JP2022512161A - 免疫療法のための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本出願は、複数の細胞型を含む医薬組成物、及びこれらの組成物を使用して対象におけるがんを処置する方法に関する。【選択図】図１３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／７７８，１８９号の利益を主張するものであり、この内容全体が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内のリンパ球集団は、主にＴ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を構成する。ＮＫ細胞は、ウイルス感染に対する中心的な防御及び腫瘍細胞の殺傷を担うことが知られており、抗原特異的細胞表面受容体を欠くため、自然免疫のエフェクターとして分類されている。Ｔ細胞は、体液性免疫を媒介する細胞性免疫を媒介し、自然免疫系と緊密に連携して作用する適応免疫を提供することが知られている。ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６の表面発現によって、ならびにＣＤ３表面発現の欠如によって、表現型的に定義される。ヒトＮＫ細胞の約９０％は、ＣＤ５６ｄｉｍ ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔ細胞であり、主要な細胞傷害性サブセットであることが見出されたのに対し、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ ＣＤ１６ｄｉｍ／－ＮＫ細胞は、より多くのサイトカインを分泌することが見出された。ＮＫ細胞によって分泌される主要なサイトカインは、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦ－β、顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、及びＩＬ－１３である。
がん患者の末梢血から単離されたＮＫ細胞は、特にがんの進行期に表現型及び機能性の変化を示す。新たに単離された腫瘍浸潤ＮＫ細胞は、自己腫瘍に対して細胞傷害性でないことが示されている。Ｔ細胞機能不全もまた、がん患者において報告されている。さらに、がん患者の末梢血から得られたＮＫ細胞及びＴ細胞、特にＮＫ細胞は、機能、特に細胞傷害活性が有意に低下している。ＮＫ細胞の抑制は、腫瘍微小環境におけるＮＫ受容体の下方制御によって媒介される。末梢血リンパ球のＮＫ細胞浸潤及び細胞傷害活性は、がん患者の予後と間接的な相関関係を有する。
主要なＴ細胞亜集団は、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞及び細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞である。腫瘍から保護する細胞性免疫応答は、典型的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞に帰属し、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、がんに対する化学療法応答に関連する。ＣＤ８＋メモリーＴ細胞を伴う多数のＴ細胞、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）の割合（％）が高い腫瘍浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の低減、及び腫瘍部位でのＣＤ４／ＣＤ８比率の逆転は、固形がんを有する患者の全生存率と有意に関連していた。ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の高い発現を伴うＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は、Ｔメモリー細胞と比較して、より長い活性寿命を有し、がんに対してより効果的であることが示されている。ＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞の抗腫瘍及び抗菌活性において重要な役割を担い、がん患者のＴ細胞上でのＣＤ２８の表面発現が低いことは、それらの患者におけるがん及び感染に対して戦うためのＴ細胞の活性が低いことを示す。Ｔ細胞の表面上でのＣＤ１２７の表面発現の低下は、がん及び感染症の存在によって影響を受けることが示されている。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ５４及びＢ７Ｈ１の発現が低く、ＣＤ４４の発現が高いがん幹細胞／未分化腫瘍を、溶解及び分化する。末梢血リンパ球の中程度及び高い細胞傷害活性は、がんリスクの低下と関連し、腫瘍の高ＮＫ細胞浸潤はより良好な予後と関連するのに対し、低活性はがんリスクの増加と関連する。
がん幹細胞（ＣＳＣ）／低分化腫瘍上でのＭＨＣクラスＩ発現が低いことは、それらの生存に有利に働く可能性があり、がん患者におけるＴ細胞ベースの免疫療法に対するそれらの限られた有効性を説明する。ＣＳＣは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の優れた標的であるのに対し、それらの分化した対応物は、有意により耐性がある。さらに、腫瘍の脱分化は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対するそれらの感受性の増加をもたらした。初代ＮＫ細胞の細胞傷害性機能が、ＣＳＣ／幹細胞との相互作用後に抑制されるということが知られている。ＮＫ細胞は、ＣＳＣ／未分化腫瘍とのＣＤ１６受容体架橋または相互作用の結果として、スプリットアネルギーを受ける。これは、ＮＫ細胞傷害性を喪失するが、ＩＦＮ－γのより多くの分泌が誘発され、抗ＰＤ－１療法の有効性と相関することが最近示されている腫瘍上でのＭＨＣクラスＩ、ＣＤ５４及びＰＤ－Ｌ１の分化抗原発現における増加を促進する、鍵となる事象である。実際、循環ＮＫ細胞の全体的な高レベルは、がん患者におけるより良好な予後と関連している。しかしながら、がん患者の末梢血におけるＮＫ細胞の細胞傷害活性は低下し、また、ＮＫ細胞活性化受容体の発現は、がんの初期ステージでさえも減少し、進行疾患ではさらに低下する。ＮＫ細胞機能における欠損は、膵臓癌の前新生物ステージ及び新生物ステージの両方で見られる。膵臓腫瘍の中で、ＭｉａＰａＣａ－２（ＭＰ２）膵臓癌幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍細胞の成長、遊走、クローン原性、及び自己複製能ならびに化学療法耐性が増加していることが示された。
単一型の免疫細胞を用いた免疫療法は、有効ではあるが、腫瘍の完全な根絶を実証しておらず、これは、この免疫療法が、免疫細胞の特異化したサブセットのみを利用して、がん細胞の亜集団を標的とするためである。ゆえに、複数の機序を使用してがん細胞を標的とすることができる複数の免疫細胞型を包含する改善された免疫療法のための治療組成物及び方法を同定及び開発することが大いに必要とされている。
本発明は、少なくとも部分的に、初代ＮＫ細胞が、分化腫瘍に対して抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するが、未分化／幹様腫瘍に対しては媒介しない、及びスーパーチャージドＮＫ細胞が、ＡＤＣＣを媒介しないが、分化腫瘍を直接標的／殺傷することができるという発見に基づく。本発明はまた、少なくとも部分的に、ＮＫ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に拡大し、ＮＫ細胞がＣＳＣ／低分化腫瘍の選択及び分化を通してがんの進行を防ぎ、腫瘍の侵攻性、転移能の阻害、及び化学療法に対する感受性の増加をもたらすという発見に基づく。
一態様では、本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に免疫学的組成物を投与することを含み、免疫学的組成物は、以下：（ａ）同種異系初代ＮＫ細胞、（ｂ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞、（ｃ）自己スーパーチャージドＮＫ細胞拡大（expanded）ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び（ｄ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞拡大自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される少なくとも２つの細胞型を含む。
本発明の任意の態様に適用することができる、及び／または本明細書に記載の任意の他の実施形態（複数可）と組み合わせることができる、多数の実施形態をさらに提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、３つの細胞型、またはさらには４つの細胞型を含む免疫学的組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、対象のＮＫ細胞は、以下：（ａ）サイトカイン分泌、任意選択でサイトカインはＩＦＮ－γである、（ｂ）細胞傷害性、（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大（expansion）、（ｄ）幹様／低分化腫瘍細胞の分化、及び（ｅ）ＡＤＣＣ活性から選択される１つまたは複数の活性の低下を示す。ある特定の実施形態では、免疫学的組成物は、医薬的に許容可能な製剤にて投与される。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、がん細胞上で高度に発現される少なくとも１つの表面タンパク質に対する抗体、例えば、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢと結合する抗体を投与することをさらに含む。抗体は、ＡＤＣＣを誘導するのに十分な量で投与され得る。
ある特定の実施形態では、本方法は、例えば、対象に、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を増強する１つまたは複数の追加の作用物質、例えばＩＬ－２、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、メカブ、及び／または少なくとも１つの細菌株（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）を含む組成物、任意選択で少なくとも１つの細菌株は生きているまたは超音波処理されている、を投与することによって、ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導または増強することによって、ＮＫ細胞を活性化することをさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、ＡＪ２細菌を含む。特に好ましい実施形態では、ＮＫ細胞を活性化する１つまたは複数の追加の作用物質は、メカブ及びＡＪ２細菌である。
ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、例えば、免疫学的組成物の前、後、またはこれと並行して（concurrently）投与され得る、少なくとも１つの追加の免疫療法及び／またはがん治療を投与することをさらに含む。ある特定のかかる実施形態では、少なくとも１つの追加の免疫療法は、免疫チェックポイント、例えばＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３またはＡ２ａＲを阻害する。ある特定の好ましい実施形態では、免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２から選択される。ある特定の他の実施形態では、がん治療は、放射線、放射線増感剤、化学療法、インターフェロン、及びインターフェロン誘導剤から選択される。ある特定のかかる実施形態では、がん治療は化学療法であり、任意選択で化学療法はパクリタキセル及び／またはシスプラチンである。
ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、低分化がん細胞の分化を誘導する作用物質を投与することをさらに含み、任意選択で作用物質はＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。
ある特定の実施形態では、がんは、膵臓癌、または口腔癌、例えば、口腔扁平上皮癌である。ある特定の実施形態では、がんは、高度に分化している。他の実施形態では、がんは、幹様／低分化である。
ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、マウスまたはヒト、好ましくはヒトである。
別の態様では、本発明は、がん細胞を殺傷するまたはがん細胞の増殖を阻害する方法を提供し、該方法は、がん細胞を、免疫学的組成物（例えば、本明細書に記載の組成物）と接触させることを含み、例えば、免疫学的組成物は、以下：（ａ）同種異系初代ＮＫ細胞、（ｂ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞、（ｃ）自己スーパーチャージドＮＫ細胞拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び（ｄ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞拡大自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される少なくとも２つの細胞型を含む。
上記のように、本発明の任意の態様に適用することができる、及び／または本明細書に記載の任意の他の実施形態（複数可）と組み合わせることができる、多数の実施形態をさらに提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本方法は、がん細胞を、これらの細胞型のうちの少なくとも３つ、またはさらにはこれらの細胞型のうちの４つを含む免疫学的組成物と接触させることを含む。免疫学的組成物は、医薬的に許容可能な製剤内にあり得る。
ある特定の実施形態では、本方法は、がん細胞を、がん細胞上で高度に発現される少なくとも１つの表面タンパク質に対する抗体、例えば、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢと結合する抗体と接触させることをさらに含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣを誘導するのに十分な量で提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、例えば、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を増強する１つまたは複数の追加の作用物質、例えばＩＬ－２、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、メカブ、及び少なくとも１つの細菌株（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）を含む組成物、任意選択で少なくとも１つの細菌株は生きているまたは超音波処理されている、と接触させることによって、ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導または増強することによって、ＮＫ細胞を活性化することをさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、ＡＪ２細菌を含む。特に好ましい実施形態では、１つまたは複数の追加の作用物質は、メカブ及びＡＪ２細菌である。
ある特定の実施形態では、本方法は、がん細胞を、例えば、免疫学的組成物の前、後、またはこれと並行して投与され得る、少なくとも１つの追加の免疫療法及び／またはがん治療と接触させることをさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の免疫療法は、免疫チェックポイント、例えばＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３またはＡ２ａＲを阻害する。ある特定の好ましい実施形態では、免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２から選択される。ある特定の実施形態では、がん治療は、放射線、放射線増感剤、化学療法、インターフェロン、及びインターフェロン誘導剤から選択される。ある特定のかかる実施形態では、がん治療は化学療法であり、任意選択で化学療法はパクリタキセル及び／またはシスプラチンである。ある特定の実施形態では、本方法は、がん細胞を、低分化がん細胞の分化を誘導する作用物質と接触させることをさらに含み、任意選択で作用物質はＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。
ある特定の実施形態では、がんは、膵臓癌、または口腔癌、例えば、口腔扁平上皮癌である。ある特定の実施形態では、がんは、高度に分化している。他の実施形態では、がんは、幹様／低分化である。
ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、マウスまたはヒト、好ましくはヒトである。
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を惹起することができる免疫学的組成物を提供し、該組成物は、以下：（ａ）同種異系初代ＮＫ細胞、（ｂ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞、（ｃ）自己スーパーチャージドＮＫ細胞拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び（ｄ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞拡大自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される少なくとも２つの細胞型を含む。
ある特定のかかる実施形態では、免疫学的組成物は、３つの細胞型、またはさらには４つの細胞型を含む。免疫学的組成物は、医薬的に許容可能な製剤であり得る。ある特定の実施形態では、免疫学的組成物は、がん細胞上で高度に発現される少なくとも１つの表面タンパク質に対する抗体、例えばＭＩＣＡ／ＭＩＣＢと結合する抗体をさらに含む。抗体は、対象に投与された場合にＡＤＣＣを誘導するのに十分な量で存在し得る。
ある特定の実施形態では、免疫学的組成物は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を増強する１つまたは複数の追加の作用物質、例えばＩＬ－２、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、メカブ、または少なくとも１つの細菌株（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）を含む組成物、任意選択で少なくとも１つの細菌株は生きているまたは超音波処理されている、をさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、ＡＪ２細菌を含む。特に好ましい実施形態では、免疫学的組成物は、メカブ及びＡＪ２細菌をさらに含む。ある特定の実施形態では、免疫学的組成物は、少なくとも１つの追加の免疫療法及び／またはがん治療をさらに含む。ある特定のかかる実施形態では、少なくとも１つの追加の免疫療法は、免疫チェックポイント、例えばＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３またはＡ２ａＲを阻害する。なおもある特定の好ましい実施形態では、免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２から選択される。ある特定の実施形態では、免疫学的組成物は、放射線増感剤、化学療法、インターフェロン、及びインターフェロン誘導剤から選択されるがん治療をさらに含む。ある特定のかかる実施形態では、がん治療は化学療法であり、任意選択で化学療法はパクリタキセル及び／またはシスプラチンである。ある特定の実施形態では、免疫学的組成物は、低分化がん細胞の分化を誘導する作用物質をさらに含み、任意選択で作用物質はＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。
Ａ～Ｄは、口腔腫瘍細胞の分化ステージが、ＮＫ細胞媒介性溶解に対する感度と相関することを示す。ＯＳＣＳＣ及びＭＰ２は、方法及び材料に記載する通りに分化させた。ＯＳＣＳＣ、ＯＳＣＣ及びスプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清分化ＯＳＣＳＣ腫瘍細胞（図１Ａ）、ならびにＭＰ２、ＰＬ１２、及び分化ＭＰ２（図１Ｂ）上でのＣＤ４４、ＭＨＣ－Ｉ、及びＭＩＣＡの表面発現を、それぞれのＰＥコンジュゲート抗体で染色した後にフローサイトメトリー分析を使用して分析した。アイソタイプ対照抗体を、対照として使用した。ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性は、ＯＳＣＣ、分化ＯＳＣＣＳ及びＯＳＣＳＣ（図１Ｃ）、ならびにＭＰ２、分化ＭＰ２、及びＰＬ１２（図１Ｄ）腫瘍細胞に対する、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理してから、それらを５１Ｃｒ標識腫瘍に、様々なエフェクター対標的比にて加えた。 分化口腔腫瘍及び膵臓腫瘍細胞が、それらの未分化区画と比較して、より高いＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ表面発現を発現したことを示す。ＯＳＣＳＣ及びＭＰ２は、方法及び材料に記載する通りに分化させた。ＯＳＣＣＳ、ＯＣＳＣＳ、及びスプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清分化ＭＰ２、ＰＬ１２及びスプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清分化ＯＳＣＳＣ（上）ＰＬ１２、ＭＰ２及びＮＫ細胞上清分化ＭＰ２（下）上でのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの表面発現を、それぞれのＰＥコンジュゲート抗体で染色した後にフローサイトメトリー分析を使用して評価した。アイソタイプ対照抗体を、対照として使用した。 Ａ～Ｅは、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体が、ＯＳＣＣに対するＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを増加させた一方で、ＯＳＣＳＣ細胞はＡＤＣＣを通して有意に標的とされなかったことを示す。健康なドナーからの新たに精製されたＮＫ細胞を、未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。ＯＳＣＣＳ、及びＯＳＣＳＣを、５１Ｃｒで標識し、次に、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体（５μｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。未結合抗体を洗浄し、未処理またはＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに対する抗体で処理したＯＳＣＣ（図３Ａ）及びＯＳＣＳＣ（図３Ｂ）に対する細胞傷害性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した（図３Ａ及び３Ｂは１つの研究を代表する）。未処理（図３Ｃ）、ＩＬ－２処理（図３Ｄ）及びＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂ（図３Ｅ）処理ＮＫ細胞の細胞傷害性におけるＡＤＣＣ誘導性増加倍数を測定した。 Ａ～Ｅは、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体が、ＰＬ１２に対するＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを増加させた一方で、ＭＰ２細胞は標的とされなかったことを示す。健康なドナーからの新たに精製されたＮＫ細胞を、未処理のままにした、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）の組み合わせで１８時間処理した。ＰＬ１２、及びＭＰ２を、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体（５μｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。未結合抗体を洗浄し、未処理またはＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに対する抗体で処理したＰＬ１２（図４Ａ）及びＭＰ２（図４Ｂ）に対する細胞傷害性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。未処理（図４Ｃ）、ＩＬ－２処理（図４Ｄ）、及びＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂ処理（図４Ｅ）ＮＫ細胞の細胞傷害性におけるＡＤＣＣ誘導性増加倍数を測定した。 Ａ～Ｆは、スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いたＯＳＣＳＣの分化が、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体を通してＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに対するそれらの感受性をもたらすことを示す。ＯＳＣＳＣ及びＭＰ２腫瘍細胞は、方法及び材料のセクションに記載する通りに分化させた。健康なドナーからの新たに精製されたＮＫ細胞を、未処理のままにしたまたはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理した。ＯＳＣＣＳ、分化ＯＳＣＳＣ、及びＯＳＣＳＣを、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体（５μｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。未結合抗体を洗浄し、未処理または抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ処理したＯＳＣＣ（図５Ａ）、分化ＯＳＣＳＣ（図５Ｂ）、ＯＳＣＳＣ（図５Ｃ）、ＰＬ１２（図５Ｄ）、分化ＭＰ２（図５Ｅ）、及びＭＰ２（図５Ｆ）に対する未処理ＮＫ細胞及び／またはＩＬ－２処理の細胞傷害性を、標準的な４時間の５１クロミウム放出アッセイを使用して決定した。 Ａ～Ｃは、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現する分化口腔腫瘍と培養した場合、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体が、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を増加させたことを示す。ＯＳＣＣ及びＯＳＣＳＣを、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体（５μｇ／ｍＬ）の不在下または存在下で一晩培養した。未結合抗体を洗浄した。健康なドナーから新たに精製されたＮＫ細胞を、未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）の組み合わせで１８時間処理し、それらを、ＯＳＣＣ（図６Ａ）、及びＯＳＣＳＣ（図６Ｂ）と共培養した。２４時間後、上清を培養物から収集し、ＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡで測定した。図Ａ及びＢは、１つの実験を代表する。図６Ｃは、３つの異なる実験において、未処理または抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体処理ＯＳＣＣ及びＯＳＣＳＣと共培養したＩＬ－２処理ＮＫのＩＦＮ－γレベルを示す。 拡大ＮＫ細胞が、未分化及び分化腫瘍細胞の両方を標的とする一方で、初代ＮＫ細胞は、未分化／幹様集団を優先的に標的とすることを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）で処理し、拡大ＮＫ細胞をＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）で１８時間再活性化した。ＯＳＣＣＳ及びＯＳＣＳＣを、５１Ｃｒで標識し、ＯＳＣＣ（左）及びＯＳＣＳＣ（右）に対する初代及び拡大ＮＫ細胞の細胞傷害性を、３つの異なる実験において、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。 拡大ＮＫ細胞が、未分化及び分化腫瘍細胞の両方を標的とする一方で、初代ＮＫ細胞は、未分化／幹様集団を優先的に標的とすることを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）で処理し、拡大ＮＫ細胞をＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）で１８時間再活性化した。ＰＬ１２及びＭＰ２を、５１Ｃｒで標識し、ＭＰ２及びＰＬ１２に対する初代ＮＫ細胞の細胞傷害性、及び拡大ＮＫの細胞傷害性を決定した。 Ａ～Ｃは、ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６処理の組み合わせが、初代ＮＫ細胞ではスプリットアネルギーを誘導するが、スーパーチャージドＮＫ細胞では誘導しないことを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、それらをＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、またはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。拡大ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間再活性化した。ＯＳＣＳＣを、５１Ｃｒで標識し、ＯＳＣＳＣに対するＩＬ－２処理ならびにＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせの初代ＮＫ細胞（図８Ａ）及び拡大ＮＫ細胞（図８Ｂ）の細胞傷害性を、標準的な４時間の５１クロミウム放出アッセイを使用して決定した。図Ａ及びＢは、１つの別々の実験を代表する。抗ＣＤ１６ｍＡｂ処理の結果として引き起こされた細胞傷害性における低減倍数を計算した（図８Ｃ）。 初代ＮＫ細胞が、拡大ＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介することを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、それらを未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。拡大ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、未処理のままにしたまたはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間再活性化した。ＯＳＣＣＳを、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体、もしくはセタキシマブ（５μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。未結合抗体を洗浄し、未処理またはＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体に対する抗体もしくはセツキシマブで処理されたＯＳＣＣに対する、未処理（図９Ａ）、ＩＬ－２処理（図９Ｂ）、ならびにＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせ（図９Ｃ）の初代及び拡大ＮＫ細胞の細胞傷害性を、標準的な４時間のクロミウム放出アッセイを使用して決定した。（図９Ａ～９Ｃは、１つの研究を包括している）。 初代ＮＫ細胞が、拡大ＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介することを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、それらを未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。拡大ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、未処理のままにしたまたはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間再活性化した。ＯＳＣＣＳを、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体、もしくはセタキシマブ（５μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。未結合抗体を洗浄し、未処理またはＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体に対する抗体もしくはセツキシマブで処理されたＯＳＣＣに対する、未処理（図９Ａ）、ＩＬ－２処理（図９Ｂ）、ならびにＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせ（図９Ｃ）の初代及び拡大ＮＫ細胞の細胞傷害性を、標準的な４時間のクロミウム放出アッセイを使用して決定した。（図９Ａ～９Ｃは、１つの研究を包括している）。 初代ＮＫ細胞が、拡大ＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介することを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、それらを未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。拡大ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、未処理のままにしたまたはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間再活性化した。ＯＳＣＣＳを、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体、もしくはセタキシマブ（５μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。未結合抗体を洗浄し、未処理またはＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体に対する抗体もしくはセツキシマブで処理されたＯＳＣＣに対する、未処理（図９Ａ）、ＩＬ－２処理（図９Ｂ）、ならびにＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせ（図９Ｃ）の初代及び拡大ＮＫ細胞の細胞傷害性を、標準的な４時間のクロミウム放出アッセイを使用して決定した。（図９Ａ～９Ｃは、１つの研究を包括している）。 初代ＮＫ細胞が、拡大ＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介することを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、それらを未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。拡大ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、未処理のままにしたまたはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間再活性化した。ＯＳＣＣＳを、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体、もしくはセタキシマブ（５μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。同じ実験の細胞傷害性率（％）を示す。 初代ＮＫ細胞が、拡大ＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介することを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、それらを未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。拡大ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、未処理のままにしたまたはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間再活性化した。ＯＳＣＣＳを、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体、もしくはセタキシマブ（５μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。ＩＬ－２処理初代及び拡大ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣ誘導性増加倍数を計算した。 初代ＮＫ細胞が、拡大ＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介することを示す。ＮＫ細胞を、方法及び材料のセクションに記載する通りに、健康なドナーの血液から精製し、拡大させた。拡大の１５日目の後、初代ＮＫ細胞を、同じドナーから精製し（１×１０６個の細胞／ｍＬ）、それらを未処理のままにした、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した。拡大ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、未処理のままにしたまたはＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間再活性化した。ＯＳＣＣＳを、５１Ｃｒで標識し、その後、未処理のままにしたまたは抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体、もしくはセタキシマブ（５μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。同じドナーからの未処理、ＩＬ－２処理（１，０００Ｕ／ｍＬ）初代ＮＫ、及び１５日目のＩＬ－２再活性化拡大ＮＫ（１，０００Ｕ／ｍｌ）の、未処理またはＭＩＣＡ／Ｂに対する抗体（５μｇ／ｍＬ）で処理されたＰＬ１２に対する細胞傷害性を、標準的な４時間のクロミウム５１放出アッセイを使用して決定した。 Ａ～Ｄは、特定の濃度でのメカブエ抽出フコイダンが、ＮＫ細胞にスプリットアネルギーを誘導し、Ａ２プロバイオティクス細菌がＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を増加させる一方で、細胞傷害性を媒介する能力が変わらないままであることを示す。メカブエをＰＢＳ（１２．５ｍｇ／ｍｌ）に可溶化し、精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理し、ＮＫ細胞を、メカブエの不在下または存在下で１：１０００、及び１：１００，０００用量設定にて培養した。上清を培養物から２４時間後に回収し、ＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって測定した（図１０Ａ）。細胞を新鮮な培地に再懸濁した（１×１０６個の細胞／ｍｌ）。ＮＫ細胞を、次に、５１Ｃｒ標識ＯＳＣＳＣに対するエフェクター細胞として使用した。ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定し、溶解単位は、方法及び材料に記載する通りに決定した（図１０Ｂ）。ＮＫ細胞を、末梢血から精製し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で、プロバイオティクス細菌ｓＡＪ２の存在下または不在下で１：２の比率（ＮＫ：ｓＡＪ２）にて１８時間処理した。上清を、後で培養物から回収し、ＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって測定した（図１０Ｃ）。ＮＫ細胞を、次に、５１Ｃｒ標識ＯＳＣＳＣに対するエフェクター細胞として使用した。ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定し、溶解単位は、前記の通りに決定した（図１０Ｄ）。 Ａ～Ｂは、ＡＪ２プロバイオティクス細菌及びメカブエが、ＩＬ２処理ＮＫ細胞においてＩＦＮ－γ分泌を相乗的に誘導できることを示す。精製されたＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理し、ＮＫ細胞を、メカブエを１：１０００，０００用量設定での、ｓＡＪ２を１：０．５の比率（ＮＫ：ｓＡＪ２）での、またはｓＡＪ２及びメカブエの組み合わせの、不在下または存在下で培養した。２４時間後、上清を収集し、ＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって測定した。Ａは、１つの実験を包括するものである）、Ｂは、３つの実験の散布図を示す。 Ａ～Ｂは、膵臓腫瘍における分化のステージが、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性と相関したことを示す。複数の膵臓細胞株上でのＣＤ４４、ＣＤ５４、及びＭＨＣクラスＩの表面発現を、それぞれのＰＥコンジュゲート抗体で染色した後、フローサイトメトリー分析で評価した。アイソタイプ対照抗体を、対照として使用した（図１２Ａ）。新たに単離されたＮＫ細胞を、未処理のままにしたまたは抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）、もしくは抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを５１Ｃｒ標識したＭＰ２、Ｐａｎｃ－１、ＢＸＰＣ３、ＨＰＡＦ、Ｃａｐａｎ及びＰＬ１２に加えた。ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性は、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定し、溶解単位３０／１０６個の細胞は、標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した（図１２Ｂ）。８つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 膵臓におけるＮＫ上清分化ＭＰ２腫瘍の同所移植後のＮＳＧマウスの腫瘍成長、転移の欠如及び長期生存を示す。ＭＰ２腫瘍は、材料及び方法のセクションに記載する通りにＮＫ上清によって分化させた（分化ＭＰ２）。患者由来の分化ＰＬ１２（２×１０６）（ｎ＝３）、ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍（分化ＭＰ２）（５×１０５）（ｎ＝３）、及びＭＰ２腫瘍（３×１０５）（ｎ＝３）を、ＮＳＧマウスの膵臓に移植した。生存率を評価し、膵臓における腫瘍成長及び転移を、安楽死後に評価した。 Ａ～Ｂは、ｒｈＴＮＦ－α及びｒｈＩＦＮ－γの組み合わせが、ＭＰ２細胞の分化及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性を誘導することを示す。ＭＰ２細胞を、未処理のままにしたまたはｒｈＴＮＦ－α（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＦＮ－γ（２００Ｕ／ｍＬ）もしくはｒｈＴＮＦ－α（２０ｎｇ／ｍＬ）及びｒｈＩＦＮ－γ（２００Ｕ／ｍＬ）の組み合わせで２４時間処理した。その後、細胞を剥離し、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＭＨＣクラスＩ及びＢ７Ｈ１の表面発現を、ＰＥコンジュゲート抗体とそれに続くフローサイトメトリー分析を使用して評価した。アイソタイプ対照を、対照として使用した（図１４Ａ）。ＭＰ２及びＣａｐａｎ細胞を、図１４Ａに記載する通りに処理し、組織培養プレートから剥離し、５１Ｃｒで標識し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）処理ＮＫ細胞を使用して標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて使用した。ＮＫ細胞のＩＬ－２（１０００Ｕ／／ｍｌ）を用いた前処理を、１８～２４時間実行した。細胞傷害性率（％）を、異なるエフェクター対標的比にて決定し、溶解単位３０／１０６個の細胞を、腫瘍細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した（図１４Ｂ）。８つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 表Ｓ１；及び表Ｓ２は、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおける骨髄、脾臓、末梢血、膵臓、口腔歯肉の表現型の特徴を示す。Ｈｕ－ＢＬＴマウスは、図１５Ａに図示するならびに材料及び方法のセクションに記載する通りに生成し、ヒト免疫系の再構成を、抗ヒト及び抗マウスＣＤ４５抗体で染色した後、フローサイトメトリー分析を使用して、ＰＢＭＣ、骨髄及び脾細胞で分析した（ｎ＝６／各実験条件）。 ヒトＣＤ４５＋免疫細胞の割合（％）を、それぞれの抗体を用いた染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により、ヒト及びマウスＣＤ４５＋免疫細胞の合計割合（％）内で決定した。 ＰＢＭＣを、材料及び方法のセクションに記載する通りに、ｈｕ－ＢＬＴマウス及びヒトドナーから単離し、ヒトＣＤ４５＋免疫細胞内のＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、及びＣＤ１４の割合（％）を、抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析を使用して決定した（ｎ＝４／各実験条件）。 ＰＢＭＣを、材料及び方法のセクションに記載する通りに、ｈｕ－ＢＬＴマウス、ヒトドナー及びＢ６ＷＴマウスからＰＢＭＣを単離し、ヒトＣＤ４５＋免疫細胞内のＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の割合（％）を、ヒトドナー及びｈｕ－ＢＬＴマウスＰＢＭＣにおいて決定し、マウスＣＤ４５＋免疫細胞とＤＸ５、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８を、抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析を使用してＢ６ＷＴマウスにおいて決定した（ｎ＝４／各実験条件）。表１は、ＣＤ４５＋免疫細胞内の各亜集団の割合（％）を示す（図１５Ｄ及び表１）。 材料及び方法に記載する通りに、ｈｕ－ＢＬＴ ＢＭ及び脾臓からの単一細胞懸濁液を単離し、ヒトＣＤ４５＋免疫細胞内のＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１４、及びＣＤ１１ｂの割合（％）を、抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析を使用して決定した（ｎ＝６／各実験条件）。 Ｈｕ－ＢＬＴ膵臓を回収し、単一細胞懸濁液を、材料及び方法に記載する通りに取得し、膵臓におけるヒトＣＤ４５＋免疫細胞内のＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ５６及びＣＤ１４の割合（％）を、抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析を使用して決定した（ｎ＝６／各実験条件）（図１５Ｆ及び表２）。 ｈｕ－ＢＬＴから口腔歯肉を回収し、単一細胞懸濁液を、材料及び方法のセクションに記載する通りに調製し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で７日間培養した。７日目に、ヒトＣＤ４５＋免疫細胞内のＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ５６の割合（％）を、抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析を使用して決定した（ｎ＝６／各実験条件）。 Ａ～Ｄは、スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓において腫瘍成長を阻害し、免疫細胞を増加させたことを示す。Ｈｕ－ＢＬＴマウスは、材料及び方法に記載する通りに生成し、膵臓に１×１０６個の腫瘍細胞を移植し、１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を、尾静脈を介して注射し（図１６Ａ）、疾患進行をモニターした。６～７週後、マウスを安楽死させ、膵臓内の腫瘍の写真を死後に撮影した（ｎ＝５／各実験条件）（図１６Ｂ）。膵臓細胞を、ＩＬ－２（１×１０６個の細胞／ｍｌ）と３日間培養してから、ＣＤ４５＋ＣＤ３（図１６Ｃ）及びＣＤ４５＋ＣＤ１６（図１６Ｄ）の割合（％）を決定した（ｎ＝３／各実験条件）。 Ａ～Ｃは、スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓において腫瘍成長を阻害し、免疫細胞を増加させたことを示す。Ｈｕ－ＢＬＴマウスは、材料及び方法のセクションに記載する通りに生成した。Ｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓に、１×１０６個の腫瘍細胞を移植し、１～２週後、マウスに１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を、尾静脈注射を介して与え、疾患進行をさらに３～５週間モニターした（ｎ＝６／各実験条件）。ＭＰ２腫瘍は、材料及び方法のセクションに記載する通りに、ＮＫ上清によって分化させた（分化ＭＰ２）。Ｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓に、１×１０６個の分化ＭＰ２腫瘍細胞を移植した（図１７Ａ）。膵臓を死後に回収し、膵臓からのヒトＣＤ４５＋免疫細胞内のＣＤ３細胞の割合（％）を、抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析を使用して決定した（ｎ＝３／各実験条件）（図１７Ｂ）。マウスを屠殺した後に膵臓を回収し、その後膵臓細胞を単離し、細胞をＩＬ－２（１×１０６個の細胞／ｍｌ）と３日間培養してから、ＣＤ４５の割合（％）を決定した（ｎ＝３／各実験条件）（図１７Ｃ）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。Ｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓に１×１０６個の腫瘍細胞を移植し、１～２週後、マウスに、１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を、尾静脈注射を介して与え、疾患進行をさらに３～５週間モニターした。マウスには、腫瘍移植の１～２週前から開始し、その後は実験全体を通して４８時間ごとにＡＪ２（５０億／用量）を与えた（ｎ＝２０）。実験の終了時に、マウスを屠殺し、膵臓／膵臓腫瘍写真を死後に撮影した。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。高度に精製された健康なヒトＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）で１８時間処理した後、上清を収集し、抗ＴＮＦ－α（１：１００）及び抗ＩＦＮ－γ（１：１００）の存在下／不在下で、５日間にわたってＭＰ２腫瘍に加えて、ＮＫ上清媒介性分化を誘導した。Ｈｕ－ＢＬＴマウスに、分化ＭＰ２（１×１０６個）またはＩＮＦ－γ及びＴＮＦ－αに対するモノクローナル抗体で処理した分化ＭＰ２（１×１０６個）を移植し、疾患進行をさらに３～５週間モニターした（ｎ＝６／各実験条件）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａ及び１８Ｂに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射した。実験の終了時に、膵臓／膵臓腫瘍を回収し、腫瘍成長を、７、１１及び１４日目に評価した（各実験条件についてｎ＝９～１２）；７日目に、各ウェルからの付着腫瘍を計数し、各群からの等数の腫瘍を再培養し、各ウェルにおける腫瘍成長を３日ごとに決定した。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、膵臓／膵臓腫瘍を切除し、材料及び方法のセクションに記載する通りに、単一細胞懸濁液を調製し、それらを７日間培養してから培養物の写真を撮影した。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１７Ａ及び１８Ｂに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスに、１×１０６個の未分化ＭＰ２またはＮＫ分化ＭＰ２細胞を同所注射した。未分化ＭＰ２腫瘍移植の１または２週後に、選択したｈｕ－ＢＬＴマウスに１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を、尾静脈注射を介して与えた。この実験の終了時に、膵臓／膵臓腫瘍を回収し、材料及び方法に記載する通りに単一細胞懸濁液を調製した。マウスからの膵臓／膵臓腫瘍細胞を培養し、培養物の写真を７日目に撮影した。４つの代表的な実験のうちの１つを図１８Ｅに示す。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した。実験の終了時に、膵臓／膵臓腫瘍を回収し、腫瘍成長を、７、１１及び１４日目に評価した（各実験条件についてｎ＝１２）；７日目に、各ウェルからの付着腫瘍を計数し、各群から等数の腫瘍を再培養し、各ウェルにおける腫瘍成長を３日ごとに決定した。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。同種異系または自己スーパーチャージドＮＫ細胞の注射を使用して、図Ｓ５Ａに記載する通りに手順を実行した。膵臓腫瘍を切除し、単一細胞懸濁液を調製し、各マウス腫瘍から培養した同一数の腫瘍を使用して、７、１１及び１４日目に腫瘍成長を評価した（各実験条件についてｎ＝９～１２）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａ及び１８Ｂに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射した。実験の終了時に、膵臓／膵臓腫瘍を回収し、腫瘍成長を、７、１１及び１４日目に評価した（各実験条件についてｎ＝９～１２）；７日目に、各ウェルからの付着腫瘍を計数し、各群から等数の腫瘍を再培養し、各ウェルにおける腫瘍成長を３日ごとに決定した。