CN112513067A - 表达异源靶向构建体的淋巴细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含异源靶向构建体的工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞或MAIT细胞)，该异源靶向构建体缺乏能够激活表达该构建体的淋巴细胞的细胞内信号传导结构域。还提供了工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞)的组合物以及使用所述工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞，例如过继性T细胞疗法的一部分)的方法。

Description

表达异源靶向构建体的淋巴细胞

背景技术

癌症是一组涉及异常细胞生长的疾病，这种异常细胞生长具有转移到身体其他部位的潜能。癌症类型的多样性是众所周知的，并且许多类型的癌症在患者之间的遗传组成可以有巨大差异。这种差异给确定靶向某些癌症的有效治疗策略带来了艰巨负担。特别地，需要针对任何给定的癌症靶标制定个性化的治疗策略。因此，基于我们可以利用免疫系统的细胞识别并破坏外来或病原细胞的识别，对T细胞免疫疗法的兴趣日益浓厚。迄今为止，T细胞免疫疗法涉及工程化αβT细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)。此类CAR T细胞可以基于嵌合抗原受体识别的靶抗原(例如肿瘤相关抗原)的表达来识别癌症靶。在结合其靶抗原后，CAR的一个或多个胞内结构域传播信号1激活和/或信号2激活(共刺激)以激活CAR T细胞，从而触发靶细胞的脱粒和裂解。然而，这种CAR T细胞方法仍存在多种问题。例如，由于健康细胞适度表达靶抗原，因此CAR T细胞具有产生脱靶细胞毒性的风险。因此，在该领域中需要改进的方法来工程化免疫系统的这些强大成分同时增强治疗的安全性和有效性。

发明内容

本发明提供了CAR T细胞的替代方法。具体地，本文的特征是异源靶向构建体，其缺乏功能性胞内结构域，该功能性胞内结构域能够激活表达它的细胞。当在具有先天样效应物功能和/或不受MHC限制的淋巴细胞(如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞和工程化的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞)上表达时，工程化的淋巴细胞可通过避免与健康细胞上低水平的靶抗原结合后的异常TCR活化而对患病细胞表现出增强的特异性。

在第一方面，本发明提供了一种工程化的γ-δ(γδ)T细胞，其包含异源靶向构建体，其中异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至抗原结合结构域的跨膜结构域，其中异源靶向构建体缺乏能够激活所述工程化的γδT细胞的细胞内结构域(例如，如果存在，细胞内结构域不传播信号1激活，也不传播信号2共刺激)。在一些实施方式中，异源靶向构建体还包括将抗原结合结构域可操作地连接至跨膜结构域的茎结构域(stalk domain)。

在另一方面，本发明提供了一种包括异源靶向构建体的工程化的γδT细胞，其中异源靶向构建体包含抗原结合结构域和跨膜结构域，其中跨膜结构域是末端跨膜结构域(即具有未连接的末端端部的跨膜结构域，例如未与肽或蛋白质连接的C末端)。因此，末端跨膜结构域未连接到细胞内结构域，如细胞内信号传导结构域。跨膜结构域不传播信号1激活。在一些实施方式中，末端跨膜结构域不参与细胞内信号途径(例如TCR途径，例如T细胞信号途径，例如信号2共刺激)。在其他实施方式中，跨膜结构域可以与内源性分子结合，从而传播信号2共刺激。在一些实施方式中，异源靶向构建体还包括将抗原结合结构域可操作地连接至跨膜结构域的茎结构域。

在本发明任何方面的一些实施方式中，跨膜结构域不激活工程化的γδT细胞。

在另一方面，本发明提供了一种工程化的γδT细胞，其包含由抗原结合结构域、可操作地连接抗原结合结构域的茎结构域和可操作地连接至所述茎结构域的跨膜结构域组成的异源靶向构建体。

在本发明任何方面的一些实施方式中，工程化的γδT细胞为Vδ2阴性(例如Vδ2阴性γδT细胞是Vδ1阳性或双阴性)。在本发明任何方面的替代实施方式中，工程化的γδT细胞可以为Vδ2阳性。

抗原结合结构域可以包括单链可变片段(scFv)、单克隆抗体、Fab片段、B细胞受体、T细胞受体、抗体支架、受体特异性配体或配体特异性受体(例如对表面表达的配体特异的受体)。在一些实施方式中，茎结构域包括从下列中选择的结构域中的一个或多个：CD8茎、IgG1铰链-CH₂结构域、IgG1-铰链-CH₃结构域、IgG1-铰链-CH₂-CH₃结构域、(G₄S)₃铰链、IgG1铰链、CD7茎、IgD铰链、IgD铰链-CH₂结构域、IgD铰链-CH₃结构域、IgD铰链-CH₂-CH₃结构域、IgG4铰链、IgG4铰链-CH₂结构域、IgG4铰链-CH₃结构域、IgG4铰链-CH₂-CH₃结构域或FcεRI茎结构域。

在本发明任何方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD3ε跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD45跨膜结构域、CD5跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD9跨膜结构域、CD16跨膜结构域、CD22跨膜结构域、CD33跨膜结构域、CD37跨膜结构域、CD64跨膜结构域、CD80跨膜结构域、CD86跨膜结构域、CD134跨膜结构域、CD137跨膜结构域、CD154跨膜结构域、CD7跨膜结构域、CD71跨膜结构域、CD18跨膜结构域、CD29跨膜结构域、CD11a跨膜结构域、CD11b跨膜结构域、CD11c跨膜结构域、CD11d跨膜结构域、CD94跨膜结构域、FcγR跨膜结构域或NKG2D跨膜结构域。在一些实施方式中，不超过50％的末端跨膜结构域的氨基酸驻留在细胞内(例如末端跨膜结构域(例如C末端跨膜结构域)的氨基酸的不超过45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％驻留在细胞内)。

在本发明任何方面的一些实施方式中，抗原结合结构域与靶抗原结合后，异源靶向构建体的聚簇基本上不激活工程化的γδT细胞中的TCR途径。

在本发明任何方面的一些实施方式中，抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原。例如，肿瘤相关抗原可以是在肿瘤细胞表面上表达的蛋白质或肽抗原(例如CD19)。可替代地，肿瘤相关抗原可以是肿瘤细胞表面上表达的碳水化合物。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原是肿瘤细胞表示上表达的神经节苷脂(例如GD2)。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原是免疫抑制抗原。在一个实施方式中，抗原结合结构域结合实体瘤细胞表达的靶抗原。

在任何前述实施方式的一些中，相对于具有功能性胞内结构域的参考细胞，抗原结合结构域与健康细胞上表达的靶抗原的结合触发通过工程化γδT细胞的细胞溶解大幅减少(例如少至少5％，少至少10％，少至少20％，少至少30％，少至少40％，少至少50％，少至少60％，少至少70％，少至少80％，少至少90％或少至少95％的细胞溶解)(例如其基本上不触发通过工程化的γδT细胞的细胞溶解)。在一些实施方式中，抗原结合结构域与肿瘤细胞或受感染细胞上表达的靶抗原的结合显著触发通过工程化的γδT细胞的细胞溶解。细胞溶解可以取决于工程化的γδT细胞对NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46或DNAM1的内源表达。在一些实施方式中，细胞溶解的特征是从CD107脱粒、颗粒酶释放、穿孔素释放、颗粒溶素释放、靶细胞杀伤、γδT细胞增殖和细胞因子产生中选择的响应中的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个。

在另一方面，本发明提供了一种工程化的NK细胞或NK样T细胞，其具有任何本文所描述的实施方式的异源靶向构建体。在一些实施方式中，异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至抗原结合结构域的跨膜结构域。异源靶向构建体缺乏工程化的NK细胞或NK样T细胞的细胞内结构域。

在另一方面，本发明提供了一种工程化的先天淋巴样细胞(ILC)。工程化的ILC包括任何本文所描述的实施方式的异源靶向构建体。在一些实施方式中，异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至抗原结合结构域的跨膜结构域。异源靶向构建体缺乏能够激活工程化的先天淋巴样细胞的细胞内结构域。

在另一方面，本发明提供了一种工程化的MAIT细胞。工程化的MAIT细胞包括任何本文所描述的实施方式的异源靶向构建体。在一些实施方式中，异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至抗原结合结构域的跨膜结构域。异源靶向构建体缺乏能够激活工程化的MAIT细胞的细胞内结构域。

在另一方面，本发明提供了一种分离的细胞群，其包括至少十个任何前述实施方式的工程化的γδT细胞、工程化的NK细胞或NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞或工程化的MAIT细胞。在一些实施方式中，工程化的γδT细胞、工程化的NK细胞或NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞或工程化的MAIT细胞占分离的细胞群中细胞总数的大于2％(例如2％至100％，10％至95％，20％至90％，30％至80％，40％至70％，例如大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、96％、97％、98％或99％)。

在另一方面，本发明提供了一种分离的细胞群，其包括多个任一前述实施方式的工程化的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞。工程化的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞的群可以占分离的细胞群中细胞总数的大于2％(例如2％至100％，10％至95％，20％至90％，30％至80％，40％至70％，例如大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、96％、97％、98％或99％)。在一些实施方式中，分离的细胞群包括至少十个任一前述实施方式的工程化的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞。

在另一方面，本发明包括一种包含异源多核苷酸的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞。异源多核苷酸可以编码异源靶向构建体，该异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至抗原结合结构域的跨膜结构域，其中异源靶向构建体不直接激活工程化的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞。

在又另一方面，本发明提供了一种γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞MAIT细胞，其包含编码包括抗原结合结构域和末端跨膜结构域的靶向构建体的异源多核苷酸。

任何前述实施方式的工程化的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞；分离的工程化的γδT细胞群、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞群；或包含异源多核苷酸的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞可以在通过过继性细胞疗法治疗受试者的方法中使用(例如用于通过过继性细胞疗法治疗受试者的方法中)。

在另一方面，本发明提供了一种通过过继性细胞疗法(例如过继性T细胞疗法)治疗受试者的方法，包括向有需求的受试者给予治疗有效量任何前述实施方式的工程化细胞、分离的细胞群或细胞。

在另一方面，本发明提供了用于在通过过继性细胞疗法(例如过继性T细胞疗法)治疗受试者的方法中使用的任何前述实施方式的工程化的细胞、分离的细胞群或细胞，其中所述方法包括向有需求的受试者给予治疗有效量任何前述实施方式的工程化的细胞、分离的细胞群或细胞。

在任何前述方面的一些实施方式中，受试者是人类。例如，受试者可以是人类癌症患者(例如正在接受实体瘤治疗的人类癌症患者)。或者，所述人类患者可以是接受病毒感染治疗的人类患者。

附图说明

图1是示出经典嵌合抗原受体(CAR)以及不包括细胞内结构域的异源靶向构建体一个实施方式的示意图。

图2A-图2C是一系列示意图，示出如何使用针对所需靶标量身定制的各种细胞外结构域来修饰异源靶向构建体。图2A示出广义的细胞外结构域，其可以是例如B细胞受体、抗体支架或模拟物、scFv、mAb、Fab或T细胞受体。图2B示出作为配体特异性受体的细胞外结构域。图2C示出作为受体特异性配体的细胞外结构域。

图3A和图3B是流式细胞术直方图。图3A示出转导的Vδ1细胞上没有细胞内结构域(“非信号或nsCAR”)的抗CD19靶向构建体以及全长抗CD19 CAR的表达。图3B示出未转导的(UTD；顶行)、用非信号CD19 CAR转导的(中间行)和用CD19 CAR转导的(底行)Vδ1细胞上NCR(天然细胞毒性受体)NKp30(左列)、NKp44(中间列)和NKG2D(右列)的表达。

