KR20230074195A - 조혈 세포 이식 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 mdm2 억제제 - Google Patents

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로베르트 차이저
유스투스 두이스터
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Abstract

본 발명은 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 마우스 이중 미세염색체 2 (MDM2) 억제제에 관한 것이다. 실시양태에서, 혈액학적 신생물은 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 (AML)이다. 바람직하게는, 환자는 HCT와 함께 및/또는 HCT 후에, 예컨대 MDM2 투여 시점에서 동종이계 T 세포 이식을 받았다. 더욱이, 본 발명은 선행 청구항 중 어느 한 항에 따라 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 MDM2 억제제 및 엑스포틴 1 (XPO-1) 억제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

Description

조혈 세포 이식 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 MDM2 억제제
본 발명은 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 마우스 이중 미세염색체(mouse double minute) 2 (MDM2) 억제제에 관한 것이다. 실시양태에서, 혈액학적 신생물은 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 (AML)이다. 바람직하게는, 환자는 HCT와 함께 및/또는 HCT 후에, 예컨대 MDM2 투여 시점에서 동종이계 T 세포 이식을 받았다. 더욱이, 본 발명은 선행 청구항 중 어느 한 항에 따른 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 MDM2 억제제 및 엑스포틴 1 (XPO-1) 억제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
급성 골수성 백혈병 (AML) 재발은 동종이계 조혈 세포 이식 (allo-HCT) 후에 이식 후 100일 후의 사망의 주요 원인이다 (1). 재발을 촉진하는 주요 메커니즘은 특히 MHC 클래스 II (MHC-II)의 하향조절 (2,3), 미스매치 HLA4의 손실, 면역 체크포인트 리간드의 상향조절 (3), 및 감소된 IL-15 생산 (5) 및 백혈병-유래 락트산 방출 (6)을 포함한다 (7에서 검토됨). TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL) 수용체 1 및 2를 포함한 아폽토시스 촉진성(pro-apoptotic) 유전자의 하향조절은 AML의 치료-내성 및 재발과 연결되어 있는 것으로 나타났다 (8). 이들 데이터는 MHC-II 또는 TRAIL-R1/2 발현을 증가시키는 접근법이 allo-HCT 후에 AML 재발을 치료하는데 성공적일 수 있음을 시사한다.
AML 재발에 대한 현재 약리학적 접근법은 다른 FLT3 키나제 억제제 외에도, 면역 체크포인트 억제제, 탈메틸화제, bcl-2 억제제 등을 포함한다 (9에서 검토됨). 마우스 이중 미세염색체-2 (MDM2) 억제제 (10,11)는 AML에서 p53-의존성 아폽토시스를 유도할 수 있지만, allo-HCT 설정 후 상기 억제제의 역할은 지금까지 평가되지 않았다.
종래 기술에 비추어 백혈병 또는 림프종 재발 그리고 특히 HCT 후에 AML 재발을 치료하기 위한 추가적인 및/또는 개선된 수단을 제공하기 위한 유의한 필요성이 관련 기술분야에 남아있다. 특히, 이러한 치료는 백혈병 세포에서 MHC-II 또는 TRAIL-R1/2 발현을 증가시키는 화합물을 포괄할 수 있을 것이다. 그러나, 이러한 화합물은 현재까지 이용가능하지 않으며, 이러한 화합물을 제공할 필요성이 남아있다.
종래 기술에 비추어 본 발명의 근본적인 기술적 문제는 백혈병 또는 림프종 재발 그리고 특히 HCT 후에 AML 재발을 치료하기 위한 대안적 및/또는 개선된 수단을 제공하는 것이다. 이러한 수단은 백혈병 세포에서 MHC-II 또는 TRAIL-R1/2 발현의 상향조절을 매개하거나 발현을 유지하기에 적합한 화합물, 분자 및/또는 조성물을 포함하여야 한다.
이 문제는 독립 청구항의 특징에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 종속 청구항에 의해 제공된다.
따라서 본 발명은 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 마우스 이중 미세염색체 2 (MDM2) 억제제에 관한 것이다. MDM2 억제제는 HCT의 투여 전에 및/또는 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 (바람직하게는 HCT 후에) 투여될 수 있다.
본 발명은 HCT 후에 혈액학적 신생물을 앓고 있는 환자에서 암 세포의 재발이 MDM2 억제제의 투여에 의해 특이적으로 치료되거나 예방될 수 있다는 완전히 놀라운 연구결과를 기반으로 한다. 본 발명은 MDM2의 억제가 암 세포, 예컨대 백혈병 세포 또는 AML 세포에서 MHC-I 및 MHC-II 분자, 뿐만 아니라 TRAIL-수용체의 상향조절을 발생시킨다는 예상치 못한 발견으로 거슬러 올라간다. 이는 HCT로 및/또는 동종이계 T 세포의 별도 이식 (동종이계 공여자 림프구 주입; DLI)으로 환자에게 도입된 동종이계 T 세포에 의해 환자의 암 세포의 인식의 거대한 증강을 발생시킨다. 환언하면, MDM2 억제제에 대한 노출은 환자의 암 세포를 면역학적으로 "가시적"이 되도록 하거나 면역학적 "가시성"을 강력하게 증강시켜, 이식된 동종이계 T 세포가 이제 암 세포를 인식하고 공격할 수 있도록 한다.
MDM2 단백질은 p53의 N-말단 트랜스-활성화 도메인을 인식하는 유비퀴틴 리가제로서 및 p53 전사 활성화의 억제제로서 기능한다. 종양원성 Ras와 협력하여 Mdm2 과발현은 1차 설치류 섬유모세포의 형질전환을 촉진하고, MDM2 억제는 p53 활성을 증가시킬 수 있다 (11). MDM2 효과는 p53 단백질 수준을 감소시킴으로써, 종양 세포에서 신생 돌연변이의 축적을 촉진하여 상기 세포들의 악성 가능성을 증강시키는 것이다. p53은, 그의 항종양원성 효과 외에도, 특정 면역-관련 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 놀랍게도, 유사한 메커니즘이 혈액학적 신생물의 암 세포에서, 그리고 특히 AML 세포에서 작동성이라는 점, 즉 HLA-클래스 II 분자 및 TRAIL-수용체의 상향조절이 그들을 allo-HCT 후에 동종반응성 공여자 T 세포 반응에 대해 더 감수성이 되도록 한다는 점이 밝혀졌다.
MDM2 억제가 백혈병 및 림프종 세포, 예컨대 일차 인간 AML 세포 및 AML 세포주에서 TRAIL-R1/2 발현을 유발한다는 것은 완전히 예상치 못한 일이었다. TRAIL 라이게이션시, TRAIL 사멸 수용체는 그들의 세포내 사멸 도메인 (DD)에서, 사멸 도메인을 가진 FAS-연관 단백질 (FADD) 및 프로-카스파제-8/10으로 구성된 사멸-유도-신호전달-복합체 (DISC)를 어셈블리한다 (17). TRAIL-R 활성화는 항종양 활성을 갖는 것으로 나타났다 (18).
더욱이, 본원에서는 MDM2 억제가 일차 백혈병 및 림프종 세포 상에서, 특히 인간 AML 세포 상에서 MHC-II 발현을 또한 증가시켰으며, 이는 allo-HCT 후에 AML 재발에서 관찰된 MHC-II 감소를 역전시키기 위한 약리학적 개입을 제공할 수 있음을 밝혀냈다 (2, 3).
실시양태에서, 혈액학적 신생물은 백혈병, 림프종 및 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 혈액학적 신생물은 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 (AML)이다.
실시양태에서, 혈액학적 신생물은 신생물성 세포에서 MDM2 및/또는 MDM4 발현을 유도하는, 종양원성 돌연변이와 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 놀랍게도, 특정 돌연변이는 MDM2 및/또는 MDM4를 유도하며, 이는 이러한 신생물성 암 세포를 MDM2 억제제 치료에 특히 감수성이 되도록 한다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 MDM2 및/또는 MDM4 유도 돌연변이를 포함하는 혈액학적 신생물은 AML이다. MDM2 및/또는 MDM4 유도 돌연변이는, 예를 들어, 염색체 전좌를 통해 형성될 수 있는 점 돌연변이 또는 융합 유전자일 수 있다.
MDM2 및/또는 MDM4 유도 돌연변이는, 제한 없이, cKit-D816V, FIP1L-PDGFR-α, FLT3-ITD, 및 JAK2-V617F를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 MDM2 및/또는 MDM4 유도 돌연변이는 예를 들어 본원에 기재된 기술을 사용함으로써 확인할 수 있다.
cKit-D816V는 특히 급성 골수성 백혈병 (AML)에서, 그러나 또한 전신성 비만세포증 및 생식 세포 종양에서 악성 세포 성장에 연루되는 Kit 유전자의 코돈 816의 활성화 돌연변이이며, 이는 아스파르트산의 발린으로의 치환 (D816V)을 특징으로 하며 이는 수용체를 활성화 및 신호전달을 위해 리간드와 독립적이 되도록 만든다.
FIP1L1-PDGFRα 융합 유전자는 혈액학적 악성종양, 특히 AML에 관여하는 호산구, 호중구, 비만 세포, 단핵구, T 림프구, 및 B 림프구에서 검출되었다. FIP1L1-PDGFR-α 융합 단백질은 PDGFR-α-관련 티로신 키나제 활성을 유지하나, PDGFR-α와 달리, 그의 티로신 키나제는 구성적, 즉 연속적으로 활성이며; PDGFR-α가 그의 활성화 리간드인 혈소판-유래 성장 인자에 결합하지 않는 한 상기 융합 단백질은 통상 티로신 키나제 활성을 차단하는 PDGFR-α의 무손상 막근접 도메인(juxtamembrane domain)이 결여되어 있다. FIP1L1-PDGFR-α 융합 단백질은 또한 PDGFR-α의 정상적인 분해 경로, 즉 프로테아좀-의존성 유비퀴틴화에 내성이 있다. 결과적으로, 그들은 매우 안정하고, 수명이 길며, 조절되지 않으며, 그의 PDGFRA 티로신 키나제 성분의 자극 작용을 연속적으로 발현한다.
바람직하게는 동종이계 T 세포 이식과 조합하여, MDM2 억제제를 사용한 HCT 후 조혈 신생물 재발, 예컨대 AML 재발의 치료는 MDM2 및/또는 MDM4 유도 돌연변이를 보유하는 신생물을 가진 환자에서 특히 효율적이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서 환자는 예를 들어 FLT3-ITD, JAK2-V617F, cKit-D816V 또는 FIP1L-PDGFR-α와 같은 돌연변이를 보유하는 조혈 신생물을 앓고 있는 것으로 공지되어 있다.
실시양태에서, HCT는 동종이계 HCT이다. HLA 분자에 대한 차이로 인해, 이식에 의해 포함된 동종이계 T 세포는 HCT 후에 재발하는 암 세포에 대한 이식편 대 백혈병 또는 이식편 대 암 세포 반응을 생성할 수 있기 때문에, 조혈 세포 이식은 동종이계인 것이 바람직하다 (그리고 T 세포가 고갈되지 않은 것이 가장 바람직함). 따라서, MDM2 억제제 투여는 암 세포에 대한 생착된(engrafted) T 세포의 더 강력한 항암 효과를 발생시킬 수 있고, HCT 후에 암의 재발을 예방할 수 있거나, 재발이 발생한 후에 암 세포의 제어 또는 근절을 발생시킬 수 있다.
실시양태에서, HCT는 T 세포를 포함한다.
실시양태에서, MDM2 억제제는 HCT 후에 및 재발 발생 전에 환자에게 투여된다. 본 발명의 맥락에서, MDM2 억제제는 다양한 시점에서 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 억제제는 HCT의 시점 (조혈 세포의 이식 시점), 예컨대 동일한 날에 투여될 수 있다. 실시양태에서, HCT 전에, 예컨대 HCT 전 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일에 상기 억제제를 이미 투여하여, 남아있는 암 세포가 조혈 세포 이식에 포함된 T 세포에 즉시 가시적이 되도록 하는 것이 유용할 수 있다. MDM2 억제제는 HCT 후에, 예컨대 HCT 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 초과에 또한 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, MDM2 억제제는 HCT의 투여 전에, 투여 이전에, 그리고 투여 후에 투여된다. 바람직하게는, MDM2 억제제는 HCT의 투여 후에(만) 투여된다.
MDM2 억제제 투여는 다수회 발생할 수 있으며 심지어 정기적으로, 예컨대 매일, 2일에 한 번, 4일에 한 번, 매주, 매월, (반복된) 28일 일정의 1-5일째 또는 (반복된) 28일 일정의 1-7일째 반복될 수 있다.
MDM2 억제제 투여는 예를 들어 이식편 대 암 효과를 증강시키고 환자의 암 재발 발생을 예방하기 위해, 예방적 조치로서 HCT를 받았고/거나 받고 있고/거나 받을 혈액학적 신생물을 가진 환자에서 일상적으로 발생할 수 있다.
실시양태에서, 억제제는 HCT 후 재발 발생 후에 백혈병 환자에게 투여된다. MDM2 억제제 투여는, 잠재적으로 추가 동종이계 T 세포 이식 (바람직하게는 조혈 줄기 세포를 전혀 함유하지 않는 공여자 림프구 주입 (DLI))과 조합하여, HCT 후에 혈액학적 신생물을 가진 환자에서의 재발 발생 후 치료 조치일 수 있다.
한 실시양태에서, MDM2 억제제는 HCT 후에, 및 a) 동종이계 T 세포 이식 전에, 및/또는 b) 동종이계 T 세포 이식과 동일한 날, 및/또는 c) 동종이계 T 세포 이식 후에 투여된다.
이러한 맥락에서 MDM2 억제제와 동종이계 T 세포 이식의 조합 투여는 상기 억제제와 세포의 협동(coordinated) 투여와 관련될 수 있음이 이해된다. 두 생성물은 단일 조성물로 투여될 필요는 없으나, 또한 상이한 시점에서 별도의 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 예를 들어 TRAIL-R1, TRAIL-R2, 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 분자 및 HLA 클래스 II 분자의 상향조절을 유도하기 위해 먼저 MDM2 억제제를 받고, 그 후에, 예컨대 동일한 날 후에, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 후에 T 세포 이식을 받을 수 있다. 그러나, 두 생성물은 또한 대략 8시간 이내를 의미하는, 대략 동일한 시점에 투여될 수 있거나, MDM2 억제제는 T 세포 이식이 투여된 후에 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 생성물 (MDM2 억제제 또는 T 세포 이식) 중 하나 또는 둘 다가 협동 방식으로 환자에게 1회 초과 투여될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 HCT, 동종이계 T 세포 이식, 및/또는 XPO-1 억제제와 같은 추가 생성물과의 MDM2의 협동 투여는 MDM2 억제제 및 상기 억제제의 치료 또는 예방 효과를 증강시키기 위한 다른 생성물의 투여에 관한 것임이 이해된다. 통상의 기술자는 MDM2 억제제를 투여받는 환자의 구체적 사례에 따라 적합한 투여 요법을 선택할 수 있고, 억제제 및 기타 화합물/생성물의 각각의 투여를 조정할 수 있다. 게다가, 예를 들어 cKIT-D816V 및 FIP1L-PDGFR-α가 MDM2 및 MDM4를 유도하는 것으로 관찰되었기 때문에, MDM2 발현을 유도하는 특정 돌연변이를 가진 백혈병이 특히 잘 반응할 가능성이 있다. 이들 맥락에 따라, allo-HCT (골수 이식) 후에 allo-T-세포/MDM2-억제제 조합이 FIP1L-PDGFR-α-돌연변이체 및 cKIT-D816V-돌연변이체 AML을 보유하는 마우스에서 매우 효과적이었음을 알 수 있을 것이다.
실시양태에서, 본 발명의 치료는 HCT와 함께 및/또는 HCT 후에, 동종이계 T 세포 이식의 투여를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 동종이계 T 세포 이식은 림프구를 포함하나 조혈 줄기 세포를 포함하지 않는 공여자 림프구 주입이다. 실시양태에서, 동종이계 T 세포 이식의 공여자는 또한 HCT의 공여자였다.
본 발명의 맥락에서, MDM2 억제제는 바람직하게는 RG7112 (RO5045337), 이다사누틀린 (RG7388), AMG-232 (KRT-232), APG-115, BI-907828, CGM097, 시레마들린 (HDM-201), 및 밀라데메탄 (DS-3032b) 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, MDM2 억제제는 시레마들린 (HDM-201), 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 공결정 (예를 들어 숙신산 공결정 또는 숙시네이트 염)이다.
다양한 MDM2 억제제가 관련 기술분야에 공지되어 있고, MDM2 억제제의 확인을 위한 다수의 확립된 검정이 기재되어 있으며 다양한 병태를 치료하기 위해 연구 중이다 (Marina Konopleva et al. Leukemia. 2020 Jul 10. doi: 10.1038/s41375-020-0949-z). 그러나, HCT 후에 혈액학적 신생물을 가진 환자에서 암 재발을 특이적으로 치료하거나 예방하기 위한 MDM2 억제제의 사용은 관련 기술분야에 전혀 기재되거나 제안된 적이 없다. 이러한 치료의 이점은 지금까지 전혀 기재된 적이 없으며 백혈병 세포와 같은 혈액학적 신생물의 암 세포가 동종이계 T 세포에 의한 암 세포의 인식을 증강시키는 분자를 상향조절한다는 완전히 놀라운 연구결과를 기반으로 한다.
실시양태에서, MDM2 억제제의 투여는 TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 수용체 1 (TRAIL-R1), TRAIL-R2, 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 분자 및 HLA 클래스 II 분자 중 하나 이상의 상향조절을 발생시킨다. 따라서, 실시양태에서 MDM2의 억제는 TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 수용체 1 (TRAIL-R1), TRAIL-R2, 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 분자 및 HLA 클래스 II 분자 중 하나 이상의 상향조절을 발생시킨다. 실시양태에서, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 수용체 1 (TRAIL-R1), TRAIL-R2, 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 분자 및 HLA 클래스 II 분자 중 하나 이상의 상향조절, 특히 TRAIL-R1 및/또는 TRAIL-R2의 상향조절은 p53 의존적이다.
실시양태에서, MDM2 억제제의 투여는 암 세포에 대한 CD8+ allo-T 세포의 세포독성을 증가시키며, 여기서 바람직하게는 CD8+ allo-T 세포의 세포독성은 암 세포의 TRAIL-R과 CD8+ allo-T 세포의 TRAIL-리간드 (TRAIL-L)의 상호작용에 적어도 부분적으로 의존한다.
실시양태에서, MDM2 억제제의 투여는 이식편 대 백혈병 (GVL) 또는 이식편 대 림프종 반응을 증가시키며, 여기서 바람직하게는 이식편 대 백혈병 반응 또는 이식편 대 림프종 반응은 CD8+ allo-T 세포에 의해 매개된다.
실시양태에서, MDM2 억제제의 투여는 CD8+ allo-T 세포에 의한 퍼포린, CD107a, IFN-γ, TNF 및 CD69 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따라, MDM2 억제제 (예를 들어, HDM201 또는 그의 제약상 허용되는 염)를 HCT (예를 들어, 예를 들어 T 세포를 포함하는, 동종이계 HCT)와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, CD8+ allo-T 세포에 의한 퍼포린, CD107a, IFN-γ, TNF 및 CD69 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
실시양태에서, MDM2 억제제의 투여는 T-세포, 특히 CD8+ T-세포, 예컨대 CD8+ allo-T 세포에서 장수의 특징 ((13)에 기재된 바와 같음)을 유도한다. 예를 들어, 실시양태에서, 이식된 CD8+ T-세포는 MDM2 억제의 맥락에서 Bcl-2 및/또는 IL-7R (CD127)의 높은 발현을 나타낸다. 더욱이, 실시양태에서, MDM2 억제제의 투여는 CD27이 결여된 CD8+ T-세포와 같이, 높은 항원 회상(recall) 반응 (예를 들어 (12)에서 정의된 바와 같음)을 가진 CD8+ T-세포를 유도한다. 실시양태에서, MDM2 억제제 치료는 CD8+CD27+TIM3+ 공여자 T-세포의 감소를 유도한다.
본 발명의 추가의 완전히 예상치 못한 발견은 MDM2 억제제의 투여가 본원에 기재된 바와 같이 암 세포에서 수용체 및 표면 분자의 상향조절을 발생시킬 뿐만 아니라, 또한 환자에서 동종이계 T 세포에서 유리한 표현형을 유도하여, 암 세포에 대한 T 세포의 더 강력한 세포독성 효과를 발생시킬 수 있다는 점이다. 대략적으로 말하면, MDM2 억제제는 CD8+ allo-T 세포에서 더 큰 세포독성의 표현형을 유도하여, 재발하는 암 세포에 대해 상기 T 세포가 더 "공격적"이 되도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면, MDM2 억제제 (예를 들어, HDM201 또는 그의 제약상 허용되는 염)를 HCT (예를 들어, 예를 들어 T 세포를 포함하는, 동종이계 HCT)와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, CD8+ allo-T 세포에서 보다 효과적인 세포독성 표현형을 유도하는 방법이 본원에 제공된다.
실시양태에서, 본 발명에 따른 대상체에 대한 MDM2 억제제의 투여는 이식편 대 백혈병 반응 동안 생체내에서 T 세포의 당분해 활성을 증강시킨다. 따라서, 실시양태에서 MDM2 억제는 대상체에서 T 세포의 당분해 활성의 증가를 발생시킨다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따라, MDM2 억제제 (예를 들어 HDM201 또는 그의 제약상 허용되는 염)를 HCT (예를 들어, 예를 들어 T 세포를 포함하는, 동종이계 HCT)와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, CD8+ allo-T 세포에서 당분해 활성을 증강시키는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 나타낸 바와 같이, MDM2 억제는 세포독성 T-세포를 포함한, T-세포에서 당분해 활성의 증가를 발생시키며, 이는 더 강력한 T-세포 활성화 및 증가된 GVL-활성을 나타낸다. 실시양태에서, MDM2 억제제 치료는 대상체에서 T-세포의 활성화를 증가시키고/시키거나 T-세포의 GVL-활성을 증가시킨다. T-세포는 내인성 또는 투여된 T-세포, 바람직하게는 CD8+ allo-T 세포일 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 대상체의 MDM-억제는 상기 대상체에서 T-세포의 당분해 활성의 증가를 유도한다.
본 발명의 맥락에서 MDM2 억제제의 투여가 증강된/증가된 당분해 활성을 가진 T 세포 표현형을 유도하여, CD8+ allo-T 세포의 세포독성 활성을 추가로 개선한다는 것은 완전히 예상치 못한 것이었다.