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した。実験の終了時に、膵臓／膵臓腫瘍を回収し、腫瘍成長を、７、１１及び１４日目に評価した（各実験条件についてｎ＝１２）；７日目に、各ウェルからの付着腫瘍を計数し、各群から等数の腫瘍を再培養し、各ウェルにおける腫瘍成長を３日ごとに決定した。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスに腫瘍を移植し、スーパーチャージドＮＫ細胞を注射した。腫瘍を切除し、単一細胞培養物を調製し、７日間培養した後、抗体で染色し、続いてフローサイトメトリー分析を行った後で、腫瘍内のヒトＣＤ４５、ＣＤ９４、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＤＮＡＭの割合（％）を決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスに腫瘍を移植し、スーパーチャージドＮＫ細胞を注射した。腫瘍を切除し、単一細胞培養物を調製し、７日間培養した後、抗体で染色し、続いてフローサイトメトリー分析を行った後で、腫瘍内のヒトＣＤ４５、ＣＤ９４、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＤＮＡＭの割合（％）を決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した。実験の終了時に、腫瘍を切除し、図１８Ｃに記載する通りに、単一細胞培養物を調製し、等数の腫瘍を７日目及び１１日目に培養し、ＩＦＮ－γのレベルを培養物上清にて決定した（各実験条件についてｎ＝２）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の単回注射が、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍の分化に起因して腫瘍成長を阻害したことを示す。この図に示す通りに手順を実行し、疾患進行をモニターした（図１９Ａ）。マウスを屠殺し、膵臓腫瘍を回収して秤量した（ｎ＝４／各実験条件）（図１９Ｂ）。図１９Ａに記載する通りに手順を実行し、マルチプレックスアレイを使用して、マウスの末梢血由来血清中のＩＦＮ－γを決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを示す（図１９Ｃ）。図１９Ａに記載する通りに手順を実行してから、膵臓腫瘍を回収して秤量した。３つの代表的な実験のうちの１つを示す（図１９Ｄ）。図１９Ａに記載する通りに手順を実行した。膵臓を除去し、単一細胞培養物を調製した後、ヒトＣＤ４５＋免疫細胞の割合（％）を決定した（ｎ＝４／各実験条件）（図１９Ｅ）。図１９Ａに記載する通りに手順を実行した。膵臓を除去し、単一細胞培養物を調製し、等数の膵臓細胞を、７日目及び１１日目まで培養し、ＩＦＮ－γ（図１９Ｆ）及びＩＬ－６（図１９Ｇ）のレベルを、培養物上清にて決定した（ｎ＝４／各実験条件）。図１９Ａに記載する通りに手順を実行した。腫瘍を切除し、単一細胞培養物を調製し、ＭＨＣクラスＩ、Ｂ７Ｈ１及びＣＤ５４の表面発現を、１１日間の培養後の腫瘍で決定した（ｎ＝４）（図１９Ｈ）。健康なヒトドナーからのＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で１８時間処理してから、それらを、異なる腫瘍を移植された及び／または様々なエフェクター対標的比にて図１９Ａに記載する通りにＮＫ細胞を注射されたマウスから得た５１Ｃｒ標識腫瘍に加えた。ＮＫ媒介性細胞傷害性は、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。溶解単位（ＬＵ）３０／１０６個の細胞は、腫瘍細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した（ｎ＝３）（図１９Ｉ及び１９Ｊ）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの異なる組織からのＮＫ細胞のＩＦＮ－γ分泌及び／または細胞傷害性機能を回復及び増加させたことを示す。図１９Ａに記載する通りに手順を実行した。屠殺時に、ＰＢＭＣを血液から単離し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で処理してから、それらを、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性アッセイにおいて使用した。ＬＵ３０／１０６は、図１９Ｉに記載する通りに決定した（ｎ＝３／各実験条件）（図２０Ａ）。手順を、図１９Ａに記載する通りに実行してから、ＰＢＭＣを単離し、（１０００Ｕ／ｍＬ）で処理し、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した（ｎ＝４／各実験条件）（図２０Ｂ及び２０Ｃ）。手順を、図１９Ａに記載する通りに実行してから、脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を調製した。脾細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で処理してから、それらを、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性アッセイに使用した。ＬＵ３０／１０６は、図１９Ｉに記載する通りに決定した（ｎ＝４／各実験条件）（図２０Ｄ）。上清を、脾細胞の３日目及び７日目の培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した（ｎ＝５／各実験条件）（図２０Ｅ及び２０Ｆ）。ＮＫ富化細胞を、脾細胞から単離し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）と培養してから、それらを、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性に使用した。ＬＵ３０／１０６は、図１９Ｉに記載する通りに決定した（ｎ＝４／各実験条件）（図２０Ｇ）。上清を、３日目及び７日目のＮＫ富化培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した（ｎ＝６／各実験条件）（図２０Ｈ）。ＣＤ３Ｔ細胞を、脾細胞から単離し、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍＬ）と培養し、３日目及び７日目に上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した（ｎ＝４／各実験条件）（図２０Ｉ）。図１９Ａに記載する通りに手順を実行した。ＢＭ細胞を回収し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で７日間処理してから、それらを、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性に使用した。ＬＵ３０／１０６は、図１９Ｉに記載する通りに決定した（ｎ＝４／各実験条件）（図２０Ｊ）。上清を、ＢＭ培養物の３日目及び７日目に回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した（ｎ＝６／各実験条件）（図２０Ｋ及び２０Ｌ）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。健康なヒトドナー及び膵臓癌患者からのＰＢＭＣ（図２１Ａ）及び精製ＮＫ細胞（図２１Ｂ）を取得し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で１８時間処理してから、それらを、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性に使用した。溶解単位（ＬＵ）３０／１０６個の細胞は、腫瘍細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。健康なヒトドナー及び膵臓癌患者からのＰＢＭＣ（図２１Ａ）及び精製ＮＫ細胞（図２１Ｂ）を取得し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で１８時間処理してから、それらを、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性に使用した。溶解単位（ＬＵ）３０／１０６個の細胞は、腫瘍細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。健康なヒトドナー及び膵臓癌患者からのＰＢＭＣ（図２１Ｃ）及び精製ＮＫ細胞（図２１Ｄ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で１８時間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。健康なヒトドナー及び膵臓癌患者からのＰＢＭＣ（図２１Ｃ）及び精製ＮＫ細胞（図２１Ｄ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で１８時間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスに腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した／給餌しなかった。実験の終了時に、ＰＢＭＣを単離し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴのＰＢＭＣからのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 １８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、図１８Ｂに記載する通りに、ＩＮＦ－γ及びＴＮＦ－αに対するモノクローナル抗体で処理したＮＫ分化ＭＰ２及び分化ＭＰ２を移植した。安楽死後、ＰＢＭＣを単離し、（１０００Ｕ／ｍＬ）で７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴのＰＢＭＣからのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスに腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した／給餌しなかった。実験の終了時に、脾臓を回収し、脾細胞を単離し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴの脾細胞からのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、図１８Ｂに記載する通りに、ＩＮＦ－γ及びＴＮＦ－αに対するモノクローナル抗体で処理したＮＫ分化ＭＰ２及び分化ＭＰ２を移植した。安楽死後、脾臓を回収し、脾細胞を単離し、（１０００Ｕ／ｍＬ）で７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴの脾細胞からのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。ＮＫ富化細胞を、材料及び方法に記載する通りに、脾細胞から単離し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）と７日間培養してから、上清を、３日目及び７日目のＮＫ富化培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴのＮＫ富化細胞からのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝６）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。ＣＤ３Ｔ細胞を、材料及び方法に記載する通りに、脾細胞から単離し、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍＬ）と培養し、３日目及び７日目に、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴからのＣＤ３Ｔ細胞からのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスに腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した／給餌しなかった。実験の終了時に、骨髄細胞を単離し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴの骨髄細胞からのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血、脾臓、ＢＭ、富化ＮＫ細胞及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ分泌を回復及び増加させたことを示す。図１８Ａに記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスにＭＰ２腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射し、図１８Ｂに記載する通りに、ＩＮＦ－γ及びＴＮＦ－αに対するモノクローナル抗体で処理したＮＫ分化ＭＰ２及び分化ＭＰ２を移植した。安楽死後、骨髄細胞を単離し、（１０００Ｕ／ｍＬ）で７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ放出の変化倍数を、腫瘍単独注射ｈｕ－ＢＬＴの骨髄細胞からのＩＦＮ－γの分泌量をベースとして使用して決定した（各実験条件についてｎ＝４）。 Ａ～Ｂは、ＡＪ２給餌を伴う／伴わないスーパーチャージドＮＫ細胞の注射が、口腔腫瘍注射ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血におけるＮＫ細胞のＩＦＮ－γ分泌及び細胞傷害性機能を回復及び増加させたことを示す。Ｈｕ－ＢＬＴマウスに、材料及び方法に記載する通りに、ヒトＯＳＣＳＣを移植し、ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した。屠殺後、末梢血を収集し、ＰＢＭＣを単離し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で７日間処理した。７日目に、細胞傷害性アッセイを、ＯＳＣＳＣに対する標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して行い、ＬＵ３０／１０６個の細胞を、ＯＳＣＳＣ×１００の３０％を溶解するために必要な細胞の逆数を使用して決定した（図２２Ａ）。上清を回収し、ＩＦＮ－γのレベルを、特異的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。マウスの各群からの各組織におけるＩＦＮ－γ分泌の変化倍数は、ＯＳＣＳＣのみを注射されたマウスから得られたものに対して決定した（図２２Ｂ）。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。再構成に成功したｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓に、１×１０６個のヒトＭＰ２細胞を同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、選択したｈｕ－ＢＬＴマウスに、１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を、尾静脈注射を介して与えた。７日後、抗ＰＤ１（５０μｇ／マウス）を、尾静脈注射を介して注射した。実験の終了時に、動物を屠殺し、膵臓を回収し、材料及び方法に記載する通りにマウスの膵臓から単一細胞懸濁液を調製し、７日間培養して、培養物の写真を撮影した。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。新たに解剖した膵臓腫瘍を解離して単一細胞を回収し、細胞を培養中７、１１、１４及び１８日目に計数した。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。マウスからの膵臓細胞を培養し、３、７及び１１日目に、一方で上清を培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。末梢血をｈｕ－ＢＬＴマウスから回収し、材料及び方法に記載する通りに単一細胞懸濁液を取得した。細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、図にて指定する日に、上清を培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。脾臓をｈｕ－ＢＬＴマウスから回収し、材料及び方法に記載する通りに単一細胞懸濁液を取得した。細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、図にて指定する日に、上清を培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。骨髄をｈｕ－ＢＬＴマウスから回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得した。細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、図にて指定する日に、上清を培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から単離されたＮＫ富化細胞（図２３Ｇ）及びＣＤ３＋Ｔ細胞（図２３Ｈ）を、ＩＬ－２（それぞれ、１０００Ｕ／ｍｌ及び１００Ｕ／ｍｌ）で処理し、図にて指定する日に、上清を培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。２つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 スーパーチャージドＮＫ細胞と抗ＰＤ１抗体注射の組み合わせが、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて、ＰＢＭＣ、脾細胞及び骨髄由来免疫細胞によるＩＦＮ－γ分泌を実質的に増加させ、低分化ＭＰ２腫瘍の成長を停止させたことを示す。ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から単離されたＮＫ富化細胞（図２３Ｇ）及びＣＤ３＋Ｔ細胞（図２３Ｈ）を、ＩＬ－２（それぞれ、１０００Ｕ／ｍｌ及び１００Ｕ／ｍｌ）で処理し、図にて指定する日に、上清を培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。２つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 高分化ＰＬ１２及びＣａｐａｎにおけるＮＡＣによる細胞死の誘導の増加を示し、低分化幹様ＭＰ２ではより少ないことを示す；パクリタキセル媒介性細胞死への効果。ＭＰ２、ＰＬ１２及びＣａｐａｎ細胞を、ＮＡＣ（２０ｎＭ）を用いてまたは用いずに２４時間処理した後、パクリタキセル（２００及び６００ｎＭ）で１８～２４時間処理した。全ての試料は、同数の細胞（１００，０００個／２４ウェルプレートのウェル）から開始して、異なる処理方法で処理した。その後、未処理及び処理されたＭＰ２、ＰＬ１２及びＣａｐａｎ細胞の生存能を、ヨウ化プロピジウムを使用して決定し、フローサイトメトリーで分析した。５つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 Ａ～Ｂは、パクリタキセルが、ＮＡＣを用いて及び用いずに処理された患者由来の分化ＰＬ１２及びＣａｐａｎならびにＮＫ分化ＭＰ２腫瘍において有意な細胞死を誘導したことを示す。ＭＰ２、ＰＬ１２及びＣａｐａｎ腫瘍（１×１０５個の腫瘍／ウェル）を、パクリタキセルを用いてまたは用いずに１８～２０時間処理してから、細胞の生存能を、ヨウ化プロピジウム染色を使用して決定した。＜０．０５のＰ値が、１０ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ、１０００ｎＭ及び１０μｇのパクリタキセルの濃度にて、ＭＰ２対ＰＬ１２及びＣａｐａｎ間の差に関して得られた（ｎ＝２／各実験条件）（図２５Ａ）。ＭＰ２腫瘍を、材料及び方法に記載する通りに、抗ＩＦＮ－γ及び抗ＴＮＦ－αの存在下及び不在下で５日間にわたってＮＫ上清で分化させてから、それらを洗浄し、ＮＡＣ（２０ｎＭ）を用いて／用いずに２４時間処理した後、１０ｎＭ～６００ｎＭ範囲にて１８～２４時間パクリタキセル処理した。細胞の生存能を、ヨウ化プロピジウムで染色することによって決定した（ｎ＝３／各実験条件）（図２５Ｂ）。 Ａ～Ｄは、ＮＫ細胞を注射したまたはＮＫ分化ＭＰ２腫瘍のみを移植した担腫瘍マウスからの単球または破骨細胞が、腫瘍のみを移植したマウスのものと比較した場合、ＮＫ細胞からのＩＦＮ－γを有意に多く誘発したことを示している。Ｈｕ－ＢＬＴマウスに、図１６Ａに記載する通りに、腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射してから、マウスを安楽死させた後、脾臓及びＢＭを回収し、単一細胞懸濁液を調製した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を脾細胞から正に選択し、単球をＢＭ細胞から精製し、（ＮＫ：単球；２：１比率）にて共培養し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）単独またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせて７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＩＦＮ－γ分泌を、培養にて１×１０６個のＮＫ細胞に基づいて調整した（図２６Ａ）。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。ＯＣは、材料及び方法のセクションに記載する通りに、ｈｕ－ＢＬＴ単球から生成した。健康なヒトドナーから精製した同種異系ＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）で１８時間前処理し、次に単独またはｈｕ－ＢＬＴ－ＯＣとｓＡＪ２の存在下（ＮＫ：ＯＣ：ｓＡＪ２；２：１：４）で培養し、拡大するＮＫ細胞の数を、６、９、１２及び１５日目に計数した。培養の各日に、各群から等数のＮＫ細胞を培養し、それらの細胞成長を決定した（図２６Ｂ）。培養の１５日目に、細胞を計数し、等数のＮＫ細胞を、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性に使用した。図１９Ｉに記載する通りに、ＬＵ３０／１０６個の細胞を決定した（図２６Ｃ）。図２６Ｃに記載する、ｓＡＪ２の存在下でのＮＫ及びＯＣ培養物からの上清を、６、９、１２及び１５日目に回収し、ＩＦＮ－γのレベルを、ＥＬＩＳＡを使用して決定した（図２６Ｄ）。２つの代表的な実験のうちの１つを示す。 ｈｕ－ＢＬＴによって拡大されたＨｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞及びヒト由来破骨細胞が、同等するレベルのＩＦＮ－γを分泌し、そのレベルが、細胞１個あたりで、自己破骨細胞によって拡大したヒトドナーからのＮＫ細胞によって分泌されたものと類似していたことを示す。材料及び方法に記載する通りに、Ｈｕ－ＢＬＴマウスに腫瘍を移植し、ＮＫ細胞を注射してから、マウスを安楽死させた後、脾臓及びＢＭを回収し、単一細胞懸濁液を調製した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を脾細胞から正に選択し、単球をＢＭ細胞から精製し、（ＮＫ：単球；２：１比率）にて共培養し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）単独またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせて７日間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。 ｈｕ－ＢＬＴによって拡大されたＨｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞及びヒト由来破骨細胞が、同等するレベルのＩＦＮ－γを分泌し、そのレベルが、細胞１個あたりで、自己破骨細胞によって拡大したヒトドナーからのＮＫ細胞によって分泌されたものと類似していたことを示す。ＯＣを、材料及び方法のセクションに記載する通りに、健康なヒトドナー及び膵臓癌患者の末梢血由来単球から生成し、健康なヒトＮＫ細胞とｓＡＪ２の存在下で培養し、ＮＫ細胞の数を、６、９、１２、１５、１８及び２２日目に計数した。培養の各日に、各群から等数のＮＫ細胞を培養し、細胞成長を決定した。 ｈｕ－ＢＬＴによって拡大されたＨｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞及びヒト由来破骨細胞が、同等するレベルのＩＦＮ－γを分泌し、そのレベルが、細胞１個あたりで、自己破骨細胞によって拡大したヒトドナーからのＮＫ細胞によって分泌されたものと類似していたことを示す。ＯＣを、材料及び方法のセクションに記載する通りに、健康なヒトドナー及び膵臓癌患者の末梢血由来単球から生成し、健康なヒトＮＫ細胞とｓＡＪ２の存在下で培養し、ＮＫ細胞の数を、６、９、１２、１５、１８及び２２日目に計数した。培養の各日に、各群から等数のＮＫ細胞を培養した。培養の１５日目に、ＮＫ細胞を計数し、等数のＮＫ細胞を、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用してＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性に使用した。ＬＵ３０／１０６個の細胞を決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 ｈｕ－ＢＬＴによって拡大されたＨｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞及びヒト由来破骨細胞が、同等するレベルのＩＦＮ－γを分泌し、そのレベルが、細胞１個あたりで、自己破骨細胞によって拡大したヒトドナーからのＮＫ細胞によって分泌されたものと類似していたことを示す。ＯＣを、材料及び方法のセクションに記載する通りに、健康なヒトドナー及び膵臓癌患者の末梢血由来単球から生成し、健康なヒトＮＫ細胞とｓＡＪ２の存在下で培養し、ＮＫ細胞の数を、６、９、１２、１５、１８及び２２日目に計数した。培養の各日に、各群から等数のＮＫ細胞を培養した。培養物からの上清を、６、９、１２、１５、１８及び２２日目に回収し、ＩＦＮ－γのレベルを、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 ｈｕ－ＢＬＴによって拡大されたＨｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞及びヒト由来破骨細胞が、同等するレベルのＩＦＮ－γを分泌し、そのレベルが、細胞１個あたりで、自己破骨細胞によって拡大したヒトドナーからのＮＫ細胞によって分泌されたものと類似していたことを示す。健康なドナー及び膵臓癌患者のＯＣ上でのＭＨＣクラスＩ、ＣＤ５４、ＫＩＲ２、ＫＩＲ３、ＫＬＲＧ１及びＭＩＣＡ／Ｂの表面発現を、抗体染色を使用して決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 Ａ～Ｃは、健康なドナーＴ細胞と比較して、がん患者ＮＫ及びＴ細胞によって分泌される同一量のＩＦＮ－γが、口腔癌幹様腫瘍においてより低いレベルの分化を誘導することを示す。ＩＬ－２（１０００ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８時間処理した健康なドナー及び膵臓患者のＮＫ細胞からの等量のＩＦＮ－γを含有する上清を、ＯＳＣＳＣに４日間加えて、分化を誘導した。その後、ＭＨＣクラスＩ、Ｂ７Ｈ１及びＣＤ５４の発現を、ＯＳＣＳＣの表面上で決定した（図２８Ａ）。健康なヒトドナーからの同種異系ＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で１８～２４時間処理してから、それらを、未処理ならびに、生成された、健康及び患者ＮＫ上清分化ＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性において使用した。腫瘍を、５１Ｃｒ標識し、細胞傷害性アッセイにおいて使用し、ＬＵ３０／１０６個の細胞を、ＯＳＣＳＣ×１００の３０％を溶解するために必要な細胞の逆数を使用して決定した（図２８Ｂ）。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。健康なドナー及びがん患者からの高度に精製されたＴ細胞を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）で１８時間処理してから、上清を回収し、ＯＳＣＳＣ培養物に４日間加えた。その後、未処理ＯＳＣＳＣ及び図に示す異なるＴ細胞上清で処理したものを、組織培養プレートから剥離し、１×ＰＢＳで広範囲に洗浄し、５１Ｃｒで標識した。健康なヒトドナー細胞から新たに単離された同種異系ＮＫを、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）で２４時間処理してから、細胞を、Ｔ細胞上清で処理したＯＳＣＳＣに対する５１Ｃｒ放出アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した（図２８Ｃ）。２つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 Ｈｕ－ＢＬＴ単球から生成された破骨細胞が、Ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から単離されたＮＫ細胞において拡大を誘導し、サイトカイン分泌を増加させたことを示す。破骨細胞（ＯＣ）は、材料及び方法のセクションに記載する通りに、ヒト末梢血単離単球から生成した。健康なヒトドナーから精製した同種異系ＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）で１８時間前処理し、次に単独またはヒトＯＣと、ｓＡＪ２の存在下（ＮＫ：ＯＣ：ｓＡＪ２；２：１：４）で培養し、拡大するＮＫ細胞の数を、６、１０、１４、１８及び２２日目に計数した。培養の各日に、各群から等数のＮＫ細胞を培養し、細胞成長を決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 Ｈｕ－ＢＬＴ単球から生成された破骨細胞が、Ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から単離されたＮＫ細胞において拡大を誘導し、サイトカイン分泌を増加させたことを示す。ＯＣを、材料及び方法のセクションに記載する通りに、ｈｕ－ＢＬＴ骨髄単球及びヒト末梢血単球から生成した。ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から精製したＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）で１８時間前処理し、次に単独またはｈｕ－ＢＬＴ－ＯＣもしくはヒトＯＣとｓＡＪ２の存在下（ＮＫ：ＯＣ：ｓＡＪ２；２：１：４）で培養し、拡大するＮＫ細胞の数を、６、１０、１４、１８及び２２目に計数した。培養の各日に、各群から等数のＮＫ細胞を培養し、細胞成長を決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを、図に示す。 Ｈｕ－ＢＬＴ単球から生成された破骨細胞が、Ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から単離されたＮＫ細胞において拡大を誘導し、サイトカイン分泌を増加させたことを示す。図２９Ａに記載するように、ｓＡＪ２の存在下でのＮＫ細胞及びＯＣ培養物からの上清を、６、１０、１４、１８及び２２日目に回収し、ＩＦＮ－γのレベルを、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 Ｈｕ－ＢＬＴ単球から生成された破骨細胞が、Ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から単離されたＮＫ細胞において拡大を誘導し、サイトカイン分泌を増加させたことを示す。ｓＡＪ２の存在下でのＮＫ細胞及びＯＣ培養物からの上清を、６、１０、１４、１８及び２２日目に回収し、ＩＦＮ－γのレベルを、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 Ｈｕ－ＢＬＴ単球から生成された破骨細胞が、Ｈｕ－ＢＬＴ脾細胞から単離されたＮＫ細胞において拡大を誘導し、サイトカイン分泌を増加させたことを示す。図２９Ｃ及び２９ＤにおけるＩＦＮ－γ分泌を、１×１０６個のＮＫ細胞（培養物における図２９Ａ及び２９ＢでのＮＫ細胞数）に基づいて調整した。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 がん患者の末梢血から得られたＰＢＭＣの数の低減及びＮＫ細胞の機能喪失を示す。ヒトＰＢＭＣを、健康な個体（ｎ＝１４）及びがん患者（ｎ＝１４）の末梢血（３０ｍｌ）から単離し、細胞の数を、顕微鏡を使用して決定した。 がん患者の末梢血から得られたＰＢＭＣの数の低減及びＮＫ細胞の機能喪失を示す。ヒトＰＢＭＣを、健康な個体（ｎ＝９～１２）及びがん患者（ｎ＝９～１２）の末梢血から単離し、等数（２×１０５個の細胞）のＰＢＭＣを使用して、ＣＤ４５＋免疫細内のＣＤ１６（ｎ＝１２）、ＣＤ５６（ｎ＝１２）、ＣＤ３（ｎ＝１２）、ＣＤ１９（ｎ＝９）、ＣＤ１４（ｎ＝１０）及びＣＤ１１ｂ（ｎ＝９）サブセットの割合（％）を、フローサイトメトリー分析を使用して決定した。 がん患者の末梢血から得られたＰＢＭＣの数の低減及びＮＫ細胞の機能喪失を示す。ヒトＮＫ細胞を、材料及び方法に記載する通りに、健康な個体（ｎ＝９）及びがん患者（ｎ＝９）のＰＢＭＣから単離した。精製されたＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を未処理のままにした及びＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理してから、上清を回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 がん患者の末梢血から得られたＰＢＭＣの数の低減及びＮＫ細胞の機能喪失を示す。図３０Ｃに記載する通りにＮＫ細胞を単離及び処理し、５１Ｃｒ標識口腔扁平上皮細胞癌幹細胞（ＯＳＣＳＣ）に、様々なエフェクター対標的比にて加えた。ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性は、口腔扁平上皮細胞癌幹細胞株（ＯＳＣＳＣ）に対する標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用する。溶解単位３０／１０６個の細胞は、ＯＳＣＳＣ×１００の３０％を溶解するために必要なリンパ球の逆数を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝９）。 がん患者の末梢血から得られたＰＢＭＣの数の低減及びＮＫ細胞の機能喪失を示す。個体（ｎ＝４）及びがん患者（ｎ＝４）のＰＢＭＣから単離された高度に精製されたＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理して（１×１０６個の細胞／ｍｌ）から、上清を回収し、マルチプレックスサイトカインアレイキットを用いて実行して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－５及びＩＬ－４分泌を決定した。 がん患者の血清中のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子分泌の低減を示す。健康なドナー（ｎ＝５）またはがん患者（ｎ＝８）の末梢血から血清を取得し、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子のレベルについてマルチプレックスアレイキットを使用して分析した。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝７０）及びがん患者（ｎ＝７０）からの精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、健康な個体の単球から生成されたＯＣとｓＡＪ２の存在下で、１：２：４の比率（ＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）にて培養した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、拡大したリンパ球の数を、顕微鏡を使用して決定した。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝１６）及びがん患者（ｎ＝１６）からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。１５日目の培養したＮＫ細胞の細胞傷害性を、ＯＳＣＳＣに対して標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３０Ｄに記載する方法を使用して決定した。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝６３）及びがん患者（ｎ＝６３）からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養し、上清を６、９、１２及び１５日目の共培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝２１）及びがん患者（ｎ＝２１）からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、拡大したＮＫ細胞の数を、顕微鏡を使用して計数し、上清を回収して、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。ＩＦＮ－γ分泌は、１００万個の細胞数あたりに基づいて評価した。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝７０及びがん患者（ｎ＝７）からの精製Ｔ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、ＯＣとｓＡＪ２の存在下で１：２：４の比率（ＯＣ：Ｔ：ｓＡＪ２）にて共培養した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、リンパ球を、顕微鏡を使用して手動で計数し、０日目から１５日目までのリンパ球の累積細胞数を図３２Ｅに示す。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝４２）及びがん患者（ｎ＝４２）からの精製されたＴ細胞を、図３２Ｅに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。上清を、６、９、１２及び１５日目の共培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝２８）及びがん患者（ｎ＝２８）からの精製Ｔ細胞を、図３２Ｅに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、リンパ球を、顕微鏡を使用して手動で計数し、上清を共培養物から回収して、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、１００万個のリンパ球数あたりに正規化した。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝１０）からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。健康な個体（ｎ＝１０）からの精製Ｔ細胞を、図３２Ｅに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、リンパ球を、顕微鏡を使用して手動で計数し、０日目から１５日目までのリンパ球の累積細胞数を、図に示す。 がん患者からの破骨細胞調節ＮＫ細胞が、健康な個体と比較して、拡大する、または細胞傷害性を媒介する及びＩＦＮ－γを分泌する能力がはるかに低いことを示す。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞（ＯＣ）を生成した。健康な個体（ｎ＝１０）からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。健康な個体（ｎ＝１０）からの精製Ｔ細胞を、図３２Ｅに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。上清を、共培養の６、９、１２及び１５日目に回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、０日目から１５日目までのリンパ球による累積ＩＦＮ－γ分泌を図に示す。 Ａ～Ｃは、破骨細胞で拡大した患者のＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の、異なる拡大日数において健康な個体のＮＫ細胞から得られたものと比較した場合の、有意な継続的低減を示す。健康な個体（ｎ＝８）及びがん患者（ｎ＝８）からの精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、ｓＡＪ２で、１：２の比率（ＮＫ：ｓＡＪ２）にて処理した。上清を、６、９、１２及び１５日目の共培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した（図３３Ａ）。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝８）及びがん患者（ｎ＝８）からの精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、ｓＡＪ２及びＯＣと、１：２：４の比率（ＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）にて共培養した。上清を、６、９、１２及び１５日目の共培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した（図３３Ｂ）。健康な個体及びがん患者からの精製ＮＫ細胞を、図３３Ｂに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。ＩＦＮ－γ分泌は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、共培養の２１日目に決定した。３つの代表的な実験のうちの１つを図に示す（図３３Ｃ）。 異なる拡大日数において健康な個体のＴ細胞からのＴ細胞と比較した場合の、初代の、非破骨細胞で拡大した及び破骨細胞で拡大した患者のＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の有意な低減を示す。単球を、ヒトＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝４）及びがん患者（ｎ＝４）からの正に選択されたＴ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、ｓＡＪ２で、ＯＣの不在下または存在下で１：２：４の比率（ＯＣ：Ｔ：ｓＡＪ２）にて処理した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、拡大したＴ細胞の数を、顕微鏡を使用して計数し、０日目から１５日目までのリンパ球の累積細胞数を図に示す。 異なる拡大日数において健康な個体のＴ細胞からのＴ細胞と比較した場合の、初代の、非破骨細胞で拡大した及び破骨細胞で拡大した患者のＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の有意な低減を示す。単球を、ヒトＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝４）及びがん患者（ｎ＝４）からの精製Ｔ細胞を、図３４Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。上清を、共培養の６、９、１２及び１５日目に回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、０日目から１５日目までのリンパ球による累積ＩＦＮ－γ分泌を図に示す。 異なる拡大日数において健康な個体のＴ細胞からのＴ細胞と比較した場合の、初代の、非破骨細胞で拡大した及び破骨細胞で拡大した患者のＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の有意な低減を示す。単球を、ヒトＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝１５）及びがん患者（ｎ＝１５）からの精製Ｔ細胞を、図３４Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。上清を、共培養の６、９、１２及び１５日目に回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、０日目から１５日目までのリンパ球による累積ＩＦＮ－γ分泌を、０日目から１５日目までのリンパ球の累積細胞数の１００万個の細胞数に基づいて評価した。 異なる拡大日数において健康な個体のＴ細胞からのＴ細胞と比較した場合の、初代の、非破骨細胞で拡大した及び破骨細胞で拡大した患者のＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の有意な低減を示す。単球を、ヒトＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝４）及びがん患者（ｎ＝４）からの精製Ｔ細胞を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、ｓＡＪ２で１：２の比率（Ｔ：ｓＡＪ２）にて処理した。上清を、６、９、１２及び１５日目の共培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 異なる拡大日数において健康な個体のＴ細胞からのＴ細胞と比較した場合の、初代の、非破骨細胞で拡大した及び破骨細胞で拡大した患者のＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の有意な低減を示す。単球を、ヒトＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝４）及びがん患者（ｎ＝４）からの精製Ｔ細胞を、図３４Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。上清を、６、９、１２及び１５日目の共培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した。 異なる拡大日数において健康な個体のＴ細胞からのＴ細胞と比較した場合の、初代の、非破骨細胞で拡大した及び破骨細胞で拡大した患者のＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の有意な低減を示す。単球を、ヒトＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝３）及びがん患者（ｎ＝３）からの精製Ｔ細胞を、図３４Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。ＩＦＮ－γ分泌は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、共培養の２１日目に決定した。 異なる拡大日数において健康な個体のＴ細胞からのＴ細胞と比較した場合の、初代の、非破骨細胞で拡大した及び破骨細胞で拡大した患者のＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の有意な低減を示す。単球を、ヒトＰＢＭＣから精製し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養して、破骨細胞を生成した。健康な個体（ｎ＝４）からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３３Ａ及び３３Ｂに記載する通りに、処理し、ＯＣを用いて及び用いずに共培養した。健康な個体（ｎ＝４）から正に選択されたＴ細胞を、図３４Ａ及び３４Ｄに記載する通りに、処理し、ＯＣを用いて及び用いずに培養した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、リンパ球を、顕微鏡を使用して手動で計数し、０日目から１５日目までのリンパ球の累積細胞数を、図に示す。 Ａ～Ｅは、健康な個体のＰＢＭＣと比較して、がん患者のＰＢＭＣ内で決定した場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（％）が低減し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）が増加することを示す。健康な個体（ｎ＝１２）及びがん患者（ｎ＝１２）ＰＢＭＣから新たに単離されたＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、及びＣＤ１２７の表面発現についてフローサイトメトリーを使用して分析した。ＩｇＧ２アイソタイプを、対照として使用した（図３５Ａ）。ヒトＰＢＭＣを、健康な個体（ｎ＝１２）及びがん患者（ｎ＝１２）の末梢血から単離し、ＣＤ４及びＣＤ８の表面発現を、ＣＤ３＋免疫細胞内でフローサイトメトリーを使用して分析した（図３５Ｂ）。ヒトＰＢＭＣを、健康な個体（ｎ＝１２）及びがん患者（ｎ＝１２）の末梢血から単離し、ＣＤ４及びＣＤ８の表面発現を、ＣＤ３＋免疫細胞内でフローサイトメトリーを使用して分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と比較し、比率を図に示す（図３５Ｃ）。健康な個体（ｎ＝２８）及びがん患者（ｎ＝２８）からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。健康な個体（ｎ＝２８）及びがん患者（ｎ＝２８）からの精製Ｔ細胞を、図３２Ｅに記載する通りに、処理し、ＯＣと培養した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、ＣＤ４及びＣＤ８の表面発現を、ＣＤ３＋免疫細胞内でフローサイトメトリーを使用して分析し（図３５Ｄ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と比較し、比率を図に示す（図３５Ｅ）。 破骨細胞調節ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞調節ＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。拡大のために、健康な個体からの精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、自己ＤＣまたはＯＣと、ｓＡＪ２の存在下で１：２：４の比率（ＤＣまたはＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）にて共培養した。拡大したリンパ球の数は、８、１１、１５及び１８日目に、顕微鏡測定を使用して評価した（各実験条件についてｎ＝３０）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図３８Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、ＣＤ３、ＣＤ１６、及びＣＤ５６の表面発現を、８、１１、１５及び１８日目に分析した。ＮＫ細胞（図３６Ｂ）及びＴ細胞（図３６Ｃ）細胞の数を、それぞれの図３６Ａの合計拡大細胞内でのＣＤ１６＋及びＣＤ３＋表面発現の割合（％）を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３０）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図３８Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、ＣＤ３、ＣＤ１６、及びＣＤ５６の表面発現を、８、１１、１５及び１８日目に分析した。ＮＫ細胞（図３６Ｂ）及びＴ細胞（図３６Ｃ）細胞の数を、それぞれの図３６Ａの合計拡大細胞内でのＣＤ１６＋及びＣＤ３＋表面発現の割合（％）を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３０）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図３８Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、細胞傷害性を、１５日目に、ＯＳＣＳＣに対する標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３０Ｄに記載する方法を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝１２）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図３８Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、ＣＤ１６の表面発現を１５日目。図３６ＤからのＬＵを使用して、ＮＫ細胞の１％に基づくＬＵを評価した（各実験条件についてｎ＝１２）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図３８Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、上清を共培養の８、１１、１５及び１８日目に回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝１２）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図５Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（図３６Ｇ）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（図３６Ｈ）細胞の数を、図に示す日の、それぞれの合計拡大細胞内でのＣＤ３＋細胞内のＣＤ４＋及びＣＤ８＋の表面発現割合（％）を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝１２）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図５Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（図３６Ｇ）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（図３６Ｈ）細胞の数を、図に示す日の、それぞれの合計拡大細胞内でのＣＤ３＋細胞内のＣＤ４＋及びＣＤ８＋の表面発現割合（％）を使用して決定した（各実験条件についてｎ＝１２）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図３８Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養し、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の表面発現を、８、１１、１５及び１８日目に分析し、ＣＤ４及びＣＤ８の割合（％）を図に示す（各実験条件についてｎ＝１２）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。