图4A-图4C是显示Nalm-6和B细胞上的CD19表达(图4A)和在1:1效应物与靶比例下16小时杀伤测定的结果的图(图4B和图4C)。图4B示出CD19+Nalm-6细胞的杀伤，并且图4C示出原代B-ALL细胞的杀伤。示出两个独立的供体和实验。

图5A和图5B是示出Vδ1细胞上抗GD2非信号传导CAR表达的图(图5A)以及显示单独或在Vδ1细胞存在下Kelly细胞系生长的60小时时间过程的图(图5B)。数据表示为每个图像的绿色物体计数的数量的变化，其已相对于时间为零时每个图像的绿色物体计数的数量进行归一化。每个数据点代表一式三份的孔。

具体实施方式

本文公开了表达异源靶向构建体的工程化的淋巴细胞(例如具有先天样效应物功能的淋巴细胞，如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、淋巴样细胞或粘膜相关恒定T细胞)的组合物。异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至抗原结合结构域的跨膜结构域(例如直接连接或通过茎结构域连接)。这些工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞)可以用于治疗如癌症或病毒感染等疾病。因为本发明的异源构建体缺乏能够传播T细胞激活的功能性胞内结构域，所以它们依赖γδT细胞的内源性MHC非依赖性激活途径特性，这在αβT细胞中是缺乏的。因此，本文所描述的异源构建体设计用于在淋巴细胞表面表达，例如γδT细胞(例如Vδ1细胞、Vδ2细胞、Vδ3细胞、Vδ5细胞和Vδ8细胞)。

定义

应当理解的是，本文所描述的本发明的方面和实施方式包括“包含”多个方面和实施方式、“由其组成”和“基本上由其组成”。如本文所使用的，除非另有说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该/所述(an)”包括复数引用。

如本文所使用的，术语“约”是指本技术领域技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的提及包括(并且描述了)针对该值或参数本身的实施方式。在一些情况下，“约”涵盖相对于指定值+20％的变化，在一些情况下+10％，在一些情况下+5％，在一些情况下+1％，或在一些情况下+0.1％，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。

如本文所使用的，术语“基本的”和“基本上”是指展现出所关注的特征或特性的全部或几乎全部范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)行进至完成和/或进行到完整或达到或避免绝对结果。因此，本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性不足。当描述物理场景时，例如受体/配体相互作用或细胞/细胞接触，如果其功能结果可通过执行该方法的人员可用的常规手段检测到，则该场景是基本的。例如，“基本TCR激活”是指细胞群中可检测水平的TCR激活(例如统计学上显著程度TCR激活)。在一些实施方式中，当暴露于各自细胞群体上高达0.1％、高达0.5％、高达1％、高达5％、高达10％、高达20％、高达30％或高达40％的TCR途径激动剂(例如抗体，例如抗CD3，或凝集素)的EC₅₀时，TCR被基本上被激活。

如本文所使用的，“异源靶向构建体”是指一种蛋白质或一组蛋白质(例如二聚化形成功能性季蛋白的两种或多种蛋白质)，其驻留在宿主细胞上(即工程化的细胞)并且结合存在于另一细胞上的靶分子，并且它不是其驻留的细胞天然表达的。异源靶向构建体可以由工程化细胞内表达的多核苷酸编码。

如本文所使用的，“激活”T细胞是指通过传播信号1激活或信号2激活来启动或放大T细胞受体(TCR)途径。例如，具有功能信号1T细胞激活结构域(例如CD3ζ)或共刺激结构域(例如CD28,4-1BB等)的嵌合抗原受体可通过响应于抗原结合而聚集，从而“激活”其宿主T细胞。缺乏功能性胞内结构域的异源靶向构建体可以无法传播信号1激活或信号2激活并因此不能够激活TCR途径。缺乏功能性胞内结构域的异源靶向构建体在其跨膜结构域传播共刺激时，例如在NKG2D跨膜结构域与内源性DAP10或DAP12结合后，可以能够“激活”表达它的T细胞。在替代实施方式中，本发明描述了具有非功能性跨膜结构域的异源靶向构建体，并且该异源靶向结构域不激活表达它的T细胞。

“T细胞受体(TCR)途径”的激活是指通过TCR信号诱导增殖或激活T细胞的其他后果。TCR信号途径涉及信号1激活，例如Src相关蛋白酪氨酸激酶(PTK)、Lck和Fyn以及70kDA(ZAP70)的的ζ链(TCR)相关蛋白激酶的顺序激活。这些PTK导致包括T细胞的接头激活剂(LAT)的多肽的磷酸化，这导致通过细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N末端激酶(JNK)和激活的T细胞的核因子(NFAT)的下游刺激。信号2(即共激活)例如通过CD28、CD45、DAP10或DAP12可以增强磷酸化并增强TCR活化。因此，靶向TCR或共刺激途径的一部分的任何分子均可以直接激活T细胞信号。简单地使T细胞与靶细胞接触的表面结合分子可以促进其他分子直接触发T细胞激活(例如异源靶向构建体)，但是这些靶向分子不会直接激活TCR途径。

TCR途径激动剂包括抗体(例如单克隆抗体，例如抗TCR Vδ1、抗TCRδTCS-1、抗TCRPANγδ和抗CD3)、凝集素(例如植物凝集素，例如伴刀豆球蛋白A，来自以下各项的的凝集素：菜豆(Phaseolus vulgaris)(PHA-P)、美洲商陆(Phytolacca Americana)、普通小麦(Triticum vulgaris)、小扁豆(Lens culinaris)、大豆(Glycine max)、山槐(Maackiaamurensis)、豌豆(Pisum sativum)和西洋接骨木(Sambucus nigra))、合成磷酸抗原(例如BrHPP(溴代醇焦磷酸盐)、2M3B1PP(2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸酯)、HMBPP((E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯)或IPP(异戊烯基焦磷酸酯))和N-双膦酸酯(例如唑来膦酸酵酯)。TCR途径激动剂包括共受体激动剂，包括抗体(例如单克隆抗体，例如抗CD2、抗CD6、抗CD9、抗CD28、抗CD43、抗CD94、抗CD160、抗SLAM、抗NKG2D、抗2B4、抗HLA-A、抗HLA-b、抗HLA-C和抗ICAM-3)和蛋白质(例如重组蛋白，例如重组人类蛋白，例如CD7L、CD26、CD27L、CD30L、CD40L、OX40L、4-1BBL、ICAM-1、纤连蛋白、氢化可的松及其变体，例如Fc-融合蛋白，例如CD27L-Fc)。TCR途径激动剂可以是可溶的或与膜结合的，并且可以例如存在于细胞上，如人工抗原呈递细胞(aAPC)，与MHC或HLA复合物一样。用于激活T细胞信号的合适的aAPC是本领域已知的。通过外源添加TCR途径激动剂激活T细胞的合适方法是本领域众所周知的，并且总结于Deniger,et al.(Deniger,et al.Frontiers in Immunology.2014.5(636):1-10)的图1中。

“外源TCR途径激动剂”是指不起源于非造血组织或其供体的TCR途径激动剂(即它们是外源添加的)。因此，需要理解的是，在本发明的一些实施方式中，TCR途径激动剂可以作为非造血组织的残留物质存在于培养物中(例如可溶性纤连蛋白或细胞结合的ICAM-1)。在一些实施方式中，残留的TCR途径激动剂的浓度可以忽略不计，并且基本上不激活T细胞。

对于在本文中要“可操作地连接到”另一结构域的蛋白质(如异源靶向构建体)的结构域，是指与该另一结构域驻留在同一蛋白质上，直接与该另一结构域相邻或被一个或多个氨基酸或结构域间隔开。例如，在具有N末端抗原结合结构域的异源靶向构建体中，中间茎结构域与C末端跨膜结构域、抗原结合结构域和跨膜结构域可以说是可操作地连接的。在紧邻C末端跨膜结构域具有N末端抗原结合结构域的异源靶向构建体中，抗原结合结构域和跨膜结构域也可以说是可操作地连接的，但更具体地是直接连接的。

如本文所使用的，“抗体支架”是指非天然抗原结合蛋白、肽或抗体片段。抗体支架包括Adnectins、亲和体、affilins、anticalins、atrimers、高亲和性多聚体(avimers)、双环肽、centyrins、半胱氨酸-结(cys-knots)、DARPins、fynomers、Kunitz结构域、Obodies和Tn3s。抗体支架在本领域中是已知的并且例如描述于Vazquz-Lombardi et al,DrugDiscovery Today,2015,20(10):1271-83中，通过引用将其全部内容并入本文。

术语“抗体”在最广义上使用并且具体地涵盖抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们具有所需的生物学活性即可。

如本文所使用的，术语“细胞毒性”是指免疫细胞(例如γδT细胞)杀伤其他细胞(例如靶细胞)的能力。具有细胞毒性功能的免疫细胞释放出能够杀伤附近细胞的毒性蛋白质(例如穿孔素和颗粒酶)。

如本文所使用的，术语“脱粒”是指一种细胞过程，其中包括抗微生物和细胞毒性分子在内的分子从称为颗粒的细胞内分泌囊泡中释放出来。脱粒是免疫细胞(例如细胞毒性T细胞)针对病原体和入侵微生物的免疫反应的一部分。脱粒过程中释放的分子因细胞类型而异，并且可以包括旨在杀伤入侵病原体和微生物或促进免疫反应(例如炎症)的分子。

如本文所使用的，术语“先天淋巴样细胞”是指缺乏重排的抗原受体(如由T和B细胞表达的抗原受体)的先天样淋巴细胞。先天淋巴样细胞包括NK细胞、1型先天淋巴样细胞(ILC1)、内ILC1细胞、2型先天淋巴样细胞(ILC2)、3型先天淋巴样细胞(ILC3)等。

如本文所使用的，术语“粘膜相关恒定T细胞”和“MAIT细胞”是指表达恒定T细胞受体α(TCRα)链和多样化TCRβ链并且可以在进化上保守的主要组织相容性复合物相关分子1(MR1)的背景下识别一组独特分子的先天样T细胞。

如本文所使用的，术语“NK细胞”是指自然杀伤细胞，一种不表达TCR或CD3且对CD56和CD161表达呈阳性的先天样淋巴细胞。NK细胞也可以表达天然细胞毒性受体，例如NKp44和NKp46。

如本文所述，术语“NK样T细胞”是指自然杀伤样T细胞或自然杀伤T细胞(NKT细胞)，是表达与T细胞和NK细胞共享的功能和结构特性的先天样淋巴细胞，即它们表达TCR(例如αβTCR)、CD3和CD56。NK样T细胞在MHC I类样糖蛋白CD1d的背景下识别糖脂并与之反应，并在激活后可产生IFN-γ和IL-4。

如本文所使用的，“非造血细胞”包括基质细胞和上皮细胞。基质细胞是任何器官的非造血结缔组织细胞，并支持该器官的基本细胞的功能。基质细胞的例子包括成纤维细胞、周细胞、间充质细胞、角质形成细胞、内皮细胞和非血液肿瘤细胞。上皮细胞是非造血细胞，排列在全身血管和器官的腔和表面。它们通常为鳞状、柱状或立方形，可以布置为单层细胞，也可以布置为两个或多个细胞层。

