、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２のうちの１つ以上をノックダウンまたはノックアウトするように改変されている、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、前記少なくとも１つの免疫刺激因子が、樹状細胞の成熟を増加させる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、前記組成物が、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５倍以上のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、前記組成物が、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１．５倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、前記組成物が、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１．５倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、前記組成物が、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１．７倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、前記組成物が、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも２．０倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる、組成物。
- 治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ／あるいは（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のＴＡＡの発現を増加させるように改変されている、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 前記組成物が、未改変がん細胞株を含む組成物と比較して、少なくとも１、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、または２倍のＩＦＮγ産生の増加を刺激することができる、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
- 治療有効量の少なくとも１つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 前記組成物が、４、５、または６つのがん細胞株を含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以上のＴＡＡの発現を増加させるように改変されている細胞を含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させかつ／あるいは（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のＴＡＡの発現を増加させるように改変されている、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 治療有効量の少なくとも３つのがん細胞株を含む免疫原性組成物であって、各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ／あるいは（ｉｉｉ）ＣＴ８３、ＭＳＬＮ、ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＴＢＸＴ、ＢＯＲＩＳ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＣ２、ＷＴ１、ＦＢＰ、ＴＤＧＦ１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＬＹＫ６Ｋ、ＦＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６／Ｅ７、もしくはそれらの変異バージョンのうちの１つ以上を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含む、免疫原性組成物。
- 前記変異バージョンが、
（ｉ）ｍｏｄＴＥＲＴ、ｍｏｄＰＳＭＡ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＢＯＲＩＳ、ｍｏｄＦＳＨＲ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０、ｍｏｄＭＡＧＥＣ２、ｍｏｄＷＴ１、ｍｏｄＫＲＡＳ、ｍｏｄＦＢＰ、ｍｏｄＴＤＧＦ１、ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、ｍｏｄＬＹ６Ｋ、ｍｏｄＦＡＰ、およびｍｏｄＰＲＡＭＥからなる群から選択される変異バージョン、または
（ｉｉ）ｍｏｄＣＴ８３－ＭＳＬＮ、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｐｐ６５、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＢＯＲＩＳ、ｍｏｄＦＳＨＲ－ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＭＡＧＥＣ２、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１－ＫＲＡＳ、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＦＢＰ、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＴＤＧＦ１、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＬＹ６Ｋ、ｍｏｄＦＡＰ－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８、およびｍｏｄＰＲＡＭＥ－ｍｏｄＴＢＸＴからなる群から選択される融合タンパク質を含む、請求項３３に記載の免疫原性組成物。 - 前記変異バージョンが、
（ｉ）ｍｏｄＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（配列番号６２）、ｍｏｄＴＥＲＴ（配列番号３６）、ｍｏｄＰＳＭＡ（配列番号３８）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１（配列番号７３）、ｍｏｄＴＢＸＴ（配列番号７９）、ｍｏｄＢＯＲＩＳ（配列番号６０）、ｍｏｄＦＳＨＲ（配列番号９５）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０（配列番号９７）、ｍｏｄＭＡＧＥＣ２（配列番号８７）、ｍｏｄＷＴ１（配列番号８１）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（配列番号８３）もしくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（配列番号８５）、ｍｏｄＦＢＰ（配列番号９３）、ｍｏｄＴＤＧＦ１（配列番号８９）、ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８（配列番号１１０）、ｍｏｄＬＹＫ６Ｋ（配列番号１１２）、ｍｏｄＦＡＰ（配列番号１１５）、およびｍｏｄＰＲＡＭＥ（配列番号９９からなる群から選択される改変バージョン、または
（ｉｉ）ＣＴ８３－ＭＳＬＮ（配列番号２２）、ｍｏｄＭＡＧＥＡ１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｐｐ６５（配列番号４０）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＢＯＲＩＳ（配列番号４２）、ｍｏｄＦＳＨＲ－ｍｏｄＭＡＧＥＡ１０（配列番号４４）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＭＡＧＥＣ２（配列番号４６）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１（配列番号４８）、ｍｏｄＴＢＸＴ－ｍｏｄＷＴ１（ＫＲＡＳ）（配列番号５０）、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＦＢＰ（配列番号５２）、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＴＤＧＦ１（配列番号５４）、ｍｏｄＷＴ１－ｍｏｄＣｌａｕｄｉｎ １８（配列番号５６）、ｍｏｄＰＳＭＡ－ｍｏｄＬＹ６Ｋ（配列番号５８）、およびｍｏｄＰＲＡＭＥ－ｍｏｄＴＢＸＴ（配列番号６６）からなる群から選択される融合タンパク質を含む、請求項３４に記載の免疫原性組成物。 - 治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物であって、前記がん幹細胞株が、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている、組成物。
- 治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物であって、前記がん幹細胞株が、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている、組成物。
- 治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物であって、前記がん幹細胞株が、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）前記がん幹細胞株によって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている、組成物。
- 前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＴＢＸＴ、ＢＯＲＩＳ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＣ２、ＷＴ１、ＫＲＡＳ、ＦＢＰ、ＴＤＧＦ１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＬＹ６Ｋ、ＦＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６／Ｅ７、およびＦＡＰ、またはそれらの変異バージョンからなる群から選択される、請求項３８に記載の組成物。
- 治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物であって、前記がん幹細胞株が、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）前記がん幹細胞株によって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている、組成物。
- 治療有効量のがん幹細胞株を含む組成物であって、前記がん幹細胞株が、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）前記がん幹細胞株によって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変されている、組成物。
