JP2022543026A - Nk細胞を評価するためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
本出願は、NK細胞の拡大可能性及び機能を決定するのに有用なナチュラルキラー(NK)細胞特異的な試験に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、NK細胞を評価するためのシステム及び方法に関するものである。
関連出願の相互参照
本出願は、2019年8月1日に出願された米国仮特許出願第62/881,626号の利益を主張し、この全内容は、この参照により全体が本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照
本出願は、2019年8月1日に出願された米国仮特許出願第62/881,626号の利益を主張し、この全内容は、この参照により全体が本明細書に組み込まれる。
末梢血単核細胞(PBMC)のリンパ球集団は、主に、T細胞、B細胞、及びナチュラルキラー細胞(NK細胞)を構成する。NK細胞は、ウイルス感染に対する中心的な防御及び腫瘍細胞の殺傷を担うことが知られており、抗原特異的細胞表面受容体を欠くため、自然免疫のエフェクターとして分類されている。T細胞は、体液性免疫を媒介する細胞性免疫を媒介し、自然免疫系と緊密に連携して作用する適応免疫を提供することが知られている。ヒトNK細胞は、CD56及びCD16の表面発現により、ならびにCD3表面発現の欠如により、表現型的に定義される。ヒトNK細胞の約90%は、CD56dim CD16bright細胞であり、主要な細胞傷害性サブセットであることが見出されたのに対し、CD56bright CD16dim/-NK細胞は、より多くのサイトカインを分泌することが見出された。NK細胞により分泌される主要なサイトカインは、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、TNF-β、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-10(IL-10)、及びIL-13である。
がん患者の末梢血から単離されたNK細胞は、特に、がんの進行期に表現型及び機能性の変化を示す。新たに単離された腫瘍浸潤NK細胞は、自己腫瘍に対して細胞傷害性でないことが示されている。T細胞機能不全もまた、がん患者において報告されている。さらに、がん患者の末梢血から得られたNK細胞及びT細胞、特に、NK細胞は、機能、特に、細胞傷害活性が、有意に低減している。NK細胞の抑制は、腫瘍微小環境におけるNK受容体の下方制御により媒介される。末梢血リンパ球のNK細胞浸潤及び細胞傷害活性は、がん患者の予後と間接的な相関関係を有する。
主要なT細胞亜集団は、ヘルパー(CD4+)T細胞及び細胞傷害性(CD8+)T細胞である。腫瘍から保護する細胞性免疫応答は通常、CD8+T細胞に帰属しており、CD8+T細胞は、がんに対する化学療法応答に関連する。CD8+メモリーT細胞を伴う多数のT細胞、T制御性(Treg)の割合(%)が高い腫瘍浸潤CD4+T細胞の割合の減少、及び腫瘍部位でのCD4/CD8比率の逆転は、固形がん患者の全生存率と有意に関連していた。CD62L及びCCR7の高い発現を伴うCD45RA+T細胞は、メモリーT細胞と比較して、より長い活性寿命を有し、がんに対してより効果的であることが示されている。CD28共刺激は、T細胞の抗腫瘍及び抗菌活性において重要な役割を担い、がん患者のT細胞上でのCD28の表面発現が低いことは、それらの患者におけるがん及び感染に対して戦うためのT細胞の活性が低いことを示す。T細胞の表面上でのCD127の表面発現の低下は、がん及び感染症の存在により影響を受けることが示されている。
ナチュラルキラー(NK)細胞は、MHCクラスI、CD54、及びB7H1の発現が低く、CD44の発現が高いがん幹細胞/未分化腫瘍を、溶解及び分化する。末梢血リンパ球の中程度及び高い細胞傷害活性は、がんリスクの低減と関連し、腫瘍の高NK細胞浸潤は、より良好な予後と関連するのに対し、低活性は、がんリスクの増加と関連する。
がん幹細胞(CSC)/低分化腫瘍上でのMHCクラスI発現が低いことは、それらの生存に有利に働く可能性があり、がん患者におけるT細胞ベースの免疫療法に対するそれらの限られた効果を説明する。CSCは、NK細胞媒介性細胞傷害の優れた標的であるのに対し、それらの分化した対応物は、有意により耐性がある。さらに、腫瘍の脱分化は、NK細胞媒介性細胞傷害に対するそれらの感受性の増加をもたらした。初代NK細胞の細胞傷害機能が、CSC/幹細胞との相互作用後に抑制されるということが知られている。NK細胞は、CSC/未分化腫瘍とのCD16受容体架橋または相互作用の結果として、スプリットアネルギーを受ける。これは、NK細胞傷害性を喪失するが、IFN-γのより多くの分泌が誘発され、抗PD-1療法の効果と相関することが最近示されている腫瘍上でのMHCクラスI、CD54、及びPD-L1の分化抗原発現における増加を促進する、鍵となる事象である。実際に、循環するNK細胞の全体的なより高いレベルは、がん患者のより良好な予後と関連する。
NK細胞の抗腫瘍活性は、NK細胞をがんの免疫療法で使用するための魅力的な候補にし、様々なNK細胞ベースの療法が、悪性腫瘍についてクリニックで評価されているか、または現在評価される。しかし、がんが欠陥のあるNK細胞を誘導する機序を生じるので、がん患者由来のNK細胞は、様々な抗腫瘍活性を示す。従って、がん患者由来のNK細胞は、多くの場合、最適に機能せず、NK細胞ベースの免疫療法での使用に適しない。例えば、がん患者の末梢血中のNK細胞の細胞傷害活性が低減し、さらには、NK細胞活性化受容体の発現は、早期がんであっても減少し、さらに、進行した疾患で低減している。NK細胞機能の欠陥は、膵癌の前腫瘍期及び腫瘍形成期の両方で見られる。
従って、NK細胞の拡大可能性及び機能、ならびにNK細胞ベースの免疫療法で使用されるNK細胞の適合性を正確に評価する方法が大いに必要とされる。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書に提示される方法が、NK細胞拡大可能性及び機能を評価する、驚くほど感度が高く且つ特定の方法を提供するという発見に基づく。これらの方法は、健常患者及び罹患患者のNK細胞の機能及び拡大可能性を決定するのに役立つ。いくつかの実施形態では、患者は、膵癌または口腔癌(例えば、口腔扁平上皮癌)などのがんを有する。本明細書に提示される方法もまた、罹患患者を処置する免疫療法で使用されるNK細胞の適合性を決定するのに有用である。そのようなNK細胞は、患者にとって自己または同種異系であってよい。いくつかの実施形態では、NK細胞は、本明細書に記載の方法を使用して評価される前及び/または後に、in vitro、ex vivo、またはin vivoで拡大、改変、及び/または活性化されてもよい。特定の実施形態では、NK細胞の拡大、改変、及び/または活性化は、NK細胞を、サイトカイン、抗体、破骨細胞、CD16受容体などのNK機能に重要な遺伝子をコードする外因性核酸、及び/またはそれら任意の組み合わせと接触させることを含む。そのような外因性核酸は、限定されないが、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)を含むウイルスベクターにより形質導入されてもよい。
本明細書に記載の方法は、NK細胞の複数の機能を評価し、これらの組み合わせは、以前は有用または必須であると予測されていなかった。いくつかの実施形態では、方法は、NK細胞の細胞傷害機能を評価し、これは、(i)口腔扁平上皮癌幹細胞(OSCSC)及び/またはMia-Paca-2(MP2)などの、NK細胞に驚くほど感受性のある細胞に対する直接的な細胞傷害性、及び/または、(ii)NK細胞の抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性、を含み、これは、分化した腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞傷害性を評価するのに特に有用である。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、ELISA及び/またはELISPOTにより、NK細胞により産生されるIFN-γの量を評価する。いくつかの実施形態では、方法は、NK細胞により産生されるIFN-γが腫瘍細胞の分化を誘導する能力を評価する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、単独でまたは組み合わせて、さらに、(i)NK細胞上のCD16受容体の量及び/または機能、(ii)NK細胞がCD8+T細胞を拡大させる能力、を含む、NK細胞機能の他の重要な態様を測定すること、及び/または、CD44、CD54、MHCクラスI、PD-L1(B7H1)、及びMICA/Bから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの発現レベルを測定すること、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、さらに、自己NK細胞、同種異系NK細胞、及びNK細胞拡大CD8+T細胞から選択される少なくとも1つを対象に投与することを含み、任意に、NK細胞は、拡大、改変、及び/または活性化されている。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。
本発明は、部分的に、NK細胞の拡大可能性及び機能、及び/またはNK細胞ベースの免疫療法に対するNK細胞の適合性を決定する方法に関する。そのような方法は、がんなどの疾患を処置するために用いることができる。しかし、NK細胞ベースの治療が、一般に、対象の免疫系を強化し、従って、それが有益であり得るいかなる状況においても、対象の免疫系を増強するのに有用であり得るので、方法の有用性は、がんの処置に限定されない。
本明細書に開示されるように、試験NK細胞の細胞傷害機能を評価するために、様々な標準が使用されてもよい。例えば、試験NK細胞の細胞傷害機能は、試験NK細胞を標的細胞、例えば、がん幹細胞(直接的殺傷)、と共インキュベートするか;または試験NK細胞、標的細胞、及び標的細胞に発現する細胞表面マーカーに対する抗体(ADCC活性)を共インキュベートすることにより、測定されてもよい。そのようなアッセイでは、NK細胞の細胞傷害機能は、細胞傷害機能を有さない非NK細胞により殺傷された標的細胞の割合と比較して、所与の時間フレームで、例えば、試験NK細胞により殺傷された標的細胞の割合として、測定されてもよい。あるいは、試験NK細胞により殺傷された標的細胞の割合は、NK細胞なしに殺傷された(例えば、自然死)標的細胞の割合または既知の活性の参照NK細胞(例えば、細胞株、既知または規定の機能及び拡大可能性のNK細胞)により殺傷された標的細胞の割合と比較されてもよい。同様に、試験NK細胞により殺傷された標的細胞の割合が、所定の割合、例えば、通常、活性NK細胞により、in vitro、ex vivo、またはin vivoで殺傷された細胞の割合を表す割合と比較されてもよい。例えば、所定の割合は、罹患または健常対象のいずれかである複数の対象由来のNK細胞のプールから導出されてもよい。一部の場合では、所定の割合は、患者のがんの重症度及び/または、例えば、所与の対象のがんを処置するために殺傷するのに必要ながん細胞の数に基づいて調整されてもよい。いくつかの実施形態では、試験NK細胞により殺傷された細胞の割合は、上記の対照または参照のいずれかと定性的に比較される(例えば、顕微鏡下での視覚化、FACS分析からのMFIプロット)。
あるいは、試験NK細胞の細胞傷害機能は、特定割合の標的細胞を殺傷するのに必要な試験NK細胞数として表されてもよい。次に、この数を、上記で概説された参照または対照のいずれかに対して決定される対応する参照または対照数と比較することができる。同様に、試験NK細胞の細胞傷害機能の他の任意の測定値は、試験NK細胞の細胞傷害機能の定量的または定性的な比較評価を可能にする対応する対照または参照値と比較されてもよい。
同様に、様々な標準は、本明細書に開示のように、試験NK細胞により産生されたIFN-gの量を評価するために使用されてもよい。例えば、試験NK細胞により産生されるIFN-gの量は、測定され、非NK細胞または参照NK細胞(例えば、細胞株、既知または規定の機能及び拡大可能性のNK細胞)により産生されたIFN-gの量と比較されてもよい。NK細胞により産生されたIFN-gの量は、濃度として表されてもよい。いくつかのそのような実施形態では、濃度は、対象(例えば、血清、全血、腫瘍)におけるIFN-gの濃度と比較される。試験NK細胞により産生されたIFN-gの量または濃度は、既知の状態(例えば、罹患または健常)の複数の対象の試料を表す値などの所定の値と比較されてもよい。
本明細書に開示されるように、試験NK細胞のIFN-gが腫瘍細胞の分化を誘導する能力を評価するため、様々な標準もまた、使用されてもよい。例えば、分化腫瘍細胞がゆっくりと成長するか、またはそれらの細胞分裂が阻害される場合、IFN-gの腫瘍成長及び/または腫瘍細胞分裂を減少及び/または阻害する能力が監視される。試験NK細胞のIFN-gと共インキュベートされた腫瘍細胞の測定された成長及び/または細胞分裂は、IFN-gなしの腫瘍細胞の成長及び/または細胞分裂と、既知の活性の参照IFN-gを有する腫瘍細胞の成長及び/または細胞分裂と、または既に分化した細胞の成長及び/または細胞分裂と比較されてもよい。同様に、試験NK細胞のIFN-gと共インキュベートされた腫瘍細胞の測定された成長及び/または細胞分裂は、好適な未分化細胞(例えば、がん細胞株、がん幹細胞)の成長及び/または細胞分裂と比較されてもよい。
試験NK細胞のIFN-gが腫瘍細胞の分化を誘導する能力は、細胞分化に関連する細胞マーカーの変化を調べることにより評価することができる。例えば、様々な分化状態を示す1つ以上の異なる細胞表面マーカー(例えば、CD44、CD54、MHCクラスI、PD-L1)のレベルは、試験NK細胞のIFN-gでのインキュベーションまたは処理後に測定されてもよい。次に、試験NK細胞のIFN-gで処理された細胞上のマーカーの測定レベル(複数可)を、IFN-g、分化細胞(例えば、正常な初代細胞、形質転換されていない細胞)、または未分化細胞(例えば、がん細胞株、がん幹細胞)で処理されていない細胞上のマーカーのレベル(複数可)と比較することができる。あるいは、それらの細胞上のIFN-gの影響を評価するために、試験NK細胞のIFN-gを用いる処理の前後のそのようなマーカーのレベル(複数可)を測定及び比較することができる。
本明細書に開示されるように、様々な標準が、試験NK細胞のIFN-gが腫瘍細胞の分化を誘導する能力を評価するために使用されてもよい。例えば、分化腫瘍細胞がNK細胞媒介性殺傷に耐性がある場合、試験NK細胞のIFN-gでインキュベートされた腫瘍細胞は、参照NK細胞(例えば、細胞傷害機能を有することが知られているもの)により殺傷の程度について試験されてもよい。試験NK細胞のIFN-gにより分化した腫瘍細胞の参照NK細胞媒介性細胞傷害性殺傷を測定する際に、NK細胞細胞傷害機能を試験するために上に開示される比較器のいずれか1つが使用されてもよい。
特定の実施形態では、試験NK細胞のIFN-gの活性を正常なIFN-gの活性と比較するために、または試験NK細胞のIFN-gの活性を絶対スケールで評価して、好適な参照または対照値と比較するために、IFN-gの固有活性を評価するための他の方法は、同様に使用することができる。
試験NK細胞が破骨細胞で拡大する能力を評価するために、様々な基準が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、破骨細胞と共インキュベートした後のNK細胞の数は、破骨細胞と共インキュベートする前のNK細胞の数、破骨細胞と共インキュベートせずに培養された対照細胞集団のNK細胞の数、または破骨細胞で拡大した参照(例えば、正常)NK細胞の試料を表す値などの所定の値と比較される。これらの破骨細胞は、NK細胞に対して自己であっても、なくてもよい。
試料NK細胞がCD8+T細胞を拡大させる能力を評価するために、様々な標準が使用されてもよい。NK細胞媒介性拡大後のCD8+T細胞の数は、NK細胞媒介性拡大前のCD8+T細胞の数と、NK細胞で拡大していないCD8+T細胞の数と、または参照(例えば、正常)NK細胞で拡大したCD8+T細胞の試料を表す値などの所定の値と比較されてもよい。あるいは、所定の値は、既知の状態(例えば、がんに罹患しているか、または健常)の複数の対象からのNK細胞の拡大可能性を表す値を表し得る。好ましい実施形態では、同じNK細胞で拡大したCD4+T細胞の数と比較して、NK細胞で拡大したCD8+T細胞の数を決定した。CD8+T細胞対CD4+T細胞の比は、上述の対照及び/または参照標準のいずれかと比較されてもよい。
同様に、試験NK細胞上のCD16受容体の機能を評価するために、様々な標準が使用されてもよい。例えば、CD16での処理に応答してNK細胞により分泌されたIFN-gの量が決定され、上記の対照及び/または参照標準のいずれか、特に、IFN-gの測定に関連するものと比較されてもよい。試験NK細胞がCD16に応答する分化腫瘍に対するADCC機能を媒介する能力は、代替的または追加的に測定され、比較のための基礎として使用されてもよい。測定されたADCC機能は、上述の対照及び/または参照標準のいずれか、特に、NK細胞の細胞傷害機能の測定に関連するもの、と比較されてもよい。
NK細胞上のCD16受容体の量を評価するために、様々な基準が使用されてもよい。例えば、測定された量は、正常なNK細胞、例えば、健常対象及び/またはがんのない対象からのNK細胞上のCD16受容体の量と比較されてもよい。あるいは、測定された量は、参照NK細胞(例えば、細胞株)上のCD16受容体の量と比較されてもよい。
CD44、CD54、MHCクラスI、PD-L1(B7H1)、MICA、及び/またはMICBの量を評価するために、様々な基準が使用されてもよい。がん細胞で測定された量は、任意の未分化のがん細胞(例えば、がん細胞株、がん幹細胞)または分化したがん細胞(例えば、正常な初代細胞、非形質転換異形成細胞)上の同じマーカーの量と比較されてもよい。同様に、腫瘍組織及び/またはその解離細胞でも、上記のマーカーが特性決定されてもよい。
複数のアッセイを使用して、NK細胞を評価するための本明細書に記載の方法については、全てのアッセイが、全く同じ細胞で実施される必要があるわけではないと理解されるであろう。NK細胞は、第1のアッセイでNK細胞の第1の試料、2のアッセイで細胞の第2の試料を試験することなどにより評価されてもよいが、但し、各試料が実質的にランダムであり、群としてNK細胞を代表する。対象のNK細胞を評価する方法では、NK細胞が患者の単一のサンプリングで得られることは好ましいが、場合により異なる時でも、異なる時間のNK細胞が依然として、対象のNK細胞を合理的に代表する限り、NK細胞を複数のサンプリングで得ることができる。
従って、本明細書に記載のアッセイに、様々な試料が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、患者の腫瘍組織が得られ、腫瘍組織の特徴(例えば、分化状態)が(例えば、免疫組織化学により)分析されてもよい。追加的または代替的に、腫瘍細胞及び浸潤性免疫細胞は、腫瘍組織から(例えば、機械的または化学的に)解離されて、本明細書に記載のアッセイを使用して分析されてもよい。腫瘍組織及び/または解離細胞の分析は、患者の浸潤性免疫細胞(例えば、NK細胞)の分析と比較されてもよく、これにより、腫瘍細胞/組織に対する免疫機能の状態及び/または腫瘍細胞の状態、例えば、腫瘍細胞の分化ステージの重要なin vivo決定が可能になる。例えば、免疫細胞による腫瘍細胞の高い浸潤は、高い分化ステージの腫瘍が小さい腫瘍サイズに対応することを示し得る。従って、これらの試験は、がん患者の処置方策を考案するための貴重な予後ツール及びガイドを提供する。
これらのアッセイの多くの用途が、本明細書で提供される。健常者のNK細胞の状態及び罹患患者(例えば、がんに罹患する患者)のものを評価するために、これらのアッセイが使用されてもよく、このNK細胞機能及び/または拡大可能性が損なわれ得る。患者の自己NK細胞が免疫療法に適するかどうかを評価するためにも、これらのアッセイが使用されてもよい。そのような評価は、追加のNK細胞の拡大及び/または活性化の有無にかかわらず行われてもよい。患者に対して同種異系のNK細胞を免疫療法に使用すべきかどうかを判定するために、これらのアッセイが使用されてもよい。さらに、そのような同種異系NK細胞が免疫療法に適するかどうか判定するために、これらのアッセイが使用されてもよい。
患者に好適な治療レジメンを選択するために、本明細書で提供されるアッセイが使用されてもよい。例えば、患者のNK細胞が、好適な細胞傷害性を有するが、標準以下のレベルのIFN-γ分泌及び/またはIFN-γ腫瘍分化能を示すと判定される場合、患者のNK細胞におけるIFN-γ分泌のレベルを増加させるために、患者は、IL-2(好ましくは、低用量で)及び/または本明細書でより詳細に記載されるプロバイオティック細菌を用いる治療を受けるように選択されてもよい。そのような患者はまた、例えば、本明細書に記載の方法のうちの1つ以上により、拡大及び/または活性化されているNK細胞(自己または同種異系)の注入から恩恵を受けてもよい。
同様に、患者のNK細胞が標準量のIFN-γを産生するが、標準以下の拡大可能性、細胞傷害性、またはCD8+T細胞を拡大する能力を示す場合、IL-2、IL-15、及び/またはIL-21の治療レジメンを受けるように患者が選択されてもよい。代替的または付加的に、患者は、患者のNK細胞の細胞傷害機能を改善するために、例えば、IL-2(好ましくは低用量で)及び/または本明細書でより詳細に記載されるプロバイオティック細菌を用いる治療を受けるように選択されてもよい。細胞傷害性が欠損しているが、IFN-gの分泌が維持される、スプリットアネルギー化NK細胞を有する患者では、IFN-γは、化学療法の影響を受けやすくするように腫瘍の分化を促進し得る。従って、そのような患者は、化学療法及び/または放射線療法による処置を受けるようにさらに選択され得る。
患者のNK細胞の複数のNK細胞機能(例えば、細胞傷害性、拡大可能性、IFN-γ分泌、IFN-γ腫瘍分化能、CD8+T細胞を拡大させる能力)が標準以下であると判定される場合、患者は、注入、例えば、NK細胞(自己または同種異系)、例えば、本明細書に記載の方法のうちの1つ以上により拡大及び/または活性化されているNK細胞の反復注入を受けて、本明細書に記載のアッセイで評価されたNK細胞の機能の全てまたはほとんど全てに対する基準に合うように、選択され得る。そのような患者はまた、本明細書に記載されるIL-15、IL-2(例えば、低用量)、及び/またはプロバイオティクス細菌を用いる処置を受けるように選択され得る。
特定の好ましい実施形態では、方法は、さらに、患者が受けるように選択されている処置のうちの1つ以上を患者に投与することを含んでもよい。
NK細胞が、機能及び/または拡大可能性において標準的または標準以下であるかを判定する様々な基準が使用されてもよい。特定の好ましい実施形態では、NK細胞が、がん細胞及び/またはがん幹細胞を殺傷(例えば、直接殺傷及び/またはADCC依存性殺傷)する効率が、健常なNK細胞が、がん細胞及び/またはがん幹細胞を殺傷する効率の25%未満である場合、NK細胞は標準以下とみなされ得る。いくつかの実施形態では、1つのがん細胞の殺傷を媒介するために必要とされるNK細胞の数が決定され得る。例えば、1つのがん細胞を殺傷(直接殺傷及び/またはADCC依存性殺傷)するために、少なくとも2つの標準以下のNK細胞が必要とされ得る。対照的に、1つのがん細胞を殺傷するために、わずか約0.25~約0.5の標準的または健常なNK細胞が通常必要とされる。すなわち、1つの健常なNK細胞は、複数のがん細胞またはがん幹細胞、例えば、2つ、3つ、あるいはさらには4つのがん細胞またはがん幹細胞を殺傷することができ得る。
いくつかの実施形態では、IL-2で処理された時のNK細胞により産生されたIFN-γの量が、IL-2で処理された時の標準または健常なNK細胞により産生されたIFN-γの量の約33%未満である場合、NK細胞は、標準以下と考えられてもよい。特定の実施形態では、NK細胞は、IL-2で処理された時の100万毎のNK細胞により産生されたIFN-γの量が、約100ピコグラム(pg)未満(例えば、ELISAにより測定)である場合、標準以下とみなされ得る。対照的に、100万毎の標準的または健常なNK細胞は、約3倍のIFN-γ(約300ピコグラム)を産生し得る。同様に、NK細胞が単一細胞レベルで健常なNK細胞により産生されたIFN-γの量の約30%未満を産生する場合、NK細胞は、標準以下とみなされ得る。例えば、標準以下のNK細胞は、約20~30未満のスポット(例えば、ELISPOTで測定)を生じ得る。これは、100を超えるスポットを生じ得る健常なNK細胞と対照的であり、これは、多すぎて正確に計数できないこともある。
特定の態様では、NK細胞により産生されたIFN-γが、腫瘍細胞の分化を誘導することができない場合、NK細胞は、標準以下であるとみなされ得る。例えば、NK細胞により産生されたIFN-γが、腫瘍成長及び/または腫瘍細胞分裂を少なくとも50%減少または阻害しない場合、NK細胞は、標準以下であり得る。特定の実施形態では、NK細胞により産生されたIFN-γが、CD44の発現レベルを減少させないか、及び/または対照における同じマーカーの発現レベルと比較して、CD54、MHCクラスI、及びPD-L1のうちの少なくとも1つの発現レベルを少なくとも3倍増加させる場合、NK細胞は、標準であり得る。いくつかの実施形態では、NK細胞により産生されたIFN-γが、対照の耐性と比較して、NK細胞媒介性細胞傷害に対する腫瘍細胞の耐性を約60~70%未満増加させる場合、NK細胞は、標準以下であり得る。
特定の態様では、NK細胞は、本明細書で詳細に記載される1つ以上の方法による活性化を必要とすると考えられる。いくつかの実施形態では、上で概説された任意の基準により標準以下であると考えられるNK細胞は、さらに活性化される必要がある。いくつかの実施形態では、上記の基準と類似しているが差異が考えられ得る。例えば、NK細胞が、単一細胞レベルで、約20~40スポット未満(例えば、ELISPOTで測定)を生じる場合、NK細胞は、活性化を必要とすると考えられ得る。特定の実施形態では、NK細胞により産生されたIFN-γが、腫瘍成長及び/または腫瘍細胞分裂を少なくとも50%減少または阻害しない場合、NK細胞は、活性化を必要とすると考えられ得る。さらに、NK細胞により産生されたIFN-γが、対照における同じマーカーの発現レベルと比較して、CD44の発現レベルを減少させるか、及び/またはCD54、MHCクラスI、及びPD-L1のうちの少なくとも1つの発現レベルを約2~3倍未満で増加させる場合、NK細胞は、活性化を必要とすると考えられ得る。さらに、NK細胞により産生されたIFN-γが、対照における耐性と比較して、NK細胞媒介性細胞傷害に対する腫瘍細胞の耐性を約50~70%未満増加させる場合、NK細胞は、活性化を必要とすると考えられ得る。活性化後、NK細胞が、元々標準以下の基準または基準に従って再試験することができるか、またはアッセイの元のパネルで再試験することができる。
いくつかの実施形態では、NK細胞が破骨細胞で拡大する能力が決定されてもよい。例えば、NK細胞が、破骨細胞で、4週間以内に少なくとも約17~21の集団倍加に拡大しない場合、NK細胞は標準以下と考えられてもよい。
特定の実施形態では、NK細胞がCD8+T細胞を拡大する能力が評価されてもよい。例えば、NK細胞がCD8+T細胞を少なくとも10倍に拡大させない場合、NK細胞は、標準以下と考えられてもよい。
特定の実施形態では、NK細胞上のCD16受容体の量及び/または機能が評価される。NK細胞が、CD16発現のレベルにおいて少なくとも20%の減少を示す場合、NK細胞は、標準以下と考えられてもよい(例えば、フローサイトメトリー(MFI)、ウェスタンブロット、mRNA/cDNAを検出するためのPCRで測定)。
VIII.NK細胞の活性化
NK細胞が本アッセイにより記載された基準により不十分に活性または不活性であるとみなされる場合、NK細胞を活性化するために、多数の方法のうちのいずれかを使用することができる。好適な方法は、当該技術分野で既知であり、及び/または本明細書に開示される。NK細胞を活性化する特定の好ましい実施形態は、国際特許出願WO2018/112366及びWO2018/152340(本明細書で参照により本明細書に組み込まれる)に開示されるものを含む。
NK細胞が本アッセイにより記載された基準により不十分に活性または不活性であるとみなされる場合、NK細胞を活性化するために、多数の方法のうちのいずれかを使用することができる。好適な方法は、当該技術分野で既知であり、及び/または本明細書に開示される。NK細胞を活性化する特定の好ましい実施形態は、国際特許出願WO2018/112366及びWO2018/152340(本明細書で参照により本明細書に組み込まれる)に開示されるものを含む。
NK細胞は、例えば、in vitro、ex vivo、またはin vivoで、NK細胞を活性化するのに十分な量のCD16を発現する単球と、NK細胞を接触させることにより活性化されてもよい。いくつかのそのような実施形態では、単球は、CD16の発現を誘導する外因性DNAを含む。あるいは、NK細胞は、IL-2、CD16、抗CD16抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び少なくとも1つの細菌株を含む組成物、例えば、プロバイオティクス組成物、好ましくは、sAJ2細菌を含むもののうちの少なくとも1つと接触させることにより、活性化されてもよい。多数の好適なプロバイオティクス組成物が、本明細書及び国際特許出願WO18/112366に開示される。
活性化後、NK細胞は、元々標準以下の基準または基準に従って再試験することができるか、またはアッセイの元のパネルで再試験することができる。NK細胞が再検査に合格する場合、それらは、患者に投与するか、または元の一連のアッセイで、基準(複数可)を満たすとみなされているかように、別の方法で処置することができる。
I.定義
冠詞「a」及び「an」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指すように使用される。例として、「an」要素は、1つの要素または複数の要素を意味する。
冠詞「a」及び「an」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指すように使用される。例として、「an」要素は、1つの要素または複数の要素を意味する。
「投与する」という用語は、治療薬がその意図された機能を実施することを可能にする投与経路を含むことが意図される。投与経路の例としては、注射(皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内など)、経口、吸入、及び経皮経路が挙げられる。注射は、ボーラス注射または連続注入であり得る。治療薬は、単独で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて投与されてもよい。投与経路の例としては、さらに、身体への細胞の移植(transplantation)または移植(grafting)が挙げられ、これに、身体の外科的開口部が先行しても、先行しなくてもよい。本発明の免疫増強剤、例えば、NK細胞、CD8+T細胞は、好ましくは、免疫細胞媒介性免疫応答を増強するために、in vivoでの医薬投与に適する生物学的に適合性のある形態で対象に投与される。「in vivoでの投与に適する生物学的に適合性のある形態」とは、いかなる毒性作用をも治療効果が上回る投与されるべき形態を意味する。
「活性化すること」または「活性化」という用語は、標的の機能の増強を指す。例えば、本開示は、in vitro、ex vivo、及び/またはin vivoでNK細胞を活性化する方法を提供する。本開示では、細胞の活性化は、少なくとも活性の増強及び/または少なくとも1つの細胞機能(例えば、細胞傷害性、細胞分裂、及び/または成長速度など)を含む、そのような細胞の機能の増強を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される作用物質は、NK細胞(複数可)などの少なくとも1つの細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される作用物質は、NK細胞(複数可)などの細胞の少なくとも1つの機能を活性化する。
「NK細胞機能(複数可)」という用語は、細胞傷害性及び/またはIFN-γの分泌を含むサイトカイン/ケモカイン産生/分泌活性などのNK細胞の任意の機能を指す。
「がん」または「腫瘍」または「過剰増殖性」という用語は、制御不能な増殖、不死、転移可能性、急速な成長、及び増殖速度、ならびに特定の特徴的な形態学的特徴など、がんを引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在を指す。別途記載のない限り、本用語は、化生を含む。いくつかの実施形態では、そのような細胞は、少なくとも1つの遺伝子変異による一部または全てのそのような特徴を示す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であることが多いが、そのような細胞は、動物内に単独で存在しても、白血病細胞などの非腫瘍化がん細胞であってもよい。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、前悪性及び悪性のがんを含む。がんは、B細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病、良性モノクローナル免疫グロブリン血症、及び免疫細胞性アミロイドーシス、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織のがんなどを含むが、これらに限定されない。本発明に包含される方法に適用可能ながんのタイプの他の非限定例としては、ヒト肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫(endotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、肝癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌腫、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫;白血病、例えば、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病(骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病);慢性白血病(慢性骨髄性(顆粒球性)白血病及び慢性リンパ性白血病);ならびに真性多血症、リンパ腫(ホジキン病及び非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに重鎖病が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは、本質的に上皮性であり、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科のがん、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または皮膚癌を含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、がんは、口腔癌、口腔扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、または結腸癌である。さらに他の実施形態では、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌(例えば、漿液性卵巣癌)、または乳癌である。限定されないが、漿液性、子宮内膜、粘液性、明細胞、ブレナー、または未分化を含む上皮癌は、他の様々な方法で特性決定されてもよい。
「対照」という用語は、正常な患者、正常な対象などの対象から単離された培養初代細胞/組織、患者の同じ臓器もしくは身体の位置から得られた隣接する正常な細胞/組織、正常な対象から単離された組織もしくは細胞試料、または保管場所から得られた初代細胞/組織などの任意の好適な参照標準を指す。他の好ましい実施形態では、対照は、発現レベル、特定の細胞型の数(例えば、NK細胞もしくは単球)、及び/または正常もしくは健常対象などの一連の対象に対する特定の細胞型の細胞機能を含んでもよい。いくつかの実施形態では、対照は、試験剤、例えば、IFN-gを欠く試料を指す。
「対照」という用語は、試験試料中の発現産物との比較を提供するのに適する任意の参照標準も指す。一実施形態では、対照は、発現産物レベル、例えば、NK細胞、腫瘍細胞、単球上のバイオマーカーが検出され、試験試料からの発現産物レベルと比較される「対照試料」を得ることを含む。そのような対照試料は、限定されないが、既知の結果を有する対照がん患者由来の試料(試料もしくは以前の試料の測定値を保存することができる);正常患者もしくはがん患者などの対象から単離された正常組織もしくは細胞、正常対象もしくはがん患者などの対象から単離された培養初代細胞/組織、がん患者の同じ臓器もしくは身体の位置から得られた隣接正常細胞/組織、正常対象から単離された組織もしくは細胞試料、または保管場所から得られた初代細胞/組織を含む、任意の好適な試料を含んでもよい。いくつかの実施形態では、対照は、限定されないが、ハウスキーピング遺伝子、正常組織(または他の以前に分析された対照試料)からの発現産物レベル範囲、患者群または特定の結果(例えば、1、2、3、4年などの生存)を有するか、もしくは特定の処置を受けている(例えば、標準治療のがん療法)一連の患者由来の試験試料内で以前に決定された発現産物レベル範囲を含む、任意の好適な供給源の参照標準発現産物レベルを含んでもよい。そのような対照試料及び参照標準発現産物レベルは、本発明の方法における対照として組み合わせて使用することができると、当業者らに理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、試料内のタンパク質または核酸の量は、同じ試料中の別の遺伝子のタンパク質または核酸の量と比較して、またはそれの比として、決定されてもよい。いくつかの実施形態では、対照は、限定されないが、試験試料における2つの遺伝子の発現産物レベルの比を決定して、参照標準における同じ2つの遺伝子の任意の好適な比と比較すること;試験試料における2つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定して、任意の好適な対照における発現産物レベルの差を決定すること;及び試験試料における2つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定して、その発現を、試験試料におけるハウスキーピング遺伝子の発現に正規化して、任意の好適な対照と比較すること、を含む、発現産物レベルの変換比を含む。好ましい実施形態では、対照は、試験試料と同じ系統及び/またはタイプのものである対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、全てのがん患者などの一連の患者試料内またはそれに基づいてパーセンタイルとしてグループ化された発現産物レベルを含んでもよい。一実施形態では、対照発現産物レベルが確立され、例えば、特定のパーセンタイルと比較して、高いまたは低いレベルの発現産物が、結果を予測するための基礎として使用される。別の好ましい実施形態では、既知の結果を有する対照がん患者由来の発現産物レベルを使用して、対照発現産物レベルが確立され、試験試料由来の発現産物レベルが、結果を予測するための基礎として対照発現産物レベルと比較される。以下のデータにより示されるように、試験試料対対照では、本発明の方法は、発現産物のレベルの比較における特定のカットポイントの使用に限定されない。