如本文所使用的，“非造血组织驻留γδT细胞”、“非造血组织来源的”和“非造血组织原生γδT细胞”是指在组织移出时存在于非造血组织中的γδT细胞。非造血组织驻留γδT细胞可以从任何合适的人类或非人类动物非造血组织获得。非造血组织是除血液或骨髓以外的组织。在一些实施方式中，γδT细胞不是从特定类型的生物液体样本(例如血液或滑液)中获得。这种合适的人类或非人类动物非造血组织的例子包括皮肤或其一部分(例如真皮或表皮)、胃肠道(例如胃肠道上皮、结肠、小肠、胃、阑尾、盲肠或直肠)、乳腺组织、肺(优选其中组织不是通过支气管肺泡灌洗获得的)、前列腺、肝脏和胰腺。在一些实施方式中，非造血组织驻留γδT细胞可以来源于淋巴样组织，例如胸腺、脾脏或扁桃体。γδT细胞也可以驻留在人类癌症组织中，例如乳腺和前列腺。在一些实施方式中，γδT细胞不是从人类癌症组织获得的。非造血组织样品可通过标准技术获得例如通过外植(例如活检)。非造血组织驻留γδT细胞包括例如Vδ1T细胞、双重阴性(DN)T细胞、Vδ2T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。

上述因素中的任何一种或多种可以以有效产生扩增的淋巴细胞(例如γδT细胞)群的量包括在扩增方案中，可以使用编码本发明的异源靶向构建体的核酸转染所述淋巴细胞。如本文所使用的，短语“有效于……的量”是指导致可检测结果的量(例如，相对于起始群，具有统计学意义的数量增加的细胞数量，例如p<0.05)。在一次存在多个因素的情况下，有效量是指所有因素的复合效应(例如IL-2和IL-15的复合效应，或IL-2、IL-4、IL-15和IL-21的复合效应)。

如本文所使用的，“扩增的γδ细胞群”指的是包括γδT细胞的造血或非造血细胞群，所述γδT细胞已在一定条件下持续培养一段时间以诱导了γδ细胞的扩增(即增加γδ细胞数量)。同样地，如本文所使用的，“扩增的Vδ1T细胞群”是指包括Vδ1T细胞的造血或非造血细胞群，所述Vδ1T细胞已经在一定条件下持续培养一段时间以诱导了Vδ1T细胞的扩增(即增加Vδ1T细胞数量)。

如本文所使用的，“饲养细胞”指添加到培养物中以向非造血组织来源的细胞提供细胞间表面接触的任何外源细胞。饲养细胞可以是原代细胞(例如来自组织)或衍生自细胞系。饲养细胞可以是活的或辐射的，包括肿瘤细胞、成纤维细胞、B细胞和其他抗原呈递细胞。

本文中的术语“标志物”是指DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、糖脂或基于细胞的分子标志物，可以通过标准方法(或本文公开的方法)检测其在患者样品中的表达或存在。

“表达”目标标志物的细胞或细胞群是在细胞或群中确定存在编码所述蛋白质的mRNA或蛋白的质本身(包括其片段)的细胞或细胞群。可以通过多种方法检测标志物的表达。例如，在一些实施方式中，标志物的表达是指细胞上标志物的表面密度。例如，将用作流式细胞仪读数的平均荧光强度(MFI)代表了细胞群上标志物的密度。本领域技术人员可以理解的是，MFI值取决于染色参数(例如浓度、持续时间和温度)和荧光染料组成。然而，在适当的对照范围内考虑时，MFI可以是定量的。例如，相对于在相同条件下染色的相同细胞群上适当同种型对照抗体的MFI，如果针对一标志物的抗体的MFI显著更高，则可以说该细胞群表达所述标志物。另外地或可替代地，根据常规流式细胞仪分析方法使用正门和负门，可以说细胞群逐个细胞地表达标志物(例如通过根据同种型或“荧光减一”(FMO)对照设置门)。通过这种度量，如果检测到标志物阳性的细胞数量明显高于背景，则可以说群“表达”了所述标志物(例如通过在同种型对照上进行门控)。

如本文所使用的，当将某个群的表达表示为阳性细胞的百分比并将该百分比与参考群的相应阳性细胞百分比进行比较时，该百分比差就是每个相应群的亲本群的百分比。例如，如果标志物在群A的10％的细胞上表达，并且同一标志物在群B的1％的细胞上表达，则可以说群A的标志物阳性细胞的频率比群B大9％(即10％-1％，不是10％÷1％)。当频率乘以亲本群中的细胞数时，将计算出绝对细胞数的差。在上面给出的示例中，如果群A中有100个细胞，而群B中有10个细胞，那么群A的细胞数是群B的100倍即(10％x 100)÷(1％x10)。

标志物的表达水平可以是核酸表达水平(例如DNA表达水平或RNA表达水平，例如mRNA表达水平)。可以使用确定核酸表达水平的任何合适的方法。在一些实施方式中，使用qPCR、rtPCR、RNA-seq、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、基因表达的系列分析(SAGE)、MassARRAY技术、原位杂交(例如FISH)或它们的组合来确定核酸表达水平。

如本文所使用的，细胞的“参考群”是指对应于目标细胞的细胞群，相对于该细胞群来测量目标细胞的表型。例如，可以将分离的非造血组织来源的γδ细胞群上的标志物表达水平与相同标志物在造血组织来源的γδT细胞(例如血液驻留γδ细胞，例如来自相同供体或供体的血液驻留γδ细胞)或在不同条件下(例如在基本TCR激活的存在下，在外源TCR活化剂(例如抗CD3)存在下或与基质细胞(例如成纤维细胞)基本接触)扩增的非造血组织来源的γδT细胞上的表达水平进行比较。也可以将一个群与其自身早期状态进行比较。例如，参考群可以是扩增之前的分离的细胞群。在这种情况下，将扩增后的群与扩增步骤之前其自身的组成进行比较，即在这种情况下，其过去的组成是参考群。

“癌症”是指恶性癌细胞的异常增殖并且包括造血癌症(例如血液系统恶性肿瘤，例如白血病，如急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)、骨髓增生异常综合症(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)，淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM))，和实体癌，如肉瘤(例如软组织肉瘤、子宫肉瘤)、皮肤癌、黑色素瘤(例如恶性黑色素瘤)、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、大肠癌(例如大肠腺癌)、宫颈癌、肝癌(即肝癌)、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌)、食道癌、胰腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肾上腺癌、胃癌、胃部癌(例如胃腺癌)、睾丸癌、胆囊和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、脑癌、胆道癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑肿瘤、宫颈癌、结肠癌、胶质瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞肿瘤、原发性甲状腺癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮癌和子宫癌。癌症患者中的癌细胞可以在免疫学上不同于正常个体中的体细胞(例如癌性肿瘤可以是免疫原性的)。例如，癌细胞可以能够在癌症患者中引发针对癌细胞表达的一种或多种抗原的全身免疫反应。引发免疫反应的抗原可以是肿瘤抗原或可以被正常细胞共享。患有癌症的患者可以会显示至少一个可识别的体征、症状或实验室发现，其足以根据本领域已知的临床标准进行癌症诊断。此类临床标准的示例可在医学教科书中找到，如Harrison’sPrinciples of Internal Medicine(Longo DL,Fauci AS,Kasper DL,Hauser SL,JamesonJ,Loscalzo J.eds.18e.New York,NY:McGraw-Hill；2012)。在一些情况下，诊断个体中的癌症可以包括识别从个体获得的体液或组织的样品中的特定细胞类型(例如癌细胞)。

如本文所使用的，“实体瘤”是除血液、骨髓或淋巴系统以外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞起源的实体瘤和非上皮细胞起源的实体瘤。上皮细胞实体瘤的例子包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、唇、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤和骨瘤。

适合如上所述治疗的患者、受试者或个体可以是哺乳动物，如啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长类动物、类人猿(例如猴子或猿)、猴(例如狨猴或狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿)或人类。

在一些实施方式中，患者、受试者或个体是人类。在其他优选的实施方式中，可以使用非人类哺乳动物，尤其是常规用作证明人类治疗功效的模型的哺乳动物(例如鼠、灵长类、猪、犬或兔)。

如本文所使用的，“治疗”(及其语法变体，例如“治疗(treat)”或“处置(treating)”)指对人类或动物的临床干预(例如在兽医应用中)，其中达到了某些所需的治疗效果，例如病情进展的抑制或延迟，并且包括进展速率降低，进展速率停止，病情改善，病情的治愈或缓解(部分或全部)，预防、延迟、减轻或阻止病情的一种或多种症状和/或指征，或将受试者或患者的生存期延长超出在没有治疗情况下预期的时间。

还包括作为预防措施(即预防法)的治疗。例如，可以如本文所述治疗易患癌症或有癌症发生或再次发生风险的患者、受试者或个体。这种治疗可以预防或延迟患者、受试者或个体中癌症的发生或再发生。

特别地，治疗可以包括抑制癌症生长(包括完全缓解癌症)和/或抑制癌症转移。癌症生长通常是指许多指标中的任何一个，这些指标表明癌症内的变化为更发达的形式。因此，衡量癌症生长抑制的指标包括癌细胞存活率降低、肿瘤体积或形态减小(例如使用计算机断层摄影术(CT)、超声检查或其他成像方法确定)、肿瘤生长延迟、肿瘤脉管系统破坏、改善了迟发型超敏反应皮肤测试的性能、溶细胞性T淋巴细胞活性增加和肿瘤特异性抗原水平降低。减少个体中癌性肿瘤中的免疫抑制可以提高个体抵抗癌症生长的能力(特别是已经存在该受试者中的癌症的生长)和/或降低个体中癌症生长的倾向。

在一些实施方式中，给予扩增的γδT细胞(例如非造血组织来源的γδT细胞，例如非造血组织来源的Vδ1T细胞)以延缓疾病的发展或减缓疾病或病症的进展。

如本文所使用的，“给予”是指给予患者一定剂量的疗法(例如过继性T细胞疗法，包括例如非造血组织来源的γδT细胞)或组合物(例如药物组合物，例如包括非造血组织来源的γδT细胞的药物组合物)的方法。本文所描述的方法中使用的组合物可以例如肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、眼眶内、玻璃体内(例如通过玻璃体内注射)、通过滴眼、口服、局部、经皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接沐浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、乳脂或脂质组合物给予。本文所描述的方法中使用的组合物也可以全身或局部给予。给予方法可因各种因素(例如正在给予的治疗剂或组合物以及所治疗病情、疾病或病症的严重程度)而异。

“治疗有效量”是指用于治疗或预防哺乳动物的疾病或病症的治疗剂的量。在癌症的情况下，治疗剂(例如非造血组织来源的γδT)的治疗有效量可以减少癌细胞数量；减少原发肿瘤大小；抑制(即一定程度的减缓且优选停止)癌细胞渗入周围器官；抑制(即一定程度的减缓且优选停止)肿瘤转移；一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与疾病相关的一种或多种症状。在某种程度上，该药物可阻止生长和/或杀伤现有的癌细胞，其可以抑制细胞生长和/或具有细胞毒性。对于癌症疗法，例如可以通过评估生存时间、疾病进展时间(TTP)、缓解率(例如完全缓解(CR)和部分缓解(PR))、反应持续时间和/或生活质量来衡量体内疗效。

术语“同时”在本文中用于指两种或多种治疗剂的给予，其中至少一部分给予时间重叠。因此，同时给予包括停止施用一种或多种其他药剂后继续施用一种或多种药剂的给予方案。例如，在一些实施方式中，非造血组织来源的γδT细胞和IL-2可以同时给予。

术语“药物组合物”是指一种制剂，其形式应能使其中所含的一种或多种活性成分的生物活性有效，并且不含对施用该配方的患者具有不可接受的毒性的附加成分。

如本文所使用的，“末端跨膜结构域”是指具有未连接末端端部(例如未与肽或蛋白质连接的C末端)的跨膜结构域。因此，末端跨膜结构域没有连接至细胞内结构域，如细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，末端跨膜结构域不参与细胞内信号途径(例如T细胞信号途径，例如信号1激活或信号2共刺激)。