- 前記がん幹細胞株が、ＪＨＯＭ－２Ｂ、ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶ５６、ＪＨＯＳ－４、ＪＨＯＣ－５、ＯＶＣＡＲ－４、ＪＨＯＳ－２、ＥＦＯ－２１、ＣＦＰＡＣ－１、Ｃａｐａｎ－１、Ｐａｎｃ０２．１３、ＳＵＩＴ－２、Ｐａｎｃ０３．２７、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＲＶＨ－４２１、Ｈｓ８９５．Ｔ、Ｈｓ９４０．Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ｈｓ９３６．Ｔ、ＳＨ－４、ＣＯＬＯ８００、ＵＡＣＣ－６２、ＮＣＩ－Ｈ２０６６、ＮＣＩ－Ｈ１９６３、ＮＣＩ－Ｈ２０９、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＣＯＲ－Ｌ４７、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＮＣＩ－Ｈ１４３６、ＣＯＲ－Ｌ９５、ＣＯＲ－Ｌ２７９、ＮＣＩ－Ｈ１０４８、ＮＣＩ－Ｈ６９、ＤＭＳ５３、ＨｕＨ－６、Ｌｉ７、ＳＮＵ－１８２、ＪＨＨ－７、ＳＫ－ＨＥＰ－１、Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７、ＳＮＵ－１０６６、ＳＮＵ－１０４１、ＳＮＵ－１０７６、ＢＩＣＲ１８、ＣＡＬ－３３、ＹＤ－８、ＣＡＬ－２９、ＫＭＢＣ－２、２５３Ｊ、２５３Ｊ－ＢＶ、ＳＷ７８０、ＳＷ１７１０、ＶＭ－ＣＵＢ－１、ＢＣ－３Ｃ、ＫＮＳ－８１、ＴＭ－３１、ＮＭＣ－Ｇ１、ＧＢ－１、ＳＮＵ－２０１、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＹＫＧ－１、ＥＣＣ１０、ＲＥＲＦ－ＧＣ－１Ｂ、ＴＧＢＣ－１１－ＴＫＢ、ＳＮＵ－６２０、ＧＳＵ、ＫＥ－３９、ＨｕＧ１－Ｎ、ＮＵＧＣ－４、ＳＮＵ－１６、ＯＣＵＭ－１、Ｃ２ＢＢｅ１、Ｃａｃｏ－２、ＳＮＵ－１０３３、ＳＷ１４６３、ＣＯＬＯ ２０１、ＧＰ２ｄ、ＬｏＶｏ、ＳＷ４０３、ＣＬ－１４、ＨＣＣ２１５７、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１８０６、ＨＣＣ１５９９、ＭＤＡ－ＭＢ－４１５、ＣＡＬ－５１、ＫＯ５２、ＳＫＮＯ－１、Ｋａｓｕｍｉ－１、Ｋａｓｕｍｉ－６、ＭＨＨ－ＣＡＬＬ－３、ＭＨＨ－ＣＡＬＬ－２、ＪＶＭ－２、ＨＮＴ－３４、ＨＯＳ、ＯＵＭＳ－２７、Ｔ１－７３、Ｈｓ８７０．Ｔ、Ｈｓ７０６．Ｔ、ＳＪＳＡ－１、ＲＤ－ＥＳ、Ｕ２ＯＳ、ＳａＯＳ－２、ＳＫ－ＥＳ－１、ＭＫＮ－４５、ＨＳＣ－３、ＨＳＣ－４、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、およびＳＣＣ－９からなる群から選択される、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の組成物。
- 治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含む組成物であって、前記細胞株ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＴＧＦβ２をノックダウンし、（ｉｉ）ＣＤ２７６をノックアウトし、かつ（ｉｉｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２の発現を上方制御するように改変されている、組成物。
- 治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含む組成物であって、前記細胞株ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＴＧＦβ２をノックダウンし、（ｉｉ）ＣＤ２７６をノックアウトし、かつ（ｉｉｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を上方制御するように改変されている、組成物。
- 治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含むワクチン組成物であって、前記細胞株ＤＭＳ５３によって発現される少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する、ワクチン組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、前記細胞株のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、前記細胞株のうちの少なくとも１つが、小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３であり、かつ少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させるか、または少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させるように改変されている細胞を含む、組成物。
- 治療有効量の少なくとも２つのがん細胞株を含む組成物であって、前記少なくとも１つの細胞株が、少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞を含み、１つの細胞株が、小細胞肺癌ＤＭＳ５３細胞株である、組成物。
- 治療有効量の小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３を含む組成物であって、前記細胞株が、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている、組成物。
- 治療有効量の３つのがん細胞株を含む組成物であって、各細胞株が、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞を含み、前記細胞株のうちの１つが、小細胞肺癌細胞株ＤＭＳ５３である、組成物。
- 前記組成物が、ワクチン組成物である、請求項１～４４および４６～４９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象における免疫応答を誘発することができる、請求項４～４９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のがん細胞株を含む、請求項１～２９および３１～４９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている細胞株（複数可）を含む、請求項４、６、１３～１７、２１、２５、２６、３６～４８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるための改変を含む、請求項５、６、１３～１７、２１、２５、２６、３６～４８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のＴＡＡを発現するかまたはその発現を増加させるための改変を含む、請求項２６～３０、４０、および４１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＴＡＡのうちの１つ以上のアミノ酸配列が、変異および／またはネオエピトープを含むように改変されている、請求項５５に記載の組成物。
- 前記免疫応答が、自然免疫応答、適応免疫応答、細胞性免疫応答、および／または体液性応答である、請求項１～３および５１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫応答が、適応免疫応答である、請求項５７に記載の組成物。
- 前記適応免疫応答が、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、およびＢ細胞からなる群から選択される抗原特異的細胞の産生を含む、請求項５８に記載の組成物。
- 前記抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞が、メモリー細胞、１型ヘルパーＴ細胞、９型ヘルパーＴ細胞、１７型ヘルパーＴ細胞、２２型ヘルパーＴ細胞、および濾胞性ヘルパーＴ細胞を含む、請求項５９に記載の組成物。
- 前記抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞が、メモリー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、請求項５９に記載の組成物。
- 前記抗原特異的Ｂ細胞が、メモリー細胞、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、および免疫グロブリンＡを含む、請求項５９に記載の組成物。
- 各細胞株または前記細胞株の組み合わせが、少なくとも１０のＴＡＡを発現する、請求項１および４～６２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＴＡＡが、前記組成物を受けることが意図された対象のがんにおいても発現される、請求項６３に記載の組成物。
- 前記治療有効量が、約８×１０6細胞の各細胞株を含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療有効量が、約１×１０7細胞の各細胞株を含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療有効量が、約１．０×１０6～６．０×１０7細胞の各細胞株を含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療有効量が、ほぼ等しい数の細胞の各細胞株を含む、請求項１～６７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、遺伝的に不均一な同種、遺伝的に均一な同種、遺伝的に不均一な異種、遺伝的に均一な異種、または同種および異種の組み合わせである、請求項１～６８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、肺、前立腺、精巣、乳房、結腸、膀胱、胃腸系、脳、脊髄、尿路、結腸、直腸、胃、頭頸部、肝臓、腎臓、中枢神経系、内分泌系、中皮、卵巣、子宮内膜、膵臓、食道、神経内分泌系、子宮、または皮膚に由来する固形腫瘍の親細胞株に由来する、請求項１～６８に記載の組成物。
- 前記親細胞株が、扁平上皮細胞、癌腫細胞、腺癌細胞、腺扁平上皮細胞、大細胞性細胞、小細胞性細胞、肉腫細胞、明細胞癌細胞、癌肉腫細胞、混合中胚葉細胞、および奇形癌細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項７０に記載の組成物。
- 前記肉腫細胞が、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、中皮腫、線維肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、粘液肉腫、間葉性または混合中胚葉性を含む、請求項７１に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、非小細胞肺癌細胞株または小細胞肺癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３からなる群から選択される、請求項７３に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、小細胞肺癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ－Ｈ１９６、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＳＢＣ－５、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＮＣＩ－Ｈ１３４１、ＮＣＩＨ－１８７６、ＮＣＩ－Ｈ２０２９、ＮＣＩ－Ｈ８４１、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ１６９４からなる群から選択される、請求項７５に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、前立腺癌細胞株または精巣癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＰＣ３、ＤＵ－１４５、ＬＮＣＡＰ、ＮＥＣ８、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１からなる群から選択される、請求項７７に