실시양태에서, 환자는 엑스포틴 1 (XPO-1) 억제제를 추가로 받을 수 있다. 따라서, 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용하기 위한 MDM2 억제제에 관한 것이며, 여기서 치료는 엑스포틴-1 (XPO-1) 억제제의 투여를 추가로 포함한다.
하기 실시예에 나타낸 바와 같이, AML 세포에서 MDM2 억제는 TRAIL-R1/2 발현을 증가시키고 AML 세포에 대한 GVL을 증강시키며, 이는 HCT 후에 재발의 경우에 환자 치료의 맥락에서 또는 HCT 후에 재발을 예방하기 위해 막대한 이점이 될 수 있다. 분자 XPO-1은 핵으로부터 p53의 외수송을 매개하며, 놀랍게도 특정 암성 세포에서 XPO-1이 MDM2 억제시 p53-유도된 TRAIL-R1/2/MHC-II 생성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, MDM2 억제 효과를 최대화하기 위해 본 발명의 맥락에서 XPO-1을 추가로 억제하는 것이 유리하다. MDM2 억제제 및 XPO-1 억제제는 MDM2 억제제와 조혈 세포 이식 또는 동종이계 T 세포 이식의 조합 투여에 대해 상기에 기재된 바와 같이 협동 방식으로 투여될 수 있다. 두 억제제의 투여는 개별적으로 또는 두 억제제를 모두 포함하는 제약 생성물 또는 조성물의 형태로 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 선행 청구항 중 어느 한 항에 따른 환자에서의 조혈 세포 이식 (HCT) 후 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 MDM2 억제제 및 엑스포틴 1 (XPO-1) 억제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 제약 조성물은 본원에 기재된 모든 실시양태의 맥락에서 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 한 측면에 따르면, 환자에서 혈액학적 신생물의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 XPO-1 억제제가 본원에 제공되며, 여기서 치료는 조혈 세포 이식 (예를 들어, 예를 들어 T 세포를 포함하는, 동종이계) 및 MDM2 억제제의 투여를 추가로 포함한다.
특허 및 비특허 문헌의 모든 인용 문서는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
따라서 본 발명은 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 마우스 이중 미세염색체 2 (MDM2) 억제제에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 혈액학적 신생물 재발의 "예방"은 혈액학적 신생물 재발이 반드시 발생하지 않도록 하기 위한 임의의 방법, 공정 또는 조치에 관한 것으로 이해된다. 예방은 재발 상황을 피하기 위해 의도된 예방적 치료에 관한 것이다. "예방적" 치료는 질환의 징후를 나타내지 않거나 병리 발병 위험, 본 건에서는 HCT 후에 재발의 발생을 감소시킬 목적으로 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다.
용어 "치료"는 질환 또는 병리학적 상태 (여기서는 HCT 후에 혈액학적 신생물의 재발)의 징후 또는 증상이 발병하기 시작한 후 그의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 병리학적 상태와 관련하여 용어 "개선하는"은 치료의 임의의 관찰가능한 유익한 효과를 지칭한다. 유익한 효과는, 예를 들어 감수성 대상체에서 질환의 임상 증상의 지연된 개시, 질환의 일부 또는 모든 임상 증상의 중증도 감소, 질환의 더 느린 진행, 대상체의 전반적인 건강 또는 웰빙의 개선, 또는 특정한 질환에 특이적인 관련 기술분야에 널리 공지된 기타 파라미터에 의해 입증될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 및 수의학 대상체 둘 다, 특히 포유동물, 및 기타 유기체를 포함한다. 용어 "수용자"는 HCT 및 본 발명의 MDM2 억제제를 받는 환자 또는 대상체에 관한 것이다.
용어 "신생물"은 조직의 새로운 비정상적인 성장에 관한 것으로 이해된다. 악성 신생물은 양성 신생물과 비교하여, 더 큰 역형성 정도를 나타내며 침습 및 전이의 특성을 가지고 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈액학적 신생물"은 혈액 및 혈액-형성 조직 (골수 및 림프 조직)에 위치한 신생물에 관한 것이다. 가장 통상적인 형태는 다양한 유형의 백혈병, 림프종, 및 골수이형성 증후군, 특히 진행성, 생명을 위협하는 형태의 골수이형성 증후군이다.
용어 혈액학적 신생물은 혈액, 골수, 림프, 및 림프계에 영향을 미치는 종양 및 암과 관련된 조혈 및 림프구양 조직(lymphoid tissue)의 종양 및 암을 포함한다. 조혈 조직과 림프구양 조직은 순환계와 면역계 둘 다를 통해 모두 밀접하게 연결되어 있기 때문에, 하나에 영향을 미치는 질환은 종종 다른 질환에도 영향을 미쳐, 골수증식과 림프증식 (그리고 따라서 백혈병 및 림프종)이 밀접하게 관련되고 종종 문제점이 중복된다.
본 발명의 대상인 혈액학적 악성종양은 악성 신생물 ("암")이고, 이들은 일반적으로 혈액학 및/또는 종양학 전문의에 의해 치료되며, 내과의 하부전문분야로서, 외과 및 방사선 종양전문의가 또한 이러한 병태에 관여한다. 혈액학적 악성종양은 두 가지 주요 혈액 세포 계통인 골수양 세포주와 림프구양 세포주 중 하나로부터 유래될 수 있다. 골수양 세포주는 통상 과립구, 적혈구, 트롬보사이트, 대식세포 및 비만 세포를 생성하며; 림프구양 세포주는 B, T, NK 및 형질 세포를 생성한다. 림프종, 림프구성 백혈병, 및 골수종은 림프양 계열(lymphoid line)로부터 유래하고, 한편 급성 및 만성 골수원성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 골수증식성 질환은 기원이 골수양이다.
본 발명의 맥락에서, 백혈병은 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 무백혈성 백혈병, 백혈구병성(leukocythemic) 백혈병, 호염기성 백혈병, 모세포 백혈병(blast cell leukemia), 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 피부 백혈병, 배아 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병(Gross' leukemia), 털세포 백혈병, 혈구모세포 백혈병(hemoblastic leukemia), 혈구모세포 백혈병(hemocytoblastic leukemia), 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프형성 백혈병(lymphogenous leukemia), 림프구양 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 미세골수모구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수양 과립구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 내겔리 백혈병(Naegeli leukemia), 형질 세포 백혈병, 형질구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리이더 세포 백혈병(Rieder cell leukemia), 쉴링 백혈병(Schilling's leukemia), 줄기 세포 백혈병, 아백혈성 백혈병, 및 미분화 세포 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따르면, 림프종은 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 원발성 종격동 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 소림프구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 B-세포 림프종, 점막-연관 림프구양 조직 (MALT) 림프종으로도 공지된 결절외 변연부 B-세포 림프종, 결절 변연부 B-세포 림프종 및 비장 변연부 B-세포 림프종, 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 림프형질세포 림프종 (발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia)), 털세포 백혈병 원발성 중추신경계 (CNS) 림프종, 전구체 T-림프모구성 림프종/백혈병, 말초 T-세포 림프종, 피부 T-세포 림프종 (균상 식육종, 세자리(Sezary) 증후군 등), 성인 T-세포 백혈병/림프종 (무증상(smoldering), 만성, 급성 및 림프종 아형 포함), 혈관면역모구성 T-세포 림프종, 결절외 자연 킬러/T 세포 림프종, 비강형, 창자병증-연관 장 T-세포 림프종 (EATL), 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 및 상세불명의 말초 T-세포 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 호지킨 및 비호지킨 림프종 (B-세포 및 T-세포 림프종)을 포함한다.
골수이형성 증후군 (MDS)은 골수에 있는 미성숙 혈액 세포가 성숙하지 않아, 건강한 혈액 세포가 되지 못하는 암의 군이다. 증상은 피곤함, 숨가쁨, 쉬운 출혈, 또는 빈번한 감염을 포함할 수 있다. 일부 유형은 급성 골수성 백혈병으로 발전할 수 있다.
급성 골수성 백혈병 (AML)은 골수와 혈액에 축적되어 정상적인 혈액 세포 생성을 방해하는 비정상 세포의 급속한 성장을 특징으로 하는, 혈액 세포의 골수양 계열의 암이다. 증상은 피곤함, 숨가쁨, 쉬운 타박상 및 출혈, 및 감염 위험의 증가를 포함할 수 있다. 때때로, 뇌, 피부, 또는 잇몸에 퍼질 수 있다. 급성 백혈병으로서, AML은 빠르게 진행되며 치료하지 않고 방치하면 전형적으로 몇 주 또는 몇 달 내에 치명적이다. AML은 전형적으로 관해 유도를 목적으로, 초기에 화학요법으로 치료된다. 이어서 사람들은 추가 화학요법, 방사선 요법, 또는 줄기 세포 이식을 받을 수 있다. 암 세포 내에 존재하는 구체적 유전적 돌연변이는 치료를 안내할 수 있을 뿐만 아니라 그 사람이 얼마나 오래 생존 가능할지를 결정할 수 있다.
공격적 형태의 혈액학적 신생물 및 혈액학적 악성종양은 화학요법, 방사선요법, 면역요법 및 조혈 세포 이식 (HCT)의 한 형태인 골수 이식을 사용한 치료를 필요로 한다.
조혈 세포 이식 (HCT) (조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)이라고도 함)은 대개 골수, 말초 혈액, 또는 제대혈로부터 유래하는 다능성 조혈 줄기 세포의 이식이다. HCT는 자가 (환자 자신의 줄기 세포가 사용됨), 동종이계 (공여자에서 비롯된 줄기 세포) 또는 동계 (일란성 쌍둥이로부터)일 수 있다. HCT는 혈액 또는 골수 또는 림프계의 특정 암, 예컨대 다발성 골수종 또는 백혈병을 가진 환자를 위해 수행된다. 이들 경우에, 수용자의 면역계는 대개 조혈 줄기 세포 이식편의 이식 (골수상해(myeloablation) 또는 부분적 골수상해)의 전에 방사선 및/또는 화학요법 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법으로 완전히 (또는 일부 경우에 단지 부분적으로) 파괴된다. 감염 및 이식편 대 숙주 질환은 동종이계 HCT의 주요 합병증이다. HCT는 많은 가능한 합병증을 가진 위험한 절차이므로 생명을 위협하는 질환을 가진 환자에게 거의 독점적으로 수행된다.
본 발명의 맥락에서, HCT는 동종이계인 것이 바람직하다. 자가 HCT와 비교하여 암 되풀이/재발 위험이 감소된다. 동종이계 HCT는 (건강한) 공여자와 (환자) 수용자를 포함한다. 동종이계 HCT 공여자는 수용자의 것과 일치하는 조직 유형 (인간 백혈구 항원, HLA)을 가지고 있어야 한다. 일치는 대개 HLA 유전자의 3개 이상의 유전자좌에서 가변성을 기반으로 하여 수행되며, 이들 유전자좌에서 완벽한 일치가 바람직하다. 이들 중대한 대립유전자에서 양호한 일치가 있더라도, 수용자는 이식편 대 숙주 질환을 완화하기 위해 면역억제 의약을 필요로 할 것이다. 동종이계 이식 공여자는 관련이 있거나 (대개 HLA가 밀접하게 일치하는 형제) 관련이 없을 수 있다 (관련이 없으며 매우 근접한 정도의 HLA 일치를 갖는 것으로 밝혀진 공여자). 동종이계 이식은 또한 제대혈을 줄기 세포의 공급원으로서 사용하여 수행된다. 일반적으로, 건강한 줄기 세포를 수용자의 혈류에 주입하여 건강한 면역계를 개혁함으로써, 동종이계 HCT는 일단 즉각적인 이식-관련 합병증이 해결되면 치유 또는 장기간 관해의 기회를 개선시키는 것으로 보인다.
잠재적인 공여자의 혈액으로부터 추가 HLA-시험을 행함으로써 적합한 공여자를 찾는다. HLA 유전자는 두 가지 범주 (유형 I 및 유형 II)에 해당한다. 일반적으로, 유형-I 유전자 (즉 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C)의 불일치는 이식 거부 위험을 증가시킨다. HLA 유형 II 유전자 (즉 HLA-DR, 또는 HLA-DQB1)의 불일치는 이식편 대 숙주 질환의 위험을 증가시킨다.
공여자 세포의 가능한 공급원은 골수, 말초 혈액 줄기 세포, 양수 및 제대혈을, 제한 없이 포함한다.
이식편 대 숙주 질환 (GVHD)은 동종이계 이식에 고유한 염증성 질환이며 수용자의 조직에 대한 "새로운" 골수의 면역 세포에 의한 공격에 의해 매개된다. 이는 공여자와 수용자가 HLA가 동일한 경우더라도 면역계가 여전히 그의 조직 간의 다른 차이점을 인식할 수 있기 때문에 발생할 수 있다. 급성 이식편 대 숙주 질환은 전형적으로 이식 후 처음 3개월 이내에 발생하며 피부, 장, 또는 간을 포함할 수 있다. 프레드니손과 같은 고용량 코르티코스테로이드가 표준 치료이나; 그러나, 이 면역억제 치료는 종종 치명적인 감염을 발생시킨다. 만성 이식편 대 숙주 질환은 또한 동종이계 이식 후에 발생할 수 있으며 상기 질환이 사망을 발생시키는 경우는 드물긴 하지만, 후기 치료-관련 합병증의 주요 공급원이다.
본 발명의 실시양태에서, 이식된 allo-T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 MDM2 억제에 의해 증강되는 이식편 대 종양 효과 (GvT)를 매개한다. GvT 효과는 동종이계 HCT 후에 나타난다. 이식편은 잔류 악성 세포를 제거함으로써 수용자에게 유익할 수 있는 공여자 T 세포 (T 림프구)를 함유할 수 있으며, 본 발명의 맥락에서 환자가 하나 이상의 추가적인 동종이계 T-세포 이식을 받는 것이 가능하다.
GvT는 종양-특이적 또는 수용자-특이적 동종항원을 인식한 후에 발생할 수 있다. 그것은 혈액학적 악성종양의 관해 또는 면역 제어를 발생시킬 수 있으므로 HCT 후에 혈액학적 신생물 재발의 예방 또는 치료의 맥락에서 이용될 수 있다. 이 효과는 골수종 및 림프구양 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 및 아마도 유방암에 적용되며 본 발명의 맥락에서 이식편 대 백혈병 효과 또는 이식편 대 림프종 효과 또는 이식편 대 다발성 골수종 효과로 지칭될 수 있다. 이는 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)과 밀접하게 연결되어 있어 있으며, 그 이유는 동종면역의 근본 원리가 동일하기 때문이다. CD4+CD25+ 조절 T 세포 (Treg)는 유익한 GvT 효과의 손실 없이 GvHD를 억제하는데 사용될 수 있으며 관련 기술분야의 통상의 기술자는 GvT 효과를 미세 조정하기 위해 본 발명의 구체적 실시양태를 조정할 수 있다. GvT는 조혈 세포 상에서 특이적으로 발현되거나 다수의 조직 세포 또는 종양-연관 항원 상에서 보다 광범위하게 발현되는 다형성 마이너 조직적합성 항원과의 반응을 포함할 가능성이 높다. GvT는 주로 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 매개되나 자연 킬러 (NK 세포)에 의해 별도의 이펙터로서 이용될 수 있다.
이식편 대 백혈병 (GvL)은 구체적 유형의 GvT 효과이며 환자의 재발을 발생시키는 HCT 전에 골수 상해적 치료 후 남아 있고/있거나 확장될 수 있는 숙주의 백혈병 세포에 대한 반응이다. GvL은 그 효과가 동종면역 원리에 의존하고 숙주에 대한 이식편의 반응의 일부이기 때문에 유전적 차이를 필요로 한다. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)은 숙주에 부정적인 영향을 미치는 반면, GvL은 조혈 악성종양을 가진 환자에게 유익하다. HCT 후 GvL 및 GvHD 둘 다가 발생할 수 있다. 그러한 두 가지 효과의 상호연결은 HCT 후에 백혈병 재발과 GvHD 발생의 비교에 의해 알 수 있다. 만성 또는 급성 GvHD가 발생하는 환자는 백혈병 재발의 더 낮은 가능성을 갖는다. T-세포 고갈 줄기 세포 이식을 이식할 때, GvHD는 부분적으로 예방될 수 있으나, 동시에 GvL 효과가 또한 감소되는데, 그 이유는 T-세포가 그러한 효과 둘 다에서 중요한 역할을 하기 때문이다. 따라서, T-세포 고갈은 본 발명의 맥락에서 바람직하지 않다. 조혈 악성종양의 치료에서 GvL 효과의 가능성은 GvHD에 의해 제한된다. HCT 후에 GvL을 유도하지만 GvH는 유도하지 않는 능력은 그러한 환자에게 매우 유익할 것이다. 이식 후 GvHD를 억제하거나 GvL을 증강시키는 일부 전략이 있으나 그들 중 어느 것도 이 문제에 대한 이상적인 해결책을 제공하지는 않는다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 MDM2 억제제의 사용은 GvL 및 GvT 반응의 촉진을 가능하게 하는 새로운 전략을 나타낸다.
예를 들어 급성 골수성 백혈병 (AML)과 같은 일부 형태의 조혈 악성종양의 경우, HCT 동안 필수 세포는, 공여자의 T 세포 외에도, KIR 수용체와 상호작용하는 NK 세포이다. NK 세포는 이식 생착에서 중요한 역할을 한다는 것을 의미하는 숙주의 골수를 다시 채우는 첫 번째 세포 내에 있다. GvL 효과에서의 상기 세포의 역할을 위해, 그의 동종반응성이 필요하다. KIR 및 HLA 유전자는 독립적으로 유전되기 때문에, 이상적인 공여자는 동시에 NK 세포의 동종반응을 유도하는 적합한 HLA 유전자 및 KIR 수용체를 가질 수 있다. 이것은 대부분의 관련이 없는 공여자에게 발생할 것이다.
비고갈 T-세포 이식을 사용하는 경우, 이식 후 GvHD 또는 이식 거부를 방지하기 위해 시클로포스파미드를 사용한다. GvHD를 억제하고 GvL을 증강시키기 위해 현재 임상적으로 사용되는 다른 전략은 예를 들어 이식 후 이식 조건의 최적화 또는 공여자 림프구 주입 (DLI)이다. 가능성 중 하나는 시토카인을 사용하는 것이다. 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF)는 이식 동안 HSC를 동원하고 T 세포 내성을 매개하는데 사용된다. G-CSF는 LPS 및 TNF-α의 수준을 감소시켜 GvL 효과를 증강시키고 GvHD를 억제하는데 도움이 될 수 있다. G-CSF를 사용하는 것은 Treg 수준을 또한 증가시키며, 이는 GvHD 예방에 또한 도움이 될 수 있다. GvL을 제거하지 않고 GvHD를 예방하거나 감소시키기 위해 다른 시토카인, 예를 들어 KGF, IL-11, IL-18 및 IL-35를 또한 사용할 수 있다.
동종이계 HCT는 고위험 악성종양에 대한 집중적인 치유적 치료이기 때문에, 재발 예방을 위한 그의 실패는 성공적인 구제 치료를 위한 옵션이 거의 남지 않게된다. 많은 환자가 재발로 인한 높은 조기 사망률을 갖지만, 일부는 반응을 하고 지속된 관해를 가지며, 소수는 적절한 요법을 통해 두 번째 치유 기회를 가진다. 본 발명은 MDM2 억제가 allo-T 세포에 대한 잔존 또는 재발 암 세포의 가시성을 증가시키기 때문에, HCT 후에 재발을 치료 및 예방하기 위한 새로운 전략을 나타낸다. HCT 후에 재발된 혈액학적 악성종양의 예후는 네 가지 인자에 주로 의존한다: SCT에서 재발까지 경과된 시간 (재발은 최악의 예후를 갖는 6개월 이내에 발생함), 질환 유형 (추가 치료로 두 번째 치유 가능성을 갖는 만성 백혈병 및 일부 림프종을 가짐), 질환 부담 및 재발 부위 (질환을 조기에 치료하면 더 양호한 치료 성공을 가짐), 및 첫 번째 이식 조건 (동종면역 효과, 표적 작용제에 의한 항백혈병 효과의 특이성 또는 두 번째 이식에서 컨디셔닝 강도를 증가시킬 기회가 있는 환자에 대한 우수한 결과를 가짐). 이들 특징은 변형된 2차 이식, 화학요법, 표적 항백혈병 요법, 면역 요법 또는 완화적 치유에 대한 직접적인 치료를 제공한다. HCT 후에 재발은 종양학에서 중요한 문제이며 통상의 기술자는 예를 들어 문헌 [Barrett et al. (Expert Rev Hematol. 2010 Aug; 3(4): 429-441.doi: 10.1586/ehm.10.32)]에 의해 검토된 바와 같이, HCT 후에 재발의 경우에 재발을 발생시키는 병리메커니즘, 현재 치료 옵션 및 환자 관리에 대한 현재의 이해를 알고 있다.
마우스 이중 미세염색체 2 상동체 (MDM2)는 E3 유비퀴틴-단백질 리가제 Mdm2로도 공지되어 있으며 인간에서 MDM2 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. MDM2는 p53 종양 억제인자의 중요한 음성 조절자이며 p53 종양 억제인자의 N-말단 트랜스-활성화 도메인 (TAD)을 인식하는 E3 유비퀴틴 리가제로서 및 p53 전사 활성화의 억제제로서 둘 다 기능한다.
MDM2는 또한 반대되지 않는 p53 활성화는 포돕토시스로 지칭되는 p53 과잉 활성화-의존성 세포 사멸을 발생시키기 때문에 장기 발달 및 조직 항상성에 필요하다. 포돕토시스는 카스파제-독립적이므로, 아폽토시스와 상이하다. MDM2의 유사분열촉진 역할은 조직 손상시 상처 치유에 또한 필요하며, 한편 MDM2 억제는 상피 손상시 재상피화를 손상시킨다. 게다가, MDM2는 핵 인자-카파 베타 (NFκB) 활성화에서 p53-독립적 전사 인자-유사 효과를 가진다. 따라서, MDM2는 조직 염증을 촉진하고 MDM2 억제는 조직 손상에서 강력한 항염증 효과를 가진다. 따라서, MDM2 차단은 염증성 및 과증식성 장애 예컨대 특정 암 또는 림프증식성 자가면역, 예컨대 전신성 홍반성 루푸스 또는 초승달 사구체신염에서 추가적인 치료 효능이 있을 수 있는 대부분 항염증 및 항유사분열 효과를 가졌다. Mdm2의 핵심 표적은 p53 종양 억제인자이다. Mdm2는 p53 전사 활성을 억제하는 p53 상호작용 단백질로서 확인되었다. Mdm2는 p53의 N-말단 트랜스-활성화 도메인에 결합하고 이를 차단함으로써 이러한 억제를 달성한다. Mdm2는 p53 반응 유전자이며-즉, 그의 전사는 p53에 의해 활성화될 수 있다. 따라서, p53이 안정화되는 경우, Mdm2의 전사가 또한 유도되어, Mdm2 단백질 수준이 더 높아진다. MDM2의 기능 및 암에서의 그의 역할은 광범위한 연구의 주제이며, 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Li et al. (Front. Pharmacol., 07 May 2020, volume 11, Article 631, "Targeting Mouse Double Minute 2: Current Concepts in DNA Damage Repair and Therapeutic Approaches in Cancer"]에 의해 검토되어 있다. 동일한 논문이 또한 현재 다양한 암 치료를 위해 임상 조사 중인 MDM2 억제제를 검토한다. HCT 후에 혈액학적 신생물의 재발의 치료 및/또는 예방을 위한 이 간행물에서 논의된 억제제의 용도는 본 발명에 의해 포함된다.