「免疫細胞」という用語は、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血起源であり、リンパ球、例えば、B細胞及びT細胞;ナチュラルキラー細胞;骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達において重要な小タンパク質(約5~20kDa)の広い及び緩いカテゴリーを指す。それらの放出は、それらの周りの細胞の挙動に作用する。サイトカインは、免疫調節作用物質として、自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達、及び内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子を含み、さらに、本開示ではホルモンまたは成長因子を含んでもよい。サイトカインは、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球及びマスト細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、及び様々な間質細胞を含む、幅広い細胞により産生される。好ましいサイトカインを、本開示の明細書及び図面に例示される。
「サイトカイン/ケモカイン活性」という用語は、サイトカインまたはケモカインが細胞機能の少なくとも1つを調節する能力を含む。一般に、サイトカインまたはケモカインは、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答間のバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、成長、及び応答性を制御する。従って、「サイトカイン/ケモカイン活性」という用語は、サイトカインまたはケモカインが天然の細胞受容体(複数可)に結合する能力、細胞シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力を含む。
「免疫応答」という用語は、NK媒介性、T細胞媒介性、及び/またはB細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、T細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害を含む。さらに、免疫応答という用語には、NK細胞またはT細胞の活性化により間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生(体液性応答)及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。
「免疫療法(複数可)」という用語は、がんなどの疾患と戦うために対象の免疫系の特定の部分を使用する任意の処置を指す。対象自身の免疫系は、その目的のための1つ以上の作用物質の投与の有無にかかわらず、刺激(または抑制)される。いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫細胞の投与を含む。いくつかの実施形態では、免疫療法は、対象へのNK細胞及び/またはCD8+T細胞の投与を含む。NK細胞及び/またはCD8+T細胞は、対象に対して自己または同種異系であってよい。NK細胞及び/またはCD8+T細胞は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで拡大、改変、及び/または活性化されてもよい。
「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、疾患、障害、または状態に罹患していないが、これを発症するリスクがあるか、または発症しやすい対象の疾患、障害、または状態を発症する可能性を低減させることを指す。
「阻害する」という用語は、例えば、特定の作用、機能、または相互作用の低減、減少、制限、または遮断を含む。一部の実施形態では、がんは、がんの少なくとも1つの症状が緩和、終結、減速、または予防される場合に、「阻害」される。本明細書で使用される場合、がんは、がんの再発または転移が低減、減速、遅延、または予防される場合にも、「阻害」される。
「対象」という用語は、任意の健常な動物、哺乳動物もしくはヒト、またはがん、例えば、脳転移、口腔癌、肺、卵巣、膵臓、肝臓、乳房、前立腺、結腸癌、メラノーマ、多発性骨髄腫などに罹患した任意の動物、哺乳動物、もしくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と互換性がある。
「治療効果」という用語は、薬理学的に活性な物質により引き起こされた、動物、特に、哺乳動物、より詳細には、ヒトにおける局所的または全身的効果を指す。「治療的有効量」という表現は、任意の処置に適用可能な合理的な利益/リスク比で何らかの望ましい局所または全身効果を生じるような物質の量を意味する。
「量」または「レベル」という用語は、核酸のコピー数、及び/またはタンパク質の量もしくはレベルを指す。核酸またはタンパク質の量またはレベルは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して決定されてもよい。
本明細書で使用される場合、試料中のバイオマーカーまたは活性の量(例えば、CD16、CD44、CD54、MHCクラスI、PD-L1(B7H1)、MICA、MICB、IFN-g、細胞傷害機能、拡大T細胞の数、破骨細胞で拡大したNK細胞の数など)は、量が、正常対照レベルよりも、量を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも多い量だけ、好ましくは、その量よりも少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、350%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、多いまたは少ない場合、バイオマーカーまたは活性の正常/対照量よりも、それぞれ、「有意に」多いまたは少ない。そのような「有意性」は、任意の所望のまたは既知の比較点、例えば、特定の後処理対前処理バイオマーカー測定値の比、例えば、IFN-gの処理による腫瘍細胞の分化(例えば、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍など)から評価することができる。代替的に、試料中のバイオマーカーまたは活性の量は、量が、それぞれバイオマーカーまたは活性の正常量の少なくとも約2倍、3倍、4倍、もしくは5倍高いまたは低い場合、正常量よりも「有意に」高いまたは低いと考えることができる。そのような「有意性」は、例えば、発現、細胞傷害、細胞成長などについて、本明細書に記載の他の任意の測定されたパラメーターに適用することもできる。
本発明は、抗体依存性細胞傷害アッセイを含むアッセイにおいて及びバイオマーカーを検出するために抗体を使用する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル;異種、同種異系、もしくは同系;またはその改変型(例えば、ヒト化、キメラなど)であってよい。抗体はまた、完全にヒトであってよい。好ましくは、本発明の抗体は、バイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に、または著しく特異的に結合する。「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原の特定のエピトープと免疫応答することができる抗原結合部位のうち1種のみを含有する抗体ポリペプチドの集団を指すが、「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位のうち複数種を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、通常、免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。
NK細胞
ナチュラルキラー細胞またはNK細胞は、自然免疫系に重要な細胞傷害性リンパ球の一種である。NK細胞が担う役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性T細胞の役割と類似している。NK細胞は、ウイルス感染細胞に迅速に応答し、感染後およそ3日で作用し、腫瘍形成に応答する。通常は、免疫細胞は、感染細胞表面上に提示される主要組織適合性複合体(MHC)を検出し、サイトカイン放出を誘発し、溶解またはアポトーシスを引き起こす。しかし、NK細胞は、抗体及びMHCの不在下でストレスを受けた細胞を認識する能力を有し、はるかに速い免疫反応が可能になるように固有である。それらは、MHCクラス1の「自己」マーカーが欠落している細胞を殺傷するために活性化を必要としないという当初の考えから、「ナチュラルキラー」と名付けられた。MHCIマーカーが欠落している有害な細胞が、Tリンパ球細胞などの他の免疫細胞では検出及び破壊することができないので、この役割は、特に重要である。
ナチュラルキラー細胞またはNK細胞は、自然免疫系に重要な細胞傷害性リンパ球の一種である。NK細胞が担う役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性T細胞の役割と類似している。NK細胞は、ウイルス感染細胞に迅速に応答し、感染後およそ3日で作用し、腫瘍形成に応答する。通常は、免疫細胞は、感染細胞表面上に提示される主要組織適合性複合体(MHC)を検出し、サイトカイン放出を誘発し、溶解またはアポトーシスを引き起こす。しかし、NK細胞は、抗体及びMHCの不在下でストレスを受けた細胞を認識する能力を有し、はるかに速い免疫反応が可能になるように固有である。それらは、MHCクラス1の「自己」マーカーが欠落している細胞を殺傷するために活性化を必要としないという当初の考えから、「ナチュラルキラー」と名付けられた。MHCIマーカーが欠落している有害な細胞が、Tリンパ球細胞などの他の免疫細胞では検出及び破壊することができないので、この役割は、特に重要である。
NK細胞(自然リンパ球の群に属する)は、大顆粒リンパ球(LGL)として定義され、Bリンパ球及びTリンパ球を生じる一般的なリンパ球前駆細胞から分化した第3種の細胞を構成する。NK細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺で分化及び成熟し、次に、循環系に入ることが知られている。NK細胞は、起源及びそれぞれのエフェクター機能により、ナチュラルキラーT細胞(NKT)と表現型的に異なり;多くの場合、NKT細胞活性は、IFNγを分泌することによりNK細胞活性を促進する。NKT細胞とは対照的に、NK細胞は、T細胞抗原受容体(TCR)もしくはパンTマーカーCD3または表面免疫グロブリン(Ig)B細胞受容体を発現しないが、通常、ヒトにおいては、表面マーカーCD16(FcγRIII)及びCD56を発現し、C57BL/6マウスにおいては、NK1.1またはNK1.2を発現する。NKp46細胞表面マーカーは、現時点では、ヒト、マウスのいくつかの系統(BALB/cマウスを含む)の両方及び3つの一般的なサル種において発現している優先する別のNK細胞マーカーを構成する。
NK細胞は、主要組織適合性複合体(MHC)クラスI特異的阻害性受容体により負に制御されている(Karre et al.,1986;Ohlen et al,1989)。これらの特異的受容体は、MHCクラスI分子の多型性決定基または他の細胞上に存在するHLAに結合し、NK細胞溶解を阻害する。ヒトでは、キラーIg様受容体(KIR)と称される受容体のファミリーの特定のメンバーが、HLAクラスI対立遺伝子の群を認識する。
KIRは、NK細胞を含むリンパ球のある特定のサブセットに存在する受容体の大きなファミリーである。KIRの命名法は、細胞外ドメイン(KIR2DまたはKIR3D)の数及び細胞質尾部が長い(KIR2DLもしくはKIR3DL)か、短い(KIR2DSもしくはKIR3DS)かに基づく。ヒトでは、所与のKIRの有無にかかわらず、単一個体に存在するあるNK集団内でNK細胞から別のNK細胞に変化する。ヒトの集団内に、比較的高いレベルのKIR分子の多型もあり、特定のKIR分子が、いくつかの個体に存在するが、全ての個体に存在するわけではない。特定のKIR遺伝子産物は、適切なリガンドに結合する場合、リンパ球活性の刺激を引き起こす。確認された刺激性KIRは全て、免疫刺激性モチーフ(ITAM)を有するアダプター分子と会合する、荷電膜貫通残基を伴う短い細胞質尾部を有する。他のKIR遺伝子産物は、本質的に阻害性である。
ナチュラルキラー細胞は、ヒト血液中の末梢血単核細胞の約10%を構成し、CD3の表面発現の欠如ならびにCD16及びCD56の発現により同定される。NK細胞は、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する直接細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害(ADCC)の両方を媒介する。それらは、事前の感作なしに、これらの細胞を認識し得る。NK細胞は、壊死及びアポトーシスを誘導し得る、パーフォリン及びグランザイムBとして知られる事前に形成された顆粒を放出することにより、直接細胞傷害を媒介する。NK細胞が標的細胞を認識し、溶解性免疫シナプスを形成する場合、分泌型リソソームは、シナプスに向かって分極し、原形質膜の近傍に移動する。膜破壊タンパク質であるパーフォリンは、セリンプロテアーゼであるグランザイムの送達を促進し、これは、カスパーゼなどの様々な標的を切断し、細胞死がもたらされる。NK細胞は、Fasリガンド、Trail、及びTNF-アルファなどのリガンドの表面発現を通して、標的細胞上の細胞死受容体を介して直接細胞傷害を媒介することもできる。腫瘍壊死因子受容体ファミリーに属する細胞表面タンパク質であるFas(CD95/APO-1/TNFRSF6)は、その天然リガンドであるCD95L(CD178/TNFSF6)に結合するか、アゴニスト抗体で刺激される場合、アポトーシスを媒介し得る。NK細胞は、腫瘍に対する抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介し、サイトカイン及びケモカインの分泌を介して他の細胞の機能を制御し得る。
NK細胞の2つの主要なサブセットが同定されており、一方は、CD16+++CD56+の表面発現を伴い、これは、細胞傷害性の高い循環血液内の主なサブセットであるが、他方は、制御性サブセットとして既知の粘膜に存在するCD16-CD56+++サブセットである。本発明者らの研究室は、4つの異なるステージのNK細胞成熟を確立している。ステージ1のNK細胞は、がん幹様細胞/未分化腫瘍を選択及び殺傷することが判明したCD16+++、CD56+、CD69-、及びCD107a-である。IL-2活性化及びCD16受容体誘発の際に、NK細胞は、CD16+/-CD56++CD69+CD107a+を発現し、IFN-γ及びTNF-αの分泌を増加させるが、細胞傷害性の減少を示す。これは、第2ステージであり、このステージのNK細胞は、スプリットアネルギー化NK細胞として既知である。さらなる活性化がなければ、NK細胞は、ステージ3に移り、ここで、NK細胞は非機能性となり、その細胞傷害性及びサイトカイン分泌能を喪失する。最後に、NK細胞は、アポトーシスを受けてもよく、ステージ4が生じる。
プロバイオティクス細菌
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、NK細胞機能を制御することができる少なくとも1つのプロバイオティクス細菌株を含む組成物を使用する。そのようなプロバイオティクス細菌は、活性化NK細胞に有意なスプリットアネルギーを誘発して、IFN-γ及びTNF-αの有意な誘導がもたらされる。加えて、そのようなプロバイオティクス細菌は、NK細胞の著しい拡大を誘導する。この目的に有用な例示的なプロバイオティクス細菌は、国際特許出願WO18/112366(本明細書で参照により本明細書に組み込まれる)に、特に、それが開示するプロバイオティクス細菌について、開示される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、NK細胞機能を制御することができる少なくとも1つのプロバイオティクス細菌株を含む組成物を使用する。そのようなプロバイオティクス細菌は、活性化NK細胞に有意なスプリットアネルギーを誘発して、IFN-γ及びTNF-αの有意な誘導がもたらされる。加えて、そのようなプロバイオティクス細菌は、NK細胞の著しい拡大を誘導する。この目的に有用な例示的なプロバイオティクス細菌は、国際特許出願WO18/112366(本明細書で参照により本明細書に組み込まれる)に、特に、それが開示するプロバイオティクス細菌について、開示される。
多くの市販のプロバイオティクスが利用可能であり、胃腸の不快感を低減するか、または免疫系を強化する様々な効果を有する。本明細書に記載の組成物及び方法で使用される好ましいプロバイオティクス細菌種は、プロバイオティクス細菌(例えば、AJ2細菌)の市販株、特に、Streptococcus(例えば、S.thermophiles)、Bifidobacterium(例えば、B.longum、B.breve、B.infantis、B.breve、B.infantis)、及びLactobacillus属(例えば、L.acidophilus、L.helveticus、L.bulgaricus、L.rhamnosus、L.plantarum、及びL.paracasei)由来のものを含む。方法は、少なくとも1つのプロバイオティック細菌株、好ましくは、2つ以上の異なる細菌株の組み合わせを、対象に、好ましくは、哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することを含んでもよい。そのような投与は、全身的または局所的に(例えば、腸に直接)実施されてもよい。好ましい投与経路は、経口投与である。他の経路(例えば、直腸)も使用されてもよい。投与のために、細菌(例えば、湿式、超音波処理、粉砕、もしくは乾燥形態もしくは製法)、細菌を含有する細菌培地、または細菌培地上清(細菌を不含)のいずれかが投与されてもよい。
AJ2は、IL-2処理またはIL-2+抗CD16モノクローナル抗体処理NK細胞(抗CD16mAb)に添加された場合、IFN-γの相乗的産生を誘導する能力があるグラム陽性プロバイオティクス細菌の8つの株の組み合わせである。株の組み合わせは、バランスの取れた炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインの相乗的誘導ならびに成長因子放出NK細胞に加えて、細菌の多様性を提供するために使用される。免疫細胞に対するAJ2の有益な効果は、国際特許出願WO18/112366(本明細書で参照により本明細書に組み込まれる)に開示される。
抗体依存性細胞傷害
抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、Fc受容体を有する免疫細胞が、抗体のFc部分にFc受容体が結合する際に、抗体で被覆された細胞を殺傷し得る機序である。NK細胞は、CD16としても既知のFcγRIIIA受容体を通してADCCを媒介し得る免疫細胞のサブセットの1つである。NK細胞がADCCを媒介する機序は、完全には理解されていない。エフェクター細胞が、Fc受容体及び標的細胞を被覆する抗体の架橋により標的を認識する場合、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)が、エフェクター細胞においてリン酸化され、標的細胞を殺傷するためのエフェクター細胞における主要な下流シグナル伝達経路の誘発をもたらす。NK細胞媒介性ADCCがパーフォリン-グランザイムを介するものであり得る機序のうちの1つが、細胞傷害を媒介する。ADCCにおけるFASリガンドの役割は、不明であるが、NK細胞上のCD16受容体の架橋は、ADCCにおけるFas/Fas-Lの重要な役割を示している可能性があるNK細胞上のFASリガンドを上方制御し得ることが示されている。
抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、Fc受容体を有する免疫細胞が、抗体のFc部分にFc受容体が結合する際に、抗体で被覆された細胞を殺傷し得る機序である。NK細胞は、CD16としても既知のFcγRIIIA受容体を通してADCCを媒介し得る免疫細胞のサブセットの1つである。NK細胞がADCCを媒介する機序は、完全には理解されていない。エフェクター細胞が、Fc受容体及び標的細胞を被覆する抗体の架橋により標的を認識する場合、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)が、エフェクター細胞においてリン酸化され、標的細胞を殺傷するためのエフェクター細胞における主要な下流シグナル伝達経路の誘発をもたらす。NK細胞媒介性ADCCがパーフォリン-グランザイムを介するものであり得る機序のうちの1つが、細胞傷害を媒介する。ADCCにおけるFASリガンドの役割は、不明であるが、NK細胞上のCD16受容体の架橋は、ADCCにおけるFas/Fas-Lの重要な役割を示している可能性があるNK細胞上のFASリガンドを上方制御し得ることが示されている。
スプリットアネルギー
スプリットアネルギーは、NK細胞の成熟ステージであり、ここで、NK細胞は、細胞傷害性の低減及びIFN-γの分泌の増大を示す。スプリットアネルギー化NK細胞は、分泌因子及び膜結合因子を介して標的細胞の分化を促進し、NK細胞媒介性細胞傷害に対する腫瘍細胞の耐性を増加させ、腫瘍分化後のサイトカイン及びケモカイン産生の低減に起因する炎症を阻害する。
スプリットアネルギーは、NK細胞の成熟ステージであり、ここで、NK細胞は、細胞傷害性の低減及びIFN-γの分泌の増大を示す。スプリットアネルギー化NK細胞は、分泌因子及び膜結合因子を介して標的細胞の分化を促進し、NK細胞媒介性細胞傷害に対する腫瘍細胞の耐性を増加させ、腫瘍分化後のサイトカイン及びケモカイン産生の低減に起因する炎症を阻害する。
がん幹細胞
がん幹細胞(CSC)は、腫瘍塊を規定する分化細胞の様々な集団を作製し得る幹細胞である。CSCは、正常な幹細胞のようなものであり、自己複製能力を有し、分化することもできるが、無制御な方法による。限定されないが、急性骨髄性白血病、乳房、前立腺、メラノーマ、肺、結腸、脳、肝臓、胃、及び膵癌を含む多くの腫瘍において、CSCの存在が記載される。
がん幹細胞(CSC)は、腫瘍塊を規定する分化細胞の様々な集団を作製し得る幹細胞である。CSCは、正常な幹細胞のようなものであり、自己複製能力を有し、分化することもできるが、無制御な方法による。限定されないが、急性骨髄性白血病、乳房、前立腺、メラノーマ、肺、結腸、脳、肝臓、胃、及び膵癌を含む多くの腫瘍において、CSCの存在が記載される。
破骨細胞
破骨細胞は、骨を再吸収することにより骨の恒常性に関与する骨細胞である。破骨細胞は、RANKL刺激を介して成熟し、プロセスは、ICAM-1により制御される。炎症誘発性シグナルは、破骨細胞上でICAM-1及びRANKLの発現を誘導し得る。これらのシグナルは、免疫細胞のサブセットにより媒介される。破骨細胞は、活性化及び阻害性NK細胞受容体の両方に対して複数のリガンドを発現することが示されている。
破骨細胞は、骨を再吸収することにより骨の恒常性に関与する骨細胞である。破骨細胞は、RANKL刺激を介して成熟し、プロセスは、ICAM-1により制御される。炎症誘発性シグナルは、破骨細胞上でICAM-1及びRANKLの発現を誘導し得る。これらのシグナルは、免疫細胞のサブセットにより媒介される。破骨細胞は、活性化及び阻害性NK細胞受容体の両方に対して複数のリガンドを発現することが示されている。
MICA/MICB
主要組織適合性複合体クラスI関連鎖A及びB(MICA/MICB)は、ストレス、損傷、ウイルス感染、または細胞の形質転換時に誘導され、細胞傷害性リンパ球を通した『kill me』シグナルとして作用することが知られているタンパク質である。典型的なMHCクラスI分子とは対照的に、このタンパク質は、抗原提示に関与していないが、細胞傷害性細胞の受容体であるナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)受容体のリガンドであることが知られている。NKG2D受容体の会合は、ナチュラルキラー(NK)細胞媒介性細胞傷害を誘発し、CD8T細胞及びγδT細胞に共刺激シグナルを提供する。MICA/Bは、健常な正常細胞により構成的に発現されるとは考えられていなかったが、最近の研究により、このタンパク質が、胃、小腸、結腸、膀胱、子宮頸部、卵管、前立腺、及び尿管内の平滑筋細胞及び/または筋線維芽細胞中の健常細胞、例えば、乳房、結腸、肝臓、膵臓、胃、気管支、膀胱、及び尿管の表面上にも発現されることが示されている。腫瘍細胞の分化状態に基づくMICA/MICBの差次的発現は研究されていない。この研究では、本発明者らは、未分化/幹様及び分化口腔及び膵腫瘍上のMICA/MICBの発現を評価するであろう。
主要組織適合性複合体クラスI関連鎖A及びB(MICA/MICB)は、ストレス、損傷、ウイルス感染、または細胞の形質転換時に誘導され、細胞傷害性リンパ球を通した『kill me』シグナルとして作用することが知られているタンパク質である。典型的なMHCクラスI分子とは対照的に、このタンパク質は、抗原提示に関与していないが、細胞傷害性細胞の受容体であるナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)受容体のリガンドであることが知られている。NKG2D受容体の会合は、ナチュラルキラー(NK)細胞媒介性細胞傷害を誘発し、CD8T細胞及びγδT細胞に共刺激シグナルを提供する。MICA/Bは、健常な正常細胞により構成的に発現されるとは考えられていなかったが、最近の研究により、このタンパク質が、胃、小腸、結腸、膀胱、子宮頸部、卵管、前立腺、及び尿管内の平滑筋細胞及び/または筋線維芽細胞中の健常細胞、例えば、乳房、結腸、肝臓、膵臓、胃、気管支、膀胱、及び尿管の表面上にも発現されることが示されている。腫瘍細胞の分化状態に基づくMICA/MICBの差次的発現は研究されていない。この研究では、本発明者らは、未分化/幹様及び分化口腔及び膵腫瘍上のMICA/MICBの発現を評価するであろう。
キット
「キット」は、本発明のコピー数、発現、及び/またはマーカーの量を特異的に検出及び/または作用するための少なくとも1つの試薬、例えば、抗体、抗体フラグメント、プローブ、または小分子を含む任意の製品(例えば、パッケージまたは容器)である。キットは、細胞(例えば、破骨細胞またはがん細胞)などの生物学的試薬も含んでもよい。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして宣伝、配布、または販売されてもよい。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現するために必要な1つ以上の試薬を含んでもよい。特定の実施形態では、キットは、さらに、細胞成長、分裂、遊走、生存、またはアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に作用または制御しない参照標準、例えば、タンパク質をコードする核酸を含んでもよい。当業者は、限定されないが、一般的な分子タグ(例えば、緑色蛍光タンパク質及びベータガラクトシダーゼ)、GeneOntology参照により細胞成長、分裂、遊走、生存、もしくはアポトーシスを含む経路のいずれにも分類されないタンパク質、または遍在するハウスキーピングタンパク質を含む多くのそのような制御タンパク質を想定し得る。キット内の試薬は、個別の容器で、または単一の容器内の2つ以上の試薬の混合物として提供されてもよい。加えて、キット内に組成物の使用を記載する教材を含むことができる。
「キット」は、本発明のコピー数、発現、及び/またはマーカーの量を特異的に検出及び/または作用するための少なくとも1つの試薬、例えば、抗体、抗体フラグメント、プローブ、または小分子を含む任意の製品(例えば、パッケージまたは容器)である。キットは、細胞(例えば、破骨細胞またはがん細胞)などの生物学的試薬も含んでもよい。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして宣伝、配布、または販売されてもよい。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現するために必要な1つ以上の試薬を含んでもよい。特定の実施形態では、キットは、さらに、細胞成長、分裂、遊走、生存、またはアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に作用または制御しない参照標準、例えば、タンパク質をコードする核酸を含んでもよい。当業者は、限定されないが、一般的な分子タグ(例えば、緑色蛍光タンパク質及びベータガラクトシダーゼ)、GeneOntology参照により細胞成長、分裂、遊走、生存、もしくはアポトーシスを含む経路のいずれにも分類されないタンパク質、または遍在するハウスキーピングタンパク質を含む多くのそのような制御タンパク質を想定し得る。キット内の試薬は、個別の容器で、または単一の容器内の2つ以上の試薬の混合物として提供されてもよい。加えて、キット内に組成物の使用を記載する教材を含むことができる。
II.対象
特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物及び方法に適する対象は、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、飼育動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなど)であり、好ましくは、ヒトである。
特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物及び方法に適する対象は、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、飼育動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなど)であり、好ましくは、ヒトである。
特定の実施形態では、対象は、がんの動物モデルである。例えば、動物モデルは、ヒト由来がんの同所性異種移植動物モデルであり得る。
本発明の方法の様々な実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び/または免疫療法などの処置を受けたことがない。他の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び/または免疫療法などの処置を受けている。
特定の実施形態では、対象は、がん性または前がん性組織を除去するための手術を受けたことがある。他の実施形態では、がん性組織は除去されておらず、例えば、がん性組織は、生命に不可欠な組織などの身体の手術不能な領域、または外科的処置が患者を害する多くのリスクを引き起こす領域に位置し得る。
III.抗がん療法
本明細書に開示されるように、併用療法も意図され、例えば、1つ以上の化学療法剤及び放射線、1つ以上の化学療法剤及び免疫療法、または1つ以上の化学療法剤、放射線、及び化学療法を含み得、これらのそれぞれの組み合わせは、療法と共に存在し得る。下記のように、薬剤は、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生物質、放射性標識化合物との、または外科手術、凍結療法、及び/または放射線療法との併用療法で投与することができる。上述の処置方法は、従来の治療前または治療後のいずれかで、他の形態の従来の療法(例えば、当業者に周知のがんの標準療法)と組み合わせて投与することができる。例えば、これらの制御性作用物質は、治療的有効用量の化学療法剤と共に投与することができる。他の実施形態では、これらの制御性作用物質は、化学療法と併せて投与されて、化学療法剤の活性及び有効性が増強される。医師用卓上参考書(PDR)は、様々ながんの処置において使用されている化学療法剤の投薬量を開示する。治療的に有効であるこれらの上述の化学療法剤の投薬計画及び投薬量は、処置される特定のメラノーマ、疾患の程度、及び当業者の医師によく知られている他の要因に依存することになり、医師が決定することができる。
本明細書に開示されるように、併用療法も意図され、例えば、1つ以上の化学療法剤及び放射線、1つ以上の化学療法剤及び免疫療法、または1つ以上の化学療法剤、放射線、及び化学療法を含み得、これらのそれぞれの組み合わせは、療法と共に存在し得る。下記のように、薬剤は、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生物質、放射性標識化合物との、または外科手術、凍結療法、及び/または放射線療法との併用療法で投与することができる。上述の処置方法は、従来の治療前または治療後のいずれかで、他の形態の従来の療法(例えば、当業者に周知のがんの標準療法)と組み合わせて投与することができる。例えば、これらの制御性作用物質は、治療的有効用量の化学療法剤と共に投与することができる。他の実施形態では、これらの制御性作用物質は、化学療法と併せて投与されて、化学療法剤の活性及び有効性が増強される。医師用卓上参考書(PDR)は、様々ながんの処置において使用されている化学療法剤の投薬量を開示する。治療的に有効であるこれらの上述の化学療法剤の投薬計画及び投薬量は、処置される特定のメラノーマ、疾患の程度、及び当業者の医師によく知られている他の要因に依存することになり、医師が決定することができる。
IV.治療法
免疫応答を上方制御する作用物質は、既存の免疫応答を増強するか、または初期免疫応答を誘発する形態をとることができる。従って、対象の組成物及び方法を使用して免疫応答を増強することは、がんを処置するために有用であるが、また、感染症(例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫)、寄生虫感染、及び免疫抑制疾患を処置するのに有用であり得る。
免疫応答を上方制御する作用物質は、既存の免疫応答を増強するか、または初期免疫応答を誘発する形態をとることができる。従って、対象の組成物及び方法を使用して免疫応答を増強することは、がんを処置するために有用であるが、また、感染症(例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫)、寄生虫感染、及び免疫抑制疾患を処置するのに有用であり得る。
感染患者における免疫応答はまた、ex vivoアプローチにより、例えば、患者から免疫細胞を除去すること、免疫細胞を本明細書に記載の作用物質とin vitroで接触させること、in vitroで刺激された免疫細胞を患者に再導入することにより、増強させることができる。
特定の場合では、さらに免疫応答を増大するために、さらに、免疫応答を上方制御する他の作用物質、例えば、共刺激受容体を介してシグナルを伝達する他のB7ファミリーメンバーの形態を投与することが望ましい場合がある。そのような追加の作用物質及び治療は、さらに、以下で記載される。
免疫応答を上方制御する作用物質は、様々なポリペプチド(例えば、病原体に由来するポリペプチド)に対するワクチンにおいて予防的に使用することができる。病原体(例えば、ウイルス)に対する免疫は、適切なアジュバント中の免疫応答を上方制御する作用物質と共にウイルスタンパク質でワクチン接種することにより誘導することができる。
さらに、本明細書に記載されるように、免疫応答機能の上方制御または増強は、腫瘍免疫の誘導に有用である。
さらに、免疫応答は、本明細書に記載の方法により刺激することができる。例えば、対象が著しい免疫応答を起こすことができない抗原に対する免疫応答、例えば、腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する免疫応答は、免疫応答を上方制御する本明細書に記載の適切な作用物質、NK細胞、CD8+T細胞を投与することにより誘導することができる。同様に、腫瘍特異的抗原などの自己抗原を同時投与することができる。加えて、本組成物は、能動免疫獲得のプロセスで外来抗原への応答を高めるアジュバントとして使用することができる。
特定の実施形態では、免疫細胞を、対象から取得し、本明細書に記載のような作用物質の存在下、ex vivoで培養して、免疫細胞の集団を拡大する及び/または免疫細胞活性化を増強する。次に、免疫細胞は、対象に投与されてもよい。免疫細胞は、当該技術分野で知られているように、例えば、免疫細胞に1次活性化シグナル及び共刺激シグナルを提供することにより、in vitroで刺激することができる。免疫細胞の増殖を共刺激するために、様々な作用物質を使用することもできる。免疫細胞は、PCT出願第WO94/29436号に記載の方法に従って、ex vivoで培養されてもよい。共刺激ポリペプチドは、可溶性であり得るか、細胞膜に付着することができるか、またはビーズなどの固体表面に付着することができる。