単球を、健康な個体のＰＢＭＣから精製し、ＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）と８日間培養して、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するために、単球を、図３２Ａに記載する通りに培養した。ＮＫ細胞を、図３８Ａに記載する通りに、ＯＣまたはＤＣと共培養した。ＣＤ４、ＣＤ８、ＫＬＲＧ１、ＴＩＭ３、及びＰＤ－１の表面発現を、ＣＤ３＋細胞内で、共培養の２７日目に分析した（各実験条件についてｎ＝８）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。ＤＣ及びＯＣを、図３８Ａに記載する通りに生成した。健康な個体からの精製Ｔ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、自己ＤＣまたはＯＣと、ｓＡＪ２の存在下で１：２：４の比率（ＤＣまたはＯＣ：Ｔ：ｓＡＪ２）にて共培養した。ＣＤ４、ＣＤ８、ＫＬＲＧ１、ＴＩＭ３及びＰＤ－１の表面発現を、ＣＤ３＋細胞内で、共培養の２７日目に分析した（各実験条件についてｎ＝８）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。図３８Ａに記載する通りに、ＤＣ及びＯＣを生成し、ＮＫ細胞をＯＣまたはＤＣと共培養し、Ｔ細胞を処理し、ＯＣまたはＤＣと共培養した。ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＣＲ７及びＣＤ１２７の表面発現を、ＣＤ３＋細胞内で、共培養の１２日目に分析した（各実験条件についてｎ＝８）。 破骨細胞で調節したＮＫ細胞が、ＮＫ細胞拡大を促進するのに対し、樹状細胞で調節したＮＫ細胞は、Ｔ細胞拡大を促進することを示す；ＯＣ拡大ＮＫ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害性機能を呈する。図３８Ａに記載する通りに、ＤＣ及びＯＣを生成し、ＮＫ細胞をＯＣまたはＤＣと共培養し、Ｔ細胞を処理し、ＯＣまたはＤＣと共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌの表面発現を、共培養の１２日目に分析した（各実験条件についてｎ＝８）。 破骨細胞拡大ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞によって調節されたまたはＯＣを用いて単独で拡大した、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図Ｓ２Ｂに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。培養１２日目に、ＮＫ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、各細胞型に対する特異的な単離キットを使用して単離した。単離されたＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組合せで処理し、各Ｔ細胞サブタイプを、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８時間処理してから、上清を回収し、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子のレベルについてマルチプレックスアレイキットを使用して分析した。各細胞型からの分泌のレベルは、１００万個の細胞数に基づいて調整し、ＮＫ細胞の分泌レベルからのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌レベルの増加倍数を図に示す。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 破骨細胞拡大ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞によって調節されたまたはＯＣを用いて単独で拡大した、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図Ｓ２Ｂに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。培養１２日目に、ＮＫ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、各細胞型に対する特異的な単離キットを使用して単離した。単離されたＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組合せで処理し、各Ｔ細胞サブタイプを、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８時間処理してから、上清を回収し、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子のレベルについてマルチプレックスアレイキットを使用して分析した。各細胞型からの分泌のレベルは、１００万個の細胞数に基づいて調整し、ＮＫ細胞の分泌レベルからのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌レベルの増加倍数を図に示す。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 破骨細胞拡大ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞によって調節されたまたはＯＣを用いて単独で拡大した、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ｂに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。健康なドナーからの新たに精製されたＴ細胞を、図３４Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。培養の６日後、上清を回収し、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子のレベルについてマルチプレックスアレイキットを使用して分析し、ＮＫ細胞の分泌レベルからのＴ細胞の分泌レベルの増加倍数を図に示す。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 破骨細胞拡大ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞によって調節されたまたはＯＣを用いて単独で拡大した、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌することを示す。図３７Ｃ及び３７Ｅにおける分泌のレベルを、１００万個の細胞数に基づいて調整し、ＮＫ細胞の分泌レベルからのＴ細胞の分泌レベルの増加倍数を図に示す。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 破骨細胞拡大ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞によって調節されたまたはＯＣを用いて単独で拡大した、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３２Ｂに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。健康なドナーからの新たに精製されたＴ細胞を、図３４Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。培養の６日後、上清を回収し、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子のレベルについてマルチプレックスアレイキットを使用して分析し、ＮＫ細胞の分泌レベルからのＴ細胞の分泌レベルの増加倍数を図に示す。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 破骨細胞拡大ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞によって調節されたまたはＯＣを用いて単独で拡大した、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌することを示す。図３７Ｃ及び３７Ｅにおける分泌のレベルを、１００万個の細胞数に基づいて調整し、ＮＫ細胞の分泌レベルからのＴ細胞の分泌レベルの増加倍数を図に示す。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 破骨細胞拡大ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞によって調節されたまたはＯＣを用いて単独で拡大した、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図３３Ｂに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養し、培養の１２日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、単離キットを使用して単離し、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８時間処理した（培養Ａ）。別の培養では、健康な個体のＰＢＭＣから精製された新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８時間処理してから、それらを、ＯＣと培養した（１：２：４；ＯＣ：Ｔ：ｓＡＪ２）。培養１２日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、単離キットを使用して培養物から単離し、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８時間処理した（培養Ｂ）。上清を、培養Ａ及び培養Ｂの両方、ＣＤ８＋Ｔ細胞培養物から同時に回収し、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子のレベルについてマルチプレックスアレイキットを使用して分析し、ＯＣと培養したＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌レベルからの、ＯＣ拡大ＮＫ細胞から選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌レベルの増加倍数を、図に示す。３つの代表的な実験のうちの１つを示す。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。疾患進行及びマウスの体重減少を、さらに３～４週間モニターした（ｎ＝３）。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。ＣＤ３及びＣＤ８の表面発現を、ＢＭ培養の７日目に分析した（各実験条件についてｎ＝３）。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。上清を、ＢＭ培養の７日目の培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３）。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。７日間のＢＭ培養のＯＳＣＳＣに対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、ＯＳＣＳＣに対する標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３）。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３０Ｄに記載する方法を使用して決定した。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。ＣＤ３及びＣＤ８の表面発現を、脾臓培養の７日目に分析した（各実験条件についてｎ＝３）。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。上清を、脾臓培養の７日目の培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３）。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。７日間の脾臓培養のＯＳＣＳＣに対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、ＯＳＣＳＣに対する標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝３）。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３０Ｄに記載する方法を使用して決定した。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。ＣＤ３及びＣＤ８の表面発現を、ＰＢＭＣ培養の７日目に分析した（各実験条件についてｎ＝２）。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。上清を、ＰＢＭＣ培養の７日目の培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝２）。 担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、ＢＭ、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、ＩＦＮ－γ分泌の増加をもたらし、これらの組織区画におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を上昇させたことを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。腫瘍移植の１～２週後、マウスに、１２日目のＯＣ拡大ヒトＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。実験の終了時に、ｈｕ－ＢＬＴマウスを屠殺し、脾臓、ＢＭ及び末梢血を回収し、材料及び方法に記載する通りに、単一細胞懸濁液を取得し、各組織から取得した細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、７日間培養した。７日間のＰＢＭＣ培養のＯＳＣＳＣに対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、ＯＳＣＳＣに対する標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した（各実験条件についてｎ＝２）。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３０Ｄに記載する方法を使用して決定した。 Ａ～Ｅは、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＯＣ拡大ＮＫ細胞を用いた免疫療法が、血清中のサイトカイン分泌を増加させたことを示す。再構成されたｈｕ－ＢＬＴ（健康なドナーと同等なＴ細胞のレベル及び系統）に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを、口腔底に同所注射した。１～２週後、ｈｕ－ＢＬＴマウスに１．５×１０６個のＯＣ拡大ヒトスーパーチャージドＮＫ細胞を静脈内注射し、ＮＫ細胞を図３３Ｂに記載の通りに、処理し、ＯＣと共培養し、１２日目の拡大ＮＫ細胞をマウス注射に使用した。疾患進行及び体重減少を、さらに３～４週間モニターし、その後マウスを屠殺し、末梢血を、心臓穿刺により死後ヘパリンを含まないバイアルに収集し、血清試料を回収し、ＩＦＮ－γ（図３９Ａ）、ＩＬ－６（図３９Ｂ）、ＩＴＡＣ（図３９Ｃ）、ＩＬ－８（図３９Ｄ）及びＧＭ－ＣＳＦ（図３９Ｅ）分泌についてマルチプレックスアレイを使用して分析した（図３９Ａ～３９Ｅ）。３つの代表的な実験のうちの１つを図３９に示す。 ＯＣと培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が徐々に増加するのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実質的に低減し、ＯＣがＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を優先的に支持することを示す。健康な個体から新たに精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／ＣＤ２８ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、それらを、ｓＡＪ２と共培養した（Ｔ：ｓＡＪ２；１：２）。６、１２、１５及び１９日間の共培養後、リンパ球を、顕微鏡を使用して手動で計数し、各時点の拡大倍数を図示する通りに示す（各実験条件についてｎ＝６）。 ＯＣと培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が徐々に増加するのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実質的に低減し、ＯＣがＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を優先的に支持することを示す。健康な個体からの精製ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、図６Ａに記載する通りに１８時間処理してから、それらを、ＯＣと、ｓＡＪ２の存在下で１：２：４の比率（ＯＣ：ＣＤ４ＴまたはＣＤ８Ｔ：ｓＡＪ２）にて共培養した。６、１２、１５及び１９日間の共培養後、リンパ球を、顕微鏡を使用して手動で計数し、各時点の拡大倍数を図示する通りに示す（各実験条件についてｎ＝６）。 ＯＣと培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が徐々に増加するのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実質的に低減し、ＯＣがＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を優先的に支持することを示す。健康な個体からの精製ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。健康な個体からの精製ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、図４０Ａに記載する通りに処理した。６、９、１２及び１５日間の共培養後、リンパ球を、顕微鏡を使用して手動で計数し、ＯＣ拡大ＮＫ、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、非ＯＣ拡大対照細胞の数から差し引き、細胞の拡大倍数を、それを最初の入力細胞に割ることによって決定した（各実験条件についてｎ＝６）。 ＯＣと培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が徐々に増加するのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実質的に低減し、ＯＣがＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を優先的に支持することを示す。健康な個体からの精製ＮＫ細胞を、図３２Ａに記載する通りに、処理し、ＯＣと共培養した。健康な個体からの精製ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、図４０Ａに記載する通りに処理した。上清を、６、９、１２及び１５日目の共培養物から回収し、ＩＦＮ－γ分泌を、シングルＥＬＩＳＡを使用して決定し、分泌されたＩＦＮ－γを、リンパ球１００万個あたりに調整した（各実験条件についてｎ＝３）。 ＯＣと培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が徐々に増加するのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実質的に低減し、ＯＣがＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を優先的に支持することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理し、健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、ＮＫ細胞を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、ＴＶＡアッセイを使用して決定し、溶解単位３０／１０７個の細胞を、標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した。 ＯＣと培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が徐々に増加するのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は実質的に低減し、ＯＣがＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を優先的に支持することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理し、健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、図４０Ｅに記載の通りに処理してから、ＮＫ細胞を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、ＴＶＡアッセイを使用して決定し、溶解単位３０／１０７個の細胞を、標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した。 ＮＫ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではなくＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に溶解することを示す。健康な個体からの新たに精製されたＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理し、健康な個体からの新たに精製されたＮＫ細胞を、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理してから、ＮＫ細胞を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＯＳＣＳＣに対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、ＴＶＡアッセイを使用して決定し、溶解単位３０／１０７個の細胞を、標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なＮＫ細胞の逆数を使用して決定した。
本発明は、部分的に、がんに罹患している対象を処置するため、及び／またはがん細胞を殺傷するもしくはがん細胞の増殖を阻害するための、免疫学的組成物及びそれらの使用方法に関する。組成物は、がん細胞の異なる集団を標的とすることができる複数の免疫細胞型を含む。かかる組成物はまた、一般に対象の免疫系を強化することができるために、がん以外の疾患にも利益をもたらすことができる。
Ｉ．定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）の、その冠詞の文法上の目的語を指すように使用される。例として、「ａｎ」要素は、１つの要素または複数の要素を意味する。
「投与すること」という用語は、作用物質がその意図される機能を行うことを可能にする投与経路を含むことが意図される。使用することができる身体の処置のための投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内など）、経口、吸入、及び経皮経路が挙げられる。注射は、ボーラス注射であることができるまたは持続注入であることができる。投与経路に応じて、作用物質を、その意図される機能を行う能力に有害な影響を及ぼし得る自然条件から保護するために、選択された材料で被覆するまたはその中に収容することができる。作用物質は、単独で、または医薬的に許容可能な担体と併せて投与され得る。
「活性化すること」または「活性化」という用語は、標的の機能の増強を指す。例えば、本開示は、インビトロ、エキソビボ、及び／またはインビボでＮＫ細胞を活性化する方法を提供する。本開示では、細胞の活性化は、活性及び／または少なくとも１つの細胞機能（例えば、細胞傷害性、細胞分裂及び／または成長速度など）の少なくとも増強を含む、かかる細胞の機能の増強を指す。一部の実施形態では、本明細書で使用する作用物質は、少なくとも１つの細胞、例えばＮＫ細胞（複数可）を活性化する。
「がん」または「腫瘍」または「過剰増殖性」という用語は、無秩序増殖、不死、転移能、急速な成長及び増殖速度、ならびにある特定の特徴的形態学的特性など、がんを引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在を指す。別段の記述がない限り、本用語は、化生を含む。一部の実施形態では、かかる細胞は、少なくとも１つの遺伝子突然変異による一部または全てのかかる特徴を呈する。がん細胞は、腫瘍の形態であることが多いが、かかる細胞は、動物内に単独で存在し得る、または非腫瘍化がん細胞、例えば白血病細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「がん」という用語は、前悪性ならびに悪性のがんを含む。がんには、Ｂ細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、ならびに免疫細胞アミロイドーシス、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがんなどが含まれるが、これに限定されない。本発明に包含される方法に適用可能ながんのタイプの他の非限定的な例には、ヒト肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝臓癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）；及び真正赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびに重鎖病が含まれる。一部の実施形態では、がんは、本質的に上皮性であり、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科のがん、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または皮膚癌を含むが、これに限定されない。他の実施形態では、がんは、口腔癌、口腔扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、または結腸癌である。さらに他の実施形態では、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮癌は、漿液、子宮内膜、粘液性、明細胞、ブレナー、または未分化を含むがこれに限定されない、様々な他の方法で特徴決定され得る。
「対照」という用語は、正常な患者、正常な対象などの対象から単離された培養初代細胞／組織、患者の同じ臓器もしくは身体の位置から得られた隣接する正常な細胞／組織、正常な対象から単離された組織もしくは細胞試料、または保管場所から取得した初代細胞／組織などの任意の好適な参照標準を指す。他の好ましい実施形態では、対照は、一組の対象、例えば正常または健康な対象に関する、発現レベル、ある特定の細胞型（例えば、ＮＫ細胞または単球）の数、及び／またはある特定の細胞型のある特定の細胞機能を含み得る。
「免疫細胞」という用語は、免疫応答において役割を担う細胞を指す。免疫細胞は、造血起源であり、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達において重要な小タンパク質（約５～２０ｋＤａ）の広い及び緩いカテゴリーを指す。それらの放出は、それらの周りの細胞の挙動に作用する。サイトカインは、免疫調節作用物質として、自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達及び内分泌シグナル伝達に関与している。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が含まれ、本開示ではホルモンまたは成長因子を追加で含み得る。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及びマスト細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、及び様々な間質細胞を含む、広範な細胞によって産生される。好ましいサイトカインを、本開示の明細書及び図面に例示している。
「サイトカイン／ケモカイン活性」という用語は、細胞機能の少なくとも１つを調節するサイトカインまたはケモカインの能力を含む。一般に、サイトカインまたはケモカインは、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答間のバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、成長、及び応答性を制御する。ゆえに、「サイトカイン／ケモカイン活性」という用語は、サイトカインまたはケモカインがその天然細胞受容体（複数可）と結合する能力、細胞シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力を含む。
「免疫応答」という用語は、ＮＫ媒介性、Ｔ細胞媒介性、及び／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害性が含まれる。加えて、免疫応答という用語は、ＮＫ細胞またはＴ細胞活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。
「免疫療法剤」という用語は、宿主免疫系を刺激して対象において腫瘍またはがんに対する免疫応答を生成することができる任意の分子、ペプチド、抗体または他の作用物質を含むことができる。様々な免疫療法剤が、本明細書に記載の組成物及び方法において有用である。
本開示は、ＮＫ細胞を活性化するための方法を提供する。「活性化する」、「活性化」、または「活性化すること」という用語は、ＮＫ細胞機能を活性化することを指す。「ＮＫ細胞機能（複数可）」という用語は、細胞傷害性及び／またはサイトカイン／ケモカイン産生／分泌活性、特にＩＦＮ－γの分泌などのＮＫ細胞の任意の機能を指す。
「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、疾患、障害、または状態を有さないが、発症するリスクがあるまたは発症しやすい対象において、疾患、障害、または状態を発症する可能性を低下させることを指す。
「阻害する」という用語は、例えば、特定の作用、機能、または相互作用の低下、低減、制限、または遮断を含む。一部の実施形態では、がんは、がんの少なくとも１つの症状が軽減、終了、減速、または予防される場合に、「阻害」される。本明細書で使用する場合、がんは、がんの再発または転移が低下、減速、遅延、または予防される場合にも、「阻害」される。
「対象」という用語は、任意の健康な動物、哺乳動物もしくはヒト、またはがん、例えば、脳転移、口腔癌、肺、卵巣、膵臓、肝臓、乳房、前立腺、結腸癌、黒色腫、多発性骨髄腫などに罹患した任意の動物、哺乳動物もしくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と互換可能である。
「治療効果」という用語は、薬理学的活性物質によって引き起こされる、動物、具体的には哺乳動物、及びより具体的にはヒトにおける局所的または全身的効果を指す。ゆえに、本用語は、動物またはヒトにおける、疾患の診断、治癒、緩和、処置もしくは予防、または所望の身体的もしくは精神的発達及び状態の増強に使用することを目的とした任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、任意の処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で何らかの所望の局所的または全身的効果を生み出すかかる物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度などに依存するだろう。例えば、本発明の方法によって発見されたある特定の化合物は、かかる処置に適用可能な合理的な利益／リスク比を産生するのに十分な量で投与され得る。
本明細書内で別段の指定がない限り、「抗体」及び「抗体（複数）」という用語は、「細胞内抗体」として細胞内で発現されるように適応可能な抗原結合部分を指す。（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９５－６０１）。細胞内部分を標的とする（例えば、阻害する）ように抗体を適応させるための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の使用、超安定性のための免疫グロブリンＶＬドメインの修飾、還元性細胞内環境に抵抗するための抗体の修飾、細胞内安定性を増加させる及び／または細胞内局在化を調節する融合タンパク質の生成などである。細胞内抗体は、例えば、予防及び／または治療目的で（例えば、遺伝子治療として）、多細胞生物の１つまたは複数の細胞、組織または臓器において導入及び発現させることもできる（例えば、少なくともＰＣＴ公開ＷＯ０８／０２００７９、ＷＯ９４／０２６１０、ＷＯ９５／２２６１８、及びＷＯ０３／０１４９６０；米国特許第７，００４，９４０号；Ｃａｔｔａｎｅｏ ａｎｄ Ｂｉｏｃｃａ（１９９７）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｌａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ ｐｕｂｌｓ．）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４：１６３－１７０；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：２４４５－２４５６；Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０８：４０７－４１２；Ｓｈａｋｉ－Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３０３：１９－３９を参照されたい）。
抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル；異種、同種異系、もしくは同系；またはその修飾形態（例えば、ヒト化、キメラなど）であってよい。抗体は、完全にヒトであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片に特異的または実質的に特異的に結合する。「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原の特定のエピトープと免疫応答することができる抗原結合部位のうち１種のみを含有する抗体ポリペプチドの集団を指すのに対し、「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位のうち複数種を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫応答する特定の抗原に対する単一の結合親和性を表す。
抗体は、「ヒト化」されてもよく、これは、ヒト細胞によって作成され得る抗体により酷似するように改変されている可変領域及び定常領域を有する非ヒト細胞によって作成される抗体を含むことを意図する。例えば、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に見出だされるアミノ酸を組み込むように非ヒト抗体アミノ酸配列を改変することによる。本発明のヒト化抗体は、例えば、ＣＤＲ内に、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発、またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含み得る。「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列を、ヒトフレームワーク配列へとグラフトした抗体も含む。
「免疫細胞」という用語は、免疫応答において役割を担う細胞を指す。免疫細胞は、造血起源であり、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメイン及び軽鎖ＣＤＲ３ドメインが抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を担うことは当該技術分野で周知であるため、上記のように調製された本発明の組み換えモノクローナル抗体は、本明細書に記載され、当該技術分野で周知の抗体の可変領域の重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３を含むことが好ましい。同様に、抗体は、前記抗体の可変領域のＣＤＲ２をさらに含むことができる。抗体は、前記抗体の可変領域のＣＤＲ１をさらに含むことができる。他の実施形態では、抗体は、ＣＤＲの任意の組み合わせを含むことができる。
上記の操作された抗体のＣＤＲ１、２、及び／または３領域は、本明細書に記載の本発明の可変領域のものとして正確なアミノ酸配列（複数可）を含むことができる。しかしながら、当業者は、抗体、特にイントロボディが、単独でまたは免疫療法と組み合わせて、所望の目的、例えば１つまたは複数のバイオマーカー、かかるバイオマーカーの結合パートナー／基質、または免疫療法と効果的に、結合する能力を依然として保持したままで、正確なＣＤＲ配列からのいくらかの逸脱が可能であり得ることを理解するだろう（例えば、保存的配列修飾）。従って、他の実施形態では、操作された抗体は、本明細書に記載の本発明のまたは公的に利用可能な１つまたは複数のＣＤＲと、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である１つまたは複数のＣＤＲから構成され得る。
例えば、非ヒトまたはヒト抗体（例えば、ラット抗マウス／抗ヒト抗体）の構造的特徴を使用して、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性、例えば免疫チェックポイントを保持する構造的に関連するヒト抗体、特にイントロボディを作製することができる。別の機能特性には、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、元の既知の、非ヒトまたはヒト抗体の結合を阻害することが含まれる。
本発明の抗体、免疫グロブリン、及びポリペプチドは、単離された（例えば、精製された）形態で使用できる、または膜もしくは脂質小胞（例えば、リポソーム）などのベクター内に含有することができる。さらに、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。ヒト化抗体を、非ヒト動物由来の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに単純にグラフトして産生すると、非ヒト動物に由来する元の抗体のものと比較して抗原結合活性が低下することが知られている。非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのいくつかのアミノ酸残基は、ＣＤＲだけでなくＦＲにおいても、直接的または間接的に抗原結合活性に関連していると考えられている。従って、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基で置換すると、結合活性が低下し得、このアミノ酸を、非ヒト動物に由来する元の抗体のアミノ酸残基で置き換えることによって修正することができる。
同様に、本明細書に記載の抗体の構造、及びそれらをコードするＤＮＡ配列において修飾及び変更を加えてよく、それでも、所望の特徴を有する抗体及びポリペプチドをコードする機能性分子を取得する。例えば、抗体のグリコシル化パターンは、例えば、安定性を増加するように調節することができる。「改変すること」とは、抗体に見出される１つもしくは複数の炭水化物部分の欠失、及び／または抗体に存在しない１つもしくは複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結である。「Ｎ連結」とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素付着のための認識配列である。ゆえに、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。グリコシル化部位の、抗体への付加は、（Ｎ連結グリコシル化部位のために）上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより好都合に達成される。共有結合修飾の別のタイプは、化学的にまたは酵素的に、抗体にグリコシドをカップリングさせることに関与する。これらの手順は、Ｎ－またはＯ－連結グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞での抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用するカップリング様式に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着し得る。例えば、かかる方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
同様に、抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的にまたは酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理は、抗体をインタクトなままにしておく一方、連結糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）により及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）により記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）によって記載されるように、様々なエンド－及びエキソ－グリコシダーゼの使用によって達成することができる。
「免疫療法」または「免疫療法（複数）」という用語は、がんなどの疾患と戦うために対象の免疫系のある特定の部分を使用する任意の処置を指す。対象自身の免疫系は、その目的のための１つまたは複数の作用物質の投与の有無にかかわらず、刺激（または抑制）される。免疫応答を惹起または増幅するように設計された免疫療法は、「活性化免疫療法」と称される。免疫応答を低下または抑制するように設計された免疫療法は、「抑制免疫療法」と称される。遺伝子修飾された移植がん細胞に免疫系の効果を有すると考えられる任意の作用物質をアッセイして、その作用物質が免疫療法であるか否か、及び所与の遺伝子修飾が免疫応答の調節に及ぼす効果を決定することができる。一部の実施形態では、免疫療法は、がん細胞特異的である。一部の実施形態では、免疫療法は、免疫系細胞と選択的に相互作用しないが、免疫系機能を調節する作用物質の投与を指す「非標的」であることができる。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子治療、及び放射線療法が含まれるが、これに限定されない。
免疫療法は、例えば、がんワクチン及び／または感作された抗原提示細胞の使用を含み得る標的療法の１つの形態である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞を傷つけることなく、がん細胞に感染及びこれを溶解することができるウイルスであり、がん治療において潜在的に有用である。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞の破壊を促進し、腫瘍部位での用量増幅も産生する。それらはまた、抗がん遺伝子のベクターとしても作用し得、それらを腫瘍部位に特異的に送達することを可能にする。免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して指向した予生成抗体の投与（例えば、化学療法剤または毒素に任意選択で連結した、モノクローナル抗体の、腫瘍抗原への投与）により達成される、宿主の短期保護のための受動免疫療法を伴うことができる。例えば、抗ＶＥＧＦ及びｍＴＯＲ阻害剤は、腎細胞癌の処置に有効であることが公知である。免疫療法はまた、がん細胞株の細胞傷害性リンパ球認識エピトープを使用することに焦点を当てることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍またはがんの開始、進行、及び／または病理につながる生体分子を選択的に調節することができる。
免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して指向した予生成抗体の投与（例えば、化学療法剤または毒素に任意選択で連結した、モノクローナル抗体の、腫瘍抗原への投与）により達成される、宿主の短期保護のための受動免疫療法を伴うことができる。免疫療法はまた、がん細胞株の細胞傷害性リンパ球認識エピトープを使用することに焦点を当てることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍またはがんの開始、進行、及び／または病理につながる生体分子を選択的に調節することができる。
「免疫原性化学療法」という用語は、免疫原性細胞死を誘導することが実証されている任意の化学療法を指し、これは、カルレティキュリン、ＡＴＰ及びＨＭＧＢ１を含むがこれに限定されない、１つまたは複数のダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）分子の放出によって検出可能な状態である（Ｋｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：５１－７２）。加えて、「免疫原性化学療法」という用語は、がんに対する免疫活性の増強をもたらすような免疫系のプライミングをもたらす任意の化学療法をさらに指す。コンセンサス免疫原性化学療法の特定の代表例としては、とりわけ、５’－フルオロウラシル、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン、及び白金製剤であるオキサリプラチンが挙げられる。
一部の実施形態では、免疫療法は、１つまたは複数の免疫チェックポイントの阻害剤を含む。「免疫チェックポイント」という用語は、抗腫瘍免疫応答を下方調節するまたは阻害することにより免疫応答を微調整する、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上にある分子の群を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、当該技術分野で周知であり、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＡ２ａＲを含むが、これに限定されない（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）。本用語は、生物学的に活性なタンパク質断片、ならびに完全長免疫チェックポイントタンパク質及びその生物学的に活性なタンパク質断片をコードする核酸をさらに包含する。一部の実施形態では、本用語は、本明細書に提供する相同性の記載に従う任意の断片をさらに包含する。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントは、ＰＤ－１である。
免疫チェックポイント及びそれらの配列は当該技術分野で周知であり、代表的な実施形態を以下に記載する。例えば、「ＰＤ－１」という用語は、既知のリガンドとしてＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を有する共阻害受容体として機能する免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーを指す。ＰＤ－１は、ＴＣＲ誘導性活性化Ｔ細胞死の間に上方制御される遺伝子を選択するためのサブトラクションクローニングに基づく手法を使用して、以前に同定された。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１に結合するその能力に基づく分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４のように、ＰＤ－１は、抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面上に急速に誘導される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．２５（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５）。しかしながら、ＣＴＬＡ－４とは対照的に、ＰＤ－１は、（抗ＩｇＭに応答して）Ｂ細胞の表面上でも誘導される。ＰＤ－１は、胸腺細胞及び骨髄細胞のサブセット上でも発現する（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）前出；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７７３）。
代表的なヒトＰＤ－１バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにてＮＭ＿００５０１８．２及びＮＰ＿００５００９．２の下に一般に利用可能であり、表１に示している（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）２０ ＥＭＢＯ Ｊ １１：３８８７；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：７０４；米国特許第５，６９８，５２０号も参照されたい）。ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメインを含有する細胞外領域、ならびに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：７０４；及び米国特許第５，６９８，５２０号）及び免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞内領域を有する。これらの特徴も、免疫阻害性受容体と呼ばれるポリペプチドの大きなファミリーを定義するものであり、それはｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、及びキラー阻害受容体（ＫＩＲ）も含む（Ｖｉｖｉｅｒ ａｎｄ Ｄａｅｒｏｎ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：２８６）。これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭ及びＩＴＳＭモチーフが、阻害シグナルをもたらす、ホスファターゼを含有するＳＨ２ドメインと相互作用すると推定されることが多い。これらの免疫阻害性受容体のサブセットは、ＭＨＣポリペプチド、例えば、ＫＩＲに結合し、ＣＴＬＡ４はＢ７－１及びＢ７－２に結合する。ＭＨＣ及びＢ７遺伝子間に系統発生的関係があることが提唱されている（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２０（６）：２８５－８）。
「免疫療法への応答」または「免疫療法と組み合わせた、表１に列挙する１つまたは複数のバイオマーカーの阻害剤（複数可）への応答」という用語は、表１に列挙する１つまたは複数のバイオマーカーの阻害剤などの抗がん剤に対する、及び免疫療法に対する過剰増殖性障害（例えば、がん）の任意の応答、好ましくはネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後の腫瘍質量及び／または体積の変化に関連する。過剰増殖性障害応答は、例えば、有効性に関して、またはネオアジュバントもしくはアジュバントの状況において評価されてよく、この場合全身介入後の腫瘍のサイズは、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、または触診によって測定された初期サイズ及び寸法と比較することができる。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のノギス測定または病理学的検査によって評価してもよい。応答は、腫瘍体積における変化率（％）のような定量的様式で、または「病理学的完全奏効」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定状態」（ｃＳＤ）、「臨床的進行疾患」（ｃＰＤ）、もしくは他の定性的基準のような定性的様式で記録し得る。過剰増殖性障害応答の評価は、ネオアジュバント療法またはアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間、数日、数週後、または好ましくは数か月後に行われ得る。応答評価に関する典型的なエンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終了時、または残存腫瘍細胞及び／または腫瘍床の外科的除去時である。これは典型的には、ネオアジュバント療法の開始後３か月である。一部の実施形態では、本明細書に記載の治療的処置の臨床的有効性は、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することによって決定され得る。臨床的有用率は、治療終了から少なくとも６か月経過した時点で、完全寛解（ＣＲ）にある患者の割合（％）、部分寛解（ＰＲ）にある患者の数及び安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の合計を決定することによって測定される。この式に関する簡略表記は、ＣＢＲ＝６か月にわたるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定のがん治療レジメンに関するＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれ以上である。がん治療に対する応答を評価するための追加の基準は、「生存」に関連しており、これは、以下：全生存としても知られる死亡までの生存（前記死亡は、原因とは無関係または腫瘍関連であり得る）；「無再発生存」（再発という用語は、局所的再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）；無転移生存；無疾患生存（疾患という用語は、がん及びそれと関連する疾患を含むものとする）の全てを含む。前記生存の長さは、定義された開始点（例えば、診断または処置開始時点）及び終了点（例えば、死亡、再発、または転移）を参照することによって計算され得る。加えて、処置の有効性の基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の転移の確率、及び腫瘍再発の確率を含むように拡大することができる。例えば、適切な閾値を決定するために、特定のがん治療レジメンを対象の母集団に施すことができ、転帰を、任意のがん治療を施す前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。転帰の測定は、ネオアジュバント設定で与えられた治療に対する病理学的応答であり得る。あるいは、全生存及び無疾患生存などの転帰指標を、バイオマーカーの測定値が既知であるがん治療後の対象について、一定期間にわたってモニターすることができる。ある特定の実施形態では、投与される用量は、がん治療剤に関して当該技術分野で公知の標準的な用量である。対象をモニターする期間は、変動できる。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０か月間モニターされ得る。がん治療の転帰に相関するバイオマーカー測定閾値は、実施例のセクションに記載するものなどの、当該技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。