MDM2의 기능은 MDM2를 항암제로서 사용될 억제제 설계의 유망한 표적인 것으로서 확인하였다. 시간이 지남에 따라 치료 효과 유지에 단일 표적 약물의 결핍뿐만 아니라 약물 내성을 촉진하는 대안적 신호전달 경로를 활성화시키는데 도움이 되는 점을 고려하여, 이중 또는 다중-표적 MDM2 억제제가 등장하고 있다. 다수의 상이한 MDM2 억제제가 이미 임상 시험을 위해 성공적으로 개발되어 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용어 "MDM2 억제제"의 의미를 잘 알고 있으며 또한 관련 기술분야에 공지된 이러한 억제제의 다수의 예를 쉽게 확인할 수 있다. 상기 억제제들은, 예를 들어, RG7112 (RO5045337), 이다사누틀린 (RG7388), AMG-232 (KRT-232), APG-115, BI-907828, CGM097, 시레마들린 (HDM-201), 및 밀라데메탄 (DS-3032b)을 포함한다.
누틀린은 p53-결합 포켓에서 MDM2에 결합하는 것으로 확인된 일련의 시스-이미다졸린 유사체이며, 이는 누드 마우스에서 암 세포의 세포 주기 정지 및 아폽토시스, 뿐만 아니라 인간 종양 이종이식편의 성장 억제를 발생시킨다. MDM2-p53 예컨대 RG7112, RG7388, RG7775, SAR405838, HDM201, APG-115, AMG-232, 및 MK-8242를 표적으로 하는 몇몇 억제제가 최근 임상 시험으로 인간 암을 치료하기 위해 개발되었다.
RG7112
Figure pct00001
는 인간 임상 시험에 진입한 최초의 소분자 MDM2 억제제였으며 누틀린-3a의 구조적 변형으로부터 유래되었다. RG7112는 p53-결합 포켓에서 MDM2를 표적으로 하도록 설계되고 p53 야생형 교모세포종 세포에서 강력한 p21 발현 및 아폽토시스를 유도하는 p53 활성을 복원시켰다. 지금까지, RG7112에 대한 7건의 임상 연구가 완료되었다 (http://www.clinicaltrials.gov/; NCT01677780, NCT01605526, NCT01143740, NCT01164033, NCT00559533, NCT00623870, NCT01677780). NP25299 연구 (NCT01164033)는 고형 종양을 가진 환자에서 개방-표지, 무작위화, 교차 연구였다. 상기 연구는 RG7112의 단일 경구 용량의 약동학에 대한 식품의 영향을 평가하였다. 이 연구는 두 부분을 포함하였다: 첫 번째 부분은 초기 단일-용량을 포함하였으며, 한편 다른 부분은 증가된 용량의 4가지 상이한 치료 일정을 포함하였다. 결과는 RG7112가 가장 통상적인 AE인 GI 독성에 대해 일반적으로 내약성이 양호하여, 항구토제로 이를 치료할 수 있게 함을 나타낸다 (Patnaik et al., 2015).
2세대 누틀린인 RG7388
Figure pct00002
은, 이전 누틀린의 효능과 독성 프로파일을 개선하기 위해 개발되었다. RG7388은 3개의 세포주 MCF-7, U-2OS 및 SJSA-1에서 p21 발현 및 효과적인 세포 주기 정지를 유도하여, 이는 p53의 강력한 활성화를 입증하였다. RG7388은 현재 MDM2 억제제에 대한 유일한 III상 임상 시험 (MIRROS/NCT02545283)을 포함한, 몇몇 임상 시험을 진행 중이다. I상 임상 시험 결과는 RG7388은 높은 수준의 MDM2 발현 을 가진 AML 환자에서 p53 활성을 조정함으로써 임상 결과를 개선한다는 것을 나타냈다. MIRROS는 재발성 및 불응성 급성 골수성 백혈병 (AML) 치료에서 시타라빈과 조합한 RG7388의 효능을 평가하기 위한 무작위화 III상 임상 시험이다. 2019년 4월 현재, 연구는 환자 집단의 대략 90%를 모집하였으며 여전히 진행 중이다. 본 연구의 p53-WT 집단에서 사망의 80%가 관찰되면, 2020년까지 중간 유효성 분석을 수득할 수 있다. MIRROS는 MDM2 억제제의 첫 번째 III상 임상 시험 데이터를 수득하고 AML을 가진 환자에게 새로운 치료 옵션을 제공할 수 있다.
RG7775는 AP (이다사누틀린)의 불활성 페길화 전구약물이며, 이는 혈액에서 에스테라제의 페길화 꼬리를 절단한다. AP는 p53 경로를 활성화시키는 p53-MDM2 상호작용의 강력하고 선택적인 억제제이며 세포-주기 정지 및/또는 아폽토시스와 연관된다. 전임상 시험에서, 정맥내 (IV) RG7775 (RO6839921)는 면역손상 마우스 모델에서 골육종 및 AML에서 항종양 효과를 나타냈다. I상 연구 (NCT02098967)에서, RG7775는 진행성 악성종양을 가진 환자에서 안전성, 내약성, 및 약동학에 대해 조사되었다. 결과는 RG7775가 경구용 이다사누틀린에 필적하는 안전성 프로파일을 갖는다는 것을 나타냈다.
SAR405838
Figure pct00003
은 MDM2-p53 상호작용을 표적으로 하는, MDM2의 경구 선택적 스피로옥신돌 소분자 유도체 길항제이다. 역분화된 지방육종 세포의 치료에서, SAR405838은 p53을 효과적으로 안정화시키고, p53 경로를 활성화하고, 세포 증식을 차단하고, 세포-주기 정지를 촉진하고, 아폽토시스를 유도하였다. SAR405838은 암 환자 (NCT01636479, NCT01985191)에 대한 두 가지 임상 시험에서 사용되었다. TED12318 (NCT01636479)의 연구는 진행성 고형 종양을 가진 성인 환자에서 경구 투여된 I상, 개방-표지, 용량-범위, 용량 증량, 안전성 연구이었다. 이 시험에서, 74명의 환자를 SAR405838로 치료하였으며 이는 32%의 3개월 무진행률을 가진 56%의 환자에서 가장 좋은 반응을 나타냈다. 이 연구는 SAR405838이 진행성 고형 종양을 가진 환자에서 허용되는 안전성 프로파일을 가짐을 나타냈다. SAR405838에 대한 또 다른 임상 시험은 TCD13388 (NCT01985191)의 연구였으며, 이는 암 환자에서 피마세르팁과 조합된 SAR405838의 안전성 및 효능을 분석하였다. 이 연구에서, 야생형 p53 및 RAS 또는 RAF 돌연변이를 갖는 것으로 문서화된, 국소 진행성 또는 전이성 고형 종양을 가진 환자 26명이 이 연구에 등록되었다. 이 연구의 목적은 최대 허용 용량 (MTD)을 탐색하는 것이었다. SAR405838 200 또는 300 mg QD + 피마세르팁 60 mg QD 또는 45 mg BID에서 환자 반응이 관찰되었다. 관찰된 가장 빈번하게 발생하는 유해 사례는 설사 (81%), 혈중 크레아틴 포스포키나제 (77%), 메스꺼움 (62%) 및 구토 (62%)였다. 이 연구는 피마세르팁과 조합된 SAR405838의 안전성 프로파일이 약물 둘 다의 안전성 프로파일과 일치함을 나타냈다.
시레마들린 또는 NVP-HDM201이라고도 하는 HDM201
Figure pct00004
은, MDM2와 p53 사이의 상호작용을 억제하는 강력하고 선택적인 소분자이며, 이는 저용량 및 고용량 요법 둘 다로 전임상 모델에서 종양 퇴행을 발생시킨다. 유사한 활성의 화합물 및 관련 화합물은 WO2013/111105A1에 뿐만 아니라 WO2019/073435A1에 광범위하게 기재되어 있다. HDM201은 미도탈린과 조합하여 사용시 양성-ITD를 가진 p53 야생형 세포에 대해 특이적이고 효과적인 사멸 효과를 가졌다. HDM201은 임상 시험에서 사용되었다 (NCT02143635). NCT02143635는 야생형 p53을 가진 진행성 종양을 가진 환자에서 HDM201의 안전하고 내약성 있는 용량을 결정하고 평가하였다. 데이터 컷오프의 시점 (2016년 4월 1일)에, 74명의 환자가 HDM201을 받았다 (여전히 치료를 받고 있는 38명의 환자를 가진 Reg 1 및 36명의 환자를 가진 Reg 2). 결과는 두 요법 (Reg 1 및 Reg 2) 모두에서 통상적인 등급 3/4 유해 사례 (AE)가 빈혈 (8%; 17%), 호중구 감소증 (26%; 14%), 및 혈소판 감소증 (24%; 28%)임을 나타냈다. 예비 데이터는 혈액학적 독성이 지연되고 요법에 의존하며 Reg 1 요법이 더 높은 누적 용량을 허용함을 나타냈다.
APG-115
Figure pct00005
는 새로운, 경구 활성 소분자 MDM2 억제제이다. APG-115는 MDM2와 결합한 후 p53 발현을 복원하고 야생형 p53을 가진 종양 세포에서 p53 매개 아폽토시스를 활성화한다. APG-115는 고형 종양 (NCT02935907), 전이성 흑색종 (NCT03611868), 및 타액선 암종 (NCT03781986)의 치료를 위한 임상 시험에 사용되었다. 연구 NCT02935907은 진행성 고형 종양 또는 림프종을 가진 환자에서 경구 투여된 APG-115의 안전성, 약동학 및 약력학 특성에 대한 I상 연구였다. 이 연구에서는 상이한 용량 수준 (10 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg 및 300 mg 포함)을 시험하였다. 결과는 APG-115의 최적 용량은 어떤 용량-제한 독성도 없는 100 mg이라는 것을 나타냈다. 최근 연구에서, APG-115는 종양 미세환경 (TME)의 항종양 면역을 매개하였다. APG-115는 시험관내에서 골수-유래 대식세포에서 p53 및 p21을 활성화하였고, c-Myc 및 c-Maf를 하향-조절함으로써 면역억제성 M2 대식세포의 수를 감소시켰다. 게다가, APG-115는 T 세포에서 공동자극 활성을 나타냈고 종양 세포에서 PD-L1의 발현을 증가시켰다. 이 증거는 APG와 면역요법의 조합이 새로운 항종양 요법일 수 있음을 시사한다.
AMG 232
Figure pct00006
는 MDM2-p53 상호작용을 차단함으로써 p53 종양 억제를 복원시키는 연구용 경구 선택적 MDM2 억제제이다. AMG 232의 활성 및 p53 신호에 대한 그의 효과는 몇몇 전임상 종양 모델에서 특성화되었다. AMG 232는 p53 활성을 강하게 유도한 MDM2에 결합하여, 세포 주기 정지를 발생시키고 종양 세포 증식을 억제한다. AMG 232 예컨대 NCT01723020, NCT02016729, NCT02110355, NCT03031730, NCT03041688, NCT03107780, 및 NCT03217266의 몇몇 임상 시험은 인간 암을 치료하기 위해 계속 진행 중이었다. NCT02016729는 AMG 232의 안전성, 약동학, 및 MTD를 평가한 개방-표지 I상 연구였다. 이 연구에서, AMG 232는 두 가지 요법 (아암 1 및 아암 2)으로 투여되었다. 환자는 AMG 232 60, 120, 240, 360, 480, 또는 960 mg으로 단일요법으로서 1일 1회 7일 동안 2주마다 아암 1에서 치료를 받거나 60 mg으로 트라메티닙 2 mg과 조합하여 아암 2에서 치료를 받았다. 결과는 통상적인 치료-관련 AE가 메스꺼움 (58%), 설사 (56%), 구토 (33%), 및 식욕 감소 (25%)를 포함한다는 것을 나타냈다. 그러나, AMG 232의 MTD는 도달되지 않았다. 더 높은 용량에서 그의 허용되지 않는 위장관 AE 때문에 용량 증량을 중단하였다.
MK-8242
Figure pct00007
는 MDM2-p53 상호작용을 표적으로 하는 강력한 소분자 억제제이다. MK-8242는 대부분의 급성 림프모구성 백혈병 이종이식편에서 다양한 고형 종양 유형의 종양 퇴행 및 완전 또는 부분 반응을 유도하였다. MK-8242는 2개의 I상 임상 시험 (NCT01451437 및 NCT01463696)에서 사용되었다. NCT01451437의 연구는 불응성 또는 재발성 AML을 가진 성인 참가자에서 MK-8242 단독 및 시타라빈과의 조합에 대한 연구였다. 이 연구에서 MK-8242는 28일 주기로 7일 온/7일 오프에 대해 30-250 mg (p.o;QD) 또는 120-250 mg (p.o;BID)으로 투여되었고 최적화된 요법은 21일 주기로 7 온/14 오프에 대해 210 또는 300 mg (p.o;BID)으로 투여되었다. 26명의 환자가 이 연구에 등록되었으며, 그 중 5명은 AE로 인해 중단되었고 7명의 환자는 사망하였다. 이 연구는 7 온/14 오프 요법은 7 온/7 오프 요법보다 더 유리한 안전성 프로파일을 가진다는 것을 나타냈다. NCT01463696은 진행성 고형 종양을 가진 환자에서 MK-8242의 안전성과 약동학 프로파일을 평가하는 것을 목표로 하였다. 이 연구에서, 파트 1에서 MTD를 결정하기 위해 약물 용량을 증량하고 파트 2에서 MTD를 확인하고 권장 2상 용량 (RPTD)을 확립하였다. 마지막으로, 47명의 환자가 이 연구에 등록되어 MK-8242로 60 내지 500 mg 범위의 8개 수준 용량으로 치료를 받았다. 결과는 MK-8242가 400 mg (BID)에서 허용되는 내약성 프로파일로 p53 경로를 활성화한다는 것을 나타냈다.
MDM2 억제제 BI 907828은 잠재적인 항신생물 활성을 가진, 뮤린 이중 미세염색체 2 (MDM2)의 경구로 이용가능한 억제제이다. 경구 투여시, BI 907828은 MDM2 단백질에 결합하여 종양 억제인자 단백질 p53의 전사 활성화 도메인에 대한 그의 결합을 방지한다. MDM2-p53 상호작용을 방지함으로써, p53의 전사 활성이 복원된다. 이것은 종양 세포 아폽토시스의 p53-매개 유도를 발생시킨다. 현재 이용가능한 MDM2 억제제와 비교할 때, BI 907828의 약동학적 특성은 이 부류의 억제제에 대한 골수억제, 온-타겟, 용량-제한 독성을 감소시킬 수 있는 보다 최적의 투여 및 용량 일정을 허용한다.
NVP-CGM097
Figure pct00008
은 TR-FRET 검정에서 hMDM2에 대한 1.3 nM의 Ki 값을 가진 매우 강력하고 선택적인 MDM2 억제제이다. 그것은 Mdm2 단백질의 p53 결합-부위에 결합하여, 두 단백질 모두 간의 상호작용을 방해하여, p53 경로의 활성화를 발생시킨다.
밀라데메탄
Figure pct00009
은, 잠재적인 항신생물 활성을 가진 경구적으로 이용가능한 MDM2 (뮤린 이중 미세염색체 2) 길항제이다. 경구 투여시, 밀라데메탄은 MDM2 단백질에 결합하여, 상기 단백질이 종양 억제인자 단백질 p53의 전사 활성화 도메인에 결합하는 것을 방지한다. 이 MDM2-p53 상호작용을 방지함으로써, p53의 프로테아좀-매개 효소 분해가 억제되고 p53의 전사 활성이 복원된다. 이것은 p53 신호전달의 복원을 발생시키고 종양 세포 아폽토시스의 p53-매개 유도를 발생시킨다. 징크 핑거 단백질이며 p53 경로의 음성 조절자인 MDM2는 암 세포에서 과발현되며; 그것은 암 세포 증식과 생존에 연루되어 있다.
상기 화합물 중 임의의 것의 염이 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, MDM2 억제제는 미국 출원 공개 번호 2008/0015194로서 공개된 미국 출원 일련 번호 11/626,324; 미국 비가출원 일련 번호 12/986,146; WO 2011/085126으로서 공개된 국제 출원 번호 PCT/US11/20414; 또는 WO 2011/085129로서 공개된 국제 출원 번호 PCT/US11/20418에 개시된 바와 같은 화합물일 수 있으며; 상기 각각이 본원에 참조로 포함된다.
MDM2 억제제는 문헌 [Vassilev 2006 Trends in Molecular Medicine 13(1), 23-31]에 개시된 바와 같은 화합물일 수 있다. 예를 들어, MDM2 억제제는 누틀린 (예를 들어, 시스-이미다졸 화합물, 예컨대 누틀린-3a); 문헌 [Grasberger et al. 2005 J Med Chem 48, 909-912]에 개시된 바와 같은 벤조디아제핀; 문헌 [Issaeva et al. 2004 Nat Med 10, 1321-1328]에 개시된 바와 같은 RITA 화합물; 문헌 [Ding et al. 2005 J Am Chem Soc 127, 10130-10131] 및 [Ding et al. 2006 J Med Chem 49, 3432-3435]에 개시된 바와 같은 스피로-옥스인돌 화합물; 또는 문헌 [Lu et al. 2006 J Med Chem 49, 3759-3762]에 개시된 바와 같은 퀴니놀 화합물일 수 있다. 추가 예로서, MDM2 억제제는 문헌 [Chene 2003 Nat. Rev. Cancer 3, 102-109; Fotouhi and Graves 2005 Curr Top Med Chem 5, 159-165]; 또는 [Vassilev 2005 J Med Chem 48, 4491-4499]에 개시된 바와 같은 화합물일 수 있다.
MDM2-억제가 공여자 T 세포의 세포독성 및 장수를 촉진한다는 것이 본 발명의 MDM2 억제제의 중요한 이점이다.
실시양태에서, MDM2 억제는 환자에서 allo-T 세포의 표현형에 영향을 미쳐, 증가된 세포독성 및 장수를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, MDM2 억제는 allo-T 세포가 장수와 연관된 마커인 Bcl-2-수용체 및 IL7-수용체 (DE127)의 발현을 상향조절하도록 할 수 있다. 더욱이, 세포독성 마커의 상향조절된 발현, 예컨대 CD8+ allo-T 세포에 의한 퍼포린, CD107a, IFN-γ, TNF 및 CD69의 증가된 발현이 본 발명의 맥락에서 MDM2 억제제에 의한 MDM2 억제시 관찰될 수 있다.
세포독성 T 세포 (세포독성 T 림프구, CTL, T-킬러 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T-세포 또는 킬러 T 세포라고도 공지됨)는 암 세포, 감염 (특히 바이러스로)된 세포, 또는 다른 방식으로 손상된 세포를 사멸시키는 T 림프구 (백혈구의 한 유형)이다. 대부분의 세포독성 T 세포는 특이적 항원을 인식할 수 있는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현한다. 항원은 면역 반응을 자극할 수 있는 분자이며 종종 암 세포나 바이러스에 의해 생성된다. 세포 내부의 항원은 클래스 I MHC 분자에 결합되고, 클래스 I MHC 분자에 의해 세포 표면으로 가져오게 되어, 거기서 이들이 T 세포에 의해 인식될 수 있다. TCR이 그 항원에 특이적인 경우, 이는 클래스 I MHC 분자와 항원의 복합체에 결합하고, T 세포가 세포를 파괴한다. TCR이 클래스 I MHC 분자에 결합하기 위해, 전자가 클래스 I MHC 분자의 불변 부분에 결합하는, CD8이라고 하는 당단백질을 동반하여야 한다. 따라서, 이들 T 세포를 CD8+ T 세포라고 한다. CD8과 MHC 분자 사이의 친화도는 항원-특이적 활성화 동안 TC 세포와 표적 세포가 밀접하게 함께 결합되도록 유지한다. CD8+ T 세포는 일단 이들이 활성화되면 TC 세포로서 인식되며 일반적으로 면역계 내에서 미리 정의된 세포독성 역할을 갖는 것으로서 분류된다. CD8+ T 세포는 또한 일부 시토카인을 만들 수 있다.
MDM2 억제제의 투여는 환자의 암 세포 상에서 TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 수용체 1(TRAIL-R1), TRAIL-R2, 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 분자 및 HLA 클래스 II 분자의 상향조절 및 증가된 발현을 유도할 수 있다. TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)는 아폽토시스라고 하는 세포 사멸의 과정을 유도하는 리간드로서 기능하는 단백질이다. TRAIL은 대부분의 정상 조직 세포에서 생산되고 분비되는 시토카인이다. 그것은 특정 사멸 수용체, TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2에 결합함으로써, 주로 종양 세포에서 아폽토시스를 유발한다. TRAIL은 또한 CD253 (분화 클러스터 253) 및 TNFSF10 (종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리, 구성원 10으로 지정되었다.
TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL) 및 그의 5개의 세포 수용체는 면역계에서 세포간 아폽토시스 반응을 조절하는 것으로 나타난 3개의 사멸-수용체/리간드 시스템 중 하나를 구성한다. 항원 또는 종양 챌린지의 상이한 시스템에서, TRAIL/TRAIL 수용체 시스템은 면역억제, 면역조절, 프로바이러스 또는 항바이러스, 및 종양 면역감시 기능을 갖는 것으로 나타났다. TRAIL은 두 개의 아폽토시스-유도 수용체 - TRAIL-R1 (DR4) 및 TRAIL-R2 (DR5) - 및 아폽토시스 신호를 전달할 수 없는 두 개의 추가 세포-결합 수용체 - TRAIL-R3 (LIT, DcR1) 및 TRAIL-R4 (TRUNDD, DcR2) - 때때로 미끼 수용체라고도 한다 - 에 결합할 수 있다. TRAIL에 의한 아폽토시스 유도의 초기 단계는 리간드가 TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2에 결합하는 것이다. 이로써 수용체가 삼량체화되고 사멸-유도 신호전달 복합체 (DISC)가 어셈블리된다. 어댑터 분자인 Fas-연관 사멸 도메인 (FADD)은 DISC로 전좌되어 거기서 수용체의 세포내 사멸 도메인 (DD)과 상호작용한다. 그의 두 번째 기능성 도메인인 사멸 이펙터 도메인 (DED)을 통해, FADD는 프로카스파제 8과 10을 DISC로 동원하여 거기서 이들이 자가촉매반응적으로 활성화된다. 이 활성화는 카스파제-의존성 신호전달 캐스케이드의 시작을 나타낸다. 이펙터 카스파제의 완전한 활성화는 표적 단백질의 절단, DNA의 단편화 및, 궁극적으로, 세포 사멸을 발생시킨다. TRAIL 및 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2의 기능은 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Falschlehner et al. (Immunology. 2009 Jun; 127(2): 145-154)]에 의해 기재되어 있다.
놀랍게도 투여 MDM2 억제는 T 세포 상에 TRAIL의 부재로 인해 본 발명의 맥락에서 allo-T 세포의 세포독성 효과를 매개하는데 적어도 부분적으로 요구되었던 본 발명의 맥락에서 암 세포에 대한 TRAIL-R1/R2 발현을 증강시켜 강하게 감소된 사멸을 발생시킨다는 것이 밝혀졌다.
더욱이, MDM2-억제가 암 세포, 예컨대 백혈병 세포 및 특히 AML 세포 상에서 MHC 단백질을 상향조절하여, HCT 및 allo-T 세포 이식 후 동종이계 T 세포에 대한 그의 취약성을 증강시킬 수 있다는 것은 완전히 예상치 못한 일이었다.
주요 조직적합성 복합체 (MHC)는 적응 면역계에 필수적인 세포 표면 단백질을 코딩하는 밀접하게 연결된 다형성 유전자 세트를 함유하는 척추동물 DNA 상에 큰 유전자좌이다. 이 위치는 이식시 조직 적합성 연구에서 발견되었기 때문에 그의 명칭을 얻었다. 이후 연구는 비적합성으로 인한 조직 거부가 MHC 분자의 실제 기능을 차단하는 - 자기-단백질로부터 또는 병원체로부터 유래된 항원과 결합하고 적절한 T-세포에 의한 인식을 위해 세포 표면 상에 항원을 제시하는, 실험적인 인공물이라는 것을 밝혀냈다. MHC 분자는 백혈구, 다른 백혈구 또는 체세포와의 상호작용을 매개한다. MHC는 장기 이식에 대한 공여자의 적합성, 뿐만 아니라 교차-반응 면역화를 통해 자가면역 질환에 대한 그의 감수성을 결정한다.
MHC 클래스 I 분자는 모든 유핵 세포 및 또한 혈소판-본질적으로 적혈구를 제외한 모든 세포에서 발현된다. 이는 세포독성 T 림프구 (CTL)라고도 하는 킬러 T 세포에 에피토프를 제공한다. CTL은 T-세포 수용체 (TCR) 외에도 CD8 수용체를 발현한다. CTL의 CD8 수용체가 MHC 클래스 I 분자에 도킹할 때, CTL의 TCR이 MHC 클래스 I 분자 내의 에피토프에 맞으면, CTL은 세포가 아폽토시스에 의해 프로그램된 세포 사멸을 겪도록 촉발한다. 따라서, MHC 클래스 I은 박테리아 L형, 박테리아 속 미코플라즈마(Mycoplasma) 및 박테리아 속 리케차(Rickettsia)를 포함한, 바이러스 및 일부 박테리아와 같은 세포내 병원체를 해결하는 주요 수단인 세포 면역을 매개하는데 도움이 된다. 인간에서, MHC 클래스 I은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 분자를 포함한다.
MHC 클래스 II는 모든 세포 유형에 의해 조건부로 발현될 수 있으나, 일반적으로 "전문" 항원-제시 세포 (APC): 대식세포, B 세포, 및 특히 수지상 세포 (DC)에서만 발생한다. APC는 항원 단백질을 취하고, 항원 처리를 수행하고, 그것의 분자 분획-에피토프라고 하는 분획-을 반환하고 이를 MHC 클래스 II 분자 내에서 커플링된 APC 표면에 디스플레이한다 (항원 제시). 세포 표면 상에서, 에피토프는 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 면역학적 구조에 의해 인식될 수 있다. 에피토프에 결합하는 분자 영역은 파라토프이다. 헬퍼 T 세포의 표면 상에는 CD4 수용체, 뿐만 아니라 TCR이 있다. 나이브 헬퍼 T 세포의 CD4 분자가 APC의 MHC 클래스 II 분자에 도킹할 때, 그의 TCR은 MHC 클래스 II 내에 커플링된 에피토프를 만나 결합할 수 있다. 이 사건은 나이브 T 세포를 프라이밍한다. 국소 환경, 즉, 미세환경에서 APC에 의해 분비되는 시토카인의 균형에 따라, 나이브 헬퍼 T 세포 (Th0)는 지금까지 확인된 바와 같이, 유형 1 (Th1), 유형 2 (Th2), 유형 17 (Th17), 또는 조절/억제인자 (Treg)의 표현형의 기억 Th 세포 또는 이펙터 Th 세포로 분극화되며, 즉 Th 세포의 말단 분화이다. 따라서 MHC 클래스 II는 항원-또는, APC가 Th0 세포를 원칙상 Treg 세포로 분극화하는 경우, 항원의 면역 내성-에 대한 면역화를 매개한다. 항원에 대한 1차 노출 동안의 분극화는 유사한 항원에 대한 2차 노출시 그의 기억 회상이 촉발될 때 기억 Th 세포가 조정하는 면역 반응을 왜곡함(skewing)으로써, 염증성 장 질환 및 천식과 같은 다수의 만성 질환을 결정하는데 핵심이다. B 세포는 MHC 클래스 II를 발현하여 Th0에 항원을 제시하나, 그의 B 세포 수용체가, MHC에 의해 매개되지 않는 상호작용인, 일치하는 에피토프에 결합할 때, 이들 활성화된 B 세포가 가용성 면역글로불린: 체액성 면역을 매개하는 항체 분자를 분비한다. 클래스 II MHC 분자는 또한 이종이량체이며, α 및 β 서브유닛 둘 다에 대한 유전자는 다형성이며, MHC 클래스 II 하위영역 내에 위치한다. MHC-II 분자의 펩티드-결합 그루브는 동일한 쇄의 두 도메인이 관여하는 MHC-I 분자와 달리, 이종이량체의 두 서브유닛인 α1 및 β1의 N-말단 도메인에 의해 형성된다. 게다가, MHC-II의 두 서브유닛 모두 CD4 공동-수용체에 의해 인식될 수 있는 막관통 나선 및 면역글로불린 도메인 α2 또는 β2를 함유한다. 이런 식으로, 상이한 림프구가 상이한 T-세포 수용체 (TCR) 공동-수용체를 발현하기 때문에, MHC 분자는 어떤 유형의 림프구가 높은 친화도로 주어진 항원에 결합할 수 있는지 샤페론 역할을 한다.
인간 백혈구 항원 (HLA) 시스템 또는 복합체는 인간의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 유전자 복합체에 의해 코딩되는 관련 단백질의 군이다. 모두 HLA 클래스1 군인 MHC 클래스 I (A, B 및 C)에 상응하는 HLA는 세포 내부로부터의 펩티드를 제시한다. 예를 들어, 세포가 바이러스에 감염되면, HLA 시스템은 바이러스의 단편을 세포 표면으로 가져와 세포가 면역계에 의해 파괴될 수 있도록 한다. 이들 펩티드는 프로테아좀에서 분해되는 소화 단백질로부터 생성된다. 일반적으로, 이들 특정한 펩티드는 길이가 약 8-10개의 아미노산인 소형 중합체이다. MHC 클래스 I에 의해 제시된 외부 항원은 세포를 파괴하는 킬러 T-세포 (CD8-양성 또는 세포독성 T-세포라고도 함)라고 하는 T 림프구를 끌어들인다. 일부 새로운 연구는 10개 보다 긴 아미노산 (11-14개 아미노산) 항원이 세포독성 T 세포 반응을 도출하는 MHC I에 제시될 수 있다고 제안하였다.[3] MHC 클래스 I 단백질은 HLA 단백질과 달리 15번 염색체의 유전자에 의해 코딩되는 β2-마이크로글로불린과 회합한다.
MHC 클래스 II (DP, DM, DO, DQ, 및 DR)에 상응하는 HLA는 세포 외부로부터 T-림프구로의 항원을 제시한다. 이들 특정한 항원은 T-헬퍼 세포 (CD4-양성 T 세포라고도 함)의 증식을 자극하여, 항체-생성 B 세포를 자극하여 그 특이적 항원에 대한 항체를 생성한다. 자기-항원은 조절 T 세포에 의해 억제된다.
염색체 유지 관리 1 (CRM1)이라고도 하는, XPO1 (엑스포틴 1)은 단백질, rRNA, snRNA, 및 일부 mRNA의 핵 외수송을 매개하는 진핵 단백질이다. 엑스포틴 1은 류신-풍부 핵 외수송 신호 (NES)-의존성 단백질 수송을 매개하고 구체적으로는 Rev 및 U snRNA의 핵 외수송을 매개한다. 이는 사이클린 B, MAPK, 및 MAPKAP 키나제 2의 국부화를 제어함으로써 몇몇 세포 과정의 제어에 관여하며, NFAT 및 AP-1을 또한 조절한다. 더욱이, p53과 상호작용하고 핵으로부터의 그의 외수송을 매개하여, TRAIL-R1 및 -R2뿐만 아니라 MHC-II를 코딩하는 유전자와 같이, p53 제어 하에 있는 유전자의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다.
XPO1은 또한 많은 악성종양에서 상향조절되며 불량한 예후와 연관이 있다. 그의 억제는 치료의 표적이 되어 왔으며, 따라서, 핵 수송의 선택적 억제제 (SINE) 화합물이 새로운 부류의 항암제로서 개발되었다. 가장 널리 공지된 SINE 작용제는셀리넥서 (KPT-330)이며 고형 종양 및 혈액학적 악성종양 둘 다에서 I상 및 II상 임상 시험에서 널리 시험되었다.
핵 외수송의 선택적 억제제 (SINE 또는 SINE 화합물)는 세포 핵으로부터 세포질로의 수송에 관여하는 단백질인 엑스포틴 1 (XPO1 또는 CRM1)을 차단하는 약물이다. 이것은 세포 주기 정지와 아폽토시스에 의한 세포 사멸을 유발한다. 따라서, SINE 화합물은 항암제로서 관심을 받고 있으며; 몇몇이 개발 중이며, 하나 (셀리넥서)는 최후의 수단의 약물로서 다발성 골수종 치료용으로 승인되었다. 원형적인 핵 외수송 억제제는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 박테리아의 천연물이자 이차 대사물인 렙토마이신 B이다. SINE은 KPT-330 외에도 예를 들어 KPT-8602, KPT-185, KPT-276 KPT-127, KPT- 205, 및 KPT-227을 또한 포함한다. 치료 목적을 위한 XPO-1 억제는 문헌, 예를 들어 [Parikh et al (J Hematol Oncol. 2014; 7: 78)]에서 검토되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에게 투여하기 위한 제약 조성물은 선택된 분자 외에도 적어도 1종의 추가의 제약상 허용되는 첨가제 예컨대 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 방부제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 또한 1종 이상의 추가 활성 성분 예컨대 항균제, 항염증제, 마취제 등을 포함할 수 있다. 이들 제제에 유용한 제약상 허용되는 담체는 통상적이다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)]은 본원에 개시된 화합물의 제약 전달에 적합한 조성물 및 제제를 기재한다.
일반적으로, 담체의 특성은 이용되는 특정한 투여 방식에 따라 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구 제제는 대개 비히클로서 제약 및 생리학상 허용되는 유체 예컨대 물, 생리 식염수, 균형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤을 포함하는 주사가능한 유체를 함유한다. 고체 조성물 (예를 들어, 분말, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체는, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 외에도, 투여될 제약 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 방부제, 및 pH 완충제 등, 예를 들어 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 치료 방법에 따라, 화합물은 치료 또는 예방이 요구되는 장애의 관리와 연관된 통상적인 방법론과 일치하는 방식으로 대상체에게 전달될 수 있다. 본원의 개시내용에 따르면, 예방적 또는 치료적 유효량의 화합물 및/또는 다른 생물학적 활성제는 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 선택된 질환 또는 병태 또는 그의 하나 이상의 증상(들)을 예방, 억제, 및/또는 개선하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 투여된다.
화합물 또는 생성물의 "투여" 및 "을 투여하는"은 화합물, 화합물의 전구약물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 화합물 또는 조성물은 대상체에게 (예를 들어, 정맥내로) 또 다른 사람에 의해 투여될 수 있거나 대상체에 의해 자기-투여될 수 있다 (예를 들어, 정제).
의학적 상태의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 화합물에 대한 본원의 임의의 언급은 또한 화합물, 또는 상기 화합물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 상기 의학적 상태를 치료하는 방법, 상기 의학적 상태의 치료에서 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
투여량은 목표 부위 (예를 들어, 폐, 골수 또는 전신 순환계)에서 원하는 농도를 유지하기 위해 주치의에 의해 달라질 수 있다. 전달 방식, 예를 들어 경표피, 직장, 경구, 폐, 또는 비강내 전달 대 정맥내 또는 피하 전달을 기반으로 하여 더 높거나 더 낮은 농도가 선택될 수 있다. 투여량은 또한, 예를 들어, 폐내 스프레이 대 분말, 지속 방출 경구 대 주사된 미립자 또는 경피 전달 제제 등의 투여된 제제의 방출 속도를 기반으로 하여 조정될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 치료 방법은 바람직하게는 치료 유효량의 화합물 및 잠재적으로 본원에 개시된 추가 화합물 또는 생성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "의약"은 질환을 진단, 치유, 치료, 또는 예방하기 위해 사용되는 약물, 제약 약물, 또는 의약품을 지칭한다. 이는 질환을 치료하거나 예방하는 특성을 가진 것으로서 제시된 임의의 물질 또는 물질의 조합을 지칭한다. 상기 용어는 약리학적, 면역학적 또는 대사 작용을 발휘함으로써 생리학적 기능을 복원, 교정 또는 변형하기 위한, 또는 의학적 진단을 내리기 위한 관점으로 사용되거나 투여될 수 있는 임의의 물질 또는 물질의 조합을 포함한다. 용어 의약은 생물학적 약물, 소분자 약물 또는 생리학적 과정에 영향을 미치는 기타 물리적 물질을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 MDM2 억제제 및 잠재적으로 추가의 화합물은 그것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부, 및 주사와 같은 투여 경로에 대해 멸균이 필요한지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명은 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소로, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 방광내, 점막으로, 심장막내, 제대내, 안구내, 경구, 국소로, 국부적으로, 흡입 (예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포에 직접 베이딩(bathing)하는 국부화 관류, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 지질 조성물 (예를 들어, 리포좀)로, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 바와 같은 다른 방법 또는 전술한 것들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조).
본 발명의 맥락에서 용어 "암 요법"은 수술, 화학요법, 방사선요법, 방사선조사 요법, 호르몬 요법, 표적 요법, 세포 요법, 암 면역요법, 모노클로날 항체 요법을, 제한 없이, 포함하는 모든 종류의 암 치료를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 MDM2 억제제의 투여는 보다 광범위한 암 요법 전략에 내포될 수 있다.
MDM2 억제제의 투여는 하나 이상의 다른 암 요법과 조합될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 용어 "조합"은 본 발명에 따른 화합물을 받는 개체가 또한 반드시 동시에 발생하지는 않는 다른 암 요법, 단일 약리학적 조성물로 또는 동일한 경로의 투여를 통해 조합되는 것을 나타낸다. 따라서 "조합"은 암을 앓고 있는 개체를 하나 초과의 암 요법으로 치료하는 것을 지칭한다. 조합 투여는 동시 치료, 공동-치료 또는 혼합 치료(joint treatment)를 포함하며, 이로써 치료는 서로 몇 분 이내에, 서로 동일한 시간, 동일한 날, 동일한 주 또는 동일한 달에 발생할 수 있다.
본 발명의 의미에서 암 요법은 방사선조사 요법 및 화학요법을 포함하나 이에 제한되지는 않으며 DNA 손상을 복구하는 세포의 능력을 압도하여 작용하여, 세포 사멸을 발생시킨다.
이 맥락에서, 화학요법은 표준화된 화학요법 요법의 일부로서 1종 이상의 항암 약물 (화학요법제)을 사용하는 암 치료 범주를 지칭한다. 화학요법은 치유 의도 (이는 거의 항상 약물 조합 포함)로 제공될 수 있거나, 이는 생명 연장 또는 증상 감소 (완화적 화학요법)를 목표로 할 수 있다. 화학요법은 의학 종양학 (구체적으로 암에 대한 약물요법에 전념하는 의학 분야)의 주요 범주 중 하나이다. 화학요법제는 암을 치료하는데 사용되며 수일에서 수주의 기간에 걸쳐 2종 이상의 작용제를 조합하여, 1회 이상의 주기 요법으로 투여된다. 이러한 작용제는 높은 증식률을 가진 세포 - 예를 들어 암 자체뿐만 아니라, GI관 (메스꺼움 및 구토 유발), 골수 (다양한 혈구감소증 유발) 및 모발 (대머리 발생)에 독성이 있다.
화학요법제는, 제한 없이, 악티노마이신, 올-트랜스 레티노산, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메클로레타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉시드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 방사선조사 또는 방사선 요법은, 일반적으로 암 세포 또는 종양 세포와 같은 악성 세포를 제어하거나 사멸시키기 위한 암 치료의 일부로서 이온화 또는 자외선-가시광선 (UV/Vis) 방사선을 사용하는 치료적 접근법에 관한 것이다. 방사선 요법은 신체의 한 부위에 국부화되는 경우, 다수의 암 유형에 치유적일 수 있다. 이는 또한 원발성 악성종양 (예를 들어, 초기 단계의 유방암)을 제거하기 위한 수술 후 종양 재발을 예방하기 위해, 아주반트 요법의 일부로서 사용할 수 있다. 방사선 요법은 화학요법과 상승작용적이며 감수성 암에서 화학요법 전에, 동안에, 및 후에 사용할 수 있다. 방사선 요법은 세포 성장을 제어하는 그의 능력 때문에 암성 종양에 통상적으로 적용된다. 전리 방사선은 암성 조직의 DNA를 손상시켜 세포 사멸을 발생시킴으로써 작용한다. 방사선 요법은 전신 또는 국부적으로 사용할 수 있다.
방사선 요법은 암 세포의 DNA를 손상시킴으로써 작용한다. 이 DNA 손상은 광자 또는 하전 입자의 두 가지 유형의 에너지 중 하나에 의해 유발된다. 이 손상은 DNA 쇄를 구성하는 원자의 직접적 또는 간접적 이온화이다. 간접 이온화는 물의 이온화 결과로서 발생하며, 이는 히드록실 라디칼을 포함한 자유 라디칼의 형성을 발생시켜, 그 다음에 DNA를 손상시킨다. 광자 요법에서, 대부분의 방사선 효과는 자유 라디칼을 통해 매개된다. 세포는 단일-가닥 DNA 손상 및 이중 가닥 DNA 손상을 복구하는 메커니즘을 갖는다. 그러나, 이중-가닥 DNA 파단은 복구하기가 훨씬 더 어렵고 극적인 염색체 이상 및 유전적 결실을 발생시킬 수 있다. 이중-가닥 파단을 표적으로 하는 것은 세포가 세포 사멸을 겪을 확률을 증가시킨다.
광자 방사선 요법에 사용되는 방사선의 양은 회색 (Gy)으로 측정되며 치료하는 암의 유형 및 단계에 따라 다르다. 치유적 사례의 경우, 고형 상피 종양에 대한 전형적인 용량은 60 내지 80 Gy의 범위이며, 한편 림프종은 20 내지 40 Gy로 치료한다. 예방적 (아주반트) 용량은 전형적으로 1.8 내지 2 Gy 분획에서 약 45 내지 60 Gy이다 (유방암, 두경부암의 경우).
통상적인 외부 빔 방사선 요법을 포함한 외부 빔 방사선 요법, 정위 방사선(방사선 수술), 가상 시뮬레이션, 3차원 입체형태적 방사선 요법, 및 강도-조정 방사선 요법, 강도-조정 방사선 요법 (IMRT), 부피 조정 아크 요법 (VMAT), 입자 요법, 오거 요법, 근접요법, 수술 중 방사선요법, 방사성 동위원소 요법 및 심호흡 숨 참기(deep inspiration breath-hold)와 같은 상이한 유형의 방사선 요법이 공지되어 있다.
외부 빔 방사선 요법은 X-선, 감마선 및 하전 입자를 포함하며 전반적인 치료 접근법에 따라 저용량률 또는 고용량률로 적용할 수 있다.
내부 방사선 요법에서 방사성 물질은 하나 이상의 모노클로날 항체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 방사성 아이오딘은 갑상선 악성종양에 사용할 수 있다. 고용량 요법 (HDR) 또는 저용량 요법 (LDR)의 근접요법은 전립선암에서 IR과 조합될 수 있다.
본 발명에 따르면, DNA 손상-유도 화학요법은 안트라사이클린 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 미톡산트론; 토포이소머라제 I의 억제제 예컨대 이리노테칸 (CPT-11) 및 토포테칸; 에토포시드, 테니포시드 및 타플루포시드를 포함한 토포이소머라제 II의 억제제; 백금-기반 작용제 예컨대 카르보플라틴, 시스플라틴, 및 옥살리플라틴; 및 다른 화학요법 예컨대 블레오마이이신을 포함하나 이에 제한되지는 않는 화학요법제의 투여를 포함한다.
본 개시내용은 또한 포유동물 대상체에서 질환 및 기타 병태의 예방 및 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 제약 조성물, 활성 성분, 및/또는 이를 투여하기 위한 수단을 함유하는 키트, 패키지 및 다중-용기 유닛을 포함한다.