V.試料
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象由来の初代NK細胞を使用して実施されてもよい。他の実施形態では、NK細胞は、一過性または安定して形質転換される。いくつかの実施形態では、NK細胞は、NK細胞の代表的な試料である。いくつかの実施形態では、NK細胞は、単一の対象に由来する。他の実施形態では、NK細胞は、少なくとも2人の対象由来のNK細胞のプールである。いくつかの実施形態では、NK細胞は、罹患対象、例えば、がんを有する対象に由来する。いくつかの実施形態では、NK細胞は、精製される。他の実施形態では、アッセイは、NK細胞を含む身体の試料(例えば、血液などの体液)を用いて実施されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、試料中の少なくとも1つのマーカーまたは活性/機能の存在またはレベルを検出または決定する前に、対象由来の試料(例えば、NK細胞)を得ること、を含む。他の実施形態では、本発明の方法は、例えば、対象のNK細胞が十分な活性を示すと判定された場合、さらに、アッセイで試料を試験した後、対象由来の追加の試料を得ることを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象由来の初代NK細胞を使用して実施されてもよい。他の実施形態では、NK細胞は、一過性または安定して形質転換される。いくつかの実施形態では、NK細胞は、NK細胞の代表的な試料である。いくつかの実施形態では、NK細胞は、単一の対象に由来する。他の実施形態では、NK細胞は、少なくとも2人の対象由来のNK細胞のプールである。いくつかの実施形態では、NK細胞は、罹患対象、例えば、がんを有する対象に由来する。いくつかの実施形態では、NK細胞は、精製される。他の実施形態では、アッセイは、NK細胞を含む身体の試料(例えば、血液などの体液)を用いて実施されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、試料中の少なくとも1つのマーカーまたは活性/機能の存在またはレベルを検出または決定する前に、対象由来の試料(例えば、NK細胞)を得ること、を含む。他の実施形態では、本発明の方法は、例えば、対象のNK細胞が十分な活性を示すと判定された場合、さらに、アッセイで試料を試験した後、対象由来の追加の試料を得ることを含む。
いくつかの実施形態では、対象由来の試料中のサイトカイン(例えば、IFN-γ)またはマーカー(例えば、CD44、CD54、MHCクラスI、PD-L1、MICA、MICB、またはCD8+)の量及び/または活性測定値(複数可)は、所定の対照(標準)試料と比較される。試料は、健常対象または罹患対象由来のものであってよい。対照試料は、同じ対象由来または異なる対象由来のものであり得る。対照試料は、通常、正常な非罹患試料である。しかし、いくつかの実施形態では、対照試料は、罹患組織由来のものであり得る。対照試料は、いくつかの異なる対象由来の試料の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、対象由来のマーカー量及び/または活性測定値(複数可)は、所定のレベルと比較される。この所定のレベルは、通常、正常の試料から得られる。本明細書に記載される場合、「所定の」マーカー量及び/または活性測定値(複数可)が、ほんの一例として、処置のために選択され得る対象を評価するために使用されたマーカー量及び/または活性測定値(複数可)であってよい。所定のマーカー量及び/または活性測定値(複数可)は、がんを有するか、または有さない患者の集団において決定されてもよい。所定のバイオマーカー量及び/または活性測定値(複数可)は、全ての患者に等しく適用可能な1つの数字であり得るか、または所定のバイオマーカー量及び/または活性測定値(複数可)は、患者の特定の亜集団に応じて変動し得る。対象の年齢、体重、身長、及び他の因子は、個体の所定のバイオマーカー量及び/または活性測定値(複数可)に影響を与え得る。さらに、所定のバイオマーカー量及び/または活性は、各対象について個別に決定することができる。一実施形態では、本明細書に記載の方法で決定及び/または比較された量は、絶対測定値に基づく。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で決定及び/または比較された量は、比(例えば、拡大前後のCD8+T細胞対CD4T細胞、PBMC内のCD8+T細胞対CD4T細胞、NK細胞より産生されたIFN-gに応じた分化細胞の測定値対精製IFN-g(多くの場合、市販)に応じた分化細胞の測定値、IFN-g対精製IFN-gの測定値)などの相対的測定値に基づく。
所定のマーカー量及び/または活性測定値(複数可)は、任意の好適な標準であり得る。例えば、所定のマーカー量及び/または活性測定値(複数可)は、患者の選択が評価されている同じまたは異なるヒトから得ることができる。いくつかの実施形態では、所定のマーカー量及び/または活性測定値(複数可)は、同じ患者の以前の評価から得ることができる。そのようにして、患者の選択の進行を経時的に監視することができる。加えて、対照は、対象がヒトである場合、別のヒトまたは複数のヒト、例えば、ヒトの選択群の評価から得ることができる。そのようにして、選択が評価されているヒトの選択の程度は、他の好適なヒト、例えば、目的のヒトと類似の状況にある他のヒト、例えば、類似または同じ状態(複数可)に罹患するもの及び/または同じ人種集団のもの、と比較することができる。
本発明のいくつかの実施形態では、所定のレベルのマーカー量及び/または活性測定値(複数可)の変化は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、もしくは5.0倍以上、またはその間(両端を含む)の任意の範囲である。そのようなカットオフ値は、測定値が相対的な変化に基づく、例えば、後処理バイオマーカー測定値と比較した前処理バイオマーカー測定値の比に基づく場合、等しく適用する。
生体試料は、核酸及び/またはタンパク質を含む体液試料、細胞試料、または組織試料を含む、対象由来の様々な供給源から収集することができる。「体液」は、身体から排泄または分泌される体液、及び通常は分泌されない体液(例えば、羊水、房水、胆汁、血液及び血漿、脳脊髄液)を指す。いくつかの実施形態では、対象及び/または対照試料は、細胞、細胞株、組織学的スライド、パラフィン包埋組織、生検、全血、血清、血漿、口腔内掻き取り物、唾液、脳脊髄液、及び骨髄からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、試料は、PBMCである。
試料は、長期間にわたって繰り返し個体から収集することができる(例えば、日、週、月、毎年、半年毎などの順序で1回以上)。
試料調製及び分離は、収集された試料のタイプ及び/またはバイオマーカー測定(複数可)の分析に応じた手順のうちのいずれかを含み得る。そのような手順としては、ほんの一例として、濃縮、希釈、pHの調整、豊富なポリペプチド(例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、及びトランスフェリンなど)の除去、保存剤及びキャリブラントの添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、変性剤の添加、試料の脱塩、試料タンパク質の濃縮、脂質の抽出及び精製が挙げられる。いくつかの実施形態では、特定の細胞型は、細胞表面に存在する少なくとも1つのマーカーに基づいて精製される。いくつかの実施形態では、そのような精製に、他のタイプの望ましくない細胞またはタンパク質を濃縮及び/または分離するための遠心分離が先行する。いくつかの実施形態では、細胞表面に存在するマーカーは、フローサイトメトリーにより決定される。いくつかの実施形態では、1つのマーカーが、決定される。好ましい実施形態では、少なくとも2、3、4、5、6、または7つのマーカーが決定される。
VI.遺伝子送達
本発明は、遺伝子送達法を使用して、核酸を細胞に導入する(例えば、CD16をコードする外因性核酸分子を導入して、単球におけるCD16の発現を誘導し、次に、これを使用して、NK細胞を活性化することができる)。哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト、またはその細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の手段が、意図されたレシピエントに本発明の様々な構築物を送達するための本発明の実施に適合してもよい。本発明の一実施形態では、DNA構築物は、トランスフェクションにより、すなわち、「ネイキッド」DNAの送達により、またはコロイド分散系との複合体において、細胞に送達される。コロイド系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合体化またはリポソーム製剤化DNAである。前者のアプローチでは、例えば、脂質と共に、DNAを配合する前に、所望のDNA構築物を有する導入遺伝子を含有するプラスミドは、最初に、発現について実験的に最適化されてもよい(例えば、5’非翻訳領域にイントロンを含み、不必要な配列を除去する(Felgner,et al.,Ann NY Acad Sci 126-139,1995))。次に、例えば、様々な脂質またはリポソーム物質とのDNAの製剤は、既知の方法及び材料を使用して達成され、レシピエント哺乳動物に送達されてもよい。例えば、Canonico et al,Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29,1994;Tsan et al,Am J Physiol 268;Alton et al.,Nat Genet.5:135-142,1993及びCarson et al.の米国特許第5,679,647号を参照のこと。
本発明は、遺伝子送達法を使用して、核酸を細胞に導入する(例えば、CD16をコードする外因性核酸分子を導入して、単球におけるCD16の発現を誘導し、次に、これを使用して、NK細胞を活性化することができる)。哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト、またはその細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の手段が、意図されたレシピエントに本発明の様々な構築物を送達するための本発明の実施に適合してもよい。本発明の一実施形態では、DNA構築物は、トランスフェクションにより、すなわち、「ネイキッド」DNAの送達により、またはコロイド分散系との複合体において、細胞に送達される。コロイド系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合体化またはリポソーム製剤化DNAである。前者のアプローチでは、例えば、脂質と共に、DNAを配合する前に、所望のDNA構築物を有する導入遺伝子を含有するプラスミドは、最初に、発現について実験的に最適化されてもよい(例えば、5’非翻訳領域にイントロンを含み、不必要な配列を除去する(Felgner,et al.,Ann NY Acad Sci 126-139,1995))。次に、例えば、様々な脂質またはリポソーム物質とのDNAの製剤は、既知の方法及び材料を使用して達成され、レシピエント哺乳動物に送達されてもよい。例えば、Canonico et al,Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29,1994;Tsan et al,Am J Physiol 268;Alton et al.,Nat Genet.5:135-142,1993及びCarson et al.の米国特許第5,679,647号を参照のこと。
核酸は、任意の所望のベクターで送達することができる。これらは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びプラスミドベクターを含む、ウイルスまたは非ウイルスベクターを含む。ウイルスの例示的なタイプとしては、HSV(単純ヘルペスウイルス)、AAV(アデノ関連ウイルス)、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)、BIV(ウシ免疫不全ウイルス)、及びMLV(マウス白血病ウイルス)が挙げられる。核酸は、例えば、ウイルス粒子中、リポソーム中、ナノ粒子中で、及びポリマーとの複合化されて、十分に効率的な送達レベルを提供する任意の所望のフォーマットで投与することができる。
目的のタンパク質または核酸をコードする核酸は、当該技術分野で知られているように、プラスミドまたはウイルスベクターまたは他のベクターであってよい。そのようなベクターは、既知であり、特定の用途のために、いずれのものも選択することができる。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーター及びデメチラーゼコード配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーター及び細胞増殖により活性化されるプロモーター、例えば、チミジンキナーゼ及びチミジル酸シンターゼプロモーターである。他の好ましいプロモーターとしては、ウイルスでの感染により活性化可能なプロモーター、例えば、α及びβインターフェロンプロモーター、ならびにエストロゲンなどのホルモンにより活性化可能なプロモーターが挙げられる。使用することができる他のプロモーターとしては、モロニーウイルスLTR、CMVプロモーター、及びマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。プロモーターは、構成的または誘導的であり得る。
別の実施形態では、WO90/11092及び米国特許第5,580,859号に記載されるように、ネイキッドポリヌクレオチド分子は、遺伝子送達ビヒクルとして使用される。そのような遺伝子送達ビヒクルは、成長因子DNAまたはRNAのいずれかであり得、特定の実施形態では、殺傷アデノウイルスに連結されている。Curiel et al.,Hum.Gene.Ther.3:147-154,1992。任意に使用することができる他のビヒクルとしては、DNAリガンド(Wu et al.,J.Biol.Chem.264:16985-16987,1989)、脂質-DNA混合物(Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413 7417,1989)、リポソーム(Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.84:7851-7855,1987)、及びマイクロプロジェクタイル(Williams et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:2726-2730,1991)が挙げられる。
遺伝子送達ビヒクルは、任意に、ウイルス複製起点またはパッケージングシグナルなどのウイルス配列を含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、またはアデノウイルスなどのウイルスから選択することができる。好ましい実施形態では、成長因子遺伝子送達ビヒクルは、組み換えレトロウイルスベクターである。組み換えレトロウイルス及びその様々な使用は、多数の参考文献、例えば、Mann et al.,Cell 33:153,1983,Cane and Mulligan,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 81:6349,1984,Miller et al.,Human Gene Therapy 1:5-14,1990、米国特許第4,405,712号、同第4,861,719号、及び同第4,980,289号、ならびにPCT出願第WO89/02,468号、同第WO89/05,349号、及び同第WO90/02,806号に記載されている。多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクル、例えば、EP0,415,731;WO90/07936;WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;米国特許第5,219,740号;WO9311230;WO9310218;Vile and Hart,Cancer Res.53:3860-3864,1993;Vile and Hart,Cancer Res.53:962-967,1993;Ram et al.,Cancer Res.53:83-88,1993;Takamiya et al.,J.Neurosci.Res.33:493-503,1992;Baba et al.,J.Neurosurg.79:729-735,1993(米国特許第4,777,127号、GB2,200,651、EP0,345,242、及びWO91/02805)に記載のものを本発明で利用することができる。
本発明のポリヌクレオチドを送達するために使用することができる他のウイルスベクターシステムは、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(1997年5月20日に発行されたWoo et al.の米国特許第5,631,236号及びNeurovexのWO00/08191)、ワクシニアウイルス(Ridgeway(1988)Ridgeway,“Mammalian expression vectors,”In:Rodriguez R L,Denhardt D T,ed.Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses.Stoneham:Butterworth,;Baichwal and Sugden(1986)“Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses:Transient and stable expression of transferred genes,”In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:Plenum Press;Coupar et al.(1988)Gene,68:1-10)、及びいくつかのRNAウイルスから誘導されている。好ましいウイルスとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが挙げられる。それらは、様々な哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な機能を提供する(Friedmann(1989)Science,244:1275-1281;上掲のRidgeway,1988;上掲のBaichwal and Sugden,1986;Coupar et al.,1988;Horwich et al.(1990)J.Virol.,64:642-650)。
他の実施形態では、ゲノム中の標的DNAは、当該技術分野で周知の方法を使用して操作することができる。例えば、ゲノム内の標的DNAは、欠失、挿入、及び/または変異により操作することができ、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターによるランダム挿入、遺伝子標的化、転移性要素、及び/または外来DNAを導入するか、もしくは改変DNA/改変核DNAを作成する他の任意の方法である。他の改変技術としては、ゲノムからのDNA配列の削除、及び/または核DNA配列の変更が挙げられる。例えば、核DNA配列は、部位特異的変異導入により変更されてもよい。
実施例1:実施例2~8の材料及び方法
細胞株、試薬、及び抗体
10%のウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Products,CA,USA)が補充されたRPMI1640を、ヒトNK細胞及び単球の培養に使用した。UCLAで、OSCC及び幹様OSCSCを口腔がん患者の舌腫瘍から単離し、10%のFBS(Gemini Bio-Products,CA,USA)、1.4%の抗生物質抗真菌剤、1%のピルビン酸ナトリウム、1.4%の非必須アミノ酸、1%のL-グルタミン、0.2%のゲンタマイシン(Gemini Bio-Products,CA,USA)、及び0.15%の重炭酸ナトリウム(Fisher Scientific,PA,USA)が補充されたRPMI1640で培養した。Mia-Paca-2(MP2)を、10%のFBSならびに1%のペニシリン及びストレプトマイシン(Gemini Bio-Products,CA,USA)を含むDMEMで培養した。組み換えIL-2を、NIH-BRBから入手した。組み換えTNF-α及びIFN-γを、BioLegend(San Diego,CA,USA)から入手した。抗MHCクラスIを調製し、1:100希釈物が、使用に最適な濃度であることが判明した。PEコンジュゲート抗CD54、抗CD44、抗B7H1、抗MICA/MICB抗体を、BioLegend(San Diego,CA,USA)から入手した。MICA/MICBに対する抗体は、Feinberg school of medicineのDr.Jennifer Wuからの寄贈物であった。ヒトNK及び単球精製キットを、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から入手した。
細胞株、試薬、及び抗体
10%のウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Products,CA,USA)が補充されたRPMI1640を、ヒトNK細胞及び単球の培養に使用した。UCLAで、OSCC及び幹様OSCSCを口腔がん患者の舌腫瘍から単離し、10%のFBS(Gemini Bio-Products,CA,USA)、1.4%の抗生物質抗真菌剤、1%のピルビン酸ナトリウム、1.4%の非必須アミノ酸、1%のL-グルタミン、0.2%のゲンタマイシン(Gemini Bio-Products,CA,USA)、及び0.15%の重炭酸ナトリウム(Fisher Scientific,PA,USA)が補充されたRPMI1640で培養した。Mia-Paca-2(MP2)を、10%のFBSならびに1%のペニシリン及びストレプトマイシン(Gemini Bio-Products,CA,USA)を含むDMEMで培養した。組み換えIL-2を、NIH-BRBから入手した。組み換えTNF-α及びIFN-γを、BioLegend(San Diego,CA,USA)から入手した。抗MHCクラスIを調製し、1:100希釈物が、使用に最適な濃度であることが判明した。PEコンジュゲート抗CD54、抗CD44、抗B7H1、抗MICA/MICB抗体を、BioLegend(San Diego,CA,USA)から入手した。MICA/MICBに対する抗体は、Feinberg school of medicineのDr.Jennifer Wuからの寄贈物であった。ヒトNK及び単球精製キットを、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から入手した。
10%のウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Products,CA)が補充されたRPMI1640を、ヒトNK細胞及び口腔扁平上皮癌幹様細胞(OSCSC)の培養に使用した。10%のウシ胎児血清(FBS)(GeminiBio-Products,CA)が補充されたRPMI1640を、hu-BLTマウス組織から単離された細胞の培養に使用した。MiaPaCa-2(MP2)、PL12、BXPC3、HPAF、及びCapanを、10%のFBSが補充されたDMEMで培養した。10%のFBSが補充されたDMEMを使用して、hu-BLTマウス膵臓から分離された膵腫瘍細胞を培養した。組み換えIL-2(rhIL-2)を、NIH-BRBから入手した。この研究で使用されたフローサイトメトリー及び他の抗体を、Biolegend(San Diego,CA)から入手した。TNF-α及びIFN-γに対するモノクローナル抗体を調製し、1:100希釈物が、ブロッキング実験の使用に最適な濃度であることが判明した。pHが7~7.2の滅菌蒸留水を使用して、20mMのNACを調製し、DMEM培地を使用して、20nMの最終濃度を有するように希釈した。
ヒト膵癌細胞株Panc-1、MIA PaCa-2(MP2)、BXPC3、HPAF、Capanは、Dr.Guido Eibl(UCLA David Geffen School of Medicine)から厚意で提供され、PL12は、Dr.Nicholas Cacalano(UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center)から提供された。10%のFBS及び2%のペニシリン-ストレプトマイシン(Gemini Bio-Products,CA)が補充されたDMEMで、Panc-1、MP2、及びBXPC3を培養した。HPAF、Capan、及びPL12を、10%のFBS及び2%ペニシリン-ストレプトマイシンが補充されたRMPI1640培地で培養した。組み換えヒトIL-2を、NIH-BRBから入手した。組み換えヒトTNF-α及びIFN-γはBiolegend(SanDiego,CA)から入手した。CD16に対する抗体を、Biolegend(San Diego,CA)から購入した。抗MHCクラスIを調製し、1:100希釈物が、使用に最適な濃度であることが判明した。フローサイトメトリー用の蛍光色素コンジュゲートヒト及びマウス抗体を、Biolegend(San Diego,CA)から入手した。TNF-αハイブリドーマを注射されたマウスの腹水から、TNF-αに対するモノクローナル抗体を調製し、この後、抗体を精製し、特異性をELISA及びrhTNF-αに対する機能アッセイの両方で決定した。モノクローナルIFN-γ抗体をウサギで調製し、精製し、ELISA及びrIFN-γに対する機能アッセイで特異性を決定した。抗TNF-α及び抗IFN-γ抗体の1:100希釈は、rhTNF-α及びrhIFN-γ機能をブロックするための最適な濃度であることが判明した。ヒトNK、CD3+T細胞、及び単球精製キットを、Stem Cell Technologies(Vancouver,Canada)から入手した。ヨウ化プロピジウム及びN-アセチルシステイン(NAC)を、Sigma Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。シスプラチン及びパクリタキセルを、Ronald Reagan UCLA Medical Center Pharmacy(Los Angeles,CA)から購入した。
ヒト末梢血由来のNK細胞及びT細胞の精製
UCLA Institutional Review Board(IRB)により承認された書面によるインフォームドコンセントは、健常な血液ドナーから得られ、全ての手順は、UCLA-IRBにより承認された。フィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血を分離し、この後、末梢血単核細胞(PBMC)を含有する白濁層を採取し、洗浄し、10%のFBSが補充されたRPMI1640(Invitrogen by Life Technologies,CA)に再懸濁し、プラスチック組織培養皿にプレーティングした。1~2時間のインキュベーション後、非接着性のヒト末梢血リンパ球(PBL)を収集した。NK細胞を負に選択し、EasySep(登録商標)ヒトNK細胞濃縮キット及びT細胞単離キット(それぞれ、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から購入)を使用して、PBLから単離した。分離NK細胞を、それぞれ抗CD16抗体及び抗CD3抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定した。精製NK細胞は、10%のFBS(Gemini Bio-Products,CA)、1%の抗生物質/抗真菌剤、1%のピルビン酸ナトリウム、及び1%のMEM非必須アミノ酸(Invitrogen、Life Technologies,CA)が補充されたRPMI培地1640で培養した。
UCLA Institutional Review Board(IRB)により承認された書面によるインフォームドコンセントは、健常な血液ドナーから得られ、全ての手順は、UCLA-IRBにより承認された。フィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血を分離し、この後、末梢血単核細胞(PBMC)を含有する白濁層を採取し、洗浄し、10%のFBSが補充されたRPMI1640(Invitrogen by Life Technologies,CA)に再懸濁し、プラスチック組織培養皿にプレーティングした。1~2時間のインキュベーション後、非接着性のヒト末梢血リンパ球(PBL)を収集した。NK細胞を負に選択し、EasySep(登録商標)ヒトNK細胞濃縮キット及びT細胞単離キット(それぞれ、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から購入)を使用して、PBLから単離した。分離NK細胞を、それぞれ抗CD16抗体及び抗CD3抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定した。精製NK細胞は、10%のFBS(Gemini Bio-Products,CA)、1%の抗生物質/抗真菌剤、1%のピルビン酸ナトリウム、及び1%のMEM非必須アミノ酸(Invitrogen、Life Technologies,CA)が補充されたRPMI培地1640で培養した。
ヒトNK細胞及びヒトT細胞の拡大
ヒト精製NK細胞を、rh-IL-2(1000U/ml)及び抗CD16mAb(3μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、フィーダー細胞(破骨細胞または樹状細胞)及びsAJ2(NK:OCまたはDC:sAJ2;2:1:4)と共培養した。3日毎に、rh-IL-2(1500U/ml)を含有するRMPIで、培地をリフレッシュした。ヒト精製T細胞をrh-IL-2(100U/ml)及び抗CD3(1μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、破骨細胞あり/なし及びsAJ2あり/なしで共培養した(T:OC:sAJ2;2:1:4)。3日毎に、rh-IL-2(150U/ml)で、培地をリフレッシュした。
ヒト精製NK細胞を、rh-IL-2(1000U/ml)及び抗CD16mAb(3μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、フィーダー細胞(破骨細胞または樹状細胞)及びsAJ2(NK:OCまたはDC:sAJ2;2:1:4)と共培養した。3日毎に、rh-IL-2(1500U/ml)を含有するRMPIで、培地をリフレッシュした。ヒト精製T細胞をrh-IL-2(100U/ml)及び抗CD3(1μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、破骨細胞あり/なし及びsAJ2あり/なしで共培養した(T:OC:sAJ2;2:1:4)。3日毎に、rh-IL-2(150U/ml)で、培地をリフレッシュした。
ヒト精製及びhu-BLT濃縮NK細胞を、rh-IL-2(1000U/ml)及び抗CD16mAb(3ug/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、フィーダー細胞及びsAJ2と共培養した。3日毎に、rh-IL-2で、培地をリフレッシュした。
幹細胞の分化に使用されたNK細胞の上清
上記のように、ヒトNK細胞を健常ドナーのPBMCから精製した。NK細胞を抗CD16mAb(3μg/mL)及びIL-2(1,000U/mL)の組み合わせで18時間処理した後、上清を取り出し、分化実験に使用した。活性化NK細胞により産生されたIFN-γの量を、IFN-γELISA(BioLegend,CA,USA)で評価した。漸増量のNK細胞上清を毎日徐々に添加することで、OSCSCを分化させた。平均して、分化を誘導するために、合計3,500pgのIFN-γ含有上清を5日間添加して、分化及びNK細胞媒介性細胞傷害に対するOSCSCSの耐性を誘導し、合計7000pgのIFN-γ含有上清を7日間添加して、分化及びNK細胞媒介性細胞傷害に対するMP2の耐性を誘導した。その後、標的細胞をPBSで洗浄し、分離し、実験に使用した。
上記のように、ヒトNK細胞を健常ドナーのPBMCから精製した。NK細胞を抗CD16mAb(3μg/mL)及びIL-2(1,000U/mL)の組み合わせで18時間処理した後、上清を取り出し、分化実験に使用した。活性化NK細胞により産生されたIFN-γの量を、IFN-γELISA(BioLegend,CA,USA)で評価した。漸増量のNK細胞上清を毎日徐々に添加することで、OSCSCを分化させた。平均して、分化を誘導するために、合計3,500pgのIFN-γ含有上清を5日間添加して、分化及びNK細胞媒介性細胞傷害に対するOSCSCSの耐性を誘導し、合計7000pgのIFN-γ含有上清を7日間添加して、分化及びNK細胞媒介性細胞傷害に対するMP2の耐性を誘導した。その後、標的細胞をPBSで洗浄し、分離し、実験に使用した。
プロバイオティクス細菌(AJ2)
AJ2は、グラム陽性プロバイオティクス細菌の8つの異なる株(Streptococcus thermophiles、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、及びLactobacillus bulgaricus)の組み合わせであり、NK細胞における炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインの両方の最適の分泌を誘導する優れた能力について選択した。
AJ2は、グラム陽性プロバイオティクス細菌の8つの異なる株(Streptococcus thermophiles、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、及びLactobacillus bulgaricus)の組み合わせであり、NK細胞における炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインの両方の最適の分泌を誘導する優れた能力について選択した。
AJ2の超音波処理
AJ2を計量し、10mg/mLの濃度で、10%のFBSを含有するRPMI培地1640に再懸濁した。細菌を完全にボルテックスし、次に、氷上、6~8の振幅で、15秒間超音波処理した。次に、超音波処理試料を氷上で30秒間インキュベートした。5パルス毎の後に、試料を採取して、細胞壁の少なくとも80%が溶解するまで、顕微鏡で観察した。約20ラウンドの氷上での超音波処理/インキュベーションを実施して、完全な超音波処理を達成したと判定した。最後に、超音波処理試料(sAJ2)を分注し、-80℃の冷凍庫に保存した。
AJ2を計量し、10mg/mLの濃度で、10%のFBSを含有するRPMI培地1640に再懸濁した。細菌を完全にボルテックスし、次に、氷上、6~8の振幅で、15秒間超音波処理した。次に、超音波処理試料を氷上で30秒間インキュベートした。5パルス毎の後に、試料を採取して、細胞壁の少なくとも80%が溶解するまで、顕微鏡で観察した。約20ラウンドの氷上での超音波処理/インキュベーションを実施して、完全な超音波処理を達成したと判定した。最後に、超音波処理試料(sAJ2)を分注し、-80℃の冷凍庫に保存した。
破骨細胞の生成
破骨細胞をPBMC精製単球から生成し、M-CSF(25ng/mL)及びRANKリガンド(RANKL)(25ng/mL)を含有するアルファMEM培地で21日間培養した。3日毎に、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)を含有する新しいアルファMEMで、14の培地をリフレッシュした。
破骨細胞をPBMC精製単球から生成し、M-CSF(25ng/mL)及びRANKリガンド(RANKL)(25ng/mL)を含有するアルファMEM培地で21日間培養した。3日毎に、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)を含有する新しいアルファMEMで、14の培地をリフレッシュした。
ADCC誘導
標的細胞(5×105)を50μCiの51Cr(Perkin Elmer,Santa Clara,CA)で標識し、1時間クロム酸処理した。インキュベーション後、標的細胞を1回洗浄して、過剰の未結合の51Crを除去した。細胞を1×106/mLで再懸濁し、抗MICA/MICB抗体またはCetaximab(3μg/mL)で処理し、30分間インキュベートした。インキュベーション後、標的細胞を再度洗浄して、過剰の未結合抗体及び51Crを除去した。標識標的細胞をエフェクター細胞と共に培養し、51Cr放出細胞傷害アッセイを使用して、標的細胞に対する細胞傷害性を評価した。
標的細胞(5×105)を50μCiの51Cr(Perkin Elmer,Santa Clara,CA)で標識し、1時間クロム酸処理した。インキュベーション後、標的細胞を1回洗浄して、過剰の未結合の51Crを除去した。細胞を1×106/mLで再懸濁し、抗MICA/MICB抗体またはCetaximab(3μg/mL)で処理し、30分間インキュベートした。インキュベーション後、標的細胞を再度洗浄して、過剰の未結合抗体及び51Crを除去した。標識標的細胞をエフェクター細胞と共に培養し、51Cr放出細胞傷害アッセイを使用して、標的細胞に対する細胞傷害性を評価した。
51Cr放出細胞傷害アッセイ
51Crを、Perkin Elmer(Santa Clara,CA)から購入した。標準的な51Cr放出細胞傷害アッセイを使用して、実験培養物におけるNK細胞の細胞傷害機能を決定する。エフェクター細胞(1×105細胞/ウェル)を96ウェル丸底マイクロウェルプレート(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)に分注し、4~8つの連続希釈で滴定した。標的細胞(5×105)を、50μCiの51Cr(Perkin Elmer,Santa Clara,CA)で標識し、1時間クロム酸処理した。インキュベーション後、標的細胞を2回洗浄して、過剰な未結合の51Crを除去した。上限5:1のエフェクター:標的(E:T)比の1×104細胞/ウェルの濃度のエフェクター細胞を含有する96ウェル丸底マイクロウェルプレートに、51Cr標識標的細胞を分注した。プレートを遠心分離し、4時間インキュベートした。4時間のインキュベーション期間の後、上清を各試料から採取し、ガンマカウンターを使用して、放出された放射能をカウントした。総放出値(51Cr標識標的細胞を含有)及び自然放出値(標的細胞の上清のみ)を測定し、特異的細胞傷害の割合を計算するために使用した。次の式を使用して、特異的細胞傷害の割合を計算した。