「耐性」という用語は、がん治療に対するがん試料または哺乳動物の後天的または先天的耐性（すなわち、治療的処置に対して非応答である、または応答が低下もしくは制限されている）を指し、例えば、治療的処置に対して２５％以上、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍またはそれ以上の応答低下を有する。応答の低下は、耐性が獲得される前に同じがん試料もしくは哺乳動物と比較することによって、または治療的処置に対して耐性を有さないことが公知である異なるがん試料もしくは哺乳動物と比較することによって測定することができる。化学療法に対する典型的な後天性耐性は、「多剤耐性」と称される。多剤耐性は、Ｐ糖タンパク質によって媒介され得るもしくは他の機序によって媒介され得る、または哺乳類が多剤耐性微生物もしくは微生物の組み合わせに感染した場合に発生し得る。治療的処置に対する耐性の決定は、当該技術分野で慣習的であり、当業者の技術の範囲内であり、例えば、本明細書で「感作すること」として記載される細胞増殖アッセイ及び細胞死アッセイによって測定することができる。一部の実施形態では、「耐性を逆転させる」という用語は、一次がん治療（例えば、化学療法または放射線療法）単独では、未処置腫瘍の腫瘍体積と比較して統計学的に有意な腫瘍体積の低減を生成することができない状況における未処置腫瘍の腫瘍体積と比較した場合に、一次がん治療（例えば、化学療法または放射線療法）と組み合わせた第２の作用物質の使用が、統計学的有意性の水準（例えば、ｐ＜０．０５）で腫瘍体積の有意な低減を生成することができることを意味する。これは一般に、未処置腫瘍が対数律動的に成長しているときに行われる腫瘍体積測定に適用される。
「応答」または「応答性」という用語は、例えば、腫瘍サイズの低下または腫瘍成長の阻害という意味での抗がん応答を指す。これらの用語は、予後の改善も指すことができ、これは例えば、最初の事象として二次原発性がんのために打ち切る最初の再発もしくは再発のエビデンスを伴わない死までの期間である、無再発期間の増加、または処置から任意の原因からの死までの期間である、全生存の増加により反映される。応答する、または応答を有するとは、刺激に曝露された場合に達成される有益なエンドポイントがあることを意味する。あるいは、負のまたは有害な症状が、刺激に曝露されると最小限に抑えられる、軽減される、または減弱される。腫瘍または対象が好ましい応答を呈するだろう可能性を評価することは、腫瘍または対象が好ましい応答を呈さない（すなわち、応答の欠如を呈する、または非応答性であるだろう）可能性を評価することと同等であることが理解されるだろう。
本明細書で使用する場合、「無応答性」という用語は、治療に対するがん細胞の不応性、または刺激、例えば、活性化受容体もしくはサイトカインを介した刺激に対する免疫細胞などの治療細胞の不応性を含む。無応答性は、例えば、免疫抑制剤への曝露または高用量の抗原への曝露を原因として生じ得る。本明細書で使用する場合、「アネルギー」または「寛容性」という用語は、受容体媒介性刺激の活性化に対する不応性を含む。かかる不応性は一般に抗原特異的であり、寛容化抗原への曝露が終わった後も持続する。例えば、（無応答性とは反対に）Ｔ細胞におけるアネルギーは、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ－２の欠如を特徴とする。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、第１のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ－３媒介性シグナル）を第２のシグナル（共刺激シグナル）の不在下で受け取るときに生じる。これらの条件下で、同じ抗原への細胞の再曝露は（たとえ再曝露が共刺激ポリペプチドの存在下で生じたとしても）、サイトカインの産生に失敗し、ゆえに増殖に失敗する。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）と培養すると増殖することができる。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡによってまたは増殖アッセイによって指標細胞株を使用して測定されたＴリンパ球によるＩＬ－２産生の欠如によっても観察することができる。あるいは、レポーター遺伝子構築物を使用することができる。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ－２遺伝子エンハンサーの制御下にある異種プロモーターによって、またはエンハンサー内に見出すことができるＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩＬ－２遺伝子転写の開始に失敗する（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１１３４）。
ＮＫ細胞
ナチュラルキラー細胞またはＮＫ細胞は、自然免疫系に決定的に重要な細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞が担う役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割と類似している。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に迅速に応答し、感染後およそ３日で作用し、腫瘍形成に応答する。典型的には、免疫細胞は、感染細胞表面上に提示される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を検出し、サイトカイン放出を誘発し、溶解またはアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＮＫ細胞は、抗体及びＭＨＣの不在下でストレスを受けた細胞を認識する能力を有し、はるかに速い免疫応答を可能にするという点で、固有である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラス１の「自己」マーカーが欠失している細胞を殺傷するために活性化を必要としないという初期の概念から、「ナチュラルキラー」と命名された。この役割は、ＭＨＣＩマーカーが欠失している有害な細胞は、Ｔリンパ球細胞などの他の免疫細胞によって検出することができない及び破壊することができないため、特に重要である。
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を生じる一般的なリンパ球前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺で分化及び成熟し、その後循環系に入ることが知られている。ＮＫ細胞は、起源及びそれぞれのエフェクター機能によって、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）と表現型的に異なる；しばしば、ＮＫＴ細胞活性は、ＩＦＮγを分泌することによってＮＫ細胞活性を促進する。ＮＫＴ細胞とは対照的に、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）もしくはパンＴマーカーＣＤ３または表面免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｂ細胞受容体を発現しないが、通常、ヒトにおいては、表面マーカーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）及びＣＤ５６を発現し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいては、ＮＫ１．１またはＮＫ１．２を発現する。ＮＫｐ４６細胞表面マーカーは、現時点では、ヒト、マウスのいくつかの系統（ＢＡＬＢ／ｃマウスを含む）の両方及び３つの一般的なサル種において発現している優先する別のＮＫ細胞マーカーを構成する。
ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的阻害性受容体によって負に制御されている（Ｋａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｏｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ，１９８９）。これらの特異的受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子の多型性決定基または他の細胞上に存在するＨＬＡに結合し、ＮＫ細胞溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と称される受容体のファミリーのある特定のメンバーが、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の群を認識する。
ＫＩＲは、ＮＫ細胞を含むリンパ球のある特定のサブセットに存在する受容体の大きなファミリーである。ＫＩＲの命名法は、細胞外ドメイン（ＫＩＲ２ＤまたはＫＩＲ３Ｄ）の数及び細胞質尾部が長い（ＫＩＲ２ＤＬまたはＫＩＲ３ＤＬ）かまたは短い（ＫＩＲ２ＤＳまたはＫＩＲ３ＤＳ）かに基づいている。ヒト内では、所与のＫＩＲの有無は、単一個体に存在するＮＫ集団内でＮＫ細胞によって変動する。ヒト集団内では、ＫＩＲ分子の多型性レベルも比較的高く、ある特定のＫＩＲ分子は、一部の個体に存在するが、全ての個体に存在するわけではない。ある特定のＫＩＲ遺伝子産物は、適切なリガンドに結合するとリンパ球活性の刺激を引き起こす。確認された刺激性ＫＩＲは全て、免疫刺激性モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアダプター分子と会合する、荷電膜貫通残基を伴う短い細胞質尾部を有する。他のＫＩＲ遺伝子産物は、本質的に阻害性である。
ナチュラルキラー細胞は、ヒト血液中の末梢血単核細胞の約１０％を構成し、ＣＤ３の表面発現の欠如ならびにＣＤ１６及びＣＤ５６の発現によって同定される。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する直接細胞傷害性及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の両方を媒介する。ＮＫ細胞は、事前の感作を伴わずにこれらの細胞を認識することができる。ＮＫ細胞は、壊死及びアポトーシスを誘導することができる、パーフォリン及びグランザイムＢとして知られる事前に形成された顆粒を放出することにより、直接細胞傷害性を媒介する。ＮＫ細胞がその標的細胞を認識し、溶解性免疫シナプスを形成すると、分泌型リソソームはシナプスに向かって分極し、原形質膜の近傍に移動する。膜破壊タンパク質であるパーフォリンは、セリンプロテアーゼであるグランザイムの送達を促進し、これはカスパーゼなどの様々な標的を切断し、細胞死をもたらす。ＮＫ細胞は、Ｆａｓリガンド、Ｔｒａｉｌ及びＴＮＦ－アルファなどのリガンドの表面発現を通して、標的細胞上のデスレセプターを介して直接細胞傷害性を媒介することもできる。腫瘍壊死因子受容体ファミリーに属する細胞表面タンパク質であるＦａｓ（ＣＤ９５／ＡＰＯ－１／ＴＮＦＲＳＦ６）は、その天然リガンドであるＣＤ９５Ｌ（ＣＤ１７８／ＴＮＦＳＦ６）に結合する、またはアゴニスティック抗体で刺激されると、アポトーシスを媒介することができる。ＮＫ細胞は、腫瘍に対する抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介し、サイトカイン及びケモカインの分泌を通して他の細胞の機能を制御することができる。
ＮＫ細胞の２つの主要なサブセットが同定されており、一方は、ＣＤ１６＋＋＋ＣＤ５６＋の表面発現を伴い、これは細胞傷害性の高い循環血液内の主なサブセットであるのに対し、他方は、制御性サブセットとして公知の粘膜に存在するＣＤ１６－ＣＤ５６＋＋＋サブセットである。本発明者らの研究室は、ＮＫ細胞成熟の４つの異なるステージを確立している。ステージ１ＮＫ細胞は、がん幹様細胞／未分化腫瘍を選択する及び殺傷すると見出されたＣＤ１６＋＋＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ６９－、及びＣＤ１０７ａ－である。ＩＬ－２活性化及びＣＤ１６受容体誘発により、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋／－ＣＤ５６＋＋ＣＤ６９＋ＣＤ１０７ａ＋を発現し、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの分泌を増加させる一方で、細胞傷害性の低減を呈する。これは第２ステージであり、このステージのＮＫ細胞はスプリットアネルギー化ＮＫ細胞として知られている。さらなる活性化がなければ、ＮＫ細胞はステージ３に移り、この場合ＮＫ細胞は非機能性となり、その細胞傷害性及びサイトカイン分泌能力を喪失する。最後に、ＮＫ細胞はアポトーシスを起こし、ステージ４をもたらす。
プロバイオティクス細菌
一部の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞機能を制御することができる、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株を含む組成物に関する。かかるプロバイオティクス細菌は、活性化ＮＫ細胞において有意なスプリットアネルギーを誘導し、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの有意な誘導をもたらす。加えて、かかるプロバイオティクス細菌は、ＮＫ細胞の有意な拡大を誘導する。この目的のために有用である例示的なプロバイオティクス細菌は、国際特許出願ＷＯ１８／１１２３６６に開示されており、特にそれが開示するプロバイオティクス細菌について、参照により本明細書に組み込まれる。
多くの市販のプロバイオティクスが利用可能であり、胃腸の不快感を低下する、または免疫系を強化する様々な効果を有する。本明細書に記載の組成物及び方法における使用に好ましいプロバイオティクス細菌種には、市販されているプロバイオティクス細菌の菌株（例えばＡＪ２細菌）、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｅｎｅｒａ（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、及びＬ．ｃａｓｅｉ）からのものを含む。本開示は、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株、好ましくは２つ以上の異なる細菌株の組み合わせを、対象、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する方法を含む。かかる投与は、全身的または局所的に（例えば、腸に直接）行われ得る。好ましい投与経路は、経口投与である。他の経路（例えば、直腸）も使用され得る。投与に関して、細菌（例えば、湿潤した、超音波処理された、粉砕された、もしくは乾燥した形態または処方）、細菌を含有する細菌培養培地、または細菌培養培地上清（細菌を含有しない）のいずれかを投与し得る。
ＡＪ２は、グラム陽性プロバイオティクス細菌の８つの菌株の組み合わせであり、ＩＬ－２処理またはＩＬ－２＋抗ＣＤ１６モノクローナル抗体処置ＮＫ細胞（抗ＣＤ１６ｍＡｂ）に加えると、ＩＦＮ－γの相乗的産生を誘導する能力を伴う。菌株の組み合わせを使用して、バランスの取れた炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインならびに成長因子放出ＮＫ細胞の相乗的誘導に加えて、細菌の多様性を提供した。さらに、菌株の組み合わせ内の各細菌の量を調整して、細菌の不在下でＮＫ細胞をＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いて活性化した場合に得られる比率により近い、ＩＦＮ－γのＩＬ－１０に対する比率を得た。かかる選択の背後にある理論的根拠は、ＮＫ細胞を細菌の不在下でＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いて活性化した処理が細胞の有意な分化を提供したので、かかる処理で得られたものと同様の比率を得ることにあった。
抗体依存性細胞傷害性
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、それによって、Ｆｃ受容体を有する免疫細胞が、抗体のＦｃ部分にＦｃ受容体が結合する際に抗体で被覆された細胞を殺傷することができる機序である。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６としても知られるＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を通してＡＤＣＣを媒介できる免疫細胞のサブセットの１つである。ＮＫ細胞がＡＤＣＣを媒介する機序は、完全には理解されていない。エフェクター細胞が、Ｆｃ受容体及び標的細胞を被覆する抗体の架橋によって標的を認識すると、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）がエフェクター細胞においてリン酸化され、標的細胞を殺傷するためのエフェクター細胞における主要な下流シグナル伝達経路の誘発をもたらす。ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣによる機序の１つは、パーフォリン－グランザイム媒介性細胞傷害性を通してものであることができる。ＡＤＣＣにおけるＦＡＳリガンドの役割は不明だが、ＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体の架橋が、その上にあるＦＡＳリガンドを上方制御できることが示されており、これはＡＤＣＣにおけるＦａｓ／Ｆａｓ－Ｌの重要な役割を示している可能性がある。
フコイダン
フコイダンは、モズコ、メカブエ、リムムイ、ブラダーラック及びヒジキなどの、様々な種類の褐藻類及び褐海藻に見出される硫酸化多糖類である。抽出源に基づいて、フコイダンは異なる化学組成を有し得る。例えば、多糖類及び硫酸塩の他に、他の単糖類（マンノース、ガラクトース、グルコース、キシロースなど）ウロン酸、アセチル基、及びタンパク質も含有し得る。またメカブエ海藻としても知られるＵｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａは、フコース、ガラクトース、及び硫酸塩を構成するフコイダンの別の供給源である。
スプリットアネルギー
スプリットアネルギーは、ＮＫ細胞の成熟ステージであり、この場合ＮＫ細胞は細胞傷害性の低下及びＩＦＮ－γの分泌の増大を示す。スプリットアネルギー化ＮＫ細胞は、分泌因子及び膜結合因子を介して標的細胞の分化を促進し、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する腫瘍細胞の耐性を増加させる、ならびに腫瘍分化後のサイトカイン及びケモカイン産生の低下による炎症を阻害する。
がん幹細胞
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍塊を画定する分化細胞の様々な集団を作製できる幹細胞である。ＣＳＣは正常な幹細胞のようなものであり、自己複製能力を有し、分化することもできるが、制御不全様式で行われる。ＣＳＣの存在は、急性骨髄性白血病、乳房、前立腺、黒色腫、肺、結腸、脳、肝臓、胃及び膵臓癌を含むがこれに限定されない、多くの腫瘍において記載されている。
破骨細胞
破骨細胞は、骨を再吸収することによって骨の恒常性を担う骨細胞である。破骨細胞は、ＲＡＮＫＬ刺激を介して成熟し、その過程はＩＣＡＭ－１によって制御される。炎症誘発性シグナルは、破骨細胞上でＩＣＡＭ－１及びＲＡＮＫＬの発現を誘導することができる。これらのシグナルは、免疫細胞のサブセットによって媒介される。破骨細胞が、活性化及び阻害性ＮＫ細胞受容体の両方に対して複数のリガンドを発現することが示されている。
ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ
主要組織適合性複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢ（ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ）は、ストレス、損傷、ウイルス感染、または細胞の形質転換時に誘導され、細胞傷害性リンパ球を通した「殺して（ｋｉｌｌ ｍｅ）」シグナルとして作用することが知られているタンパク質である。古典的なＭＨＣクラスＩ分子とは対照的に、このタンパク質は抗原提示に関与していないが、細胞傷害性細胞の受容体であるナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体のリガンドであることが知られている。ＮＫＧ２Ｄ受容体の会合は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞傷害性を誘発し、ＣＤ８Ｔ細胞及びγδＴ細胞に共刺激シグナルを提供する。ＭＩＣＡ／Ｂは、健康な正常細胞によって構成的に発現されるとは考えられていなかったが、最近の研究では、このタンパク質が、胃、小腸、結腸、膀胱、子宮頸部、ファロピウス管、前立腺及び尿管内の平滑筋細胞及び／または筋線維芽細胞において乳房、結腸、肝臓、膵臓、胃、気管支、膀胱及び尿管などの健康な細胞の表面上でも発現されることが示されている。腫瘍細胞の分化状態に基づくＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの差次的発現は研究されていない。この研究では、本発明者らは、未分化／幹様腫瘍ならびに分化した口腔腫瘍及び膵臓腫瘍上でのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの発現を評価する。
ＩＩ．対象
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する組成物及び方法に好適な対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、飼育動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマなど）であり、好ましくは、ヒトである。
ある特定の実施形態では、対象は、がんの動物モデルである。例えば、動物モデルは、ヒト由来がんの同所性異種移植動物モデルであることができる。
本発明の方法の様々な実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び／または免疫療法などの処置を受けたことがない。他の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び／または免疫療法などの処置を受けたことがある。
ある特定の実施形態では、対象は、がん性または前がん性組織を除去するための手術を受けたことがある。他の実施形態では、がん性組織は、除去されておらず、例えば、がん性組織は、生命に必須の組織など、身体の手術不能な領域、または外科的処置が患者に害を及ぼす重大なリスクを引き起こし得る領域に位置し得る。
ＩＩＩ．抗がん治療
一態様では、他の抗がん治療及び／または免疫療法の組み合わせあるいは治療法の組み合わせ（例えば、１つまたは複数のＰＩ３Ｋベータ選択的阻害剤、例えばＫＩＮ１９３を、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１抗体と組み合わせ、単独でまたはなおも追加の抗がん治療、例えば標的療法と組み合わせる）を、（共同で）投与することができる。
「共同投与」及び「共同投与する」という語句は、先に投与された治療化合物が体内で依然有効である間に第２の化合物が投与されるような、２つ以上の異なる治療化合物の任意の投与形態を指す（例えば、２つの化合物は患者内で同時に有効であり、これは２つの化合物の相乗効果を含み得る）。例えば、異なる治療化合物は、同じ製剤で投与される場合もあれば、別々の製剤で投与される場合もあり、同時にまたは連続して投与されることができる。ある特定の実施形態では、異なる治療化合物を、互いの１時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、または１週間以内に投与することができる。ゆえに、かかる処置を受ける個体は、異なる治療化合物の組み合わせ効果から利益を得ることができる。
併用療法も企図されており、例えば、１つもしくは複数の化学療法剤及び放射線、１つもしくは複数の化学療法剤及び免疫療法、または１つもしくは複数の化学療法剤、放射線及び化学療法を含むことができ、これらの各組み合わせは、本明細書に記載の治療を伴うことができる。下記のように、作用物質は、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生剤、放射性標識化合物と、あるいは外科手術、凍結療法、及び／または放射線療法と併用療法にて投与することができる。先行処置法は、従来の治療と連続して、前または後のいずれかで、他の形態の従来の治療（例えば、当業者に周知であるがんの標準治療）と併せて投与することができる。例えば、これらの調節性作用物質は、治療有効量の化学療法剤と共に投与することができる。他の実施形態では、これらの調節性作用物質は、化学療法と併せて投与されて、化学療法剤の活性及び有効性を増強する。米国医師用卓上参考書（ＰＤＲ）は、様々ながんの処置において使用されてきた化学療法剤の投与量を開示している。治療的に有効なこれらの前述の化学療法薬の投薬レジメン及び投与量は、処置される特定の黒色腫、疾患の程度、及び当業者に周知である他の因子に依存することになり、医師により決定され得る。
「標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用してそれによってがんを処置する作用物質の投与を指す。一例には、当該技術分野で周知である、免疫チェックポイント阻害剤などの免疫療法が含まれる。例えば、当該技術分野で周知であり上記の治療用モノクローナル遮断抗体などの抗ＰＤ－１経路剤を使用して、腫瘍微小環境ならびにＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２などのＰＤ－１経路の望ましくない構成要素を発現する細胞を標的にすることができる。
例えば、「ＰＤ－１経路」という用語は、ＰＤ－１受容体及びそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を指す。「ＰＤ－１経路阻害剤」は、ＰＤ－１及びそのリガンドの一方または両方間の相互作用を遮断するまたは別様に低下させ、相互作用によって別様に生成された免疫阻害性シグナル伝達を遮断するまたは別様に低下させる。抗免疫チェックポイント阻害剤は、直接的または間接的であることができる。直接的な抗免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント及びそのリガンドの少なくとも１つの間の相互作用を遮断するまたは別様に低下させる。例えば、ＰＤ－１阻害剤は、そのリガンドの一方または両方とのＰＤ－１結合を遮断することができる。特に、ＰＤ－１の天然結合パートナー（例えば、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）、ＰＤ－Ｌ１の天然結合パートナー（例えば、ＰＤ－１及びＢ７－１）、及びＰＤ－Ｌ２の天然結合パートナー（例えば、ＰＤ－１及びＲＧＭｂ）が公知であるために、直接的なＰＤ－１組み合わせ阻害剤は、当該技術分野で周知である。
例えば、ＰＤ－１ならびにＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１ならびにＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１ならびにＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方の間の相互作用を直接遮断する作用物質、例えば二重特異性抗体は、阻害性シグナル伝達を防ぐことができる及び免疫応答を上方制御することができる（すなわち、ＰＤ－１経路阻害剤として）。あるいは、ＰＤ－１及びそのリガンドの一方または両方間の相互作用を間接的に遮断する作用物質は、阻害性シグナル伝達を防ぐことができる及び免疫応答を上方制御することができる。例えば、Ｂ７－１またはその可溶型は、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに結合することにより、ＰＤ－１に結合するために利用可能なＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの有効濃度を間接的に低下させる。例示的な作用物質としては、受容体及びリガンド（複数可）間の相互作用を遮断する、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２に対する単一特異性または二重特異性遮断抗体；非活性化型のＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２（例えば、ドミナントネガティブまたは可溶性ポリペプチド）、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド；ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２に結合し、受容体及びリガンド（複数可）間の相互作用を阻害する融合タンパク質（例えば、抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２の細胞外部分）；非活性化型の天然ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、及び／またはＰＤ－Ｌ２リガンド、ならびに可溶型の天然ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、及び／またはＰＤ－Ｌ２リガンドが挙げられる。
間接的な抗免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント及びそのリガンドの少なくとも１つの間の相互作用によって生成される免疫阻害性シグナル伝達を遮断または別様に低下させる。例えば、阻害剤は、ＰＤ－１及びそのリガンドの一方または両方間の相互作用を、ＰＤ－１及びそのリガンドの一方または両方間の相互作用を必ずしも直接遮断することなく、遮断することができる。例えば、間接阻害剤には、シグナル伝達するために必要なＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１の細胞内部分と結合して、免疫阻害性シグナル伝達を遮断または別様に低下させるイントラボディが含まれる。同様に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２の発現を低下させる核酸は、相互作用のための構成要素の利用可能性を取り除くことにより、ＰＤ－１及びそのリガンドの一方または両方間の相互作用を間接的に阻害できる。かかる核酸分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及び／またはＰＤ－Ｌ２の転写または翻訳を遮断することができる。
免疫応答を惹起または増幅するように設計された免疫療法は、「活性化免疫療法」と称される。免疫応答を低下または抑制するように設計された免疫療法は、「抑制免疫療法」と称される。遺伝子修飾された移植がん細胞に免疫系の効果を有すると考えられる任意の作用物質をアッセイして、その作用物質が免疫療法であるか否か、及び所与の遺伝子修飾が免疫応答の調節に及ぼす効果を決定することができる。一部の実施形態では、免疫療法は、がん細胞特異的である。一部の実施形態では、免疫療法は、免疫系細胞と選択的に相互作用しないが、免疫系機能を調節する作用物質の投与を指す「非標的」であることができる。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子治療、及び放射線療法が含まれるが、これに限定されない。
免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して指向した予生成抗体の投与（例えば、化学療法剤または毒素に任意選択で連結した、モノクローナル抗体の、腫瘍抗原への投与）により達成される、宿主の短期保護のための受動免疫療法を伴うことができる。免疫療法はまた、がん細胞株の細胞傷害性リンパ球認識エピトープを使用することに焦点を当てることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍またはがんの開始、進行、及び／または病理につながる生体分子を選択的に調節することができる。
ある特定の実施形態では、免疫療法は、養子細胞免疫療法を含む。周知の養子細胞免疫療法モダリティには、限定されないが、照射自己もしくは同種異系腫瘍細胞、腫瘍溶解物もしくはアポトーシス腫瘍細胞、抗原提示細胞免疫療法、樹状細胞免疫療法、養子Ｔ細胞移入、養子ＣＡＲ Ｔ細胞療法、自己免疫増強療法（ＡＩＥＴ）、がんワクチン、及び／または抗原提示細胞が含まれる。かかる細胞免疫療法は、ＧＭ－ＣＳＦのようなサイトカインを発現するなど免疫応答をさらに調節するための１つもしくは複数の遺伝子産物を発現するように、及び／またはＭａｇｅ－１、ｇｐ－１００、患者特異的ネオ抗原ワクチンなどの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原を発現するように、さらに修飾することができる。
他の実施形態では、免疫療法は、非細胞免疫療法を含む。ある特定のかかる実施形態では、ワクチン増強アジュバントを伴うまたは伴わない抗原を含む組成物が使用される。かかる組成物は、ペプチド組成物、腫瘍溶解性ウイルス、融合タンパク質を含む組み換え抗原などの多くの周知の形態で存在する。さらに他の実施形態では、免疫調節性インターロイキン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３など、ならびにそれらのモジュレータ（例えば、遮断抗体またはより強力もしくはより長続きする形態）が使用される。なおも他の実施形態では、免疫調節性サイトカイン、例えばインターフェロン、Ｇ－ＣＳＦ、イミキモド、ＴＮＦアルファなど、ならびにそれらのモジュレータ（例えば、遮断抗体またはより強力もしくはより長続きする形態）が使用される。他の実施形態では、免疫調節性ケモカイン、例えばＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、及びＣＸＣＬ７など、ならびにそれらのモジュレータ（例えば、遮断抗体またはより強力もしくはより長続きする形態）が使用される。他の実施形態では、免疫抑制を標的とする免疫調節分子、例えばＳＴＡＴ３シグナル伝達モジュレータ、ＮＦカッパＢシグナル伝達モジュレータ、及び免疫チェックポイントモジュレータが使用される。「免疫チェックポイント」及び「抗免疫チェックポイント療法」という用語は、上に記載している。
さらに他の実施形態では、免疫調節薬、例えば免疫細胞静止薬、グルココルチコイド、細胞静止薬、イムノフィリン及びそれらのモジュレータ（例えば、ラパマイシン、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス、シクロスポリン（シクロスポリン）、ピメクロリムス、アベチマス、グスペリムス、リダフォロリムス、エべロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムスなど）、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ドカ）アルドステロン、非グルココルチコイドステロイド、ピリミジン合成阻害剤、レフルノミド、テリフルノミド、葉酸類似体、メトトレキサート、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、サリドマイド、レナリドマイド、ペントキシフィリン、ブプロピオン、クルクミン、カテキン、オピオイド、ＩＭＰＤＨ阻害剤、ミコフェノール酸、ミリオシン、フィンゴリモド、ＮＦ－ｘＢ阻害剤、ラロキシフェン、ドロトレコギンアルファ、デノスマブ、ＮＦ－ｘＢシグナル伝達カスケード阻害剤、ジスルフィラム、オルメサルタン、ジチオカルバメート、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２、Ｐｒｏｌ、ＮＰＩ－００５２、クルクミン、ゲニスタイン、レスベラトロール、パルテノライド、サリドマイド、レナリドマイド、フラボピリドール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三酸化ヒ素、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、Ｉ３Ｃ（インドール－３－カルビノール）／ＤＩＭ（ジ－インドルメタン）（１３Ｃ／ＤＩＭ）、Ｂａｙ １１－７０８２、ルテオリン、細胞透過性ペプチドＳＮ－５０、ＩＫＢａ．－スーパーリプレッサー過剰発現、ＮＦＫＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、または任意のそれらの誘導体もしくは類似体が使用される。なおも他の実施形態では、免疫調節抗体またはタンパク質が使用される。例えば、ＣＤ４０、トール様受容体（ＴＬＲ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７に結合する、または４－１ＢＢに結合する抗体、Ｔ細胞二重特異性抗体、抗ＩＬ－２受容体抗体、抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３（ムロモナブ）、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ、抗ＣＤ４抗体、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ザノリムマブ、抗ＣＤ１１抗体、エファリズマブ、抗ＣＤ１８抗体、エルリズマブ、ロベリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、アフツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、パスコリズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ２３抗体、ルミリキシマブ、抗ＣＤ４０抗体、テネリキシマブ、トラリズマブ、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ルプリズマブ、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、アセリズマブ、抗ＣＤ８０抗体、ガリキシマブ、抗ＣＤ１４７抗体、ガビリモマブ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）阻害抗体、ベリムマブ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質、アバタセプト、ベラタセプト、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、トレメリムマブ、抗エオタキシン１抗体、ベルチリムマブ、抗ａ４－インテグリン抗体、ナタリズマブ、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、トシリズマブ、抗ＬＦＡ－１抗体、オズリモマブ、抗ＣＤ２５抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ、抗ＣＤ５抗体、ゾリモマブ、抗ＣＤ２抗体、シプリズマブ、ネレリモマブ、ファラリモマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、セデリズマブ、ドルリモマブアリトックス、ドルリキシズマブ、フォントリズマブ、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ、レブリリズマブ、マスリモマブ、モロリムマブ、ペキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトックス、バパリキシマブ、ベパリモマブ、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、アナキンラ、抗ＩＬ－５抗体、メポリズマブ、ＩｇＥ阻害剤、オマリズマブ、タリズマブ、ＩＬ１２阻害剤、ＩＬ２３阻害剤、ウステキヌマブなど。
免疫応答を増強する栄養補助食品、例えばビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣなどは、当該技術分野で周知であり（例えば、米国特許第４，９８１，８４４号及び同第５，２３０，９０２号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／００４４８３を参照されたい）本明細書に記載の方法において使用することができる。
同様に、免疫療法以外の作用物質及び治療法またはそれらの組み合わせは、免疫応答を刺激してそれによってそれから利益を得るだろう状態を処置するための免疫療法を伴ってまたは伴わずに、表１に列挙される１つまたは複数のバイオマーカーの阻害剤と組み合わせて使用することができる。例えば、化学療法、放射線、エピジェネティック修飾因子（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）修飾因子、メチル化修飾因子、リン酸化修飾因子など）、標的療法などは、当該技術分野で周知である。
あるいは、免疫療法は、例えば、がんワクチン及び／または感作された抗原提示細胞の使用を含み得る。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞を傷つけることなく、がん細胞に感染及びこれを溶解することができるウイルスであり、がん治療において潜在的に有用である。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞の破壊を促進し、腫瘍部位での用量増幅も産生する。それらはまた、抗がん遺伝子のベクターとしても作用し得、それらを腫瘍部位に特異的に送達することを可能にする。免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して指向した予生成抗体の投与（例えば、化学療法剤または毒素に任意選択で連結した、モノクローナル抗体の、腫瘍抗原への投与）により達成される、宿主の短期保護のための受動免疫療法を伴うことができる。免疫療法はまた、がん細胞株の細胞傷害性リンパ球認識エピトープを使用することに焦点を当てることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍またはがんの開始、進行、及び／または病理につながる生体分子を選択的に調節することができる。
「非標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しないが、それでもがんを処置する作用物質の投与を指す。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子治療、及び放射線療法が含まれるが、これに限定されない。
ある特定の実施形態では、化学療法が使用される。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。かかる化学療法剤は以下：白金化合物、細胞傷害性抗生物質、抗代謝剤、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、及び毒素；ならびにそれらの合成誘導体の化合物の群の中から選択されるものであり得るが、これに限定されない。例示的な化合物としては、アルキル化剤：シスプラチン、トレオスルファン、及びトロフォスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：テニポシド、クリスナトール、及びマイトマイシン；抗葉酸：メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びヒドロキシウレア；ピリミジン類似体：５－フルオロウラシル、ドキシフルリジン、及びシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリン及びチオグアニン；ＤＮＡ抗代謝物質：２’－デオキシ－５－フルオロウリジン、アフィジコリングリシネート、及びピラゾロイミダゾール；ならびに抗有糸分裂剤；ハリコンドリン、コルヒチン、及びリゾキシンが挙げられるが、これらに限定されない。１つまたは複数の化学療法剤（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物も使用され得る。ＦＬＡＧには、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、及びＧ－ＣＳＦが含まれる。ＣＨＯＰには、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾンが含まれる。ある特定の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ－１及び／またはＰＡＲＰ－２）阻害剤が使用され、かかる阻害剤は当該技術分野で周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ－８８８、ＢＳＩ－２０１、ＢＧＰ－１５（Ｎ－Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ－１００１（Ｉｎｏｔｅｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）；ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ）；３－アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４－アミノ－１，８－ナフタルイミド；（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）－フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国再発行特許第３６，３９７号）；及びＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．）。作用機序は一般に、ＰＡＲＰ阻害剤がＰＡＲＰに結合してその活性を低減させる能力に関連する。ＰＡＲＰは、ベータ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）からニコチンアミド及びポリ－ＡＤＰ－リボース（ＰＡＲ）への変換を触媒する。ポリ（ＡＤＰ－リボース）及びＰＡＲＰの両方が、転写、細胞増殖、ゲノム安定性、及び発がんの制御に関連している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ Ｖ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３１，Ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ ２００３，ｐｐ．４４６－４５４（９）；Ｈｅｒｃｅｇ Ｚ．；Ｗａｎｇ Ｚ．－Ｑ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４７７，Ｎｕｍｂｅｒ １，２ Ｊｕｎ．２００１，ｐｐ．９７－１１０（１４））。ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）の修復における鍵となる分子である（ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：７３０３－７３０７；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ Ｖ，Ｄａｎｔｚｅｒ Ｆ，Ａｍｅ Ｊ Ｃ，ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ Ｇ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：５１７－５２８；Ｗａｎｇ Ｚ Ｑ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １１：２３４７－２３５８）。ＰＡＲＰ１機能の阻害によるＳＳＢ修復のノックアウトは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、これは相同性指向ＤＳＢ修復に欠陥があるがん細胞において合成致死性を誘発することができる（Ｂｒｙａｎｔ Ｈ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３４：９１３－９１７；Ｆａｒｍｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３４：９１７－９２１）。化学療法剤の前述の例は例示的なものであり、限定することを意図するものではない。
他の実施形態では、放射線療法が使用される。放射線療法で使用される放射線は、イオン化放射線であることができる。放射線療法は、ガンマ線、Ｘ線、または陽子線でもあることができる。放射線療法の例には、体外ビーム放射線療法、放射性同位元素（Ｉ－１２５、パラジウム、イリジウム）の間質移植、ストロンチウム８９などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ－３２放射線療法、及び／または全腹部及び骨盤放射線療法が含まれるが、これに限定されない。放射線療法の一般的な概要については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。放射線療法は、体外ビーム放射線または遠隔療法として施すことができ、この場合放射線は遠隔源から向けられる。放射線処置は、内部療法または近接照射療法として施すこともでき、この場合放射線源はがん細胞または腫瘍塊に近接する体内に配置される。ヘマトポルフィリン及びその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ－ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ－ヒポクレリンＡ；ならびに２ＢＡ－２－ＤＭＨＡなどの光増感剤の投与を含む光線力学療法の使用も包含される。
なおも他の実施形態では、外科的介入は、がん性細胞及び／または組織を物理的に除去することができる。
さらに他の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモン療法処置は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ－ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成及びプロセシングの阻害剤、ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３類似体；抗ゲスターゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含むことができる。
なおも他の実施形態では、身体組織を高温（最大１０６°Ｆ）に曝露する手法である温熱療法が使用される。熱は、細胞に損傷を与える、または生存に必要な物質を欠乏させることで、腫瘍の縮小を助け得る。温熱療法は、外部及び内部の加熱デバイスを使用する、局所、領域、及び全身の温熱療法であることができる。温熱療法は、ほとんどの場合、その有効性を増加しようと試みるために他の形態の治療法（例えば、放射線療法、化学療法、及び生物学的療法）と共に使用される。局所温熱療法は、腫瘍などの非常に小さな領域に加えられる熱を指す。この領域は、身体の外側にあるデバイスから腫瘍に向けられた高周波を用いて外部から加熱され得る。内部加熱を達成するためには、細い加熱ワイヤーまたは温水で満たされた中空チューブ；移植マイクロ波アンテナ；及びラジオ波電極を含む、いくつかのタイプの滅菌プローブのうちの１つを使用し得る。領域温熱療法では、臓器または四肢が加熱される。高エネルギーを生成する磁石及びデバイスを、加熱される領域を覆うように配置する。灌流と称される別のアプローチでは、患者の血液の一部を取り出し、加熱し、次に内部加熱するべき領域に送り込む（灌流する）。全身加熱は、身体の至る所に拡散している転移性がんを処置するために使用される。これは、温水ブランケット、ホットワックス、誘導コイル（電気ブランケットにおけるもののような）、またはサーマルチャンバ（大型インキュベータに類似）を使用して実現され得る。温熱療法は、放射線の副作用または合併症の顕著な増加を引き起こさない。しかし、皮膚に直接的に熱を加えると、処置を受けた患者の約半数において不快感またはさらには重大な局所的な痛みを引き起こし得る。また、一般的に急速に治癒する水疱も引き起こし得る。
さらに他の実施形態では、光線力学療法（ＰＤＴ、光放射線療法、光線療法、または光化学療法とも呼ばれる）が、いくつかのタイプのがんの処置に使用される。これは、光増感剤として知られるある特定の化学物質が、単細胞生物を特定のタイプの光に曝露した場合に、この単細胞生物を殺傷できるという発見に基づく。ＰＤＴは、固定周波数のレーザー光を光増感剤と組み合わせて使用することにより、がん細胞を破壊する。ＰＤＴでは、光増感剤は血流中に注入され、全身の細胞によって吸収される。この作用物質は、正常細胞よりも長い期間にわたってがん細胞に留まる。処置されたがん細胞がレーザー光に曝露されると、光増感剤が光を吸収し、処置されたがん細胞を破壊する活性型の酸素を生成する。
なおも他の実施形態では、レーザー治療を使用して、高輝度光を利用してがん細胞を破壊する。この技術は、特に他の処置ではがんを治癒できない場合に、出血または閉塞などのがんの症状を緩和するために使用されることが多い。また、腫瘍を縮小または破壊することによってがんを処置するために使用され得る。「レーザー」という用語は、放射線の誘導放出による光増幅を表す。電球からの光などの通常の光は、多くの波長を有し、全方向に広がる。一方、レーザー光は特定の波長を有し、狭いビームに集束する。このタイプの高輝度光は多くのエネルギーを含有する。次に、レーザー光が腫瘍の温度を上昇させ、これによりがん細胞を損傷または破壊する。
治療に伴う処置の期間及び／または用量は、特定の治療剤またはそれらの組み合わせに応じて変動し得る。特定のがん治療剤の適切な処置時間は、当業者によって理解されるだろう。本発明は、各がん治療剤に関する最適な処置スケジュールの継続的な評価を企図しており、本発明の方法によって決定される対象のがんの表現型は、最適な処置用量及びスケジュールを決定する因子である。