如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指一种重组多肽构建体，其包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和传播激活细胞的激活信号的细胞内结构域。在一些实施方式中，所述CAR包括在CAR融合蛋白N端的可选前导序列。

如果本文阐述的定义与通过引用并入本文的任何参考文献中提供的定义之间存在任何冲突或不一致，以本文阐述的定义为准。

γδT细胞和表达异源靶向构建体的其他先天样淋巴细胞

淋巴细胞如γδT细胞和其他先天样淋巴细胞(例如先天淋巴样细胞，如NK细胞和NK样T细胞，以及粘膜相关恒定T(MAIT)细胞)是用于本文所描述的异源靶向构建体的有吸引力的载体，因为它们可以用异源靶向构建体进行转导，同时保留了它们识别如癌细胞和感染细胞等病原细胞的先天样能力。可以使用本领域已知的或本文描述的任何合适的方法进行转导，方法如通过电穿孔、基因编辑(例如通过成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)、锌指核酸酶(ZFN)转染)、转座子传递等。另外，例如通过γδT细胞缺乏MHC依赖性抗原识别降低了移植物抗宿主疾病的可能性，并使它们能够靶向表达低水平MHC的肿瘤。同样地，γδT细胞对常规信号2共刺激的不依赖性(例如通过CD28的接合)增强了对表达低水平共刺激受体配体的肿瘤的靶向。

在一个方面，本发明提供了γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞和MAIT细胞以及它们的细胞群，其在表面上表达异源靶向构建体。经工程化以表达异源靶向构建体的此种γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞和MAIT细胞可用于通过异源构建体上的抗原结合结构域靶向所需抗原。与用作常规(例如αβ)T细胞过继性免疫治疗方案的一部分的常规嵌合抗原受体(CAR)系统相比，因为γδT细胞不依赖于MHC受体而响应外源病原体，因此异源靶向构建体不需要细胞内结构域来诱导细胞溶解或细胞毒性。取而代之的是，γδT细胞引起内在的靶特异性细胞溶解，并且通过使用异源构建体改善和增加与靶细胞(例如肿瘤，例如实体瘤)的接触时间而可以进一步增强这种响应。使用异源构建体工程化的γδT细胞可以结合靶抗原，例如肿瘤相关抗原，并诱导细胞毒性和/或细胞溶解。这种细胞毒性可以通过内源性表达激活受体(例如NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46和/或DNAM1)来介导。

异源靶向构建体可以提供细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至抗原结合结构域的跨膜结构域。茎结构域可以进一步被包括作为异源靶向构建体的一部分以将抗原结合结构域连接至跨膜结构域。在一些实施方式中，本文提供的异源靶向构建体缺乏细胞内结构域(图1)并还缺乏激活TCR信号的能力(例如通过信号1激活和/或信号2激活(即共刺激))。

在一些实施方式中，细胞溶解的特征是γδT细胞的脱粒(例如CD107脱粒)、γδT细胞的颗粒酶释放、γδT细胞的穿孔素释放、靶细胞杀伤、γδT细胞的增殖或γδT细胞的细胞因子生产。本领域技术人员将认识到，测量这些特性或活性的各种测定法可用于评估工程化T细胞的功效，例如在治疗癌症中的功效。

通常，脱粒是细胞溶解的先决条件。例如，可以通过LAMP-1的表面表达来识别脱粒细胞(溶酶体相关膜蛋白1，也称为CD107)。CD107在表面瞬时表达并在脱粒后迅速内在化。在非激活状态下，CD107a驻留在溶细胞颗粒膜的细胞质中。可以通过在莫能菌素存在下(以防止抗体标记的内含CD107a的囊泡酸化)对CD107染色来测量上调(例如通过FACS)。

根据本领域已知的方法，还通过FACS测量了穿孔素和颗粒酶的测定。细胞毒性γδT细胞通过颗粒或受体介导的机制杀伤其靶。细胞毒性颗粒是在含有裂解蛋白(穿孔素和颗粒酶)的细胞质中预先形成的分泌性溶酶体。靶细胞被识别后，通过胞吐作用分泌裂解蛋白。因此，一旦靶细胞被识别，即可以通过FACS来测量细胞内颗粒酶和/或穿孔素水平的降低。

细胞杀伤测定可以用来监测表达异源靶向构建体的γδT细胞的效果。动力学靶细胞裂解测定可用于追踪在各种效应物与靶的比率下随时间推移的杀伤百分比。终点靶细胞裂解测定(例如萤光素酶测定)可以用来追踪在特定终点时间在各种效应物与靶的比率下的杀伤百分比。免疫突触形成(例如通过活细胞成像观察)可以用来测量结合动力学、靶识别(例如效应细胞中的Ca通量)、致死冲击(例如在靶细胞中通过碘化丙啶腮红测量)或靶细胞舍入。

在一些实施方式中，抗原结合结构域与健康细胞上表达的靶抗原的结合基本上不触发通过工程化的γδT细胞的细胞溶解。在一些实施方式中，抗原结合结构域与肿瘤细胞或受感染的细胞上表达的靶抗原的结合显著触发通过工程化的γδT细胞的细胞溶解。

在一个方面，本发明提供了一种工程化以表达异源靶向构建体的细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)，其中工程化的细胞表现出抗肿瘤特性。在一个方面，用异源靶向构建体转染(例如通过核转染、电穿孔等)细胞并且异源靶向构建体表达在所述细胞表面上。使用编码异源靶向构建体的病毒载体转导所述细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)。在一些实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施方式中，所述细胞可以稳定表达异源靶向构建体。在另一实施方式中，使用编码异源靶向构建体的核酸(例如mRNA、cDNA、DNA)转染(例如通过核转染、电穿孔等)所述细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)。在一些实施方式中，所述细胞可以瞬时表达异源靶向构建体。

在一个方面，本发明提供了一种工程化的γδT细胞的细胞群(例如分离的细胞群)(例如至少10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个细胞)，其中所述细胞群的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)是表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞。

可替代地，本发明提供了一种工程化的NK细胞或NK样T细胞的细胞群(例如分离的细胞群)(例如至少10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个NK细胞或NK样T细胞)，其中所述细胞群的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)被工程化以表达异源靶向构建体。

可替代地，本发明提供了一种工程化的先天淋巴样细胞的细胞群(例如分离的细胞群)(例如至少10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个NK细胞或NK样T细胞)，其中所述细胞群的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)被工程化以表达异源靶向构建体。可替代地，本发明提供了一种工程化的MAIT细胞的细胞群(例如分离的细胞群)(例如至少10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个NK细胞或NK样T细胞)，其中所述细胞群的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或基本上全部)被工程化以表达异源靶向构建体。

异源靶向构建体

可以修饰各种类型的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞以包括异源靶向构建体以产生工程化的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞。异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。例如，异源靶向构建体可以包括通过1-1,000个氨基酸残基(例如通过1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-250、250-500或500-1,000个氨基酸残基)可操作地连接至跨膜结构域的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域通过茎结构域连接至跨膜结构域。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域、茎结构域和跨膜结构域以N-至-C末端取向可操作地连接(例如N-抗原结合结构域—茎结构域—跨膜结构域-C)。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域、茎结构域和跨膜结构域以N-至-C末端取向可操作地连接。

一般而言，本文公开的异源靶向构建体不具有细胞内信号传导结构域的特异性抗体的抗原结合结构域。相比于不具有功能性胞内结构域就无效的工程化的αβT细胞(例如CAR T细胞)(Ghosh et al.,Nat.Med.,23:242-251,2017；Whilding et al.Mol.Ther.,25:259-273,2017；和Wilkie et al.J.Biol.Chem.,285:25538-25544,2010)，可以通过不具有功能性胞内结构域的异源靶向构建体来介导先天样淋巴细胞(如γδT细胞)的激活。本领域技术人员将理解，该多肽可以含有非功能性细胞内氨基酸残基，例如作为跨膜结构域的延伸，其不会直接激活工程化的T细胞。例如，在一些方面，跨膜结构域出于结构、稳定性和/或表达目的而可以包括额外残基，或可以具有非功能性胞内结构域。在一些实施方式中，所述C末端跨膜结构域的残基不超过50％(例如不超过45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)驻留在细胞内。

抗原结合结构域

抗原结合结构域可以是经工程化以特异性地结合靶的抗体或抗体片段。抗原结合结构域可以采取各种结构的形式，例如B细胞受体、抗体支架或模拟物(例如亲和体、affilin、anticalin、适体、atrimer、DARPin、FN3支架、fynomer、Kunitz结构域、粘连蛋白、Obody、双环肽、半胱氨酸-结等)、单链可变片段(scFv)、单克隆抗体(mAb)、抗原结合片段(Fab)或T细胞受体(TCR)(图2A)。抗原结合结构域可以结合靶，如肿瘤相关抗原(TAA；例如在实体瘤上表达的TAA)。TAA可以是例如在肿瘤细胞表面表达的蛋白质或肽抗原。可替代地，TAA包括在肿瘤细胞表面表达的碳水化合物或神经节苷脂。在一些实施方式中，TAA是免疫抑制抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域是配体特异性受体，如图2B所示。在一些实施方式中，抗原结合结构域是受体特异性配体，如图2C所示。

在一个方面，异源靶向构建体的靶结合部分是scFv。在一个方面，此类抗体片段之所以是功能性的是因为它们保留了等效的结合亲和力，例如它们结合相同抗原的功效与产生该抗原的IgG抗体相当。可替代地，可以根据需要对它们进行工程化以增强结合亲和力或减弱结合亲和力，例如基于靶抗原的表达密度，实现最佳的结合动力学(例如亲和力)。在一个方面，此种抗体片段之所有是功能性的是因为它们提供了生物学响应，可以包括但不限于激活免疫反应、抑制源自其靶抗原的信号转导、激酶活性的抑制等，如本领域技术人员将理解的。

在一个方面，异源靶向构建体的抗原结合结构域是鼠scFv抗体片段。在另一方面，异源靶向构建体的抗原结合结构域是与衍生其的scFv鼠序列相比被人源化的scFv抗体片段。小鼠scFv的人源化可以是临床环境需要的，其中小鼠特异性残基可以在接受工程化T细胞治疗的患者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)反应。

在一个方面，异源靶向构建体的抗原结合结构域部分由转基因编码，该转基因的序列已经经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一个方面，本发明的整个异源靶向构建体由具有经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达的序列的转基因编码。密码子优化是指发现编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中存在偏重。这种密码子简并性允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法，这两者都通过引用以其全部内容并入本文。

在一个方面，本发明的异源靶向构建体包含靶特异性结合元件抗原结合结构域。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，抗原结合结构域可以经选择以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。可以充当本发明的异源靶向构建体中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的例子包括与癌症以及病毒、细菌、寄生虫感染相关的那些。

在一个方面，通过工程化特异性地将所需抗原结合到异源靶向构建体中的抗原结合结构域，可以将异源靶向构建体-介导的T细胞响应指向目标抗原。抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体以及它们的功能化片段，包括但不限于单结构域抗体，如骆驼科动物源性纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域，以及本领域已知发挥抗原结合结构域作用的替代性支架，如重组纤连蛋白结构域等。在某些情况下，抗原结合结构域来源于最终将在其中使用异源靶向构建体的相同物种是有益的。例如，对于在人类中使用，可以有益的是异源靶向构建体的抗原结合结构域包括抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人类或人源化残基。