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、大腸癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、およびＬＳ４１１Ｎからなる群から選択される、請求項７９に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、乳癌またはトリプルネガティブ乳癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、Ｈｓ５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄからなる群から選択される、請求項８１に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、膀胱癌または尿路癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ、ＨＴ－１３７６、およびＳＣａＢＥＲからなる群から選択される、請求項８３に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、頭頸部癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＨＳＣ－４、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＫＯＮ、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＯＳＣ－２０からなる群から選択される、請求項８５に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、胃癌または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、Ｆｕ９７、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ４５、ＯＣＵＭ－１、およびＭＫＮ１からなる群から選択される、請求項８７に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、肝臓癌または肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、Ｈｅｐ－Ｇ２、ＪＨＨ－２、ＪＨＨ－４、ＪＨＨ－５、ＪＨＨ－６、Ｌｉ７、ＨＬＦ、ＨｕＨ－１、ＨｕＨ－６、およびＨｕＨ－７からなる群から選択される、請求項８９に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、神経膠芽腫がん細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０からなる群から選択される、請求項９１に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、卵巣癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＥＳ－２、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＭＣＡＳからなる群から選択される、請求項９３に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、食道癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＴＥ－１０、ＴＥ－６、ＴＥ－４、ＥＣ－ＧＩ－１０、ＯＥ３３、ＴＥ－９、ＴＴ、ＴＥ－１１、ＯＥ１９、およびＯＥ２１からなる群から選択される、請求項９５に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、腎臓癌または腎細胞癌がん細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞株が、Ａ－４９８、Ａ－７０４、７６９－Ｐ、７８６－Ｏ、ＡＣＨＮ、ＫＭＲＣ－１、ＫＭＲＣ－２、ＶＭＲＣ－ＲＣＺ、およびＶＭＲＣ－ＲＣＷからなる群から選択される、請求項９７に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、膵臓癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１１からなる群から選択される、請求項９９に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、子宮内膜癌細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＳＮＧ－Ｍ、ＨＥＣ－１－Ｂ、ＪＨＵＥＭ－３、ＲＬ９５－２、ＭＦＥ－２８０、ＭＦＥ－２９６、ＴＥＮ、ＪＨＵＥＭ－２、ＡＮ３－ＣＡ、およびＩｓｈｉｋａｗａからなる群から選択される、請求項１０１に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、皮膚癌または黒色腫がん細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＲＰＭＩ－７９５１、ＭｅＷｏ、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、ＣＯＬＯ８２９、Ｃ３２、Ａ－３７５、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ８５２Ｔ、およびＡ２０５８からなる群から選択される、請求項１０３に記載の組成物。
- 前記細胞株（複数可）が、中皮腫がん細胞株である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、ＮＣＩ－Ｈ２８、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＩＳＴ－Ｍｅｓ１、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ２０５２、ＮＣＩ－Ｈ２４５２、ＭＰＰ８９、およびＩＳＴ－Ｍｅｓ２からなる群から選択される、請求項１０５に記載の組成物。
- がん幹細胞株をさらに含む、請求項７７～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞株ＤＭＳ５３をさらに含む、請求項７７～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株のうちの１つが、他の細胞株のうちの少なくとも１つとは異なるがんの細胞株である、請求項４、５、７、８、１３～２０、２２、２３、２７～２９、３３～３５、および１０８のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも３つの細胞株が、各々、同じタイプのがんである、請求項４、５、７、８、１３～２０、２２、２３、２７～２９、３３～３５、および１０８のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも３つの細胞株が、各々、異なる細胞組織型または分子サブタイプである、請求項４、５、７、８、１３～２０、２２、２３、２７～２９、３３～３５、および１０８に記載の組成物。
- 前記細胞組織型が、扁平上皮、癌腫、腺癌、大細胞、小細胞、および肉腫からなる群から選択される、請求項１１１記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫刺激因子の発現を増加させるための前記改変が、前記少なくとも１つの免疫刺激因子をコードするレンチウイルスベクター（複数可）の使用を含む、請求項４、５、８、１３～４２、４６～４９、および５３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫刺激因子が、未改変細胞株と比較して、少なくとも２．０倍高いレベルで発現される、請求項１１３に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫刺激因子が、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、およびＩＬ－１２からなる群から選択される、請求項１１４に記載の組成物。
- 前記免疫刺激因子が、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１２である、請求項１１５に記載の組成物。
- 前記免疫刺激因子が、ＧＭ－ＣＳＦ、膜結合ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ－１５である、請求項１１５に記載の組成物。
- 前記ＧＭ－ＣＳＦが、配列番号８を含む、請求項１１６または１１７に記載の組成物。
- 前記膜結合ＣＤ４０Ｌが、配列番号３を含む、請求項１１６または１１７に記載の組成物。
- 前記ＩＬ－１２が、配列番号１０を含む、請求項１１６に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるための前記改変が、前記少なくとも１つの免疫抑制因子のノックアウトまたはノックダウンを含む、請求項５４に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫抑制因子の発現が、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、または３０％減少する、請求項１２１に記載の組成物。
- 前記改変が、ノックダウンである、請求項１２２に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるための前記改変が、前記少なくとも１つの免疫抑制因子の発現をノックダウンすること、および異なる免疫抑制因子の発現をノックアウトすることの組み合わせを含む、請求項２０、２７、２８、３２、３３、３４、３５、４１、４３、４４、および５４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫抑制因子が、ＣＤ２７６、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３からなる群から選択される、請求項１２２に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの免疫抑制因子が、ＣＤ２７６、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２からなる群から選択される、請求項１２５に記載の組成物。
- 前記免疫抑制因子が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６である、請求項１２６に記載の組成物。
- 前記免疫抑制因子が、ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６である、請求項１２６に記載の組成物。
- 前記免疫抑制因子が、ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６である、請求項１２６に記載の組成物。
- ＴＧＦβ１が、配列番号２５を含むショートヘアピンＲＮＡを使用してノックダウンされる、請求項１２５、１２６、または１２７のいずれか一項に記載の組成物。
- ＴＧＦβ２が、配列番号２４を含むショートヘアピンＲＮＡを使用してノックダウンされる、請求項１２５、１２６、１２７、または１２８のいずれか一項に記載の組成物。