他の実施形態では、組み換えバイオマーカーポリペプチド、及びその断片を、対象に投与することができる。一部の実施形態では、増強された生物学的特性を有する融合タンパク質を構築及び投与することができる。加えて、バイオマーカーポリペプチド、及びその断片は、生物学的利用能の増加及びタンパク質分解の低減などの所望の生物学的活性をさらに増強するために、当該技術分野で周知の薬理学的方法（例えば、ペグ化、グリコシル化、オリゴマー化など）に従って修飾することができる。
ＩＶ．処置方法
本明細書に記載の治療用組成物は、本明細書に記載の製剤及び／または組み合わせを使用して、様々なインビトロ及びインビボ治療用途において使用することができる。様々な実施形態では、治療剤は、それに応答すると決定されたがんを処置するために使用することができる。
本発明の調節方法は、細胞、例えば免疫細胞を、かかる１つまたは複数のバイオマーカー及び免疫療法の拡大及び／または活性を阻害するまたは遮断する作用物質、例えば免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１）と接触させることに関与する。かかる方法において有用な例示的な作用物質は、上に記載する。かかる作用物質は、インビトロまたはエクスビボで（例えば、細胞を作用物質と接触させることによって）、またはあるいは、インビボで（例えば、作用物質を対象に投与することによって）投与することができる。したがって、本発明は、感染症または結腸直腸癌のようながんなどの免疫応答の増加から利益を得ることになる状態に罹患している個体を処置するために有用な方法を提供する。
免疫応答を上方制御する作用物質は、既存の免疫応答を増強するまたは最初の免疫応答を惹起するという形態であることができる。ゆえに、主題の組成物及び方法を使用して免疫応答を増強することは、がんの処置に有用であるが、感染性疾患（例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫）、寄生虫感染症、及び免疫抑制疾患の処置にも有用であることができる。
例示的な感染性障害には、ウイルス性皮膚疾、例えばヘルペスまたは帯状疱疹が含まれ、その場合、かかる作用物質は、皮膚に局所的に送達することができる。加えて、全身性ウイルス性疾患、例えばインフルエンザ、風邪、脳炎は、かかる作用物質の全身投与によって軽減され得る。例えば、本明細書に記載の免疫応答を上方制御する作用物質は、寄生虫に対する防御免疫応答を促進するための、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ感染中のアルギナーゼ／ｉＮＯＳバランスの調節に有用である。
免疫応答は、例えば、患者から免疫細胞を除去し、インビトロで免疫細胞を本明細書に記載の作用物質と接触させ、インビトロで刺激した免疫細胞を患者に再導入することにより、エクスビボアプローチを通して感染患者においても増強することができる。
ある特定の例では、免疫応答をさらに増大するために、免疫応答を上方制御する他の作用物質、例えば、共刺激受容体を介してシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーメンバーの形態をさらに投与することが望ましくあり得る。かかる追加の作用物質及び治療は、下でさらに記載する。
免疫応答を上方制御する作用物質は、様々なポリペプチド（例えば、病原体に由来するポリペプチド）に対するワクチンにおいて予防的に使用することができる。病原体（例えば、ウイルス）に対する免疫は、適切なアジュバントにおいて、免疫応答を上方制御する作用物質とともにウイルスタンパク質をワクチン接種することによって誘導することができる。
加えて、本明細書に記載するような、免疫応答機能の上方制御または増強は、腫瘍免疫の誘導において有用である。
さらに、免疫応答は、既存の寛容性、クローン欠失、及び／または疲弊（例えば、Ｔ細胞疲弊）が克服されるように、本明細書に記載の方法によって刺激することができる。例えば、対象が有意な免疫応答を開始することができない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する免疫応答は、免疫応答を上方制御する本明細書に記載の適切な作用物質を投与することにより誘導することができる。同様に、腫瘍特異的抗原などの自己抗原を同時投与することができる。加えて、主題の組成物は、能動免疫獲得の過程で外来抗原に対する応答を高めるためのアジュバントとして使用することができる。
ある特定の実施形態では、免疫細胞を、対象から取得し、本明細書に記載のような作用物質の存在下、エキソビボで培養して、免疫細胞の集団を拡大する及び／または免疫細胞活性化を増強する。次に、免疫細胞は対象に投与され得る。免疫細胞は、例えば、免疫細胞に一次活性化シグナル及び共刺激シグナルを提供することによって、インビトロで刺激することができ、これは当該技術分野で公知である。免疫細胞の増殖を共刺激するために、様々な作用物質を使用することもできる。免疫細胞は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４３６に記載の方法に従って、エクスビボで培養され得る。共刺激ポリペプチドは、可溶性である、細胞膜に付着する、またはビーズなどの固体表面に付着することができる。
Ｖ．作用物質の投与
本発明の免疫調節剤は、対象に、免疫細胞媒介性免疫応答を増強するために、インビボでの医薬的投与に好適な生物学的に適合可能な形態で投与される。「インビボでの投与に好適な生物学的に適合可能な形態」とは、任意の毒性効果を治療効果が上回る、投与される形態を意味する。「対象」という用語は、免疫応答を惹起することができる生物、例えば、哺乳動物を含むことを意図している。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。本明細書に記載するような作用物質の投与は、治療的に活性な量の作用物質単独または医薬的に許容可能な担体との組み合わせを含めた、任意の薬理学的形態であることができる。
本発明の治療用組成物の治療的に活性な量の投与は、所望の結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量として定義される。例えば、作用物質の治療的に活性な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびにペプチドが個体において所望の応答を惹起する能力によって変動し得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するように調節できる。例えば、いくつかに分割された用量を毎日投与できる、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例して低下させることができる。
本明細書に記載の治療剤は、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与などの好都合な様式にて投与することができる。投与経路に応じて、活性化合物は、化合物を、酵素、酸及び化合物を不活化し得る他の天然条件の作用から化合物を保護するために材料内にコーティングされることができる。例えば、非経口投与以外による作用物質の投与の場合、作用物質を、その不活性化を防ぐための物質でコーティングする、またはこれと同時投与することが望ましくあり得る。
作用物質は、個体に、適切な担体、希釈剤またはアジュバント内で投与できる、酵素阻害剤と同時投与できる、またはリポソームなどの適切な担体内で投与できる。医薬的に許容可能な希釈剤には、生理食塩水及び緩衝水溶液が含まれる。アジュバントはその最も広義で使用され、インターフェロンなどの任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書で企図されるアジュバントには、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＥＰ）及びトラシロールが含まれる。リポソームには、水中油中水型エマルジョンならびに従来のリポソームが含まれる（Ｓｔｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
下記で詳細に述べるように、本発明の医薬組成物は、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得、それには以下：（１）経口投与、例えば、飲薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸薬、粉末、顆粒、ペースト剤；（２）非経口投与、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液として、例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射による；（３）局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏もしくはスプレー；（４）膣内もしくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリームもしくは発泡体；または（５）エアロゾル、例えば、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物もしくは固体粒子、に適応するものが含まれる。
本明細書で採用される「医薬的に許容可能」という語句は、健全な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比を伴って、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適である、作用物質、材料、組成物、及び／または剤形を指す。
「医薬的に許容可能な担体」という語句は、本明細書で使用する場合、主題の化学物質を１つの臓器または身体部分から別の臓器または身体部分へと運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填材、希釈剤、賦形剤、溶剤または封入材料などの、医薬的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合可能である、及び患者に有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。医薬的に許容可能な担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、以下：（１）糖、例えばラクトース、グルコース、及びスクロース；（２）デンプン、例えばコーンデンプン及びジャガイモデンプン；（３）セルロース、及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバター及び坐剤ワックス；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロゲンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝剤；ならびに（２１）医薬製剤に採用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。
湿潤剤、乳化剤ならびに潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤ならびに抗酸化剤も組成物中に存在することができる。
医薬的に許容可能な抗酸化剤の例としては、以下：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロシキトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなど；及び（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本発明の方法において有用な製剤は、経口、経鼻、局所（バッカル及び舌下を含む）、直腸、経膣、エアロゾル及び／または非経口投与に好適なものを含む。本製剤は、単位剤形で好都合に存在し得、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主、投与の特定の様式に依存して変動するだろう。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を産生する化合物の量であるだろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、活性成分が約１％～約９９％、好ましくは約５％～約７０％、最も好ましくは約１０％～約３０％の範囲であるだろう。
非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の治療剤を、１つまたは複数の医薬的に許容可能な滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または滅菌注射可能溶液もしく分散液に使用直前に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて含み、これには抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤が含有され得る。
本発明の医薬組成物に採用され得る好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確保され得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含むことも望ましくあり得る。加えて、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる作用物質を含めることによってもたらされ得る。
本発明の治療剤が、医薬品として、ヒト及び動物に投与される場合、それらは、それ自体で、または例えば、医薬的に許容可能な担体と組み合わせて０．１～９９．５％（より好ましくは、０．５～９０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えることができる。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、対象に有毒であることなく、特定の対象、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するのに有効である、活性成分の量を得るように、本発明の方法によって決定され得る。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物の構成要素は、抗体である。本明細書で定義するように、治療有効量の抗体（すなわち、有効投与量）は、約０．００１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１～２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、及びさらにより好ましくは約１～１０ｍｇ／ｋｇ、２～９ｍｇ／ｋｇ、３～８ｍｇ／ｋｇ、４～７ｍｇ／ｋｇ、または５～６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全身健康及び／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれに限定されない、ある特定の因子が対象を有効に処置するために必要な投薬量に影響を及ぼし得ることを理解するだろう。さらに、治療有効量の抗体を用いた対象の処置は、単一の処置を含むことができる、または好ましくは、一連の処置を含むことができる。好ましい例では、対象は、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体で、週１回、約１～１０週間、好ましくは２～８週間、より好ましくは約３～７週間、さらにより好ましくは約４、５、または６週間処置される。処置に使用される抗体の有効投薬量は、特定の処置の過程にわたって増加または低減し得ることも理解されるだろう。投薬量における変化は、診断アッセイの結果からもたらされ得る。
本発明の治療用組成物は、公知の抗酸化剤、緩衝剤、及び他の作用物質、例えば着色剤、香味料、ビタミンまたはミネラルも含み得る。
実施例１：実施例２～１０に関する材料及び方法
細胞株、試薬、及び抗体
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ １６４０を、ヒトＮＫ細胞及び単球の培養に使用した。ＯＳＣＣ及び幹様ＯＳＣＳＣは、ＵＣＬＡで口腔癌患者の舌腫瘍から単離し、１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１．４％抗生物質抗真菌剤、１％ピルビン酸ナトリウム、１．４％非必須アミノ酸、１％Ｌ－グルタミン、０．２％ゲンタマイシン（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及び０．１５％重炭酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＡ，ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ １６４０で培養した。Ｍｉａ－Ｐａｃａ－２（ＭＰ２）は、１０％ＦＢＳならびに１％ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭで培養した。組み換えＩＬ－２は、ＮＩＨ－ＢＲＢから取得した。組み換えＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から取得した。抗ＭＨＣクラスＩを調製し、１：１００希釈が使用に最適な濃度であることを見出した。ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ５４、抗ＣＤ４４、抗Ｂ７Ｈ１、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から取得した。ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに対する抗体は、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅのＤｒ．Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｗｕから寛大にも譲り受けた。ヒトＮＫ及び単球精製キットは、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）から取得した。
ヒト末梢血からのＮＫ細胞及びＴ細胞の精製
ＵＣＬＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認された書面によるインフォームドコンセントを、健康な血液ドナーから取得し、全ての手順はＵＣＬＡ－ＩＲＢによって承認された。フィコール－ハイパック遠心分離を使用して末梢血を分離した後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する白い曇った層を回収し、洗浄し、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）に再懸濁し、プラスチック組織培養皿にプレーティングした。１～２時間のインキュベーション後、非接着性の、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を収集した。それぞれＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）から購入した、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＮＫ細胞富化キット及びＴ細胞単離キットを使用して、ＮＫ細胞を負に選択し、ＰＢＬから単離した。単離したＮＫ細胞を、それぞれ、抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して細胞の純度を測定した。精製ＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）、１％抗生物質／抗真菌剤、１％ピルビン酸ナトリウム、及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ培地１６４０で培養した。
ＮＫ細胞の拡大
ヒト精製ＮＫ細胞及びｈｕ－ＢＬＴ富化ＮＫ細胞は、ｒｈ－ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３ｕｇ／ｍｌ）で１８～２０時間活性化してから、それらを、フィーダー細胞及びｓＡＪ２と共培養した。培養培地は、ｒｈ－ＩＬ－２で３日ごとに再び新しくした［４３］。
幹細胞分化に使用したＮＫ細胞上清
上記のように、ヒトＮＫ細胞は、健康なドナーのＰＢＭＣから精製した。ＮＫ細胞を、抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）及びＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）の組み合わせで１８時間処理してから、上清を除去し、分化実験に使用した。活性化ＮＫ細胞によって産生されたＩＦＮ－γの量は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価した。ＯＳＣＳＣは、ＮＫ細胞上清の量を漸増させながら毎日徐々に加えることで分化させた。平均して、分化を誘導するために、合計３，５００ｐｇのＩＦＮ－γ含有上清を５日間加えて、ＯＳＣＳＣＳの分化及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性を誘導し、合計７０００ｐｇのＩＦＮ－γ含有上清を７日間加えて、ＭＰ２の分化及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性を誘導した。その後、標的細胞をＰＢＳで洗浄し、剥離して実験に使用した。
ＮＫ細胞をメカブエで処理する
メカブエ海藻から抽出したフコイダンは、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃから購入した。１２．５ｇのメカブエ抽出フコイダン（メカブエ）を、１ｍｌのＰＢＳ．１に溶解し、次に培養物に加えた。
ＡＪ２を超音波処理する
ＡＪ２を秤量し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にて１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地１６４０に再懸濁した。細菌を完全にボルテックスし、次に氷上で１５秒間、６～８振幅で超音波処理した。次に、超音波処理した試料を、氷上で３０秒間インキュベートした。５パルスごとに、試料を採取して、細胞壁の少なくとも８０％が溶解するまで、顕微鏡下で観察した。完全な超音波処理を達成するために、氷上でおよそ２０ラウンドの超音波処理／インキュベーションが実施されたことが決定された。最後に、超音波処理した試料（ｓＡＪ２）を分注し、－８０℃の冷凍庫にて保管した。
破骨細胞の生成
破骨細胞は、ＰＢＭＣ精製単球から生成し、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）（２５ｎｇ／ｍＬ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地にて２１日間培養した。１４培地を、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）を含有する新鮮なアルファ－ＭＥＭで、３日ごとに再び新しくした。
ＡＤＣＣ誘導
標的細胞（５×１０５個）を、５０μＣｉ５１Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で標識し、１時間クロメート処理した。インキュベーション後、標的細胞を１回洗浄して、過剰な未結合５１Ｃｒを除去した。細胞を、１×１０６／ｍＬに再懸濁し、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体またはセタキシマブ（３μｇ／ｍＬ）で処理し、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、標的細胞を再び洗浄して、過剰な未結合抗体及び５１Ｃｒを除去した。標識標的細胞を、エフェクター細胞と培養し、標的細胞に対する細胞傷害性を、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイを使用して評価した。
５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ
５１Ｃｒは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から購入した。標準的な５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイを使用して、実験培養物におけるＮＫ細胞の細胞傷害性機能を決定した。エフェクター細胞（１×１０５個の細胞／ウェル）を、９６ウェル丸底マイクロウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に分注し、４～８段階希釈で滴定した。標的細胞（５×１０５個）を、５０μＣｉ５１Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で標識し、１時間クロメート処理した。インキュベーション後、標的細胞を２回洗浄して、過剰な未結合５１Ｃｒを除去した。５１Ｃｒ標識標的細胞を、エフェクター細胞を１×１０４個の細胞／ウェルの濃度にて上位エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比５：１で含有する９６ウェル丸底マイクロウェルプレートに分注した。プレートを、遠心分離し、４時間インキュベートした。４時間のインキュベーション期間の後、上清を各試料から回収し、ガンマカウンターを使用して放出された放射能を計算した。総（５１Ｃｒ標識標的細胞を含有する）及び自発的（標的細胞のみの上清）放出値を測定し、特異的細胞傷害性率（％）を計算するために使用した。特異的細胞傷害性率（％）を、以下の式：を使用して計算した。
細胞傷害性率（％）＝［実験ｃｐｍ－自発ｃｐｍ］／［総ｃｐｍ－自発ｃｐｍ］を使用して計算した。Ｌｕ３０／１０６は、標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なエフェクター細胞の数の逆数を使用することにより計算される。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＩＦＮ－γに関するＥＬＩＳＡキットは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＥＬＩＳＡを行って、細胞培養物から産生されたＩＦＮ－γのレベルを検出した。アッセイは、製造元のプロトコルに記載の通りに実施した。簡潔には、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートを、標的サイトカインに対応する希釈した捕捉抗体でコーティングし、一晩４℃にてインキュベートした。１６～１８時間のインキュベーション後、プレートを洗浄１８バッファー（１×ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄し、アッセイ希釈液（１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）でブロックした。プレートを、１時間室温にて、プレートシェーカー上２００ｒｐｍでインキュベートした；インキュベーション後、プレートを４回洗浄した。次に、１００μＬの標準液及び各培養物から収集した試料をウェルに加え、２時間室温にて、プレートシェーカー上２００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、プレートを４回洗浄し、検出抗体をロードし、１時間室温にて、プレートシェーカー上２００ｒｐｍでインキュベートした。１時間のインキュベーション後、プレートを４回洗浄した；ウェルに、アビジン－ＨＲＰ溶液をロードし、３０分間室温にて、プレートシェーカー上２００ｒｐｍでインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した後；１００ｕＬのＴＭＢ基質溶液をウェルに加え、プレートを暗所で所望の青色になるまで（または最大３０分間）インキュベートした。次に、１００μＬの停止溶液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）をウェルごとに加えて、反応を停止させた。最後に、プレートを、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取り、吸光度値を得た（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＥＬＩＳＡマニュアル）。
表面染色
各条件から１×１０５個の細胞を、実験で詳述したように、所定の最適濃度のＰＥコンジュゲート抗体で１００μＬの冷１％ＢＳＡ－ＰＢＳにて染色し、４℃にて３０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁した。Ｅｐｉｃｓ Ｃ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメーターを、細胞表面分析に使用した。
統計学分析
実験計画に応じて異なる群を比較するために、対応のないまたは対応のある両側スチューデントのｔ検定を行った。ｐ値は、以下のように図内で表した：＊＊＊ｐ値＜０．００１、＊＊ｐ値：０．００１～０．０１、＊ｐ値：０．０１～０．０５。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを分析した。
実施例２：ＮＫ細胞は、未分化／幹様の口腔腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞に対して、それらの分化区画と比較して、より高い細胞傷害性を媒介する。
ＯＳＣＳＣ及びＭＰ２は、ＣＤ４４の発現が高く、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＩＣＡ及びＣＤ５４の発現が低いことを示した一方で、それらの分化区画では逆のプロファイルが見られた。ＯＳＣＳＣ、及びＭＰ２を分化させるために、実施例１に記載する通りに、腫瘍細胞をスプリットアネルギー化ＮＫ細胞からの上清で処理した。スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いたＯＳＣＳＣ及びＭＰ２の処理は、ＣＤ４４表面発現を低減させ、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＩＣＡ及びＣＤ５４表面発現を増加させた（図１Ａ及び１Ｂ）。ＮＫ細胞は、分化した口腔扁平上皮癌細胞（ＯＳＣＣ）及び膵臓腫瘍細胞（ＰＬ１２）と比較した場合、口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）、及び未分化／幹様膵臓腫瘍細胞（ＭＰ２）に対してはるかに高い細胞傷害性を媒介した。（図１Ｃ及び１Ｄ）。スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いたＯＳＣＳＣの処理は、ＩＬ－２処理ＮＫ細胞媒介性溶解に対するそれらの感度を有意に低減させた。
実施例３：分化した膵臓腫瘍及び口腔腫瘍は、それらの未分化区画と比較して、より高いレベルのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現した。
ＯＳＣＳＣ及びＭＰ２は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの発現を低いことを示した一方で、その分化区画、ＯＳＣＣ及びＰＬ１２では逆のプロファイルが見られた。スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いたＯＳＣＳＣ及びＭＰ２の処理は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ表面発現を増加させ、高分化腫瘍が、未分化／幹様の口腔腫瘍及び膵臓腫瘍と比較して、より高いレベルのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現することを示している（図２）。
実施例４：ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体は、ＯＳＣＣに対するＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを増加させた一方で、ＯＳＣＳＣは標的とされなかった。
高レベルのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現する分化腫瘍細胞及び低レベルのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現するそれらの未分化区画に対する、ＮＫ細胞における抗体依存性媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を研究するために、ＮＫ細胞を、健康なドナーから精製した。ＮＫ細胞は、未処理のままにした、ＩＬ－２で処理した、またはＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせで処理した。未処理またはＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに対する抗体で処理したＯＳＣＳＣ及びＯＳＣＣに対するそれらの細胞傷害性を、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。未処理及びＩＬ－２処理ＮＫ細胞は、未処理ＯＳＣＣＳと比較して、抗ＭＩＣＡ／Ｂ処理ＯＳＣＣＳに対してより高い細胞傷害性を媒介した（図３Ａ）。抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ処理ＯＳＣＣに対する細胞傷害性における増加倍数は、未処理ＯＳＣＣよりも、未処理（平均＝６．９倍増加）及びＩＬ－２処理ＮＫ（平均＝３．１倍増加）で有意に高かった（図３Ｃ及び３Ｄ）一方で、未処理及び抗ＭＩＣＡ／／Ｂ処理ＯＳＣＳＣＳに対する未処理及びＩＬ－２処理ＮＫ細胞の細胞傷害性における差は、有意差ではなかった（図３Ｂ～３Ｄ）。ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせで処理したＮＫ細胞は、ＯＳＣＳＣ及びＯＳＣＣＳに対して有意なレベルのＡＤＣＣを媒介しなかった。（図３Ａ～３Ｄ）。
実施例５：ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体は、ＰＬ１２に対するＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを増加させた一方で、ＭＰ２細胞は標的とされなかった。
膵臓腫瘍において同じ所見を見ることができることをさらに確認するために、実施例４における同じ実験を、ＭＰ２及びＰＬ１２で実施した。抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ処理ＰＬ１２に対する細胞傷害性は、未処理ＰＬ１２よりも未処理ＮＫで５５倍、ＩＬ－２処理ＮＫで４．３倍高かった。（図４Ｃ及び４Ｄ）一方、未処理及び抗ＭＩＣＡ／Ｂ処理ＭＰ２に対する細胞傷害性における差は有意ではなかった。
実施例６：スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いたＯＳＣＳＣの分化が、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体を通したＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに対するそれらの感受性をもたらす。
スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いたＯＳＣＳＣ及びＭＰ２の処理は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを含む分化マーカーの表面発現を増加させる。スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いて口腔腫瘍及び膵臓腫瘍を分化させることにより、それらがＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに感受性になるか否かを決定するために、ＯＳＣＳＣ、及びＭＰ２を、実施例１に記載の通りに分化させ、未処理及びＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ処理未分化、スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清分化、及び未分化／幹様の口腔腫瘍及び膵臓腫瘍に対する、未処理及びＩＬ－２処理ＮＫ細胞の細胞傷害性を測定した。未処理及びＩＬ－２処理ＮＫ細胞は、ＯＳＣＣＳ及びＰＬ１２に対するＡＤＣＣを媒介した（図５Ａ及び５Ｄ）。未分化ＯＳＣＳＣ及びＰＬ１２は、ＩＬ－２処理ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に高度に感受性であった一方で、それらの上清分化区画に対する細胞傷害性は、ＯＳＣＳＣにおいて４倍の低減及びＭＰ２において６７倍の低減を示した。ＩＬ－２処理ＮＫ細胞は、未処理腫瘍と比較して、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ処理分化ＯＳＣＳＣ及びＭＰ２に対してより高いレベルの細胞傷害性を示した一方で、ＡＤＣＣ媒介性溶解は、ＭＰ２またはＯＳＣＳＣに対して発生しなかった（図４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、及び４Ｆ）。これは、スプリットアネルギー化ＮＫ細胞上清を用いたＯＳＣＳＣ及びＭＰ２の分化が、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体を通してそれらをＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに感受性にすることを示している。
実施例７：ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現する分化口腔腫瘍と培養した場合、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を増加させた。
抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体が、ＩＦＮ－γの分泌を増加させることができるか否かを決定するために、ＮＫ細胞を、未処理または抗ＭＩＣＡ／ＭＣＢ処理ＯＳＣＣ及びＯＳＣＳＣと培養した。未処理ＮＫ細胞は、腫瘍細胞との共培養の有無にかかわらず、ＩＦＮ－γ分泌を誘導しなかった。本発明者らが以前に示したように、ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせは、ＮＫ細胞による最高レベルのＩＦＮ－γを誘導した。ＩＬ－２処理ＮＫ細胞を、ＯＳＣＣ及びＯＳＣＳＣと共培養すると、対照群（ＮＫ細胞のみ、腫瘍無し）と比較してより高いレベルのＩＦＮ－γを分泌し、ＯＳＣＳＣはＯＳＣＣよりも多くのＩＦＮ－γの分泌を引き起こした。ＩＬ－２処理ＮＫ細胞を、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ処理ＯＳＣＣと培養した場合、それらは未処理ＯＳＣＣと培養したＮＫ細胞よりも多くのＩＦＮ－γを分泌した一方で、未処理ＯＳＣＳＣ及び抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ処理ＯＳＣＣと共培養したＮＫ細胞において分泌されたＩＦＮ－γは、有意差はなかった。同じ傾向が、３つの異なる別々の実験で見られた（図８Ａ～８Ｃ）。ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせで処理したＮＫ細胞によって分泌されたＩＦＮ－γの量は、未処理及び抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体処理ＯＳＣＣ及びＯＳＣＳＣＳにおいて有意差はなかった。
実施例８：拡大ＮＫ細胞は、未分化腫瘍細胞及び分化腫瘍細胞の両方を標的とする一方で、初代ＮＫ細胞は、未分化／幹様集団を優先的に標的とする。
スーパーチャージドＮＫ細胞（「拡大ＮＫ細胞」）は、高い細胞傷害性及びサイトカイン分泌能力の両方を有する。初代ＮＫ細胞及びスーパーチャージドＮＫ細胞の機能及び表面発現を比較すると、それらは異なる特徴を示す。スーパーチャージドＮＫ細胞は、未分化腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を有するが、分化腫瘍に対するそれらの機能は研究されなかった。分化腫瘍細胞及び未分化腫瘍細胞に対する初代ＮＫ及び拡大ＮＫの細胞傷害性を比較するために、ＮＫ細胞を１５日間拡大させ、ＯＳＣＣ、ＯＳＣＳＣＳ、ＰＬ１２及びＭＰ２に対するそれらの細胞傷害性を測定した。未分化腫瘍細胞は、分化区画と比較して、初代ＮＫ細胞媒介性溶解に対してより感受性であったが、同じドナーからの拡大ＮＫ細胞は、分化腫瘍細胞及び未分化腫瘍細胞の両方を有意に標的とすることができた。拡大ＮＫ細胞の細胞傷害性は、初代ＮＫ細胞と比較して、ＯＳＣＣに対して３～１５倍高く、ＰＬ１２に対して４．７倍高かった。
実施例９：ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６の組み合わせ処理は、初代ＮＫ細胞ではスプリットアネルギーを誘導するが、スーパーチャージドＮＫ細胞では誘導しない。
ＮＫ細胞成熟の１つのステージは「スプリットアネルギー」と命名され、サイトカインの有意な分泌の存在下でのＮＫ細胞細胞傷害性の低下を示す。ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いたＮＫ細胞の処理は、初代ＮＫ細胞においてスプリットアネルギーを誘導できる。ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ処理の組み合わせが、拡大ＮＫにおいて細胞傷害性を低減し得るか否かを決定するために、健康なドナーから新たに精製したＮＫを拡大した。１５日間培養した後、同じドナーからＮＫ細胞を精製し、初代ＮＫ細胞及び拡大ＮＫ細胞を、ＩＬ－２ならびにＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせで１８時間処理し、ＯＳＣＳＣに対するそれらの細胞傷害性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定した。ＯＳＣＳＣに対するＩＬ－２及び抗ＣＤ１６処理初代ＮＫ細胞の細胞傷害性が、２．４～４．９倍低減する一方で、ＩＬ－２及び抗ＣＤ１６処理拡大ＮＫ細胞の拡大における細胞傷害性は、ＩＬ－２処理拡大ＮＫとほぼ同じであった（図８）。
実施例１０：初代ＮＫ細胞は、拡大ＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介する。
ＣＤ１６は、拡大ＮＫ細胞上で下方調節される。ＡＤＣＣを媒介する拡大ＮＫ細胞の能力を研究するために、同じドナーからの、初代ＮＫ細胞及び拡大ＮＫ細胞の１５日目の細胞傷害性を、未処理、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体処理、及びセタキシマブ処理ＯＳＣＣに対して測定した。未処理及びＩＬ－２処理初代ＮＫ細胞が、未処理腫瘍よりも抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体及びセタキシマブ処理ＯＳＣＣに対してより高いレベルの細胞傷害性を媒介した一方で、拡大ＮＫ及びＩＬ２再活性化ＮＫ拡大ＮＫ細胞は、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体またはセタキシマブ処理ＯＳＣＣに対してＡＤＣＣを媒介しなかった。（図９Ａ、９Ｂ、９Ｄ及び９Ｅ）。実験を、ＰＬ１２腫瘍を用いて繰り返した場合、同じ結果が見られた（図９Ｄ）。ＩＬ－２処理及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせで処理された初代ＮＫ細胞及び拡大ＮＫ細胞は両方とも、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体処理ＯＳＣＣ及びＰＬ１２に対してＡＤＣＣを媒介することができなかった（図９Ｃ及び９Ｆ）。
実施例１１：各ＡＪ２プロバイオティクス細菌及びメカブエから抽出されたＤ－フコイダンを用いたＮＫ細胞の処理は、ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ分泌能力を増加させたが、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性は上昇させなかった。
ＮＫ細胞により分泌されるＩＦＮ－γは、腫瘍細胞の分化において重要な役割を有する。ＩＦＮ－γのＮＫ細胞媒介性産生を増加させるための戦略を検討するために、ＮＫ細胞の機能に対するフコイダン及びＡＪ２プロバイオティクス細菌の効果を研究した。ＮＫ細胞機能に対するフコイダンの効果を研究するために、健康なドナーからの精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－２、及びメカブエとして公知であるＵｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａから抽出された様々な濃度のＤ－フコイダンで２４時間処理した。メカブエを用いたＮＫ細胞の２４時間にわたる処理は、そのＩＦＮ－γを分泌する能力を有意に増加させたが、その細胞傷害性を低減させ、ＮＫ細胞をスプリットアネルギーとして知られるステージに押し上げた（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
ＮＫ細胞の機能に対するＡＪ２プロバイオティクス細菌の効果を研究するために、精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－２で１８時間処理し、それらをＡＪ２プロバイオティクス細菌で２４時間処理した。ＡＪ２を用いて活性化されたＮＫ細胞は、より高いレベルのＩＦＮ－γを誘導した一方で、細胞傷害性を媒介する能力は変化しなかった。（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。
実施例１２：ＡＪ２プロバイオティクス細菌及びメカブエは、ＩＬ２処理ＮＫ細胞においてＩＦＮ－γ分泌を相乗的に誘導することができる。
ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ誘導に対するＡＪ２及びメカブエの相乗効果を研究するために、健康なドナーからの精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－２で１８時間処理し、次にそれらを、未処理のままにした、ＡＪ２もしくはメカブエ、またはその両方で処理した。培養物からの上清を、２４時間後に収集し、ＩＦＮ－γを測定した。ＡＪ２またはメカブエで処理したＮＫ細胞は、対照群と比較して有意に高いレベルのＩＦＮ－γを誘導する（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＡＪ２及びメカブエの組み合わせは、対照及びＡＪ２またはメカブエのみで処理したＮＫ細胞と比較して、より高いＩＦＮ－γを有意に誘導した。（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
ＮＫ細胞は、鍵となる分化抗原の発現が低い低分化細胞または幹細胞を標的とする。腫瘍の成熟及び分化のステージと、ＮＫ細胞媒介性溶解に対する感度との間の関連性が、本研究において発見されている。本明細書では、幹様／低分化の口腔腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対して有意に高く感受性であったのに対し、それらの分化した対応物は、有意により耐性であったことを実証している。さらに、本明細書では、スプリットアネルギー化ＮＫ細胞からの上清を用いてインビトロで分化した、分化口腔、膵臓腫瘍細胞、及びがん幹細胞／低分化腫瘍細胞が、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に耐性を有するようになったことを実証する。がん幹細胞（ＣＳＣ）／低分化腫瘍細胞とは異なり、患者由来の分化腫瘍細胞及びスプリットアネルギー化ＮＫ上清分化腫瘍細胞の両方が、ＣＤ５４、Ｂ７Ｈ１、及びＭＨＣクラスＩ表面発現の上方制御を呈し、ＣＤ４４発現の低減を実証した。
ＮＫ細胞免疫に関しては、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗原は、それがＮＫＧ２Ｄの周知のリガンドであり、ストレス、損傷、ウイルス感染、または細胞の形質転換時に発現し、細胞傷害性リンパ球を通した「殺して（ｋｉｌｌ ｍｅ）」シグナルとして作用するために、重要な役割を担う。本明細書では、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢが、全ての腫瘍細胞上で上方制御されるわけではないが、細胞の分化ステージと相関していることを実証している。本明細書では、スプリットアネルギー化ＮＫ細胞からの上清を用いてインビトロで分化した、分化口腔、膵臓腫瘍細胞、及びがん幹細胞／低分化腫瘍細胞が、それらの幹様／低分化対応物と比較して、より高いレベルのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現することを、初めて提示する。初代ＮＫ細胞は、幹様／未分化細胞を優先的に標的とする。従って、高分化細胞が、ＮＫ細胞上のアクチベーター受容体のリガンドであるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを高レベルで発現するという驚くべき所見は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢリガンド及びその受容体の新しい役割を示している。幹様／未分化及び高分化の口腔腫瘍及び膵臓腫瘍においてＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ発現のパターンに違いがあったため、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体に基づいてＮＫ細胞がこれらの腫瘍に対してＡＤＣＣを差異的に媒介するか否かを研究した。本明細書では、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体が、スプリットアネルギー化ＮＫ細胞からの上清を用いてインビトロで分化した高分化及びがん幹細胞／低分化腫瘍細胞に対して、ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを増加させた一方で、幹様／未分化は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの発現レベルと相関するＡＤＣＣを通して未処理及びＩＬ－２処理初代ＮＫ細胞によって標的とされなかったことを実証する。ＮＫ細胞を、抗ＣＤ１６ｍＡｂで処理した場合、ＣＤ１６受容体が抗体によってマスクされていたため、ＮＫ細胞はＡＤＣＣを媒介できなかった。本明細書では、幹様／未分化口腔腫瘍細胞ではなく、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現する分化口腔腫瘍と培養した場合に、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体が、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を増加させることをさらに提示する。ＮＫ細胞を、標的細胞及びそれらが提示する抗原に特異的な抗体と培養した場合、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γなどのサイトカインまたはＩＬ－８及びＭＣＰ－１などのケモカインが有意に増強されることが見出された。
本明細書では、直接細胞傷害性及びＡＤＣＣにおける初代ＮＫ細胞及び拡大ＮＫ細胞の機能間の根底的な違いについても表した。ＮＫ細胞は、ＩＬ－２、抗ＣＤ１６ｍＡｂ、及びＡＪ２プロバイオティクス細菌活性化によって、ならびに破骨細胞をフィーダー細胞として使用して拡大させた。この戦略により、高い細胞傷害性及び高レベルのＩＦＮ－γ分泌を有する、「スーパーチャージドＮＫ細胞」と呼ばれるＮＫ細胞がもたらされた。幹様／未分化の口腔腫瘍及び膵臓腫瘍に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を、その高分化対応物と比較すると、拡大ＮＫ細胞は未分化及び分化腫瘍細胞の両方を標的とする一方で、初代ＮＫ細胞は未分化／幹様集団を優先的に標的とすることが発見された。拡大ＮＫ細胞の細胞傷害性は、初代ＮＫ細胞と比較してＯＳＣＣに対して３～１５倍高く、ＰＬ１２に対して４．７倍高く、拡張高分化腫瘍細胞が拡大ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に感度を有するようになることができ、これらの細胞の生物学及びおそらく初代ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性に基づいて異なり得ることを示している。拡大ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞よりも高いレベルのＮＫＧ２Ｄを発現する。上に提示したように、ＮＫＧ２Ｄリガンドの１つであるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢは、高分化細胞上で高度に発現し、これは高レベルのＭＨＣ－Ｉも発現する。それゆえ、拡大ＮＫ細胞が高レベルのＮＫＧ２Ｄを発現するため、ＮＫＧ２Ｄ－ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ媒介性溶解は、拡大ＮＫ細胞における細胞傷害性の主要な機序となり、未分化及び分化腫瘍細胞の両方を標的とすることになる。
スプリットアネルギーと呼ばれるＮＫ細胞における成熟のステージは、ＣＤ１６受容体を含むＮＫ細胞上の様々な受容体を標的にすることにより開始できる。上記のように、ＮＫ細胞をＩＬ－２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂの組み合わせで処理すると、ＩＬ－２処理ＮＫ細胞と比較して、その細胞傷害性は低減するが、ＩＦＮ－γを分泌する能力は有意に増加する。さらに、本明細書では、スプリットアネルギーは初代ＮＫ細胞では発生するが、拡大ＮＫ細胞では発生しないことを提示している。拡大ＮＫ細胞をＩＬ－２及び抗ＣＤ１６の組み合わせで処理しても、その細胞傷害性は低減しなかった。ＣＤ１６は、拡大ＮＫ細胞の表面上で下方制御され、これは、拡大ＮＫ細胞での抗ＣＤ１６処理がそれらをスプリットアネルギーステージに押し進めることができない理由を説明している。ＣＤ１６のレベルは初代ＮＫ細胞及び拡大ＮＫ細胞上で異なるため、初代ＮＫ細胞及び拡大ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣを比較した。ＡＤＣＣのレベルを、未処理及びＩＬ－２処理ＮＫ細胞において、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体及びさらにセタキシマブ（ＥＧＦＲ受容体に対する抗体）で処理した高分化口腔腫瘍に対して測定した場合、初代ＮＫ細胞にもかかわらず、拡大ＮＫ細胞はＡＤＣＣを媒介できず、未処理細胞と比較して、抗体処理腫瘍細胞では、いくらかのレベルの阻害さえ見られた。拡大ＮＫ細胞のＡＤＣＣのレベルが低いのは、その表面上でのＣＤ１６受容体の下方制御によるものである。拡大ＮＫ細胞は、いくらかのレベルのＣＤ１６を発現しするが、ＮＫ細胞がＡＤＣＣを媒介できるようにするためにはより高いレベルのＣＤ１６が必要であり、これは、ＨＩＶ－１感染時に、ＮＫ細胞が低レベルのＣＤ１６を発現し、ＡＤＣＣの低下を呈すると知られている通りである。