도면
본 발명은 다음 도면에 의해 추가로 기재된다. 이들은 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니나 본원에 기재된 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 제공된 본 발명의 측면의 바람직한 실시양태를 나타낸다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: MDM2-억제는 다수의 GVL 마우스 모델에서 AML 생존을 개선시킨다
(a) AML WEHI-3B 세포 (BALB/c 배경) 및 동종이계 C57BL/6 BM의 전달 후 BALB/c 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 나타낸 바와 같이, 마우스에 추가적인 동종이계 T-세포 (C57BL/6)를 주사하고/하거나 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. 군당 n=9-10마리의 독립적인 동물이 제시되고, 양측(two-sided) 만텔-콕스 검정(Mantel-Cox test)을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(b) AMLMLL-PTD FLT3-ITD 세포 (C57BL/6 배경) 및 동종이계 BALB/c BM의 전달 후 C57BL/6 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 나타낸 바와 같이, 마우스에 추가적인 동종이계 T-세포 (BALB/c)를 주사하고/하거나 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. 2개의 실험으로부터 n=10마리의 생물학적으로 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(c) 인간 OCI-AML-3 세포의 전달 후 Rag2 -/- Il2rγ -/- 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 나타낸 바와 같이, 마우스에 추가적인 인간 T-세포 (건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리됨)를 주사하고/하거나 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. 3개의 실험으로부터 n=12마리의 생물학적으로 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(d) OCI-AML3 세포와 접촉된 단리된, CD3/28 및 IL-2 확장된 인간 T-세포의 특이적 용해 백분율이 제시된다. OCI-AML3 세포를 DMSO 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 전처리하고 E:T, 이펙터 (T-세포) 대 표적 (OCI-AML3 세포) 비는 나타낸 바와 같이 10:1 내지 1:1로 다양하였다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 대표적인 실험이 제시된다.
(e) OCI-AML3 세포에서 카스파제-3의 활성화 및 로딩 대조군 (β-액틴)을 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯. DMSO 또는 RG-7112 (1 μM)에 노출된 OCI-AML3 세포를 활성화된 T-세포와 10:1의 E:T 비로 4시간 동안 공동-배양하였다.
(f) 막대 다이어그램은 β-액틴에 대해 정규화된 절단된 카스파제-3 대 프로-카스파제-3의 비를 나타낸다. 값은 T 세포 단독 군 ("1"로 설정)에 대해 정규화되었다.
(g) 24시간 동안 DMSO, RG-7112 (1 μM) 또는 HDM-201 (200 nM)로 처리한 후 OCI-AML3 세포에서의 TNFRSF10A 및 TNFRSF10B의 발현 수준의 마이크로어레이-기반 분석은 로버스트 멀티칩 평균(Robust Multichip Average) (RMA) 신호 값의 타일 디스플레이, 군당 n=6개의 생물학적으로 독립적인 샘플로서 표시된다.
(h) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R1 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정(Student's unpaired t-test)을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(i) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R2 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(j, k) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 (p53+/+) 또는 p53 넉아웃 (p53-/-) OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R1 (j) 또는 TRAIL-R2 (k) 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(l, m) TRAIL-R1 (TNFRSF10A) (l) 및 TRAIL-R2 (TNFRSF10B) (m)의 프로모터에 대한 p53의 결합을 검출하기 위해 12시간 동안 DMSO 또는 2 μM RG-7112로 처리된 OCI-AML3 세포에서의 ChIP-qPCR 분석. 데이터는 퍼센트 투입으로서 제시되며 3개의 실험을 대표한다; 오차 막대, 세 가지 기술적 복제물로부터 s.e.m. N.D, 검출되지 않음.
도 2: MDM2-억제는 TRAIL-R1/2 발현을 p53-의존성 방식으로 증강시킨다
(a) AMLMLL-PTD FLT3-ITD 세포 (C57BL/6 배경) 및 동종이계 BALB/c BM의 전달 후 C57BL/6 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 나타낸 바와 같이, 마우스에 추가적인 동종이계 T-세포 (BALB/c)를 주사하고/하거나, MDM2-억제제 RG-7112로 그리고 항-TRAIL-항체 또는 IgG-이소형으로 처리하였다. 2개의 실험으로부터 n=10마리의 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(b) AMLMLL-PTD FLT3-ITD 세포 (C57BL/6 배경) 및 동종이계 BALB/c BM의 전달 후 C57BL/6 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 마우스에 추가적인 동종이계 T-세포 (BALB/c), WT T-세포 또는 TRAIL-/- T-세포를 주사하였다. 2개의 실험으로부터 n=10마리의 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(c) OCI-AML3 세포에서 카스파제-3, 카스파제-9의 활성화 및 로딩 대조군 (β-액틴)을 나타내는 웨스턴 블롯. 활성화된 T-세포를 10 μg/ml 항-TRAIL, 중화 항체 또는 IgG 대조군으로 1시간 동안 전처리하고 DMSO 또는 RG-7112 (1 μM)에 노출된 OCI-AML3 세포와 10:1의 E:T 비로 4시간 동안 공동-배양하였다.
(d) 이소형 대조군으로서 정규화된 절단된 카스파제-3/총 카스파제-3의 비의 정량화. 각각의 데이터 포인트는 독립적인 생물학적 복제물을 나타낸다.
(e) 이소형 대조군에 대해 정규화된 절단된 카스파제-9/총 카스파제-9의 비의 정량화. 각각의 데이터 포인트는 독립적인 생물학적 복제물을 나타낸다.
(f) WT OCI-AML 세포 또는 TRAIL-R2 CRISPR-Cas 넉아웃 OCI-AML 세포를 수용한 Rag2 -/- Il2rγ -/- 마우스의 생존. 마우스에 건강한 공여자로부터 단리된 1차 인간 T-세포를 추가로 주사하고 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. 2개의 독립적인 실험으로부터 n=10마리의 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(g) 막대 다이어그램은, 지시된 경우, 1 μM의 MDM2-억제제 RG7112와 함께 인큐베이션된 WT 또는 TRAIL-R2 CRISPR-Cas 넉아웃 OCI-AML3 세포 (TRAIL-R2-/-)의 생존율을 나타낸다. 48시간 후 제한 농도의 hTRAIL (TNFSF 10)을, 지시된 경우, 24시간 동안 첨가하였다. AML 세포의 생존율은 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 삼중의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(h) C57BL/6 BM + 동종이계 C57BL/6 T-세포로 allo-HCT를 겪은 WEHI-3B 백혈병-보유 BALB/c 마우스의 allo-HCT 후 12일째에 비장으로부터 단리된 CD8+ T-세포의 세포외 산성화율 (ECAR). 수용자 마우스를 나타낸 바와 같이 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. 각각의 복제물에 대해, ECAR 기준선 값에 대한 정규화를 수행하였다. n=4개의 생물학적으로 독립적인 복제물로부터의 평균값 ± SEM, 각각의 복제물을 2마리의 마우스로부터 비장을 풀링함으로써 생성하였다. 양측 독립표본 스튜던트 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(i) 패널 h에 기재된 바와 같이 BMT 수용자로부터 단리된 CD8+ T-세포의 당분해 (글루코스 주사 후 ECAR와 기본 ECAR 사이의 차이로 계산됨) 및 당분해 능력 (올리고마이신 주사 후 ECAR과 기본 ECAR 사이의 차이로 계산됨). n=4개의 생물학적으로 독립적인 복제물로부터의 평균값 ± SEM, 각각의 복제물을 2마리의 마우스로부터 비장을 풀링함으로써 생성하였다. 양측 독립표본 스튜던트 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(j) 패널 h에 기재된 바와 같이 BMT 수용자로부터 단리된 CD8+ T-세포의 생체외 표지 후 당분해 중간체에 대한 U-13C-글루코스의 기여 분율. 각각의 점은 단일 마우스를 나타낸다. 양측 독립표본 스튜던트 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다, ns: 유의하지 않음. Biorender.com으로 생성된 경로 도식.
도 3: MDM2-억제는 공여자 T 세포의 세포독성 및 장수를 촉진시킨다
(a-h) 산점도 및 대표 히스토그램은 C57BL/6 BM + 동종이계 C57BL/6 T-세포를 이식하고 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리한 WEHI-3B 백혈병 보유 BALB/c 마우스의 allo-HCT 후 12일째에 비장으로부터 단리된 CD8+ T-세포의 퍼포린 (a, b), CD107a (c, d), IFN-γ (e, f), TNF-α (g, h)의 발현을 나타낸다. 2개의 실험으로부터 군당 n=14-19마리의 생물학적으로 독립적인 동물로부터의 평균값 ± SEM으로 나타내고, 양측 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(i) AMLMLL-PTD FLT3-ITD 세포 (C57BL/6 배경) 및 동종이계 BALB/c BM을 사용한 BMT의 전달 후 C57BL/6 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 마우스에 BMT 후 2일째에 추가적인 동종이계 T-세포 (BALB/c)를 주사하였다. 지시된 경우, CD8 T-세포 또는 NK 세포가 고갈되었다. 2개의 실험으로부터 n=10마리의 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(j) AMLMLL-PTD FLT3-ITD 세포 (C57BL/6 배경) 및 동종이계 BALB/c BM의 전달 후 C57BL/6 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 마우스에 이전에 챌린지되고 처리된 (MDM2-억제제 또는 비히클) 마우스로부터 유래된 추가적인 동종이계 T-세포 (BALB/c)를 주사하였다. 2개의 실험으로부터 n=10 마리의 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(k) FlowSOM-가이드된 수동 메타클러스터링 (A, 상단)을 나타내는 UMAP 및 allo-이식된 백혈병 보유 BALB/c 마우스로부터 비장의 살아있는 CD45+ 세포의 중간(median) 마커 발현 (하단)을 나타내는 히트맵.
(l) FlowSOM-가이드된 수동 메타클러스터링 (A, 상단)을 나타내는 UMAP 및 나타낸 바와 같이 RG-7112 또는 비히클로 처리된 allo-이식된 백혈병 보유 BALB/c 마우스로부터 공여자-유래된 (H-2kb+) TCRb+CD8+ T 세포의 중간 마커 발현 (하단)을 나타내는 히트맵.
(m) 나타낸 바와 같이 RG-7112 또는 비히클로 처리된 allo-이식된 백혈병 보유 BALB/c 마우스로부터의 공여자-유래된 (H-2kb+) TCRb+CD8+CD27+ TIM3+ T 세포의 정량화.
도 4: 일차 인간 AML 세포에서 MDM2-억제는 TRAIL-1/2 발현을 발생시킨다
(a) 그래프는 qPCR을 통해 결정된 바와 같이, hGapdh에 대해 정규화된 12시간 동안 RG-7112 (2 μM)로 시험관내 처리 전 또는 후에 일차 인간 AML 세포에서의 hTRAIL-R1 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 각각의 데이터 포인트는 하나의 독립적인 환자의 개별 샘플을 나타낸다. 실험은 독립적으로 수행되었으며 결과 (평균 ± s.e.m.)는 풀링되었다.
(b) 그래프는 12시간 동안 상이한 농도의 RG-7112 (0.5, 1 및 2 μM)로 시험관내 처리한 후 환자-유래된 PBMC로부터의 일차 AML 모세포의 hTRAIL-R1 mRNA 수준의 대표적인 정량화를 나타낸다.
(c) 그래프는 qPCR을 통해 결정된 바와 같이, hGapdh에 대해 정규화된 12시간 동안 RG-7112 (2 μM)로 시험관내 처리 전 또는 후에 일차 인간 AML 세포에서의 hTRAIL-R2 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 각각의 데이터 포인트는 하나의 독립적인 환자의 개별 샘플을 나타낸다. 실험은 독립적으로 수행되었으며 결과 (평균 ± s.e.m.)는 풀링되었다.
(d) 그래프는 12시간 동안 상이한 농도의 RG-7112 (0.5, 1 및 2 μM)로 시험관내 처리한 후 환자-유래된 PBMC로부터의 일차 AML 모세포의 hTRAIL-R2 mRNA 수준의 대표적인 정량화를 나타낸다.
(e) 일차 인간 AML-세포의 전달 후 Rag2 -/- Il2rγ -/- 수용자 마우스의 생존율이 표시된다 (환자 #56). 나타낸 바와 같이, 마우스에 추가적인 인간 T-세포 (HLA 비-매치 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리됨)를 주사하고/하거나 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. n=10마리의 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(f) 인간 WT 또는 p53 넉다운 (p53-/-) OCI-AML-3 세포의 전달 후 Rag2 -/- Il2rγ -/- 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 나타낸 바와 같이, 마우스에 추가적인 인간 T-세포 (HLA 비일치 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리됨)를 주사하고/하거나 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. 2개의 실험으로부터 n=10마리의 생물학적으로 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(g) 인간 OCI-AML3 세포에서의 카스파제-8, 카스파제-3, PARP 및 로딩 대조군 (β-액틴)을 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯. DMSO 또는 RG-7112 (1 μM)에 노출된 OCI-AML3 세포를 활성화된 T-세포와 10:1의 E:T 비로 4시간 동안 공동-배양하였다. 값은 β-액틴에 대해 정규화되었다.
(h, i) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램 (h) 및 배수 변화 막대 다이어그램 (i)은 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서 HLA-C 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. 막대 그래프는 n=5-6개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(j, k) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램 (j) 및 배수 변화 막대 다이어그램 (k)은 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 HLA-DR 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. 막대 그래프는 n=5-6개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(l, m) 그래프는 RG-7112 (2 μM)로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 (p53 +/+) 또는 p53 넉다운 (p53 -/-) OCI-AML3 세포 상에서의 HLA-C (l) HLA-DR (m) 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(n) 48시간 동안 RG-7112 (2 μM)로 시험관내 처리한 후 일차 AML 환자 모세포의 누적 HLA-DR (MHC-II) 수준을 유동 세포측정법에 의해 결정하였고 n=11명의 생물학적으로 독립적인 환자의 MFI로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 HLA-DR (MHC-II)의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 윌콕슨 매치된-쌍 부호 순위 검정(Wilcoxon matched-pairs signed rank test)을 사용하여 P-값을 계산하였으며 그래프에 제시된다.
(o) 대표적인 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 48시간 동안 시험관내 처리한 후 환자의 일차 AML 모세포 상에서의 HLA-DR 발현에 대한 MFI를 삼중으로 수행된 한 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 MFI를 1.0으로 설정하였고, 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
도 5: GVHD 조직병리학 점수화
(a-c) 산점도는 BALB/c BM 및 T 세포를 수용하고 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리된 C57BL/6 마우스로부터 allo-HCT 후 12일째에 단리된, (a) 간, (b) 결장, (c) 소장으로부터의 조직병리학적 점수를 나타낸다. 양측 만-휘트니 U 검정 (유의하지 않음 (n.s.))을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 6: RG7112 또는 HDM201로 MDM2 억제시 인간 OCI-AML3 세포에서의 TRAIL-R1/R2 mRNA 및 단백질 발현
(a) 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R1 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램. 5개의 독립적인 생물학적 복제물 중 하나가 제시된다.
(b) 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R2 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램. 5개의 독립적인 생물학적 복제물 중 하나가 제시된다.
(c-f) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 6h (c, d) 또는 12h (e, f) 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포에서의 인간 TRAIL-R1 (hTRAILR1) RNA 및 hTRAILR2 RNA의 배수 변화를, 각각의 2개의 기술적 복제물을 사용하여 n=3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포로부터의 RNA를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(g, i) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM-201로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 hTRAIL-R1 (g) 및 hTRAIL-R2 (i) 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 도시한다.
(h, j) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R1 (h) 및 TRAIL-R2 (j) 발현의 MFI의 배수 변화를 n=5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 7: 뮤린 WEHI-3B 세포에서의 TRAIL-R mRNA 및 단백질 발현
(a, b) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 6시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포에서의 마우스 TRAIL-R (mTRAIL-R) RNA 및 mTRAIL-R2 RNA의 배수 변화를 n=4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. DMSO-처리된 세포의 RNA를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(c, d) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 12시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포에서의 마우스 TRAIL-R (mTRAIL-R) RNA 및 mTRAIL-R2 RNA의 배수 변화를 n=4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. DMSO-처리된 세포의 RNA를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(e) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서의 TRAIL-R2 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
(f) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서의 TRAIL-R2 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(g) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서의 TRAIL-R2 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 도시한다.
(h) 그래프는 지시된 농도의 MDM2 억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서 TRAIL-R2 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 8: XI-006 (MDMX-억제제) 처리는 증가된 TRAIL-R1/R2 발현을 발생시킨다.
(a) 그래프는 지시된 농도의 MDMX-억제제 XI-006으로 72시간 동안 처리된 살아있는 (고정가능한 생존율 염료 음성) OCI-AML3 세포의 백분율을 n=7개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(b, c) 그래프는 지시된 농도의 MDMX-억제제 XI-006으로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R1 (b) 및 TRAIL-R2 (c) 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=7개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. DMSO-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 9: HDM201 (MDM2 억제제) 처리는 p53-의존성 방식으로 인간 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R1/R2 발현을 증가시킨다.
(a) 지시된 경우, 4시간 동안 1 mg/ml 독소루비신에 노출된 WT OCI-AML3 세포 또는 p53 넉다운 OCI-AML3 세포에서의 MDM2, p53 및 로딩 대조군 (GAPDH)의 발현을 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯 (좌측 패널). 우측 패널: 각각의 군에 대한 단백질 밴드의 상대적 강도의 정량화.
(b) 4시간 동안 1 μM RG-7112에 노출된 OCI-AML3 세포에서의 MDM2, p53 및 로딩 대조군 (GAPDH)의 발현을 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯 (좌측 패널).
(c, d) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 야생형 (WT) OCI-AML3 또는 p53 넉다운 (p53-/-) OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R1 (c) 및 TRAIL-R2 (d) 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(e) 그래프는 생존 세포의 백분율을 나타낸다. 지시된 경우, 야생형 OCI-AML3 (WT) 또는 p53 넉아웃 (p53-/-) OCI-AML3을 1 μM MDM2-억제제 RG7112와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후 제한 농도의 hTRAIL (TNFSF 10)을 지시된 경우 24시간 동안 첨가하였다. 세포의 생존율은 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 삼중물의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 10: OCI-AML3 세포에서의 TRAIL-R2 넉다운 효능 및 MDM2 억제의 영향.
(a) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 WT OCI-AML3 세포 상에서 또는 CRISPR-Cas를 사용한 hTRAIL-R2 넉아웃시 hTRAIL-R2, hTRAIL-R1 및 p53 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 도시한다. 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG7112로 72시간 동안 처리.
(b) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG7112로 72시간 동안 처리한 후 WT 또는 TRAIL-R2 CRISPR-Cas 넉아웃 OCI-AML3 세포 상에서의 TRAIL-R2 발현의 MFI의 배수 변화를 n=2개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(c) 최적 농도의 hTRAIL (TNFSF 10)로 24시간 동안 처리한 후 WT 또는 TRAIL-R2 CRISPR-Cas 넉아웃 OCI-AML3 세포의 생존율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 삼중물의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 11: MDM2 억제는 동종반응성 T 세포의 대사 활성을 증가시킨다
(a-c) CD8+ T 세포는 MDM2 억제제로 처리된, allo-HCT 수용자 마우스의 비장으로부터 풍부화되었다. 비히클로 처리된 n=8마리의 마우스 및 MDM2-억제제로 처리된 n=7마리의 마우스로부터 보충 방법에 기재된 바와 같이 극성 대사물을 추출하고 LC-MS에 의해 측정하였다. (a) 표적 접근법으로 분석된 100개의 대사물의 화산 플롯. 독립표본 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다. (b) "MDM2 억제제"와 "비히클" 사이에서 27개의 유의하게 조절된 대사물의 히트맵 (p<0.05). 색상 스케일은 각각의 샘플의 정규화된 농도를 나타낸다. (c) 피리미딘 생합성 경로로부터의 대사물의 절대 풍부도. Biorender.com으로 생성된 경로 스킴, * p<0.05, ** p<0.01.
도 12: 백혈병 보유 마우스에서 MDM2 억제시 비장 H-2kb + CD8 + T 세포 및 CD8 T 세포 상의 CD69 발현에 대한 게이팅 전략.
(a) 뮤린 비장으로부터 공여자-유래된 (H-2kb+) CD3+CD8+ T 세포를 확인하기 위한 게이팅 전략을 나타내는 유동 세포측정법 플롯. 게이팅된 세포는 단일체(signlet), 살아있는 (고정가능한 생존율 염료 음성), H-2kb+, CD45+, CD3+ 및 CD8+였다. TBI를 겪고 C57BL/6 BM 및 WEHI-3B 세포를 주사한 BALB/c 마우스로부터 비장을 수확하였다 (d0). 마우스에 동종이계 공여자 T 세포 (d2)를 주입하고 d3에서 시작하여 2일마다 5회 용량의 RG-7112로 처리하였다.
도 13: allo-HCT를 겪은 MDM2-억제제 처리 마우스로부터 단리된 T-세포의 표현형.
(a) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 allo-HCT를 겪고 비히클로 처리된 백혈병 보유 BALB/c 마우스로부터의 모든 살아있는 공여자 (H-2kb+) CD8+ T 세포의 CD69에 대한 MFI의 배수 변화를 나타내는 평균 형광 강도 (MFI) 및 산점도를 도시한다. 2개의 실험으로부터 군당 n=14/15마리의 생물학적으로 독립적인 마우스로부터의 평균값 ± SEM으로 나타낸다. 비히클-처리된 백혈병 보유 마우스의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 만-휘트니 U 검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(b) 나타낸 바와 같이 RG-7112 또는 비히클로 처리된 allo-이식된 백혈병 보유 BALB/c 마우스로부터의 모든 살아있는 공여자 (H-2kb+) CD3+ T 세포의 CD8+ 세포의 백분율을 나타내는 산점도. 3개의 실험으로부터 군당 n=14/19마리의 생물학적으로 독립적인 마우스로부터의 평균값 ± SEM으로 나타낸다. 비히클-처리된 백혈병 보유 마우스의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 만-휘트니 U 검정을 사용하여 P-값을 계산하였다. CD8 T-세포/모든 CD3 T-세포에서의 어떠한 차이도 검출되지 않았다.
도 14: MDM2 억제는 나이브 마우스에서 T 세포 세포독성을 촉진한다
(a-d) 2일마다 5회 용량의 RG-7112 또는 비히클로 처리된 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포의 유동 세포측정법 분석. 분석 시점은 마지막 처리 후 1일이었다.
(a) 나타낸 바와 같이 RG-7112 또는 비히클로 처리된 비처리 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 모든 살아있는 공여자 (H-2kb+) CD3+ T 세포의 CD8+ 세포의 백분율을 나타내는 산점도. 2개의 실험으로부터 군당 n=5/10마리의 생물학적으로 독립적인 마우스로부터의 평균값 ± SEM으로 나타낸다. 비히클-처리된 백혈병 보유 마우스의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 만-휘트니 U 검정을 사용하여 P-값을 계산하였다
(b-d) 비히클로 처리된 비처리된 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 모든 살아있는 공여자 (H-2kb+) CD8+ CD3+ T 세포의 CD107a (b), TNFα (c) 및 CD69 (d)에 대한 MFI의 배수 변화를 나타내는 산점도. 2개의 실험으로부터 군당 n=5/10마리의 생물학적으로 독립적인 마우스로부터의 평균값 ± SEM으로 나타낸다. 비히클-처리된 백혈병 보유 마우스의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 만-휘트니 U 검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 15: CD8 + T 세포 또는 NK1.1 + 세포의 고갈 전 및 후의 BM 이식편의 순도.