- ＣＤ２７６が、配列番号２６を含むＣＤ２７６のゲノムＤＮＡ配列を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ対を使用してノックアウトされる、請求項１２５～１２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＨＬＡスーパータイプの不均一性を発現する細胞株を含み、少なくとも２つの異なるＨＬＡ－Ａおよび少なくとも２つのＨＬＡ－Ｂスーパータイプが表現される、請求項１～１３２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ０８、ＨＬＡ－Ｂ２７、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプの主要組織適合複合体分子を発現する、請求項１３３に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ２７、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプの主要組織適合複合体分子を発現する、請求項１３３に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＨＬＡ－Ａ０１、ＨＬＡ－Ａ０３、ＨＬＡ－Ｂ０７、ＨＬＡ－Ｂ０８、およびＨＬＡ－Ｂ４４スーパータイプを発現する、請求項１３３に記載の組成物。
- 前記細胞株が、遺伝的に均一な細胞株である、請求項１～１３６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞株が、遺伝的に不均一な細胞株である、請求項１～１３６のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 対象において、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つ以上の組成物を投与することを含む、方法。
- 対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つ以上の組成物を投与することを含み、前記組成物が、異なる組み合わせの細胞株を含む、方法。
- 対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物を投与することを含み、前記組成物が、各々、３つの異なる細胞株を含む、方法。
- 前記免疫応答が、抗原特異的またはワクチン特異的な免疫グロブリンＧ抗体の産生の増加を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＣＣＬ５、またはＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上の産生の増加を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が、ＩＦＮγの産生の増加を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が、グランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン、およびＣＤ１０７ａの産生の増加を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が、制御性Ｔ細胞、単核単球由来サプレッサー細胞、および多形核由来サプレッサー細胞のレベルの低下を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベル、好中球／リンパ球比（ＮＬＲ）、および血小板／リンパ球比（ＰＬＲ）の低下を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が、腫瘍微小環境における免疫浸潤の変化を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つ以上の組成物を投与することを含み、前記組成物が、異なる組み合わせの細胞株を含む、方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物を投与することを含み、前記組成物が、各々、３つの異なる細胞株を含む、方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記対象に、治療有効量の化学療法剤を投与することをさらに含む、方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の１つ以上の組成物を投与することを含み、前記対象に、治療有効量のシクロホスファミドを投与することをさらに含む、方法。
- 前記治療有効量のシクロホスファミドが、前記治療有効量の前記組成物を投与する前の１～１０日間、５０ｍｇ／日を含む、請求項１５５に記載の方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記対象に、治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、方法。
- 前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、および２Ｂ４の阻害剤からなる群から選択される、請求項１５７に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤が、ペムブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、セトレリマブ、ドスタルリマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、デュルバルマブ、およびニボルマブからなる群から選択される、請求項１５８に記載の方法。
- 前記対象に、単離された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を投与することをさらに含む、請求項１３９～１５９のいずれか一項に記載の方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記対象に、ＡＬＫ、ＰＡＲＰ、ＶＥＧＦＲｓ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１－３、ＨＩＦ１α、ＰＤＧＦＲ１－２、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－ＫＩＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＡＲ、ＰＲ、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＳＴＡＴ３、Ｒａｓ、ＨＤＡＣ１－１１、ｍＴＯＲ、およびＣＸＣＲ４の阻害剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を投与することをさらに含む、方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記対象に、治療有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記対象に、癌治療手術を施すことをさらに含む、方法。
- 対象における２つ以上のがんを同時に治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 請求項１～１３８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を調製する方法であって、
（ａ）少なくとも５、１０、１５、もしくは２０以上のＴＡＡを発現する１つ以上のがん細胞株を選択するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記１つ以上のがん細胞株の各々を改変するステップであって、前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ／あるいは（ｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡの発現を増加させるように改変されている細胞を含む、改変するステップと、を含む、方法。 - 前記細胞株または前記細胞株の組み合わせが、少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるようにさらに改変されている細胞を含む、請求項１６５に記載の方法。
- 前記改変するステップが、１つ以上のベクターを、前記細胞株のうちの１つ以上に導入することを含む、請求項１６５に記載の方法。
- 前記１つ以上のベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１６７に記載の方法。
- 前記改変された細胞株を異種不含培地に適合させるステップをさらに含む、請求項１６６に記載の方法。
- 前記細胞株を照射するステップをさらに含む、請求項１６６に記載の方法。
- 前記細胞を凍結保存培地に適合させるステップをさらに含む、請求項１６６に記載の方法。
- 前記組成物（複数可）が、非経口、経腸、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、節内、鼻腔内、経皮、吸入、粘膜、および局所からなる群から選択される投与経路によって、前記対象に投与される、請求項１３９～１６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記経路が、皮内である、請求項１７２に記載の方法。
- 前記組成物（複数可）が、腕（複数可）、大腿（複数可）、および背中からなる群から選択される前記対象の投与部位に投与される、請求項１３９～１６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、前記対象の異なる投与部位に皮内投与される、請求項１４１～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、前記投与部位の表面から５～１５度の角度で配置された注射器を用いる注射によって皮内投与される、請求項１７４に記載の方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の１つ以上の組成物の第１の用量および治療有効量のその後の用量を投与することを含み、前記１つ以上の組成物が、１年目に１～２４回、２年目に１～１６回、３年目に１～１４回投与される、方法。
- 対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物の第１の用量を投与することを含み、前記第１の用量が、６３日目まで２１日ごとに４回投与され、次いで、追加の用量が、１８９日目まで４２日ごとに３回投与される、方法。
- 追加の用量を、３９９日目まで４２日間隔で５回投与し、次いで、その後、８４日間隔で少なくとも２回投与することをさらに含む、請求項１７８に記載の方法。
- 対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物の第１の用量およびその後の用量を投与することを含み、前記第１の用量が、４２日目まで１４日ごとに４回投与され、次いで、追加の用量が、１６８日目まで４２日ごとに３回投与される、方法。
- 前記対象に、追加の用量を、３７８日目まで４２日間隔で５回投与し、次いで、その後、８４日間隔で少なくとも２回投与することをさらに含む、請求項１８０に記載の方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の２つの組成物を投与することを含み、各組成物が、（ｉ）少なくとも１つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも１つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させるように改変された少なくとも２つのがん細胞株を含み、一方の組成物が、前記対象の上半身に投与され、他方の組成物が、前記対象の下半身に投与される、方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の２つの組成物の第１の用量およびその後の用量を投与することを含み、各組成物が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌのうちの１つ以上を発現するかまたはその発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６のうちの１つ以上の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡの発現を増加させるように改変された少なくとも２つのがん細胞株を含み、一方の組成物が、前記対象の上半身に投与され、他方の組成物が、前記対象の下半身に投与される、方法。