ＮＫ細胞エフェクター機能におけるスプリットアネルギーの誘導は、健康な、ならびに形質転換された幹様細胞の分化を誘発する。分化した腫瘍の微小環境は、侵襲性が低くなり、化学療法剤により感受性になるため、腫瘍細胞の分化は、ＮＫ細胞の重要な役割の１つである。ＮＫ細胞によって分泌されるサイトカイン、主にＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αは、がん幹細胞（ＣＳＣ）の分化を担い、ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ５４、Ｂ７Ｈ１、及びＭＩＣＡなどの分化抗原の増加ならびにＣＤ４４の低減をもたらす。従って、口腔癌幹細胞及び膵臓癌幹細胞を、ＩＬ－２及びＣＤ１６で活性化されたＮＫ細胞によって分泌されるＩＦＮ－γに曝露すると、それぞれ分化した腫瘍細胞と同じ分化マーカーの分化の上方制御が生じ、ＮＫ細胞に対する細胞傷害性が失われる。これらの結果及びＡＪ２プロバイオティクス細菌に関する研究は、スプリットアネルギーとして知られる、サイトカイン分泌の有意な増加を誘導するというＮＫ細胞に対してプロバイオティクス細菌が有する意味深い能力を示す。ＡＪ２は、ＩＬ－２またはＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂ処理ＮＫ細胞に加えたときに、ＩＦＮ－γの有意な分泌を誘導する能力のためのプロバイオティクス細菌の８つの菌株の組み合わせである。ｓＡＪ２を作製するために加えられる細菌の比率は、細菌を用いずに細胞をＩＬ－２またはＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂで活性化する場合の、ＩＦＮ－γのＩＬ－１０に対する比率をもたらすように調整した。この比率は、細菌を用いずにＮＫ細胞をＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂで活性化する場合と同様の比率が得られるように確立したが、これは、このＮＫ処理が幹細胞の分化を増加させたためである。抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０は、分化の過程で細胞によって分泌されるかなりの量のＩＦＮ－γのバランスをとるために考慮に入れた。細菌株のこの組み合わせは、ＮＫ細胞により炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインならびに成長因子が最適に誘導されるために選択された。
フコイダンは、硫酸化多糖類であり、様々な種類の褐藻類及び褐海藻から抽出できる。この化合物は、免疫細胞に免疫調節作用を及ぼすことが知られている。研究により、フコイダンが、腫瘍サイズを低減し、抗腫瘍活性を有し、腫瘍誘発マウスにおいて生存率を高めることができることが示されているが、ＮＫ細胞機能に対するフコイダンの正確な役割は、十分に研究されていない。本明細書では、メカブエ抽出フコイダンが、スプリットアネルギー化ＮＫ細胞のプロファイルである、ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ分泌能力を増加させたが、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を低減させたことを提示する。ＮＫ細胞を最高レベルのＩＦＮ－γを分泌させるように後押しする戦略を模索し、本明細書では、ＮＫ細胞媒介性ＩＦＮ－γ分泌に対するメカブエ及びＡＪ２プロバイオティクス細菌の相乗効果を調査した。ＡＪ２またはメカブエで処理したＮＫ細胞は、未処理、ｓＡＪ２、またはメカブエ処理ＩＬ－２処理ＮＫ細胞と比較して、有意に高いレベルのＩＦＮ－γを誘導する。ＮＫ細胞は、トール様受容体（ＴＬＲ）の様々なファミリーを発現する。プロバイオティクス細菌のグラム陽性菌は、細胞壁成分を介してＮＫ細胞ＴＬＲを誘発することができる。ある研究では、Ｂ．ｂｒｅｖｅ及びｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉによるサイトカイン誘導が、ＴＬＲ９の遮断がＰＢＭＣにおけるＩＬ－１０及びＩＦＮ－γの産生を低減させたために、ＴＬＲ９に強く依存することが示された。海藻由来のフコイダンは、ＴＬＲ－２及びＴＬＲ－４の独立したリガンドである。従って、ＮＫ細胞は、ＡＪ２プロバイオティクス細菌及びメカブエの両方の存在下でより高いレベルのＩＦＮ－γを産生する。これは、これらの化合物がＮＫ細胞上のＴＬＲの異なるファミリーを標的とするためである。
結論として、膵臓癌細胞の分化ステージは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性及び鍵となる表面抗原の発現と直接相関していた。ＮＫ細胞による分化は、がん幹細胞／未分化腫瘍細胞の有効な標的化において非常に重要である。ＩＦＮ－γが分化において決定的に重要なルールを担うため、ＮＫ細胞をより高いレベルのＩＦＮ－γを産生するように後押しする処理戦略は、腫瘍を排除する上で決定的に重要なステップである。プロバイオティクスＡＪ２細菌とメカブエ海藻から抽出されたフコイダンの組み合わせは、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γのより高い分泌を引き起こすことができる。分化腫瘍細胞が、幹様／未分化腫瘍細胞よりも高いレベルのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現するため、口腔腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗原発現の特異的なパターンを有する。高分化細胞がより高いレベルのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを発現するため、ＮＫ細胞は、未分化区画よりもこれらの細胞に対してＭＩＣＡ／ＭＩＣＢに特異的な抗体を通してより高いレベルのＡＤＣＣを媒介する。さらに、初代及び拡大ＮＫ細胞は、非常に異なる特徴及び生物学的機能を有する。従って、異なるサブセットＮＫ細胞の全ての多様な機能は、ＮＫ細胞免疫療法アプローチを開発する新しい方法を提供する。
実施例１３：実施例１４～２３に関する材料及び方法
細胞株、試薬、及び抗体
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ １６４０を、ヒトＮＫ細胞、及び口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）の培養に使用した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ １６４０を、ｈｕ－ＢＬＴマウス組織から単離された細胞培養に使用した。ＭｉａＰａＣａ－２（ＭＰ２）、ＰＬ１２、ＢＸＰＣ３、ＨＰＡＦ、及びＣａｐａｎは、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養した。１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭを使用して、ｈｕ－ＢＬＴマウス膵臓から単離された膵臓腫瘍細胞を培養した。組み換えＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）は、ＮＩＨ－ＢＲＢから取得した。本研究で使用したフローサイトメトリー及び他の抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取得した。ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γに対するモノクローナル抗体を調製し、１：１００希釈がブロッキング実験に使用するために最適な濃度であると見出した。２０ｍＭのＮＡＣは、ｐＨ７～７．２の滅菌蒸留水を使用して調製し、ＤＭＥＭ培地を使用して最終濃度が２０ｎＭになるように希釈した。
ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＭＰ２）、ＢＸＰＣ３、ＨＰＡＦ、Ｃａｐａｎは、Ｄｒ．Ｇｕｉｄｏ Ｅｉｂｌ（ＵＣＬＡ Ｄａｖｉｄ Ｇｅｆｆｅｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から寛大に提供され、ＰＬ１２は、Ｄｒ．Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｃａｃａｌａｎｏ（ＵＣＬＡ Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）により提供された。Ｐａｎｃ－１、ＭＰ２及びＢＸＰＣ３は、１０％ＦＢＳ及び２％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭで培養した。ＨＰＡＦ、Ｃａｐａｎ及びＰＬ１２は、１０％ＦＢＳ及び２％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＭＰＩ １６４０培地で培養した。組み換えヒトＩＬ－２は、ＮＩＨ－ＢＲＢから取得した。組み換えヒトＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取得した。ＣＤ１６に対する抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。抗ＭＨＣクラスＩを調製し、１：１００希釈が使用に最適な濃度であることを見出した。フローサイトメトリー用の蛍光色素コンジュゲートヒト及びマウス抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取得した。ＴＮＦ－αに対するモノクローナル抗体は、ＴＮＦ－αハイブリドーマを注射したマウスの腹水から調製し、その後、抗体を精製し、ｒｈ ＴＮＦ－αに対するＥＬＩＳＡ及び機能性アッセイの両方によって特異性を決定した。モノクローナルＩＦＮ－γ抗体を、ウサギにおいて調製し、精製し、ｒＩＦＮ－γに対するＥＬＩＳＡ及び機能性アッセイで特異性を決定した。抗ＴＮＦ－α及び抗ＩＦＮ－γ抗体の１：１００希釈が、ｒｈＴＮＦ－α及びｒｈＩＦＮ－γ機能をブロックするための最適な濃度であることが見出された。ヒトＮＫ、ＣＤ３＋Ｔ細胞及び単球精製キットは、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から取得した。ヨウ化プロピジウム及びＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。シスプラチン及びパクリタキセルは、Ｒｏｎａｌｄ Ｒｅａｇａｎ ＵＣＬＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。
ヒトＮＫ細胞及び単球の精製
ＵＣＬＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認された書面によるインフォームドコンセントを取得し、全ての手順はＵＣＬＡ－ＩＲＢによって承認された。それぞれＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）から購入した、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＮＫ細胞富化キット及び単球単離キットを使用して、ＮＫ細胞及び単球を陰性選択し、ＰＢＭＣから単離した。単離したＮＫ細胞及び単球を、それぞれ、抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ１４抗体で染色し、細胞純度を、フローサイトメトリー分析を使用して測定した。
免疫不全（ＮＳＧ）マウス及びヒト化ＢＬＴマウスにおけるヒト膵臓癌細胞成長の分析
動物研究は、ＵＣＬＡ動物研究委員会（ＡＲＣ）の書面による承認の下で行った。ヒト化ＢＬＴ（ｈｕ－ＢＬＴ；ヒト骨髄／肝臓／胸腺）マウスを、前述の通りに調製した。
膵臓腫瘍のインビボ成長を、８～１０週齢のＮＳＧマウスまたはｈｕ－ＢＬＴマウス膵臓への同所性細胞移植によって行った。同所性腫瘍を確立するために、マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、続いて右下腹部を２ｃｍ切開した。脾臓が露出すると、脾臓の下に膵臓があるため、脾臓を引き出した。滅菌した鉗子を使用して脾臓を保持し、膵臓を露出させた（開腹術）。次に、腫瘍細胞を、膵臓に、２８Ｇ針を備えたインスリンシリンジを使用して、１０μｌ ＨＣマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて直接注射することによって移した。マウスは、腫瘍成長に関して、腹部を触診することによりモニターした。手術の７～１０日後、マウスに、１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を、尾静脈注射を介して投与した。ヒトがプロバイオティクスを摂取するのと同様に、マウスに、ＡＪ２（５０億／用量）を経口摂取させた。初回用量のＡＪ２を、腫瘍移植の１週または２週前に与え、実験全体を通して４８時間ごとに継続した。罹患の兆候が明らかな場合、マウスを安楽死させた。膵臓、膵臓腫瘍、骨髄、脾臓、及び末梢血を、実験の終了時または腫瘍サイズが直径２ｃｍに達したときにマウスから回収した。
免疫不全マウス及びヒト化マウスにおけるヒト口腔癌細胞成長の分析
同所性腫瘍を確立するために、マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、次に口腔腫瘍細胞を、１０μｌ ＨＣマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて直接注射することによって口腔底に注射した。口腔腫瘍注射の７～１０日後、マウスに、１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を、尾静脈注射を介して与えた。ヒトがプロバイオティクスを摂取するのと同様に、マウスに、ＡＪ２（５０億／用量）を経口摂取させた。初回用量のＡＪ２を、腫瘍移植の１週または２週前に与え、実験全体を通して４８時間ごとに継続した。罹患の兆候が明らかな場合、マウスを安楽死させた。末梢血を、実験の終了時または腫瘍サイズが直径２ｃｍに達したときにマウスから回収した。
ｈｕ－ＢＬＴ及びＮＳＧマウスからの組織の細胞解離及び細胞培養
ＮＳＧ及びｈｕ－ＢＬＴマウスから回収した膵臓及び／または膵臓腫瘍を、直ちに１ｍｍ３片に切断し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ、１０Ｕ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ Ｉ、及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する消化バッファーを含むＤＭＥＭ培地に入れて、２０分間３７℃のオーブンにて１５０ｒｐｍのシェーカー上でインキュベートした。消化後、試料を、４０ｍｍセルストレーナーを通して濾過し、１５００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心分離した。ペレットを、ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、細胞を計数した。ＢＭから単一細胞懸濁液を取得するために、大腿骨を両端から切り取り、ＲＰＭＩ培地を使用して一端から他端に洗い流し、ＢＭ細胞を、４０ｍｍセルを通して濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を取得するために、脾臓を大きな断片がなくなるまで粉砕し、試料を、４０ｍｍセルを通して濾過し、１５００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。ペレットを、ＡＣＫバッファーに再懸濁して、赤血球を２～５分間除去した後、ＲＭＰＩ培地に再懸濁し、１５００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン処理された血液検体のフィコール－ハイパック遠心分離を使用して単離した。ＰＢＭＣを含有するバフィーコートを回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
ｈｕ－ＢＬＴマウスからのＮＫ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、及び単球の精製
ｈｕ－ＢＬＴマウス脾細胞からのＮＫ細胞を、ヒトＣＤ５６＋選択キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｎａｄａ）を使用して単離した。ｈｕ－ＢＬＴマウスＢＭ細胞からの単球を、ヒトＣＤ１４単離キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＢＭから正に選択した。単離したＮＫ細胞及び単球を、それぞれ、抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ１４抗体で染色し、細胞純度を、フローサイトメトリー分析を使用して測定した。
破骨細胞の生成ならびにヒトＮＫ細胞及びｈｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞の拡大
ヒト末梢血及びｈｕ－ＢＬＴマウスＢＭ細胞の両方からの精製単球を、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）を含有するアルファ－ＭＥＭ培地で２１日間培養した、または別途指定した。培地は、Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを含有する新鮮なアルファ－ＭＥＭで３日ごとに再び新しくした。ヒト精製ＮＫ細胞及びｈｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞を、ｒｈ－ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３ｕｇ／ｍｌ）で１８～２０時間活性化してから、それらを、破骨細胞及び超音波処理したＡＪ２と共培養し、ＮＫ細胞を拡大させた。培地は、ｒｈ－ＩＬ－２（１５００Ｕ／ｍｌ）を含有するＲＭＰＩで３日ごとに再び新しくした。
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びマルチプレックスサイトカインアッセイ
ＩＦＮ－γ用のヒトＥＬＩＳＡキットは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。アッセイは、製造元のプロトコルに記載の通りに実施した。プレートを、マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにて読み取って、吸光度値を得た（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＥＬＩＳＡマニュアル）。サイトカイン及びケモカイン濃度を分析する及び取得するために、標準曲線を、製造元によって提供された組み換えサイトカインの２倍または３倍希釈のいずれかによって生成した。
サイトカイン及びケモカインのレベルは、マルチプレックスアッセイによって調査し、これは、各指定キットに関する製造元のプロトコルに記載されている通りに実施した。分析は、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックス機器（ＭＡＧＰＩＸ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して行い、データは、独自のソフトウェア（ｘＰＯＮＥＮＴ ４．２，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して分析した。
表面染色及び細胞死アッセイ
染色は、前述の通りに抗体で細胞を標識することにより行った。簡潔には、細胞を、氷冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回洗浄した。所定の最適濃度の特異的ヒトフローサイトメトリー抗体を、５０μｌの冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中の１×１０４個の細胞に加え、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡにて洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて５００μｌにした。フローサイトメトリー分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬサイトメーター（Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して行い、結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｖＸソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。
５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ
５１Ｃｒ放出アッセイは、前述の通りに行った。ＯＳＣＳＣを、標的細胞として使用して、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を評価した。なぜなら、これらの細胞が、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対して最も感受性の高い細胞であるためである。簡潔には、異なる数のエフェクター細胞を、５１Ｃｒ標識標的細胞とインキュベートした。４時間のインキュベーション期間の後、上清を各試料から回収し、ガンマカウンターを使用して放出された放射能を計数した。特異的細胞傷害性率（％）を、以下の式：を使用して計算した。
細胞傷害性率（％）＝実験ｃｐｍ－自発ｃｐｍ／総ｃｐｍ－自発ｃｐｍ
溶解単位３０／１０６は、腫瘍標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なエフェクター細胞の数の逆数を使用することにより計算される。
インビトロでのＭＰ２がん幹細胞分化
ＭＰ２腫瘍の分化は、前述の通りに実施した。ＮＫ細胞を、抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ）及びＩＬ－２（１，０００Ｕ／ｍＬ）の組み合わせで１８時間処理してから、上清を除去し、分化実験に使用した。活性化ＮＫ細胞によって産生されたＩＦＮ－γの量は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価した。ＭＰ２細胞は、（対応する処理の）ＮＫ細胞上清の量を漸増させながら毎日徐々に加えることで分化させた。平均して、分化を誘導するために、合計３，５００ｐｇのＩＦＮ－γ含有上清を４日間加えて、ＭＰ２腫瘍細胞の分化及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性を誘導した。その後、標的細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、剥離して実験に使用した。
統計学分析
統計学分析のために、対応のない両側スチューデントのｔ検定を行った。Ｐｒｉｓｍ－７ソフトウェアを使用した一元配置分散分析を使用して、様々な群を比較した。（ｎ）は、実験の各条件について使用したマウスの数を示す。以下の記号は、各分析内の統計学的有意性のレベルを表す、＊＊＊（ｐ値＜０．００１）、＊＊（ｐ値０．００１～０．０１）、＊（ｐ値０．０１～０．０５）。
実施例１４：膵臓腫瘍における分化のステージは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性と相関する；ＮＫ細胞受容体の誘発後のＮＫ細胞の細胞傷害性の喪失。
６つの膵臓腫瘍細胞を使用して、ＮＫ細胞と培養した場合の、表面発現、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性、及びサイトカインの分泌を測定した。低分化ＭＰ－２及びＰａｎｃ－１は、高量のＣＤ４４ならびに中程度または低レベルのＭＨＣクラスＩ及びＣＤ５４を発現した。中分化ＢＸＰＣ３及びＨＰＡＦは、中程度から高レベルのＣＤ４４及びＣＤ５４ならびに高レベルのＭＨＣクラスＩを発現した。高分化Ｃａｐａｎ及びＰＬ１２は、はるかに低レベルのＣＤ４４ならびに高レベルのＣＤ５４及びＭＨＣクラスＩを有した（図１２Ａ）。分化のステージ及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性間の直接的相関が、膵臓腫瘍細胞において観察された。未分化ＭＰ２及びＰａｎｃ－１がＮＫ媒介性溶解に対して最も高い感度を呈したのに対し、ＰＬ－１２及びＣａｐａｎ高分化腫瘍はＮＫ媒介性溶解に対して最も低い感度を実証した（図１２Ｂ）。中分化ＢＸＰＣ３及びＨＰＡＦは、ＮＫ細胞溶解に対して中程度の感度を実証した（図１２Ｂ）。ゆえに、ＮＫ媒介性細胞傷害性に対する感受性の増加及び膵臓腫瘍の低分化間には直接的相関があった。
６つの異なる膵臓腫瘍タイプ（図１２Ａ及び１２Ｂ）の中で、それぞれが形態学的及び病理学的に分化の異なるステージにあることが以前に同定された及び特徴付けられた；幹様／低分化ステージのＭｉａＰａＣａ－２（ＭＰ２）及び高分化ステージのＰＬ１２を、分化の２つの極端なステージを代表して、下記の本発明者らのインビボ実験で使用するために選択した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。結果は、ＭＰ２腫瘍がより高いＣＤ４４ならびにより低いＭＨＣクラスＩ及びＣＤ５４を発現し（図１２Ａ）、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性が高い（図１２Ｂ）のに対し、ＰＬ１２腫瘍はより低いＣＤ４４だがより高いＣＤ５４及びＭＨＣ－クラスＩ表面発現を有し（図１２Ａ）、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に耐性であった（図１２Ｂ）ことを示した。同様の傾向は、他の膵臓腫瘍タイプでも見られた（図１２Ａ及び１２Ｂ）。また、本明細書では、口腔及び神経膠芽腫、さらに最近では黒色腫及び肺腫瘍における腫瘍分化に関する上述の基準も示す。
ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍は、高分化ＰＬ１２及びＣａｐａｎ腫瘍と同様の表面表現型を呈し、それらもＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に耐性があった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。ＮＫ細胞は、分泌された及び膜結合型ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの機能を通してＭＰ２腫瘍の分化を媒介した。さらに、ＭＰ２腫瘍分化の媒介におけるＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α受容体、ならびにｒｈＩＦＮ－γ及び／またはｒｈＴＮＦ－αの重要性が示されている（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
実施例１５：ＮＫ上清分化ＭＰ２腫瘍及び患者由来分化ＰＬ１２腫瘍の移植後の、ＮＳＧマウスの膵臓腫瘍成長の抑制及び転移の欠如及び長期生存。
ＮＳＧマウスの膵臓に移植されたＭＰ２腫瘍（３×１０５腫瘍）は、３～４週以内に成長し、肝臓に転移してマウスを死に至らしめた（図１３）（ｎ＝３）のに対し、より多くのＰＬ１２腫瘍（２×１０６）を注射したマウスは、１２週以内に腫瘍を全く生成しなかったまたは非常に小さく生成し、腫瘍は、転移せずマウスを死に至らしめることもなかった（図１３）（ｎ＝３）。膵臓へのＮＫ分化ＭＰ２腫瘍（５×１０５）の注射は、目に見える腫瘍成長も肝臓への腫瘍転移も呈さず、全てのマウスは実験が終了した１２週時点で生存していた（図１３）（ｎ＝３）。
実施例１６：ｒｈＴＮＦ－α及びｒｈＩＦＮ－γの組み合わせは、ＭＰ２細胞の分化及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する耐性を誘導する。
幹様／未分化ＭＰ２及び高分化Ｃａｐａｎ膵臓腫瘍細胞を、ｒｈＴＮＦ－α及びｒｈＩＦＮ－γで処理し、ＮＫ細胞媒介性溶解に対するそれらの感受性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにて評価した。図１４Ａに示すように、ｒｈＴＮＦ－α及びｒｈＩＦＮ－γの組み合わせは、ＭＰ－２腫瘍においてＣＤ５４、ＭＨＣ－１及びＢ７Ｈ１を上方制御し、ＣＤ４４を下方調節することができた。ｒｈＴＮＦ－α及びｒｈＩＦＮ－γの両方が、ＣＤ５４及びＭＨＣクラスＩの表面発現を増加させることができたが、ｒｈＩＦＮ－γのみがＢ７Ｈ１を上方制御することができた（図１４Ａ）。ｒｈＴＮＦ－αのＭＰ２への添加は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対して中程度の耐性を誘導することができたのに対し、ｒｈＩＦＮ－γは、有意な耐性を誘導した（図１４Ｂ）。ＮＫ細胞によるＣａｐａｎ腫瘍の溶解は少なく、ｒｈＩＦＮ－γ及びｒｈＴＮＦ－αを用いた処理は、これらの細胞において中程度の耐性を誘導した（図１４Ｂ）。
実施例１７：ヒト及びｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＮＫ細胞の頻度における差異。
ヒト免疫系で再構成したＨｕ－ＢＬＴマウスは、異なる組織区画においてｈｕＣＤ４５＋免疫細胞で９０％を超える再構成を呈した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。ドナー間の末梢血ＮＫ細胞にある範囲の頻度が見られるヒトと同様に、異なるドナー免疫細胞で再構成されたｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血にも様々な割合（％）のＮＫ細胞が存在する。これまでに検査したｈｕ－ＢＬＴマウスの数に基づくと、平均して、ｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血中のＮＫ細胞の割合（％）は、ヒトドナー末梢血と比較して低くあり得るが、これらのマウスの生成におけるコスト及び労力に加えて、胸腺及び肝臓組織の入手可能性が制限されているため、それらは、末梢血ＮＫ細胞の割合（％）に関して集団に基づく範囲を確立するには、ヒトドナー血液ほど容易に利用可能ではない（図１５Ｃ及び１５Ｄ；表１）。しかしながら、ｈｕ－ＢＬＴマウスの異なる組織区画における異なる免疫細胞サブセットの分析に基づいて、本明細書では、末梢血（図１５Ｃ及び１５Ｄ；表１）、ＢＭ（図１５Ｅ）、脾臓（図１５Ｅ）、膵臓（図１５Ｆ）及びさらには免疫浸潤に関して評価することが非常に難しい区画である歯肉（図１５Ｇ）においてさえにも、ヒト免疫サブセットの高い再構成及び浸潤が発見された。実際、歯肉細胞を７日間培養した場合、ｈｕＣＤ４５＋免疫細胞及び異なる免疫サブセットの高い浸潤を明確に確認することができた（図１５Ｇ）。ヒト及びｈｕ－ＢＬＴマウスの末梢血の間で同一の割合（％）のＴ細胞サブセットが見出された（図１５Ｄ；表１）。ｈｕ－ＢＬＴ、ヒト及びマウス末梢血の間で免疫細胞サブセットを比較すると、リンパ球のサブセットの同様であるが同一ではない頻度を、ｈｕ－ＢＬＴ及びヒトドナー間に見出すことができ、両方ともマウス末梢血から得られたものとは非常に差があった（図１５Ｄ；表１）。
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実施例１８：ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍は、ｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓において可視腫瘍を成長させなかった。
Ｈｕ－ＢＬＴマウス（図１５Ａ～１５Ｇは、ｈｕ－ＢＬＴの異なる組織区画における免疫サブセットの詳細、ならびに末梢血におけるヒト及びマウスの免疫サブセットとのそれらの比較を示す）の膵臓に、未分化ＭＰ２腫瘍（図１６Ａ）を、ならびに以前及び本明細書に記載する通りにＮＫ上清で分化させたもの（図１７Ａ）を移植し、それらのマウスでの成長動態及び全体的効果を研究した。ＭＰ２腫瘍は急速に成長し、膵臓において触知可能な腫瘍を形成し、マウスは、６～７週以内に罹患の兆候を全て呈し、７週目に屠殺した際、腹部全体に広がり、脾臓、胃及び腸の一部を包む腫瘍を呈した（図１６Ｂ－上部パネル）。ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍をマウスに移植した場合、屠殺の日まで触知可能または可視腫瘍は無く、マウスは罹患の兆候をいずれも示さず、７週目に屠殺した際、視覚的に見ることができる腫瘍は無かった（図１６Ｂ－下部パネル）。インビトロ細胞培養では、患者由来ＰＬ１２分化腫瘍に類似するＮＫ分化ＭＰ２腫瘍は、未分化ＭＰ２腫瘍と比較した場合に成長が遅かった。
実施例１９：膵臓における免疫サブセットの頻度。
膵臓における浸潤ヒト免疫細胞の大多数は、ＣＤ３＋Ｔ（５４％）及びＢ細胞（４３．３％）であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞（およそ２０％）よりも大きな割合のＴ細胞（およそ８０％）を構成している（表２；図１５Ｆ）。ＮＫ及びＣＤ１４＋細胞は、健康なｈｕ－ＢＬＴマウスの膵臓において免疫細胞の少数の亜集団を構成した（表２；図１５Ｆ）。
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実施例２０：ＮＫ細胞の単回注射は、ＭＰ２腫瘍を移植されたマウスにおいて腫瘍成長を阻害した。
ＭＰ２腫瘍を移植し、強力な細胞傷害性及びサイトカイン分泌能力を有するスーパーチャージドＮＫ細胞を１～１．５×１０６個注射したマウス（図１６Ａ）は、他の臓器の関与または罹患の兆候を伴わずに、腫瘍を全く呈さなかったまたは実質的に小さい腫瘍を呈した（図１６Ｂ－中央パネル）。腫瘍移植後７週で急速に成長する腫瘍により担腫瘍マウスが死亡したため、屠殺の時期を腫瘍移植の４～５週後に短縮して、膵臓及び膵臓における免疫浸潤の動態を研究できるようにした。２倍を超えるｈｕＣＤ４５＋免疫細胞が、担腫瘍マウスのものと比較した場合、ＮＫ注射担腫瘍マウスもしくはＮＫ分化腫瘍移植マウスのいずれかの膵臓においてまたは健康な対照マウスにおいて見られた（図１７Ｂ及び１７Ｃ）。加えて、ＭＰ２移植マウスの膵臓ｈｕＣＤ４５＋免疫細胞のほとんどは、ＣＤ３＋Ｔ細胞であった（図１６Ｃ及び１７Ｂ）のに対し、ＮＫ細胞を投与された担腫瘍マウスまたはＮＫ分化腫瘍を移植されたマウスもしくは対照の健康な膵臓を有するマウスは、膵臓におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の割合（％）が比較的低く（図１６Ｃ及び１７Ｂ）、ＮＫ細胞の割合（％）が高かった（図１６Ｄ）。同様に、膵臓内のＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞における２倍を超える増加が、担腫瘍マウスからのものと比較した場合、ＮＫ注射担腫瘍マウスにおいてまたは腫瘍を移植していない健康な対照マウスの膵臓のいずれにおいても見られた（図１６Ｄ）。
担腫瘍マウスとは異なり、腫瘍移植の１～２週前にマウスにＡＪ２を与え、同種異系または自己スーパーチャージドＮＫ細胞を注射した場合（図１９Ａ及び以下を参照されたい）、腫瘍は触知可能でなく（図１８Ａ）、それらの腫瘍重量は実質的に低いままであった（図１９Ｂ）。ＮＫまたはＮＫ注射／ＡＪ２給餌マウス間で、平均腫瘍重量においてわずかな低減は見られたが、腫瘍重量においてこの２つの間で統計学的に有意な差は観察できなかった（図１９Ｂ）。これは、担腫瘍マウスにおいてＮＫ注射単独ですでに見られた有意な低減による可能性が高い。実際、ＮＫ注射またはＮＫ注射／ＡＪ２給餌担腫瘍マウスの末梢血からの血清は、腫瘍のみを有するマウスと比較した場合、それぞれ２．７３倍及び４．８倍多いＩＦＮ－γを呈した（図１９Ｃ）。同様に、ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍を移植されたマウス（図１７Ａ）は、触知可能な腫瘍を有さず、抗ＩＦＮ－γ及び抗ＴＮＦ－α抗体でＭＰ２分化を遮断する（図１８Ｂ）と、腫瘍分化が阻害され、より高い腫瘍重量を有する触知可能な腫瘍が生成された（図１９Ｄ）。
ＮＫ注射を受けなかった担腫瘍マウスから膵臓を取り出し、解離させて等数の細胞を培養すると、腫瘍の付着コロニーを２４～４８時間で見ることができ、それらはその後急速に成長したのに対し、同種異系ＮＫ細胞（図１８Ｃ～１８Ｉ）または自己ＮＫ細胞（図１８Ｇ）を注射したマウスは、最初はコロニーを呈さなかったが、５日または６日後にはいくつか目視可能となり、それらのコロニーは成長が非常に遅く、回復した腫瘍の数は、ＮＫ注射を受けなかったものと比較して実質的に低いままであった（図１８Ｃ～１８Ｉ）。同様に、ＮＫ分化腫瘍は、マウスに移植し、それらの膵臓を屠殺後に解離したとき、後日腫瘍は成長しなかったまたは非常に少ないコロニーを成長させ、それらの成長は極めて遅いままであった（図１６Ｂ、１８Ｅ、及び１８Ｈ）、しかしながら、抗ＩＦＮ－γ及び抗ＴＮＦ－α抗体を用いた分化の遮断は、腫瘍の付着及び成長を２４～４８時間で可能にし、成長の反応速度論を増加させた（図１８Ｈ）。解離及びプレーティング後の腫瘍成長は、ＮＫ単独注射マウスと比較して、ＡＪ２を給餌しＮＫ細胞を注射したマウスにおいてわずかに少なく、両方とも、ＭＰ２腫瘍の移植のみを受けたマウスよりも実質的に少なかった（図１８Ｄ、１８Ｆ、１８Ｇ、及び１８Ｉ）。腫瘍単独注射マウスと比較して、腫瘍及びＮＫ細胞を注射したマウスから培養した膵臓において、１８～２２倍多くのｈｕＣＤ４５＋免疫細胞が浸潤していた（図１９Ｅ及び１８Ｊ）。ＮＫ注射担腫瘍マウスの膵臓内でより高い割合（％）の浸潤ｈｕＣＤ４５＋免疫細胞が、ＣＤ９４、及びＮＫＧ２Ｄ表面受容体を発現した一方で、ＮＫ注射の不在下の担腫瘍マウスと比較した場合、それらは同様の割合（％）のＤＮＡＭ表面受容体を発現した（図１８Ｊ及び１８Ｋ）。
平均して、膵臓細胞培養物から分泌されたＩＦＮ－γにおける低減が、腫瘍を有さない対照マウスと比較して、ＭＰ２腫瘍を移植したマウスにおいて観察できた（図１９Ｆ及び１８Ｌ）。担腫瘍マウスへのＮＫ細胞の注射は、膵臓細胞培養物におけるＩＦＮ－γ分泌を回復させ、そのレベルは、腫瘍を有さない対照マウスで見られるものを超えた（図１９Ｆ及び１８Ｌ）。ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍の移植は、膵臓細胞培養物におけるＩＦＮ－γの阻害をもたらさず、その量は、腫瘍を有さない対照マウスから得られたものと同等であった（図１９Ｆ）。対照的に、ＩＬ－６分泌は、担腫瘍マウスからの膵臓細胞培養物で最も高く、全ての他の群のマウスで実質的に低かった（図１９Ｇ）。腫瘍重量／腫瘍成長に関して、ＮＫ単独注射またはＮＫ注射及びＡＪ２給餌マウス間に有意差は見られなかったが、平均して、これらの群間でＩＦＮ－γ放出に差があった（図１８Ｌ）。
Ｂ７Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）、ＭＨＣクラスＩ及びＣＤ５４の発現は、ＮＫ注射の不在下の担腫瘍マウスと比較した場合、ＮＫ注射マウスの膵臓から培養されたＭＰ２腫瘍でより高かった（図１９Ｈ）。さらに、インビトロ実験と同様に、ＮＫ注射マウスからの培養ＭＰ２腫瘍は、ＮＫ細胞媒介性殺傷に対する感受性の低減を呈したのに対し、ＮＫ注射の不在下で担腫瘍マウスから培養された腫瘍は、有意に感受性が高いままであった（図１９Ｉ及び１９Ｊ）。腫瘍のＮＫ細胞媒介性分化がＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αに対する抗体で遮断された場合、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性が回復した（図１９Ｊ）。
実施例２１：全ての組織区画内での担腫瘍マウスにおけるＮＫ細胞の細胞傷害性の抑制及びＩＦＮ－γの分泌の低減、ならびにＡＪ２の給餌の存在下及び不在下でのＮＫ細胞の注射を用いたそれらの回復／増加。
膵臓癌患者からのＰＢＭＣ（図２１Ａ）及びＮＫ細胞（図２１Ｂ）と同様の担腫瘍マウスからのＰＢＭＣ（図２０Ａ）は、それぞれ健康なマウスまたはヒトからのものと比較した場合、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性が有意に低く、ＩＦＮ－γ分泌の低減を呈した（図２０Ｂ、２０Ｃ、及び２１Ｃ～２１Ｆ）。脾細胞（図２０Ｄ～２０Ｆ、及び２１Ｇ～２１Ｈ）、脾細胞からの富化ＮＫ細胞（図２０Ｇ～２０Ｈ、及び２１Ｉ）、脾細胞からのＣＤ３＋Ｔ細胞（図２０Ｉ及び２１Ｊ）、及びＢＭ由来免疫細胞（図２０Ｊ～２０Ｌ、及び２１Ｋ～２１Ｌ）を、ＮＫ細胞傷害性及び／またはＩＦＮ－γの分泌について評価し、担腫瘍マウスは、腫瘍を有さない対照マウス、もしくはＮＫ細胞を注射された担腫瘍マウスから得られたもの、またはＮＫ分化腫瘍を移植されたものと比較して、全ての組織区画から得られた細胞においてはるかに低い細胞傷害性及び／またはＩＦＮ－γの分泌を有した（図２０及び２１）。抗ＩＦＮ－γ及び抗ＴＮＦ－α抗体による腫瘍のＮＫ分化の遮断は、検査した全ての組織区画において、未分化腫瘍から得られたものと同程度のＩＦＮ－γ分泌をもたらした。（図２０Ｃ、２０Ｆ、２０Ｌ、２１Ｆ、２１Ｈ、及び２１Ｌ）。
膵臓腫瘍で見られるものと同様に、ｈｕ－ＢＬＴマウスの口腔への口腔腫瘍の移植は、ＮＫ注射及びＡＪ２給餌の存在下及び不在下で口腔腫瘍を有するマウスから単離されたＰＢＭＣから、同様のプロファイルの細胞傷害性及びＩＦＮ－γの分泌をもたらした（図２２）。担腫瘍マウスから単離されたＰＢＭＣは、腫瘍移植の不在下の対照マウスまたはＮＫ注射担腫瘍マウスのいずれかと比較した場合、有意に低い細胞傷害性及びＩＦＮ－γの分泌を有した；最も高い増加は、ＮＫ細胞を注射され、ＡＪ２を給餌した担腫瘍マウスで見られた（図２２Ａ及び２２Ｂ）。ＡＪ２を給餌した担腫瘍マウスは、ＡＪ２を給餌されていない担腫瘍マウスと比較した場合、平均して細胞傷害性が増加した及びＩＦＮ－γ分泌が倍増したが、そのレベルはＮＫを注射された及び／またはＡＪ２を給餌した担腫瘍マウスから見られたものよりはるかに低かった（図２２Ａ及び２２Ｂ）。ＮＫ注射の不在下で担腫瘍マウスにＡＪ２を給餌すると、細胞傷害性及びＩＦＮ－ｇの分泌が中程度に改善された（図２２）。
膵臓における腫瘍成長のＮＫ媒介性阻害が非常に強力であったので、ＮＫ注射担腫瘍マウスまたはＮＫ及び抗ＰＤ１抗体の両方を投与されたマウスのいずれにおいても、担腫瘍マウスと比較した場合、腫瘍成長を見ることはできなかった（図２３Ａ及び２３Ｂ）。しかしながら、ＮＫ細胞と組み合わせた抗ＰＤ１のＩＶ注射は、ＮＫ単独注射マウスと比較して、わずかな増加が見られる膵臓から解離した細胞を除いて、検査した全ての組織区画においてＩＦＮ－γの分泌を上昇させた（図２３Ｃ～２３Ｈ）。担腫瘍マウスにおけるＮＫ細胞の不在下での抗ＰＤ１抗体注射は、腫瘍単独注射マウスからのものと比較した場合、膵臓から解離した細胞を除いて、全ての組織においてＩＦＮ－γの分泌を増加させた（図２３Ｃ～２３Ｈ）。
実施例２２：パクリタキセルは、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を用いて／用いずに処理されたＮＫ分化ＭＰ２腫瘍において有意な細胞死を誘導する。
ＭＰ２腫瘍とは異なり、パクリタキセルを用いた高分化ＰＬ１２及びＣａｐａｎ腫瘍の処理（図２４及び２５Ａ）は、より高いレベルの細胞死を実証した。同様に、ＮＫ上清を用いたＭＰ２腫瘍の分化は、パクリタキセル媒介性細胞死に対する感受性をもたらし（図２５Ｂ）、抗ＩＦＮ－γ及び抗ＴＮＦ－α抗体を用いたＮＫ上清媒介性分化の遮断は、パクリタキセルによって誘導される細胞死を実質的に低減させた（図２５Ｂ）。（図２４及び２５Ａ）に示すように、ＭＰ２、ＰＬ１２及びＣａｐａｎにＮＡＣを加えると、パクリタキセル媒介性細胞死が増加した。同様に、ＮＫ上清分化ＭＰ２腫瘍にＮＡＣを加えると、細胞死が増加し、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α ｍＡｂを用いた分化の遮断は、パクリタキセル媒介性細胞死を低減させた（図２５Ｂ）。ＮＡＣによる細胞の分化能は以前に示しており、患者由来の分化ＯＳＣＣまたはＮＫ分化ＯＳＣＳＣへのパクリタキセルまたはシス－ジクロロジアンミン白金（ＣＤＤＰまたはシスプラチン）の添加も、より高い細胞死を媒介したのに対し、幹様／分化ＯＳＣＳＣでは最小限の効果が見られた。
実施例２３：ＮＫ細胞を注射した担腫瘍マウスからまたはＮＫ分化ＭＰ２移植腫瘍からの単球または破骨細胞は、腫瘍のみを移植したマウスのものと比較した場合、ＮＫ細胞を活性化する能力が高かった。
異なる群のマウスからの精製ＮＫ細胞を、そのそれぞれの自己単球と培養した（図２６Ａ及び２７Ａ）、または健康なヒトドナーから精製した同種異系ＮＫ細胞を、図２６Ｂ～２６Ｄに示すように各群のマウスのＢＭから単離された単球に由来する破骨細胞と培養し、ＮＫ拡大、細胞傷害性、及びＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ分泌のレベルを評価した。ＮＫ細胞を注射した担腫瘍マウスまたはＮＫ分化ＭＰ２腫瘍を移植したマウスからの自己単球と培養したＮＫ細胞は、ＮＫ注射の不在下での担腫瘍マウスのものと比較した場合、ＩＦＮ－γ分泌を誘導する能力がはるかに高かった（図２６Ａ及び２７Ａ）。腫瘍を移植しＮＫ細胞を注射した、またはＮＫ分化腫瘍を移植したマウスからの破骨細胞と培養した同種異系ＮＫ細胞は、ＮＫ注射の不在下での担腫瘍マウスからのものと比較して、拡大及び機能が有意に高かった（図２６Ｂ～２６Ｄ）。膵臓癌患者からの破骨細胞を同種異系の健康なヒトＮＫ細胞と培養した場合にも、健康な個体から培養したものと比較した場合、同様の結果が得られた（図２７Ｂ～２７Ｄ）。がん患者からの破骨細胞は、健康なドナーからのものと比較した場合、ＮＫ細胞を拡大させる能力が低い（図２７Ｂ）、またはＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を増加させる能力が低い（図２７Ｃ）もしくはＩＦＮ－γのＮＫ細胞媒介性分泌を増加させる能力が低かった（図２７Ｄ）。がん患者及び健康な個体の破骨細胞上での表面受容体の発現を調べると、健康なＯＣと比較して、がん患者のＯＣ上では、ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ５４、ＫＬＲＧ１、ＫＩＲ２／ＫＩＲ３及びＭＩＣＡ／Ｂの発現の低減が見られた（図２７Ｅ）。
最後に、ＮＫ細胞の上清からの同量のＩＦＮ－γを使用してＯＳＣＳＣ腫瘍を分化させた場合、膵臓癌患者のＮＫ細胞からのものは、健康なドナーのＮＫ細胞からのものと比較して、ＯＳＣＳＣ腫瘍の分化において効果が低かった。（図２８Ａ～２８Ｂ）。患者からのＮＫ上清は、ＭＨＣクラスＩを中程度に上昇させ、ＯＳＣＳＣ腫瘍のＮＫ媒介性細胞傷害性に対する耐性を３５％しか誘導しなかったのに対し、健康な個体からのＮＫ上清は、ＭＨＣクラスＩを実質的に上昇させ、ＯＳＣＳＣのＮＫ媒介性細胞傷害性に対する耐性を７８％誘導した（図２８Ａ～２８Ｂ）。患者の上清は依然として健康な個体のＴ細胞からのものより劣っていたが、患者及び健康な個体のＴ細胞からの上清は両方とも、ＯＳＣＳＣを分化させた（図２８Ｃ）。ＯＳＣＳＣを使用する理論的根拠は、これらの細胞がＩＦＮ－γ媒介性分化に高度に感度を有するためである。
ＮＫ細胞は、腫瘍溶解及び分化によって、ＣＳＣ／低分化膵臓腫瘍の成長及び拡大を制限する。ＭＰ２腫瘍は幹様／低分化であり、ＮＳＧ及びｈｕ－ＢＬＴマウスで大きな腫瘍を形成し、他の臓器／組織に転移する能力を有するのに対し、そのＮＫ分化ＭＰ２腫瘍または患者由来高分化ＰＬ－１２腫瘍は、膵臓においてそれぞれ腫瘍を形成しないまたは非常に小さい腫瘍を形成し、転移能を有さない。実際、インビトロでのＭＰ２腫瘍の成長能は１０～１５倍であると見出されているのに対し、同じ数の腫瘍を同じ期間培養した場合、ＮＫ分化対応物の成長能は、１．５～４倍であり、未分化ＭＰ２腫瘍またはＮＫ細胞によって分化した腫瘍のいずれの培養物でも細胞死は見られなかったまたはわずかに見られた。
患者由来ＰＬ１２腫瘍またはＮＫ分化腫瘍は、初代ＮＫ細胞によって殺傷されなかったが、しかしながら化学療法薬に感受性であり、パクリタキセル（図２４及び２５）ならびにＣＤＤＰによって殺傷されたのに対し、幹様／低分化腫瘍は比較的耐性があった。実際、ＭＰ２腫瘍のＮＫ誘導性分化が、抗ＩＦＮ－γ及び抗ＴＮＦ－α抗体の組み合わせによって阻害された場合、腫瘍は化学療法薬に対する感度を失い、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に感受性になった。さらに、他の効果に加えて細胞を分化させることが知られているＮＡＣは、ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍及び患者由来高分化膵臓腫瘍においてパクリタキセル媒介性細胞死を増加させた（図２４及び２５Ｂ）。
自己破骨細胞によって拡大したヒトＮＫ細胞と同様に、Ｈｕ－ＢＬＴ単球由来破骨細胞は、ｈｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞を拡大させた。加えて、自己及び同種異系破骨細胞の両方が、ｈｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞を拡大させることができ、ｈｕ－ＢＬＴ破骨細胞がわずかに高いＮＫ拡大能を有した（図２９Ｂ）。ｈｕ－ＢＬＴまたはヒト由来破骨細胞によって拡大されたＨｕ－ＢＬＴ ＮＫ細胞（図２９Ｄ）は、ＩＦＮ－γを分泌した（図２９Ｅ）。ｈｕ－ＢＬＴ及びヒト由来ＮＫ細胞間のＮＫ応答における、自己破骨細胞によって拡大し、より高いレベルのＩＦＮ－γを分泌し、増加した細胞傷害性を媒介するそれらの能力におけるかかる類似性は、この動物モデルをヒト疾患の研究のための代理モデルとして使用する理論的根拠を部分的に提供する。さらに、ｈｕ－ＢＬＴマウスモデルは、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴ及びがん患者のＮＫ細胞の両方に同様の欠陥が見られるため、ＮＫ欠陥及びがん進行の根底にある機序を研究するために適切なモデルである。
ＮＳＧマウスと同様に、ＮＫ分化ＭＰ２腫瘍は、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて可視腫瘍を形成できるレベルまで成長せず、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αに対する抗体を使用して腫瘍分化を防ぐと、腫瘍は実質的に成長した（図１８Ｃ、１８Ｈ、及び１９Ｄ）。ＡＪ２給餌の存在下または不在下での自己または同種異系ＮＫ細胞の注射は、ｈｕ－ＢＬＴマウスにおいて腫瘍成長の有意な阻害をもたらし、これはプロバイオティクス細菌によるＮＫ機能の有意な増加と一致した。
ＮＫ細胞を注射し、ＡＪ２を給餌した／給餌しなかった担腫瘍マウスから、膵臓を解離及び培養した場合、成長した腫瘍は非常に少なく、成長した腫瘍は分化表現型であったのに対し、ＮＫ細胞注射の不在下での担腫瘍マウスからの腫瘍は、急速に成長し、未分化のままであった。さらに、ＮＫ注射担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスから解離及び培養した腫瘍は、ＮＫ注射の不在下の担腫瘍マウスから解離腫瘍から培養されたものと比較した場合、約１８～２２倍多くのｈｕＣＤ４５＋免疫細胞を含有した。加えて、ＩＦＮ－γ分泌は実質的に増加したが、ＮＫ細胞を注射した担腫瘍マウスからの膵臓細胞培養物ではＩＬ－６分泌がはるかに低く、ＩＦＮ－γ分泌の最も高い増加がＡＪ２を給餌しＮＫ細胞を注射した担腫瘍マウスで見られたのに対し、ＮＫ注射の不在下の担腫瘍マウスでは、膵臓細胞培養物からのＩＬ－６の分泌はより高く、ＩＦＮ－γ分泌は低かった。ＩＬ－６分泌の増加は、担腫瘍マウスにおける腫瘍成長が原因である可能性が高い。腫瘍を移植し、ＡＪ２給餌の存在下／不在下でＮＫ細胞を注射したｈｕ－ＢＬＴマウスの異なる組織におけるＮＫ細胞は、有意な細胞傷害性を媒介し、ＩＦＮ－γの分泌量を増加させたのに対し、ＮＫ注射の不在下の担腫瘍マウスからのものは、はるかに低い細胞傷害性またはＩＦＮ－γ分泌を媒介した。
スーパーチャージドＮＫ細胞を担腫瘍マウスに単回注射すると、移植された腫瘍細胞上でのＰＤ－Ｌ１、ＣＤ５４及びＭＨＣクラスＩの表面受容体発現が増加し、成長が低減し、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する腫瘍細胞の感受性の喪失が媒介され（図１９Ｈ～１９Ｊ）、それにより、ＭＨＣクラスＩ発現の増加による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性殺傷に対する感受性の増加への道が開かれた。またより高い割合（％）のＮＫＴ細胞が、ＮＫ注射の不在下の腫瘍移植マウスと比較して、ＮＫ注射担腫瘍マウスから切除された腫瘍において見られた。膵臓においてＮＫ細胞の割合（％）が低減している状態の担腫瘍マウスにおけるＴ細胞の割合（％）の増加は、幹様／未分化腫瘍の除去の成功に関して、これらの腫瘍が膵臓のＮＫ細胞によって効率的に標的とされず、腫瘍の持続性及び拡大をもたらし得るため、問題となり得る。
がん患者の単球及び破骨細胞と同様に、担腫瘍マウスからのものは、自己もしくは同種異系ＮＫ細胞を拡大する、またはそれらの機能的可能性を増加する能力がはるかに低かった。ＮＫ及び単球の両方が担腫瘍マウスからのものである場合、ＮＫ細胞及び単球両方における複合的欠陥のために、ＮＫ細胞拡大及び機能のより著しい阻害が見られる。これらの実験は、担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスモデル及びヒトがん間の類似性を浮き彫りにするだけでなく、がん患者と同様の担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスにおけるＮＫ細胞活性化エフェクターの機能における著しい欠陥も示す。ｈｕ－ＢＬＴマウスからのＮＫ細胞の最も高い活性化は、ＮＫ分化腫瘍の移植によって達成されたことに留意することも重要である。これは、腫瘍の最適な分化が、インタクトな単球／破骨細胞機能を実際に促進及び維持できることを示唆している。
ＮＫ細胞機能の阻害を支配する根底的な機序を理解するために、破骨細胞の表面発現を、健康なドナーの破骨細胞と比較してがん患者から決定した。所見は、阻害性ＭＨＣクラスＩ発現が下方制御されるだけでなく、活性化ＣＤ５４、ＫＬＲＧ１及びＭＩＣＡ／Ｂ表面発現も低減したことを示し、このことはＮＫリガンド発現の全体的な低減を示唆している。活性化リガンドの喪失は、明らかにＮＫ細胞の活性化が低減する理由であり得る。しかしながら、阻害性受容体の喪失は、より複雑な状況を提供する。活性化及び阻害性ＮＫ細胞リガンドの発現の喪失は、ＮＫ細胞機能の喪失及び膵臓腫瘍の生成と相関する膵臓ＫＲＡＳ突然変異を有するＫＣマウスからの破骨細胞でも見られた。
患者のＮＫ細胞からの上清は、腫瘍を分化する能力が低く、患者ＮＫ細胞から分泌されたＩＦＮ－γの機能も著しく損なわれていることを示している。ゆえに、患者における膵臓腫瘍の誘導及び進行は、ＮＫ拡大、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の低減及びＩＦＮ－γの分泌の低下における複合的欠陥、ならびに分泌されたＩＦＮ－γが腫瘍を分化する能力がはるかに低いことだけでなく、ＮＫ細胞拡大及び機能を支持する免疫細胞の他のサブセットにおける欠陥にも起因する。