標的細胞×100の30%を溶解させるのに必要なエフェクター細胞の数の逆数を使用して、溶解単位(LU)30/106を計算する。
51Crを、Perkin Elmer(Santa Clara,CA)から購入した。標準的な51Cr放出細胞傷害アッセイを使用して、実験培養物におけるNK細胞の細胞傷害機能を決定する。エフェクター細胞(1×105細胞/ウェル)を96ウェル丸底マイクロウェルプレート(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)に分注し、4~8つの連続希釈で滴定した。標的細胞(5×105)を、50μCiの51Cr(Perkin Elmer,Santa Clara,CA)で標識し、1時間クロム酸処理した。インキュベーション後、標的細胞を2回洗浄して、過剰な未結合の51Crを除去した。上限5:1のエフェクター:標的(E:T)比の1×104細胞/ウェルの濃度のエフェクター細胞を含有する96ウェル丸底マイクロウェルプレートに、51Cr標識標的細胞を分注した。プレートを遠心分離し、4時間インキュベートした。4時間のインキュベーション期間の後、上清を各試料から採取し、ガンマカウンターを使用して、放出された放射能をカウントした。総放出値(51Cr標識標的細胞を含有)及び自然放出値(標的細胞の上清のみ)を測定し、特異的細胞傷害の割合を計算するために使用した。次の式を使用して、特異的細胞傷害の割合を計算した。
酵素結合免疫測定法(ELISA)及びマルチプレックスサイトカインアッセイ
IFN-γ用のELISAキットを、BioLegend(San Diego,CA)から購入した。ELISAを実施して、細胞培養から産生されたIFN-γのレベルを検出した。製造者のプロトコールに記載されるように、アッセイを実施した。要約すると、96ウェルEIA/RIAプレートを、標的サイトカインに対応する希釈捕捉抗体でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。16~18時間のインキュベーション後、プレートを洗浄18バッファー(1×PBS中0.05%のTween)で4回洗浄し、アッセイ希釈液(1×PBS中1%のBSA)でブロックした。200rpmのプレートシェーカーで、プレートを室温で1時間インキュベートし;インキュベーション後、プレートを4回洗浄した。次に、各培養物から収集された標準及び試料100μLをウェルに添加し、200rpmのプレートシェーカーで、室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを4回洗浄し、検出抗体を入れ、200rpmのプレートシェーカーで、室温で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、プレートを4回洗浄し;ウェルにアビジンHRP溶液を入れ、200rpmのプレートシェーカーで、室温で30分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄した後。100uLのTMB基質溶液をウェルに添加し、プレートを、暗所で所望の青色を呈するまで(または最大30分)インキュベートした。次に、ウェル毎に、100μLの停止溶液(2NのH2SO4)を添加して、反応を停止させた。最後に、プレートをマイクロプレートリーダーで読み取り、450nmで、吸光度値を得た(BioLegend、ELISAマニュアル)。
IFN-γ用のELISAキットを、BioLegend(San Diego,CA)から購入した。ELISAを実施して、細胞培養から産生されたIFN-γのレベルを検出した。製造者のプロトコールに記載されるように、アッセイを実施した。要約すると、96ウェルEIA/RIAプレートを、標的サイトカインに対応する希釈捕捉抗体でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。16~18時間のインキュベーション後、プレートを洗浄18バッファー(1×PBS中0.05%のTween)で4回洗浄し、アッセイ希釈液(1×PBS中1%のBSA)でブロックした。200rpmのプレートシェーカーで、プレートを室温で1時間インキュベートし;インキュベーション後、プレートを4回洗浄した。次に、各培養物から収集された標準及び試料100μLをウェルに添加し、200rpmのプレートシェーカーで、室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを4回洗浄し、検出抗体を入れ、200rpmのプレートシェーカーで、室温で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、プレートを4回洗浄し;ウェルにアビジンHRP溶液を入れ、200rpmのプレートシェーカーで、室温で30分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄した後。100uLのTMB基質溶液をウェルに添加し、プレートを、暗所で所望の青色を呈するまで(または最大30分)インキュベートした。次に、ウェル毎に、100μLの停止溶液(2NのH2SO4)を添加して、反応を停止させた。最後に、プレートをマイクロプレートリーダーで読み取り、450nmで、吸光度値を得た(BioLegend、ELISAマニュアル)。
サイトカイン及びケモカインのレベルをマルチプレックスアッセイで調べ、各特定のキットの製造者のプロトコールに記載されるように、これを実施した。Luminexマルチプレックス機器(MAGPIX,Millipore,Billerica,MA)を使用して、分析を実施し、プロプライエタリソフトウェア(xPONENT 4.2,Millipore,Billerica,MA)を使用して、データを分析した。
表面染色
実験で詳述されるように、所定の最適濃度のPEコンジュゲート抗体を含む、冷1%BSA-PBS100μl中で、各条件の1×105細胞を染色し、4℃で30分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、1%のBSA-PBSに再懸濁した。Epics C(Coulter)フローサイトメーターを細胞表面分析に使用した。
実験で詳述されるように、所定の最適濃度のPEコンジュゲート抗体を含む、冷1%BSA-PBS100μl中で、各条件の1×105細胞を染色し、4℃で30分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、1%のBSA-PBSに再懸濁した。Epics C(Coulter)フローサイトメーターを細胞表面分析に使用した。
統計分析
対応のないまたは対応のある両側スチューデントのt検定を実施して、実験計画に応じて異なる群を比較した。p値は、図中で以下のように表された:***p値<0.001、**p値:0.001~0.01、*p値:0.01~0.05。GraphPad Prismソフトウェアを使用して、データを分析した。
対応のないまたは対応のある両側スチューデントのt検定を実施して、実験計画に応じて異なる群を比較した。p値は、図中で以下のように表された:***p値<0.001、**p値:0.001~0.01、*p値:0.01~0.05。GraphPad Prismソフトウェアを使用して、データを分析した。
prism-7ソフトウェアも、統計分析に使用した。統計分析のために、対応のないまたは対応のある両側スチューデントのt検定を実施した。ボンフェローニ事後検定を用いる一元ANOVAを使用して、異なる群を比較した。(n)は、ヒトドナーまたはマウスの数を示す。in vitro研究では、2重または3重の試料を評価に使用した。以下の記号は、各分析内の統計的有意性のレベルを表す。***(p値<0.001)、**(p値0.001~0.01)、*(p値0.01~0.05)。
hu-BLTマウスへの腫瘍移植
全ての連邦、州、及び地方のガイドラインに従って、UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した。複合免疫不全NOD.CB17-Prkdcscid/J及びNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(T、B、及びナチュラルキラー細胞を欠くNSG)を、Jackson Laboratoryから購入した。上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスをNSGバックグラウンドで調製した。同所性腫瘍を確立するために、最初にマウスを酸素と組み合わせたイソフルランで麻酔し、次に、10μlのHCマトリゲル(Corning,NY,USA)(1×106細胞)を含む懸濁液中のヒトOSCSC腫瘍細胞を、口底に直接注射した。腫瘍注射の4~5週間後に、マウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、及び末梢血を採取した。
全ての連邦、州、及び地方のガイドラインに従って、UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した。複合免疫不全NOD.CB17-Prkdcscid/J及びNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(T、B、及びナチュラルキラー細胞を欠くNSG)を、Jackson Laboratoryから購入した。上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスをNSGバックグラウンドで調製した。同所性腫瘍を確立するために、最初にマウスを酸素と組み合わせたイソフルランで麻酔し、次に、10μlのHCマトリゲル(Corning,NY,USA)(1×106細胞)を含む懸濁液中のヒトOSCSC腫瘍細胞を、口底に直接注射した。腫瘍注射の4~5週間後に、マウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、及び末梢血を採取した。
hu-BLTマウスBM、脾臓、及び末梢血からの細胞の分離
BMからの単一細胞懸濁液を得るために、大腿骨を両端から切断し、RPMI1640培地を使用して、一端から他端へフラッシュし、その後、BM細胞を40μmのセルストレーナーに通して濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を得るために、脾臓を大きな片が残らなくなるまで粉砕し、試料を40μmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に再懸濁して、赤血球を2~5分間除去し、続いて、RMPI培地に再懸濁し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ヘパリン加血検体のフィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。PBMCを含有する軟膜を採取し、洗浄し、RPMI1640培地に再懸濁した。
BMからの単一細胞懸濁液を得るために、大腿骨を両端から切断し、RPMI1640培地を使用して、一端から他端へフラッシュし、その後、BM細胞を40μmのセルストレーナーに通して濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を得るために、脾臓を大きな片が残らなくなるまで粉砕し、試料を40μmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に再懸濁して、赤血球を2~5分間除去し、続いて、RMPI培地に再懸濁し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ヘパリン加血検体のフィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。PBMCを含有する軟膜を採取し、洗浄し、RPMI1640培地に再懸濁した。
免疫不全(NSG)及びヒト化BLTマウスにおけるヒト膵癌細胞の成長の分析
UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した。上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスを調製した。
UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した。上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスを調製した。
8~10週齢のNSGマウスまたはhu-BLTマウス膵臓への同所性細胞移植により、膵腫瘍のin vivo成長を行った。同所性腫瘍を確立するために、イソフルランを使用して、マウスを麻酔し、それに続いて、右下腹部を2cm切開した。脾臓を露出させた時点で、膵臓が脾臓の下にあるので、脾臓を引き抜いた。滅菌鉗子を使用して、脾臓を保持し、膵臓を露出させた(開腹術)。次に、膵臓に、28G針を備えたインスリン注射器を使用して、10μlのHCマトリゲル(Corning,NY,USA)を直接注射することにより、腫瘍細胞を移した。腹部を触診することにより、マウスを腫瘍の成長について監視した。手術の7~10日後、マウスは、尾静脈注射により、1.5×106のスーパーチャージNK細胞を投与された。ヒトがプロバイオティクスを摂取する方法と同様に、マウスにAJ2(50億/用量)を経口給餌した。腫瘍移植の1または2週間前に、初回用量のAJ2を与え、48時間毎に実験を通して継続した。罹患の徴候が明らかな場合、マウスを安楽死させた。実験の終了時または腫瘍サイズが直径2cmに達した時に、膵臓、膵腫瘍、骨髄、脾臓、及び末梢血をマウスから採取した。
免疫不全及びヒト化マウスにおけるヒト口腔癌細胞成長の分析
同所性腫瘍を確立するために、イソフルランを使用して、マウスを麻酔し、次に、10μlのHCマトリゲル(Corning,NY,USA)を直接注射することにより、口腔腫瘍細胞を口腔床に注射した。口腔腫瘍注射の7~10日後、マウスは、尾静脈注射により、1.5×106のスーパーチャージNK細胞を投与された。ヒトがプロバイオティクスを摂取する方法と同様に、マウスにAJ2(50億/用量)を経口給餌した。腫瘍移植の1または2週間前に、初回用量のAJ2を与え、実験を通して48時間毎に継続した。罹患の徴候が明らかな場合、マウスを安楽死させた。実験の終了時または腫瘍サイズが直径2cmに達した時に、末梢血をマウスから採取した。
同所性腫瘍を確立するために、イソフルランを使用して、マウスを麻酔し、次に、10μlのHCマトリゲル(Corning,NY,USA)を直接注射することにより、口腔腫瘍細胞を口腔床に注射した。口腔腫瘍注射の7~10日後、マウスは、尾静脈注射により、1.5×106のスーパーチャージNK細胞を投与された。ヒトがプロバイオティクスを摂取する方法と同様に、マウスにAJ2(50億/用量)を経口給餌した。腫瘍移植の1または2週間前に、初回用量のAJ2を与え、実験を通して48時間毎に継続した。罹患の徴候が明らかな場合、マウスを安楽死させた。実験の終了時または腫瘍サイズが直径2cmに達した時に、末梢血をマウスから採取した。
hu-BLT及びNSGマウスの組織の細胞解離及び細胞培養
NSG及びhu-BLTマウスから採取された膵臓及び/または膵腫瘍を直ちに1mm3の小片に切断し、DMEM培地中1mg/mlのコラゲナーゼIV、10U/mlのDNAse I、及び1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有する消化緩衝液に入れ、37℃のオーブンで20分間、150rpmのシェーカーでインキュベートした。消化後、試料を40mmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で10分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをDMEM培地に再懸濁し、細胞を計数した。BMからの単一細胞懸濁液を得るために、大腿骨を両端から切断し、RPMI培地を使用して、一端から他端へフラッシュし、BM細胞を40mmのセルに通して濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を得るために、脾臓を大きな片が残らなくなるまで粉砕し、試料を40mmのセルに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に再懸濁して、赤血球を2~5分間除去し、続いて、RMPI培地に再懸濁し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ヘパリン加血検体のフィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。PBMCを含有する軟膜を採取し、洗浄し、RPMI1640培地に再懸濁した。
NSG及びhu-BLTマウスから採取された膵臓及び/または膵腫瘍を直ちに1mm3の小片に切断し、DMEM培地中1mg/mlのコラゲナーゼIV、10U/mlのDNAse I、及び1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有する消化緩衝液に入れ、37℃のオーブンで20分間、150rpmのシェーカーでインキュベートした。消化後、試料を40mmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で10分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをDMEM培地に再懸濁し、細胞を計数した。BMからの単一細胞懸濁液を得るために、大腿骨を両端から切断し、RPMI培地を使用して、一端から他端へフラッシュし、BM細胞を40mmのセルに通して濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を得るために、脾臓を大きな片が残らなくなるまで粉砕し、試料を40mmのセルに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に再懸濁して、赤血球を2~5分間除去し、続いて、RMPI培地に再懸濁し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ヘパリン加血検体のフィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。PBMCを含有する軟膜を採取し、洗浄し、RPMI1640培地に再懸濁した。
hu-BLTマウス由来のNK細胞、CD3+T細胞、及び単球の精製
ヒトCD56+選択キット(Stem Cells Technologies,Canada)を使用して、hu-BLTマウス脾細胞由来のNK細胞を単離した。ヒトCD14分離キット(eBioscience,San Diego,CA)を使用して、hu-BLTマウスBM細胞由来の単球を、BMから正に選択した。単離NK細胞及び単球を、それぞれ抗CD16抗体及び抗CD14抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定した。
ヒトCD56+選択キット(Stem Cells Technologies,Canada)を使用して、hu-BLTマウス脾細胞由来のNK細胞を単離した。ヒトCD14分離キット(eBioscience,San Diego,CA)を使用して、hu-BLTマウスBM細胞由来の単球を、BMから正に選択した。単離NK細胞及び単球を、それぞれ抗CD16抗体及び抗CD14抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定した。
破骨細胞の生成ならびにヒト及びhu-BLT NK細胞の拡大
精製単球はともに、ヒト末梢血を形成し、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)を含有するアルファMEM培地で、hu-BLTマウスBM細胞を21日間培養するか、または別の方法で指定する。3日毎に、M-CSF及びRANKLを含有する新しいアルファMEMで、培地をリフレッシュした。ヒト精製及びhu-BLT NK細胞を、rh-IL-2(1000U/ml)及び抗CD16mAb(3ug/ml)で18~20時間活性化した後に、それらを、NK細胞の拡大のために、破骨細胞及び超音波処理AJ2と共培養した。3日毎に、rh-IL-2(1500U/ml)を含有するRMPIで、培地をリフレッシュした。
精製単球はともに、ヒト末梢血を形成し、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)を含有するアルファMEM培地で、hu-BLTマウスBM細胞を21日間培養するか、または別の方法で指定する。3日毎に、M-CSF及びRANKLを含有する新しいアルファMEMで、培地をリフレッシュした。ヒト精製及びhu-BLT NK細胞を、rh-IL-2(1000U/ml)及び抗CD16mAb(3ug/ml)で18~20時間活性化した後に、それらを、NK細胞の拡大のために、破骨細胞及び超音波処理AJ2と共培養した。3日毎に、rh-IL-2(1500U/ml)を含有するRMPIで、培地をリフレッシュした。
In vitroでのMP2がん幹細胞の分化
上述のように、MP2腫瘍の分化を実施した。NK細胞を抗CD16mAb(3μg/mL)及びIL-2(1,000U/mL)の組み合わせで18時間処理した後、上清を取り出し、分化実験に使用した。活性化NK細胞により産生されたIFN-γの量を、IFN-γ ELISA(Biolegend,CA,USA)で評価した。漸増量のNK細胞上清(対応する処理の)を毎日徐々に添加することで、MP2細胞を分化させた。平均して、分化を誘導するために、合計3,500pgのIFN-γ含有上清を4日間添加して、分化と、NK細胞媒介性細胞傷害に対するMP2腫瘍細胞の耐性を誘導した。その後、標的細胞を1×PBSで洗浄し、分離し、実験に使用した。
上述のように、MP2腫瘍の分化を実施した。NK細胞を抗CD16mAb(3μg/mL)及びIL-2(1,000U/mL)の組み合わせで18時間処理した後、上清を取り出し、分化実験に使用した。活性化NK細胞により産生されたIFN-γの量を、IFN-γ ELISA(Biolegend,CA,USA)で評価した。漸増量のNK細胞上清(対応する処理の)を毎日徐々に添加することで、MP2細胞を分化させた。平均して、分化を誘導するために、合計3,500pgのIFN-γ含有上清を4日間添加して、分化と、NK細胞媒介性細胞傷害に対するMP2腫瘍細胞の耐性を誘導した。その後、標的細胞を1×PBSで洗浄し、分離し、実験に使用した。
IFN-γに対するヒト単色酵素ELISPOTアッセイ
80μlの抗ヒトIFN-γ捕捉抗体を、96ウェル高タンパク質結合PVDFフィルタープレートの各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。プレートに試料を添加する前に、プレートを150μlのPBSで1回洗浄した。RPMI200μl中の50,000の細胞を各ウェルに添加し、37℃、5%のCO2で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBS200μlで2回洗浄し、続いて、0.05%のTween-PBS200μlで2回洗浄した。抗ヒトIFN-γ検出抗体80μlを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートし、プレートを0.05%のTween-PBS200μl/ウェルで3回洗浄した。1:1000の希釈Strep-APから作製された第3溶液80μL/ウェルをプレートに添加し、30分間インキュベートした。プレートを0.05%のTween-PBS200μl/ウェルで2回洗浄し、続いて、200μl/ウェルの蒸留水で2回洗浄した。次に、80μL/ウェルの青色現像液を添加し、プレートを室温で15分間インキュベートした。膜を水道水で3回穏やかにすすぐことにより、反応を停止させた。プレートを2時間空気乾燥し、immunoSpot(登録商標)Sofewareを備えたCTL機を使用して、IFN-γ放出をカウントするためにスキャンした。(Cellular Technology Limited,OH,USA)。
80μlの抗ヒトIFN-γ捕捉抗体を、96ウェル高タンパク質結合PVDFフィルタープレートの各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。プレートに試料を添加する前に、プレートを150μlのPBSで1回洗浄した。RPMI200μl中の50,000の細胞を各ウェルに添加し、37℃、5%のCO2で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBS200μlで2回洗浄し、続いて、0.05%のTween-PBS200μlで2回洗浄した。抗ヒトIFN-γ検出抗体80μlを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートし、プレートを0.05%のTween-PBS200μl/ウェルで3回洗浄した。1:1000の希釈Strep-APから作製された第3溶液80μL/ウェルをプレートに添加し、30分間インキュベートした。プレートを0.05%のTween-PBS200μl/ウェルで2回洗浄し、続いて、200μl/ウェルの蒸留水で2回洗浄した。次に、80μL/ウェルの青色現像液を添加し、プレートを室温で15分間インキュベートした。膜を水道水で3回穏やかにすすぐことにより、反応を停止させた。プレートを2時間空気乾燥し、immunoSpot(登録商標)Sofewareを備えたCTL機を使用して、IFN-γ放出をカウントするためにスキャンした。(Cellular Technology Limited,OH,USA)。
ヒト単球の精製ならびに破骨細胞及び樹状細胞の生成
単球を負に選択し、EasySep(登録商標)ヒト単球分離キット(Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から購入)を使用して、PBMCから分離した。単離単球を、抗CD14抗体で染色して、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定し、95%を超える純度を達成した。M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)で21日間処理することにより、単球を破骨細胞に分化させた。樹状細胞(DC)を生成するために、単球をGM-CSF(150ng/mL)及びIL-4(50ng/mL)で7日間処理した。
単球を負に選択し、EasySep(登録商標)ヒト単球分離キット(Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から購入)を使用して、PBMCから分離した。単離単球を、抗CD14抗体で染色して、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定し、95%を超える純度を達成した。M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)で21日間処理することにより、単球を破骨細胞に分化させた。樹状細胞(DC)を生成するために、単球をGM-CSF(150ng/mL)及びIL-4(50ng/mL)で7日間処理した。
標的細胞可視化アッセイ(TVA)
標的細胞をTVATM色素と共に370Cで15分間インキュベートし、その後、エフェクター細胞を標的細胞と共に4時間培養した。4時間のインキュベーション期間の後、525nmの発光波長の免疫スポットを用いて、標的細胞を計数した。以下の通り、特異的細胞傷害の割合を計算した:
標的細胞をTVATM色素と共に370Cで15分間インキュベートし、その後、エフェクター細胞を標的細胞と共に4時間培養した。4時間のインキュベーション期間の後、525nmの発光波長の免疫スポットを用いて、標的細胞を計数した。以下の通り、特異的細胞傷害の割合を計算した:
実施例2:[1]現在使用される代表的なK562腫瘍とは異なった、非常に感受性が高く、NK細胞の特定の標的であるOSCSC及びMP2腫瘍に対して、NK細胞の細胞傷害機能を測定するであろう
この試験の独自性は、NK特異的腫瘍細胞の使用を理由とする。既存の方法論は、NK細胞媒介性殺傷に固有のものではない。K562細胞は、NK細胞傷害性を評価するために使用される代表的な細胞であるが、これらの細胞は、場合により、T細胞により殺傷され、それらがNK細胞の機能に極めて固有のものではない。本発明者らは、NK細胞及びそれらのそれぞれの分化対応物による直接殺傷に高度の感受性があるがん幹細胞/低分化腫瘍の数を確認し、これは、NK細胞媒介性直接細胞傷害の影響を受けないか、または受けにくい(図1及び2)。しかし、分化腫瘍は、多くの場合、抗体が標的とする受容体の発現を上方制御するので、NK細胞により直接殺傷されなくても、NK細胞媒介性ADCCの影響を受けやすくなり、それ故、NK細胞は、様々な殺傷機序を使用して、未分化及び分化腫瘍の両方を殺傷することができる(さらなる説明については以下を参照)。がん幹細胞に対するNK細胞の殺傷能力は、CD8+T細胞、γδT細胞、及びCD4+T細胞などの免疫細胞の他のサブセットがこれらの標的を殺傷することができないので、特異的である(以下を参照)。
この試験の独自性は、NK特異的腫瘍細胞の使用を理由とする。既存の方法論は、NK細胞媒介性殺傷に固有のものではない。K562細胞は、NK細胞傷害性を評価するために使用される代表的な細胞であるが、これらの細胞は、場合により、T細胞により殺傷され、それらがNK細胞の機能に極めて固有のものではない。本発明者らは、NK細胞及びそれらのそれぞれの分化対応物による直接殺傷に高度の感受性があるがん幹細胞/低分化腫瘍の数を確認し、これは、NK細胞媒介性直接細胞傷害の影響を受けないか、または受けにくい(図1及び2)。しかし、分化腫瘍は、多くの場合、抗体が標的とする受容体の発現を上方制御するので、NK細胞により直接殺傷されなくても、NK細胞媒介性ADCCの影響を受けやすくなり、それ故、NK細胞は、様々な殺傷機序を使用して、未分化及び分化腫瘍の両方を殺傷することができる(さらなる説明については以下を参照)。がん幹細胞に対するNK細胞の殺傷能力は、CD8+T細胞、γδT細胞、及びCD4+T細胞などの免疫細胞の他のサブセットがこれらの標的を殺傷することができないので、特異的である(以下を参照)。
OSCSCは、感受性が高く、NK細胞の特定の標的である。
未処理、IL-2処理、及びIL-2+抗CD16処理NK細胞により、分化OSCCではなく幹様OSCSCの溶解の増加(図1A及び1B)。加えて、OSCSCは、NK細胞からのIFN-g分泌を誘発するが、その分化対応物OSCCは、はるかに少なく誘発する(図1C)。OSCSCは、より高いCD44及びより低いMHCクラスI表面受容体を発現し、CD338(多剤耐性遺伝子)のレベルの増加に起因する可能性がある分化OSCCとは異なり、CDDP誘導性細胞死の影響を受けにくい(図1D~1F)。
未処理、IL-2処理、及びIL-2+抗CD16処理NK細胞により、分化OSCCではなく幹様OSCSCの溶解の増加(図1A及び1B)。加えて、OSCSCは、NK細胞からのIFN-g分泌を誘発するが、その分化対応物OSCCは、はるかに少なく誘発する(図1C)。OSCSCは、より高いCD44及びより低いMHCクラスI表面受容体を発現し、CD338(多剤耐性遺伝子)のレベルの増加に起因する可能性がある分化OSCCとは異なり、CDDP誘導性細胞死の影響を受けにくい(図1D~1F)。
口腔腫瘍の分化ステージに応じて、直接殺傷またはADCCを介した差次的NK細胞媒介性溶解
OSCCは、OSCSCと比較して、高いレベルの表面MIC A/Bを発現する(図2A)。本発明者らは、NK細胞媒介性直接殺傷の低下、分化OSCCに対するADCCの増加(図2B)を観察したが、抗MIC A/B抗体の存在下、OSCSCに対するADCCがない状態では、NK細胞媒介性直接殺傷の増加が観察された(図2C)。NK細胞によるOSCSCの分化は、MIC A/B発現を増加させ(図2A)、NK細胞によるADCCを増加させた(データは示さず)。NK細胞をIL-2及び抗CD16mAbで処理すると、OSCCに対するNK細胞媒介性ADCCが完全にブロックされた(図2B)。
OSCCは、OSCSCと比較して、高いレベルの表面MIC A/Bを発現する(図2A)。本発明者らは、NK細胞媒介性直接殺傷の低下、分化OSCCに対するADCCの増加(図2B)を観察したが、抗MIC A/B抗体の存在下、OSCSCに対するADCCがない状態では、NK細胞媒介性直接殺傷の増加が観察された(図2C)。NK細胞によるOSCSCの分化は、MIC A/B発現を増加させ(図2A)、NK細胞によるADCCを増加させた(データは示さず)。NK細胞をIL-2及び抗CD16mAbで処理すると、OSCCに対するNK細胞媒介性ADCCが完全にブロックされた(図2B)。
MP2幹様/低分化膵腫瘍は、NK細胞媒介性細胞傷害に非常に感受性が高いが、それらの高分化対応物は、NK細胞媒介性細胞傷害に耐性がある
6つの膵腫瘍細胞を使用して、NK細胞と共に培養された場合の表面発現及びNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性を測定した。低分化MP-2及びPanc-1は、大量のCD44及び中レベルまたは低レベルのMHCクラスI及びCD54を発現した。中分化BXPC3及びHPAFは、MP2及びPanc-1と比較して、中~高レベルのCD44及びCD54ならびに高レベルのMHCクラスIを発現した。高分化Capan及びPL12は、はるかに低いレベルのCD44ならびにはるかに高いレベルのCD54及びMHCクラスIを有していた(図3A)。膵腫瘍細胞では、分化ステージ及びNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性間の直接的な相関関係が観察された。未分化MP2及びPanc-1が最も高いが、PL-12及びCapanの高分化腫瘍は、NK媒介性溶解に対して最も低い感受性を示した(図3B)。中分化BXPC3及びHPAFは、NK細胞溶解に対して中程度の感受性を示した(図3B)。従って、NK媒介性細胞傷害に対する感受性の増加及び膵腫瘍の低分化間に、直接的な相関関係があった。
6つの膵腫瘍細胞を使用して、NK細胞と共に培養された場合の表面発現及びNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性を測定した。低分化MP-2及びPanc-1は、大量のCD44及び中レベルまたは低レベルのMHCクラスI及びCD54を発現した。中分化BXPC3及びHPAFは、MP2及びPanc-1と比較して、中~高レベルのCD44及びCD54ならびに高レベルのMHCクラスIを発現した。高分化Capan及びPL12は、はるかに低いレベルのCD44ならびにはるかに高いレベルのCD54及びMHCクラスIを有していた(図3A)。膵腫瘍細胞では、分化ステージ及びNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性間の直接的な相関関係が観察された。未分化MP2及びPanc-1が最も高いが、PL-12及びCapanの高分化腫瘍は、NK媒介性溶解に対して最も低い感受性を示した(図3B)。中分化BXPC3及びHPAFは、NK細胞溶解に対して中程度の感受性を示した(図3B)。従って、NK媒介性細胞傷害に対する感受性の増加及び膵腫瘍の低分化間に、直接的な相関関係があった。
パクリタキセルは、患者由来の分化PL12及びCapan膵腫瘍に有意な細胞死を誘導したが、MP2の低分化腫瘍では誘導しなかった
MP2腫瘍とは異なり、高分化PL12及びCapan腫瘍を、パクリタキセルで処理すると(図4)、はるかに高いレベルの細胞死が示された
MP2腫瘍とは異なり、高分化PL12及びCapan腫瘍を、パクリタキセルで処理すると(図4)、はるかに高いレベルの細胞死が示された
膵腫瘍の分化ステージに応じて、直接殺傷またはADCCを介した差次的NK細胞媒介性溶解
分化PL-12腫瘍は、MP2と比較して、高いレベルの表面MIC A/Bを発現する(図5A)。NK細胞によるMP2の分化は、MIC A/B発現を増加させる(図5A)。NK細胞の低下が、直接殺傷を媒介したが、分化PL12に対するADCCを増加させた(図5B)一方、抗MIC A/B抗体の存在下、MP2腫瘍に対するADCCの非存在下では、NK細胞の増加が、直接殺傷を媒介した(図5C)。NK細胞をIL-2及び抗CD16mAbで処理すると、OSCCに対するNK細胞媒介性ADCCが完全にブロックされた(図2B)。初代NK細胞とは異なり、NK92細胞またはCD16がトランスフェクトされたNK92細胞(NK92V)は、直接殺傷またはADCCのいずれも媒介できなかった(図5D及び5E)。
分化PL-12腫瘍は、MP2と比較して、高いレベルの表面MIC A/Bを発現する(図5A)。NK細胞によるMP2の分化は、MIC A/B発現を増加させる(図5A)。NK細胞の低下が、直接殺傷を媒介したが、分化PL12に対するADCCを増加させた(図5B)一方、抗MIC A/B抗体の存在下、MP2腫瘍に対するADCCの非存在下では、NK細胞の増加が、直接殺傷を媒介した(図5C)。NK細胞をIL-2及び抗CD16mAbで処理すると、OSCCに対するNK細胞媒介性ADCCが完全にブロックされた(図2B)。初代NK細胞とは異なり、NK92細胞またはCD16がトランスフェクトされたNK92細胞(NK92V)は、直接殺傷またはADCCのいずれも媒介できなかった(図5D及び5E)。
初代末梢血由来NK細胞のみが、OSCSCに対する細胞傷害を媒介する