- 前記対象に、１つ以上の治療剤または治療を投与することをさらに含む、請求項１７７～１８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、他のワクチンまたは治療剤による治療を控える、請求項１７７～１８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療剤または治療が、放射線療法、化学療法、手術、小分子阻害剤、およびチェックポイント阻害剤からなる群から選択される、請求項１８４に記載の方法。
- 前記治療剤が、シクロホスファミドである、請求項１８４に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、および２Ｂ４の阻害剤からなる群から選択される、請求項１８６に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤が、ペムブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、セトレリマブ、ドスタルリマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、デュルバルマブ、またはニボルマブである、請求項１８８に記載の方法。
- 前記１つ以上の治療剤または治療が、前記第１の用量および／または前記その後の用量を少なくとも１回投与する前に、投与される、請求項１８４に記載の方法。
- 前記１つ以上の治療剤または治療が、前記組成物の各投与の前、同時、または後に投与される、請求項１８４に記載の方法。
- 第１の治療剤が、前記第１の用量の前に投与され、第２の治療剤が、前記第１の用量および前記その後の用量と同時に投与される、請求項１８４に記載の方法。
- 対象における免疫応答を刺激する方法であって、
ａ．前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物の第１の用量を投与することであって、前記２つの組成物が、異なる部位で同時に投与される、第１の用量を投与すること、および前記第１の用量を投与した後、前記対象に、前記２つの組成物のその後の用量を投与することであって、前記２つの組成物が、異なる部位で同時に投与される、その後の用量を投与することと、
ｂ．任意選択的に、（ａ）の前記第１の用量を投与する前の１～１０日間、および任意選択的に、（ａ）の前記その後の用量を投与する前の１～１０日間、前記対象に、治療有効量のシクロホスファミドを投与することと、
ｃ．任意選択的に、（ｉ）（ａ）の各用量と同時に、または（ｉｉ）（ａ）の前記第１の用量に続いて、１、２、３、もしくは４週間ごとに、前記対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む、方法。 - 対象におけるがんを治療する方法であって、
ａ．前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物の第１の用量を投与すること、および前記第１の用量を投与した後、前記対象に、前記２つの組成物のその後の用量を投与することであって、前記２つの組成物が、異なる部位で同時に投与される、投与することと、
ｂ．任意選択的に、（ａ）の前記第１の用量を投与する前の１～１０日間、および任意選択的に、（ａ）の前記その後の用量を投与する前の１～１０日間、前記対象に、シクロホスファミドを投与することと、
ｃ．任意選択的に、（ｉ）（ａ）の各用量と同時に、または（ｉｉ）（ａ）の前記第１の用量に続いて、１、２、３、もしくは４週間ごとに、前記対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む、方法。 - 対象におけるがんを治療する方法であって、
ａ．前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物の第１の用量を投与すること、および前記第１の用量を投与した後、前記対象に、前記２つの組成物のその後の用量を投与することであって、前記２つの組成物が、異なる部位で同時に投与され、前記その後の用量が、前記第１の用量の投与の３、６、９、１５、２１、および２７週間後に投与される、投与することと、
ｂ．（ａ）の前記第１の用量および前記その後の用量を投与する前の７日間、毎日、前記対象に、シクロホスファミドを投与することと、
ｃ．（ａ）の前記第１の用量の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７週間後に、前記対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む、方法。 - シクロホスファミドが、経口投与され、前記チェックポイント阻害剤が、ペムブロリズマブであり、静脈内投与される、請求項１９５に記載の方法。
- シクロホスファミドが、５０ｍｇの投与量で経口投与され、前記チェックポイント阻害剤が、ペムブロリズマブであり、２００ｍｇの投与量で静脈内投与される、請求項１９５に記載の方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、
ａ．前記対象に、治療有効量の請求項１～１３８のいずれか一項に記載の２つの組成物の第１の用量を投与すること、および前記第１の用量を投与した後、前記対象に、前記２つの組成物のその後の用量を投与することであって、前記２つの組成物が、異なる部位で同時に投与され、前記その後の用量が、前記第１の用量の投与の２、４、６、１２、１８、および２４週間後に投与される、投与することと、
ｂ．（ａ）の前記第１の用量および前記その後の用量を投与する前の７日間、毎日、前記対象に、シクロホスファミドを投与することと、
ｃ．（ａ）の前記第１の用量の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、および３０週間後に、前記対象に、チェックポイント阻害剤を投与することと、を含む、方法。 - シクロホスファミドが、５０ｍｇの投与量で経口投与され、前記チェックポイント阻害剤が、デュルバルマブであり、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与される、請求項１９８に記載の方法。
- 前記組成物の投与前の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間、および前記組成物の投与後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間、カンナビノイドの投与を控えるステップをさらに含む、請求項１７７～１９９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、肺癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、神経膠腫、子宮内膜癌、卵巣癌、膵臓癌、黒色腫、および中皮腫からなる群から選択されるがんに罹患している、請求項１５１～２００のいずれか一項に記載の方法。
- 前記肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記肺癌が、小細胞肺癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、前立腺癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、乳癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記乳癌が、トリプルネガティブ乳癌である、請求項２０５に記載の方法。
- 前記がんが、食道癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、大腸癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、膀胱癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、胃癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、頭頸部癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、肝臓癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、腎臓癌である、請求項２０１記載の方法。
- 前記がんが、神経膠腫である、請求項２０１記載の方法。
- 前記がんが、神経膠肉腫である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記神経膠腫が、星状細胞腫である、請求項２１４に記載の方法。
- 前記星状細胞腫が、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）である、請求項２１６に記載の方法。
- 前記がんが、子宮内膜癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、卵巣癌である、請求項２０１記載の方法。
- 前記がんが、膵臓癌である、請求項２０１に記載の方法。
- 前記がんが、黒色腫である、請求項２０１記載の方法。
- 前記がんが、中皮腫である、請求項２０１に記載の方法。
- 請求項１～１３８のいずれか一項に記載の１つ以上の組成物を含むキット。
- 少なくとも１つのバイアルを含むキットであって、前記バイアルが、請求項１～１３８のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
- 第１のバイアルに第１のワクチン組成物を含み、第２のバイアルに第２のワクチン組成物を含む、キットであって、前記第１および第２のワクチン組成物が、各々、少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させるように改変されている少なくとも２つのがん細胞株を含む、キット。
- ６つのバイアルを含むキットであって、前記バイアルが、各々、がん細胞株を含む組成物を含み、前記６つのバイアルのうちの少なくとも４つが、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ／あるいは（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させ、かつ／あるいは（ｉｉｉ）１つの細胞株もしくは前記細胞株の前記組み合わせによって発現されないかまたは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡの発現を増加させるように改変されているがん細胞株を含み、前記バイアルのうちの少なくとも４つが、異なる組成物を含む、キット。
- 使用説明書をさらに含む、請求項２２３～２２６のいずれか一項に記載のキット。
- がんの治療に使用される、請求項２２３～２２６のいずれか一項に記載のキット。
- がんを治療するための薬剤の単位用量であって、異なるがん細胞株の６つの組成物を含み、少なくとも４つの組成物が、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかまたはその発現を増加させ、かつ（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかまたは減少させるように改変されている細胞株を含む、単位用量。
- 前記細胞株が、以下を含む、
（ａ）非小細胞肺癌細胞株および／もしくは小細胞肺癌細胞株（ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３からなる群から選択される）、
（ｂ）ＤＭＳ５３および５つの小細胞肺癌細胞株（ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ－Ｈ１９６、ＮＣＩ－Ｈ１０９２、ＳＢＣ－５、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ８８９、ＮＣＩ－Ｈ１３４１、ＮＣＩＨ－１８７６、ＮＣＩ－Ｈ２０２９、ＮＣＩ－Ｈ８４１、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ－Ｈ１６９４からなる群から選択される）、