在本发明任何方面的一些实施方式中，异源靶向构建体包含是人源化抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域。可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，包括但不限于CDR移植(参见例如欧洲专利号EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其各自通过引用以其全部内容并入本文)、镶面或表面重修(参见例如欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596，其各自通过引用以其全部内容并入本文)、链混排(参见例如美国专利号5,565,332，通过引用将其全部内容并入本文)和例如美国专利申请公开号2005/0042664、美国专利申请公开号2005/0048617、美国专利号6,407,213和5,766,886以及国际公开号WO 93/17105中公开的技术，其各自通过引用以其全部内容并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变(例如改善)抗原结合。通过本领域众所周知的方法识别这些框架取代，例如通过对CDR与框架残基的相互作用进行建模以识别对抗原结合很重要的框架残基，并进行序列比较以识别特定位置的异常框架残基。参见例如美国专利号5,585,089，通过引用将其全部内容并入本文。

人源化抗体或抗体片段中存在一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，通常取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包括来自非人类免疫球蛋白分子和框架区的一个或多个CDR，其中包含所述框架的氨基酸残基完全或主要源自人类种系。用于将抗体或抗体片段人源化的多种技术是本领域众所周知的，并且基本上可以按照Jones et al.,Nature,1986,321:522-525；Riechmann et al.,Nature,1988,332:323-327；和Verhoeyen et al.,Science,1988,239:1534-1536的方法来进行，它们的每一篇均通过引用以其全部内容并入本文，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人类抗体的相应序列，即CDR移植。在此类人源化抗体及其抗原结合片段中，基本上少于完整的人类可变结构域已被来自非人类物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人类抗体，其中一些CDR残基和可以的一些框架(FR)残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。

在一些方面，将本发明的包括抗体片段的异源靶向构建体的部分人源化，同时保留了对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，人源化抗体和抗体片段是通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产品进行分析的方式来制备的。三维免疫球蛋白模型是普遍可用的，并且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可以三维构象结构的计算机软件是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可以作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现所需的抗体或抗体片段特性，如增加对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最基本地参与影响抗原结合。

在某些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如Bird et al.,Science,1988,242:423-426和Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85:5879-5883；其各自通过引用以其全部内容并入本文)。可通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来生产ScFv分子。scFv分子包括具有最佳长度和/或氨基酸组成的接头(例如Ser-Gly接头)。接头长度会大大影响scFv可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果使用较短的多肽接头(例如5-10个氨基酸)，则防止了链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区集合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的例子，参见例如Hollinger etal.Proc Natl Acad.Sci.USA,1993,90:6444-6448；美国公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794以及国际专利公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715，它们通过引用并入本文。

scFv可以在其VL和VH区之间包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基的接头。在一些实施方式中，所述接头序列包括氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一实施方式中，所述接头序列包括多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(GGGGS)n，其中n是等于或大于1的正整数(例如1、2、3、4、5或更大)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在结合和活性方面产生优异的功效。

本发明的工程化的γδT细胞对靶细胞的细胞溶解动力学部分地取决于抗原结合结构域的结合亲和力。可以按需根据已知方法修饰任何本文提供的抗原结合结构域以增强或降低对特定靶的结合亲和力。在一些实施方式中，抗原结合结构域对其抗原的结合亲和力或解离常数(K_D)为10^-4M至10^-10M(例如通过表面等离振子共振，例如BIAcore，在标准生理温度和压力下测量，例如为10^-4M至10^-5M、10^-5M至10^-6M、10^-6M至10^-7M、10^-7M至10^-8M、10^-8M至10^-9M、10^-9M至10^-10M，例如10^-5M至10^-9M、10^-5M至10^-8M、10^-5M至10^-7M、10^-5M至10^-6M、10^-6M至10^-10M、10^-6M至10^-9M、10^-6M至10^-8M、10^-6M至10^-7M、10^-7M至10^-10M、10^-7M至10^-9M、10^-7M至10^-8M、10^-8M至10^-10M、10^-8M至10^-9M，或10^-9M至10^-10M)。

除了工程化的γδT细胞的抗原结合结构域对靶细胞的结合亲和力之外，亲和力相互作用在有效结合和随后裂解靶细胞中也起作用。亲和力由(a)抗原结合结构域的结合亲和力和(b)沿T细胞与靶之间给定界面的抗原结合结构域与抗原之间的相互作用数决定。在一些实施方式中，工程化的γδT细胞在其表面上含有10²至10⁶个抗原结合结构域(例如10²至10³、10³至10⁴、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10²至10⁴、10²至10⁵、10³至10⁴、10³至10⁵、10³至10⁶、10⁴至10⁵、10⁴至10⁶或10⁵至10⁶个抗原结合结构域)。

茎结构域

本发明的异源靶向构建体可以包括位于跨膜结构域和细胞外抗原结合结构域之间的茎结构域。在一些实施方式中，茎结构域包括从CD8茎、IgG铰链-重恒定(CH)结构域(例如IgG1铰链-CH₂结构域、IgG1铰链-CH₃结构域或IgG1铰链-CH₂-CH₃结构域)、(G₄S)₃铰链、IgG1铰链、CD7茎、IgD铰链-CH₂结构域、IgD铰链-CH₃结构域、IgD铰链-CH₂-CH₃结构域、IgG4铰链-CH₂结构域、IgG4铰链-CH₃结构域、IgG4铰链-CH₂-CH₃结构域或FcεRI茎中选择的结构域中的一个或多个。茎可以在细胞外结构域和跨膜结构域之间提供柔韧性，并有助于靶识别。本领域技术人员将理解，茎结构域可以包括邻近细胞外或跨膜区的一个或多个附加氨基酸，例如与衍生出茎的蛋白质的细胞外或跨膜区相关的一个或多个氨基酸(例如细胞外或跨膜区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。茎可以可选地包括一个或多个接头，如(GGGGS)_n或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)。

跨膜结构域

在本发明任何文献的各实施方式中，可以将异源靶向构建体设计为包括与细胞外结构域附接的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与所述跨膜区相邻的一个或多个附加氨基酸，例如与衍生出所述跨膜的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)和/或与衍生出所述跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个附加氨基酸(例如所述细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10到至多15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与异源靶向构建体的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在某些情况下，跨膜结构域可以经选择或通过氨基酸取代进行修饰以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如尽量减少与受体复合物的其他成员的相互作用。因此，在某些情况下，跨膜结构域基本上不会传播信号1激活和/或信号2激活(共刺激)。

可替代地，可以选择跨膜结构域结合其他蛋白质，诱导其他蛋白质的聚簇，激活、磷酸化、去磷酸化或以其他方式与其他蛋白质相互作用的能力(所述其他蛋白质例如为内源性蛋白，例如内源性膜相关蛋白，例如跨膜蛋白)。例如，在一些实施方式中，跨膜结构域可以与共刺激蛋白相关联，从而通过传播信号2共刺激信号直接激活细胞(例如γδT细胞)。在特定的实施方式中，跨膜结构域源自NKG2D的跨膜部分，其可以与内源表达的DAP10相关联以传播宿主细胞的信号2激活(共刺激)。在这种情况下，异源靶向构建体不具有能够激活所述细胞的功能性胞内结构域。例如，异源靶向构建体可以不具有细胞内结构域，或者其可以含有惰性细胞内结构域，其不传输信号1或信号2激活。例如，可以通过招募或与内源性共刺激分子相关联而传播信号2的跨膜结构域可以是末端跨膜结构域(例如没有附接至其末端之一的附加结构域)。

在一个方面，跨膜结构域能够与γδT细胞表面上的另一异源靶向构建体异二聚或同二聚。在不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代以便最小化与相同工程化T细胞中存在的天然结合伴侣的结合结构域的相互作用。

跨膜结构域可以源自天然或重组来源。在来源是天然的情况下，所述结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD18、CD22、CD29、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD94、CD134、CD137、CD154、CD7、CD3ζ、CD71、Fcγ受体(FcγR)或NKG2D的α、β或ζ电链的跨膜区。在一些实施方式中，跨膜结构域可以包括例如CD8跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是末端跨膜结构域(例如没有附接至其末端之一的附加结构域)。

在某些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如来自人类蛋白质的铰链)附接至异源靶向构建体的细胞外区域，例如异源靶向构建体的抗原结合结构域。例如，在一个实施方式中，所述铰链可以是人类Ig(免疫球蛋白)铰链，例如IgG1铰链、IgG4铰链、IgD铰链或CD8α铰链。

在一个实施方式中，跨膜结构域是重组的，在此种情况下，其将主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，在重组跨膜结构域的每个端端可以发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

可选地，较短的多肽接头(例如长度为2至10个氨基酸)可以形成异源靶向构建体的跨膜结构域与胞质区之间的连接。适合接头的一个例子是甘氨酸-丝氨酸双联体。例如，在一个方面，所述接头包括氨基酸序列(GGGGS)_n或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)。

收获和扩增γδT细胞的方法

本发明的工程化的γδT细胞可以来源于任何合适的自体或同种异体γδT细胞或其群。在一些实施方式中，用作本文工程化的γδT细胞的来源的适合γδT细胞包括Vδ1细胞、Vδ2细胞、Vδ3细胞、Vδ5细胞和Vδ8细胞。在一些实施方式中，工程化的γδT细胞的群来源于Vδ1细胞、Vδ3细胞、Vδ5细胞或Vδ8细胞的群。

例如，本文提供了从非造血组织(例如皮肤或肠)中分离和扩增Vδ1细胞的方法。例如，Vδ1细胞可以分离自人体皮肤活检，如U.S.2018/0312808所述，其通过引用整体并入本文并且特别地是从组织分离Vδ1细胞的方法。

在其他实施方式中，适合的γδT细胞可以来源于血液(例如外周血)。从血液分离和扩增Vδ1细胞的方法包括例如美国专利号9,499,788和国际专利公开号WO 2016/198480中公开的那些，其各自通过引用以其全部内容并入本文。在一些实施方式中，适合的γδT细胞可以来源于肿瘤组织(例如肿瘤浸润γδT细胞)。可替代地，可以经工程化以表达异源靶向构建体的适合γδT细胞可以根据下述方法从非造血组织中获得。

从血液分离和扩增γδT细胞

在一些实施方式中，本发明的工程化的γδT细胞可以来源于受试者的血液(例如外周血)。例如，工程化的γδT细胞可以来源于血液源性Vδ2细胞或血液源性Vδ1细胞。

在一些实施方式中，可以根据本领域已知的任何适合方法从受试者获得外周血单核细胞(PBMC)。可以在氨基双膦酸酯(例如唑来膦酸)、合成磷酸抗原(例如溴代醇焦磷酸酯；BrHPP)、2M3B1PP或2-甲基-3-丁烯-1-焦磷酸酯的存在下在存在IL-2的条件下将PBMC培养一至两周以产生富集的Vδ2细胞群。可替代地，固定的抗TCRγδ(例如泛TCRγδ)可以在IL-2存在下诱导PBMC群中Vδ2细胞的优先扩增，例如约14天。在一些实施方式中，在IL-2和IL-4存在下培养固定的抗CD3抗体(例如OKT3)后可以实现从PBMC优先扩增Vδ2细胞。在一些实施方式中，在可溶性抗CD3、IL-2和IL-4中传代培养之前，将前述培养物维持约7天。可替代地，可以使用人工抗原呈递细胞来促进γδT细胞(如Vδ2细胞)的优先扩增。例如，可以扩增在经辐照过的aAPC、IL-2和/或IL-21存在下培养的PBMC-源性γδT细胞以产生γδT细胞群，其包括高比例的Vδ2细胞、中等比例的Vδ1细胞和一些双阴性细胞。在前述方法的一些实施方式中，可以将PBMC预富集或后富集(例如通过使用TCRγδ-特异性药剂的正选择或TCRαβ-特异性药剂的负选择)。Deniger et al.,Frontiers in Immunology 2014,5,636:1-10详细地描述了用于扩增γδT细胞(如Vδ2细胞)的此类法及其他适合方法，通过引用以其全部内容并入本文。