NK細胞、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及びgdT細胞は全て、末梢血から選別し、IL-2で活性化した後、それらを、51Cr標識OSCSCsに添加した。NK細胞のみが、OSCSCを殺傷することができた(図6A)。初代NK細胞を、末梢血から選別し、スーパーチャージした後、初代NK細胞及びスーパーチャージNK細胞の両方(スーパーチャージNK細胞の説明については以下を参照)を、51Cr放出アッセイで使用した(図6B)。効果を、臍帯血由来のNK細胞と比較した(図6B)。臍帯血由来のNK細胞は、OSCSCを殺傷することができなかった(図6B)。スーパーチャージNK細胞は、非常に高いレベルでOSCSCを殺傷した(図6B)。iPSC由来のNK細胞もOSCSCの殺傷がなかったが、スーパーチャージNK細胞の存在下では、非常に高レベルのNK細胞媒介性のOSCSCの殺傷が観察された(図6C)。これらの実験は、K562腫瘍(臍帯血由来のNK細胞及びiPSC由来のNK細胞による細胞傷害を実証する文献で使用)とは異なり、特定のNK細胞標的の溶解における末梢血NK細胞の精細な特異性を示す。従って、本発明者らのプロトコールは、NK細胞の細胞傷害性を決定する、非常に特異的なシステムを提供する。
NK細胞、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及びgdT細胞は全て、末梢血から選別し、IL-2で活性化した後、それらを、51Cr標識OSCSCsに添加した。NK細胞のみが、OSCSCを殺傷することができた(図6A)。初代NK細胞を、末梢血から選別し、スーパーチャージした後、初代NK細胞及びスーパーチャージNK細胞の両方(スーパーチャージNK細胞の説明については以下を参照)を、51Cr放出アッセイで使用した(図6B)。効果を、臍帯血由来のNK細胞と比較した(図6B)。臍帯血由来のNK細胞は、OSCSCを殺傷することができなかった(図6B)。スーパーチャージNK細胞は、非常に高いレベルでOSCSCを殺傷した(図6B)。iPSC由来のNK細胞もOSCSCの殺傷がなかったが、スーパーチャージNK細胞の存在下では、非常に高レベルのNK細胞媒介性のOSCSCの殺傷が観察された(図6C)。これらの実験は、K562腫瘍(臍帯血由来のNK細胞及びiPSC由来のNK細胞による細胞傷害を実証する文献で使用)とは異なり、特定のNK細胞標的の溶解における末梢血NK細胞の精細な特異性を示す。従って、本発明者らのプロトコールは、NK細胞の細胞傷害性を決定する、非常に特異的なシステムを提供する。
がん患者の末梢血から得られたNK細胞の機能喪失
がん患者の末梢血由来の精製初代NK細胞は、健常者の末梢血から単離されたものと比較して、OSCSCを殺傷する能力が有意に低い(図7A及びB)
がん患者の末梢血由来の精製初代NK細胞は、健常者の末梢血から単離されたものと比較して、OSCSCを殺傷する能力が有意に低い(図7A及びB)
破骨細胞拡大スーパーチャージNK細胞は、高レベルの細胞傷害性及びIFN-gの分泌を有する
単球拡大NK細胞または照射PBMC拡大NK細胞と比較して、スーパーチャージNK細胞は、優れた拡大能ならびに細胞傷害性及びIFN-gの分泌の増加を有する。
単球拡大NK細胞または照射PBMC拡大NK細胞と比較して、スーパーチャージNK細胞は、優れた拡大能ならびに細胞傷害性及びIFN-gの分泌の増加を有する。
実施例3:[2]Elisa及びElispotの両方が、健常及びがん患者から得られたNK細胞で誘導されたIFN-gのレベルを評価するために、使用されるであろう
両方の方法論による評価は、より正確であり、NK細胞の全体的及び細胞毎の基準を決定する。
両方の方法論による評価は、より正確であり、NK細胞の全体的及び細胞毎の基準を決定する。
患者のPBMC及びNK細胞は、様々な処理条件下で、低レベルのIFN-gを産生した
患者のPBMC及び精製NK細胞は、Elisa(図9A)及びElispot(図9B)の両方で評価された健常者から得られたものと比較して、はるかに低いレベルのIFN-gを産生する
患者のPBMC及び精製NK細胞は、Elisa(図9A)及びElispot(図9B)の両方で評価された健常者から得られたものと比較して、はるかに低いレベルのIFN-gを産生する
実施例4:[3]分泌IFN-gが腫瘍を分化させる能力が評価されるであろう
本発明者らは、腫瘍細胞の分化を増加させて腫瘍の成長を制限し、CD54、MHCクラスI、及びPDL-1の表面マーカーを増加させるように、IFN-g及びTNF-aがともに相乗作用し得ると判定した。健常者及びがん患者のものから分泌された同量のIFN-gは、上記の分化抗原の上方制御により評価される分化レベルの差異を媒介し、がん患者由来のNK細胞では、はるかに少ない分化レベルの差異をもたらすので、これにより、がん患者の腫瘍の分化における、NK細胞から分泌されたIFN-gの機能的能力が決定されるであろう。図10に見ることができるように、患者のNK細胞から分泌されたIFN-gは、健常者NK細胞から分泌されたものと比較して、MHCクラスI、CD54、及びB7H1の分化抗原を増加させる能力がはるかに低かった。
本発明者らは、腫瘍細胞の分化を増加させて腫瘍の成長を制限し、CD54、MHCクラスI、及びPDL-1の表面マーカーを増加させるように、IFN-g及びTNF-aがともに相乗作用し得ると判定した。健常者及びがん患者のものから分泌された同量のIFN-gは、上記の分化抗原の上方制御により評価される分化レベルの差異を媒介し、がん患者由来のNK細胞では、はるかに少ない分化レベルの差異をもたらすので、これにより、がん患者の腫瘍の分化における、NK細胞から分泌されたIFN-gの機能的能力が決定されるであろう。図10に見ることができるように、患者のNK細胞から分泌されたIFN-gは、健常者NK細胞から分泌されたものと比較して、MHCクラスI、CD54、及びB7H1の分化抗原を増加させる能力がはるかに低かった。
実施例5:[4]患者のNK細胞が自己及び同種異系破骨細胞で拡大する能力が評価されることになり、低い場合、同種異系NK細胞が使用されることになり、細胞傷害性及びIFN-g分泌ならびに腫瘍を分化させる能力が試験されることになる
この試験は、がん患者のNK細胞が拡大し得るかどうか、ならびに拡大NK細胞が、細胞傷害(直接殺傷及びADCCの両方)及びそれらが機能的IFN-gを産生するという点で機能するかどうかを判定するであろう。それらが治療レベルまで拡大しないことが判明した場合、同種異系NK細胞が免疫療法に使用されるであろう。
この試験は、がん患者のNK細胞が拡大し得るかどうか、ならびに拡大NK細胞が、細胞傷害(直接殺傷及びADCCの両方)及びそれらが機能的IFN-gを産生するという点で機能するかどうかを判定するであろう。それらが治療レベルまで拡大しないことが判明した場合、同種異系NK細胞が免疫療法に使用されるであろう。
がん患者における初代NK細胞媒介性細胞傷害の抑制及び/またはサイトカインの分泌
健常者から単離されたものと比較して、がん患者の末梢血から回収されたPBMCの数は低かった(図11A)。健常者と比較して、がん患者から単離されたCD45+PBMC内で、割合が高いCD16+CD56+、CD14+、CD11b+細胞、及び割合が低いCD3+、及びCD19+細胞を得た(図11B)。がん患者由来のNK細胞は、健常者由来のNK細胞と比較して、IFN-γ分泌の減少(図11C及び11E)ならびにNK細胞媒介性細胞傷害性の有意な低下(図11D)を示した。加えて、IFN-γと同様に、IL-12p70、IL-6、TNF-α、IL-5、及びIL-4の分泌も、健常者由来のものと比較して、がん患者のNK細胞から有意に低かった(図11E)。がん患者の末梢血から収集された血清で、同様の結果が見られた(図11F)。
健常者から単離されたものと比較して、がん患者の末梢血から回収されたPBMCの数は低かった(図11A)。健常者と比較して、がん患者から単離されたCD45+PBMC内で、割合が高いCD16+CD56+、CD14+、CD11b+細胞、及び割合が低いCD3+、及びCD19+細胞を得た(図11B)。がん患者由来のNK細胞は、健常者由来のNK細胞と比較して、IFN-γ分泌の減少(図11C及び11E)ならびにNK細胞媒介性細胞傷害性の有意な低下(図11D)を示した。加えて、IFN-γと同様に、IL-12p70、IL-6、TNF-α、IL-5、及びIL-4の分泌も、健常者由来のものと比較して、がん患者のNK細胞から有意に低かった(図11E)。がん患者の末梢血から収集された血清で、同様の結果が見られた(図11F)。
がん患者由来のスーパーチャージNK細胞は、健常者と比較して、拡大する能力、または細胞傷害を媒介してIFN-γを分泌する能力がはるかに低い。
がん患者及び健常者からの精製NK細胞を健常な同種異系OCと共に培養し、NK細胞の拡大、細胞傷害性及びIFN-γ分泌のレベルを評価した。がん患者由来のNK細胞は、健常者由来のものと比較して、有意に低い拡大(図12A)、及び低いNK細胞媒介性細胞傷害性(図12B)を有していた(図12A~12B)。がん患者のNK細胞はまた、OCの非存在下または存在下の両方で、有意に低いレベルのIFN-γ分泌を媒介した(図12C~12D)。NK細胞と同様に、がん患者由来のT細胞は、本発明者らが、自らの方法論を使用して特定することができる欠陥を有していた(必要に応じてデータを提供可能)
がん患者及び健常者からの精製NK細胞を健常な同種異系OCと共に培養し、NK細胞の拡大、細胞傷害性及びIFN-γ分泌のレベルを評価した。がん患者由来のNK細胞は、健常者由来のものと比較して、有意に低い拡大(図12A)、及び低いNK細胞媒介性細胞傷害性(図12B)を有していた(図12A~12B)。がん患者のNK細胞はまた、OCの非存在下または存在下の両方で、有意に低いレベルのIFN-γ分泌を媒介した(図12C~12D)。NK細胞と同様に、がん患者由来のT細胞は、本発明者らが、自らの方法論を使用して特定することができる欠陥を有していた(必要に応じてデータを提供可能)
実施例6:[5]NK細胞が機能的なCD8+T細胞を拡大させる能力の決定
本発明者らの最近の研究結果は、NK細胞がCD4+T細胞の排除によるCD8+T細胞の選択及び拡大に重要であることを示した。本発明者らは、本試験を実施して、NK細胞がCD8+T細胞の拡大をいかに良好に拡大することができるかを判定するであろう。
本発明者らの最近の研究結果は、NK細胞がCD4+T細胞の排除によるCD8+T細胞の選択及び拡大に重要であることを示した。本発明者らは、本試験を実施して、NK細胞がCD8+T細胞の拡大をいかに良好に拡大することができるかを判定するであろう。
スーパーチャージNK細胞は、CD8+T細胞を有意に拡大させた
次に、本発明者らは、精製NK細胞及びT細胞のそれぞれを、OCと共に培養し、OCとのNK及びT細胞両方の共培養物内のCD4+及びCD8+T細胞の割合を決定した。OCと共に培養された精製T細胞は、CD8+T細胞の割合を増加させ、CD4/CD8の比は、OCの非存在下でのT細胞における2.4から、OCと共に培養されたものにおける1.2まで減少した(図13A)。対照的に、OCと共にNK培養内で拡大したT細胞は、CD8+T細胞の割合を有意に増加させ、従って、CD4/CD8の比は、著しく減少した(図3E)。患者由来のT細胞及びNK細胞をOCと共に培養した場合も、同様の傾向が見られた。但し、患者由来のOCと共に培養されたT細胞は、健常な対照と比較して、CD4/CD8比が低かった(図13B)。従って、NK細胞の非存在下の健常者及びがん患者から単離された精製T細胞は、CD8+T細胞を有意に拡大させることができなかったが、がん患者のT細胞は、構成的にCD8+T細胞の割合が高かった(図13A~13B)。加えて、培養開始時に検出不可能なまたは無視できるレベルの汚染T細胞を含有していたOCで活性化された精製NK細胞は、拡大期間中の後半に、健常及び患者培養物の両方に由来のCD8+T細胞を拡大させたが、患者NK細胞培養物は、健常なNK細胞よりも速くCD8+T細胞を拡大させた(図13)。
次に、本発明者らは、精製NK細胞及びT細胞のそれぞれを、OCと共に培養し、OCとのNK及びT細胞両方の共培養物内のCD4+及びCD8+T細胞の割合を決定した。OCと共に培養された精製T細胞は、CD8+T細胞の割合を増加させ、CD4/CD8の比は、OCの非存在下でのT細胞における2.4から、OCと共に培養されたものにおける1.2まで減少した(図13A)。対照的に、OCと共にNK培養内で拡大したT細胞は、CD8+T細胞の割合を有意に増加させ、従って、CD4/CD8の比は、著しく減少した(図3E)。患者由来のT細胞及びNK細胞をOCと共に培養した場合も、同様の傾向が見られた。但し、患者由来のOCと共に培養されたT細胞は、健常な対照と比較して、CD4/CD8比が低かった(図13B)。従って、NK細胞の非存在下の健常者及びがん患者から単離された精製T細胞は、CD8+T細胞を有意に拡大させることができなかったが、がん患者のT細胞は、構成的にCD8+T細胞の割合が高かった(図13A~13B)。加えて、培養開始時に検出不可能なまたは無視できるレベルの汚染T細胞を含有していたOCで活性化された精製NK細胞は、拡大期間中の後半に、健常及び患者培養物の両方に由来のCD8+T細胞を拡大させたが、患者NK細胞培養物は、健常なNK細胞よりも速くCD8+T細胞を拡大させた(図13)。
NK細胞を用いる免疫療法は、CD8+T細胞を増加させ、担口腔腫瘍hu-BLTマウスにおけるIFN-γ分泌及びNK細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらした
hu-BLTマウスの口腔内に、OSCSCを移植し、強力な細胞傷害能及びサイトカイン分泌能を有するスーパーチャージNK細胞を注射した。数週間後、マウスを死亡させ、組織を取り出し、解離させ、細胞を分析した(図14A)。NK注射担腫瘍マウスでは、他の群と比較して、BM(図14B)、脾臓(図14E)、及び末梢血(図14H)内のCD3+CD8+T細胞の割合の増加が見られた。NK細胞の注射は、NK細胞注射のないものと比較して、担腫瘍マウスにおいて、BM(図5C)、脾臓(図14F)、及び末梢血(図14I)からのIFN-γ分泌の増加、ならびにBM(図14D)、脾臓(図14F)、及び末梢血(図14J)におけるNK細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらした。興味深いことに、NK注射担腫瘍マウスの末梢血の血清は、NK注射担腫瘍マウスでは、NK細胞注射のない担腫瘍マウスと比較して、INF-γ、IL-6、及びITACが増加したが、IL-8及びGM-CSFが減少したことを示した(図14K)。
hu-BLTマウスの口腔内に、OSCSCを移植し、強力な細胞傷害能及びサイトカイン分泌能を有するスーパーチャージNK細胞を注射した。数週間後、マウスを死亡させ、組織を取り出し、解離させ、細胞を分析した(図14A)。NK注射担腫瘍マウスでは、他の群と比較して、BM(図14B)、脾臓(図14E)、及び末梢血(図14H)内のCD3+CD8+T細胞の割合の増加が見られた。NK細胞の注射は、NK細胞注射のないものと比較して、担腫瘍マウスにおいて、BM(図5C)、脾臓(図14F)、及び末梢血(図14I)からのIFN-γ分泌の増加、ならびにBM(図14D)、脾臓(図14F)、及び末梢血(図14J)におけるNK細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらした。興味深いことに、NK注射担腫瘍マウスの末梢血の血清は、NK注射担腫瘍マウスでは、NK細胞注射のない担腫瘍マウスと比較して、INF-γ、IL-6、及びITACが増加したが、IL-8及びGM-CSFが減少したことを示した(図14K)。
スーパーチャージNK細胞で拡大したCD8+T細胞は、高レベルのサイトカインを分泌する
CD8+T細胞は、スーパーチャージNK細胞で拡大し、12日間の拡大の後に選別され、OC拡大CD8+T細胞から得られたものと比較して、高レベルのサイトカインを分泌する。GM-CSF、sCD137、IFN-g、IL-10、sFASL、及びTNF-aは、スーパーチャージNK細胞から選別されたCD8+T細胞において高かったが、グランザイムB及び分泌されたFasについて差異は見ることができず、低レベルのグランザイムA及びパーフォリンを観察することができた。これらの結果は、NK細胞が、CD8+T細胞によるサイトカイン放出を増加させる一方、顆粒の放出を減少させることを示唆する。
CD8+T細胞は、スーパーチャージNK細胞で拡大し、12日間の拡大の後に選別され、OC拡大CD8+T細胞から得られたものと比較して、高レベルのサイトカインを分泌する。GM-CSF、sCD137、IFN-g、IL-10、sFASL、及びTNF-aは、スーパーチャージNK細胞から選別されたCD8+T細胞において高かったが、グランザイムB及び分泌されたFasについて差異は見ることができず、低レベルのグランザイムA及びパーフォリンを観察することができた。これらの結果は、NK細胞が、CD8+T細胞によるサイトカイン放出を増加させる一方、顆粒の放出を減少させることを示唆する。
実施例7:[6]CD16受容体の発現及び機能の測定
多くの患者は、CD16受容体の発現の低下及びCD16機能の不全を有し、機能不全のCD16発現及び機能を有する場合、これらの患者の免疫療法の異なる方策が用いられるべきであるので、これは、IFN-gの分泌及び分化腫瘍に対するADCC機能を媒介する能力(上記を参照)について試験されるであろう。
多くの患者は、CD16受容体の発現の低下及びCD16機能の不全を有し、機能不全のCD16発現及び機能を有する場合、これらの患者の免疫療法の異なる方策が用いられるべきであるので、これは、IFN-gの分泌及び分化腫瘍に対するADCC機能を媒介する能力(上記を参照)について試験されるであろう。
CD16受容体を介した活性化は、がん患者からIFN-g分泌を引き起こさない
がん患者から単離されたPBMC及び精製NK細胞は、Elisa(図16A)及びElispot(図16B)の両方でIFN-g分泌を上方制御するCD16媒介性シグナル伝達に応答しない。欠陥が、NK細胞の機能不全に起因するものだけでなく、患者単球がNK細胞と相乗作用してIFN-gを誘導する能力の欠如に起因するものもある。これらの結果は、患者が、IFN-gの分泌を増加させるためのCD16媒介性シグナル伝達に重大な欠陥を有することを示していた。さらに重要なことは、患者の単球は、有意な治療方策を提供することができる、本発明者らの特許を取得したプロバイオティック細菌sAJ2により活性化された、NK細胞媒介性IFN-gの放出の誘発に欠陥を有さない。加えて、患者のT細胞は、依然として、CD3及びCD28を介して活性化することができる。それ故、これらの実験により、がん患者において、どの細胞型に欠陥があるか、及びどの受容体に欠陥があるかを、本発明者らが明らかに示すことが可能となり、テールがそれに応じて免疫療法方策を立てる。
がん患者から単離されたPBMC及び精製NK細胞は、Elisa(図16A)及びElispot(図16B)の両方でIFN-g分泌を上方制御するCD16媒介性シグナル伝達に応答しない。欠陥が、NK細胞の機能不全に起因するものだけでなく、患者単球がNK細胞と相乗作用してIFN-gを誘導する能力の欠如に起因するものもある。これらの結果は、患者が、IFN-gの分泌を増加させるためのCD16媒介性シグナル伝達に重大な欠陥を有することを示していた。さらに重要なことは、患者の単球は、有意な治療方策を提供することができる、本発明者らの特許を取得したプロバイオティック細菌sAJ2により活性化された、NK細胞媒介性IFN-gの放出の誘発に欠陥を有さない。加えて、患者のT細胞は、依然として、CD3及びCD28を介して活性化することができる。それ故、これらの実験により、がん患者において、どの細胞型に欠陥があるか、及びどの受容体に欠陥があるかを、本発明者らが明らかに示すことが可能となり、テールがそれに応じて免疫療法方策を立てる。
実施例8:[7]分化の本発明者らのバイオマーカーを用いる、患者の腫瘍細胞の状態の決定
本発明者らは、腫瘍内の腫瘍分化のバイオマーカーを確立している。試験されるべきバイオマーカーは、CD44、CD54、MHCクラスI、及びPD-L1(B7H1)である。高いCD44及び低いCD54、MHCクラスI、ならびにPD-L1は、腫瘍細胞の低分化特性を確立することになり、低いCD44及び高いCD54、MHCクラスI、ならびにPD-L1は、腫瘍細胞の高分化を確立することになる(図1~3を参照)。本発明者らは、分化剤としてMICA/Bも含む(図2)。上に示されるように、分化のレベルを確立することも、化学療法処置の有効性を予測するために重要である。これらの試験は、予後にとって重要であろう。高分化腫瘍対低分化腫瘍の特徴(図17)及びNSGマウスへの腫瘍移植のプロトコール(図18)については、以下を参照のこと。(図18)から分かるように、MP2数が小さいと、転移を伴うより大きな腫瘍が成長したが、PL12数が大きいと、転移を伴わない小さい腫瘍のみが成長した。MP2の移植前のNK細胞による分化は、NK分化のない親系統よりも高い数で使用された場合でも、いかなる腫瘍も成長させなかった。
本発明者らは、腫瘍内の腫瘍分化のバイオマーカーを確立している。試験されるべきバイオマーカーは、CD44、CD54、MHCクラスI、及びPD-L1(B7H1)である。高いCD44及び低いCD54、MHCクラスI、ならびにPD-L1は、腫瘍細胞の低分化特性を確立することになり、低いCD44及び高いCD54、MHCクラスI、ならびにPD-L1は、腫瘍細胞の高分化を確立することになる(図1~3を参照)。本発明者らは、分化剤としてMICA/Bも含む(図2)。上に示されるように、分化のレベルを確立することも、化学療法処置の有効性を予測するために重要である。これらの試験は、予後にとって重要であろう。高分化腫瘍対低分化腫瘍の特徴(図17)及びNSGマウスへの腫瘍移植のプロトコール(図18)については、以下を参照のこと。(図18)から分かるように、MP2数が小さいと、転移を伴うより大きな腫瘍が成長したが、PL12数が大きいと、転移を伴わない小さい腫瘍のみが成長した。MP2の移植前のNK細胞による分化は、NK分化のない親系統よりも高い数で使用された場合でも、いかなる腫瘍も成長させなかった。
実施例9:実施例10~19の材料及び方法
細胞株、試薬、及び抗体
10%のウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Products,San Diego,CA,USA)が補充されたRPMI1640を、ヒトNK細胞の培養に使用した。ヒト膵癌細胞株Panc1、MIA PaCa2(MP2)、BXPC3、HPAF、及びCapanは、Dr.Guido Eibl(UCLA David Geffen School of Medicine)から厚意で提供され、PL12は、Dr.Nicholas Cacalano(UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center)から提供された。Panc-1、MP2、及びBXPC3を、10%のFBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gemini Bio-Products,West Sacramento,CA,USA)が補充されたDMEMで培養した。HPAF、Capan、及びPL12を、10%のFBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシンが補充されたRMPI1640培地で培養した。組み換えヒトIL2を、NIH-BRBから入手した。ヒトTNF-α及びIFN-γを、Biolegend(San Diego,CA,USA)から入手した。CD16に対する抗体を、Biolegend(San Diego,CA,USA)から購入した。フローサイトメトリー用の蛍光色素コンジュゲートヒト及びマウス抗体を、Biolegend(San Diego,CA,USA)から入手した。TNF-α及びIFN-γに対するモノクローナル抗体を、本発明者らの研究室で調製し、1:100の希釈で使用して、rhTNF-α及びrhIFN-γ機能をブロックした。ヒトNK細胞及び単球精製キットを、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から入手した。ヨウ化プロピジウム(PI)及びN-アセチルシステイン(NAC)を、Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA)から購入した。シスプラチン及びパクリタキセルを、Ronald Reagan UCLA Medical Center Pharmacy(Los Angeles,CA,USA)から購入した。
細胞株、試薬、及び抗体
10%のウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Products,San Diego,CA,USA)が補充されたRPMI1640を、ヒトNK細胞の培養に使用した。ヒト膵癌細胞株Panc1、MIA PaCa2(MP2)、BXPC3、HPAF、及びCapanは、Dr.Guido Eibl(UCLA David Geffen School of Medicine)から厚意で提供され、PL12は、Dr.Nicholas Cacalano(UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center)から提供された。Panc-1、MP2、及びBXPC3を、10%のFBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gemini Bio-Products,West Sacramento,CA,USA)が補充されたDMEMで培養した。HPAF、Capan、及びPL12を、10%のFBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシンが補充されたRMPI1640培地で培養した。組み換えヒトIL2を、NIH-BRBから入手した。ヒトTNF-α及びIFN-γを、Biolegend(San Diego,CA,USA)から入手した。CD16に対する抗体を、Biolegend(San Diego,CA,USA)から購入した。フローサイトメトリー用の蛍光色素コンジュゲートヒト及びマウス抗体を、Biolegend(San Diego,CA,USA)から入手した。TNF-α及びIFN-γに対するモノクローナル抗体を、本発明者らの研究室で調製し、1:100の希釈で使用して、rhTNF-α及びrhIFN-γ機能をブロックした。ヒトNK細胞及び単球精製キットを、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から入手した。ヨウ化プロピジウム(PI)及びN-アセチルシステイン(NAC)を、Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA)から購入した。シスプラチン及びパクリタキセルを、Ronald Reagan UCLA Medical Center Pharmacy(Los Angeles,CA,USA)から購入した。
参加するための倫理的承認及び同意
UCLA Institutional Review Board(IRB)により承認された書面によるインフォームドコンセントが得られ、全ての手順は、UCLA-IRBにより承認された(IRB#11-000781)。UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した(プロトコール#2012-101-13)。
UCLA Institutional Review Board(IRB)により承認された書面によるインフォームドコンセントが得られ、全ての手順は、UCLA-IRBにより承認された(IRB#11-000781)。UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した(プロトコール#2012-101-13)。
ヒトNK細胞及び単球の精製
Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)製の単離キットを使用して、NK細胞及び単球をPBMCから負に選択した。フローサイトメトリー分析に基づいて、精製NK細胞及び単球の両方に対して、96%を超える純度が得られた。
Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)製の単離キットを使用して、NK細胞及び単球をPBMCから負に選択した。フローサイトメトリー分析に基づいて、精製NK細胞及び単球の両方に対して、96%を超える純度が得られた。
免疫不全(NSG)及びヒト化BLTマウスにおけるヒト膵癌細胞成長の分析
上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスを生成した。NSGまたはhu-BLTマウスの膵臓への同所性腫瘍移植により、膵腫瘍のin vivo成長を実施した。同所性腫瘍を確立するために、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、インスリン注射器を使用して、マトリゲル(10μL)(Corning,NY,USA)との混合物中の腫瘍を膵臓に注射した。マウスは、腫瘍移植の7~10日後に、尾静脈注射を介して1.5×106のスーパーチャージNK細胞を投与された。それらに、AJ2(50億/用量)も経口給餌した。腫瘍移植の1または2週間前に、初回用量のAJ2を与え、給餌を48時間毎の間隔で実験を通して継続した。罹患の徴候が明らかな場合、マウスを安楽死させた。膵臓、膵腫瘍、骨髄、脾臓、及び末梢血を採取し、上に及び以下に記載されるように、単一細胞懸濁液を各組織から調製した。
上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスを生成した。NSGまたはhu-BLTマウスの膵臓への同所性腫瘍移植により、膵腫瘍のin vivo成長を実施した。同所性腫瘍を確立するために、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、インスリン注射器を使用して、マトリゲル(10μL)(Corning,NY,USA)との混合物中の腫瘍を膵臓に注射した。マウスは、腫瘍移植の7~10日後に、尾静脈注射を介して1.5×106のスーパーチャージNK細胞を投与された。それらに、AJ2(50億/用量)も経口給餌した。腫瘍移植の1または2週間前に、初回用量のAJ2を与え、給餌を48時間毎の間隔で実験を通して継続した。罹患の徴候が明らかな場合、マウスを安楽死させた。膵臓、膵腫瘍、骨髄、脾臓、及び末梢血を採取し、上に及び以下に記載されるように、単一細胞懸濁液を各組織から調製した。
hu-BLT及びNSGマウスの組織の細胞解離及び細胞培養
膵腫瘍をNSG及びhu-BLTマウスから採取し、1mm3の小片に切断し、DMEM培地中1mg/mLのコラゲナーゼIV、10U/mLのDNAse I、及び1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有する消化緩衝液に37℃で20分間入れた。次に、試料を40mmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で10分間、1500rpmで遠心分離した。BMから単一細胞懸濁液を得るために、培地を使用して、大腿骨をフラッシュし、40μmのセルストレーナーに通して濾過した。脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、40μmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。フィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。
膵腫瘍をNSG及びhu-BLTマウスから採取し、1mm3の小片に切断し、DMEM培地中1mg/mLのコラゲナーゼIV、10U/mLのDNAse I、及び1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有する消化緩衝液に37℃で20分間入れた。次に、試料を40mmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で10分間、1500rpmで遠心分離した。BMから単一細胞懸濁液を得るために、培地を使用して、大腿骨をフラッシュし、40μmのセルストレーナーに通して濾過した。脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、40μmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。フィコール・ハイパック遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。
hu-BLTマウスからのNK細胞、T細胞、及び単球の分離
上述にように、ヒトCD56+及びCD3+選択キット(StemCells Technologies、Vancouver,BC,Canada)を使用して、それぞれ、hu-BLT脾細胞由来のNK細胞及びT細胞を得た。ヒトCD14単離キット(eBioscience,San Diego,CA,USA)を使用して、hu-BLT骨髄由来の単球を分離した。
上述にように、ヒトCD56+及びCD3+選択キット(StemCells Technologies、Vancouver,BC,Canada)を使用して、それぞれ、hu-BLT脾細胞由来のNK細胞及びT細胞を得た。ヒトCD14単離キット(eBioscience,San Diego,CA,USA)を使用して、hu-BLT骨髄由来の単球を分離した。
破骨細胞の生成ならびにヒト及びhu-BLT NK細胞の拡大
単球をヒト末梢血またはhu-BLT BMから精製し、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/ml)を含有するアルファMEM培地を使用して、21日間培養した(培地を3日毎にリフレッシュした)。NK細胞を、rh-IL-2(1000U/mL)及び抗CD16mAb(3μg/mL)で18~20時間活性化した後、破骨細胞及び超音波処理AJ2と共に培養して、スーパーチャージNK細胞を生成した。3日毎に、rh-IL2(1000U/ml)を含有するRMPIで、培地をリフレッシュした。
単球をヒト末梢血またはhu-BLT BMから精製し、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/ml)を含有するアルファMEM培地を使用して、21日間培養した(培地を3日毎にリフレッシュした)。NK細胞を、rh-IL-2(1000U/mL)及び抗CD16mAb(3μg/mL)で18~20時間活性化した後、破骨細胞及び超音波処理AJ2と共に培養して、スーパーチャージNK細胞を生成した。3日毎に、rh-IL2(1000U/ml)を含有するRMPIで、培地をリフレッシュした。
in vitro MP2及びOSCSCのがん幹細胞分化
上述のように、MP2及びOSCSC(口腔扁平上皮癌幹細胞)腫瘍の分化を実施した。要約すると、NK細胞を抗CD16mAb(3μg/mL)及びIL-2(1000U/mL)の組み合わせで18時間処理した後、上清を取り出し、腫瘍の分化に使用した。Biolegend(San Diego,CA,USA)から購入したELISAキットを使用して、活性化NK細胞により産生されたIFN-γの量を評価した。腫瘍の分化を誘導するために、合計3500pgのIFN-γ含有上清を4日間添加した。
上述のように、MP2及びOSCSC(口腔扁平上皮癌幹細胞)腫瘍の分化を実施した。要約すると、NK細胞を抗CD16mAb(3μg/mL)及びIL-2(1000U/mL)の組み合わせで18時間処理した後、上清を取り出し、腫瘍の分化に使用した。Biolegend(San Diego,CA,USA)から購入したELISAキットを使用して、活性化NK細胞により産生されたIFN-γの量を評価した。腫瘍の分化を誘導するために、合計3500pgのIFN-γ含有上清を4日間添加した。
酵素結合免疫測定法(ELISA)及びマルチプレックスサイトカインアッセイ
IFN-γ及びIL-6用のヒトELISAキットを、Biolegend(San Diego,CA,USA)から購入した。製造者が推奨するように、アッセイを実施した。特定の実験では、マルチプレックスアレイを使用して、分泌されたサイトカイン及びケモカインのレベルを決定した。MAGPIX(Millipore,Danvers,MA,USA)を使用して分析を実施し、xPONENT4.2(Luminex,Austin,TX,USA)を使用して、データを分析した。
IFN-γ及びIL-6用のヒトELISAキットを、Biolegend(San Diego,CA,USA)から購入した。製造者が推奨するように、アッセイを実施した。特定の実験では、マルチプレックスアレイを使用して、分泌されたサイトカイン及びケモカインのレベルを決定した。MAGPIX(Millipore,Danvers,MA,USA)を使用して分析を実施し、xPONENT4.2(Luminex,Austin,TX,USA)を使用して、データを分析した。
表面染色及び細胞死アッセイ
上述のように、細胞を抗体で染色することにより、染色を実施し、要約すると、50μLの冷PBS+1%のBSA中の1×104の細胞に抗体を添加し、細胞を氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を冷PBS+1%のBSA中で洗浄し、Beckman Coulter Epics XLサイトメーター(Brea,CA,USA)を使用して、フローサイトメトリー分析を実施し、FlowJo vXソフトウェア(Flowjo,Ashland,OR,USA)で結果を分析した。
上述のように、細胞を抗体で染色することにより、染色を実施し、要約すると、50μLの冷PBS+1%のBSA中の1×104の細胞に抗体を添加し、細胞を氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を冷PBS+1%のBSA中で洗浄し、Beckman Coulter Epics XLサイトメーター(Brea,CA,USA)を使用して、フローサイトメトリー分析を実施し、FlowJo vXソフトウェア(Flowjo,Ashland,OR,USA)で結果を分析した。
51Cr放出細胞傷害アッセイ
上述のように、51Cr放出アッセイを実施した。患者由来のOSCSCを特異的で感度の高いNK標的として使用して、NK細胞媒介性細胞傷害性を評価した。要約すると、異なる数のエフェクター細胞を、51Cr標識OSCSCとインキュベートした。4時間のインキュベーション後、上清を各試料から採取し、ガンマカウンターでカウントした。次の式を使用して、特異的細胞傷害の割合を計算した。