（ｃ）ＤＭＳ５３および前立腺癌細胞株もしくは精巣癌細胞株（ＰＣ３、ＤＵ－１４５、ＬＮＣＡＰ、ＮＥＣ８、およびＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１）、
（ｄ）ＤＭＳ５３および大腸癌細胞株（ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、およびＬＳ４１１Ｎ）、
（ｅ）ＤＭＳ５３および乳癌もしくはトリプルネガティブ乳癌細胞株（Ｈｓ５７８Ｔ、ＡＵ５６５、ＣＡＭＡ－１、ＭＣＦ－７、およびＴ－４７Ｄ）、
（ｆ）ＤＭＳ５３および膀胱癌もしくは尿路癌細胞株（ＵＭ－ＵＣ－３、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ、ＨＴ－１３７６、およびＳＣａＢＥＲ）、
（ｇ）ＤＭＳ５３および頭頸部癌細胞株（ＨＳＣ－４、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＫＯＮ、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＯＳＣ－２０）、
（ｈ）ＤＭＳ５３および胃癌もしくは胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）細胞株（Ｆｕ９７、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ４５、ＯＣＵＭ－１、およびＭＫＮ１）、
（ｉ）ＤＭＳ５３および５つの肝臓癌もしくは肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株（Ｈｅｐ－Ｇ２、ＪＨＨ－２、ＪＨＨ－４、ＪＨＨ－５、ＪＨＨ－６、Ｌｉ７、ＨＬＦ、ＨｕＨ－１、ＨｕＨ－６、およびＨｕＨ－７からなる群から選択される）、
（ｊ）ＤＭＳ５３および神経膠芽腫がん細胞株（ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＬＮ－２２９、ＳＦ－１２６、ＧＢ－１、およびＫＮＳ－６０）、
（ｋ）ＤＭＳ５３および卵巣癌細胞株（ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＥＳ－２、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＴＯＫＯ、およびＭＣＡＳからなる群から選択される）、
（ｌ）ＤＭＳ５３および５つの食道癌細胞株（ＴＥ－１０、ＴＥ－６、ＴＥ－４、ＥＣ－ＧＩ－１０、ＯＥ３３、ＴＥ－９、ＴＴ、ＴＥ－１１、ＯＥ１９、およびＯＥ２１からなる群から選択される）、
（ｍ）ＤＭＳ５３および５つの腎臓癌もしくは腎細胞癌がん細胞株（Ａ－４９８、Ａ－７０４、７６９－Ｐ、７８６－Ｏ、ＡＣＨＮ、ＫＭＲＣ－１、ＫＭＲＣ－２、ＶＭＲＣ－ＲＣＺ、およびＶＭＲＣ－ＲＣＷからなる群から選択される）、
（ｎ）ＤＭＳ５３および膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ－１、ＫＰ－３、ＫＰ－４、ＳＵＩＴ－２、およびＰＳＮ１１）、
（ｏ）ＤＭＳ５３および５つの子宮内膜癌細胞株（ＳＮＧ－Ｍ、ＨＥＣ－１－Ｂ、ＪＨＵＥＭ－３、ＲＬ９５－２、ＭＦＥ－２８０、ＭＦＥ－２９６、ＴＥＮ、ＪＨＵＥＭ－２、ＡＮ３－ＣＡ、およびＩｓｈｉｋａｗａからなる群から選択される）、
（ｐ）ＤＭＳ５３および５つの皮膚癌もしくは黒色腫がん細胞株（ＲＰＭＩ－７９５１、ＭｅＷｏ、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、ＣＯＬＯ８２９、Ｃ３２、Ａ－３７５、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ８５２Ｔ、およびＡ２０５８からなる群から選択される）、または
（ｑ）ＤＭＳ５３および５つの中皮腫がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ２８、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＩＳＴ－Ｍｅｓ１、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ２０５２、ＮＣＩ－Ｈ２４５２、ＭＰＰ８９、およびＩＳＴ－Ｍｅｓ２からなる群から選択される）、請求項２２９に記載の単位用量。 - がんを治療するための薬剤の単位用量であって、異なるがん細胞株の６つの組成物を含み、各細胞株が、（ｉ）少なくとも２つの免疫刺激因子を発現するかもしくはその発現を増加させ、（ｉｉ）少なくとも２つの免疫抑制因子の発現を阻害するかもしくは減少させ、かつ／または（ｉｉｉ）前記がん細胞株によって発現されないかもしくは最小限に発現されるかのいずれかである少なくとも１つのＴＡＡを発現するかもしくはその発現を増加させるように改変されている、単位用量。
- 各々３つの細胞株を含む２つの組成物が混合される、請求項２２９～２３１のいずれか一項に記載の単位用量。
- ワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、およびＡ５４９を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
前記治療有効量が、各細胞株について、約１．０×１０7細胞または約６×１０7細胞である、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、
（ａ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｃ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、
（ａ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｃ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、前記治療有効量が、各細胞株について、約１．０×１０7細胞または約６×１０7細胞である、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、およびＳＦ－１２６を含み、
（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶｐｐ６５を発現するように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、およびＨｕＴｕ－８０を含み、
（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、
（ｂ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１を含み、
（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、
（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰを含み、
（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｂ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄを含み、
（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｂ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、およびＤＥＴＲＯＩＴ５６２を含み、
（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、
（ｂ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４を含み、
（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、
（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、
（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、およびＨＳ－５７８Ｔを含み、
（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - ワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｃ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、ワクチン組成物。 - 前記治療有効量が、各細胞株について、約１．０×１０7細胞または約６×１０7細胞である、請求項２３７～２５１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
- 組成物であって、第１のカクテルおよび第２のカクテルを含み、前記第１のカクテルが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変された、治療有効量の少なくとも２つの照射がん細胞株を含み、
前記第２のカクテルが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変された細胞株ＤＭＳ５３を含む、組成物。 - 前記第１のカクテルおよび／または前記第２のカクテルが、ＣＴ８３、ＭＳＬＮ、ＴＥＲＴ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＴＢＸＴ、ＢＯＲＩＳ、ＦＳＨＲ、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＣ２、ＷＴ１、ＫＲＡＳ、ＦＢＰ、ＴＤＧＦ１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８、ＬＹＫ６Ｋ、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ１６／１８Ｅ６／Ｅ７、もしくはそれらの変異バージョンを発現するかまたはその発現を増加させるように改変された１つ以上の細胞株を含む、請求項２５４に記載の組成物。
- ヒト対象における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における神経膠芽腫と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６を含み、
（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における神経膠芽腫を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６を含み、
（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における大腸癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、およびＨｕＴｕ－８０を含み、
（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における大腸癌を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、およびＨｕＴｕ－８０を含み、
（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における前立腺癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１を含み、
（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、
（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における前立腺癌を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１を含み、