(a) 형광-활성화 세포 분류를 통한 CD8+ T 세포 고갈 전 및 후의 BM 순도를 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 플롯. 표시된 분류된 세포는 BM CD8+-고갈된 생존 실험에 사용되었다. 2개의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 수득하였다.
(b) 형광 활성화 세포 분류를 통해 NK1.1+ 세포 고갈 전 및 후의 BM 순도를 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 플롯. 표시된 분류된 세포는 BM NK-세포-고갈 생존 실험에 사용되었다. 2개의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 수득하였다.
도 16: 2차 수용자에서의 전달을 위한 CD3 + CD8 + H-2kd + T 세포의 순도
(a) BALB/c BM, 뮤린 AMLMLL-PTD/FLT3-ITD 세포 (d0) 및 동종이계 BALB/c T 세포 (d2)로 이식된 C57BL/6 마우스로부터 재단리된 비장 CD3+H-2kd+CD8+ T 세포 (모든 살아있는 세포의)의 순도를 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 플롯. 마우스는 d3부터 줄곧 2일마다 5회 용량의 RG-7112 또는 비히클을 받았다. allo-HCT 후 d12에 비장세포를 수확하였다. 분류된 세포는 회상 면역 생존 실험에 사용되었다. 3개의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 수득하였다.
도 17: CD45 + 및 공여자-유래 (H-2kb + ) TCRβ + CD8 + T 세포에 대한 마커 발현을 나타내는 Umap.
(a, b) 무작위로 선택된 살아있는 CD45+ 세포 (a) 및 allo-HCT를 겪은 백혈병 보유 BALB/c 마우스로부터의 공여자-유래된 (H-2kb+) TCRβ+CD8+ T 세포 (b)에 대한 마커 발현을 나타내는 Umap 다이어그램.
도 18: MDM2 억제는 CD8 T 세포에서 CD127 및 Bcl-2의 증가된 수준을 발생시킨다.
(a-d) 산점도 및 대표적인 히스토그램은 C57BL/6 BM + 동종이계 C57BL/6 T-세포로 이식하고 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리된 WEHI-3B 백혈병 보유 BALB/c 마우스의 allo-HCT 후 12일째에 비장으로부터 단리된 CD8+ T-세포의 CD127 (k, l), Bcl-2 (m, n)의 발현을 나타낸다. 2개의 실험으로부터 군당 n=14-19마리의 생물학적으로 독립적인 동물로부터의 평균값 ± SEM이 표시되고 양측 만-휘트니 U 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
도 19: PBMC에서 일차 AML 모세포를 확인하기 위한 게이팅 전략 및 MDM2 억제는 일차 AML 환자 모세포에서 p53을 증가시킨다.
(a) 환자-유래된 PBMC에서 일차 AML 모세포을 확인하기 위한 게이팅 전략을 나타내는 유동 세포측정법 플롯. 게이팅된 세포는 단일체, 살아있는 (고정가능한 생존율 염료 음성) 및 마커 CD34+ 또는 CD117 (cKIT)+에 대해 양성이었다 (여기서 CD34-양성 세포에 대한 게이팅이 표시됨). 마커는 1차 진단시 AML 세포에 대한 유익한 마커 발현을 기반으로 선택되었다.
(b) 48시간 동안 RG-7112 (2 μM)로 시험관내 처리한 후 일차 AML 환자 모세포의 누적 p53 수준을 유동 세포측정법에 의해 결정하였고, n=23명의 생물학적으로 독립적인 환자의 MFI으로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 p53의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 윌콕슨 매치된-쌍 부호 순위 검정을 사용하여 P-값을 계산하였으며 그래프에 제시된다.
(c, d) 히스토그램 (c) 및 그래프 (d)는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 48시간 동안 처리한 후 대표적인 환자의 일차 AML 모세포 상에서 p53 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 삼중으로 수행된 한 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 MFI를 1.0으로 설정하였고, 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
도 20: MDM2 억제는 일차 AML 환자 모세포에서 TRAIL-R1/R2 단백질 상향조절을 발생시킨다.
(a) 48시간 동안 RG-7112 (2 μM)로 시험관내 처리한 후 일차 AML 환자 모세포의 누적 TRAIL-R1 수준을 유동 세포측정법에 의해 결정하였고, n=23명의 독립적인 환자의 MFI으로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 TRAIL-R1의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 윌콕슨 매치된-쌍 부호 순위 검정을 사용하여 P-값을 계산하였으며 그래프에 제시된다.
(b, c) 히스토그램 (b) 및 그래프 (c)는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 48시간 동안 처리한 후 대표적인 환자의 일차 AML 모세포 상에서의 TRAIL-R1 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 삼중으로 수행된 하나의 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 MFI를 1.0으로 설정하였고, 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
(d) 48시간 동안 RG-7112 (2 μM)로 시험관내 처리한 후 일차 AML 환자 모세포의 누적 TRAIL-R2 수준을 유동 세포측정법에 의해 결정하였고, n=22명의 생물학적으로 독립적인 환자의 MFI으로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 TRAIL-R1의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 윌콕슨 매치된-쌍 부호 순위 검정을 사용하여 P-값을 계산하였으며 그래프에 제시된다.
(e) 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 48시간 동안 치료한 후 대표적인 환자의 일차 AML 모세포 상에서의 TRAIL-R2 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 삼중으로 수행된 한 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군 처리된 세포로부터의 MFI를 1.0으로 설정하였고, 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
도 21: MDM2 억제는 환자 #56의 일차 AML 모세포에서 TRAIL-R1/R2 mRNA 상향조절을 발생시킨다. 환자 #56의 일차 AML 모세포를 사용한 AML 이종이식편 마우스 모델의 순도 제어
(a) 막대 다이어그램은 MDM2-억제 (RG)에 대한 환자 #56의 일차 AML 모세포 노출시 TRAIL-R1/R2 단백질 수준 (MFI)을 나타낸다. 인간 백혈병 세포 (이전 MDM2 억제 없음)는 이종이식편 실험에서 생존 연구에 사용되었다 (도 4에 표시됨).
(b) 면역결핍 마우스로 전달 전에 AML 세포 풍부화를 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 플롯. 게이팅된 세포는 단일체, 살아있는 (고정가능한 생존율 염료 음성) 및 인간 CD45+였다.
도 22: MDM2 억제는 환자 #57의 일차 AML 모세포에서 TRAIL-R1/R2 mRNA 상향조절을 발생시킨다. 전달 및 생존 연구 전 AML 세포의 순도.
(a) 막대 다이어그램은 MDM2-억제 (RG)에 대한 환자 #57의 일차 AML 모세포 노출시 TRAIL-R1/R2 단백질 수준 (MFI)을 나타낸다. 인간 백혈병 세포 (이전 MDM2 억제 없음)를 이종이식편 실험에서 생존 연구에 사용하였다.
(b) 면역결핍 Rag2 -/- Il2rγ -/- 마우스로 전달 전에 AML 세포 풍부화를 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 플롯. 게이팅된 세포는 단일체, 살아있는 (고정가능한 생존율 염료 음성) 및 인간 CD45+였다.
(c) 일차 인간 AML-세포의 전달 후 Rag2 -/- Il2rγ -/- 수용자 마우스의 생존율이 표시된다 (환자 #57). 나타낸 바와 같이, 마우스에 추가적인 인간 T-세포 (건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리됨)를 주사하고/하거나 비히클 또는 MDM2-억제제 RG-7112로 처리하였다. 3개의 실험으로부터의 n=8마리의 독립적인 동물이 제시되고, 양측 만텔-콕스 검정을 사용하여 p-값을 계산하였다.
도 23: 이식 전 p53 -/- OCI-AML3 세포에서의 P53 넉다운 효능.
(a) 이식 전 OCI-AML3 세포에서 p53-넉다운 효능을 나타내는 대표적인 유동 세포측정법 플롯. 세포를 최소 7일 동안 1 μg/ml 독시사이클린 및 50 μg/ml 블라스티시딘을 함유하는 20% FCS RPMI 배지에서 배양하였다. 게이팅된 세포는 단일체이고 살아있었다 (고정가능한 생존율 염료 음성). 안정한 넉다운 효율을 가진 세포를 GFP+RFP+ 집단으로 나타낸다. 2개의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 수득하였다.
도 24: 골수양 BM 세포에서 MDM2를 증가시키는 종양원성 돌연변이 FIP1L1-PDGFR-α 및 cKIT-D816V는 AML을 MDM2-억제제/T-세포 효과에 민감하게 만든다.
(a) FLT3-ITD, KRAS-G12D, cKIT-D816V, JAK2-V617F 또는 FIP1L1-PDGFR-α로 형질도입된 33,000개의 일차 뮤린 BM 세포 및 5*106개 BALB/c BM 세포의 전달 후 26일째의 마우스의 비장.
(b) 막대 다이어그램은 (a)에 표시된 상이한 군의 비장 중량을 나타낸다
(c) 유동 세포측정법에 의해 정량화된, (a)로부터의 마우스의 BM에서 모든 CD45+ 세포의 종양유전자 형질도입된 (GFP+) 세포의 백분율.
(d) 나타낸 바와 같이 FLT3-ITD, KRAS-G12D, cKIT-D816V, JAK2-V617F, FIP1L1-PDGFR-α, BCR-ABL 또는 c-myc로 형질도입된 일차 뮤린 BM 세포의 MDM2 단백질 (MFI).
(e) 나타낸 바와 같이 FLT3-ITD, KRAS-G12D, cKIT-D816V, JAK2-V617F, FIP1L1-PDGFR-α, BCR-ABL 또는 c-myc로 형질도입된 일차 BM 세포의 MDM4 단백질 (MFI).
(f) 나타낸 바와 같이 FLT3-ITD, KRAS-G12D, cKIT-D816V, JAK2-V617F, FIP1L1-PDGFR-α, BCR-ABL 또는 c-myc로 형질도입된 일차 뮤린 BM 세포에서 MDM2 및 로딩 대조군 (β-액틴)의 양을 나타내는 웨스턴 블롯.
(g) 막대 다이어그램은 FLT3-ITD, KRAS-G12D, cKIT-D816V, JAK2-V617F, FIP1L1-PDGFR-α, BCR-ABL 또는 c-myc로 형질도입된 일차 뮤린 BM 세포에서 MDM2/ β-액틴의 비를 나타낸다. 비는 EV (빈 벡터)에 대해 정규화된다. 실험은 생물학적 반복물 (상이한 마우스의 BM)을 사용하여 2회 수행하였으며 데이터를 풀링하였다.
(h) FIP1L1-PDGFR-α-tg 형질도입된 BM 세포 (BALB/c 배경)의 전달 후 및 동종이계 C57BL/6 BM 후 30일에 BALB/c 수용자 마우스의 생존율이 제시된다. 마우스는 BM 전달 후 2일째에 동종이계 C57BL/6 CD3+ T 세포를 받았고 비히클 또는 MDM2-억제제로 처리되었다.
(i) cKIT-D816V-tg 형질도입된 BM 세포(BALB/c 배경)의 전달 후 및 동종이계 C57BL/6 BM 후 30일에 BALB/c 수용자 마우스의 생존율을 나타낸다. 마우스는 BM 전달 후 2일째에 동종이계 C57BL/6 CD3+ T 세포를 받았고 비히클 또는 MDM2-억제제로 처리되었다.
도 25: MDM2 및 MDMX 억제는 MHC 클래스 I 및 II 분자를 상향조절한다.
(a) 24시간 동안 DMSO, RG-7112 (1 μM) 또는 HDM-201 (200 nM)로 처리한 후 OCI-AML3 세포에서 HLA 클래스 I 및 II의 발현 수준의 마이크로어레이-기반 분석은 로버스트 멀티칩 평균 (RMA) 신호 값의 타일 디스플레이, 군당 n=6개의 생물학적으로 독립적인 샘플로서 제시된다.
(b, c) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM201로 72시간 동안 시험관내 처리 후 야생형 OCI-AML3 (p53 +/+) 또는 p53 넉아웃 (p53 -/-) OCI-AML3 세포 상에서 HLA-C (b), HLA-DR (c) 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(d, e) 그래프는 지시된 농도의 MDMX-억제제 XI-006으로 72시간 동안 처리한 후 OCI-AML3 세포 상에서 HLA-C (d) 및 HLA-DR (e) 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=7개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
도 26: MDM2 억제는 악성 WEHI-3B에서 p53 및 MHC 클래스 II 발현을 증가시키나 비-악성 32D 세포에서는 그렇지 않았다.
(a) 웨스턴 블롯은 4시간 동안 DMSO, RG-7112 (0.5 μM, 1 μM) 또는 1000 ng/ml 독소루비신에 노출된 WEHI-3B 세포에서의 MDM2, p53 및 로딩 대조군 (GAPDH)의 발현을 나타낸다.
(b) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서의 MHC 클래스 II 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=6개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(c) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2-억제제 RG-7112로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서의 MHC 클래스 II 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 도시한다.
(d) 웨스턴 블롯은 4시간 동안 DMSO, HDM201 (100 nM, 200 nM) 또는 1000 ng/ml 독소루비신에 노출된 WEHI-3B 세포에서의 MDM2, p53 및 로딩 대조군 (GAPDH)의 발현을 나타낸다.
(e) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서 MHC 클래스 II 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=4-6개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(f) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2 억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 WEHI-3B 세포 상에서의 MHC 클래스 II 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 도시한다.
(g) 웨스턴 블롯은 DMSO, HDM201 (100 nM, 200 nM) 또는 1000 ng/ ml 독소루비신에 4시간 동안 노출된 32D 세포에서의 MDM2, p53 및 로딩 대조군 (GAPDH)의 발현을 나타낸다.
(h) 그래프는 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 32D 세포 상에서의 MHC 클래스 II 발현에 대한 MFI의 배수 변화를 n=4-6개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 대조군-처리된 세포의 MFI를 1.0으로 설정하였다. 양측 스튜던트의 독립표본 t-검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.
(i) 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램은 지시된 농도의 MDM2-억제제 HDM201로 72시간 동안 처리한 후 32D 세포 상에서의 MHC 클래스 II 발현에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 도시한다.
도 27: 도해적 요약
T 세포에 대한 AML 세포의 MDM2 유도된 면역 민감성의 제안된 작용 메커니즘을 나타내는 단순화된 스케치. MDM2-억제는 p53 수준을 증가시킨다. P53은 핵으로 전좌되어 거기서 MHC 클래스 I 및 II, 뿐만 아니라 TRAIL-R1/2의 전사를 활성화한다. 증가된 MHC II 발현은 T 세포 프라이밍을 발생시켜, 연속적인 시토카인 생산으로 그의 장수 및 활성화를 촉진한다. AML 세포에 대한 TRAIL-R 상향조절은 T 세포에 의한 TRAIL-매개 아폽토시스 유도에 대한 그의 민감성을 증가시켜, AML 세포에서 TRAIL-R1/2 하류 경로 (카스파제-8, 카스파제-3, PARP)의 활성화를 유발한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다. 이들은 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 본원에 기재된 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 제공된 본 발명의 측면의 바람직한 실시양태를 나타낸다.
실시예에서 이용된 방법
환자-유래 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 단리 및 배양
인간 샘플 수집 및 분석은 독일 프라이부르크 대학교(University of Freiburg)의 의료 센터(Medical center)의 기관 윤리 검토 위원회(Institutional Ethics Review Board) (프로토콜 번호 100/20)의 승인을 받았다. 각각의 환자로부터 서면 고지에 입각한 동의서를 얻었다. 인간 데이터의 모든 분석은 관련 윤리 규정을 준수하여 수행되었다. 환자의 특성은 표 1에 열거되어 있다.
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 단리
인간 말초 혈액을 멸균 EDTA 코팅된 S-모노베트(Monovette) (자르슈테트(Sarstedt), 독일)에 수집하였다. 혈액을 PBS로 1:1로 희석하고 1 부피의 판콜 휴먼(Pancoll Human) (PAN-바이오텍(Biotech), 독일) 위에 놓았다. 실온에서 30분 동안 정지 없이 300 x g (가속: 9, 감속: 1)에서 구배 원심분리를 수행하여 PBMC를 분리하였다. 분리된 PBMC를 함유하는 계면을 흡인하고 PBS로 3회; 300 x g에서 1회, 이어서 200 x g에서 2회 10분 동안 세척하였다.
인간 PBMC로부터 CD4 + T 세포의 단리
PBMC 단리를 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 제조업체의 지침에 따라 MACS 세포 분리 시스템 (주문 번호 130-045-101 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 미국)을 사용하여 CD4+ T 세포를 풍부화하였다. 양성 선택을 위해, 항-인간 CD4+ 마이크로비드(microBead) (밀테니 바이오텍, 미국)를 사용하였다. CD4+ T 세포 순도를 유동 세포측정법에 의해 평가한 바와 같이 적어도 90%였다.
일차 건강한 공여자 PBMC 및 일차 AML 모세포
일차 세포를 20% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에 유지시켰다.
MDM2 억제에 대한 일차 AML 모세포의 노출
제조업체의 프로토콜 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 따라, 피콜(Ficoll) 구배 원심분리에 의해 AML 환자의 혈액으로부터 PBMC를 단리하고, 웰당 500,000개 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 플레이팅하고, 개별 실험에서 지시된 농도로 RG-7112 (셀렉 케미컬즈 엘엘씨(Selleck Chemicals Llc), 미국) 또는 HDM-201 (노바르티스, 스위스 바젤)의 존재 또는 부재 하에 10% 소 태아 혈청 (FCS)이 보충된 RPMI-배지 (인비트로겐(Invitrogen), 독일)에서 48시간 동안 배양하였다.
T 세포 활성화 및 세포독성 검정
세포독성 검정에 사용된 세포독성 T 세포는 건강한 자원 공여자의 말초 혈액 T 세포로부터 피콜 구배 원심분리에 의해 공여자 혈액을 단리한 후 생성되었으며, 이를 제조업체의 지침에 따라 Pan T 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍) 및 MACS 세포 분리 시스템 (밀테니 바이오텍)을 사용하여 음성 선택에 의해 풍부화하였다. 수득된 T 세포 순도는 유동 세포측정법에 의해 평가된 바와 같이 적어도 90%였다. 단리된 CD3+ T 세포는 1일째에 1백만개 T 세포당 25 μl 디나비즈(Dynabeads)™ 인간 T-활성인자 CD3/CD28 (깁코(Gibco), 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))로 그리고 단리 후 2일째 30 U/ml의 인간 인터류킨-2 (IL-2) (페프로텍(PeproTech))로 자극하고 총 7일 동안 배양하였다.
인간 AML 샘플의 정량적 실시간 PCR
단리된 환자 PBMC의 총 RNA를, 제조업체의 지침에 따라, 퀴아젠(Qiagen) 알엔이지(Rneasy) 키트를 사용하여 단리하였다. PBMC를 웰당 1천만개 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-배지 (인비트로겐)에서 배양하고 RG-7112 (0.5 μM, 1 μM 및 2 μM)로 12시간 동안 처리하였다. cDNA 합성을 위해, 랜덤 헥사머 프라이머 (고용량(Highcapacity) cDNA 역전사 키트 어플라이드 바이오시스템즈(Biosystems)/써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 및 멀티스크라이브(MultiScribe) 역전사 효소 (써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 1 μg RNA를 역전사하였다. 정량적 RT-PCR은 SYBR 그린(Green) 유전자 발현 매스터 믹스(Master Mix) (로슈(Roche) 라이트사이클러(LightCycler) 480 SYBR 그린 I 매스터) 및 표 2에 제공된 바와 같은 프라이머를 사용하여 수행하였다. 모든 반응은 50 ng cDNA를 사용하여 삼중으로 수행하고, 교정 및 재현성 측정을 이중으로 수행하였으며, 상대적 발현은 모든 mRNA 수준을 참조 유전자 hGAPDH에 대해 정규화하며 파플(Pfaffl) ΔCt 방법을 사용하여 계산되었다. 프라이머 서열은 표 2에 제공된다.
마우스
C57BL/6 (H-2Kb) 및 BALB/c (H-2Kd) 마우스를 잔비어 랩스(Janvier Labs) (프랑스) 또는 프라이부르크 대학교 의료 센터의 동물 시설의 현지 재고로부터 구입하였다. Rag2 -/- Il2rγ -/- 마우스를 프라이부르크 대학교 의료 센터의 동물 시설의 현지 재고로부터 입수하였다. 6주에서 14주령 사이의 마우스를 사용하였고, 단지 암컷 또는 수컷 공여자/수용자 쌍을 사용하였다. 동물 프로토콜은 동물 윤리 위원회 (레기에룽스프레지디움 프라이브루크(Regierungspraesidium Freiburg), 독일 프라이부르크)의 승인을 받았다 (프로토콜 번호: G17-093, G-20/96).
이식편 대 백혈병 (GvL) 마우스 모델
GvL 실험을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (5). 간단히 말하면, 수용자에게 137Cs 공급원을 사용하여 (준)치명적인 방사선조사후 백혈병 세포 +/- 공여자 BM 세포를 정맥내로 주사하였다 (i.v.). CD3+ T-세포를 공여자 비장 또는 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하고 제조업체의 지침에 따라 Pan T 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍, 미국) 및 MACS 세포 분리 시스템 (밀테니 바이오텍)을 사용하여 음성 선택에 의해 풍부화하였다. 수득된 T-세포 순도는 유동 세포측정법에 의해 평가된 바와 같이 적어도 90%였다. CD3+ T-세포는 BM 이식 후 2일째에 주어졌다.
AML MLL-PTD FLT3-ITD 백혈병 모델
AMLMLL-PTD FLT3-ITD 백혈병 모델의 경우, 4시간 간격으로 12 Gy를 2회 균등 분할 선량으로 치명적인 방사선조사를 수행한 후 C57BL/6 수용자에게 5,000개의 AMLMLL-PTD FLT3-ITD 세포 및 5백만 개의 BALB/c BM 세포를 i.v.로 이식하였다. 총 300,000개의 BALB/c (동종이계 모델) 비장 CD3+ T 세포를 이전에 보고된 바와 같이 초기 이식 후 2일째에 i.v.로 도입하였다 (19, 20).