実施例２４：実施例２５～３２に関する材料及び方法
ヒト及びＨｕ－ＢＬＴマウス末梢血からの血清収集
末梢血（２００μｌ）を、ヘパリンを含まない１．５ｍｌエッペンドロフに収集し、室温で１５～２０分間放置してから、それを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次に血清層を回収した。
ＩＦＮ－γに関するヒト単色酵素ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
８０μｌの抗ヒトＩＦＮ－γ捕捉抗体を、９６ウェル高タンパク質結合ＰＶＤＦフィルタープレートの各ウェルに加え、一晩４℃にてインキュベートした。プレートを１５０μｌのＰＢＳで１回洗浄してから、試料をプレートに加えた。２００μｌのＲＰＭＩ中の５０，０００個の細胞を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを２００μｌ ＰＢＳで２回洗浄し、続いて０．０５％２００μｌ Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで２回洗浄した。８０μｌの抗ヒトＩＦＮ－γ検出抗体を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、プレートを２００μｌ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで３回洗浄した。１：１０００に希釈したＳｔｒｅｐ－ＡＰから作成した８０μｌ／ウェルの三次溶液をプレートに加え、３０分間インキュベートした。プレートを２００μｌ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで２回洗浄し、続いて２００μｌ／ウェルの蒸留水で２回洗浄した。次に、８０μｌ／ウェルの青色現像液を加え、プレートを室温で１５分間インキュベートした。膜を水道水で３回穏やかにすすぐことにより反応を停止させた。プレートを２時間風乾し、ｉｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）ソフウェアを備えたＣＴＬマシンを使用して、スキャンしてＩＦＮ－γ放出を計数した。（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）。
細胞株、試薬、及び抗体
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して、ヒトＮＫ細胞、ヒトＴ細胞及びｈｕ－ＢＬＴマウス免疫細胞を培養した。口腔扁平上皮癌幹細胞（ＯＳＣＳＣ）は、ＵＣＬＡで舌腫瘍を有する患者から単離し、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０を、ＯＳＣＳＣ培養に使用した。１０％ＦＢＳを伴うアルファ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を、破骨細胞及び樹状細胞の培養に使用した。Ｍ－ＣＳＦ、抗ＣＤ１６ｍＡｂ及びフローサイトメトリー抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＣＡから購入した。ＲＡＮＫＬ、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪから購入し、組み換えヒトＩＬ－２は、ＮＩＨ－ＢＲＢから取得した。ヒト抗ＣＤ３は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、Ｓｉｇｍａ，ＭＯから購入した。
ヒトＮＫ細胞及びＴ細胞の精製
ＵＣＬＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認された書面によるインフォームドコンセントを、健康なドナー及びがん患者から取得し、全ての手順はＵＣＬＡ－ＩＲＢによって承認された。ＮＫ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔは、それぞれＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）から購入した、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＮＫ細胞富化キット、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＴ細胞富化キット、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＣＤ４ Ｔ細胞富化キット、及びＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＣＤ８Ｔ細胞富化キットを使用して、ＰＢＭＣから単離した。単離されたＮＫ細胞及びＴ細胞を、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８で染色して、フローサイトメトリー分析を使用して細胞純度を測定した。
ヒト単球の精製ならびに、破骨細胞及び樹状細胞の生成
単球を負に選択し、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）から購入したＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒト単球単離キットを使用してＰＢＭＣから単離した。単離された単球を、抗ＣＤ１４抗体で染色して、フローサイトメトリー分析を使用して細胞純度を測定し、９５％を超える純度が達成された。単球は、Ｍ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）で２１日間処理することにより、破骨細胞に分化させた。樹状細胞（ＤＣ）を生成するために、単球をＧＭ－ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）で７日間処理した。
プロバイオティクス細菌（ＡＪ２）
ＡＪ２は、グラム陽性プロバイオティクス細菌の８つの異なる菌株（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の組み合わせであり、ＮＫ細胞において炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインの両方の最適な分泌を誘導する優れた能力に関して選択される。超音波処理のために、ＡＪ２細菌を秤量し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。細菌を完全にボルテックスし、次に氷上で１５秒間、６～８振幅で超音波処理した。次に、超音波処理した試料を、氷上で３０秒間インキュベートした。５パルスごとに、試料を採取して、細胞壁の少なくとも８０％が溶解するまで顕微鏡下で観察した。完全な超音波処理を達成するために、氷上でおよそ２０ラウンドの超音波処理／インキュベーションが実施されたことが決定された。最後に、超音波処理したＡＪ２（ｓＡＪ２）を分注し、使用するまで摂氏－８０度にて保管した。
ヒトＮＫ細胞及びヒトＴ細胞の拡大
ヒト精製ＮＫ細胞を、ｒｈ－ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８～２０時間活性化してから、それらを、フィーダー細胞（破骨細胞または樹状細胞）及びｓＡＪ２と共培養した（ＮＫ：ＯＣまたはＤＣ：ｓＡＪ２；２：１：４）。培地は、ｒｈ－ＩＬ－２（１５００Ｕ／ｍｌ）を含有するＲＭＰＩで３日ごとに再び新しくした。ヒト精製Ｔ細胞を、ｒｈ－ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）で１８～２０時間活性化してから、それらを、破骨細胞を伴って／伴わずに及びｓＡＪ２を伴って／伴わずに共培養した（Ｔ：ＯＣ：ｓＡＪ２；２：１：４）。培養培地は、ｒｈ－ＩＬ－２（１５０Ｕ／ｍｌ）で３日ごとに再び新しくした。
ｈｕ－ＢＬＴマウスへの腫瘍移植
動物研究は、全ての連邦、州、及び地方のガイドラインに従って、ＵＣＬＡ動物研究委員会（ＡＲＣ）の書面による承認の下で行った。複合免疫不全ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ及びＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（Ｔ、Ｂ、及びナチュラルキラー細胞を欠くＮＳＧ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ヒト化ＢＬＴ（ｈｕ－ＢＬＴ；ヒト骨髄／肝臓／胸腺）マウスを、前述の通りにＮＳＧバックグラウンド上で調製した。同所性腫瘍を確立するために、マウスを最初に酸素と組み合わせたイソフルランで麻酔し、次にヒトＯＳＣＳＣ腫瘍細胞を１０μｌ ＨＣマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）（１×１０６個の細胞）と懸濁させて口腔底に直接注射した。腫瘍注射の４～５週後、マウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、及び末梢血を回収した。
ｈｕ－ＢＬＴマウスＢＭ、脾臓及び末梢血からの細胞単離
ＢＭから単一細胞懸濁液を取得するために、大腿骨を両端から切り取り、ＲＰＭＩ １６４０培地を使用して一端から他端に洗い流し、その後ＢＭ細胞を、４０μｍセルストレーナーを通して濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を取得するために、脾臓を大きな断片がなくなるまで粉砕し、試料を、４０μｍセルストレーナーを通して濾過し、１５００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。ペレットを、ＡＣＫバッファーに再懸濁して、赤血球を２～５分間除去した後、ＲＭＰＩ培地に再懸濁し、１５００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン処理された血液検体のフィコール－ハイパック遠心分離を使用して単離した。ＰＢＭＣを含有するバフィーコートを回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
ＥＬＩＳＡ及びマルチプレックスサイトカインアレイキット
シングルＥＬＩＳＡ及びマルチプレックスアッセイは、前述の通りに行った。サイトカイン及びケモカイン濃度を分析する及び取得するために、標準曲線を、製造元によって提供された組み換えサイトカインの２倍または３倍希釈のいずれかによって生成した。マルチプルサイトカインアレイに関して、サイトカイン及びケモカインのレベルは、マルチプレックスアッセイによって調査し、これは、各指定キットに関する製造元のプロトコルに記載されている通りに実施した。分析は、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックス機器（ＭＡＧＰＩＸ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して行い、データは、独自のソフトウェア（ｘＰＯＮＥＮＴ ４．２，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して分析した。
表面染色アッセイ
表面染色のために、細胞を氷冷ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用して２回洗浄した。所定の最適濃度の特異的なヒトモノクローナル抗体を、５０μｌの冷ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中の１×１０４個の細胞に加え、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、冷ＰＢＳ＋１％ＢＳＡにて洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡを用いて５００μｌにした。フローサイトメトリー分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬサイトメーター（Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して行い、結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｖＸソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。
５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ
５１Ｃｒ放出アッセイは、前述の通りに行った。簡潔には、異なる数のエフェクター細胞を、５１Ｃｒ標識標的細胞とインキュベートした。４時間のインキュベーション期間の後、上清を各試料から回収し、ガンマカウンターを使用して放出された放射能を計数した。特異的細胞傷害性率（％）は以下の通りに計算した：
細胞傷害性率（％）＝実験ｃｐｍ－自発ｃｐｍ／総ｃｐｍ－自発ｃｐｍ
Ｌｕ３０／１０６は、標的細胞の３０％を溶解するために必要なエフェクター細胞の数の逆数×１００を使用することにより計算される。
標的細胞可視化アッセイ（ＴＶＡ）
標的細胞を、ＴＶＡＴＭ色素と３７０Ｃで１５分間インキュベートし、その後、エフェクター細胞を標的細胞と４時間培養した。４時間のインキュベーション期間の後、標的細胞を、イムノスポットを用いて５２５ｎｍの発光波長にて計数した。特異的細胞傷害性率（％）は以下の通りに計算した：
細胞傷害性率（％）＝実験ｃｐｍ－自発ｃｐｍ／総ｃｐｍ－自発ｃｐｍ
Ｌｕ３０／１０７は、腫瘍標的細胞×１００の３０％を溶解するために必要なエフェクター細胞の数の逆数を使用することにより計算される。
統計学分析
ｐｒｉｓｍ－７ソフトウェアを統計学分析に使用する。統計学分析のために、対応のないまたは対応のある、両側スチューデントのｔ検定を行った。ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析を使用して、様々な群を比較した。（ｎ）は、ヒトドナーまたはマウスの数を示す。インビトロ研究では、２重または３重の試料を評価に使用した。以下の記号は、各分析内の統計学的有意性のレベルを表す、＊＊＊（ｐ値＜０．００１）、＊＊（ｐ値０．００１～０．０１）、＊（ｐ値０．０１～０．０５）。
実施例２５：がん患者におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性及び／またはサイトカインの分泌の抑制。
がん患者の末梢血から回収されたＰＢＭＣの数は、健康な個体から単離されたものと比較した場合、少なかった（図３０Ａ）。健康な個体と比較して、がん患者から単離されたＣＤ４５＋ＰＢＭＣ内では、より高い割合（％）のＣＤ１６＋ＣＤ５６＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ならびに低い割合（％）のＣＤ３＋、及びＣＤ１９＋細胞が得られた（図３０Ｂ）。がん患者からのＮＫ細胞は、健康な個体からのＮＫ細胞と比較した場合、低減したＩＦＮ－γ分泌（図３０Ｃ及び３０Ｅ）、及び有意に低下したＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を呈した（図３０Ｄ）。加えて、ＩＦＮ－γと同様に、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－５、及びＩＬ－４の分泌も、健康な個体からのものと比較した場合、がん患者のＮＫ細胞から有意に低かった（図３０Ｅ）。同様の結果が、がん患者の末梢血から収集した血清で見られた（図３１Ａ）。
実施例２６：Ｔ細胞とは異なり、ＯＣの不在下または存在下の両方で、がん患者のＮＫ細胞からＩＦＮ－γ分泌の有意な抑制が見られた。
がん患者及び健康な個体からの精製ＮＫ細胞を、健康な同種異系ＯＣと培養し、ＮＫ細胞拡大、細胞傷害性及びＩＦＮ－γ分泌のレベルを評価した。がん患者からのＮＫ細胞は、健康な個体からのものと比較して、有意に低い拡大（図３２Ａ）、及び低いＮＫ細胞媒介性細胞傷害性（図３２Ｂ）を有した（図３２Ａ及び３２Ｂ）。がん患者のＮＫ細胞はまた、ＯＣの不在下または存在下の両方で、有意に低いレベルのＩＦＮ－γ分泌を媒介した（図３２Ｃ、３２Ｄ、及び３３Ａ～３３Ｃ）。ＮＫ細胞と同様に、がん患者からのＴ細胞は、ＯＣの不在下または存在下の両方で、有意に低い拡大速度を有した（図３２Ｅ及び３４Ａ）。しかしながら、ＮＫ細胞とは対照的に、がん患者のＴ細胞は、ＯＣの不在下または存在下の両方で、ＩＦＮ－γ分泌がわずかに低減していた（図３２Ｆ～３２Ｇ及び３４Ｂ～３４Ｆ）が、細胞１個あたりでは、がん患者からのＩＬ－２活性化Ｔ細胞のみが、有意に低いレベルのＩＦＮ－γ分泌を有していた（図３２Ｇ及び３４Ｃ）。次に、本発明者らは、ＯＣの存在下での健康な個体のＮＫ細胞及びＴ細胞の拡大プロファイル及びＩＦＮ－γ分泌を比較した（図３２Ｈ、３２Ｉ、及び３４Ｇ）。ＯＣの不在下では、ＮＫ細胞と比較して、Ｔ細胞の有意に高い拡大があった（図３２Ｈ及び３４Ｇ）。しかしながら、ＯＣは、ＯＣを伴わない培養物と比較した場合、１．２～１．６倍高いＴ細胞拡大を誘導したのに対し、ＯＣはＮＫ細胞において２．６～４．５倍の拡大を誘導した（図３２Ｈ及び３４Ｇ）。これらの結果は、ＯＣがＴ細胞よりもＮＫ細胞のより高い拡大を誘導することを示した。
実施例２７：がん患者のＴ細胞は、エフェクターメモリー表面表現型、低減したＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比率を呈した；ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＯＣの存在下でさらに増加した。
より低い割合（％）のＣＤ４５ＲＡの存在下でより高い割合（％）のＣＤ４５ＲＯ発現Ｔ細胞が、がん患者から単離されたＰＢＭＣで観察されたのに対し、健康な個体からのＴ細胞は、逆の関係ＣＤ４５ＲＡ＞ＣＤ４５ＲＯを呈した（図３５Ａ）。さらに、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、及びＣＤ１２７を発現するＴ細胞の割合（％）は、健康な個体においてよりもがん患者において低かった（図３５Ａ）。加えて、ＣＤ２８及びＣＤ１２７の両方を発現するＴ細胞の割合（％）は、健康な個体においてよりもがん患者において低かった（図３５Ａ）。さらに、がん患者のＴ細胞は、健康な個体から単離されたものと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）が増加し、ＣＤ４＋Ｔ細胞が低減しており、その結果ＣＤ４／ＣＤ８比率が低減した（図３５Ｂ及び３５Ｃ）。
次に、精製されたＮＫ細胞及びＴ細胞をそれぞれＯＣと培養し、ＯＣとのＮＫ及びＴ細胞共培養物の両方内でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を決定した。ＯＣと培養した精製Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）を増加させ、ＣＤ４／ＣＤ８の比率は、ＯＣ不在下でのＴ細胞にて２．４から、ＯＣと培養されたＴ細胞にて１．２に低減した（図３５Ｄ）。対照的に、ＯＣとのＮＫ培養物内で拡大したＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）を有意に増加させ、従って、ＣＤ４／ＣＤ８の比率は実質的に低減した（図３５Ｅ）。患者からのＯＣと培養したＴ細胞が、健康な対照と比較した場合、より低いＣＤ４／ＣＤ８比率を有したことを除いて、患者からのＴ細胞及びＮＫ細胞をＯＣと培養した場合にも同様の傾向が見られた（図３５Ｅ）。ゆえに、ＮＫ細胞の不在下で健康な個体及びがん患者から単離された精製Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を有意に拡大させることに失敗したが、がん患者のＴ細胞は、構成的に高い割合（％）のＣＤ８＋Ｔ細胞を有した（図３５Ｄ及び３５Ｅ）。加えて、培養開始時に検出不可能または無視できるレベルの混入Ｔ細胞を含有したＯＣで活性化した精製ＮＫ細胞は、健康な及び患者の培養物の両方から、拡大期間中後半にてＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させたが、患者ＮＫ細胞培養物は、健康なＮＫ細胞よりも速くＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させた（図３５Ｄ及び３５Ｅ）。
実施例２８：破骨細胞拡大ＮＫ細胞は、同じ培養物中の混入Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌する。
ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－１３を除くサイトカイン、ケモカイン、可溶性Ｆａｓ－リガンド及びパーフォリンのより高い分泌が、１２日目のＯＣ拡大ＮＫ細胞培養物から精製されたＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＯＣ拡大ＮＫ細胞で見られた（図３７Ａ及び３７Ｂ）。ＣＤ４＋Ｔが最も少ない可溶性Ｆａｓ－リガンドを分泌したのに対し、ＣＤ８＋Ｔは最も少ないＭＩＰ－１ａ及びＭＩＰ－１ｂを分泌した（図３７Ａ及び３７Ｂ）。ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、可溶性Ｆａｓ、可溶性Ｆａｓ－リガンド、パーフォリン、ＭＩＰ－１ａ及びＭＩＰ１ｂの分泌レベルは、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、ＯＣ拡大ＮＫ細胞においてより高かった（図３７Ｃ～３７Ｆ）。ＩＬ－１０、グランザイムＡ及びＢ、ならびにＴＮＦ－αの分泌レベルは、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、ＯＣ拡大ＮＫ細胞においてより低く見られた（図３７Ｃ～３７Ｆ）。次に、分泌因子を、１２日目のＯＣ拡大ＮＫ細胞培養物から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞及び１２日目のＯＣ拡大ＣＤ８＋Ｔ培養物から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞から調べた。ＯＣ拡大ＮＫ細胞培養物から単離されたＣＤ８＋Ｔは、ＯＣ拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞と比較した場合、より高い分泌レベルのＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、可溶性Ｆａｓ－リガンド及びＴＮＦ－α、より低いレベルのグランザイムＡ及びパーフォリンを示したのに対し、グランザイムＢ及び可溶性Ｆａｓのレベルは同様であった（図３７Ｇ）。
実施例２９：ＯＣ拡大ＮＫ細胞内のＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に拡大したのに対し、ＤＣ拡大ＮＫ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を生成した。
Ｔ細胞混入がない／少ない健康な個体からの精製ＮＫ細胞をＯＣまたはＤＣのいずれかと培養した場合、ＯＣの存在下でのＮＫ細胞拡大は有意に高かった（図３６Ａ）。ＮＫ及びＴ細胞の数を、それぞれＣＤ１６及びＣＤ３表面発現に基づいて決定した場合、ＤＣの存在下にあるものと比較して、ＯＣの存在下でＮＫ細胞の数は有意に高く（図３６Ｂ）Ｔ細胞の数は有意に低かった（図３６Ｃ）。ＯＣ拡大リンパ球は、ＮＫ細胞１個あたりで、ＤＣによって拡大したものと比較した場合、ＯＳＣＳＣに対してより多くの細胞傷害性を媒介した（図３６Ｄ）。ＮＫ細胞の数に基づいて調整した場合、ＯＣによって拡大したものは、ＤＣ拡大ＮＫ細胞と比較して、より高い細胞傷害性を有した（図３６Ｅ）。ＯＣ拡大リンパ球は、ＤＣによって拡大されたものと比較した場合、より多くのＩＦＮ－γを分泌する（図３６Ｆ）。次に、Ｔ細胞の亜集団を、ＯＣ対ＤＣによって培養された拡大ＮＫ細胞内で決定し、この場合、ＤＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大を優先的に誘導した（図３６Ｇ、３６Ｉ、３６Ｊ及び３６Ｍ）のに対し、ＯＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を誘導した（図３６Ｈ～３６Ｊ及び３６Ｍ）。ＤＣで拡大したＮＫ細胞培養物内のＴ細胞は、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、わずかに高いレベルのＫＬＧＲ１及びＴＩＭ３を発現したのに対し、ＰＤ１発現レベルは、ＤＣ拡大Ｔ細胞と同様であった（図３６Ｊ）。ＯＣまたはＤＣのいずれかと培養した精製Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＫＬＲＧ１及びＴＩＭ３ならびにＰＤ－１発現のレベルにおいてわずかな差を発現した（図３６Ｋ）。ＯＣ拡大ＮＫ細胞培養物内のＴ細胞は、ＤＣ拡大ＮＫ細胞培養物において拡大したものと比較した場合、ＣＤ４５ＲＯのより高い発現を呈したが、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７及びＣＤ１２７のレベルははるかに低く、ＣＤ４４のレベルは同様であった（図３６Ｋ及び３６Ｌ）。ＯＣの存在下で拡大した精製Ｔ細胞は、ＤＣの存在下で拡大したものと比較した場合、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ２８の発現がわずかに高かったが、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の発現はわずかに低く、ＣＤ１２７及びＣＤ４４の発現は非常に類似していた（図３６Ｌ及び３６Ｍ）。破骨細胞拡大ＮＫ細胞は、同じ培養物中の拡大Ｔ細胞と比較した場合、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌する（図３７）。
実施例３０：ＮＫ細胞を用いた免疫療法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、口腔腫瘍を有するｈｕ－ＢＬＴマウスにおいてＩＦＮ－γ分泌及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらした。
Ｈｕ－ＢＬＴマウスの口腔内にＯＳＣＳＣを移植し、強力な細胞傷害性及びサイトカイン分泌能力を有するスーパーチャージドＮＫ細胞を注射した。数週後、マウスを屠殺し、組織を取り出し、解離し、細胞を分析した（図３８Ａ）。ＢＭ（図３８Ｂ）、脾臓（図３８Ｅ）及び末梢血（図３８Ｈ）内のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加が、他の群と比較して、ＮＫ注射担腫瘍マウスにおいて見られた。ＮＫ細胞の注射は、担腫瘍マウスにおいて、ＮＫ細胞注射の不在下のものと比較した場合に、ＢＭ（図３８Ｃ）、脾臓（図３８Ｆ）及び末梢血（図３８Ｉ）からのＩＦＮ－γ分泌の増加、ならびにＢＭ（図３８Ｄ）、脾臓（図３８Ｆ）及び末梢血（図３８Ｊ）におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらした。興味深いことに、ＮＫ注射担腫瘍マウスの末梢血からの血清は、ＮＫ注射担腫瘍マウスにおいて、ＮＫ細胞注射の不在下の担腫瘍マウスと比較した場合、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－６及びＩＴＡＣの増加を呈したが、ＩＬ－８及びＧＭ－ＣＳＦは低減した（図３９）。
実施例３１：ＯＣ拡大ＣＤ４＋Ｔと比較した場合、ＯＣ拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞から、より高い拡大及び増加したＩＦＮ－γ分泌。
精製ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２の存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８で処理して、拡大の程度を評価した（図４０Ａ）。ＯＣの不在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で活性化されたＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の間に有意差を見ることはできなかった（図４０Ａ）。しかしながら、ＩＬ－２の存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８で処理した精製ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＣ及びｓＡＪ２と培養した場合、最初は両方とも同じ速度で拡大したが、６日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞は拡大し続け、その拡大倍数を増加させ続けたのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞は安定したままであり、１２日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもはるかに低い速度ではあるが依然拡大しているにもかかわらず、拡大倍数を低減させはじめた（図４０Ｂ）。精製ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、図６Ｂに記載する通りに処理し、ＯＣの存在下または不在下で培養し、各細胞型における拡大倍数を、ＯＣを伴わないものと比較した。図６Ｃに示すように、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、ＯＣの存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞と比較した場合、有意に多く拡大した（図４０Ｃ）。同様に、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、細胞１個あたりで、ＯＣの存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞と比較した場合、有意に高いＩＦＮ－γを分泌した（図４０Ｄ）。
サイトカイン及びケモカインのレベルをＯＣ拡大ＮＫ細胞で評価し、ＯＣ拡大Ｔ細胞と比較した場合、ＮＫ細胞はより高いレベルのサイトカイン及びケモカインを分泌した（図３７）。具体的には、ＮＫ細胞は、細胞１個あたりで、Ｔ細胞と比較した場合、ＭＩＰ－１ａ及びＭＩＰ－１Ｂが３０倍より高く、ｓＣＤ１３７及びＦａｓリガンドは１０倍より高く、ＧＭＣＳＦ及びＩＦＮ－γは４倍より高く、ｓＦａｓ及びパーフォリンは２倍より高かった（図３７Ｄ及び３７Ｆ）。サイトカインの分泌は、Ｔ細胞の拡大を見ることができなかった６日目に評価を行ったために、ＮＫ細胞に混入するＴ細胞は寄与しなかった（図３７Ａ～３７Ｆ）。拡大の１２日目にＯＣ拡大ＮＫ細胞から選出されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＮＫ細胞の不在下、同じ活性化条件下でＯＣ拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較した場合、より高いレベルのＧＭＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、Ｆａｓリガンド、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αを分泌した（図３７Ｇ）。
実施例３２：ＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではなくＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に溶解する。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を正に選択し、それらを、抗ＣＤ３及びＩＬ－２でさらに活性化し（図４０Ｅ及び４１）、別のセットではＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を正に選択し、それらを、ＩＬ－２でのみ活性化して（図４０Ｆ）から、Ｔ細胞を、ＴＶＡを使用するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性アッセイに供した。ＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に溶解した（図４０Ｅ、４０Ｆ、及び４１）。
ＮＫ機能の不活性化及び数の減少は、ＫＲＡＳ突然変異及び高脂肪カロリー食の両方の影響により、膵臓癌の前新生物期に発生する。本明細書では、膵臓癌の患者が重度に抑制されたＮＫ機能を有することを実証する。細胞傷害性及びＩＦＮ－γを分泌する能力の両方が、患者において抑制されている。加えて、末梢血単核細胞の数も、がん患者において著しく低減している。興味深いことに、ＮＫ細胞及び単球の両方の割合（％）が有意に増加しているのに対し、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＢ細胞の割合（％）は有意に低減しており、ＣＤ１１ｂ＋細胞の割合（％）は増加している。さらに、ＮＫ細胞によって分泌されるまたはがん患者の血清において検出されるサイトカインの大多数も、著しく低減しており、がん患者における免疫機能の深刻な抑制を示している。さらに、がん患者ＮＫ細胞のＯＣ調節拡大は著しく阻害され、拡大した患者ＮＫ細胞は、有意に低い細胞傷害性及びＩＦＮ－γ分泌を媒介した。がん患者では、初代及び拡大ＮＫ細胞の両方が機能に欠陥を有した。Ｔ細胞の拡大ならびにＩＦＮ－γ分泌も、異なる活性化条件下のがん患者において低減している。がん患者は、高いＣＤ４５ＲＯ及び低減したＣＤ６２Ｌを実証しており、インビボでの活性化の増加を示している。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）の増加及びＣＤ４／ＣＤ８の比率の減少に関しても明らかである（図３５Ｂ及び３５Ｃ）。これらの予期せぬ結果は、ＮＫ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の優先的な拡大において非常に重要であることを示す。特に、ＯＣが、ＮＫ細胞の拡大において重要な細胞である。ＮＫ細胞によって拡大したＴ細胞の大多数はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＮＫ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞拡大の類似したプロファイルが、健康な個体及びがん患者の両方で見られ、このことはＮＫ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大に不可欠であることを示している。ＯＣは、健康な個体及びがん患者の両方において、ＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を低減させたが、レベルは、ＮＫ細胞の存在下で実質的に低減した（図３５Ｅ）。
興味深いことに、ＮＫ細胞のＤＣ調節拡大及びＯＣ調節ＮＫ細胞拡大の間に有意差が観察される。ＯＣ調節拡大が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＫ細胞調節拡大の二次拡大をもたらした場合、ＮＫ細胞のＤＣ調節拡大は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の二次拡大をもたらした。ＤＣ拡大ＮＫ細胞よりもＯＣ拡大ＮＫ細胞によって拡大されたＴ細胞において、ＣＤ４５ＲＯがより大きく増加し、ＣＤ６２Ｌが低減し、このことはＮＫ細胞によるＴ細胞の活性化の増加を示している（図３６Ｊ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大には、高い活性化シグナルが必要である。実際、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＯＣ調節拡大は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大の漸進的な増加及びＣＤ４＋Ｔ細胞の減少をもたらした（図４０Ｂ）。それゆえ、ＯＣ細胞及びＮＫ細胞の両方からのシグナルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＴ細胞の活性化において重要である。加えて、ＯＣによって拡大されたＮＫ細胞は、ＤＣによって拡大されたものよりも大きな細胞傷害活性を有し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を標的としＣＤ８＋Ｔ細胞を温存する機序を提供する。この所見を裏付けるように、ＮＫ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を差次的に標的とした。ＩＬ－２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂ活性化ＮＫ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とすることができ、このことは、顆粒調節細胞傷害性が抗ＣＤ１６ｍＡｂによって阻害されるのに対し、ＴＮＦＲαならびに潜在的にＦａｓリガンド及びＡｐｏ２リガンドにおける増加が観察されたため、調節されたより多くの死受容体が細胞死を誘導したことを示す。従って、ＯＣ拡大ＮＫ細胞によるＦａｓリガンド及びＴＮＦα分泌において有意な増加が観察され、これらのレベルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方によって誘導されて見られるものを有意に超えた。
本明細書では、ＯＣ拡大ＮＫ細胞を担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスに注射すると、骨髄、脾臓、及び末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数が増加し、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性のレベルが増加し、ならびにＩＦＮ－γの分泌が増加することを実証する（図３８Ｂ～３８Ｊ）。ＩＦＮ－γ、ＩＬ６、ＩＴＡＣのレベルの増加も、ＯＣ拡大ＮＫ細胞を注射した担腫瘍ｈｕ－ＢＬＴマウスの血清において観察された（図３９）。
参照による組み込み
本明細書で言及する全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的及び個別に示されるかのように、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書における任意の定義を含んで、本出願が優先するものとする。
ワールドワイドウェブ上でｔｉｇｒ．ｏｒｇにてＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）及び／またはワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持されているものなどの公開データベースにおけるエントリーと相関する受託番号を参照する任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列も参照によってそれらの全体が組み込まれる。
等価物
当業者は、単に慣習的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または確認することができるだろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
参考文献
１．Ｖｏｎ Ｈｏｆｆ，Ｄ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｎａｂ－Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｐｌｕｓ Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３．３６９（１８）：ｐ．１６９１－１７０３。
２．Ｂｕｒｒｉｓ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ ｗｉｔｈ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ａｓ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｎｃｅｒ：Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９７．１５（６）：ｐ．２４０３－２４１３。
３．Ｐｈｉｌｉｐ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｓｔｕｄｙ Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ Ｐｌｕｓ Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ Ｖｅｒｓｕｓ Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｇｒｏｕｐ Ｔｒｉａｌ Ｓ０２０５．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１０．２８（２２）：ｐ．３６０５－３６１０。
４．Ｌｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７．６７（３）：ｐ．１０３０－１０３７。
５．Ｌｉ，Ｃ．，Ｃ．Ｊ．Ｌｅｅ，ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｓｉｍｅｏｎｅ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００９．５６８：ｐ．１６１－７３。
６．Ｂａｏ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｏｘＱ１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１４．２８９（２１）：ｐ．１４５２０－３３。
７．Ｄｕ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｉｃｈ ｉｎ“Ｓｔｅｍ－Ｃｅｌｌ－Ｌｉｋｅ”Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１１．５６（３）：ｐ．７４１－７５０。
８．Ｓｈａｈ，Ａ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００７．１４（１２）：ｐ．３６２９－３６３７。
９．Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００９．５０：ｐ．７６５－７６６。
１０．Ｒｙｓｃｈｉｃｈ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ－Ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５．１１（２）：ｐ．４９８－５０４。
１１．Ｐａｎｄｈａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｓｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７．１４８（１）：ｐ．１２７－１３５。
１２．Ｊｅｗｅｔｔ，Ａ．，Ｙ．－Ｇ．Ｍａｎ，ａｎｄ Ｈ．－Ｃ．Ｔｓｅｎｇ，Ｄｕａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１３．４（１）：ｐ．１２－２４。
１３．Ｊｅｗｅｔｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｒｅｓｃｕｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ａｎｄ ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳＣｓ）ｆｒｏｍ ＮＫ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０．５（３）：ｐ．ｅ９８７４。
１４．Ｊｅｗｅｔｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ１６ ａｎｄ ＣＤ９４ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｎａｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６．１２（７）：ｐ．１９９４－２００３。
１５．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ，２００５．１０５（４）：ｐ．１８１５－２２。
１６．Ｓｅｌｍａｎｉ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－Ｇ５ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（ｈｉｇｈ）ＦＯＸＰ３（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００８．２６（１）：ｐ．２１２－２２２。
１７．Ｓｐａｇｇｉａｒｉ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２．Ｂｌｏｏｄ，２００８．１１１（３）：ｐ．１３２７－１３３３。
１８．Ｗｅｓｔｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＤ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｒｏｕｐ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ２ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ，２０１４．１５（１）：ｐ．６９－７７。
１９．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ＤＮＡ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｔｉ－ＰＤ１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１７．２８（５）：ｐ．１１３０－１１３６。
２０．Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＴＣＲ－ＧＡＭＭＡ－ＤＥＬＴＡ＋Ｔ－ＣＥＬＬＳ ＩＮ ＴＵＭＯＲ－ＩＮＦＩＬＴＲＡＴＩＮＧ ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ（ＴＩＬ）ＯＦ ＨＵＭＡＮ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ－ＣＡＮＣＥＲ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３．９３（３）：ｐ．４４２－４４７。
２１．Ｄｅｇｒａｔｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｕｍｏｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００９．３９４（１）：ｐ．１１５－１２１。
２２．Ａｐａｒｉｃｉｏ－Ｐａｇｅｓ，Ｍ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１．３５（１）：ｐ．２７－３２。
２３．Ｄｕａｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｈａｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａ ａｎｄ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１１．２８（２）：ｐ．４６６－４７４。
２４．Ｐｅｎｇ，Ｙ．－Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ，ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３．１１。
２５．Ｋａｕｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｉｎｇｉｖａｌ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ Ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ＫＣ ａｎｄ ＢＬＴ－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｉｃｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１７．８（１６０６）。
２６．Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２．２９５（５５６２）：ｐ．２０９７－２１００。
２７．Ｖｅｎｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ－Ｃ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｌａｐｓｅ ｂｙ ｄｏｎｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＫＩＲ２ＤＳ１．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１２．３６７（９）：ｐ．８０５－１６。
２８．Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｕ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０．５９（１２）：ｐ．１７８１－９。
２９．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｌｏｏｄ，２００５．１０５（８）：ｐ．３０５１－７。
３０．Ｒｅ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｌｉｇａｎｄ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ，ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｌｙｓｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ，２００６．１０７（３）：ｐ．６４０－８。
３１．Ｇｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１１．１３（１）：ｐ．９８－１０７。
３２．Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａ ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ／ｐｏｏｒｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２０１７．８（４）：ｐ．５３７－５５４。
３３．Ｓｉｐｏｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ：ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ，２００３．４４２（５）：ｐ．４４４－５２。
３４．Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１６．６５（９）：ｐ．１０８５－９７。
３５．Ｋａｕｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ／ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１８．５１：ｐ．１７０－１８０。
３６．Ｊｅｗｅｔｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｓｈａｐｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｏｒａｌ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ；ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ，２０１８。
３７．Ｐａｒａｎｊｐｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ＨＥＭＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００７．４３（１０）：ｐ．１３９４－４０８。
３８．Ｔｓｅｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｎ．Ｃａｃａｌａｎｏ，ａｎｄ Ａ．Ｊｅｗｅｔｔ，Ｓｐｌｉｔ ａｎｅｒｇｉｚｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｈａｌｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＮＫ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１５．６（１１）：ｐ．８９４７－５９。
３９．Ｊｅｗｅｔｔ，Ａ．，Ｙ．Ｇ．Ｍａｎ，ａｎｄ Ｈ．Ｃ．Ｔｓｅｎｇ，Ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２０１３．４（１）：ｐ．１２－２４。
４０．Ｊｅｗｅｔｔ，Ａ．ａｎｄ Ｈ．Ｃ．Ｔｓｅｎｇ，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｃｕｅ，ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｐｌｉｔ ａｎｅｒｇｙ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１２．６１（２）：ｐ．２６５－７４。
４１．Ｐａｒａｎｊｐｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ－ａｃｅｔｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｖｉａ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＪＮＫ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ，２００９．１０８（２）：ｐ．３５６－６６。
４２．Ｒｏｕｔｙ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＰＤ－１－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７。
４３．Ｖｉｖｉｅｒ Ｅ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ ＭＡ，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ，Ｙｏｋｏｙａｍａ ＷＭ，Ｕｇｏｌｉｎｉ Ｓ：Ｉｎｎａｔｅ ｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ？Ｔｈｅ ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）２０１１，３３１（６０１３）：４４－４９。