在一些实施方式中，可以将Vδ1T细胞工程化以表达异源靶向构建体。可以使用获得Vδ1T细胞群的任何适合方法。例如，通过引用整体并入本文的Almeida et al.(ClinicalCancer Research 2016,22,23；5795-5805)提供了获得Vδ1T细胞群的适合方法，该Vδ1T细胞群可以被工程化以表达本文所描述的异源靶向构建体。例如，在一些实施方式中，使用磁珠分选对PBMC进行了预富集，这可以产生大于90％的γδT细胞。可以将这些细胞在一种或多种因子(例如TCR激动剂，共同受体激动剂，和/或细胞因子，例如IL-4、IL-15和/或IFN-γ)存在下在透气生物反应器袋中培养长达21天或更长时间。该方法的变型以及获得Vδ1T细胞的其他方法都适合作为本发明的一部分。例如，可以可替代地使用例如美国专利号9,499,788和国际专利公开号WO 2016/198480(其各自通过引用以其全部内容并入本文)以及WO2017197347和WO2016081518(美国公开号20160175338)(其各自通过引用以其全部内容并入本文)中描述的方法获得血液源性Vδ1T细胞。

从非造血组织分离与扩增非造血组织驻留γδT细胞

如下所述获得的非造血组织驻留γδT细胞可以是本文异源靶向构建体的适合载体，因为它们可以表现出良好的肿瘤渗透和保留能力。例如，可以在GB申请号1707048.3(WO2018/202808)和国际专利公开号WO2017/072367(美国公开号20180312808)找到更详细的分离和扩增非造血组织驻留γδT细胞的方法，其各自通过引用以其全部内容并入本文。

非造血组织驻留γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞和/或非Vδ2T细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)可以分离自任何人类或非人类动物非造血组织，可以从患者取下所述人类或非人类动物非造血组织以获得适合于根据本发明的方法进行工程化的细胞。在一些实施方式中，衍生和扩增γδT细胞的非造血组织是皮肤(例如人类皮肤)，其可以通过本领域已知的方法获得。在一些实施方式中，通过打孔活检获得皮肤。可替代地，可以将分离和扩增本文提供的γδT细胞的方法应用于胃肠道(例如结肠)、乳腺、肺、前列腺、肝、脾和胰腺。γδT细胞也可以驻留在人类癌症组织中，例如乳腺或前列腺肿瘤中。在一些实施方式中，γδT细胞可以来自人类癌症组织(例如实体瘤组织)。在其他实施方式中，γδT细胞可以来自除了人类癌症组织之外的非造血组织(例如不具有基本数目肿瘤细胞的组织)。例如，γδT细胞可以来自与附近或邻近的癌组织分开的皮肤区域(例如健康皮肤)。

在血液中占主导地位的γδT细胞主要是Vδ2T细胞，而在非造血组织中占主导地位的γδT细胞主要是Vδ1T细胞，由此Vδ1T细胞包括非造血组织驻留γδT细胞群的约70-80％。然而，在非造血组织(例如肠道)中也发现了一些Vδ2T细胞，其中它们可以包括γδT细胞的约10-20％。驻留在非造血组织中的一些γδT细胞既不表达Vδ1也不表达Vδ2TCR，并且我们将它们命名为双阴性(DN)γδT细胞。这些DNγδT细胞可以主要是Vδ3-表达细胞，少量是Vδ5-表达细胞。因此，通常驻留在非造血组织中并通过本发明的方法扩增的γδT细胞优选为非Vδ2T细胞，例如Vδ1T细胞，并且包括少量DNγδT细胞。

在一些实施方式中，关键步骤是将非造血组织驻留T细胞(例如在混合淋巴细胞群内，其可以例如包括αβ细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞以及γδ2和非γδ2T细胞)与获得所述T细胞的组织的非造血细胞(例如基质细胞，特别是成纤维细胞)的特意分离，例如在数天或数周的培养之后。这允许在后续的数天和数周内优先且快速扩增非造血组织来源的Vδ1T细胞和DNγδT细胞。

一般而言，非造血组织驻留γδT细胞在去除与基质细胞(例如皮肤成纤维细胞)的物理接触后能够自发扩增。因此，上述基于支架的培养方法可用于诱导此类分离，导致γδT细胞的阻抑以触发扩增。因此，在一些实施方式中，在扩增步骤期间不存在基本上的TCR途径活性(例如培养物中不包含外源性TCR途径激活剂)。另外，本发明提供了扩增非造血组织驻留γδT细胞的方法，其中该方法不涉及与饲养细胞、肿瘤细胞和/或抗原呈递细胞的接触。

扩增方案包括在有效的生物因子混合物存在下培养非造血组织驻留γδT细胞，以支持高效的γδT细胞扩增。在一个实施方式中，扩增γδT细胞的方法包括提供从非造血组织获得的γδT细胞群(例如分离的非造血组织来源的γδT细胞群，例如根据本文所描述的方法分离的群)和在IL-2、IL-4、IL-15和/或IL-21存在培养γδT细胞。可以以有效于产生扩增的γδT细胞群的量将这些细胞因子或其类似物与所述细胞一起培养一段时间(例如至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天、至少28天或更长，例如5天至40天、7天至35天、14天至28天或约21天)。

扩增的γδT细胞群

扩增的γδT细胞群在数量上大于扩增步骤之前分离的γδT细胞群(例如，相对于扩增步骤之前分离的γδT细胞群，数量上至少为2倍、至少为3倍、数量上至少为4倍、数量上至少为5倍、数量上至少为6倍、数量上至少为7倍、数量上至少为8倍、数量上至少为9倍、数量上至少为10倍、数量上至少为15倍、数量上至少为20倍、数量上至少为25倍、数量上至少为30倍、数量上至少为35倍、数量上至少为40倍、数量上至少为50倍、数量上至少为60倍、数量上至少为70倍、数量上至少为80倍、数量上至少为90倍、数量上至少为100倍、数量上至少为200倍、数量上至少为300倍、数量上至少为400倍、数量上至少为500倍、数量上至少为600倍、数量上至少为700倍、数量上至少为800倍、数量上至少为900倍、数量上至少为1,000倍、数量上至少为5,000倍、数量上至少为10,000倍，或更多)。因此，可以以较高的速率扩增γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞和/或非Vδ2T细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)的大的群。在一些实施方式中，本文所描述的扩增步骤以在较低的群体倍增时间扩增γδT细胞，这由以下等式给出：

考虑到本文提供的信息，本领域技术人员将认识到，本发明提供了以少于5天(例如少于4.5天、少于4.0天、少于3.9天、少于3.8天、少于3.7天、少于3.6天、少于3.5天、少于3.4天、少于3.3天、少于3.2天、少于3.1天、少于3.0天、少于2.9天、少于2.8天、少于2.7天、少于2.6天、少于2.5天、少于2.4天、少于2.3天、少于2.2天、少于2.1天、少于2.0天、少于46小时、少于42小时、少于38小时、少于35小时、少于32小时)的群体倍增时间扩增γδT细胞(例如被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)的方法。

在一些实施方式中，通过本文提供的方法分离和扩增的γδT细胞(例如被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)可具有非常适合抗肿瘤功效的表型。在一些实施方式中，扩增的γδT细胞群比参考群(例如所述扩增步骤之前的分离的γδT细胞群)具有更高的CD27平均表达。在一些实施方式中，所述扩增的γδT细胞群具有的CD27平均表达是分离的γδT细胞群的至少2倍(例如，相对于分离的γδT细胞群，为至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少5,000倍、至少10,000倍、至少20,000倍或更高)。

扩增的γδT细胞群(例如被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)的独特部分可以上调CD27，而另一部分是CD27^低或CD27^-。在这种情况下，相对于分离的γδT细胞群，扩增群中CD27⁺细胞的频率可以更大。例如，相对于扩增前的分离的γδT细胞群，扩增的γδT细胞群中CD27⁺细胞的频率可以高出至少5％(例如，相对于扩增前的分离的γδT细胞群，CD27⁺细胞的频率高出至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。在一些实施方式中，相对于分离的γδT细胞群，扩增群中的CD27⁺细胞数可以会增加。例如，扩增的γδT细胞群中的CD27⁺细胞数为扩增前的分离的γδT细胞群中的至少2倍(例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群，CD27⁺细胞的频率高出至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。

在一些实施方式中，本文提供的扩增方法产生扩增的γδT细胞群(例如被扩展和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)，相对于参考群(例如，扩增步骤前的分离的γδT细胞群)，其具有TIGIT的低表达。在一些实施方式中，扩增的γδT细胞群具有比参考群(例如扩增步骤之前的分离的γδT细胞群)低的TIGIT平均表达。在一些实施方式中，扩增的γδT细胞群的TIGIT平均表达比分离的γδT细胞低至少10％(例如比分离的γδT细胞群低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％或低多达100％)。

扩增的γδT细胞群(例如被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)的独特部分可以表达TIGIT，例如高水平的TIGIT，而另一部分是TIGIT^低或TIGIT^-。在这种情况下，相对于分离的γδT细胞群，扩增群中的TIGIT⁺细胞频率可以更低。例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞，扩增的γδT细胞群中TIGIT⁺细胞的频率可以低至少5％(例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群，TIGIT⁺细胞群的频率低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。在一些实施方式中，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群，扩增群中的TIGIT⁺细胞数可以更少。例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群中TIGIT⁺细胞的数量，扩增的γδT细胞群中的TIGIT⁺细胞可以少至少10％(例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群中TIGIT⁺细胞的数量，TIGIT⁺细胞少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。

在一些实施方式中，扩增的γδT细胞群(例如被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)具有高数量或频率的CD27⁺细胞和低频率的TIGIT⁺细胞。在一些实施方式中，相对于参考群(例如相对于扩增之前的分离的γδT细胞群)，扩增的γδT细胞群具有高频率的CD27⁺TIGIT^-细胞。例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群，扩增的γδT细胞群具有的CD27⁺TIGIT^-细胞的频率大至少5％(例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群，CD27⁺TIGIT^-细胞的频率大至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。在一些实施方式中，相对于分离的γδT细胞群，扩增群中CD27⁺TIGIT^-细胞的数量可以增加了。例如，扩增的γδT细胞群中CD27⁺TIGIT^-细胞的数量可以是扩增之前的分离的γδT细胞群中的至少2倍(例如，相对于扩增之前的分离的γδT细胞群，CD27⁺TIGIT^-细胞的频率大至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。

在某些情况下，相对于参考群，扩增的γδT细胞群(例如被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)中CD27⁺γδT细胞群上的TIGIT平均表达较低。在一些实施方式中，扩增的CD27⁺γδT细胞群具有比参考群(例如扩增步骤之前的分离的CD27⁺γδT细胞群)低的TIGIT平均表达。在一些实施方式中，扩增的CD27⁺γδT细胞群的TIGIT平均表达比分离的CD27⁺γδT细胞群低至少10％(例如，比分离的CD27⁺γδT细胞群低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％或低高达100％)。

另外地或可替代地，相对于参考群，扩增的γδT细胞群(例如，被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)中TIGIT^-γδT细胞群上的CD27中位表达较高。例如，相对于扩增之前的分离的TIGIT^-γδT细胞群，扩增的TIGIT^-γδT细胞群中CD27⁺细胞的频率可以大至少5％(例如，相对于扩增之前的分离的TIGIT^-γδT细胞群，CD27⁺细胞的频率大至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。在一些实施方式中，相对于分离的TIGIT^-γδT细胞群，扩增群中CD27⁺细胞的数量可以增加了。例如，扩增的TIGIT^-γδT细胞群具有的CD27⁺细胞数是扩增之前的分离的TIGIT^-γδT细胞群中的至少2倍(例如，相对于扩增之前的分离的TIGIT^-γδT细胞群，CD27⁺细胞的频率大至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)