腫瘍標的細胞×100の30%を溶解させるのに必要なエフェクター細胞の数の逆数を使用して、溶解ユニット30/106を計算する。
上述のように、51Cr放出アッセイを実施した。患者由来のOSCSCを特異的で感度の高いNK標的として使用して、NK細胞媒介性細胞傷害性を評価した。要約すると、異なる数のエフェクター細胞を、51Cr標識OSCSCとインキュベートした。4時間のインキュベーション後、上清を各試料から採取し、ガンマカウンターでカウントした。次の式を使用して、特異的細胞傷害の割合を計算した。
統計分析
統計分析のために、対応のない両側スチューデントのt検定を実施した。Prism-7ソフトウェア(Graphpad Prism,San Diego,CA,USA)を使用する一元ANOVAを使用して、異なる群を比較した。(n)は、実験の各条件に使用されたマウスの数を示す。以下の記号は、各分析内の統計的有意性のレベルを表す。***(p値<0.001)、**(p値0.001~0.01)、*(p値0.01~0.05)。
統計分析のために、対応のない両側スチューデントのt検定を実施した。Prism-7ソフトウェア(Graphpad Prism,San Diego,CA,USA)を使用する一元ANOVAを使用して、異なる群を比較した。(n)は、実験の各条件に使用されたマウスの数を示す。以下の記号は、各分析内の統計的有意性のレベルを表す。***(p値<0.001)、**(p値0.001~0.01)、*(p値0.01~0.05)。
実施例10:NK細胞の細胞傷害性及び膵腫瘍の分化ステージ間の相関
低分化ステージ、中分化ステージ、及び高分化ステージでそれぞれ病理学的に特性決定された6つの異なる膵腫瘍細胞株を使用して、腫瘍の分化ステージと直接相関する、表現型、NK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性、及びIFN-γの分泌を決定した。低分化MP2及びPanc-1は、CD44受容体のより高い表面発現の存在下で、中~低レベルのMHCクラスI及びCD54を示した。中分化BXPC3及びHPAFは、表面CD44及びCD54受容体の中~高発現の存在下で、高いレベルのMHCクラスIの表面発現を示し、高分化Capan及びPL12は、低いCD44表面発現の存在下で、高レベルの表面CD54及びMHCクラスIを発現した(図3A)。さらに、腫瘍の分化ステージは、膵腫瘍細胞におけるNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性と相関していた。未分化MP2及びPanc-1腫瘍では、NK細胞媒介性細胞傷害に対する最も高い感受性が見られるが;高分化PL12及びCapan腫瘍は、NK媒介性溶解に対して最も低い感受性を示した(図3B及び図25A)。中分化腫瘍であるBXPC3及びHPAFは、NK細胞溶解に対して中程度の感受性を示した(図3B)。それ故、NK媒介性溶解に対する感受性の増強及び膵腫瘍の低分化間の直接的な相関関係は、これらの実験から明らかであった。腫瘍分化における同一の結果が、口腔腫瘍及び膠芽腫で、さらに最近では、メラノーマ及び肺腫瘍で見られた。PL12及びCapanと同様に、NK分化MP2腫瘍は、同じ表面受容体表現型を示し、NK細胞媒介性細胞傷害に対して耐性であった。NK細胞は、IFN-γ及びTNF-αの機能を介してMP2腫瘍の分化を誘導し、rhIFN-γ及び/またはrhTNF-αは、NK誘導IFN-γ及びTNF-αと同様の結果を示した(実施例17及び図25を参照)。
低分化ステージ、中分化ステージ、及び高分化ステージでそれぞれ病理学的に特性決定された6つの異なる膵腫瘍細胞株を使用して、腫瘍の分化ステージと直接相関する、表現型、NK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性、及びIFN-γの分泌を決定した。低分化MP2及びPanc-1は、CD44受容体のより高い表面発現の存在下で、中~低レベルのMHCクラスI及びCD54を示した。中分化BXPC3及びHPAFは、表面CD44及びCD54受容体の中~高発現の存在下で、高いレベルのMHCクラスIの表面発現を示し、高分化Capan及びPL12は、低いCD44表面発現の存在下で、高レベルの表面CD54及びMHCクラスIを発現した(図3A)。さらに、腫瘍の分化ステージは、膵腫瘍細胞におけるNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性と相関していた。未分化MP2及びPanc-1腫瘍では、NK細胞媒介性細胞傷害に対する最も高い感受性が見られるが;高分化PL12及びCapan腫瘍は、NK媒介性溶解に対して最も低い感受性を示した(図3B及び図25A)。中分化腫瘍であるBXPC3及びHPAFは、NK細胞溶解に対して中程度の感受性を示した(図3B)。それ故、NK媒介性溶解に対する感受性の増強及び膵腫瘍の低分化間の直接的な相関関係は、これらの実験から明らかであった。腫瘍分化における同一の結果が、口腔腫瘍及び膠芽腫で、さらに最近では、メラノーマ及び肺腫瘍で見られた。PL12及びCapanと同様に、NK分化MP2腫瘍は、同じ表面受容体表現型を示し、NK細胞媒介性細胞傷害に対して耐性であった。NK細胞は、IFN-γ及びTNF-αの機能を介してMP2腫瘍の分化を誘導し、rhIFN-γ及び/またはrhTNF-αは、NK誘導IFN-γ及びTNF-αと同様の結果を示した(実施例17及び図25を参照)。
実施例11:NK分化MP2及び患者由来の分化PL12腫瘍の移植後のマウスの膵腫瘍成長の抑制及び長期生存
NSGマウスの膵臓に移植されたMP2腫瘍(3×105)は、4週間以内に成長し、肝臓に転移し、マウスに著しい罹患率及び死亡率を引き起こした(図18及び図19)が、多数のPL12腫瘍(2×106)を注射されたマウスは、12週間以内に腫瘍を全く生じなかったか、または極めて小さい腫瘍を生じ、腫瘍は、マウスに転移も、罹患も引き起こすことがなかった(図18及び図19)。NSGマウスの膵臓へのNK分化MP2腫瘍(5×105)の注射は、目に見える腫瘍成長も、肝臓への腫瘍の転移も示さず、全てのマウスは、実験を終結した時から12週間生存した(図18及び図19)。
NSGマウスの膵臓に移植されたMP2腫瘍(3×105)は、4週間以内に成長し、肝臓に転移し、マウスに著しい罹患率及び死亡率を引き起こした(図18及び図19)が、多数のPL12腫瘍(2×106)を注射されたマウスは、12週間以内に腫瘍を全く生じなかったか、または極めて小さい腫瘍を生じ、腫瘍は、マウスに転移も、罹患も引き起こすことがなかった(図18及び図19)。NSGマウスの膵臓へのNK分化MP2腫瘍(5×105)の注射は、目に見える腫瘍成長も、肝臓への腫瘍の転移も示さず、全てのマウスは、実験を終結した時から12週間生存した(図18及び図19)。
実施例12:NK分化MP2腫瘍は、hu-BLTマウスの膵臓で目に見える腫瘍を成長させなかった
hu-BLTマウスを生成し(図26B)、脾臓、骨髄、及び末梢血におけるヒト免疫細胞の良好な再構成を確認し(図26C)、末梢血(図26D)及び膵臓(図26E)の異なる免疫サブセットのレベルを決定し、結果を、ヒトドナー由来の末梢血と比較した(図26D)。AJ2処理がある状態で、自己及び同種異系破骨細胞の両方と共に培養された場合、マウスの脾臓から精製されたhu-BLT NK細胞は、IL-2及び抗CD16mAbの処理により提供された活性化シグナルに応答し、大幅に拡大し、IFN-γの分泌の増加を示した(図26F及び図26G)。これは、破骨細胞によるhu-BLT及びヒトドナー由来のNK細胞の拡大及び機能の密接な類似性を示す。従って、NK細胞の出現頻度は、hu-BLTマウスの末梢血では低いが、それらの機能は、ヒトドナーから得られたものと類似している。上述のように、未分化MP2腫瘍(図20A)及びNK上清で分化したもの(図27A)を、hu-BLTマウスの膵臓に移植し、それらの成長動態及びマウスに対する全体的な影響を研究した。MP2腫瘍は急速に成長し、膵臓に腫瘍を形成し、6~7週間以内に、マウスは全て、罹患の徴候を示し、7週目の死亡時には、腹部全体に及ぶ腫瘍を示し、脾臓、胃、及び腸の一部を包囲していた(図20B、パネルa)。NK分化MP2腫瘍をマウスに移植した場合、腫瘍は見られず、マウスは罹患の徴候を示さなかった(図20B、パネルc)。in vitro細胞培養では、患者由来のPL12分化腫瘍と同様のNK分化MP2腫瘍は、未分化MP2腫瘍と比較して、成長が遅かった。膵臓におけるhuCD45+細胞の割合は、対照マウス(7.46%)と比較して、MP2腫瘍を移植されたマウス(3.37%)では、有意に減少した(これらのマウスの腫瘍量の増加を反映する可能性がある)(図27B)が、NK分化MP2腫瘍を移植されたものは、huCD45+細胞の割合の高さ(10.19%)を維持し、さらに、huCD45+細胞内のhuCD3+T細胞の割合は、NK分化MP2腫瘍移植マウス(62%)または対照マウス(45%)のいずれかと比較して、MP2腫瘍移植マウス(80%)では、はるかに高かった(図20C及び図27B)。
hu-BLTマウスを生成し(図26B)、脾臓、骨髄、及び末梢血におけるヒト免疫細胞の良好な再構成を確認し(図26C)、末梢血(図26D)及び膵臓(図26E)の異なる免疫サブセットのレベルを決定し、結果を、ヒトドナー由来の末梢血と比較した(図26D)。AJ2処理がある状態で、自己及び同種異系破骨細胞の両方と共に培養された場合、マウスの脾臓から精製されたhu-BLT NK細胞は、IL-2及び抗CD16mAbの処理により提供された活性化シグナルに応答し、大幅に拡大し、IFN-γの分泌の増加を示した(図26F及び図26G)。これは、破骨細胞によるhu-BLT及びヒトドナー由来のNK細胞の拡大及び機能の密接な類似性を示す。従って、NK細胞の出現頻度は、hu-BLTマウスの末梢血では低いが、それらの機能は、ヒトドナーから得られたものと類似している。上述のように、未分化MP2腫瘍(図20A)及びNK上清で分化したもの(図27A)を、hu-BLTマウスの膵臓に移植し、それらの成長動態及びマウスに対する全体的な影響を研究した。MP2腫瘍は急速に成長し、膵臓に腫瘍を形成し、6~7週間以内に、マウスは全て、罹患の徴候を示し、7週目の死亡時には、腹部全体に及ぶ腫瘍を示し、脾臓、胃、及び腸の一部を包囲していた(図20B、パネルa)。NK分化MP2腫瘍をマウスに移植した場合、腫瘍は見られず、マウスは罹患の徴候を示さなかった(図20B、パネルc)。in vitro細胞培養では、患者由来のPL12分化腫瘍と同様のNK分化MP2腫瘍は、未分化MP2腫瘍と比較して、成長が遅かった。膵臓におけるhuCD45+細胞の割合は、対照マウス(7.46%)と比較して、MP2腫瘍を移植されたマウス(3.37%)では、有意に減少した(これらのマウスの腫瘍量の増加を反映する可能性がある)(図27B)が、NK分化MP2腫瘍を移植されたものは、huCD45+細胞の割合の高さ(10.19%)を維持し、さらに、huCD45+細胞内のhuCD3+T細胞の割合は、NK分化MP2腫瘍移植マウス(62%)または対照マウス(45%)のいずれかと比較して、MP2腫瘍移植マウス(80%)では、はるかに高かった(図20C及び図27B)。
実施例13:NK細胞の単回注射は、MP2腫瘍を移植したマウスにおいて、腫瘍成長を阻害した
MP2腫瘍を移植され且つ1.5×106のスーパーチャージNK細胞(強力な細胞傷害能及びサイトカイン分泌能を有する)を注射されたマウス(図20A)は、腫瘍を示さないか、または著しく小さい腫瘍を示し、他の器官の病変または罹患の徴候はなかった(図20B、パネルb)。腫瘍移植後7週間で腫瘍が急速に成長することにより、担腫瘍マウスの罹患率及び死亡率が増加したので、本発明者らは、膵臓と、膵臓における免疫細胞浸潤の動態を研究できるように、死亡させるまでの時間を腫瘍移植後4~5週間に短縮した。NK注射担腫瘍マウス(9.2%)もしくはNK分化腫瘍移植マウス(10.19%)のいずれかの解離膵臓から調製された単一細胞では、または健常な対照マウス(7.46%)では、担腫瘍マウス(3.37%)由来のものと比較して、より多くのhuCD45+細胞が見られた(図27B)。加えて、MP2移植マウスの膵臓から解離された細胞で、huCD45+CD3+T細胞の割合の増加が見られた(図20C及び図27B)見られたが、NK細胞を投与された担腫瘍マウスの膵臓から、またはNK分化腫瘍を移植されたマウスから、または健常な対照マウスから解離された細胞は、解離膵臓では、担腫瘍マウス由来のものと比較して、割合が比較的低いhuCD45+CD3+T細胞(図20C及び図27B)ならびに割合が高いNK細胞(図20D)を示した。同様に、腫瘍移植なしのNK注射担腫瘍マウスに由来する膵臓または健常な対照マウスの膵臓のいずれかから解離された細胞内のhuCD16+NK細胞では、担腫瘍マウス由来のものと比較して、2倍を超える増加が見られた(図20D)。
MP2腫瘍を移植され且つ1.5×106のスーパーチャージNK細胞(強力な細胞傷害能及びサイトカイン分泌能を有する)を注射されたマウス(図20A)は、腫瘍を示さないか、または著しく小さい腫瘍を示し、他の器官の病変または罹患の徴候はなかった(図20B、パネルb)。腫瘍移植後7週間で腫瘍が急速に成長することにより、担腫瘍マウスの罹患率及び死亡率が増加したので、本発明者らは、膵臓と、膵臓における免疫細胞浸潤の動態を研究できるように、死亡させるまでの時間を腫瘍移植後4~5週間に短縮した。NK注射担腫瘍マウス(9.2%)もしくはNK分化腫瘍移植マウス(10.19%)のいずれかの解離膵臓から調製された単一細胞では、または健常な対照マウス(7.46%)では、担腫瘍マウス(3.37%)由来のものと比較して、より多くのhuCD45+細胞が見られた(図27B)。加えて、MP2移植マウスの膵臓から解離された細胞で、huCD45+CD3+T細胞の割合の増加が見られた(図20C及び図27B)見られたが、NK細胞を投与された担腫瘍マウスの膵臓から、またはNK分化腫瘍を移植されたマウスから、または健常な対照マウスから解離された細胞は、解離膵臓では、担腫瘍マウス由来のものと比較して、割合が比較的低いhuCD45+CD3+T細胞(図20C及び図27B)ならびに割合が高いNK細胞(図20D)を示した。同様に、腫瘍移植なしのNK注射担腫瘍マウスに由来する膵臓または健常な対照マウスの膵臓のいずれかから解離された細胞内のhuCD16+NK細胞では、担腫瘍マウス由来のものと比較して、2倍を超える増加が見られた(図20D)。
担腫瘍マウスとは異なり、腫瘍移植の1~2週間前にマウスにAJ2を給餌し、同種異系または自己のスーパーチャージNK細胞を注射した時(図21A及び図28A;以下を参照)、腫瘍重量は、著しく少ないままであった(図21B)。NK注射マウスまたはNK注射/AJ2給餌マウスでは、2群間で、平均腫瘍重量のわずかな減少を見ることができた場合であっても、腫瘍重量の統計的な有意差を観察することができなかった(図21B)。これは、NK注射のみの担腫瘍マウスにおいて、すでに見られている著しい減少に起因する可能性がある。実際、NK注射またはNK注射/AJ2給餌担腫瘍マウスのいずれかの末梢血由来の血清は、担腫瘍マウスと比較して、それぞれ、2.73倍及び4.8倍のIFN-γを示した(図21C及び図28B)。AJ2の給餌のみ、または腫瘍移植なしのスーパーチャージNK細胞の注射、または腫瘍移植ありのAJ2の給餌、またはスーパーチャージNK細胞の注射とAJ2の給餌は全て、いかなる処理もしない対照マウスと比較して、hu-BLTマウスの血清中のIFN-γのレベルを中程度に増加させた。腫瘍を移植され、AJ2を給餌され、スーパーチャージNK細胞を注射されたマウスと比較して、これらのマウスは、血清中のIFN-γがはるかに少なかった(図28B)。いかなる処理もない状態で腫瘍を移植されたマウスは、血清中のIFN-γの量が最も少なかった(図21C及び図28B)。同様に、NK-分化MP2腫瘍を移植されたマウス(図27A)は、最小の腫瘍重量を有し(図21D)、抗IFN-γ及び抗TNF-α抗体を用いるMP2分化のブロック(図21D及び図28C)により、腫瘍分化の阻害及び腫瘍重量が高い腫瘍の生成がもたらされた(図21D)。
膵臓を取り出して解離させ、NK注入を受けなかった担腫瘍マウス由来の同数の細胞を培養した場合、腫瘍の付着コロニーを24~48時間で見ることができ、その後、それらは、急速に成長したが、同種異系NK細胞または自己NK細胞を注射されたもの(図21E及び図21F)は、最初は、コロニーを示さなかったが、5または6日後にいくつかが見え、それらのコロニーは、非常にゆっくりと成長し、回収された腫瘍の数は、NK注射を受けなかったものと比較して、著しく低いままであった(図21E及び図21F)。同様に、マウスに移植される場合、NK分化腫瘍では、死亡させた後に、膵臓を解離させ、腫瘍は、成長しないか、または後日に極少数のコロニーに成長し、その成長は、非常に遅いままであり(図21E及び図21G)、しかし、抗IFN-γ及び抗TNF-α抗体を用いる分化のブロックにより、24~48時間で腫瘍の付着及び成長が可能になり、成長の動態を増加させた(図21G)。解離及びプレーティング後の腫瘍成長は、NK単独注射マウスと比較して、AJ2を給餌されてNK細胞を注射されたマウスでは少なく、両方とも、MP2腫瘍の移植のみを受けたマウスよりも著しく少なかった(図21F)。腫瘍のみを注射されたマウスと比較して、腫瘍及びNK細胞を注射されたマウスから培養された膵臓には、18~22倍の浸潤huCD45+免疫細胞があった(図21H、図21I、及び図27C)。NK注射担腫瘍マウスの膵臓内で割合が高い浸潤huCD45+免疫細胞は、CD94及びNKG2D表面受容体を発現したが、NK注射なしの担腫瘍マウスと比較して、同様の割合のDNAM表面受容体を発現した(図21H、図27C、及び図27D)。
平均して、膵臓細胞培養物からのIFN-γ分泌の減少は、腫瘍のない対照マウスと比較して、MP2腫瘍を移植されたマウスで観察することができた(図21J)。担腫瘍マウスにNK細胞を注入すると、膵臓細胞培養でIFN-γ分泌が回復され、レベルは、腫瘍のない対照マウスで見られたものを上回った(図21J)。NK分化MP2腫瘍の移植は、膵臓細胞培養においてIFN-γの阻害をもたらさず、量は、腫瘍のない対照マウスから得られた量と同等であった(図21J)。対照的に、IL-6分泌は、担腫瘍マウスからの膵臓細胞培養において最も高く、マウスの全ての他の群で著しく低かった(図21K)。膵臓の腫瘍重量/腫瘍成長に関して、NK単独注射またはNK注射マウスとAJ2給餌マウスの間に、わずかな差異を見ることができたが、平均して、NK注射及びAJ2給餌膵臓細胞培養によるIFN-γの分泌が高かった(図21L)。
NK注射マウスの膵臓から培養されたMP2腫瘍は、NK注射なしの担腫瘍マウスと比較して、B7H1(PD-L1)、MHCクラスI、及びCD54の発現の増加を示した(図21M)。さらに、本発明者らのin vitro実験と同様に、NK注射マウスの膵臓から培養されたMP2腫瘍は、NK細胞媒介性溶解に対する感受性の減少を示したが、NK注射なしの担腫瘍マウスから培養されたものは、感受性の増加を示した(図21N及び図21O)。NK細胞媒介性膵腫瘍の分化中に、IFN-γ及びTNF-αに対する抗体を添加すると、NK細胞媒介性細胞傷害に対する腫瘍の感受性が回復することが判明した(図21O)。本発明者らは、膵臓にNK分化腫瘍を移植した後、十分な腫瘍を回収できなかったので、細胞傷害アッセイを実行できなかった。
実施例14:全ての組織区画内の担腫瘍マウスにおけるNK細胞の細胞傷害性の抑制及びIFN-γの分泌の減少;スーパーチャージNK細胞による回復
膵臓がん患者由来のPBMC(図29A及び図29C)ならびにNK細胞(図29B及び図29D)と類似した担腫瘍マウス由来のPBMC(図22A)は、それぞれ、健常なマウスまたはヒト由来のものと比較して、NK細胞媒介性細胞傷害性が有意に低く、IFN-γ分泌の減少を示した。PBMC(図22A~22C)、脾細胞(図22D及び22F)、脾細胞由来の濃縮NK細胞(図22G及び図22H)、脾細胞由来のhuCD3+T細胞(図22I)、及びBM由来の免疫細胞(図22J~図22L)を、NK細胞傷害性及び/またはIFN-γの分泌について評価した時、担腫瘍マウスは、腫瘍なしの対照マウス、またはNK細胞を注射された担腫瘍マウスから得られたもの、またはNK分化腫瘍を移植されたものと比較して、全ての組織区画から得られた細胞では、細胞傷害性及び/またはIFN-γの分泌がはるかに低かった(図22)。抗IFN-γ及び抗TNF-α抗体による腫瘍のNK分化のブロックは、試験された全ての組織区画の未分化腫瘍から得られたものと同様の大きさのIFN-γ分泌をもたらした(図22C、F、L)。
膵臓がん患者由来のPBMC(図29A及び図29C)ならびにNK細胞(図29B及び図29D)と類似した担腫瘍マウス由来のPBMC(図22A)は、それぞれ、健常なマウスまたはヒト由来のものと比較して、NK細胞媒介性細胞傷害性が有意に低く、IFN-γ分泌の減少を示した。PBMC(図22A~22C)、脾細胞(図22D及び22F)、脾細胞由来の濃縮NK細胞(図22G及び図22H)、脾細胞由来のhuCD3+T細胞(図22I)、及びBM由来の免疫細胞(図22J~図22L)を、NK細胞傷害性及び/またはIFN-γの分泌について評価した時、担腫瘍マウスは、腫瘍なしの対照マウス、またはNK細胞を注射された担腫瘍マウスから得られたもの、またはNK分化腫瘍を移植されたものと比較して、全ての組織区画から得られた細胞では、細胞傷害性及び/またはIFN-γの分泌がはるかに低かった(図22)。抗IFN-γ及び抗TNF-α抗体による腫瘍のNK分化のブロックは、試験された全ての組織区画の未分化腫瘍から得られたものと同様の大きさのIFN-γ分泌をもたらした(図22C、F、L)。
膵腫瘍で見られたものと同様に、hu-BLTマウスの口腔内への口腔幹様腫瘍の移植は、NK注射あり及びNK注射なしで担口腔腫瘍マウスから単離されたPBMCの細胞傷害性ならびにIFN-γの分泌の類似のプロファイルをもたらした。
NK細胞と組み合わせた抗PD1のIV注射は、試験された様々な組織区画でIFN-γの分泌を上昇させた(図30A~30C)。担腫瘍マウスにNK細胞なしの抗PD1抗体注射は、組織においてIFN-γの分泌を増加させた(図30A~30C)。
実施例15:パクリタキセルは、N-アセチルシステイン(NAC)あり/なしで処理されたNK分化MP2腫瘍に細胞死を誘発する
MP2腫瘍とは異なり、高分化PL12及びCapan腫瘍を、パクリタキセルで処理すると(図4)、細胞死の高度の誘導が示された。同様に、MP2腫瘍をNK上清で分化させ、パクリタキセルで処理した場合、細胞死の高度の誘導がMP2腫瘍で観察された(図23)。IFN-γ及びTNF-αに対する抗体を添加することによるNK媒介性分化の阻害は、パクリタキセルにより誘導される細胞死を著しく減少させた(図23)。(図23)に示されるように、MP2、PL12、及びCapanにNACを添加すると、パクリタキセル媒介性細胞死が増加した。同様に、NK上清分化MP2腫瘍にNACを添加すると、細胞死が増加し、IFN-γ及びTNF-αmAbを用いる分化のブロッキングにより、パクリタキセル媒介細胞死(図23)が減少した。NACによる細胞の分化可能性が示され、患者由来の分化した口腔扁平上皮癌細胞(OSCC)またはNK分化OSCSCに、パクリタキセルまたはシスジクロロジアンミン白金(CDDPまたはシスプラチン)を添加すると、高い細胞死も媒介されたが、幹様/低分化OSCSCでは、最小の効果が見られた。
MP2腫瘍とは異なり、高分化PL12及びCapan腫瘍を、パクリタキセルで処理すると(図4)、細胞死の高度の誘導が示された。同様に、MP2腫瘍をNK上清で分化させ、パクリタキセルで処理した場合、細胞死の高度の誘導がMP2腫瘍で観察された(図23)。IFN-γ及びTNF-αに対する抗体を添加することによるNK媒介性分化の阻害は、パクリタキセルにより誘導される細胞死を著しく減少させた(図23)。(図23)に示されるように、MP2、PL12、及びCapanにNACを添加すると、パクリタキセル媒介性細胞死が増加した。同様に、NK上清分化MP2腫瘍にNACを添加すると、細胞死が増加し、IFN-γ及びTNF-αmAbを用いる分化のブロッキングにより、パクリタキセル媒介細胞死(図23)が減少した。NACによる細胞の分化可能性が示され、患者由来の分化した口腔扁平上皮癌細胞(OSCC)またはNK分化OSCSCに、パクリタキセルまたはシスジクロロジアンミン白金(CDDPまたはシスプラチン)を添加すると、高い細胞死も媒介されたが、幹様/低分化OSCSCでは、最小の効果が見られた。
実施例16:NK注射担腫瘍マウスまたはNK分化担腫瘍マウス由来の単球または破骨細胞は、NK細胞を活性化する能力が高かった
NK細胞を注射された担腫瘍マウスまたはNK分化MP2腫瘍を移植されたもの由来の自己単球の存在下で、NK細胞を培養した場合、それらは、IFN-γの分泌の増加を示した(図24A)。同様に、NK細胞を注射されるか、またはNK分化腫瘍を移植された担腫瘍マウスの破骨細胞と共に培養されたNK細胞は、NK注射なしの担腫瘍マウスのものと比較して、NK細胞の拡大及び機能が有意に大きかった(図24B~D)。膵臓がん患者由来の破骨細胞をNK細胞と共に培養した場合、担腫瘍hu-BLTマウスで見られたものと同様の結果も見られた(図31A~C)。がん患者由来の破骨細胞は、健常ドナー由来のものと比較して、NK細胞を拡大させる(図31A)、またはNK細胞媒介性細胞傷害性を増加させる(図31B)、またはIFN-γのNK細胞媒介性分泌を増加させる(図31C)能力が低かった。がん患者及び健常者の破骨細胞における表面受容体の発現を試験する場合、がん患者のOCでは、健常なOCと比較して、MHCクラスI、CD54、KLRG1、KIR2、及びMICA/Bの発現の減少を見ることができた(図31)。
NK細胞を注射された担腫瘍マウスまたはNK分化MP2腫瘍を移植されたもの由来の自己単球の存在下で、NK細胞を培養した場合、それらは、IFN-γの分泌の増加を示した(図24A)。同様に、NK細胞を注射されるか、またはNK分化腫瘍を移植された担腫瘍マウスの破骨細胞と共に培養されたNK細胞は、NK注射なしの担腫瘍マウスのものと比較して、NK細胞の拡大及び機能が有意に大きかった(図24B~D)。膵臓がん患者由来の破骨細胞をNK細胞と共に培養した場合、担腫瘍hu-BLTマウスで見られたものと同様の結果も見られた(図31A~C)。がん患者由来の破骨細胞は、健常ドナー由来のものと比較して、NK細胞を拡大させる(図31A)、またはNK細胞媒介性細胞傷害性を増加させる(図31B)、またはIFN-γのNK細胞媒介性分泌を増加させる(図31C)能力が低かった。がん患者及び健常者の破骨細胞における表面受容体の発現を試験する場合、がん患者のOCでは、健常なOCと比較して、MHCクラスI、CD54、KLRG1、KIR2、及びMICA/Bの発現の減少を見ることができた(図31)。
最後に、NK細胞の上清由来の同量のIFN-γを使用して、OSCSC腫瘍を分化させた場合、膵癌患者のNK細胞由来のものは、健常ドナーのNK細胞由来のものと比較して、OSCSC腫瘍の分化に効果的でなかった(図32)。患者由来のNK上清は、MHCクラスIの発現を中程度に上昇させ(図32)、NK媒介性細胞傷害に対するOSCSC腫瘍のわずか35%の耐性を誘導した(図32)が、健常者由来のNK上清は、MHCクラスIを著しく上昇させ(図32)、NK媒介性細胞傷害に対するOSCSCの78%の耐性を誘導した(図32)。OSCSCを使用する理論的根拠は、これらの細胞がIFN-γ媒介性分化に非常に感受性が高いからである。
NK細胞は、腫瘍溶解及び分化により、CSC/低分化膵腫瘍の成長及び拡大を制限する。MP2腫瘍は、低分化であり、NSG及びhu-BLTマウスで大きな腫瘍を形成し、転移する能力を有するが、NK分化腫瘍または患者由来の高分化腫瘍は、転移可能性のない、膵臓で非常に小さな腫瘍を形成する。実際に、in vitro培養でのMP2腫瘍の成長可能性は、10~15倍であることが判明するが、同数の腫瘍が同じ期間内に培養される場合、NK分化対応物のものは、1.5~4倍であり、未分化のMP2腫瘍またはNK細胞で分化したもののいずれかの培養物でも、細胞死がないか、またはわずかであることを確認することができた。MP2腫瘍と比較して高分化膵腫瘍の成長速度が遅いことも以前に示された。
患者由来のPL12腫瘍またはNK分化腫瘍は、初代NK細胞により殺傷されないが、化学療法薬に感受性があり、パクリタキセル(図4及び図23)ならびにCDDPで殺傷されるが、低分化腫瘍は、耐性であった。実際に、MP2腫瘍のNK分化を、IFN-γ/TNF-α抗体の組み合わせにより阻害した場合、腫瘍は、化学療法に対する感受性を喪失し、NK細胞媒介性細胞傷害の影響を受けやすくなった。さらに、他の効果に加えて細胞を分化させることが知られるNACは、NK分化MP2及び高分化腫瘍のパクリタキセル媒介性死を増加させた(図4及び図23)。
自己及び同種破骨細胞の両方が、わずかに高いNK拡大可能性及び高レベルのIFN-γ分泌を有するhu-BLT破骨細胞で、hu-BLT NK細胞を拡大させることができた(図26E及び26F)。自己破骨細胞により拡大され、増加したレベルのIFN-γを分泌し、向上させた細胞傷害を媒介すべきhu-BLT及びヒトNK細胞間のNK応答の類似性は、部分的に、本動物モデルをヒト疾患の研究の代理モデルとして使用する根拠を提供する。さらに、担腫瘍hu-BLT及びがん患者のNK細胞の両方に同様の欠陥が見られた。
NK分化MP2腫瘍は、hu-BLTマウスでは成長せず、腫瘍分化がIFN-γ及びTNF-αに対する抗体を使用して阻止された場合、腫瘍は、著しく成長した(図21G)。対照的に、IL-6またはIL-8を抗体でブロックしても、NK細胞による腫瘍の分化に影響を与えることはできなかった。AJ2給餌ありまたはAJ2給餌なしの、スーパーチャージNK細胞による免疫療法は、hu-BLTマウスの腫瘍成長の有意な阻害をもたらした。AJ2を給餌するための理論的根拠は、本発明者らの研究室及び他のものからの最近の研究が、プロバイオティック細菌によりNK細胞機能に有意な増加を示したので、in vivoでNK細胞活性化を維持し、増加することであった。
腫瘍は、NK細胞を注射された担腫瘍マウスにおいて徐々に成長し、それらは、分化表現型のものであるが、NK注射なしのものは、急速に成長し、未分化のままであった。さらに、NK注射担腫瘍hu-BLTマウスから培養された腫瘍は、約18~22倍のhuCD45+免疫細胞を含有し、低いIL-6分泌ありの高いIFN-γを分泌したが、NK注射のない担腫瘍マウスから培養されたものは、非常に高いIL-6分泌がある状態で、浸潤huCD45+細胞が少なく、少ないIFN-γを分泌した。担腫瘍マウスのものと比較して、AJ2を給餌され且つNK細胞を注射された担腫瘍マウス由来の試験された、腫瘍組織だけでなく、全ての組織においても、IFN-γの分泌の増加が観察された。IL-6分泌の増加は、担腫瘍マウスの腫瘍の成長に起因する可能性がある。
担腫瘍マウスへのスーパーチャージNK細胞の単回注射は、腫瘍成長の減少及びNK細胞媒介性細胞傷害に対する腫瘍細胞の感受性の喪失(図21L~図21O)を示す腫瘍細胞でのPD-L1、CD54、及びMHCクラスIの表面受容体発現の増加をもたらした。これは、MHCクラスI発現の増加による細胞傷害性Tリンパ球(CTL)媒介性殺傷に対する感受性の増加に道を開く可能性がある。担腫瘍マウスの膵臓におけるNK細胞の減少のあるT細胞の割合の増加は、これらの腫瘍がT細胞により排除されないので、未分化腫瘍の良好な除去に問題となる可能性がある。
悪性腫瘍は、腫瘍微小環境内のNK細胞の機能に影響を与えることができる唯一の細胞ではないことを強調すべきである。NK細胞が腫瘍の分化を引き起こす機能を増加させるか、または早期もしくは末期がんに応じて、それぞれ幹様/未分化腫瘍の生存及び拡大をもたらす機能を減少させ得る、膵腫瘍微小環境内に、腫瘍関連線維芽細胞、脂肪細胞、及び他の免疫エフェクターなどの間質細胞を含む他の多くの細胞がある。加えて、がんの末期で、制御性T細胞及びMDSCなどの多くの阻害性エフェクター細胞が蓄積し、それ故、がん幹細胞の生存及び拡大をもたらすNK細胞の機能を阻害することができる。実際に、有能なNK細胞は、多くの異なる骨髄由来の免疫エフェクターを溶解できるので、MDSCを標的にして溶解できるはずである。
循環に抑制可溶性因子を放出することに加えて、腫瘍は、様々なサイズの小胞、例えば、腫瘍タンパク質、mRNA、及びマイクロRNAを含有する30~100nmのエキソソームの小さなエンドソーム由来の細胞外微小胞、ならびに0.1~1μmの微粒子の被包細胞質ゾル内容物を含有する大きいサイズの小胞を放出することによりNK細胞の機能も抑制し得る。従って、腫瘍は、腫瘍微小環境内で局所的に、末梢血及び健常組織内で遠隔的に、がん患者のNK細胞の機能を大きく阻害し、患者のNK細胞の不可逆的な損傷がもたらされ得る。
がん患者の単球及び破骨細胞と同様に、担腫瘍マウス由来のものは、自己または同種異系のNK細胞を拡大するか、またはそれらの機能的可能性を増加させる能力がはるかに低かった。NK及び単球の両方が、担腫瘍マウス由来のものである場合、NK細胞及び単球の両方の欠陥の組み合わせに起因して、NK細胞の拡大及び機能のより重度の阻害が見られる。これらの実験は、担腫瘍hu-BLTマウスモデル及びヒトがん間の類似性を強調するだけでなく、がん患者と類似した担腫瘍hu-BLTマウスにおけるNK細胞活性化エフェクターの重度の機能欠損も示している。hu-BLTマウス由来のNK細胞の最も高い活性化は、NK分化腫瘍の移植により達成されたことに留意することも重要であり、これは、腫瘍の最適な分化が実際に、インタクト単球/破骨細胞機能を促進及び維持し得ることを示唆する。
患者の破骨細胞によるNK細胞機能の阻害を支配する根本的な機序を理解するために、本明細書では、健常ドナーの破骨細胞と比較した、がん患者由来の破骨細胞の表面発現を決定した。阻害性MHCクラスI発現が下方制御されるだけでなく、CD54、KLRG1、及びMICA/B表面受容体発現の活性化も減少する(図31)ことを知見は示した。これは、NKリガンド発現の全体的な減少を示す。活性化リガンドの喪失は、明らかに、NK細胞の活性化が減少する理由である可能性があるが、阻害性受容体の喪失は、より複雑な事態をもたらす。活性化及び阻害性NK細胞リガンドの両方の発現の喪失は、NK細胞の機能の喪失及び膵腫瘍の生成と相関する膵臓KRAS変異を有するKCマウス由来の破骨細胞でも見られた。
患者のNK細胞の上清は、腫瘍を分化させる能力が低かったが、これは、患者のNK細胞の分泌されたIFN-γの機能も大幅に損なわれることを示す。従って、患者における膵腫瘍誘導及び進行は、NK拡大の欠陥、NK細胞媒介性細胞傷害性の減少及びIFN-γの分泌の低下、ならびに分泌IFN-γが腫瘍を分化させる能力の著しい低下の組み合わせに起因するだけでなく、NK細胞の拡大及び機能を支援する免疫細胞の他のサブセットの欠陥にも起因する。
本明細書で提示された研究は、AJ2経口補充ありのスーパーチャージNK細胞による免疫療法は、低分化/幹様膵腫瘍の成長可能性を遅延または抑制することだけでなく、CD8+T細胞を拡大及び活性化することによっても、がん患者の免疫機能を回復させることを示す。これにより、NK拡大CD8+T細胞が、NK分化腫瘍を標的とすることが可能になるだけでなく、より重要なことには、それらが、分化腫瘍のプールに加わる。その理由は、NK拡大CD8+T細胞が、活性化の際に、IFN-γ及びTNF-αも産生し得るからである。NK及びCD8+T細胞分化腫瘍は、放射線療法及び/または化学療法方策の標的とすることもできる。
転移性腫瘍の標的化におけるNK細胞の役割は長い間推測されているが、そのような腫瘍のクリアランスの根底にある機序は、明確に説明されていない。以前の研究は、NK細胞の殺傷能力に焦点を当てている。しかし、本明細書で提示された研究は、NK細胞による腫瘍の溶解及び分化の両方が、NK細胞が腫瘍の誘導及び進行を防ぐことができる重要な機序であることを示す。
転移性腫瘍の標的化におけるNK細胞の役割は長い間推測されているが、そのような腫瘍のクリアランスの根底にある機序は、明確に説明されていない。以前の研究は、NK細胞の殺傷能力に焦点を当てている。しかし、本明細書で提示された研究は、NK細胞による腫瘍の溶解及び分化の両方が、NK細胞が腫瘍の誘導及び進行を防ぐことができる重要な機序であることを示す。
本明細書に提示された研究は、インタクトな免疫系が腫瘍の排除に必要であることを示した。しかし、腫瘍は、免疫抑制、特に、NK抑制を引き起こすことが示されており、この欠陥は、NK細胞で多くのレベルで生じる。がん患者及び腫瘍を移植されたヒト化マウスの両方に由来するNK細胞は、腫瘍を殺傷して分化させる能力を喪失する。腫瘍の溶解及び分化の増加を通じて、NK細胞が腫瘍成長を抑制することができないことは、重大な介入が必要となる深刻な欠陥である。そのような介入は、本発明者らが、低分化膵腫瘍を移植されたhu-BLTマウスで見ているように、スーパーチャージNK細胞の投与によるものであり得る。
実施例17:NK細胞の細胞傷害性とMP2及びPL-12膵腫瘍の分化ステージとの間の相関、ならびに分化及びNK細胞媒介性細胞傷害に対するMP2細胞の耐性の誘導におけるrhTNF-α及びrhIFN-γの役割
本明細書に示されるように、腫瘍の分化ステージは、膵腫瘍におけるNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性と相関していた。NK細胞媒介性細胞傷害に対する最も高い感受性は、未分化MP2腫瘍で見られたが、高分化PL-12腫瘍は、NK媒介性溶解に対して最も低い感受性を示した(図25A)。幹様/未分化MP2及び高分化Capan膵腫瘍細胞を、rhTNF-α及びrhIFN-γで処理し、NK細胞媒介性溶解に対するそれらの感受性を、標準的な4時間の51Cr放出アッセイで評価した。図25Bに示されるように、rhTNF-α及びrhIFN-γの組み合わせは、MP-2腫瘍において、CD54、MHC-1、及びB7H1を上方制御し、CD44を下方調節することができた。rhTNF-α及びrhIFN-γの両方は、CD54及びMHCクラスIの表面発現を増加させることができたが、rhIFN-γのみが、B7H1を上方制御することができた(図25B)。MP2へのrhTNF-αの添加は、NK細胞媒介性細胞傷害に対して中程度の耐性を誘導することができたが、rhIFN-γは、著しい耐性を誘導した(図25C)。予想された通り、NK細胞によるCapan腫瘍の溶解は少なく、rhIFN-γ及びrhTNF-αで処理すると、これらの細胞に中程度の耐性が誘導された(図25C)。