WEHI-3B 백혈병 모델
WEHI-3B 백혈병 모델의 경우, 4시간 간격으로 10 Gy를 2회 균등 분할 선량으로 치명적인 방사선조사를 수행한 후 BALB/c 수용자에게 5,000개의 AML (WEHI-3B) 세포 및 5백만 개의 C57/BL6 BM 세포를 i.v.로 이식하였다. 총 200,000개의 C57/BL6 (동종이계 모델) 비장 CD3+ T 세포를 초기 이식 후 2일째에 i.v.로 도입하였다.
OCI-AML3 이종이식편 모델
OCI-AML3 이종이식편 모델4의 경우, 5 Gy로 준치사량으로 방사선조사한 후 Rag2 -/- Il2rγ -/- 수용자에게 지시된 바와 같이 200,000개의 OCI-AML3 (야생형 또는 TRAIL-R2 넉아웃) 또는 1백만 개의 OCI-AML3 (야생형 또는 p53 결핍) 세포를 i.v.로 이식하였다. 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리한 총 500,000개의 인간 CD3+ T 세포를 초기 이식 후 2일째에 i.v.로 도입하였다.
원발성 인간 AML 이종이식편 모델
원발성 인간 AML 이종이식편 모델 (21)의 경우 Rag2 -/- Il2rγ -/- 수용자를 사용하였다. 일차 인간 AML 세포를 피콜 밀도 원심분리에 의해 단리하고 자기 분리(magnetic separation)에 의해 CD3+ 세포로부터 고갈시켰다. 5 Gy로 준치사량으로 조사한 후 1천만 개의 CD3+ 고갈된 일차 인간 AML 세포를 i.v.로 이식하였다. 건강한 공여자의 말초 혈액에서 단리한 총 50,000개의 인간 CD3+ T 세포를 초기 이식 후 2일째에 i.v.로 도입하였다.
BM에 도입된 종양원성 돌연변이를 기반으로 하는 백혈병 모델:
특정 종양원성 돌연변이를 기반으로 백혈병을 유도하기 위해, BALB/c 수용자에게 cKIT-D816V 또는 FIP1L1-PDGFR-α로 형질도입된 30,000개의 BALB/c 유래 BM 세포를 이식하였다. GVL 효과를 유도하기 위해 마우스는 4시간 간격으로 수행된 2회 균등 분할 선량으로 10 Gy를 사용한 방사선조사를 겪었다. 이어서 수용자 마우스에게 5백만 개의 C57/BL6 BM 세포를 i.v.로 주사하고; 200,000개의 C57/BL6 비장 T 세포를 동종이계 BM 전달 후 2일째에 i.v.로 도입하였다. MACS에 의해 CD3 양성 세포 이외의 모든 세포를 고갈시킴으로써 비장 유래된 T 세포를 풍부화하였다.
마우스 모델의 약물 치료
이식 후 3일 내지 11일째에 마우스를 2일마다 (5회 용량) RG-7112 (100 mg/kg) 또는 비히클 (옥수수유 + 5% DMSO)로 경구 위관영양을 통해 처리하였다. 이식 후 4일 및 8일째에, 정제된 항-마우스 CD253 (TRAIL) 항체 또는 이소형 대조군 항체를 각각의 실험에서 지시된 경우 12.5 μg/g 체중의 용량으로 i.p.로 주사하였다.
GvL 마우스 모델에서 T 세포 표현형결정
T 세포 표현형결정 실험을 WEHI-3B 백혈병 모델을 사용하여 수행하였다. WEHI-3B i.v. 주사 후 12일째에, 비장의 FACS 분석을 수행하였다.
백혈병 세포주
하기 백혈병 세포주를 사용하였다: AMLMLL-PTD FLT3-ITD (22) (뮤린), WEHI-3B (23) (뮤린) 및 OCI-AML3 (인간). AMLMLL-PTD FLT3-ITD 백혈병 세포는 Dr. B. R. Blazar (미네소타 대학교)에 의해 제공되었다. 생체내 실험에 사용된 모든 세포주는 독일 DSMZ 또는 멀티플렉시온(Multiplexion) (독일)에서 인증되었다. 모든 세포주를 미코플라스마 오염에 대해 반복적으로 시험하였고 음성으로 밝혀졌다.
OCI-AML3 세포에서의 p53의 넉다운
P53 넉다운 세포는 이전에 기재되어 있다 (24). p53 shRNA (p53.1224)는 적색 형광 단백질을 공동-발현하고 독시시클린에 의해 유도될 수 있는 레트로바이러스 벡터로 클로닝되어 있다 (24). 안정한 넉다운 효율을 위해 형질감염된 세포를 1 μg/ml 독시사이클린 및 50 μg/ml 블라스티시딘을 함유하는 20% FCS RPMI 배지에서 배양하였다. p53의 넉다운은 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
OCI-AML3 세포에서 TRAIL R1/R2의 넉다운
HEK293T 패키징 세포를 10% 소 태아 혈청 (FCS)가 보충된 DMEM 배지 (인비트로겐, 독일)에서 배양하였다. 클로람페니콜-내성 렌티바이러스 벡터, pGFP-C-shLenti 인간 TRAIL-R1-표적화된 shRNA (클론 ID: TL308741A 5'-TTCGTCTCTGAGCAGCAAATGGAAAGCCA-3' (서열식별번호: 13)), pGFP-C-shLenti 인간 TRAIL-R2-표적화된 shRNA (클론 ID: TL300915B 5'-AGAGACTTGCCAAGCAGAAGATTGAGGAC-3' (서열식별번호: 14)) 및 pGFP-C-shLenti 비침묵화 shRNA 대조군 (클론 ID: TR30021[AM1] 5'-GCACTACCAGAGCTAACTCAGATAGTACT-3' (서열식별번호: 15))을 미국 오리진(OriGene)으로부터 구입하였다. 렌티바이러스 입자는 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK293T 세포를 형질감염시켜 생성하였다. 300,000개의 OCI-AML3 세포를 4 μg/μl 폴리브렌(Polybrene) (머크밀리포레(Merckmillipore))의 존재 하에 렌티바이러스 입자로 형질도입하였다. TRAIL-R1 및 TRAIL-R2의 넉다운은 FACS 분석에 의해 확인되었다.
TRAIL-R2 넉아웃 OCI-AML3 세포의 생성
네온 형질감염 시스템(Neon Transfection System) (인비트로겐)은 gRNA, Cas9 단백질 및 퓨로마이신 내성 유전자 (PMID: 25075903)를 발현하는 CRISPR-Cas9 시스템을 전달하는데 사용되었다. TRAIL-R2 gRNA 설계 (5'-CGCGGCGACAACGAGCACAA-3' (서열식별번호: 16)) 및 lentiCRISPR v2 벡터 (애드진(Addgene) 플라스미드 #52961)로의 클로닝은 이전에 기재된 바와 같이 장랩(Zhang lab) 프로토콜 (PMID: 31114586)에 따라 수행되었다. lentiCRISPR v2-TRAIL-R2 플라스미드를 전달하기 위해, 200,000개의 OCI-AML3 세포를 2 μg 플라스미드의 존재 하에 재현탁 완충제 R (네온 형질감염 시스템, 인비트로겐)에 재현탁시켰다. 네온 형질감염 시스템을 사용하여 세포를 1350 V, 35 ms, 단일 펄스에서 10 μl 네온 팁으로 전기천공하고, 즉시 무항생제 배지로 옮겼다. TRAIL-R2 음성 세포를 세포 분류 (BD 아리아 퓨전(Aria Fusion))에 의해 단리하고 유동 세포측정법 분석에 의해 확인하였다.
마우스 비장 세포의 단리 및 PMA/아이오노마이신 자극
단일 세포 현탁액을 70 mm 세포 스트레이너를 통해 비장을 으깸으로써 수득하였다. 적혈구를 1 mL의 1X RBC 용해 완충제 (써모피셔)로 얼음 위에서 2분 동안 용해시키고 샘플을 PBS로 세척하고 400 g에서 7분 동안 원심분리하였다. 골기-스탑(Golgi-Stop) 및 골기-플러그(Golgi-Plug) (1:1000, BD), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (50 ng/ml, 어플리켐(Applichem)) 및 이오노마이신 (500 ng/ml, 인비트로겐)이 보충된 2 ml RPMI에서 세포를 37℃에서 5시간 동안 재자극하였다.
마이크로어레이 분석
제조업체의 지침에 따라 miRNeasy 미니 키트 (퀴아젠, 네델란드) 및 DNase (퀴아젠, 독일)를 사용하여 MDM2-억제제 RG-7112 (2 μM) 또는 HDM-201 (500 nM)로 처리한 후 24시간 후에 OCI-AML3 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 단편 분석기 (어드밴스트 어낼리티컬 테크놀로지즈, 인크.(Advanced Analytical Technologies, Inc.), 아이오아주 에임스)를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 RNA 무결성을 분석하였다. RNA 샘플을 아피메트릭스(Affymetrix) 진칩 피코(GeneChip Pico) 키트로 추가 처리하고 제조업체 (아피메트릭스, 미국)에 의해 기재된 바와 같이 아피메트릭스 클래리옴(Clariom) S 어레이에 혼성화하였다. 어레이는 R/바이오컨덕터(Bioconductor) 올리고 패키지에서 구현된 바와 같은 강력한 멀티칩 평균화를 통해 정규화되었다. 유전자 세트 풍부화는 컨센서스패쓰(ConsensusPath)DB 49로부터의 경로를 유전자 세트로 사용하고 유의 컷오프 p<0.05를 사용하여 R/바이오컨덕터 패키지 '게이지'48를 사용하여 계산하였다.
마이크로어레이 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (26). 마이크로어레이 데이터는 GEO 수탁 GSE158103 하에 데이터베이스 GEO 저장소에 기탁된다.
웨스턴 블롯팅
OCI-AML3 세포를 1 mg/ml 독소루비신 (프라이부르크 대학교 의료 센터의 약국) 또는 1 μM RG-7112 (셀렉 케미칼스 엘티씨)의 존재 또는 부재 하에 4시간 동안 배양하고 총 단백질 추출물을 이전에 기재한 바와 같이 준비하였다 (27). 카스파제 활성화를 검출하기 위해, OCI-AML3 세포를 1 μM RG-7112로 72시간 동안 처리하고 활성화된 T 세포와 이펙터 대 표적 (E:T) 비 10:1로 4시간 동안 공동-배양하였다. 일부 실험에서, T 세포를 공동배양 1시간 전에 TRAIL (10 μg/ml, MAB375, 알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 또는 마우스 IgG1 (#401408, 바이오레전드(BioLegend))에 대한 중화 항체와 함께 인큐베이션하였다. Pan T 세포 단리 키트 II를 사용함으로써 T 세포를 제거한 후, OCI-AML3 세포를 분석하였다.
EV (빈 벡터), FLT3-ITD, KRAS-G12D, cKIT-D816V, JAK2-V617F, FIP1L1-PDGFR-α, BCR-ABL 또는 c-myc로 형질도입된 일차 뮤린 골수 세포를 BD FACSAria III 세포 분류기 (비디 바이오사이언스(BD Bioscience), 독일)를 사용하여 GFP 발현 세포에 대해 분류하고 분석하였다.
포스파타제 억제제 칵테일 2 (시그마-알드리치)가 보충된 방사성면역침천 검정 (RIPA) 완충제 (산타 크루즈 바이오에크놀로지(Santa Cruz Biotechnology))에 세포를 용해시키고 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정 키트 (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 세포 용해물을 NuPAGE™ LDS 샘플 완충제 및 NuPAGE™ 샘플 환원제 (인비트로겐)를 사용하여 SDS-PAGE를 위해 제조되었다. 무세포 상청액으로부터의 상청액 샘플을 SDS 및 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하는 샘플 완충제를 사용하여 제조하였다. 1차 항체는 p53 (#2527, 셀 시그널링 테크놀로지), MDM2 (#86934, 셀 시그널링 테크놀로지), 카스파제-3 (#9662, 셀 시그널링 테크놀로지)에 대해 사용하였다. 항-GAPDH (#GAPDH-71.1, 시그마-알드리치) 및 항-β-액틴 (#4970, 셀 시그널링 테크놀로지)을 내부 로딩 대조군으로서 사용하였다. 2차 항체로서, 호스래디시 퍼옥시드 (HRP)-연결 항-토끼 또는 항-마우스 IgG를 사용하였다 (#7074, #7076, 셀 시그널링 테크놀로지). 블롯 신호는 웨스턴브라이트 퀀텀(WesternBright Quantum) 또는 시리우스(Sirius) HRP 기판 (어드반스타(Advansta)를 사용하여 검출하고, 케모켐 이미저(ChemoCam Imager) 3.2.0 (인타스 사이언스 이미징 인스트루먼츠 게엠베하(Intas Science Imaging Instruments GmbH))을 사용하여 이미지화하고 ImageJ (NIH) 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
유동 세포측정법
유동 세포측정법 분석에 사용되는 모든 항체는 표 3에 열거되어 있다. 죽은 세포를 제외하기 위해, LIVE/DEAD 픽서블 데드 셀 스테인 키트(Fixable Dead Cell Stain Kit) (몰레큘라 프로브즈, 미국) 또는 LIVE/DEAD™ 픽서블 아쿠아 데드 셀 스테인 키트(Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)를 추루우 스테인(True Stain) FcX (바이오레전드)와 함께, 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 모든 플루로크롬-접합 항체에 대해, 적정 실험을 사용하여 최적 농도를 결정하였다. 표면 항원 염색을 위해 세포를 4℃에서 20분 동안 FACS 완충제에 희석된 각각의 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 제조업체의 지침에 따라 FACS 완충제로 세척하였다. 마우스 Bcl-2 분석을 위해, 세포를 미리 가온한 3.7% 포르말린 한 부분과 FACS 완충제 한 부분으로 고정한 다음에 Bcl-2 항체를 첨가하기 전에 90% 메탄올에서 30분 동안 인큐베이션하였다. BD 시토픽스(Cytofix)/시토펌(Cytoperm) 키트 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 독일) 또는 Foxp3 / 전사 인자 염색 완충제 세트 (써모피셔)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 세포내 시토카인 염색을 수행하였다. 마우스 IFN-γ의 세포내 시토카인 염색을 위해, 염색 전, 세포를 PMA 및 이오노마이신을 함유하는 세포 자극 칵테일 (이바이오사이언스(eBioscience), 독일)의 희석액으로 제조업체의 지침에 따라 4시간 동안 재자극시켰다. 데이터를 BD LSR 포르테사(Fortessa) 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시즈, 독일) 상에서 획득하고 플로우 조(Flow Jo) 소프트웨어 버전 10.4 (트리 스타(Tree Star), 미국)를 사용하여 분석하였다. 고차원 분석을 위해, 시텍 오로라(Cytek Aurora) (시텍 바이오사이언시즈(Cytek Biosciences)) 상에서 데이터를 획득하고 단일체 및 죽은 세포 배제 및 CD45 양성 세포 선택을 위해 플로우 조 소프트웨어 버전 10.4 (트리 스타, 미국)를 사용하여 사전 처리하였다.
스펙트럼 유동 세포측정법 데이터의 알고리즘-가이드된 고차원 분석
고차원 분석을 R 환경에서 수행하였다. 2차원 UMAP (균일 다양체 근사치 및 투영(Uniform Manifold Approximation and Projections))는 umap 패키지를 사용하여 생성되었으며 FlowSOM-기반 메타클러스터링은 문헌 [Brumelman et al.]에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다 (25).
사멸 검정
OCI-AML3 표적 세포를 제조업체의 지침에 따라 0.5 mM 세포 미량 바이올렛(Cell Trace Violet) BV421 (써모 피셔 사이언티픽, 독일)로 표지된, 72시간 동안 1 μM RG-7112의 존재 또는 부재 하에 20% FCS가 보충된 RMPI 배지에서 배양하고, 96웰 플레이트에서 16시간 동안 10:1, 5:1, 2:1 및 1:1의 이펙터 대 표적 비로 이펙터 T 세포와 공동-배양하였다. 이펙터 T 세포의 세포독성은 좀비(Zombie) NIR APC/Cy7 (바이오레전드)을 사용하여 측정하였다.
재조합 hTRAIL ((TNFSF 10, Apo-2L, CD253;) SUPERKILLERTRAIL®; ENZO)을 사용하는 사멸 검정의 경우, 최적의 사멸을 위해 리간드를 24시간 동안 0.5 μg/ml (1:1000)에 그리고 사멸 조건을 OCI-AML3 표적 세포로 제한하기 위해 0.25 μg/ml (1: 2000)에 부가하였다. 세포의 생존율은 LIVE/DEAD™ 픽서블 아쿠아 데드 셀 스테인 키트 (써모 사이언티픽)로 평가하였다. 데이터를 BD LSR 포르테사 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시즈) 상에서 획득하고 플로우 조 소프트웨어 버전 10.4 (트리 스타)를 사용하여 분석하였다.
염색질 면역침전 (ChIP 검정)
OCI-AML3 세포를 2 μM RG-7112로 12시간 동안 처리하고 실온에서 10분 동안 1% 포름알데히드로 가교결합하고, 포름알데히드를 최종 농도 125 mM의 글리신을 첨가하여 불활성화시켰다. 세포를 용해 완충제 (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 프로테아제 억제제 칵테일)로 재현탁하고 고출력에서 30초 온/오프 프로그램을 사용하여 바이오럽터(Bioruptor)에서 15분 동안 초음파 처리하였다. 16,000 g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 수집하고 희석 완충제 (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% 트리톤(Triton) X-100, 프로테아제 억제제 칵테일)로 10배 희석하였다. 준비된 염색질 추출물을 마우스 IgG (sc-2025, 산타-크루즈 바이오테크놀로지(Santa-Cruz Biotechnology)) 또는 항-p53 항체 (sc-126, 산타-크루즈 바이오테크놀로지)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 면역 복합체는 디나비즈 프로테인 G (인비트로겐) 비드를 사용하여 4℃에서 회전기에서 2시간 동안 수집하고, 세척 완충제 (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% NP-40, 0.5 M NaCl, 프로테아제 억제제 칵테일)로 5회 그리고 TE 완충제 (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA)로 4회 세척하였다. DNA를 용리 완충제 (100 mM NaHCO3, 1% SDS)에서 65℃에서 6시간 동안 용리하고 퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트를 사용함으로써 정제하였다. 정량적 PCR을 사용하여 결합된 DNA의 풍부화를 측정하고 라이트사이클러 480 기기 (로슈(Roche), 스위스)에서 라이트사이클러 480 SYBR 그린 I 매스터 키트 (로슈, 스위스)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 서열이 표 2에 제공되어 있다.
각각의 프라이머 쌍에 대한 ChIP-qPCR 데이터는 투입 DNA의 그 단편의 수량과 관련하여 면역침전물에서 각각의 특정 DNA 단편의 양을 계산함으로써 퍼센트 투입으로서 표시된다.
종양 세포주
인간 백혈병 세포주 OCI-AML3, MOLM-13, 뮤린 백혈병 세포주 WEHI-3B 및 비-악성 32D 세포는 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection), 미국 버지니아주 머내서스)로부터 구입하여 10% FCS, 2 mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다.
회상 면역 실험
GvL 회상 면역 실험을 위해, allo-HCT 후 12일째에 C57BL/6 BMT 수용자로부터 비장세포를 수확하였다 (5백만 개의 BALB/c BM 및 5,000개의 AMLMLL-PTD/ FLT3-ITD 세포 (d0), 300,000개의 동종이계 T 세포 (d2)). 이어서 공여자 H-2kb+CD3+CD8+ T 세포에 대한 FACS 분류를 수행하였다. 세포 순도는 유동 세포측정법에 의해 평가한 바와 같이 적어도 90%였다. 본 발명자들은 100,000개의 분류된 세포를 5백만 개의 BALB/c BM 및 5,000개의 AMLMLL-PTD/ FLT3-ITD 세포 주입 (d0) 후 2일째에 2차 수용자에게 i.v.로 이식하였다.
뮤린 골수에서 NK 세포 고갈
NK 세포를 고갈시키기 위해, 나이브 BALB/c BM을 단리하고 CD3 및 NK1.1 표면에 대해 염색하였다. FACS 분류를 통해, 이어서 BM은 NK1.1+CD3- 세포에서 제외되어, BM에서 NK 세포의 고갈을 발생시켰다.
뮤린 골수에서 CD8 + T 세포의 고갈
CD8+ T 세포를 고갈시키기 위해, 추출된 BM을 CD3 및 CD8 표면 마커에 대해 염색하였다. 이 경우에, BM은 CD8+ T 세포가 고갈된 BM을 생성하는 FACS 분류를 통해 CD3+CD8+ 세포에서 제외되었다.
GVHD 조직학 점수화
GVHD 점수화를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (28). 장기 소장, 대장 및 간을 단리하고 조직 절편을 H&E 염색하고 처리군에 대해 맹검 병리학자에 의해 평가하였다.
세포외 플럭스 검정
제조업체에서 권장하는 바와 같이 시홀스(Seahorse) 분석기 (애질런트(Agilent))에서 세포외 플럭스 검정을 수행하였다. 간단히 말하면, 2 mM 글루타민이 보충된 시홀스 XF 기본 배지에서 96-웰 시홀스 XF 세포 배양 마이크로플레이트의 각각의 웰에 200,000개의 T-세포를 플레이팅하였다. 이어서, 세포 배양 플레이트를 37℃ 비-CO2 인큐베이터에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 센서 카트리지 포트에 글루코스, 올리고마이신 및 2-데옥시글루코스 (2-DG)가 로딩되었다. 당분해 스트레스 시험은 기저 세포외 산성화율 (ECAR)을 측정한 후 글루코스 (최종 농도 10 mM), 올리고마이신 (최종 농도 1 μM) 및 2-DG (최종 농도 50 mM)를 순차적으로 주입하여 수행하였다.
일반적인 종양원성 돌연변이 또는 유전자 융합을 가진 일차 마우스 BM 세포의 형질감염
EV-tg, FLT3-ITD-tg, KRASG12V-tg, cKITD816V-tg, JAK2V617F-tg, FIP1L1-PDGFRα-tg, BCRabl-tg, cMYC-tg BM 세포를 생성하기 위해 BALB/c 마우스에 골수 수확 4일 전에 100 mg/kg 5-플루오로우라실 (메탁 게엠베하(Medac GmbH))를 주사하였다. 뮤린 골수를 수집하고 이전에 본 발명자들이 기재한 바와 같이 성장 인자 (10 ng/mL mIL-3, 10 ng/mL mIL-6 및 14.3 ng/mL mSCF)로 밤새 미리 자극하였다 (5, 29). 성장 인자와 4 μg/mL 폴리브렌이 보충된 2 mL의 레트로바이러스 상청액을 첨가함으로써 12시간마다 3회 스핀 감염 (2400 rpm, 90분, 32℃)에 의해 세포를 형질도입하였다.