其他标志物表达的增加或降低可以另外地或可替代地用来表征一个或多个扩增的γδT细胞群(例如被扩增和/或选择用于工程化以表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞或γδT细胞)，包括CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fas配体、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30、CD2、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1和CD64。在一些情况下，相对于分离的γδT细胞群(例如在扩增之前)，扩增的γδT细胞群具有更大、相等或更低平均表达的从CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fas配体、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30和CD2中选择的一种或多种标志物。另外地或可替代地，相对于分离的γδT细胞群，扩增的γδT细胞群可以具有更大、相等或更低频率的如下细胞，该细胞表达从CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fas配体、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30和CD2中选择的一种或多种标志物。在一些实施方式中，相对于分离的γδT细胞群，扩增的γδT细胞群具有更大、相等或更低平均表达的从NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1和CD64中选择的一种或多种标志物。相对于分离的参考γδT细胞群，扩增群可以类似地具有更大、相等或更低频率的如下细胞，该细胞表达从NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1和CD64中选择的一种或多种标志物。

有许多适用于γδT细胞增殖的基础培养基，特别是完全培养基，如AIM-V、Iscoves培养基和RPMI-1640(Life Technologies)。所述培养基可以补充有其他培养基因子，如血清、血清蛋白和选择剂，例如抗生素。例如，在一些实施方式中，RPMI-1640培养基含有2mM谷氨酰胺、10％FBS、10mM HEPES,pH 7.2、1％青霉素-链霉素、丙酮酸钠(1mM；LifeTechnologies)、非必需氨基酸(例如100μM Gly、Ala、Asn、Asp、Glu、Pro和Ser；1X MEM非必需氨基酸，Life Technologies)和10μl/Lβ-巯基乙醇。便利地，在合适的培养基中，在含有5％CO₂的加湿气氛中在37℃培养细胞。

γδT细胞可以如本文所述在任何合适的系统中培养，包括搅拌罐发酵罐、气升式发酵槽、滚瓶、培养袋或培养皿以及其他生物反应器，如中空纤维生物反应器。这种系统的使用在本领域中是众所周知的。培养淋巴细胞的一般方法和技术是本领域众所周知的。

本文描述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如多于一个耗尽步骤。例如，使用针对负选择的细胞独有的表面标志物的抗体的组合，可以实现通过负选择对T细胞群的富集。一种方法是经由负磁免疫粘附或流式细胞仪的细胞分选和/或选择，其使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。

V.药物组合物和治疗方法

本文所描述的工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)(例如具有异源靶向构建体的工程化的细胞(例如γδT细胞))可以用作药物，例如用作过继性T细胞疗法。此处用途涉及将通过本发明的方法获得的淋巴细胞(例如γδT细胞)转移到患者中。该疗法可以是自体的，即可以将淋巴细胞(例如γδT细胞)转移回获得该淋巴细胞的同一患者中，或该疗法可以是同种异体的，即可以将来自一个人的淋巴细胞(例如γδT细胞)转移到不同患者中。在涉及同种异体转移的情况下，所述淋巴细胞(例如γδT细胞)可以基本上没有αβT细胞。例如，可以在例如扩增之后，使用本领域已知的任何适合方法(例如通过负选择，例如使用磁珠)从淋巴细胞(例如γδT细胞)群中耗尽αβT细胞。

在γδT细胞被工程化以表达异源靶向构建体的一些实施方式中，γδT细胞是Vδ1细胞、Vδ2细胞、Vδ3细胞、Vδ5细胞或Vδ8细胞。一种治疗方法包括：提供来自患者的内源性γδT细胞的样品；在携带编码异源靶向构建体的多核苷酸的载体的存在下，培养所述样品中的γδT细胞以产生表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞群(例如经扩增的表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞群)；和将γδT细胞群给予至受体患者。在一些实施方式中，通过电穿孔或本领域已知或本文所描述的任何其他合适的转染方法，将编码异源靶向构建体的多核苷酸递送到内源性γδT细胞中。

要治疗的患者或受试者可以是人类癌症患者(例如正在接受实体瘤的人类癌症患者)或病毒感染的患者(例如感染了CMV或HIV的患者)。在某些情况下，所患者患有实体瘤和/或正接受实体瘤治疗。

由于γδT细胞是非MHC限制性的，因此它们无法识别将其作为外来物质转移入的宿主，这意味着它们不太可以引起移植物抗宿主病。这意味着它们可以“现成”使用并转移到任何受体中，例如用于同种异体过继性T细胞疗法。

在一些实施方式中，本发明的γδT细胞表达NKG2D并且响应与恶性肿瘤密切相关的NKG2D配体(例如MICA)。它们在没有任何激活的情况下也表达细胞毒性谱，因此可以有效杀伤肿瘤细胞。例如，如本文获得的工程化的γδT细胞在没有任何激活的情况下可以表达中IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、CCL4、IL-13、颗粒溶素、颗粒酶A和B以及穿孔素的一种或多种(优选全部)，但可以不表达IL-17A。

药物组合物可以包括如本文所描述的工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞)以及一种或多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此种组合物可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽等；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。可用于本发明药物组合物的冷冻保存溶液包括例如DMSO。可以配制组合物，例如用于静脉内给予。

在一个实施方式中，所述药物组合物基本上不含(不存在可检测水平的)污染物，例如内毒素或支原体。

在某些情况下，可以以治疗有效量向受试者给予治疗有效量的由任何上述方法获得的工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)(例如用于治疗癌症，例如用于治疗实体瘤)。在一些情况下，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如工程化的γδT细胞，血液源性T细胞，例如Vδ1T细胞、Vδ2T细胞,和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的所述治疗有效量为少于10x 10¹²个细胞/剂量(例如，少于9x 10¹²个细胞/剂量、少于8x10¹²个细胞/剂量、少于7x 10¹²个细胞/剂量、少于6x 10¹²个细胞/剂量、少于5x 10¹²个细胞/剂量、少于4x 10¹²个细胞/剂量、少于3x10¹²个细胞/剂量、少于2x 10¹²个细胞/剂量、少于1x 10¹²个细胞/剂量、少于9x 10¹¹个细胞/剂量、少于8x 10¹¹个细胞/剂量、少于7x 10¹¹个细胞/剂量、少于6x 10¹¹个细胞/剂量、少于5x 10¹¹个细胞/剂量、少于4x 10¹¹个细胞/剂量、少于3x 10¹¹个细胞/剂量、少于2x 10¹¹个细胞/剂量、少于1x 10¹¹个细胞/剂量、少于9x 10¹⁰个细胞/剂量、少于7.5x 10¹⁰个细胞/剂量、少于5x 10¹⁰个细胞/剂量、少于2.5x 10¹⁰个细胞/剂量、少于1x 10¹⁰个细胞/剂量、少于7.5x10⁹个细胞/剂量、少于5x 10⁹个细胞/剂量、少于2.5x 10⁹个细胞/剂量、少于1x 10⁹个细胞/剂量、少于7.5x 10⁸个细胞/剂量、少于5x 10⁸个细胞/剂量、少于2,5x 10⁸个细胞/剂量、少于1x 10⁸个细胞/剂量、少于7.5x 10⁷个细胞/剂量、少于5x 10⁷个细胞/剂量、少于2,5x 10⁷个细胞/剂量、少于1x 10⁷个细胞/剂量、少于7.5x 10⁶个细胞/剂量、少于5x 10⁶个细胞/剂量、少于2,5x 10⁶个细胞/剂量、少于1x 10⁶个细胞/剂量、少于7.5x 10⁵个细胞/剂量、少于5x 10⁵个细胞/剂量、少于2,5x 10⁵个细胞/剂量或少于1x 10⁵个细胞/剂量)。

在一些实施方式中，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如工程化的皮肤源性γδT细胞，工程化的血液源性γδT细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的所述治疗有效量在整个疗程中少于10x 10¹²个细胞(例如，在整个疗程中，少于9x 10¹²个细胞、少于8x 10¹²个细胞、少于7x 10¹²个细胞、少于6x10¹²个细胞、少于5x 10¹²个细胞、少于4x 10¹²个细胞、少于3x 10¹²个细胞、少于2x 10¹²个细胞、少于1x 10¹²个细胞、少于9x 10¹¹个细胞、少于8x 10¹¹个细胞、少于7x 10¹¹个细胞、少于6x10¹¹个细胞、少于5x10¹¹个细胞、少于4x 10¹¹个细胞、少于3x 10¹¹个细胞、少于2x 10¹¹个细胞、少于1x 10¹¹个细胞、少于9x 10¹⁰个细胞、少于7.5x 10¹⁰个细胞、少于5x 10¹⁰个细胞、少于2.5x 10¹⁰个细胞、少于1x 10¹⁰个细胞、少于7.5x 10⁹个细胞、少于5x 10⁹个细胞、少于2.5x 10⁹个细胞、少于1x 10⁹个细胞、少于7.5x 10⁸个细胞、少于5x 10⁸个细胞、少于2,5x10⁸个细胞、少于1x 10⁸个细胞、少于7.5x 10⁷个细胞、少于5x 10⁷个细胞、少于2,5x 10⁷个细胞、少于1x 10⁷个细胞、少于7.5x 10⁶个细胞、少于5x 10⁶个细胞、少于2,5x 10⁶个细胞、少于1x 10⁶个细胞、少于7.5x 10⁵个细胞、少于5x 10⁵个细胞、少于2,5x 10⁵个细胞或少于1x10⁵个细胞)。

在一些实施方式中，如本文所描述的工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的剂量包括约1x 10⁶、1.1x 10⁶、2x 10⁶、3.6x10⁶、5x 10⁶、1x 10⁷、1.8x 10⁷、2x 10⁷、5x 10⁷、1x 10⁸、2x 10⁸或5x 10⁸个细胞/kg。在一些实施方式中，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞，血液源性γδT细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的剂量包括至少约1x 10⁶、1.1x 10⁶、2x 10⁶、3.6x 10⁶、5x 10⁶、1x 10⁷、1.8x 10⁷、2x 10⁷、5x 10⁷、1x10⁸、2x 10⁸或5x 10⁸个细胞/kg。在一些实施方式中，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞，血液源性γδT细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的剂量包括多达约1x 10⁶、1.1x 10⁶、2x 10⁶、3.6x 10⁶、5x10⁶、1x 10⁷、1.8x 10⁷、2x 10⁷、5x 10⁷、1x 10⁸、2x 10⁸、5x 10⁸个细胞/kg。在一些实施方式中，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞，血液源性γδT细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的剂量包括约1.1x 10⁶-1.8x 10⁷个细胞/kg。在一些实施方式中，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞，血液源性γδT细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的剂量包括约1x 10⁷、2x 10⁷、5x 10⁷、1x 10⁸、2x 10⁸、5x10⁸、1x 10⁹、2x 10⁹或5x 10⁹细胞。在一些实施方式中，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞,血液源性γδT细胞,例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的剂量包括至少约1x 10⁷、2x 10⁷、5x 10⁷、1x 10⁸、2x10⁸、5x 10⁸、1x 10⁹、2x 10⁹或5x 10⁹个细胞。在一些实施方式中，工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞，血液源性γδT细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的剂量包括高达约1x 10⁷、2x 10⁷、5x10⁷、1x10⁸、2x 10⁸、5x 10⁸、1x 10⁹、2x 10⁹或5x 10⁹个细胞。