本明細書に示されるように、腫瘍の分化ステージは、膵腫瘍におけるNK細胞媒介性細胞傷害に対する感受性と相関していた。NK細胞媒介性細胞傷害に対する最も高い感受性は、未分化MP2腫瘍で見られたが、高分化PL-12腫瘍は、NK媒介性溶解に対して最も低い感受性を示した(図25A)。幹様/未分化MP2及び高分化Capan膵腫瘍細胞を、rhTNF-α及びrhIFN-γで処理し、NK細胞媒介性溶解に対するそれらの感受性を、標準的な4時間の51Cr放出アッセイで評価した。図25Bに示されるように、rhTNF-α及びrhIFN-γの組み合わせは、MP-2腫瘍において、CD54、MHC-1、及びB7H1を上方制御し、CD44を下方調節することができた。rhTNF-α及びrhIFN-γの両方は、CD54及びMHCクラスIの表面発現を増加させることができたが、rhIFN-γのみが、B7H1を上方制御することができた(図25B)。MP2へのrhTNF-αの添加は、NK細胞媒介性細胞傷害に対して中程度の耐性を誘導することができたが、rhIFN-γは、著しい耐性を誘導した(図25C)。予想された通り、NK細胞によるCapan腫瘍の溶解は少なく、rhIFN-γ及びrhTNF-αで処理すると、これらの細胞に中程度の耐性が誘導された(図25C)。
実施例18:hu-BLTマウスにおける、ヒト免疫系の再構成及びヒトと比較した、hu-BLTマウスにおけるNK細胞の出現頻度の減少
ヒト免疫系で再構成されたhu-BLTマウスは、異なる組織区画においてCD45+免疫細胞による90%を超える再構成を示した(図26A~図26B)。ドナー間の末梢血NK細胞において幅広い出現頻度を見ることができるヒトと同様に、異なるドナー免疫細胞で再構成されたhu-BLTマウスの末梢血に様々な割合のNK細胞も存在する。従来試験されたhu-BLTマウスの数に基づいて、hu-BLTマウスの末梢血中のNK細胞の割合は、ヒトドナーの末梢血と比較して、平均して低い(図26C)。末梢血中に、ヒト及びhu-BLTマウス間で同様の割合のT細胞サブセットが見出された(図26C)。
ヒト免疫系で再構成されたhu-BLTマウスは、異なる組織区画においてCD45+免疫細胞による90%を超える再構成を示した(図26A~図26B)。ドナー間の末梢血NK細胞において幅広い出現頻度を見ることができるヒトと同様に、異なるドナー免疫細胞で再構成されたhu-BLTマウスの末梢血に様々な割合のNK細胞も存在する。従来試験されたhu-BLTマウスの数に基づいて、hu-BLTマウスの末梢血中のNK細胞の割合は、ヒトドナーの末梢血と比較して、平均して低い(図26C)。末梢血中に、ヒト及びhu-BLTマウス間で同様の割合のT細胞サブセットが見出された(図26C)。
実施例19:膵臓の免疫サブセットの出現頻度
膵臓の浸潤ヒト免疫細胞の大部分は、CD3+T(54%)及びB細胞(43.3%)であり、CD8+T細胞は、CD4+T細胞(約20%)よりも、T細胞の大部分(約80%)を構成している(図26D)。NK及びCD14+細胞は、健常hu-BLTマウスの膵臓における免疫細胞のマイナーな亜集団を構成していた(図26D)。
膵臓の浸潤ヒト免疫細胞の大部分は、CD3+T(54%)及びB細胞(43.3%)であり、CD8+T細胞は、CD4+T細胞(約20%)よりも、T細胞の大部分(約80%)を構成している(図26D)。NK及びCD14+細胞は、健常hu-BLTマウスの膵臓における免疫細胞のマイナーな亜集団を構成していた(図26D)。
実施例20:実施例21~28の材料及び方法
細胞株、試薬、及び抗体
UCLAで、口腔扁平上皮癌幹細胞(OSCSC)を舌腫瘍患者から分離した。10%のウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Product,CA,USA)が補充されたRPMI1640(LifeTechnologies,CA,USA)で、OSCSCを培養した。10%のFBSが補充されたRPMI1640を使用して、ヒトNK細胞、ヒトT細胞、及びhu-BLTマウスBM、脾臓、及びPBMCを培養した。破骨細胞(OC)及び樹状細胞(DC)の培養に、10%のFBSが補充されたアルファMEM(Life Technologies,CA,USA)を使用した。M-CSF、抗CD16mAb、及びフローサイトメトリー抗体を、Biolegend(CA,USA)から購入した。RANKL、GM-CSF、及びIL-4を、PeproTech(NJ,USA)から購入し、組み換えヒトIL-2を、Hoffman La Roche(NJ,USA)から入手した。ヒト抗CD3/CD28を、Stem Cell Technologies(Vancouver,Canada)から購入した。プロバイオティクス細菌AJ2は、グラム陽性プロバイオティクス細菌の8つの異なる株(Streptococcus thermophiles、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、及びLactobacillus bulgaricus)の組み合わせであり、NK細胞における炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインの両方の最適の分泌を誘導する優れた能力について選択した。10%のFBSが補充されたRPMI1640を使用して、AJ2を再懸濁した。IFN-γ用のヒトELISAキットを、Biolegend(San Diego,CA)から購入した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)及びウシ血清アルブミン(BSA)を、Life Technologies(CA,USA)から購入した。マトリゲルを、Corning(NY,USA)から購入した。
細胞株、試薬、及び抗体
UCLAで、口腔扁平上皮癌幹細胞(OSCSC)を舌腫瘍患者から分離した。10%のウシ胎児血清(FBS)(Gemini Bio-Product,CA,USA)が補充されたRPMI1640(LifeTechnologies,CA,USA)で、OSCSCを培養した。10%のFBSが補充されたRPMI1640を使用して、ヒトNK細胞、ヒトT細胞、及びhu-BLTマウスBM、脾臓、及びPBMCを培養した。破骨細胞(OC)及び樹状細胞(DC)の培養に、10%のFBSが補充されたアルファMEM(Life Technologies,CA,USA)を使用した。M-CSF、抗CD16mAb、及びフローサイトメトリー抗体を、Biolegend(CA,USA)から購入した。RANKL、GM-CSF、及びIL-4を、PeproTech(NJ,USA)から購入し、組み換えヒトIL-2を、Hoffman La Roche(NJ,USA)から入手した。ヒト抗CD3/CD28を、Stem Cell Technologies(Vancouver,Canada)から購入した。プロバイオティクス細菌AJ2は、グラム陽性プロバイオティクス細菌の8つの異なる株(Streptococcus thermophiles、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、及びLactobacillus bulgaricus)の組み合わせであり、NK細胞における炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインの両方の最適の分泌を誘導する優れた能力について選択した。10%のFBSが補充されたRPMI1640を使用して、AJ2を再懸濁した。IFN-γ用のヒトELISAキットを、Biolegend(San Diego,CA)から購入した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)及びウシ血清アルブミン(BSA)を、Life Technologies(CA,USA)から購入した。マトリゲルを、Corning(NY,USA)から購入した。
ヒトNK細胞、T細胞、及び単球の精製
UCLA Institutional Review Board(IRB)により承認された書面によるインフォームドコンセントは、健常ドナー及びがん患者から得られ(表1)、全ての手順は、UCLA-IRBにより承認された。末梢血単核細胞(PBMC)を、上述のように末梢血から分離した。簡潔には、PBMCをフィコール・ハイパック遠心分離後に得、これを用いて、EasySep(登録商標)ヒトNK細胞、EasySep(登録商標)ヒトT細胞、EasySep(登録商標)ヒトCD4T、及びEasySep(登録商標)ヒトCD8T細胞、EasySep(登録商標)ヒト単球濃縮キット(それぞれ、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から購入)を使用して、NK細胞、T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及び単球から単離した。単離NK細胞、T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及び単球を、それぞれ、抗CD16、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD14抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定した。
UCLA Institutional Review Board(IRB)により承認された書面によるインフォームドコンセントは、健常ドナー及びがん患者から得られ(表1)、全ての手順は、UCLA-IRBにより承認された。末梢血単核細胞(PBMC)を、上述のように末梢血から分離した。簡潔には、PBMCをフィコール・ハイパック遠心分離後に得、これを用いて、EasySep(登録商標)ヒトNK細胞、EasySep(登録商標)ヒトT細胞、EasySep(登録商標)ヒトCD4T、及びEasySep(登録商標)ヒトCD8T細胞、EasySep(登録商標)ヒト単球濃縮キット(それぞれ、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)から購入)を使用して、NK細胞、T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及び単球から単離した。単離NK細胞、T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及び単球を、それぞれ、抗CD16、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD14抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して、細胞純度を測定した。
ヒトOC及びDCの生成
OCを生成するために、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)が補充されたアルファMEM培地で、単球を21日間培養し、培地を3日毎に補充した。GM-CSF(150ng/mL)及びIL-4(50ng/mL)が補充されたアルファMEM培地で、単球を7日間培養して、DCを生成した。
OCを生成するために、M-CSF(25ng/mL)及びRANKL(25ng/mL)が補充されたアルファMEM培地で、単球を21日間培養し、培地を3日毎に補充した。GM-CSF(150ng/mL)及びIL-4(50ng/mL)が補充されたアルファMEM培地で、単球を7日間培養して、DCを生成した。
プロバイオティクス細菌(AJ2)の超音波処理
AJ2細菌を計量し、10mg/mlの濃度で、10%のFBSを含有するRPMI1640培地に再懸濁した。細菌を完全にボルテックスし、次に、氷上で6~8の振幅で15秒間超音波処理し、次に、超音波処理試料を氷上で30秒間インキュベートし、サイクルを、5ラウンド繰り返した。超音波処理を5ラウンド行う毎に、本発明者らは、細菌壁の少なくとも80%が溶解するまで、顕微鏡で各試料をチェックした。完全な超音波処理を達成するために、氷上で約20ラウンドの超音波処理/インキュベーションが必要であると決定した。最後に、超音波処理AJ2(sAJ2)を分注し、使用するまで-80℃で保存した。
AJ2細菌を計量し、10mg/mlの濃度で、10%のFBSを含有するRPMI1640培地に再懸濁した。細菌を完全にボルテックスし、次に、氷上で6~8の振幅で15秒間超音波処理し、次に、超音波処理試料を氷上で30秒間インキュベートし、サイクルを、5ラウンド繰り返した。超音波処理を5ラウンド行う毎に、本発明者らは、細菌壁の少なくとも80%が溶解するまで、顕微鏡で各試料をチェックした。完全な超音波処理を達成するために、氷上で約20ラウンドの超音波処理/インキュベーションが必要であると決定した。最後に、超音波処理AJ2(sAJ2)を分注し、使用するまで-80℃で保存した。
ヒトNK細胞及びヒトT細胞の拡大
ヒト精製NK細胞を、rh-IL-2(1000U/ml)及び抗CD16mAb(3μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、10%のFBSを含有するRPMI1640培地で、フィーダー細胞(OCまたはDC)及びsAJ2(OC:NK:sAJ2またはDC:NK:sAJ2;1:2:4)と共培養した。rh-IL-2(1500U/ml)を含有するRPMIで、3日毎に培地をリフレッシュした。精製ヒトT細胞をrh-IL-2(100U/ml)及び抗CD3(1μg/ml)/抗CD28(3μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、10%のFBSを含有するRPMI1640培地で、OCまたはDC及びsAJ2(OC:T:sAJ2またはDC:T:sAJ2;1:2:4)と共培養した。3日毎に、rh-IL-2(150U/ml)で、培地をリフレッシュした。
ヒト精製NK細胞を、rh-IL-2(1000U/ml)及び抗CD16mAb(3μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、10%のFBSを含有するRPMI1640培地で、フィーダー細胞(OCまたはDC)及びsAJ2(OC:NK:sAJ2またはDC:NK:sAJ2;1:2:4)と共培養した。rh-IL-2(1500U/ml)を含有するRPMIで、3日毎に培地をリフレッシュした。精製ヒトT細胞をrh-IL-2(100U/ml)及び抗CD3(1μg/ml)/抗CD28(3μg/ml)で18~20時間活性化した後、それらを、10%のFBSを含有するRPMI1640培地で、OCまたはDC及びsAJ2(OC:T:sAJ2またはDC:T:sAJ2;1:2:4)と共培養した。3日毎に、rh-IL-2(150U/ml)で、培地をリフレッシュした。
酵素結合免疫測定法(ELISA)及びマルチプレックスサイトカインアッセイ
上述のように、単一ELISA及びマルチプレックスアッセイを実施した。サイトカイン及びケモカインの濃度を分析して取得するために、製造者が提供する組み換えサイトカインを2倍または3倍に希釈することにより、検量線を作成した。マルチプレックスアレイの場合、サイトカイン及びケモカインのレベルをマルチプレックスアッセイで実験し、各特定のキットの製造者のプロトコールに記載されるように、これを実施した。Luminexマルチプレックス機器(MAGPIX、Millipore,Billerica,MA)を使用して、分析を実施し、プロプライエタリソフトウェア(xPONENT 4.2、Millipore,Billerica,MA)を使用して、データを分析した。
上述のように、単一ELISA及びマルチプレックスアッセイを実施した。サイトカイン及びケモカインの濃度を分析して取得するために、製造者が提供する組み換えサイトカインを2倍または3倍に希釈することにより、検量線を作成した。マルチプレックスアレイの場合、サイトカイン及びケモカインのレベルをマルチプレックスアッセイで実験し、各特定のキットの製造者のプロトコールに記載されるように、これを実施した。Luminexマルチプレックス機器(MAGPIX、Millipore,Billerica,MA)を使用して、分析を実施し、プロプライエタリソフトウェア(xPONENT 4.2、Millipore,Billerica,MA)を使用して、データを分析した。
51Cr放出細胞傷害アッセイ
上述のように、51Cr放出アッセイを実施した。要約すると、異なる数のエフェクター細胞を、51Cr標識標的細胞とインキュベートした。4時間のインキュベーション期間の後、上清を各試料から採取し、ガンマカウンターを使用して、放出された放射能をカウントした。以下の通り、特異的細胞傷害の割合を計算した:
腫瘍標的細胞×100の30%を溶解させるために必要なエフェクター細胞の数の逆数を使用して、LU30/106を計算する。
上述のように、51Cr放出アッセイを実施した。要約すると、異なる数のエフェクター細胞を、51Cr標識標的細胞とインキュベートした。4時間のインキュベーション期間の後、上清を各試料から採取し、ガンマカウンターを使用して、放出された放射能をカウントした。以下の通り、特異的細胞傷害の割合を計算した:
表面染色アッセイ
表面染色のために、氷冷PBS+1%のBSAを使用して、細胞を2回洗浄した。特定のヒトモノクローナル抗体の所定の最適濃度を、冷PBS+1%BSA 50μl中の1×104細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を冷PBS+1%のBSA中で洗浄し、PBS+1%のBSAで500μlにした。Beckman Coulter Epics XLサイトメーター(Brea,CA)を使用して、サイトメトリー分析を実施し、結果を、FlowJo vXソフトウェア(Ashland,OR)で分析した。
表面染色のために、氷冷PBS+1%のBSAを使用して、細胞を2回洗浄した。特定のヒトモノクローナル抗体の所定の最適濃度を、冷PBS+1%BSA 50μl中の1×104細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を冷PBS+1%のBSA中で洗浄し、PBS+1%のBSAで500μlにした。Beckman Coulter Epics XLサイトメーター(Brea,CA)を使用して、サイトメトリー分析を実施し、結果を、FlowJo vXソフトウェア(Ashland,OR)で分析した。
hu-BLTマウスへの腫瘍移植
全ての連邦、州、及び地方のガイドラインに従って、UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した。複合免疫不全NOD.CB17-Prkdcscid/J及びNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(T、B、及びNK細胞を欠くNSG)を、Jackson Laboratoryから購入した。上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスをNSGバックグラウンドで調製した。同所性腫瘍を確立するために、まず、マウスを、酸素と組み合わせてイソフルランで麻酔し、次に、HCマトリゲル 10μl中に懸濁した1×106のヒトOSCSC腫瘍細胞を口腔底に直接注入した。腫瘍移植の1~2週間後、マウスは、尾静脈注射により1.5×106のOC拡大NK細胞を投与された(図14A)。4~5後、罹患の徴候が明らかになった時、マウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、及び末梢血を採取した。
全ての連邦、州、及び地方のガイドラインに従って、UCLA Animal Research Committee(ARC)の書面による承認の下で、動物研究を実施した。複合免疫不全NOD.CB17-Prkdcscid/J及びNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(T、B、及びNK細胞を欠くNSG)を、Jackson Laboratoryから購入した。上述のように、ヒト化BLT(hu-BLT;ヒト骨髄/肝臓/胸腺)マウスをNSGバックグラウンドで調製した。同所性腫瘍を確立するために、まず、マウスを、酸素と組み合わせてイソフルランで麻酔し、次に、HCマトリゲル 10μl中に懸濁した1×106のヒトOSCSC腫瘍細胞を口腔底に直接注入した。腫瘍移植の1~2週間後、マウスは、尾静脈注射により1.5×106のOC拡大NK細胞を投与された(図14A)。4~5後、罹患の徴候が明らかになった時、マウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、及び末梢血を採取した。
hu-BLTマウスのBM、脾臓、及び末梢血の細胞単離及び細胞培養
BMから単一細胞懸濁液を得るために、大腿骨を両端で切断し、RPMI1640培地を使用してフラッシュし;その後、BM細胞を40μmのセルストレーナーで濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を得るために、脾臓を細切し、試料を40μmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に2~5分間再懸濁させて、赤血球を除去し、RPMI培地に再懸濁し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ヘパリン加血検体のフィコール・ハイパック遠心分離を使用して、PBMCを末梢血から分離した。PBMCを含有する軟膜を採取し、洗浄し、RPMI1640培地に再懸濁した。各組織試料から得られた細胞を、IL-2(1000U/ml)で処理し、10%のFBSを含有するRPMI1640培地で7日間培養した。
BMから単一細胞懸濁液を得るために、大腿骨を両端で切断し、RPMI1640培地を使用してフラッシュし;その後、BM細胞を40μmのセルストレーナーで濾過した。脾臓から単一細胞懸濁液を得るために、脾臓を細切し、試料を40μmのセルストレーナーに通して濾過し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ペレットをACK緩衝液に2~5分間再懸濁させて、赤血球を除去し、RPMI培地に再懸濁し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離した。ヘパリン加血検体のフィコール・ハイパック遠心分離を使用して、PBMCを末梢血から分離した。PBMCを含有する軟膜を採取し、洗浄し、RPMI1640培地に再懸濁した。各組織試料から得られた細胞を、IL-2(1000U/ml)で処理し、10%のFBSを含有するRPMI1640培地で7日間培養した。
標的細胞可視化アッセイ(TVA)
標的細胞をTVA(商標)色素と共に、37℃で15分間インキュベートし、次に、エフェクター細胞と共に4時間培養した。その後、525nmの発光波長でImmunoSpot(登録商標)S6ユニバーサルアナライザー/ソフトウェア(Cellular Technology Limited,OH,USA)を使用して、標的細胞を計数した。以下の通り、特異的細胞傷害の割合を計算した:
腫瘍標的細胞×100の30%を溶解させるために必要なエフェクター細胞の数の逆数を使用して、LU30/107を計算する。
標的細胞をTVA(商標)色素と共に、37℃で15分間インキュベートし、次に、エフェクター細胞と共に4時間培養した。その後、525nmの発光波長でImmunoSpot(登録商標)S6ユニバーサルアナライザー/ソフトウェア(Cellular Technology Limited,OH,USA)を使用して、標的細胞を計数した。以下の通り、特異的細胞傷害の割合を計算した:
統計分析
GraphPad Prism-8ソフトウェアを使用して、全ての統計分析を実施した。2群を用いる実験の統計分析のために、対応のないまたは対応のある両側スチューデントのt検定を実施した。ボンフェローニ事後検定を用いる一元ANOVAを使用して、異なる群を3つ以上の群を用いる実験について比較した。(n)は、各実験条件について、ヒトドナーまたはマウスの数を示す。評価のためのin vitro研究で、2重または3重の試料を使用した。以下の記号は、各分析内の統計的有意性のレベルを表す。***(p値<0.001)、**(p値0.001~0.01)、*(p値0.01~0.05)。
GraphPad Prism-8ソフトウェアを使用して、全ての統計分析を実施した。2群を用いる実験の統計分析のために、対応のないまたは対応のある両側スチューデントのt検定を実施した。ボンフェローニ事後検定を用いる一元ANOVAを使用して、異なる群を3つ以上の群を用いる実験について比較した。(n)は、各実験条件について、ヒトドナーまたはマウスの数を示す。評価のためのin vitro研究で、2重または3重の試料を使用した。以下の記号は、各分析内の統計的有意性のレベルを表す。***(p値<0.001)、**(p値0.001~0.01)、*(p値0.01~0.05)。
実施例21:がん患者におけるNK細胞による、数の減少ならびに細胞傷害性及びIFN-γの分泌の抑制
PBMCの数は、同量の血液を使用してPBMCを分離した時、健常者と比較して、がん患者の末梢血中で有意に少なくなった(図11A)。健常者と比較して、がん患者のPBMC内で、割合が高いCD16+CD56+、CD14+、及びCD11b+、ならびに割合が低いCD3+及びCD19+細胞を得た(図11B)。がん患者のNK細胞は、有意に低い量のIFN-γを分泌し(図11C及び11E)、より低い細胞傷害を媒介した(図11D)。IFN-γに加えて、がん患者のNK細胞は、有意に低いレベルの他のサイトカインも分泌した(図11E)。サイトカインのレベルの減少は、健常者のものと比較して、がん患者の血清中でも見られた(図11F)。これらの結果は、がん患者の末梢血は、健常者のものと比較して、少ないPBMCを含有し、NK細胞機能が著しく低いNK細胞の割合が高いことを示した。
PBMCの数は、同量の血液を使用してPBMCを分離した時、健常者と比較して、がん患者の末梢血中で有意に少なくなった(図11A)。健常者と比較して、がん患者のPBMC内で、割合が高いCD16+CD56+、CD14+、及びCD11b+、ならびに割合が低いCD3+及びCD19+細胞を得た(図11B)。がん患者のNK細胞は、有意に低い量のIFN-γを分泌し(図11C及び11E)、より低い細胞傷害を媒介した(図11D)。IFN-γに加えて、がん患者のNK細胞は、有意に低いレベルの他のサイトカインも分泌した(図11E)。サイトカインのレベルの減少は、健常者のものと比較して、がん患者の血清中でも見られた(図11F)。これらの結果は、がん患者の末梢血は、健常者のものと比較して、少ないPBMCを含有し、NK細胞機能が著しく低いNK細胞の割合が高いことを示した。
実施例22:同種異系OC媒介性拡大、及びがん患者由来のNK細胞の増強された機能は、健常者のものと比較して、大幅に抑制される
NK細胞及びT細胞の拡大及び機能の程度を決定するために、本発明者らは、がん患者及び健常者のNK細胞及びT細胞を拡大させた。がん患者のNK細胞は、健常者のものと比較して、有意に減少した拡大レベルを示し(図12A及び34E)、拡大NK細胞は、有意に低い細胞傷害性(図12B及び34F)、ならびにIFN-γ分泌(図12C、12D、42、及び34G)を示した。がん患者のT細胞は、拡大速度(図33A及び40A)ならびにIFN-γ分泌(図33B~33C及び40B~40E)の同様の減少を示した。
NK細胞及びT細胞の拡大及び機能の程度を決定するために、本発明者らは、がん患者及び健常者のNK細胞及びT細胞を拡大させた。がん患者のNK細胞は、健常者のものと比較して、有意に減少した拡大レベルを示し(図12A及び34E)、拡大NK細胞は、有意に低い細胞傷害性(図12B及び34F)、ならびにIFN-γ分泌(図12C、12D、42、及び34G)を示した。がん患者のT細胞は、拡大速度(図33A及び40A)ならびにIFN-γ分泌(図33B~33C及び40B~40E)の同様の減少を示した。
NK細胞及びT細胞が、明確な拡大プロファイルを示すかどうかを評価するために、本発明者らは、OCの存在下及び非存在下で健常者のNK細胞及びT細胞を培養し、OCの非存在下でT細胞がNK細胞よりも速く拡大したことが判明した(図33D及び40F)。しかし、OCは、OCの非存在下で培養されたものと比較して、NK細胞及びT細胞において、それぞれ、2.6~4.5倍及び1.2~1.6倍の拡大を誘導した(図33D及び40F)。これらの結果は、OCが、T細胞と比較して、NK細胞のより高い拡大を誘導することを示した。T細胞は、OCの非存在下で有意に高いIFN-γ分泌を分泌したが、NK細胞及びT細胞の両方でのIFN-γ分泌は、OCの存在下で同等の増加を示した(図33E)。
実施例23:がん患者のOCは、健常者のOCと比較して、NK細胞において、低い細胞拡大、IFN-γ分泌、及び細胞傷害を誘導した
患者のOCの機能を調査するために、本発明者らは、健常者のNK細胞を自己OCまたは患者のOC(同種異系)のいずれかと共に培養した。患者のOCは、NK細胞の拡大(図2A及び2E)、IFN-γ分泌(図34B~34C及び34G)、ならびにNK細胞傷害(図34C及び34F)を誘導する能力が低かった。次に、本発明者らは、自己OCとの関連で、患者のNK細胞の機能を評価した。患者のNK細胞を自己OCと共に培養した場合、NK細胞の拡大、IFN-γ分泌、及び細胞傷害性に大幅な減少が観察された(図34E~34G)。これらの結果は、がん患者のNK細胞及びOCの両方の重度の機能的欠陥を示した。
患者のOCの機能を調査するために、本発明者らは、健常者のNK細胞を自己OCまたは患者のOC(同種異系)のいずれかと共に培養した。患者のOCは、NK細胞の拡大(図2A及び2E)、IFN-γ分泌(図34B~34C及び34G)、ならびにNK細胞傷害(図34C及び34F)を誘導する能力が低かった。次に、本発明者らは、自己OCとの関連で、患者のNK細胞の機能を評価した。患者のNK細胞を自己OCと共に培養した場合、NK細胞の拡大、IFN-γ分泌、及び細胞傷害性に大幅な減少が観察された(図34E~34G)。これらの結果は、がん患者のNK細胞及びOCの両方の重度の機能的欠陥を示した。
実施例24:OC誘導性T細胞媒介性拡大は、CD8+T細胞のOC誘導性NK細胞媒介性拡大と比較して、中程度にCD8+T細胞を増加させた
次に、本発明者らは、T細胞のメモリー及びナイーブ亜集団の表面表現型を分析し、がん患者のT細胞でCD45RO+細胞(活性化T細胞)の増加及びCD45RA+細胞(ナイーブT細胞)の減少を観察した(図35A)。本発明者らは、がん患者のT細胞のCD62L、CD28、CCR7、及びCD127の表面発現の低減も留意した(図35A)。さらに、CD4+T細胞の割合は、がん患者のPBMCにおけるCD8+T細胞の割合の対応する増加とともに減少した(図35B)。従って、本発明者らは、がん患者のPBMCで、CD4+/CD8+T細胞比の減少を観察した。これは、健常者と比較したがん患者のCD8+T細胞サブセットの全体的な増加を示唆する(図35C)。
次に、本発明者らは、T細胞のメモリー及びナイーブ亜集団の表面表現型を分析し、がん患者のT細胞でCD45RO+細胞(活性化T細胞)の増加及びCD45RA+細胞(ナイーブT細胞)の減少を観察した(図35A)。本発明者らは、がん患者のT細胞のCD62L、CD28、CCR7、及びCD127の表面発現の低減も留意した(図35A)。さらに、CD4+T細胞の割合は、がん患者のPBMCにおけるCD8+T細胞の割合の対応する増加とともに減少した(図35B)。従って、本発明者らは、がん患者のPBMCで、CD4+/CD8+T細胞比の減少を観察した。これは、健常者と比較したがん患者のCD8+T細胞サブセットの全体的な増加を示唆する(図35C)。
次に、本発明者らは、健常な同種異系OCの存在下でNK細胞を培養し、拡大NK細胞内で拡大CD4+及びCD8+T細胞の割合を決定した。NK細胞の精製後に最初に、検出可能なT細胞を見ることができなかったが、NK細胞の拡大を数ラウンド行った後、本発明者らは、NK細胞内のT細胞の拡大を検出することができた。拡大T細胞は主に、CD8+T細胞であり、健常者及びがん患者の両方に由来する拡大NK細胞の培養物中にCD4+T細胞がないか、または非常に低いレベルであり(図13A)、相対CD4+/CD8+T細胞の比が、がん患者及び健常者間で同様のままであった(図13B)。しかし、健常者のものと比較して、患者は、PBMCにおいてCD4+T細胞よりもCD8+T細胞の割合が高いという点に留意すべきである(図35B、35C、13A、及び13B)。
精製T細胞を健常な同種異系OCと共に培養した場合、健常者でなくがん患者は、CD8+T細胞のレベルが、拡大がない状態で、がん患者のPBMCにおいて構成的に高かったので、CD8+T細胞の割合が高く、CD4+/CD8+T細胞比が低いことを示した(図13A~13B)。また、比較のために、OCと共に培養する前に、NK細胞がIL-2及び抗CD16mAbにより活性化されたので、本発明者らが、IL-2及び抗CD3/CD28シグナル伝達によりT細胞を活性化することを選択したという点に留意すべきである。従って、NK細胞及びT細胞を予め活性化した後、OCと共に培養した。本発明者らは、OC拡大NK細胞では、CD8+T細胞の拡大の割合及び数が非常に高く、残存するCD4+T細胞がないか、または非常に少ないが、OC誘導性T細胞が、CD8+T細胞を中程度に拡大し、有意な割合のCD4+T細胞が培養物中に依然として残存することを観察した(図13A~13B)。
実施例25:DC拡大と比較した、OC拡大によるNK数及びNK媒介性細胞傷害性の増加;OCは、優先的にCD8+T細胞を拡大させるが、DCは、NK細胞培養においてCD4+T細胞を優先的に拡大させる
OC対DCによるNK細胞の活性化が拡大プロファイル及び機能に異なる影響を与えるかどうかを評価するために、本発明者らは、健常者由来のNK細胞を、単独で、OCと共に、またはDCと共に培養した。単独またはDCと共に培養されたものと比較して、OCと共に培養されたNK細胞では、有意に高い細胞数が観察された(図36A)。次に、本発明者らは、単独で、またはOCと共に、またはDCと共に培養されたNK細胞内のCD16発現細胞及びCD3発現細胞の亜集団を判定し、総リンパ球内で、NK細胞及びT細胞の数を計数した。OC対DCの存在下で、有意に高いNK細胞数(図36B)及び低いT細胞数(図36C)が観察された。OC拡大NK細胞は、口腔扁平上皮癌幹様細胞(OSCSC)に対して有意に高いレベルの細胞傷害性を示した(図36D~36E)。さらに、OCと共に培養されたNK細胞は、DCと共に培養されたものよりも有意に高いレベルのIFN-γを分泌した(図36F)。
OC対DCによるNK細胞の活性化が拡大プロファイル及び機能に異なる影響を与えるかどうかを評価するために、本発明者らは、健常者由来のNK細胞を、単独で、OCと共に、またはDCと共に培養した。単独またはDCと共に培養されたものと比較して、OCと共に培養されたNK細胞では、有意に高い細胞数が観察された(図36A)。次に、本発明者らは、単独で、またはOCと共に、またはDCと共に培養されたNK細胞内のCD16発現細胞及びCD3発現細胞の亜集団を判定し、総リンパ球内で、NK細胞及びT細胞の数を計数した。OC対DCの存在下で、有意に高いNK細胞数(図36B)及び低いT細胞数(図36C)が観察された。OC拡大NK細胞は、口腔扁平上皮癌幹様細胞(OSCSC)に対して有意に高いレベルの細胞傷害性を示した(図36D~36E)。さらに、OCと共に培養されたNK細胞は、DCと共に培養されたものよりも有意に高いレベルのIFN-γを分泌した(図36F)。
加えて、本発明者らは、OCまたはDCを用いるNK細胞培養内で拡大したT細胞の亜集団を特性決定し、DCは、CD4+T細胞を優先的に拡大させた(図36G、36I~36J、及び36M)が、OCは、CD8+T細胞の拡大を支持した(図36H~36J及び36M)ことを見出した。DCで拡大したものと同様に、NK細胞培養物中、OCで拡大したT細胞は、キラー細胞レクチン様受容体G1(KLRG1)またはT細胞免疫グロブリン/ムチンドメイン含有タンパク質3(TIM3)のいずれも発現しなかったが、それらは、PD-1の同様のレベルを有していた(図36J)。従って、これらのチェックポイント阻害剤の有意なレベルは、OCまたはDC拡大NK細胞で拡大したT細胞では見ることができなかった(図36J)。本発明者らはまた、NK細胞の非存在下で、OC対DCと共に培養された精製T細胞におけるCD4、CD8、KLRG1、TIM3、及びPD-1の発現レベルのわずかな差異に気づいた(図36K)。NK+OC共培養のT細胞は、NK+DC共培養と比較して、高レベルのCD45RO;低レベルのCD62L、CD28、CCR7、及びCD127;ならびに同レベルのCD44を発現した(図36L~36M)。精製T細胞をOCの存在下で拡大させた時、本発明者らは、DCの存在下で拡大したものと比較して、わずかに高いレベルのCD45RO及びCD28;低レベルのCD62L及びCCR7;同レベルのCD127及びCD44を観察した(図36L~36M)。
それに対応して、両方がOCと共に培養された場合、T細胞と比較して、NK細胞では、高いレベルのサイトカイン及びケモカイン分泌が見られた(図41及び15)。NK細胞は、T細胞と比較して、高レベルのMIP-1a、MIP-1B、sCD137、FasL、GMCSF、IFN-γ、sFas、及びパーフォリンを分泌した(図41A~41C)。OC拡大NK細胞培養物から選別されたCD8+T細胞は、NK細胞の非存在下のOC拡大CD8+T細胞と比較して、高レベルのGMCSF、sCD137、IFN-γ、FasL、IL-10、及びTNF-αを分泌した(図15)。
実施例26:OCは、CD8+T細胞では、CD4+T細胞よりも、高い細胞拡大及びIFN-γ分泌を誘導する
OCは、精製T細胞(図37A及び42)または精製CD8+T細胞(図37B)に伴うものと比較して、NK培養においてCD8+T細胞の高い拡大を誘導することが判明した。精製CD4+及びCD8+T細胞を抗CD3/CD28+IL-2で処理し、OCの非存在下で培養した時、拡大の程度における有意差を見ることができなかった(図37C~37D)。しかし、細胞を抗CD3/CD28+IL-2で処理し、OCと共に培養した場合、CD4+T細胞とは対照的に、CD8+T細胞の拡大倍率において連続上昇が見られる可能性がある(図37C及び37E)。同じ実験条件の下で、CD4+T細胞数は、最初は増加するが、直後に、プラトーに達し、次に、培養の12日目の後に低下した(図37E)。次に、本発明者らは、上記のように処理し、OCと共に培養した後に、NK、CD4+T、及びCD8+T細胞によるIFN-γの拡大及び分泌を比較した。NK及びCD8+T細胞では、CD4+T細胞と比較して、高い細胞拡大(図37F)及びIFN-γ分泌(図37G)を観察することができた。