질량 분석법을 위한 샘플 준비
allo-HCT 후 12일째에 수용자 마우스의 비장으로부터 CD8+ T 세포를 풍부화시켰다. T 세포는 10% 소 태아 혈청 (깁코), 4 mM L-글루타민, 100 I.U./ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 100 U/ml 인간 재조합 IL-2, 및 55 μM 베타-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640 배지에서 2,000,000개 세포/ml의 세포 밀도로 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고 배지를 10 mM U-13C-글루코스가 첨가된 상기와 같이 보충된 글루코스-미함유 RPMI 1640 배지로 교환하였다. U-13C-글루코스로 표지화를 50분 동안 수행하였다. 샘플당 백만 개의 세포를 수확하고 4℃에서 5분 동안 500 g에서 원심분리하여 세포 배양 배지로부터 분리하였다. 세포를 500 μl PBS로 세척한 후에, 4℃에서 5분 동안 500 g에서 또 다른 원심분리 단계를 수행하였다. 상청액을 완전히 제거한 후, 세포 펠릿을 드라이아이스에서 30분 동안 미리 냉각시킨 50 μl 메탄올:아세토니트릴:물 (50:30:20) 완충제에 재현탁함으로써 대사물을 추출하였다. 샘플을 잠시 와류시키고 -80℃에서 보관하였다.
액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)
LC-MS를 음이온 모드에서 작동하는 브루커 임팩트(Bruker Impact) II QTOF-MS와 함께 애질런트 1290 인피너티(Infinity) II UHPLC를 사용하여 수행하였다. 스캔 범위는 20 내지 1050 Da였다. 질량 보정을 각각의 실행 시작 시에 수행하였다. LC 분리는 95% 완충제 B (90:10 아세토니트릴:완충제 A)에서 20% 완충제 A (물 중 20 mM 탄산암모늄 + 5 μM 메드론산)의 용매 구배를 사용하여 힐리콘(Hilicon) iHILIC (P) 통상적인 컬럼 (100 x 2.1 mm, 5 μm 입자) 상에서 이루어졌다. 유량은 150 μL/min였다. 오토샘플러 온도는 5도이고 주입량은 2 μL이다. TASQ 소프트웨어 (브루커)를 사용하여 대사물의 절대 풍부도에 대한 표적 분석을 위한 데이터 처리를 수행하였다. 각각의 대사물의 피크 면적은 수동 피크 통합에 의해 결정되었다. 샘플의 >80%에서 검출된 대사물 피크만 추가로 분석하였다. 누락된 값은 이 대사물에 대해 전체 샘플 세트에서 검출된 가장 낮은 값의 50%로서 계산되었다. 독립표본 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적 비교를 수행하였다. 다음과 같이 메타보어낼리스트(MetaboAnalyst) 5.0 (30)을 사용하여 히트맵을 생성하였다; 피크 면적 값은 대수 변환 및 오토-스케일링을 거쳤으며; 대사물은 유클리드 거리 상의 워드(Ward) 응집 방법으로 계층적 클러스터링을 사용하여 클러스터링되었다. 천연 동위원소 풍부도에 대한 보정을 포함한, 13C-글루코스 추적을 위한 데이터 처리는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (31, 32).
통계 분석
뮤린 GVL 생존 실험의 샘플 크기에 대해 검정력(power) 분석을 수행하였다. 적어도 1.06의 효과 크기를 검출하도록 0.05의 통계적 유의성에 도달하기 위해 군당 적어도 n=10개의 샘플 크기를 80% 검정력에 의해 결정하였다. 동물 생존의 차이 (카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선)를 만텔 콕스 검정에 의해 분석하였다. 실험은 비-맹검 방식으로 수행되었다. 통계 분석을 위해 독립표본 t-검정 (양측)을 적용하였다. 데이터는 평균 및 SEM (오차 막대)으로 나타낸다. P-값이 <0.01일 때 차이가 유의한 것으로 간주되었다.
실시예의 표
<표 1>
AML 환자 특성
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
약어: Pat. = 환자, f = 여성, m = 남성, sAML = 속발성 AML, MDS = 골수이형성 증후군
<표 2>
프라이머 서열.
Figure pct00014
<표 3>
유동 세포측정법 항체.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예의 결과
MDM2-억제는 동종이계 T-세포 매개 세포독성에 대한 마우스 및 인간 AML 세포의 취약성을 증가시켰다
MDM2-억제가 동종이계 면역 반응과 상승작용적 효과를 낼 것이라는 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 마우스를 골수 (BM) 단독 또는 T-세포와 조합하여 사용하여 allo-HCT로 처리하였다. 골수단핵구성 백혈병 세포 (WEHI-3B)를 보유하는 마우스에서 동종이계 BM 이식편에 T-세포를 첨가하면 생존을 개선시켰다 (도 1a). 공여자 T-세포의 부재 하에 MDM2 억제제로 백혈병 보유 마우스의 처리는 생존을 개선하였으나, 장기간의 보호를 발생시키지는 않았다 (도 1a). T-세포가 MDM2-억제와 조합된 경우에만 대부분의 마우스 (>80%)가 장기적으로 보호되었다 (도 1a). 필적하는 생존 패턴이 AMLMLL-PTD/FLT3-ITD 모델 (도 1b) 및 OCI-AML3 세포를 사용하는 인간화 마우스 모델 (도 1c)에서 나타났다. T-세포/MDM2-억제제 조합은 T-세포/비히클과 비교하여 급성 GVHD 중증도를 증가시키지 않았다 (도 5a-c).
동종이계 T-세포의 시험관내 세포독성은 OCI-AML3 세포가 MDM2-억제에 노출되었을 때 더 높았다 (도 1d). 일관되게, 절단된 카스파제-3은 T-세포가 MDM2-억제와 조합되었을 때 가장 높았다 (도 1e-f).
관찰된 생체내 상승작용의 원인이 되는 메커니즘을 이해하기 위해, OCI-AML3 세포를 MDM2-억제에 노출시켰다. 편향되지 않은 유전자 발현 분석은 MDM2-억제시 백혈병 세포에 의한 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2의 상향조절을 나타냈다 (도 1g). 일관되게, TRAIL-R1/TRAIL-R2-단백질 및 TRAIL-R1/TRAIL-R2-RNA는 인간 OCI-AML3 세포(도 1h-i, 도 6a-j)로, 그리고 마우스 OCI-AML 세포에서 MDM2-억제 (RG7112, HDM201) (도 7a-h) 또는 MDMX-억제 (XI-006)를 가진 WEHI-3B 세포 (도 8a-c)로 MDM2-억제시 증가되었다. RG7112와 HDM201은 둘 다 HDM2 결합을 방지함으로써 p53 분해를 억제한다. 본 발명자들은 p53-넉다운 OCI-AML3 세포를 사용하여 MDM2-억제 후 증가된 TRAIL-R1/2 발현이 p53에 의존하는지 여부를 시험하였고, p53의 독소루비신 유도가 p53-넉다운 세포에서 감소되었으며 (도 9a), 한편 MDM2-억제는 p53-야생형 세포에서 p53을 유도하였다 (도 9b). TRAIL-R1/2 발현은 무손상 p53을 가진 세포에서 MDM2-억제 (RG7112 또는 HDM201)로 증가하였으나, p53-넉다운 세포에서는 그렇지 않았다 (도 1j-k, 도 9c-d). 일관되게, TRAIL은 p53-/- AML 세포에서 더 적은 아폽토시스를 유도하였다 (도 9e). 염색질 면역침전은 p53이 TRAIL-R1/2-프로모터에 결합함을 나타냈다 (도 1l-m).
MDM2-억제시 증가된 TRAIL-R1/2 발현이 GVL-효과에 기여
AML 세포에서 TRAIL-R1/2 발현이 MDM2-억제시 증강된 GVL-효과에 어느 정도 기여하는지 결정하기 위해, 마우스를 항-TRAIL-리간드 차단 항체로 처리하였다. 이는 allo-T-세포/MDM2-억제의 보호 효과를 감소시켰다 (도 2a). 흥미롭게도, TRAIL-리간드 결핍 T-세포 (Tnfsf10 tm1b(KOMP)Wtsi /MbpMmucd)의 전달은 MDM2-억제의 보호 효과를 또한 감소시켰다 (도 2b). 더욱이, TRAIL-R1/2의 시험관내 차단은 MDM2-억제 노출 백혈병 세포에 대한 동종이계 T-세포의 세포독성을 감소시켰다 (도 2c-e). TRAIL-R2 CRISPR-Cas-넉아웃 AML 세포 (도 10a-c)는 allo-T-세포/MDM2-억제 효과에 덜 민감하였다 (도 2f). TRAIL + MDM2-억제의 치료적 상승작용은 WT-AML에서 관찰되었으나 TRAIL-R2-/- AML 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 2g). MDM2-억제제 처리된 마우스로부터 단리된 T-세포는 세포외 플럭스 검정에 의해 측정된 더 높은 당분해 활성을 나타냈다 (도 2h-i). 증가된 당분해 플럭스는 U-13C-글루코스가 몇몇 당분해 중간체에 상승된 혼입에 의해 확인되었다 (도 2j). 게다가, 특히 피리미딘 생합성 경로의 뉴클레오티드 및 그의 전구체는 MDM2-억제제 처리된 마우스로부터 단리된 T-세포에서 풍부화되었다 (도 11a-c). 증가된 당분해 플럭스 및 뉴클레오티드 생합성은 더 높은 GVL 활성에 상응하는 더 강한 T-세포 활성화를 나타낸다 (6).
MDM2-억제는 공여자 T 세포의 세포독성 및 장수를 촉진한다
공여자 CD8+ T-세포는 CD8+ T-세포의 총 증가 없이 비히클만 받은 사람들과 비교하여 MDM2-억제제를 투여받은 allo-HCT 수용자에서 항종양 세포독성 마커인 퍼포린 및 CD107a, IFN-γ, TNF, 및 CD69의 더 높은 발현을 나타냈다 (도 3a-h, 도 12a, 도 13a-b). 나이브 마우스에서 CD107a, TNF 및 CD69는 MDM2-억제시 증가하였다 (도 14a-d). NK-세포가 아닌 CD8+ T-세포의 고갈 (도 15a-b)은 보호 MDM2-억제 효과의 손실을 유발하였고 (도 3i), 이는 항백혈병 효과가 CD8+ T-세포에 의해 매개됨을 나타낸다. MDM2-억제제-치료 하에 회상-면역이 발생하였는지 여부를 이해하기 위해, 비히클 또는 MDM2-억제제로 처리된 백혈병-보유 마우스로부터 공여자-유형 CD8+T-세포를 단리하였다 (도 16a). MDM2-억제제로 처리한, 백혈병-보유 마우스로부터 유래한 T-세포는 2차 백혈병-보유 마우스에서 백혈병의 개선된 제어를 유발하였으며 (도 3j), 이는 항백혈병 회상 반응을 나타낸다. CD27이 결여된 이펙터 T-세포는 높은 항원 회상 반응을 나타내고 (12) MDM2-억제제-처리 수용자에서 CD8+CD27+TIM3+ 공여자 T-세포의 더 낮은 빈도를 관찰하였다 (도 3k-m, 도 17). MDM2-억제제 처리된 마우스의 T-세포는 높은 Bcl-2 및 IL-7R (CD127)을 포함한 장수의 특징 (13)을 나타냈다 (도 18a-d).
일차 인간 AML 세포의 MDM2-억제는 TRAIL-1/2 발현을 발생시킨다
인간 세포의 마우스 모델로부터의 본 발명자들의 연구결과를 검증하기 위해, 본 발명자들은 일차 인간 AML 세포에 대한 MDM2-억제의 효과를 연구하였다. MDM2-억제는 p53의 수준을 증가시켰고 (도 19a-d), 이는 온-타겟 활성을 나타낸다. MDM2-억제는 또한 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2 RNA (도 4a-d) 및 단백질 (도 20a-e)의 수준을 증가시켰다. MDM2-억제와 동종이계 T-세포의 조합은 면역결핍 마우스에서 일차 인간 AML 세포의 제거를 증강시켰다 (도 4e). AML 세포는 MDM2-억제시 증가된 TRAIL-R1/2 발현을 나타냈다 (도 21a, 도 22a-c). 인간 p53-/- AML 세포가 MDM2-억제제/allo-T-세포 조합에 내성이 있기 때문에 상승작용적 효과는 무손상 p53에 의존적이었다 (도 4f, 도 23a). MDM2-억제제/allo-T-세포 조합은 인간 AML 세포에서 TRAIL-R1/2 다운스트림 경로 (카스파제-8, 카스파제-3, PARP)의 활성화를 유발하였다 (도 4g).
MDM2 발현을 활성화시키는 종양원성 돌연변이는 T-세포/MDM2-억제제 조합에 대한 감수성을 증가시킨다
T-세포/MDM2-억제제 조합에 특히 감수성일 수 있는 AML 아형을 확인하기 위해, 본 발명자들은 다수의 통상적인 종양원성 돌연변이 또는 유전자 융합 (FLT3-ITD, KRAS-G12D, cKIT-D816V, JAK2-V617F, FIP1L-PDGFR-α, BCR-ABL 및 c-myc)이 MDM2에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 표시된 종양원성 벡터로 형질도입된 동계 BM을 받은 마우스는 비장종대 및 GFP+ 트랜스제닉 세포로 BM-침윤을 발생시켰다 (도 24a-c). cKIT-D816V 및 FIP1L-PDGFR-α는 MDM2 및 MDM4를 유도하였다 (도 24d-g). 흥미롭게도, allo-BMT 후 allo-T-세포/MDM2-억제제 조합은 FIP1L-PDGFR-α-돌연변이체 및 cKIT-D816V-돌연변이체 AML을 보유하는 마우스에서 매우 효과적이었다 (도 24h-i).
MDM2-억제는 p53-의존 방식으로 AML 세포 상에서 MHC 클래스 I/II 발현을 증가시킨다
MHC 유전자의 하향조절 및 불일치 HLA의 손실이 allo-HCT 후에 AML 재발을 유발하는 것으로 나타났기 때문에 (2, 4), MDM2-억제가 AML 세포 상에서 MHC 분자를 상향조절하여 동종이계 T-세포에 의한 그의 인식을 증강시킬 수 있는지 여부를 시험하였다.
유전자 발현 분석은 MDM2-억제시 HLA 클래스 I 및 II의 상향조절을 나타냈다 (도 25a). 단백질 수준에서, MDM2-억제는 백혈병 세포 상에서 HLA-C 및 HLA-DR 발현을 증가시켰다 (도 4h-k, 도 25b-c). HLA-DR은 HLA-DR-하향조절이 allo-HCT 후에 AML-재발과 관련이 있는 것으로 나타났기 때문에 선택되었다 (2). p53-의존성 조절과 일관되게, HLA-C 및 HLA-DR은 p53-넉다운 OCI-AML3 세포에서 MDM2-억제에 따라 증가하지 않았다 (도 4l-m). p53-활성을 증가시키기 위한 접근법으로서, MDMX-억제 (XI-006) (14)는 또한 HLA-C 및 HLA-DR을 증가시켰다 (도 25d,e). MDM2-억제는 일차 인간 AML 세포 상에서 (도 4n-o) 및 AML-세포주에서 증가된 MHC-II 발현을 유발하였으나, 비-악성 세포에서는 그렇지 않았다 (도 26a-l). 이들 연구결과는 MDM2-유도 p53-하향조절을 표적화하는 것이 마우스 및 인간에서 MHC-II 및 TRAIL-R1/2 상향조절을 통해 allo-HCT 후 항백혈병 면역을 증강시킨다는 것을 나타낸다 (도 27).
실시예에 대한 토론
AML 재발은 면역 탈출 메커니즘에 의해 유발된다 (9). 본 발명자들의 최근 연구는 AML 세포가 면역 탈출 메커니즘으로 락트산을 생성하여, T-세포 대사 및 이펙터 기능을 방해한다는 것을 나타냈다 (6). 재발을 발생시키는 두 번째 메커니즘은 IL-15 생성을 차단하는 FLT3-ITD 종양원성 신호전달을 통해, AML의 감소된 면역원성을 발생시키는 것이다 (5). 이 연구에서, 본 발명자들은 공여자 T-세포의 동종반응성과 TRAIL-R1/2 및 MHC-II 하향조절을 역전시키는 약리학적 접근법을 조합하여, 재발 치료의 새로운 개념을 시험하였다.
본 발명자들은 MDM2-억제가 일차 인간 AML 세포 및 AML 세포주에서 TRAIL-R1/2 발현을 유도함을 밝혀냈다. TRAIL 라이게이션시, TRAIL 사멸 수용체는 그의 세포내 사멸 도메인에서 사멸 도메인과 FAS-연관 단백질 (FADD) 및 프로-카스파제-8/10으로 구성된 사멸-유도-신호전달-복합체 (DISC)를 어셈블리한다 (15). TRAIL-R 활성화는 항종양 활성을 갖는 것으로 나타났다 (16). 더욱이, MDM2-억제는 또한 일차 인간 AML 세포에서 MHC-II 발현을 증가시켰으며, 이는 allo-HCT 후 인간 AML 재발에서 관찰된 MHC-II 감소를 역전시키기 위한 약리학적 개입에 대한 시점을 제공할 수 있다 (2, 3).
본 발명자들의 관찰은 백혈병 재발이 allo-HCT를 받는 환자의 사망의 57%에 대한 원인이 되기 때문에 임상적으로 매우 관련이 있다 (1, 17). 본 발명자들은 또한 이 관찰의 배후에 있는 면역학적 메커니즘을 기술하여 AML-재발을 치료하기 위해 MDM2-억제 및 T-세포를 사용하는 과학적 근거를 제공하며, 이는 I상/II상 임상 시험을 발생시킬 것이다.
참고문헌
Figure pct00018
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Albert-Ludwigs-Universit채t Freiburg Novartis AG <120> MDM2 INHIBITORS FOR USE IN THE TREATMENT OR PREVENTION OF HEMATOLOGIC NEOPLASM RELAPSE AFTER HEMATOPOIETIC CELL TRANSPLANTATION <130> 2307/20WO <150> EP 21184448.5 <151> 2021-07-08 <150> EP20197230.4 <151> 2020-09-21 <160> 16 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward hTrailR1 <400> 1 gtgtgggtta caccaatgct tc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer reverse hTrailR1 <400> 2 cctggtttgc actgacatgc tg 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward hTrailR2 <400> 3 acagttgcag ccgtagtctt g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer reverse hTrailR2 <400> 4 ccaggtcgtt gtgagcttct 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward CDKN1A <400> 5 gtggctctga ttggctttct g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer reverse CDKN1A <400> 6 ctgaaaacag gcagcccaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward TNFRSF10A <400> 7 ttcgcattcg gagttcaggg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer reverse TNFRSF10A <400> 8 aagtggcaaa acgactccga 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward TNFRSF10B <400> 9 acgactggtg cgtcttgc 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer reverse TNFRSF10B <400> 10 aagacccttg tgctcgttgt c 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward GAPDH <400> 11 gtctcctctg acttcaacag cg 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer reverse GAPDH <400> 12 accaccctgt tgctgtagcc aa 22 <210> 13 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAIL-R1 targeted shRNA <400> 13 ttcgtctctg agcagcaaat ggaaagcca 29 <210> 14 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAIL-R2 targeted shRNA <400> 14 agagacttgc caagcagaag attgaggac 29 <210> 15 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> non-silencing shRNA control <400> 15 gcactaccag agctaactca gatagtact 29 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trail-R2 gRNA design <400> 16 cgcggcgaca acgagcacaa 20

Claims (19)

  1. 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 마우스 이중 미세염색체 2 (MDM2) 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 혈액학적 신생물이 백혈병, 림프종 및 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 MDM2 억제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈액학적 신생물이 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 (AML)인 MDM2 억제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HCT가 동종이계 HCT인 MDM2 억제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HCT가 T 세포를 포함하는 것인 MDM2 억제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HCT 후에 및 재발 발생 전에 환자에게 투여되는 MDM2 억제제.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HCT 후에 재발 발생 후에 백혈병 환자에게 투여되는 MDM2 억제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, RG7112 (RO5045337), 이다사누틀린 (RG7388), AMG-232 (KRT-232), APG-115, BI-907828, CGM097, 시레마들린 (HDM-201), 및 밀라데메탄 (DS-3032b), 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 MDM2 억제제.
  9. 제8항에 있어서, 시레마들린 (HDM-201), 또는 그의 제약상 허용되는 염인 MDM2 억제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, MDM2 억제제의 투여가 TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 수용체 1 (TRAIL-R1), TRAIL-R2, 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 분자 및 HLA 클래스 II 분자 중 하나 이상의 상향조절을 발생시키는 것인 MDM2 억제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 HCT와 함께 및/또는 HCT 후에, 동종이계 T 세포 이식의 투여를 추가로 포함하는 것인 MDM2 억제제.
  12. 제11항에 있어서, 동종이계 T 세포 이식이 림프구를 포함하나, 조혈 줄기 세포를 포함하지 않는 공여자 림프구 주입인 MDM2 억제제.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 동종이계 T 세포 이식의 공여자가 또한 HCT의 공여자인 MDM2 억제제.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HCT 후에, 및 동종이계 T 세포 이식의 투여 전에 및/또는 투여와 동일한 날에, 및/또는 투여 후에 투여되는 MDM2 억제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, MDM2 억제제의 투여가 암 세포에 대한 CD8+ allo-T 세포의 세포독성을 증가시키고, 여기서 바람직하게는 CD8+ allo-T 세포의 세포독성이 적어도 부분적으로 암 세포의 TRAIL-R과 CD8+ allo-T 세포의 TRAIL-리간드 (TRAIL-L)의 상호작용에 의존하는 것인 MDM2 억제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, MDM2 억제제의 투여가 이식편 대 백혈병 또는 이식편 대 림프종 반응을 증가시키고, 바람직하게는 여기서 이식편 대 백혈병 반응 또는 이식편 대 림프종 반응이 CD8+ allo-T 세포에 의해 매개되는 것인 MDM2 억제제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, MDM2 억제제의 투여가 CD8+ allo-T 세포에 의한 퍼포린, CD107a, IFN-γ, TNF 및 CD69 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것인 MDM2 억제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 엑스포틴-1 (XPO-1) 억제제의 투여를 추가로 포함하는 것인 MDM2 억제제.
  19. 환자에서 혈액학적 신생물의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 XPO-1 억제제로서, 여기서 치료는 조혈 세포 이식 및 MDM2 억제제의 투여를 추가로 포함하는 것인 XPO-1 억제제.
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