（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、
（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における膀胱癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰを含み、
（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における膀胱癌を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、およびＴＣＣＳＵＰを含み、
（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における卵巣癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄを含み、
（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における卵巣癌を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄを含み、
（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における頭頸部癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２を含み、
（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、
（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における頭頸部癌を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２を含み、
（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、
（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における胃癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４を含み、
（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、
（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における胃癌を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、およびＭＫＮ－７４を含み、
（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、
（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における乳癌と関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象における乳癌を治療する方法であって、（ｉ）治療有効量の第１のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、およびＨＳ－５７８Ｔを含み、
（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第１のワクチン組成物と、
（ｉｉ）治療有効量の第２のワクチン組成物であって、治療有効量のがん細胞株ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、第２のワクチン組成物と、を投与することを含み、
前記第１のワクチン組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２のワクチン組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象におけるＮＳＣＬＣと関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、
ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、
ｂ．（ａ）の前記１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、前記第１の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
第２の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させるように改変されている、第１の用量をさらに投与することと、
ｃ．（ａ）の前記１週間後、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、
ｄ．（ｂ）の前記第１の用量の投与の３、６、９、１５、２１、および２７週間後に、前記第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、
ｅ．（ｃ）の前記第１の用量の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７週間後に、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む前記組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、
前記第１の組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２の組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象におけるがんと関連する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答を刺激する方法であって、
ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、
ｂ．（ａ）の前記１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、前記第１の組成物が、請求項２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、または２６０に記載の組成物からなる群から選択され、
前記第２の組成物が、請求項２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、または２６１に記載の組成物からなる群から選択される、第１の用量をさらに投与することと、
ｃ．（ａ）の前記１週間後、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、
ｄ．（ｂ）の前記第１の用量の投与の３、６、９、１５、２１、および２７週間後に、前記第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、
ｅ．（ｃ）の前記第１の用量の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７週間後に、ペムブロリズマブを２００ｍｇの投与量で含む前記組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、
前記第１の組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２の組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象におけるＮＳＣＬＣと関連するＴＡＡに特異的な免疫応答を刺激する方法であって、
ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、
ｂ．（ａ）の前記１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、前記第１の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２０、およびＡ５４９を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
第２の組成物が、治療有効量の肺癌細胞株ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させるように改変されている、第１の用量をさらに投与することと、
ｃ．（ａ）の前記１週間後、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、
ｄ．（ｂ）の前記第１の用量の投与の２、４、１０、１６、２２、および２８週間後に、前記第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、
ｅ．（ｃ）の前記第１の用量の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、および３０週間後に、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む前記組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、
前記第１の組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２の組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ヒト対象におけるＮＳＣＬＣと関連するＴＡＡに特異的な免疫応答を刺激する方法であって、
ａ．シクロホスファミドを５０ｍｇ／日の用量で１週間毎日経口投与することと、
ｂ．（ａ）の前記１週間後、第１の組成物および第２の組成物を含むワクチンの第１の用量をさらに投与することであって、前記第１の組成物が、請求項２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、または２６０に記載の組成物からなる群から選択され、
前記第２の組成物が、請求項２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、または２６１に記載の組成物からなる群から選択される、第１の用量をさらに投与することと、
ｃ．（ａ）の前記１週間後、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む組成物の第１の用量を注射によりさらに投与することと、
ｄ．（ｂ）の前記第１の用量の投与の２、４、１０、１６、２２、および２８週間後に、前記第１の組成物および第２の組成物のその後の用量をさらに投与することであって、各その後の用量に至るまで、５０ｍｇのシクロホスファミドを７日間経口投与する、その後の用量をさらに投与することと、
ｅ．（ｃ）の前記第１の用量の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、および３０週間後に、デュルバルマブを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で含む前記組成物のその後の用量をさらに静脈内投与することと、を含み、
前記第１の組成物が、前記対象の腕に皮内投与され、前記第２の組成物が、前記対象の大腿に皮内投与される、方法。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３の細胞を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、
（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、
（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、
（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、
（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、
（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、