OCは、精製T細胞(図37A及び42)または精製CD8+T細胞(図37B)に伴うものと比較して、NK培養においてCD8+T細胞の高い拡大を誘導することが判明した。精製CD4+及びCD8+T細胞を抗CD3/CD28+IL-2で処理し、OCの非存在下で培養した時、拡大の程度における有意差を見ることができなかった(図37C~37D)。しかし、細胞を抗CD3/CD28+IL-2で処理し、OCと共に培養した場合、CD4+T細胞とは対照的に、CD8+T細胞の拡大倍率において連続上昇が見られる可能性がある(図37C及び37E)。同じ実験条件の下で、CD4+T細胞数は、最初は増加するが、直後に、プラトーに達し、次に、培養の12日目の後に低下した(図37E)。次に、本発明者らは、上記のように処理し、OCと共に培養した後に、NK、CD4+T、及びCD8+T細胞によるIFN-γの拡大及び分泌を比較した。NK及びCD8+T細胞では、CD4+T細胞と比較して、高い細胞拡大(図37F)及びIFN-γ分泌(図37G)を観察することができた。
実施例27:NK細胞免疫療法に応答した担口腔腫瘍hu-BLTマウスの様々な組織区画におけるCD8+T細胞、IFN-γ分泌、及び細胞傷害性の増加
hu-BLTマウスの口腔に、OSCSCを移植し、強力な細胞傷害能及びサイトカイン分泌能を有するOC拡大NK細胞を注射した。4~5週間後、分析用の単一細胞懸濁液を得るために、マウスを死亡させ、組織を採取して解離させた(図14A)。本発明者らは、ビヒクルのみを注射された担腫瘍マウスまたは健常な非担腫瘍マウスと比較して、OC拡大NK細胞を注射した担腫瘍マウスのBM(図14B)、脾臓(図14E)、及び末梢血(図14H)におけるCD3+CD8+T細胞の割合の増加を観察した。NK細胞免疫療法は、担腫瘍マウスのBM(図14C及び14D)、脾臓(図14F及び14G)、ならびに末梢血(図14I及び14J)におけるIFN-γ分泌及びNK細胞媒介性細胞傷害性も増強した。IFN-γ、IL-6、及びITACの分泌の増加、ならびにIL-8及びGM-CSFの分泌の減少は、ビヒクルのみを注射されたものまたはOC拡大NK細胞を注射された非担腫瘍マウスと対比して、OC拡大NK細胞を注射された担腫瘍マウスの末梢血から採取された血清中にも見られた(図14K)。
hu-BLTマウスの口腔に、OSCSCを移植し、強力な細胞傷害能及びサイトカイン分泌能を有するOC拡大NK細胞を注射した。4~5週間後、分析用の単一細胞懸濁液を得るために、マウスを死亡させ、組織を採取して解離させた(図14A)。本発明者らは、ビヒクルのみを注射された担腫瘍マウスまたは健常な非担腫瘍マウスと比較して、OC拡大NK細胞を注射した担腫瘍マウスのBM(図14B)、脾臓(図14E)、及び末梢血(図14H)におけるCD3+CD8+T細胞の割合の増加を観察した。NK細胞免疫療法は、担腫瘍マウスのBM(図14C及び14D)、脾臓(図14F及び14G)、ならびに末梢血(図14I及び14J)におけるIFN-γ分泌及びNK細胞媒介性細胞傷害性も増強した。IFN-γ、IL-6、及びITACの分泌の増加、ならびにIL-8及びGM-CSFの分泌の減少は、ビヒクルのみを注射されたものまたはOC拡大NK細胞を注射された非担腫瘍マウスと対比して、OC拡大NK細胞を注射された担腫瘍マウスの末梢血から採取された血清中にも見られた(図14K)。
実施例28:NK細胞は、CD8+T細胞と比較して、CD4+T細胞を優先的に溶解させる
TVA色素を使用して、CD4+及びCD8+T細胞に対するNK細胞媒介性細胞傷害性を評価した。OC拡大NK細胞は、CD8+T細胞ではなく、優先的にCD4+T細胞を溶解し(図38A)、レベルは、IL-2処理初代NK細胞により媒介されるものよりも高かった(図38B)。同様に、IL-2+抗CD16mAbで処理されたNK細胞は、CD8+T細胞と比較して、CD4+T細胞を溶解させることができた。
TVA色素を使用して、CD4+及びCD8+T細胞に対するNK細胞媒介性細胞傷害性を評価した。OC拡大NK細胞は、CD8+T細胞ではなく、優先的にCD4+T細胞を溶解し(図38A)、レベルは、IL-2処理初代NK細胞により媒介されるものよりも高かった(図38B)。同様に、IL-2+抗CD16mAbで処理されたNK細胞は、CD8+T細胞と比較して、CD4+T細胞を溶解させることができた。
NK細胞媒介性制御ならびにCD4+及びCD8+T細胞の活性化の動態が本明細書に提示される。NK機能の不活化及び数の減少は、KRAS変異及び高脂肪カロリー食の両方の影響により、膵癌の前腫瘍期及び腫瘍形成期の両方で生じる。本明細書では、膵癌ならびに他のいくつかのがんを有する患者において、NK機能が大幅に抑制されていることが示される。細胞傷害性及びIFN-γを分泌する能力の両方が、患者のNK細胞で抑制される。加えて、本発明者らは、PBMCの総数が大幅に減少する場合であっても、がん患者では、NK、単球、及びCD11b+免疫細胞の割合が増加することも示す。加えて、CD3+T細胞及びB細胞の割合が著しく減少する。従って、NK細胞の割合はがん患者で上昇するが、NK細胞の機能は、大幅に低下し、これは、がん患者由来のNK細胞の深刻な免疫抑制を示す。NK細胞を精製し、拡大させ、OCの使用によりスーパーチャージさせた場合でさえ、がん患者由来の細胞は、健常者から拡大したものと比較して、拡大し、細胞傷害を媒介し、IFN-γを分泌する能力が非常に低かった。従って、がん患者由来のPBMCの回収の低さは、部分的に、健常者から拡大したものと比較して、NK細胞などの様々なリンパ球サブセットが増殖及び拡大することができないことに起因し得る。がん患者由来の初代及びOC拡大NK細胞はともに、機能に欠陥があり、それ故、患者の初代NK細胞で観察される欠陥が優勢であり、これらの細胞が同種異系OCの存在下で拡大した場合のみ、中程度に改善される。患者のT細胞の拡大及びOC拡大T細胞からのIFN-γ分泌も、様々な活性化条件下で減少する(図33A~33G、40A~40C、及び40E)。がん患者の免疫エフェクターは、割合が高いCD45RO及び割合が低いCD62L表面発現を示し、これにより、in vivoでの免疫活性化の状態の増加が示された。これはまた、患者におけるCD8+T細胞の割合の増加及びCD4/CD8比の減少からも明らかである(図35B~35C)。
がん患者におけるNK細胞の割合の増加は、本発明者らが、CD8+T細胞における優先的な増加及びCD4/CD8T細胞比の低下を観察する1つの理由であり得る。本発明者らの研究は、NK細胞がCD8+T細胞の優先的な拡大に非常に重要であることを示す。特に、OCは、NK細胞の拡大に重要である。NK細胞で拡大したT細胞の大部分は、CD8+T細胞であり、NK細胞が健常者及びがん患者の両方から得られた場合、NK細胞によるCD8+T細胞拡大の同様のプロファイルが見られ、これは、NK細胞がCD8+T細胞の拡大に不可欠であることを示す。OCは、健常者及びがん患者のT細胞の両方においてCD4+対CD8+T細胞の比の減少にある程度の影響を及ぼすが、NK細胞の存在下では比が著しく減少し、拡大NK細胞によるCD8+T細胞の高い選択及び拡大、ならびにCD4+T細胞の喪失を示す(図13B)。
興味深いことに、NK細胞のDC誘導発性拡大及びOC誘導性NK細胞拡大の間に、有意差が観察される。NK細胞のOC誘導性拡大は、CD8+T細胞の拡大を増加させたが、NK細胞のDC誘導性拡大は、CD4+T細胞の拡大をもたらした。現時点では、それぞれDC対OC拡大NK細胞による、CD4+対CD8+T細胞の差示的拡大を支配する機序は、十分には理解されていない。しかし、DC拡大NK細胞よりも、OC拡大NK細胞で拡大したT細胞において、CD45ROの割合の大幅な増加及びCD62Lの表面発現の割合の大幅な減少があり、これは、NK細胞によるT細胞の活性化の増加を示す(図36L)。
CD4+T細胞よりも大きいCD8+T細胞の拡大には、OC拡大NK細胞による高い活性化シグナルが必要である。実際には、CD8+T細胞のOC誘導性拡大は、総CD3+T細胞が拡大に使用される場合、CD8+T細胞の拡大に中程度の増加及びCD4+T細胞のわずかな低下をもたらした(図13A及び37A)。それ故、OC及びNK細胞の両方のシグナルは、CD8+T細胞の拡大及び活性化に重要であるように見えるが、NK細胞の効果は、OCよりも支配的であるように見える。加えて、OCで拡大したNK細胞は、DCで拡大したものよりも、細胞傷害性活性が高く、これは、CD4+T細胞を標的し且つCD8+T細胞を除く(sparing)ための機序を提供する可能性がある。この観察を支持して、本発明者らは、NK細胞が活性化CD4+及びCD8+T細胞を特異的に標的とすることも観察している(図38)。OC拡大NK細胞及びより少数の初代IL-2活性化NK細胞以外のIL-2+抗CD16mAb処理NK細胞は、活性化CD4+T細胞を標的にすることができた(図38)。実際に、以前に、NK細胞が、Fas受容体を介してGVHDのモデルにおいて慢性抗原刺激下でCD4+T細胞の増殖を阻害し、パーフォリン媒介性殺傷を阻害しないこと、ならびに、溶解が、NKG2Dリガンド発現により媒介されたことが示されている。一致して、CD56brightNK細胞は、CD56dimサブセットと比較して、活性化CD4+T細胞の高い脱顆粒及び溶解を有することが見出された。CD56brightNK細胞は、以前に、本発明者らが以前にスプリットアネルギー化NK細胞として作成しているIL-2+抗CD16mAbで処理されたNK細胞で見出されたものに類似した細胞傷害性がないか、または低い状態で、高分泌のサイトカインを有することが示された。それ故、CD4+T細胞溶解の根本的な機序は、NK細胞上のFasリガンド、TNF-α、及びTRAILにより引き起こされる死受容体を介するものである可能性がある。実際に、スプリットアネルギー化NK細胞及びOC拡大NK細胞の両方は、Fasリガンド及びTNF-αの非常に高い誘導を有する(図41)。しかし、スーパーチャージNK細胞は、強力な細胞傷害機能を備えた顆粒成分も有意に高いので、現在の本発明者らのシステムにおいて、CD4+T細胞の顆粒媒介性溶解を除外することはできない。さらに、抗原及び共刺激シグナルで刺激した際に、CD4+T細胞は、Fas受容体を介した活性化誘導性細胞死を受けるが、CD8+T細胞は、IL-2が提供される時、不応答となるが、機能を獲得することも示された。それ故、細胞死に対する感受性及び拡大様式には、CD4+及びCD8+T細胞サブセット間に明らかな差異がある。従って、NK細胞がCD8+T細胞を選択し、その拡大も引き起こすので、OC細胞及びNK細胞の両方によるCD8+T細胞の拡大が大きいほど、CD8+T細胞の選択及び拡大の増加が示唆される。他方では、これらの細胞が、細胞傷害能を有することが示されていないので、OCは、拡大を適度に助けるにすぎないことが明らかである。
OCは、CD8+T細胞をいくらか拡大させることができたが、これらの細胞の拡大は、OC拡大NK細胞の存在下で有意に亢進した(図13A~13B及び37A~37B)。それ故、OC拡大NK細胞によるCD8+T細胞の拡大の2つの異なる機序が潜在的に存在し得る。拡大の初期ステージで、1つの機序は、OCによりもたらされる可能性があり、NK培養物には、依然として、いくつかのOCが残っており、これは、CD8+T細胞の拡大が少ないか、またはわずかである場合、拡大の6日目または最大9日目までには、ほぼ終了している可能性がある。9日目までに、OCは、NK細胞の培養物中に全く残存せず、それ故、スーパーチャージNK細胞の拡大のみがあり、より急速に、CD8+T細胞を拡大させる。従って、第2の機序は、残りのCD4+T細胞の標的化及びCD8+T細胞の選択及びCD8+T細胞の活性化によるものであり得るスーパーチャージNK細胞によりもたらされる。OC拡大NK細胞の存在下では、OC媒介性T細胞拡大後に残存するかなりの数のCD4+T細胞があるが、全てではないが、大多数が、主にCD8+T細胞である(図13A)。OC拡大NK媒介性CD8+T細胞の拡大に関しては、CD45ROを発現する細胞の割合の増加及びCD62Lを発現する細胞の割合の低下の点から、OC拡大NK細胞では、単なるOC活性化T細胞と比較して、CD8+T細胞の有意に高い活性化が見られ(図36L~36M)、それ故、いずれのNK細胞も活性化CD4細胞を特異的に標的及び殺傷し、及び/または活性化誘導性細胞死が、CD4+T細胞では、CD8+T細胞よりも高い可能性がある。種々のサイトカインレベルを評価した場合、OC誘導性CD8+T細胞と比較して、NK細胞によるCD8+T細胞のより高い活性化も見られる(図15)。
患者は、健常者から得られたものと比較して、末梢血中のCD8+T細胞の割合が平均して高いことが判明する(図35B~35C)。健常者に由来するOCを使用して、健常及び患者のT細胞の両方を拡大させ、OC拡大T細胞は、健常及び患者由来のT細胞の両方のCD8+T細胞拡大の割合が高いことも実証した。これは、末梢血から最初に得られたものに見られるものより高かった(図35B、35C、13A、及び13B)。従って、患者のOC拡大T細胞で見られる高い拡大は、健常者と比較して、患者のCD8+T細胞の出現頻度の高さに起因する可能性がある。実際に、健常なOCで拡大した場合の、平均して1%の初代CD8+T細胞は、患者のT細胞により、1.2%の拡大CD8+T細胞を生じるであろうが、その平均は、健常者のT細胞では、1.6%であり、これは高い。従って、抗CD3/CD28活性化及びT細胞を介したシグナル伝達は、中程度にCD8+T細胞の割合を増強し、拡大のレベルは、健常者から拡大したCD8+T細胞と比較して、患者のCD8+T細胞では少ない(図13A~13B)。加えて、OC拡大NK細胞は、健常者由来のCD8+T細胞の1パーセントから、CD8+T細胞を2.73パーセント拡大させたが、患者由来では、それらの割合は、1.75パーセント(平均して、ほぼ1パーセントポイントの差である)で低いままであった(図35B、35C、13A、及び13B)。従って、OC拡大NK細胞によるCD8+T細胞の選択及び拡大の程度は、患者から得られたものよりも、健常者では、はるかに高い。これらの結果に基づいて、OC拡大T細胞及びOC拡大NK細胞の両方のCD8+T細胞の選択及び拡大は、健常者のものと比較して、患者細胞により有意に劣っていることは明らかである。
第2の一連の実験では、本発明者らは、自己OCを使用して、健常及びがん患者の両方のOC媒介性CD8+T細胞の拡大の速度を測定した。患者のOCは、OC拡大T細胞及びNK細胞由来の自己CD8+T細胞を拡大させる能力が低く、拡大の割合は、自己システムにおける健常ドナー由来のOC拡大T細胞及びNK細胞のCD8+拡大と比較して、非常に少なかった(図42)。加えて、拡大NK細胞の数及び細胞傷害性及びIFN-γの分泌のレベルを、自己のシステムで評価した場合、非常に低いレベルの拡大、細胞傷害性、及びIFN-γ分泌は、健常者由来のOC拡大NK細胞と比較して、患者のOC拡大NK細胞から観察することができる(図34E~34G)。健常者由来のNK細胞の拡大のための患者OCまたは患者のNK細胞を伴う健常なOCを使用して、本発明者らは、自己システムにおいて健常者のOC拡大NK細胞から得られたものと比較して、非常に低い拡大及び機能を観察した(図34)。上記の3群と比較した最低レベルの拡大及び機能は、患者のOCを使用して自己NK細胞を拡大させた時に見られた。これは、健常者由来の両方の細胞タイプの機能と比較して、がん患者由来のNK及びOCの両方に機能的欠陥があることを示す。実際に、患者及び健常なOC間で表面受容体の発現を比較して、活性化受容体の著しい下方調節があり、これは、患者OCが同種異系または自己のNK及びCD8+T細胞の拡大を支援しないことがある1つの理由であり得る。しかし、本発明者らは、MHCクラスI阻害性受容体を介したNK細胞の結合及び阻害の減少により、活性化シグナルを提供すべきMHCクラスI阻害性シグナルの大幅な減少も確認する。ほとんどの受容体は、NK細胞に対する活性化または阻害性リガンドであるどうかに関係なく、患者のOCの表面で下方調節されることが明らかである。このシナリオでは、患者由来のOCが、自己NK細胞を活性化できないので、活性化リガンドの欠如が阻害性リガンドの欠如の影響に優先する可能性がある。
本発明者らのin vitro研究と一致して、担腫瘍hu-BLTマウスにOC拡大NK細胞を注入すると、BM、脾臓、及び末梢血におけるCD8+T細胞の数が増加し、これにより、NK細胞媒介性細胞傷害のレベルの増加及びIFN-γの分泌の増加がもたらされた(図14B~14J)。OC拡大NK細胞を注射された担腫瘍hu-BLTマウスの血清でも、IFN-γ、IL6、ITACのレベルの上昇が観察された(図14K)。
本発明者らの観察結果の潜在的な関連性は、多発性骨髄腫(MM)患者で報告された研究に見ることができる。実際に、これらの患者は、かなりの数のOCが存在する骨髄でモノクローナル形質細胞の多発性腫瘍性増殖を有する。これらの患者は、末梢血及び骨髄吸引物の両方では、健常な対照と比較して、NK及びCD8+T細胞のレベルが高いことが示された。CD4/CD8比は、患者において減少し、この減少は、CD4+T細胞ではなく、CD8+T細胞によるヒト白血球抗原(HLA)-DR発現の増加と相関していたことも判明した。さらに、長期の疾患管理を有する患者は、細胞傷害性CD8+T細胞及びナチュラルキラー細胞の拡大を示したことが留意された。MM患者のT細胞拡大は、細胞傷害性T細胞の表現型を有し、拡大したV-ベータTCR集団は、主にCD8+、CD57+、CD28-、及びパーフォリン+の表現型を有する。本発明者らの観察は、著しいBMの病状を示すので、MM患者にとって重要であり、本明細書で考察される機序は、骨転移を維持し得るまたは骨に影響を与える原発腫瘍を有し得る患者においても生じる可能性もある。
実施例29:実施例30の材料及び方法
ヒトドナー及びhu-BLTマウス末梢血由来の血清収集
末梢血(200μL)を1.5mlのヘパリン不含エッペンドルフチューブに収集し、室温で15~20分間放置した。次に、チューブを10分間2000rpmで遠心分離し、次に、血清を採取した。
ヒトドナー及びhu-BLTマウス末梢血由来の血清収集
末梢血(200μL)を1.5mlのヘパリン不含エッペンドルフチューブに収集し、室温で15~20分間放置した。次に、チューブを10分間2000rpmで遠心分離し、次に、血清を採取した。
実施例30:OC拡大NK細胞は、拡大T細胞と比較して、より多くのサイトカイン及びケモカインを分泌した
NK細胞をOCと共に12日間培養した後、NK細胞を拡大させ、NK細胞拡大CD8+T細胞を、同じ培養物から単離した。単離NK細胞を、IL-2及び抗CD16mAbの組み合わせで処理し、NK拡大CD8+T細胞をIL-2及び抗CD3/CD28mAbで18時間処理した後、上清を培養物から採取し、マルチプレックスアレイを使用して、分泌物を評価した。本発明者らは、NK細胞により分泌された量を、NK拡大CD8+T細胞により分泌された量と比較し、NK拡大CD8+T細胞と比較して、NK細胞における増加倍率を決定した。図S4Aに示されるように、NK細胞は、NK拡大CD8+T細胞よりも、NK細胞で低かったIL-3を除き、高レベルの全サイトカイン及びケモカインを分泌した。特に、NK細胞は、CD8+T細胞と比較して、高レベルの分泌CD137、分泌Fas-リガンド(sFasL)、グランザイムA及びB、IL-10、TNF-a、MIP1-1a、ならびにMIP1bを分泌した(図41A)。OC拡大NK細胞は、より豊富な量のGM-CSF、可溶性CD137、IFN-γ、可溶性Fas、sFasL、パーフォリン、MIP-1a、及びMIP1bを産生したが、OC拡大T細胞は、拡大期間中に、IL-10、グランザイムA及びB、ならびにTNF-αを急速に産生した(図41B~41C)。次に、本発明者らは、12日目のOC拡大NK細胞培養物から単離されたCD8+T細胞からの分泌因子を試験し、OCのみで拡大した精製CD8+T細胞と比較した。OC拡大NK細胞培養物から単離されたCD8+T細胞は、高レベルのGM-CSF、可溶性CD137、IFN-γ、IL-10、sFasL、及びTNF-αを分泌したが、OC拡大CD8+T細胞と比較して、グランザイムA及びパーフォリンのレベルは低く、グランザイムB及び可溶性Fasのレベルは同様であった(図15)。
NK細胞をOCと共に12日間培養した後、NK細胞を拡大させ、NK細胞拡大CD8+T細胞を、同じ培養物から単離した。単離NK細胞を、IL-2及び抗CD16mAbの組み合わせで処理し、NK拡大CD8+T細胞をIL-2及び抗CD3/CD28mAbで18時間処理した後、上清を培養物から採取し、マルチプレックスアレイを使用して、分泌物を評価した。本発明者らは、NK細胞により分泌された量を、NK拡大CD8+T細胞により分泌された量と比較し、NK拡大CD8+T細胞と比較して、NK細胞における増加倍率を決定した。図S4Aに示されるように、NK細胞は、NK拡大CD8+T細胞よりも、NK細胞で低かったIL-3を除き、高レベルの全サイトカイン及びケモカインを分泌した。特に、NK細胞は、CD8+T細胞と比較して、高レベルの分泌CD137、分泌Fas-リガンド(sFasL)、グランザイムA及びB、IL-10、TNF-a、MIP1-1a、ならびにMIP1bを分泌した(図41A)。OC拡大NK細胞は、より豊富な量のGM-CSF、可溶性CD137、IFN-γ、可溶性Fas、sFasL、パーフォリン、MIP-1a、及びMIP1bを産生したが、OC拡大T細胞は、拡大期間中に、IL-10、グランザイムA及びB、ならびにTNF-αを急速に産生した(図41B~41C)。次に、本発明者らは、12日目のOC拡大NK細胞培養物から単離されたCD8+T細胞からの分泌因子を試験し、OCのみで拡大した精製CD8+T細胞と比較した。OC拡大NK細胞培養物から単離されたCD8+T細胞は、高レベルのGM-CSF、可溶性CD137、IFN-γ、IL-10、sFasL、及びTNF-αを分泌したが、OC拡大CD8+T細胞と比較して、グランザイムA及びパーフォリンのレベルは低く、グランザイムB及び可溶性Fasのレベルは同様であった(図15)。
参照による組み込み
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているかのように、全体が本明細書で参照により組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含む本出願が優先するであろう。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているかのように、全体が本明細書で参照により組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含む本出願が優先するであろう。
ワールドワイドウェブ上でtigr.orgにあるThe Institute for Genomic Research(TIGR)、及び/またはワールドワイドウェブ上でncbi.nlm.nih.govにあるNational Center for Biotechnology Information(NCBI)により維持されるような公開データベースのエントリに関するアクセッション番号に参照事項をつける任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列も全体が参照により組み込まれる。
均等物
当業者らは、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または単なる通常の実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
当業者らは、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または単なる通常の実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
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Claims (51)
- NK細胞の機能を評価する方法であって、
a)がん細胞及び/またはがん幹細胞に対する前記NK細胞の細胞傷害機能を評価すること、
b)前記NK細胞により産生されたインターフェロンγ(IFN-γ)の量を評価すること、ならびに
c)前記NK細胞により産生されたIFN-γが腫瘍細胞の分化を誘導する能力を評価すること、
を含む、前記方法。 - 前記がん細胞またはがん幹細胞が、a)口腔扁平上皮癌幹細胞(OSCSC)及び/またはMia-Paca-2(MP2)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記NK細胞により産生されたIFN-γの量を評価することが、
i)培養物中の前記NK細胞または全NK細胞の集団により産生されたインターフェロンγ(IFN-γ)の量を評価すること、及び
ii)単一細胞レベルの前記NK細胞により産生されたIFN-γの量を評価すること、
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - i)の前記培養物中の前記NK細胞または全NK細胞の前記集団により産生されたIFN-γの量が、ELISAアッセイにより測定される、請求項3に記載の方法。
- ii)の前記単一細胞レベルの前記NK細胞により産生されたIFN-γの量が、ELISPOTアッセイで決定される、請求項3または4に記載の方法。
- 前記NK細胞の細胞傷害機能を評価することが、前記NK細胞による直接の細胞傷害性殺傷を評価することを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞の前記細胞傷害機能を評価することが、前記NK細胞の抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を評価することを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞の前記細胞傷害機能が、51Cr放出細胞傷害アッセイを使用して測定される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記IFN-γが腫瘍細胞の分化を誘導する能力が、腫瘍細胞をIFN-γと共にインキュベートすることにより評価され、
a)前記IFN-γが、対照における腫瘍成長及び/または腫瘍細胞分裂と比較して、腫瘍成長及び/または腫瘍細胞分裂を減少及び/または阻害する場合、前記IFN-γは、前記腫瘍細胞の分化を誘導することができ、
b)前記IFN-γが、前記対照における同じマーカーの発現レベルと比較して、CD44の発現レベルを減少させ、及び/またはCD54、MHCクラスI、及びPD-L1のうちの少なくとも1つの発現レベルを増加させる場合、前記IFN-γは、前記腫瘍細胞の分化を誘導することができ、及び/または
c)前記IFN-γが、前記対照の耐性と比較して、前記NK細胞媒介性細胞傷害への前記腫瘍細胞の耐性を増加させる場合、前記IFN-γは、前記腫瘍細胞の分化を誘導することができる、
請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。 - a)前記NK細胞が、がん細胞及び/またはがん幹細胞を直接殺傷する効率が、健常なNK細胞が、がん細胞及び/またはがん幹細胞を直接殺傷する効率の約60%、70%、または80%未満であり、
b)少なくとも1つのNK細胞が、1つがん細胞及び/またはがん幹細胞の直接殺傷を媒介するために必要とされ(すなわち、1つのNK細胞は、複数のがん細胞を殺傷することができず)、
c)前記NK細胞が、がん細胞及び/またはがん幹細胞のADCC依存性の殺傷を媒介する効率が、健常なNK細胞が、がん細胞及び/またはがん幹細胞のADCC依存性殺傷を媒介する効率の約60%、70%、もしくは約80%未満であり、及び/または
d)少なくとも1つのNK細胞が、1つのがん細胞及び/またはがん幹細胞のADCC依存性殺傷を媒介するために必要とされ(すなわち、1つのNK細胞は、複数のがん細胞を殺傷することができず)、
任意に、前記効率が、がん細胞及び/またはがん幹細胞との前記NK細胞の共インキュベーションの約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12時間未満の期間について決定される場合、前記NK細胞が、標準以下の細胞傷害性を有すると決定される、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。 - a)(i)IL-2で処理された時の前記NK細胞により産生されたIFN-γの量が、IL-2で処理された時の健常なNK細胞により産生されたIFN-γの量の約60%、70%、もしくは80%未満であり、または
(ii)IL-2で処理された時の100万毎のNK細胞により産生されたIFN-γの量が、約300pg未満であり、及び/または
b)前記NK細胞が、単一細胞レベルで健常なNK細胞により産生されたIFN-γの量の約60%、70%、または80%未満を産生する
場合、前記NK細胞が、標準以下のレベルのIFN-γ分泌を有すると決定される、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記NK細胞により産生された前記IFN-γ(「試験IFN-γ」)が、
i)腫瘍成長及び/または腫瘍細胞分裂を少なくとも10%、20%、30%、もしくは40%減少もしくは阻害せず、
ii)腫瘍細胞上のCD44の発現レベルを少なくとも約10%、20%、30%、もしくは40%減少させず、
iii)腫瘍細胞上のCD54、MHCクラスI、及びPD-L1のうちの少なくとも1つの発現レベルを少なくとも約10%、20%、30%、もしくは40%増加させず、及び/または
iv)NK細胞媒介性細胞傷害に対する前記腫瘍細胞の耐性を少なくとも10%、20%、30%、もしくは40%増加させない
場合、前記NK細胞が、標準以下のIFN-γ腫瘍の分化能を有すると決定される、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、前記NK細胞が前記破骨細胞で拡大する能力を評価することを含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記破骨細胞が、前記NK細胞に対して自己または同種異系である、請求項13に記載の方法。
- 前記NK細胞が前記破骨細胞で拡大する能力を評価することが、前記破骨細胞と共に培地中で前記NK細胞を培養することを含む、請求項13または14に記載の方法。
- 4週間以内に、前記NK細胞を、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、またはそれ以上の集団倍加に、拡大させることを含む、請求項13~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞が、4週間以内に、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、またはそれ以上の集団倍加に、破骨細胞で拡大しない場合、前記NK細胞が、標準以下の拡大可能性を有すると決定される、請求項13~16のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記NK細胞がCD8+T細胞を拡大させる能力を評価することを含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞が前記CD8+T細胞を拡大させる能力が、前記NK細胞がCD4+T細胞を拡大させる能力と比較して決定される、請求項18に記載の方法。
- 前記自己NK細胞が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10倍、またはそれ以上に、CD8+T細胞を拡大させない場合、前記NK細胞が、CD8+T細胞を拡大させる能力が標準以下であると決定される、請求項18または19に記載の方法。
- さらに、前記NK細胞上のCD16受容体の量及び/または機能を評価することを含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。
- CD16に応答して、前記NK細胞の(a)IFN-γを分泌する能力及び/または(b)分化腫瘍に対するADCC機能を媒介する能力を評価することにより、前記NK細胞上の前記CD16受容体の機能が決定される、請求項21に記載の方法。
- 前記NK細胞が、健常なNK細胞と比較して少なくとも約10%、15%、20%、25%以上のCD16発現の減少がある場合、前記NK細胞が標準以下のCD16発現を有すると決定される、請求項21に記載の方法。
- 前記NK細胞が、1つの以上の機能について基準以下であると判定される場合に、前記方法が、さらに、前記NK細胞を活性化することを含む、請求項1~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞を活性化することは、前記NK細胞を、前記NK細胞を活性化するのに十分な量のCD16を発現する単球と接触させることを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記単球が、前記NK細胞に対して自己または同種異系である、請求項25に記載の方法。
- 前記単球が、CD16をコードする外因性核酸またはその活性フラグメントを含む、請求項25または26に記載の方法。
- 前記NK細胞を活性化することが、IL-2、CD16、抗CD16抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び少なくとも1つの細菌株を含む組成物から選択される少なくとも1つの作用物質と、前記NK細胞を接触させることを含む、請求項24~27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が、Streptococcus thermophiles、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、KE99、及びLactobacillus bulgaricusから選択される少なくとも1つの細菌株を含み、任意に、前記少なくとも1つの細菌株が、生存しているか、または超音波処理される、請求項28に記載の方法。
- 前記組成物が、sAJ2細菌を含む、請求項28または29に記載の方法。
- さらに、前記破骨細胞及び/または樹状細胞を接触させることにより、前記NK細胞を拡大させることを含み、任意に、前記破骨細胞及び/または樹状細胞が、前記NK細胞に対し自己または同種異系である、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記破骨細胞が、前記NK細胞による、IL-12、IL-6、TNF-α、IL-5、及び/またはIL-4の分泌を促進する、請求項31に記載の方法。
- 前記NK細胞が、初代NK細胞であり、任意に、前記初代NK細胞が、形質転換されていない、請求項1~32のいずれか1項に記載の方法。
- NK細胞が、がんに罹患している対象などの対象への投与に適するかどうかを判定する方法であって、前記NK細胞で、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法を実施することを含む、前記方法。
- 対象に好適な治療を決定する方法であって、前記対象から得られたNK細胞で、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法を実施することを含む、前記方法。
- 前記対象が、がんに罹患している対象であり、前記方法が、さらに、前記対象のがん細胞上のCD44、CD54、MHCクラスI、PD-L1(B7H1)、MICA、及びMICBのうちの少なくとも1つの量を決定することを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記NK細胞が、標準的な細胞傷害性を有するが、IFN-γの標準以下の産生を有すると決定される、請求項35または36に記載の方法。
- 前記好適な治療が、IL-2及び/またはプロバイオティクス組成物である、請求項37に記載の方法。
- 前記NK細胞が、標準的なIFN-γ産生を有すると決定されるが、CD8+T細胞を拡大させる能力、細胞傷害機能、及び/または拡大可能性では基準以下である、請求項35または36に記載の方法。
- 前記好適な治療が、IL-2、IL-15、及び/またはIL-21、及び/またはプロバイオティクス組成物である、請求項39に記載の方法。
- 前記好適な療法が、さらに、化学療法または放射線療法を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記プロバイオティクス組成物が、Streptococcus thermophiles、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、KE99、及びLactobacillus bulgaricusから選択される少なくとも1つの細菌株を含み、任意に、前記少なくとも1つの細菌株が、生存しているか、または超音波処理される、請求項38または40に記載の方法。
- 前記プロバイオティクス組成物が、sAJ2細菌を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記方法が、さらに、前記患者に前記好適な治療を施すことを含む、請求項34~43のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記NK細胞拡大CD8+T細胞を前記対象に投与することを含む、請求項34~44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象のNK細胞が、前記CD16受容体の低い量及び/または機能を示す場合、さらに、前記NK細胞ベースの免疫療法以外の免疫療法を投与することを含む、請求項34~45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、哺乳動物である、請求項34~46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、マウスまたはヒトである、請求項47に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項47または48に記載の方法。
- NK細胞の機能を評価するためのキットであって、前記キットが、請求項1の(a)~(c)の、さらに、請求項2~9のいずれか1項に規定される評価のそれぞれを実施するための少なくとも1つの試薬の組み合わせを含む、前記キット。
- さらに、請求項13、15、18、19、21、22、及び24~33のいずれか1項の評価を実施するための少なくとも1つの試薬を含む、請求項50に記載のキット。
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