４４．Ｓｈａｗ ＳＹ，Ｔｒａｎ Ｋ，Ｃａｓｔｏｒｅｎｏ ＡＢ，Ｐｅｌｏｑｕｉｎ ＪＭ，Ｌａｓｓｅｎ ＫＧ，Ｋｈｏｒ Ｂ，Ａｌｄｒｉｃｈ ＬＮ，Ｔａｎ ＰＨ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｋｕｂａｌｌａ Ｐ ｅｔ ａｌ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３，８（１２）：２７２４－２７３３。
４５．Ｃｏｏｐｅｒ ＭＡ，Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ＴＡ，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ ＭＡ：Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１，２２（１１）：６３３－６４０。
４６．Ｆａｒａｇ ＳＳ，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ ＭＡ：Ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂｌｏｏｄ ｒｅｖｉｅｗｓ，２０（３）：１２３－１３７。
４７．Ｓｕｎ Ｈ，Ｓｕｎ Ｃ，Ｔｉａｎ Ｚ，Ｘｉａｏ Ｗ：ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｏｒｇａｎｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１３，１０（３）：２０２－２１２。
４８．Ｃａｒａｓ Ｉ，Ｇｒｉｇｏｒｅｓｃｕ Ａ，Ｓｔａｖａｒｕ Ｃ，Ｒａｄｕ ＤＬ，Ｍｏｇｏｓ Ｉ，Ｓｚｅｇｌｉ Ｇ，Ｓａｌａｇｅａｎｕ Ａ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００４，５３（１２）：１１４６－１１５２。
４９．Ｋａｕｒ Ｋ，Ｃｏｏｋ Ｊ，Ｐａｒｋ ＳＨ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ Ｐ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ Ａ，Ｏｈａｎｉａｎ Ｎ，Ｆａｎｇ Ｃ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｉ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ Ｅｘｐａｎｄ Ｓｕｐｅｒ－Ｃｈａｒｇｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ Ｌｙｓｅ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＮＫ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１７，８：２９７。
５０．Ｓｐｅｉｓｅｒ ＤＥ，Ｈｏ ＰＣ，Ｖｅｒｄｅｉｌ Ｇ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６，１６（１０）：５９９－６１１。
５１．Ｉｇａｒａｓｈｉ Ｔ，Ｗｙｎｂｅｒｇ Ｊ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｒ，Ｂｅｃｋｎｅｌｌ Ｂ，ＭｃＣｏｙ ＪＰ，Ｊｒ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｙ，Ｓｕｆｆｒｅｄｉｎｉ ＤＡ，Ｌｉｎｅｈａｎ ＷＭ，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ ＭＡ，Ｃｈｉｌｄｓ ＲＷ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｋｉｌｌｅｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ２００４，１０４（１）：１７０－１７７。
５２．Ｗｈｉｔｅ Ｄ，Ｊｏｎｅｓ ＤＢ，Ｃｏｏｋｅ Ｔ，Ｋｉｒｋｈａｍ Ｎ：Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｅｎｉｇｎ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｂｒｅａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８２，４６（４）：６１１－６１６。
５３．Ｊｅｗｅｔｔ Ａ，Ｔｓｅｎｇ ＨＣ：Ｔｕｍｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ；ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１，２：４４３－４５７。
５４．Ｓａｎｔｏｓ ＭＦ，Ｍａｎｎａｍ ＶＫ，Ｃｒａｆｔ ＢＳ，Ｐｕｎｅｋｙ ＬＶ，Ｓｈｅｅｈａｎ ＮＴ，Ｌｅｗｉｓ ＲＥ，Ｃｒｕｓｅ ＪＭ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ，ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ，ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０１４，９６（３）：３６７－３７４。
５５．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｙ，Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ Ｈ，Ｏｎｏ Ｓ，Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ Ｎ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｈ，Ｈｉｒａｋｉ Ｓ，Ｔａｋａｈａｔａ Ｒ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ，Ｓａｉｔｏｈ Ｄ，Ｙａｍｏｒｉ Ｔ ｅｔ ａｌ：Ａｂｄｏｍｉｎａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｍｏｄｅｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１６，２３ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ２５７－２６５。
５６．Ｂａｓｋｉｃ Ｄ，Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ Ｌ，Ａｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃ Ｎ，Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ ＴＬ，Ｍｙｅｒｓ ＥＮ，Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ ＮＬ：Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ－ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｈｅａｄ＆ｎｅｃｋ ２０１３，３５（３）：３８８－３９８。
５７．Ｍｉｃｋｅｌ ＲＡ，Ｋｅｓｓｌｅｒ ＤＪ，Ｔａｙｌｏｒ ＪＭ，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ Ａ：Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ，ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８８，４８（１７）：５０１７－５０２２。
５８．Ｇｈｏｎｅｕｍ Ｍ，Ｇｉｌｌ Ｇ，Ｐｅｒｒｙ Ｌ：Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｒｙｎｘ ａｎｄ ｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｘ．Ｔｈｅ Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １９８６，９６（１１）：１３００。
５９．Ｔａｒｔｔｅｒ ＰＩ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｂ，Ｂａｒｒｏｎ ＤＭ，Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ Ｇ：Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｓｕｒｇｅｒｙ（Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ：１９６０）１９８７，１２２（１１）：１２６４－１２６８。
６０．Ｉｚａｗａ Ｓ，Ｋｏｎｏ Ｋ，Ｍｉｍｕｒａ Ｋ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ，Ｍａｒｕｙａｍａ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｈ：Ｈ２Ｏ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ５６ｄｉｍ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｎｄ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１１，６０（１２）：１８０１－１８１０。
６１．Ｎｏｌｉｂｅ Ｄ，Ｐｏｕｐｏｎ ＭＦ：Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｌｕｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １９８６，７７（１）：９９－１０３。
６２．Ｉｍａｉ Ｋ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｓ，Ｍｉｙａｋｅ Ｓ，Ｓｕｇａ Ｋ，Ｎａｋａｃｈｉ Ｋ：Ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ－ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ：ａｎ １１－ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ ２０００，３５６（９２４４）：１７９５－１７９９。
６３．Ｂｒｕｎｏ Ａ，Ｆｅｒｌａｚｚｏ Ｇ，Ａｌｂｉｎｉ Ａ，Ｎｏｏｎａｎ ＤＭ：Ａ ｔｈｉｎｋ ｔａｎｋ ｏｆ ＴＩＮＫ／ＴＡＮＫｓ：ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ／ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ２０１４，１０６（８）：ｄｊｕ２００。
６４．Ｖｉｔａｌｅ Ｍ，Ｃａｎｔｏｎｉ Ｃ，Ｐｉｅｔｒａ Ｇ，Ｍｉｎｇａｒｉ ＭＣ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ｌ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｎ ＮＫ－ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１４，４４（６）：１５８２－１５９２。
６５．Ｍｉｒｊａｃｉｃ Ｍａｒｔｉｎｏｖｉｃ ＫＭ，Ｂａｂｏｖｉｃ Ｎ，Ｄｚｏｄｉｃ ＲＲ，Ｊｕｒｉｓｉｃ ＶＢ，Ｔａｎｉｃ ＮＴ，Ｋｏｎｊｅｖｉｃ ＧＭ：Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ，ＮＫｐ４６，ＤＮＡＭ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｒｆｏｒｉｎ ａｎｄ ＳＴＡＴ－１ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｉｍ ａｎｄ ｂｒｉｇｈｔ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４，２４（４）：２９５－３０４。
６６．Ｇａｌｌｏｉｓ Ａ，Ｓｉｌｖａ Ｉ，Ｏｓｍａｎ Ｉ，Ｂｈａｒｄｗａｊ Ｎ：Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｂｙ ＴＩＭ－３ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１４，３（１２）：ｅ９４６３６５。
６７．Ｈｅｒｓｅｙ Ｐ，Ｅｄｗａｒｄｓ Ａ，Ｈｏｎｅｙｍａｎ Ｍ，ＭｃＣａｒｔｈｙ ＷＨ：Ｌｏｗ ｎａｔｕｒａｌ－ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ １９７９，４０（１）：１１３－１２２。
６８．Ｇｕｂｂｅｌｓ ＪＡ，Ｆｅｌｄｅｒ Ｍ，Ｈｏｒｉｂａｔａ Ｓ，Ｂｅｌｉｓｌｅ ＪＡ，Ｋａｐｕｒ Ａ，Ｈｏｌｄｅｎ Ｈ，Ｐｅｔｒｉｅ Ｓ，Ｍｉｇｎｅａｕｌｔ Ｍ，Ｒａｎｃｏｕｒｔ Ｃ，Ｃｏｎｎｏｒ ＪＰ ｅｔ ａｌ：ＭＵＣ１６ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｙｎａｐｓｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＮＫ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ ２０１０，９：１１。
６９．Ｂａｌｓａｍｏ Ｍ，Ｓｃｏｒｄａｍａｇｌｉａ Ｆ，Ｐｉｅｔｒａ Ｇ，Ｍａｎｚｉｎｉ Ｃ，Ｃａｎｔｏｎｉ Ｃ，Ｂｏｉｔａｎｏ Ｍ，Ｑｕｅｉｒｏｌｏ Ｐ，Ｖｅｒｍｉ Ｗ，Ｆａｃｃｈｅｔｔｉ Ｆ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ ｅｔ ａｌ：Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００９，１０６（４９）：２０８４７－２０８５２。
７０．Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ Ｒ，Ｃａｎｔｏｎｉ Ｃ，Ｄｅｌｌａ Ｃｈｉｅｓａ Ｍ，Ｖｉｔａｌｅ Ｍ，Ｍａｒｃｅｎａｒｏ Ｅ，Ｃｏｎｔｅ Ｒ，Ｂｉａｓｓｏｎｉ Ｒ，Ｂｏｔｔｉｎｏ Ｃ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ｌ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＫｐ３０ ａｎｄ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＫ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００３，１００（７）：４１２０－４１２５。
７１．Ｐｉｅｔｒａ Ｇ，Ｍａｎｚｉｎｉ Ｃ，Ｒｉｖａｒａ Ｓ，Ｖｉｔａｌｅ Ｍ，Ｃａｎｔｏｎｉ Ｃ，Ｐｅｔｒｅｔｔｏ Ａ，Ｂａｌｓａｍｏ Ｍ，Ｃｏｎｔｅ Ｒ，Ｂｅｎｅｌｌｉ Ｒ，Ｍｉｎｇｈｅｌｌｉ Ｓ ｅｔ ａｌ：Ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１２，７２（６）：１４０７－１４１５。
７２．Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＡ：Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ２０１１，１４４（５）：６４６－６７４。
７３．Ｓｍｙｔｈ ＭＪ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｙ，Ｔａｋｅｄａ Ｋ，Ｙａｇｉｔａ Ｈ：Ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ－ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ２００２，２（１１）：８５０－８６１。
７４．Ｇｒｏｓｓ Ｅ，Ｓｕｎｗｏｏ ＪＢ，Ｂｕｉ ＪＤ：Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ（Ｓｕｄｂｕｒｙ，Ｍａｓｓ）２０１３，１９（６）：４８３－４８９。
７５．Ｋｒｏｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｍ，Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ Ｙ，Ｗｅｉｄｌｅｒ Ｃ，Ｏｓｓａｄｎｉｋ Ｍ，Ｈｏｎｉｇ Ａ，Ｈａｕｓｌｅｒ Ｓ，Ｖｏｉｇｔ Ｈ，Ｂｅｃｋｅｒ ＪＣ，Ｌｅｎｇ Ｌ，Ｓｔｅｉｎｌｅ Ａ ｅｔ ａｌ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＮＫＧ２Ｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）２００８，１８０（１１）：７３３８－７３４８。
７６．Ｂｕｒｋｅ Ｓ，Ｌａｋｓｈｍｉｋａｎｔｈ Ｔ，Ｃｏｌｕｃｃｉ Ｆ，Ｃａｒｂｏｎｅ Ｅ：Ｎｅｗ ｖｉｅｗｓ ｏｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１０，３１（９）：３３９－３４５。
７７．Ｌａｒｓｅｎ ＳＫ，Ｇａｏ Ｙ，Ｂａｓｓｅ ＰＨ：ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ２０１４，１９（１－２）：９１－１０５。
７８．Ｈａｒｎｉｎｇ Ｒ，Ｋｏｏ ＧＣ，Ｓｚａｌａｙ Ｊ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｏｃｕｌａｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，３０（９）：１９０９－１９１５。
７９．Ｃｏｃａ Ｓ，Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｑｕｅｒａｓ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｄ，Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｊｏ Ａ，Ｓａｅｚ ＭＡ，Ｖａｌｌｅｊｏ Ｃ，Ｍａｒｔｏｓ ＪＡ，Ｍｏｒｅｎｏ Ｍ：Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ １９９７，７９（１２）：２３２０－２３２８。
８０．Ｐａｎｔ Ｈ，Ｈｕｇｈｅｓ Ａ，Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ Ｄ，Ｓｃｈｅｍｂｒｉ Ｍ，Ｗｏｒｍａｌｄ Ｐ，Ｍａｃａｒｄｌｅ Ｐ，Ｇｒｏｓｅ Ｒ，Ｚｏｌａ Ｈ，Ｋｒｕｍｂｉｅｇｅｌ Ｄ：Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｎａｓａｌ ｐｏｌｙｐｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｈｉｎｏｌｏｇｙ＆ａｌｌｅｒｇｙ ２０１３，２７（５）：ｅ１１７－１２６。
８１．Ｚａｎｅｔｔｉ Ｍ：Ｔａｐｐｉｎｇ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５，１９４（５）：２０４９－２０５６。
８２．Ｓｅｏ ＡＮ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｉｍ ＥＪ，Ｋｉｍ ＨＪ，Ｊａｎｇ ＭＨ，Ｌｅｅ ＨＥ，Ｋｉｍ ＹＪ，Ｋｉｍ ＪＨ，Ｐａｒｋ ＳＹ：Ｔｕｍｏｕｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８＋ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓ ａｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３，１０９（１０）：２７０５－２７１３。
８３．Ｈａｄｒｕｐ Ｓ，Ｄｏｎｉａ Ｍ，Ｔｈｏｒ Ｓｔｒａｔｅｎ Ｐ：Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１３，６（２）：１２３－１３３。
８４．Ｋｉｍ ＳＴ，Ｊｅｏｎｇ Ｈ，Ｗｏｏ ＯＨ，Ｓｅｏ ＪＨ，Ｋｉｍ Ａ，Ｌｅｅ ＥＳ，Ｓｈｉｎ ＳＷ，Ｋｉｍ ＹＨ，Ｋｉｍ ＪＳ，Ｐａｒｋ ＫＨ：Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｔｕｍｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ａｎｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１３，３６（３）：２２４－２３１。
８５．Ｓｈａｈ Ｗ，Ｙａｎ Ｘ，Ｊｉｎｇ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｗａｎｇ Ｙ：Ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ＣＤ４／ＣＤ８ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ＣＤ４（＋）ＦＯＸＰ３（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｒｖｉｘ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１，８（１）：５９－６６。
８６．Ｒｏｂｂｉｎｓ ＳＨ，Ｂｅｓｓｏｕ Ｇ，Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎ Ａ，Ｚｕｃｃｈｉｎｉ Ｎ，Ｒｕｐｐ Ｂ，Ｒｕｚｓｉｃｓ Ｚ，Ｓａｃｈｅｒ Ｔ，Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ Ｅ，Ｖｉｖｉｅｒ Ｅ，Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ ＵＨ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅａｒｌｙ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ２００７，３（８）：ｅ１２３。
８７．Ｗｏｄａｒｚ Ｄ，Ｓｉｅｒｒｏ Ｓ，Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ Ｐ：Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｆｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２００７，４（１４）：５３３－５４３。
８８．Ｗｕ Ｚ，Ｘｕ Ｙ：ＩＬ－１５Ｒ ａｌｐｈａ－ＩｇＧ１－Ｆｃ ｅｎｈａｎｃｅｓ ＩＬ－２ ａｎｄ ＩＬ－１５ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＮＫ ａｎｄ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０，２（４）：２１７－２２２。
８９．Ｔｏｍａｌａ Ｊ，Ｃｈｍｅｌｏｖａ Ｈ，Ｍｒｋｖａｎ Ｔ，Ｒｉｈｏｖａ Ｂ，Ｋｏｖａｒ Ｍ：Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｎａｉｖｅ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ＩＬ－２ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＩＬ－２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９，１８３（８）：４９０４－４９１２。
９０．Ｔａｎａｋａ Ｊ，Ｔｏｕｂａｉ Ｔ，Ｍｉｕｒａ Ｙ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｙ，Ｋａｔｏ Ｎ，Ｕｍｅｈａｒａ Ｓ，Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ Ｎ，Ｏｈｔａ Ｓ，Ａｓａｋａ Ｍ，Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ－ＣＳＦ－ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ａ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｏｎｏｒｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２００４，３６（８）：２５１１－２５１２。
９１．Ｔｓｅｎｇ ＨＣ，Ａｒａｓｔｅｈ Ａ，Ｐａｒａｎｊｐｅ Ａ，Ｔｅｒｕｅｌ Ａ，Ｙａｎｇ Ｗ，Ｂｅｈｅｌ Ａ，Ａｌｖａ ＪＡ，Ｗａｌｔｅｒ Ｇ，Ｈｅａｄ Ｃ，Ｉｓｈｉｋａｗａ ＴＯ ｅｔ ａｌ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ；ｄｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１０，５（７）：ｅ１１５９０。
９２．Ｔｓｅｎｇ ＨＣ，Ｂｕｉ Ｖ，Ｍａｎ ＹＧ，Ｃａｃａｌａｎｏ Ｎ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ Ａｎｅｒｇｙ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１４，５：２６９。
９３．Ｔｓｅｎｇ ＨＣ，Ｉｎａｇａｋｉ Ａ，Ｂｕｉ ＶＴ，Ｃａｃａｌａｎｏ Ｎ，Ｋａｓａｈａｒａ Ｎ，Ｍａｎ ＹＧ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ ｂｙ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５，６（９）：８６６－８７６。
９４．Ｂｕｉ ＶＴ，Ｔｓｅｎｇ Ｈ－Ｃ，Ｍａｕｎｇ ＰＯ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ Ａ，Ｍａｎｎ Ｋ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ Ｐ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ＩＦＮ－γ ａｎｄ ＴＮＦ－α Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｅｍ－Ｌｉｋｅ Ｔｕｍｏｒｓ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｌｅａｓｅ；Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ－１０．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１５，６。
９５．Ｊｅｗｅｔｔ Ａ，Ｂｏｎａｖｉｄａ Ｂ：Ｔａｒｇｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）１９９６，１５６（３）：９０７－９１５。
９６．Ｔｓｅｎｇ ＨＣ，Ｋａｎａｙａｍａ Ｋ，Ｋａｕｒ Ｋ，Ｐａｒｋ ＳＨ，Ｐａｒｋ Ｓ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ Ａ，Ｓｕｎ Ｓ，ＭｃＫｅｎｎａ ＣＥ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｉ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｇｉｎｇｉｖａ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｎ ｖｉｖｏ：Ｒｏｌｅ ｉｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５，６（２４）：２０００２－２００２５。
９７．Ｂｕｉ ＶＴ，Ｔｓｅｎｇ ＨＣ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ Ａ，Ｍａｕｎｇ ＰＯ，Ｋａｕｒ Ｋ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ Ｐ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ａｎｄ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｅｍ－Ｌｉｋｅ Ｔｕｍｏｒｓ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｌｅａｓｅ；Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ－１０．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１５，６：５７６。
９８．Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｓ，Ｈｏｎｇ Ｐ，Ａｒｕｍｕｇａｍ Ｂ，Ｐｏｋｏｍｏ Ｌ，Ｂｏｙｅｒ Ｊ，Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｎ，Ｋｉｔｔｉｐｏｎｇｄａｊａ Ｐ，Ｃｈｅｎ Ａ，Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｇ，Ｇａｌｉｃ Ｚ ｅｔ ａｌ：Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＣＣＲ５ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕ－ＢＬＴ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１０，１１５（８）：１５３４－１５４４。
９９．Ｖａｔａｋｉｓ ＤＮ，Ｋｏｙａ ＲＣ，Ｎｉｘｏｎ ＣＣ，Ｗｅｉ Ｌ，Ｋｉｍ ＳＧ，Ａｖａｎｃｅｎａ Ｐ，Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｇ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ，Ｋｏｈｎ ＤＢ，Ｒｉｂａｓ Ａ ｅｔ ａｌ：Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１１，１０８（５１）：Ｅ１４０８－１４１６。
１００．Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ ＡＫ，Ｋａｕｒ Ｋ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ Ｐ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ ２０１６。
１０１．Ｊｅｗｅｔｔ Ａ，Ｃａｖａｌｃａｎｔｉ Ｍ，Ｂｏｎａｖｉｄａ Ｂ：Ｐｉｖｏｔａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）１９９７，１５９（１０）：４８１５－４８２２。
１０２．Ｊｅｗｅｔｔ Ａ，Ｂｏｎａｖｉｄａ Ｂ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａｌｐｈａ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５，１５（１）：３５－４４。
１０３．Ｊｅｗｅｔｔ Ａ，Ｗａｎｇ ＭＹ，Ｔｅｒｕｅｌ Ａ，Ｐｏｕｐａｋ Ｚ，Ｂｏｓｔａｎｉａｎ Ｚ，Ｐａｒｋ ＮＨ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａＢ ｉｎ ＨＥｐ２ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００３，６４（５）：５０５－５２０。
１０４．Ｋａｕｒ Ｋ，Ｃｈａｎｇ ＨＨ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ Ｐ，Ｃｏｏｋ ＪＭ，Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ Ａ，Ｅｉｂｌ Ｇ，Ｊｅｗｅｔｔ Ａ：Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｎｕｍｂｅｒｓ，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｐｒｅ－Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｓｔａｇｅ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ＫＲＡＳ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ ｏｆ Ｏｂｅｓｅ Ｍｉｃｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８，９：１２２９。
１０５．Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ，Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ＣＡ，Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＰ：Ｐａｔｈｓ ｔｏ ｓｔｅｍｎｅｓｓ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｈｅ ｕｌｔｉｍａｔｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ Ｔ ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２，１２（１０）：６７１－６８４。
１０６．Ｐａｉａｒｄｉｎｉ Ｍ，Ｃｅｒｖａｓｉ Ｂ，Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｈ，Ｍｕｔｈｕｋｕｍａｒ Ａ，Ｄｕｎｈａｍ Ｒ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｓ，Ｒａｄｚｉｅｗｉｃｚ Ｈ，Ｐｉｅｄｉｍｏｎｔｅ Ｇ，Ｍａｇｎａｎｉ Ｍ，Ｍｏｎｔｒｏｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ：Ｌｏｓｓ ｏｆ ＣＤ１２７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｅｆｉｎｅｓ ａｎ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＨＩＶ－Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００５，１７４（５）：２９００－２９０９。
１０７．Ｄｒｅｎｎａｎ Ｓ，Ｓｔａｆｆｏｒｄ ＮＤ，Ｇｒｅｅｎｍａｎ Ｊ，Ｇｒｅｅｎ ＶＬ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ１２７（ｌｏｗ／－）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｎｏｄａｌ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１３，１４０（３）：３３５－３４３。

Claims (74)

  1. がんに罹患している対象を処置する方法であって、前記対象に免疫学的組成物を投与することを含み、前記免疫学的組成物が、以下：
    （ａ）同種異系初代ＮＫ細胞、
    （ｂ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞、
    （ｃ）自己スーパーチャージドＮＫ細胞拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び
    （ｄ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞拡大自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される少なくとも２つの細胞型を含む、前記方法。
  2. 前記免疫学的組成物が、３つの細胞型を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記免疫学的組成物が、４つの細胞型を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記対象の前記ＮＫ細胞が、以下：（ａ）サイトカイン分泌、任意選択で前記サイトカインはＩＦＮ－γである、（ｂ）細胞傷害性、（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大、（ｄ）幹様／低分化腫瘍細胞の分化、及び（ｅ）ＡＤＣＣ活性から選択される１つまたは複数の活性の低下を示す、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記免疫学的組成物が、医薬的に許容可能な製剤にて投与される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記対象に、がん細胞上で高度に発現される少なくとも１つの表面タンパク質に対する抗体を投与することをさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記抗体が、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢと結合する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記抗体が、ＡＤＣＣを誘導するのに十分な量で投与される、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導するまたは増強することによってＮＫ細胞を活性化することをさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. ＮＫ細胞を活性化することが、前記対象に前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を増強する１つまたは複数の追加の作用物質を投与することを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記１つまたは複数の追加の作用物質が、ＩＬ－２、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、メカブ、及び少なくとも１つの細菌株を含む組成物から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記組成物が、以下：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含み、任意選択で前記少なくとも１つの細菌株が生きているまたは超音波処理されている、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記組成物が、ＡＪ２細菌を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記１つまたは複数の追加の作用物質が、メカブ及びＡＪ２細菌である、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記対象に、少なくとも１つの追加の免疫療法及び／またはがん治療を投与することをさらに含む、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記免疫療法及び／またはがん治療が、前記免疫学的組成物の前、後、またはこれと並行して投与される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つの追加の免疫療法が、免疫チェックポイントを阻害する、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＡ２ａＲから選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記がん治療が、放射線、放射線増感剤、化学療法、インターフェロン、及びインターフェロン誘導剤から選択される、請求項１５に記載の方法。
  21. 前記がん治療が、化学療法であり、任意選択で前記化学療法がパクリタキセル及び／またはシスプラチンである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記対象に、低分化がん細胞の分化を誘導する作用物質を投与することをさらに含み、任意選択で前記作用物質がＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、請求項１～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記がんが、膵臓癌、または口腔癌であり、任意選択で前記口腔癌が口腔扁平上皮癌である、請求項１～２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記がんが、高度に分化している、請求項１～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記がんが、幹様／低分化である、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記対象が、哺乳動物である、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記哺乳動物が、マウスまたはヒトである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２７に記載の方法。
  29. がん細胞を殺傷するまたはがん細胞の増殖を阻害する方法であって、前記がん細胞を、免疫学的組成物と接触させることを含み、前記免疫学的組成物が、以下：
    （ａ）同種異系初代ＮＫ細胞、
    （ｂ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞、
    （ｃ）自己スーパーチャージドＮＫ細胞拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び
    （ｄ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞拡大自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される少なくとも２つの細胞型を含む、前記方法。
  30. 前記免疫学的組成物が、３つの細胞型を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記免疫学的組成物が、４つの細胞型を含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記免疫学的組成物が、医薬的に許容可能な製剤内にある、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記がん細胞を、がん細胞上で高度に発現される少なくとも１つの表面タンパク質に対する抗体と接触させることをさらに含む、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記抗体が、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢと結合する、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記抗体が、ＡＤＣＣを誘導するのに十分な量である、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導するまたは増強することによってＮＫ細胞を活性化することをさらに含む、請求項２９～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. ＮＫ細胞を活性化することが、前記ＮＫ細胞を、前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を増強する１つまたは複数の追加の作用物質と接触させることを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記１つまたは複数の追加の作用物質が、ＩＬ－２、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、メカブ、及び少なくとも１つの細菌株を含む組成物から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記組成物が、以下：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含み、任意選択で前記少なくとも１つの細菌株が生きているまたは超音波処理されている、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記組成物が、ＡＪ２細菌を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記１つまたは複数の追加の作用物質が、メカブ及びＡＪ２細菌である、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記がん細胞を、少なくとも１つの追加の免疫療法及び／またはがん治療と接触させることをさらに含む、請求項２９～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記少なくとも１つの追加の免疫療法及び／またはがん治療が、前記免疫学的組成物の前、後、またはこれと並行して追加される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記少なくとも１つの追加の免疫療法が、免疫チェックポイントを阻害する、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＡ２ａＲから選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記がん治療が、放射線、放射線増感剤、化学療法、インターフェロン、及びインターフェロン誘導剤から選択される、請求項４２に記載の方法。
  48. 前記がん治療が、化学療法であり、任意選択で前記化学療法がパクリタキセル及び／またはシスプラチンである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記がん細胞を、低分化がん細胞の分化を誘導する作用物質と接触させることをさらに含み、任意選択で前記作用物質がＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、請求項１～４８のいずれかに記載の方法。
  50. 前記がんが、膵臓癌、または口腔癌であり、任意選択で前記口腔癌が口腔扁平上皮癌である、請求項２９～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記がんが、高度に分化している、請求項２９～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記がんが、幹様／低分化である、請求項２９～５０のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記対象が、哺乳動物である、請求項２９～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記哺乳動物が、マウスまたはヒトである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５４に記載の方法。
  56. 対象において免疫応答を惹起することができる免疫学的組成物であって、以下：
    （ａ）同種異系初代ＮＫ細胞、
    （ｂ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞、
    （ｃ）自己スーパーチャージドＮＫ細胞拡大ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び
    （ｄ）同種異系スーパーチャージドＮＫ細胞拡大自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される少なくとも２つの細胞型を含む、前記免疫学的組成物。
  57. 前記免疫学的組成物が、３つの細胞型を含む、請求項５６に記載の免疫学的組成物。
  58. 前記免疫学的組成物が、４つの細胞型を含む、請求項５６に記載の免疫学的組成物。
  59. 前記免疫学的組成物が、医薬的に許容可能な製剤内にある、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の免疫学的組成物。
  60. がん細胞上で高度に発現される少なくとも１つの表面タンパク質に対する抗体をさらに含む、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の免疫学的組成物。
  61. 前記抗体が、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢと結合する、請求項６０に記載の免疫学的組成物。
  62. 前記抗体が、対象に投与された場合にＡＤＣＣを誘導するのに十分な量で存在する、請求項６０または６１に記載の免疫学的組成物。
  63. 前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を増強する１つまたは複数の追加の作用物質をさらに含む、請求項５６～６２のいずれか１項に記載の免疫学的組成物。
  64. 前記１つまたは複数の追加の作用物質が、ＩＬ－２、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、メカブ、及び少なくとも１つの細菌株を含む組成物から選択される、請求項６３に記載の免疫学的組成物。
  65. 前記組成物が、以下：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含み、任意選択で前記少なくとも１つの細菌株が生きているまたは超音波処理されている、請求項６４に記載の免疫学的組成物。
  66. 前記組成物が、ＡＪ２細菌を含む、請求項６５に記載の免疫学的組成物。
  67. 前記１つまたは複数の追加の作用物質が、メカブ及びＡＪ２細菌である、請求項６４に記載の免疫学的組成物。
  68. 少なくとも１つの追加の免疫療法及び／またはがん治療をさらに含む、請求項５６～６７のいずれか１項に記載の免疫学的組成物。
  69. 前記少なくとも１つの追加の免疫療法が、免疫チェックポイントを阻害する、請求項６８に記載の免疫学的組成物。
  70. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＡ２ａＲから選択される、請求項６９に記載の免疫学的組成物。
  71. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２から選択される、請求項７０に記載の免疫学的組成物。
  72. 前記がん治療が、放射線増感剤、化学療法、インターフェロン、及びインターフェロン誘導剤から選択される、請求項６８に記載の免疫学的組成物。
  73. 前記がん治療が、化学療法であり、任意選択で前記化学療法がパクリタキセル及び／またはシスプラチンである、請求項７２に記載の免疫学的組成物。
  74. 低分化がん細胞の分化を誘導する作用物質をさらに含み、任意選択で前記作用物質がＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、請求項５６～７３のいずれか１項に記載の免疫学的組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20230121573A (ko) * 2022-02-10 2023-08-18 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 플란타룸 균주 및 항암제를 포함하는 병용 요법을 이용한 암 예방 또는 치료용 조성물
WO2024063546A1 (ko) * 2022-09-20 2024-03-28 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 플란타룸 균주의 병용 요법 및 이를 이용한 암 치료 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9763982B2 (en) * 2010-06-29 2017-09-19 The Regents Of The University Of California Depletion of cancer stem cells
US10233425B2 (en) * 2013-09-16 2019-03-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD137 enrichment for efficient tumor infiltrating lymphocyte selection
EP3554521A4 (en) * 2016-12-15 2020-09-16 The Regents of The University of California ORAL LACTIC ACID BACTERIA COMPOSITION FOR THE REGULATION OF IMMUNE REACTIONS AND RELATED PROCEDURES
WO2018160993A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-07 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunotherapy

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230121573A (ko) * 2022-02-10 2023-08-18 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 플란타룸 균주 및 항암제를 포함하는 병용 요법을 이용한 암 예방 또는 치료용 조성물
KR102630915B1 (ko) * 2022-02-10 2024-02-01 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 플란타룸 균주 및 항암제를 포함하는 병용 요법을 이용한 암 예방 또는 치료용 조성물
WO2024063546A1 (ko) * 2022-09-20 2024-03-28 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 플란타룸 균주의 병용 요법 및 이를 이용한 암 치료 방법

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