（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変され、
（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、
（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、
（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３の細胞をほぼ含み、
（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、
（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つのバイアルを含むキットであって、各バイアルが、がん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３の細胞を含み、
（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、キット。 - ６つの組成物を含む肺癌ワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞の肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩＨ５２０、Ａ５４９、ＤＭＳ５３、ＬＫ－２、およびＮＣＩ－Ｈ２３を含み、
（ａ）ＮＣＩ－Ｈ４６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＮＣＩ－Ｈ５２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）Ａ５４９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＬＫ－２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＭＳＬＮおよびＣＴ８３を発現するように改変され、
（ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＬＮ－２２９、ＧＢ－１、ＳＦ－１２６、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ、ＫＮＳ６０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＬＮ－２２９が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＧＢ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＳＦ－１２６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄｈＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｄ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＫＮＳ６０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＭＡＧＥＡ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびｈＣＭＶ ｐｐ６５を発現するように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＨＣＴ－１５、ＲＫＯ、ＨｕＴｕ－８０、ＨＣＴ－１１６、ＬＳ４１１Ｎ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＨＣＴ－１５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＲＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＨｕＴｕ－８０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｄ）ＨＣＴ－１１６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴ、ｍｏｄＷＴ１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＳ４１１Ｎが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＰＣ３、ＮＥＣ８、ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１、ＤＵ－１４５、ＬＮＣａＰ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＰＣ３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＭＡＧＥＣ２を発現するように改変され、
（ｂ）ＮＥＣ８が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＮＴＥＲＡ－２ｃｌ－Ｄ１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＤＵ－１４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｅ）ＬＮＣａＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株Ｊ８２、ＨＴ－１３７６、ＴＣＣＳＵＰ、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ－ＵＣ－３、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）Ｊ８２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＴ－１３７６が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＴＣＣＳＵＰが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＳＣａＢＥＲが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＵＭ－ＵＣ－３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＯＶＴＯＫＯ、ＭＣＡＳ、ＴＯＶ－１１２Ｄ、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＥＳ－２、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＯＶＴＯＫＯが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｂ）ＭＣＡＳが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＴＯＶ－１１２Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＦＳＨＲおよびｍｏｄＭＡＧＥＡ１０を発現するように改変され、
（ｄ）ＴＯＶ－２１Ｇが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＦＯＬＲ１を発現するように改変され、
（ｅ）ＥＳ２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＨＳＣ－４、ＨＯ－１－Ｎ－１、ＤＥＴＲＯＩＴ５６２、ＫＯＮ、ＯＳＣ－２０、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＨＳＣ－４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＨＯ－１－Ｎ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＲＡＭＥおよびｍｏｄＴＢＸＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＤＥＴＲＯＩＴ５６２が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＫＯＮが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７を発現するように改変され、
（ｅ）ＯＳＣ－２０が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－４５、ＭＫＮ－７４、ＯＣＵＭ－１、Ｆｕ９７、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＭＫＮ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡおよびｍｏｄＬＹＫ６を発現するように改変され、
（ｂ）ＭＫＮ－４５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｃ）ＭＫＮ－７４が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＯＣＵＭ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｆｕ９７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ１およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＷＴ１およびｍｏｄＣＬＤＮ１８を発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ６つの組成物を含むがんワクチンの単位用量であって、各組成物が、約１．０×１０7細胞のがん細胞株ＣＡＭＡ－１、ＡＵ５６５、ＨＳ－５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ、およびＤＭＳ５３を含み、
（ａ）ＣＡＭＡ－１が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＰＳＭＡを発現するように改変され、
（ｂ）ＡＵ５６５が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＥＲＴを発現するように改変され、
（ｃ）ＨＳ－５７８Ｔが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｄ）ＭＣＦ－７が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変され、
（ｅ）Ｔ４７Ｄが、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、および膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、（ｉｉ）ＣＤ２７６の発現を減少させ、かつ（ｉｉｉ）ｍｏｄＴＢＸＴおよびｍｏｄＢＯＲＩＳを発現するように改変され、
（ｆ）ＤＭＳ５３が、（ｉ）ＧＭ－ＣＳＦおよび膜結合ＣＤ４０Ｌの発現を増加させ、かつ（ｉｉ）ＴＧＦβ２およびＣＤ２７６の発現を減少させるように改変されている、単位用量。 - ＤＭＳ５３が、ＩＬ－１２の発現を増加させるようにさらに改変されている、請求項２３５、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、または２５２のいずれか一項に記載の組成物。
- ＤＭＳ５３が、ＩＬ－１２の発現を増加させるようにさらに改変されている、請求項２８７～２９５のいずれか一項に記載の単位用量。
- ＤＭＳ５３が、ＩＬ－１２の発現を増加させるようにさらに改変されている、請求項２７８～２８６のいずれか一項に記載のキット。
- ＤＭＳ５３が、ＩＬ－１２の発現を増加させるようにさらに改変されている、請求項２５６～２７７のいずれか一項に記載の方法。
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