在一个实施方式中，以每kg受试者体重向受试者给予10⁴至10⁶个工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞(例如皮肤源性γδT细胞，血液源性γδT细胞，例如Vδ1T细胞和/或DN T细胞)、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)。在一个实施方式中，受试者接受初次给予的工程化的淋巴细胞群(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞(例如初次给予每kg受试者体重10⁴至10⁶个γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞，例如每kg受试者体重10⁴至10⁵个γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞))，以及一个或多个(例如2、3、4或5)后续给予的工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞(例如一个或多个后续给予的每kg受试者体重10⁴至10⁶个工程化的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞，例如每kg受试者体重10⁴至10⁵个工程化的γδT细胞))。在一个实施方式中，所述一个或多个后续给予在前一次给予后少于15天内(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)施用，例如在前一次给予后少于4、3或2天。在一个实施方式中，在整个至少三次给予γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞的群的过程中，受试者接受每kg受试者体重总计约10⁶个γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞，例如，受试者接受的初始剂量为1x 10⁵个γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞，第二次给予3x 10⁵个γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞，并且第三次给予6x 10⁵个γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞，并且例如每次给予在前一次给予后少于4、3或2天内施用。

在一些实施方式中，可以向受试者给予一种或多种附加治疗剂。所述附加治疗剂可以选自免疫治疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、放射治疗剂、抗血管生成剂或它们中两种或多种药剂的组合。可以在给予工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的同时、之前或之后给予所述附加治疗剂。所述附加治疗剂可以是免疫治疗剂，其可以对受试者体内的靶(例如受试者自身的免疫系统)起作用和/或对所转移的γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞起作用。

可以任何方便的方式给予所述组合物。本文所描述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉注射或腹膜内向患者给予，例如通过皮内或皮下注射。可以将工程化的淋巴细胞(例如γδT细胞、NK细胞、NK样T细胞、先天淋巴样细胞或MAIT细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。

实施例

下列实施例提供了工程化γδT细胞以表达异源靶向构建体的非限制性方法、功能筛选工程化的γδT细胞的非限制性方法以及使用工程化的γδT细胞的治疗性方法。

实施例1：表达异源靶向构建体的工程化的γδT细胞的功能表征

通过与靶细胞(例如癌细胞，例如肿瘤细胞系的细胞)共培养在体外功能表征了具有异源靶向受体的工程化的Vδ1T细胞。将工程化的Vδ1T细胞与三种对照细胞类型进行了比较：(1)未转导的Vδ1T细胞；(2)模拟转导的表达异源GFP的Vδ1T细胞；和(3)常规嵌合抗原受体(CAR)转导的具有功能细胞内信号传导结构域的Vδ1T细胞。每组与至少两组靶肿瘤细胞共培养：(A)表达正常水平肿瘤相关抗原(TAA)的健康细胞组，和(B)表达高水平TAA的肿瘤细胞组。测试了各种效应物与靶标的比率(γδT细胞与靶细胞比)。将未转导的或模拟转导的Vδ1细胞用作对照以识别异源靶向受体赋予的效果，并且将CAR T细胞用作对照以识别缺乏配置用于传播信号1和/或信号2刺激的功能性胞内结构域的效果。进行了以下测定：

1.根据标准CFSE稀释方案进行增殖测定，以量化工程化的γδT细胞与靶细胞之间的相互作用对工程化的γδT细胞增殖的影响，其指示了针对靶细胞的激活。相对于健康细胞，表达异源靶向构建体的γδT细胞响应于癌细胞进行了更大程度的增殖。

2.通过定量溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1；即CD107)的表达来进行CD107脱粒测定，LAMP-1是在脱粒后在γδT细胞表面上瞬时表达的。在不同的时间点对细胞进行染色以监测脱粒的动力学。相对于健康细胞，表达异源靶向构建体的γδT细胞响应于癌细胞优先展示脱粒。

3.使用FACS通过对穿孔素和颗粒酶染色来进行穿孔素/颗粒酶测定。相对于健康细胞，表达异源靶向构建体的γδT细胞响应于癌细胞优先表达穿孔素和/或颗粒酶。

4.进行细胞裂解测定以定量靶细胞裂解的程度(即细胞溶解)。通过Incucyte或萤光素酶测定法测量细胞裂解的动力学，以一定时间内的杀伤百分比表示，并使用萤光素酶测定法测量终点细胞裂解，以在给定时间点的杀伤百分比表示。相对于健康细胞，表达异源靶向构建体的γδT细胞优先裂解癌细胞。

5.通过活细胞成像监测免疫突触的形成。通过观察γδT细胞和靶细胞之间的免疫突触，监测结合动力学。此外，观察了γδT细胞中的钙通量(指示识别)和靶细胞中的PI染红(确定致命命中)。还观察了靶细胞舍入。相对于争当细胞，当与癌细胞共培养时，表达异源靶向构建体的γδT细胞中的结合动力学和钙通量被优先增强。

实施例2：表达异源靶向构建体的外周血源性工程化的γδT细胞

与常规αβT细胞相比，Vδ1γδT细胞的独特的特性之一是在保留健康组织的同时选择性杀伤恶性转化的细胞，这是一种可以通过天然细胞毒性受体的作用介导的过程。目前的结果表明，使用缺乏细胞内信号传导结构域的异源靶向构建体可以进一步增强Vδ1细胞根除肿瘤细胞的能力。使用这种构建体工程化Vδ1细胞维持或甚至增加了这些细胞针对恶性转化细胞的细胞毒性，同时仍保留健康细胞。这种方法克服了观察到的常规嵌合抗原受体(CAR)免疫疗法(例如CD19靶向CAR治疗后的B细胞耗竭)的靶上脱肿瘤效应。

材料和方法

外周血γδT-细胞分离和扩增

如先前U.S.2018/0169147(通过引用以其全部内容并入本文，特别是其从血液分离Vδ1细胞的方法)中描述的，从健康供体的外周血产生血液源性Vδ1细胞。简言之，将MACS-耗尽的αβT细胞重新悬浮于补充有自体血浆的无血清培养基(CTS OpTmizer)中并且在IL-4、IFN-γ、IL-21、IL-1β、IL-15和可溶性OKT3存在下进行扩增。用编码下述构建体的慢病毒载体转导细胞。本质上，全长CAR构建体包括靶向肿瘤抗原CD19或GD2的scFv结合区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(根据常规CAR构建体设计)。非信号传导或“nsCAR”缺乏细胞内结构域。

从血液获得Vd1细胞的其他方式在本领域中是众所周知的，如US9499788、WO2017197347、WO2016081518。可替代地，如U.S.2018/0312808中所述从人体皮肤活检分离Vδ1细胞，其通过引用以全部内容并入本文并且特别是从组织分离Vδ1细胞的方法。如上转导皮肤源性Vδ1细胞。

流式细胞仪分析

使用BD FACS Lyric流式细胞仪进行了免疫分型。使用PerCP-Vio700抗TCR a/b(Miltenyi)、APC抗TCR g/d(Miltenyi)、VioBlue抗TCR Vδ1(Miltenyi)、PE抗NKp30(BioLegend)、APC抗NKp44(BioLegend)、PerCP.Cy5.5抗NKG2D(BioLegend)分析了细胞的表面标志物表达。使用FITC抗STREP标签抗体(LSBio)检测了常规CD19 CAR和非信号CD19CAR构建体表达。使用PE抗FC抗体(BioLegend)监测非信号GD2 CAR表达。

细胞毒性测定

使用CTV或CFSE标记Nalm-6(ATCC,CRL-1567)和原代B细胞并且以1:1的效应物与靶之比与T细胞组合。将培养物在37℃温育16小时。温育之后，向孔中加入SytoxAADvanced(Invitrogen)和绝对计数并且进行流式细胞仪采集。如下计算细胞毒性：

100-(样品计数/最大计数)×100

其中，最大计数是在没有任何效应细胞的情况下的靶细胞数。

活细胞成像

使用NucLight Green编码慢病毒载体(Essen BioScience)稳定转导表达人类GD2的神经母细胞瘤细胞系Kelly(DSMZ ACC-355)以便能够自动细胞计数。使用Incucyte Zoom活细胞成像系统(Essen Bioscience)以1小时间隔监测细胞生长60小时。数据表示为在给定时间点的每幅图像的绿色物体计数数量之比的变化，其已相对于零时每幅图像绿色物体计数数量进行归一化。每个数据点代表一式三份的孔。

与αβT细胞CAR的比较

如上所述，使用全长或非信号传导CAR构建体将γδ细胞工程化。类似地，也使用全长或非信号传导CAR构建体工程化来自血液或组织的αβ-源性T细胞。测量了工程化的细胞针对表达靶抗原的健康和恶性细胞的溶细胞活性，以展示每个群的靶上脱肿瘤细胞毒性。

结果

使用编码全长(CAR19)或非信号传导抗CD19靶向构建体的慢病毒载体转导血液源性Vδ1细胞，产生了大于90％的转导效率(图3A)。在CAR分子的表面表达方面不存在明显差异。慢病毒转导未改变转导细胞的免疫表型和增殖能力。未转导的(UTD)和转导的Vδ1细胞的FACS分析未显示出关键天然细胞毒性受体(NCR)分子(NKp30、NKp44和NKG2D；图3B)表面表达的任何显著差异。

Vδ1细胞识别并杀伤表达CD19的急性淋巴细胞白血病细胞系NALM-6的细胞。Vδ1细胞上全长或非信号CD19 CAR的表达导致靶细胞杀伤力增加两倍(图4A和4B；在1:1效应物与靶之比下，供体1和供体2的杀伤百分比分别为21.4％(UTD)比46％(nsCAR19)比58％(CAR19)和42.8％(UTD)比83％(nsCAR19)比88％(CAR19))。重要的是，表达非信号传导抗CD19 CAR的Vδ1细胞不杀伤健康人类B细胞(图4C)。

为了进一步证明非信号传导CAR方法的普遍适用性，将Vδ1细胞重定向至表达GD2抗原的肿瘤细胞。通过FACS测量，使用GD2特异性nsCAR分子转导血液源性Vδ1细胞产生了54％的转导效率(图5A)。在1:1的效应物与靶之比下将未转导的和nsCAR转导的Vδ1细胞与表达GD2的神经母细胞瘤细胞系(Kelly)共培养。使用活细胞成像(Incucyte,EssenBioscience)测量了靶细胞杀伤。与在未转导的Vδ1细胞的存在下培养靶细胞相比，Kelly细胞与表达nsCAR的Vδ1细胞的共培养导致总的靶细胞数减少了40％(图5B)。

实施例3：使用用异源靶向构建体工程化的γδT细胞治疗癌症

使用本领域已知的克隆和PCR方法合成异源靶向构建体。将编码靶向肿瘤相关抗原(TAA)的scFv的蛋白质片段融合至茎结构域的N末端，然后将其融合至CD8跨膜结构域的N末端。然后将该异源靶向构建体克隆到慢病毒载体中。

患者接受白细胞分离手术，从中获得血液样品并且耗尽红血细胞。使用标准的磁分离方案耗尽αβT细胞。使用本领域公知的或本文所描述的任何合适的γδT细胞扩增方法来扩增包括γδT细胞的剩余群。在扩增过程中，使用含有编码异源靶向构建体的多核苷酸的慢病毒载体温育细胞，并且通过逆转录将所述多核苷酸整合到γδT细胞的基因组中。使用慢病毒转导的所述细胞可以在表面上表达异源靶向构建体。然后将表达异源靶向构建体的转导细胞与未转导的细胞分离，并收集以作为自体或同种异体疗法输注。

历经两小时将所述细胞经静脉内给予于患者。每周一次静脉内给予，持续12周，并监测癌症症状。

其他实施方式

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每篇独立的出版物或专利申请均被具体且单独地指出通过引用并入。

尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但应当理解的是，本发明可以进一步修改并且本申请旨在涵盖总体上遵循本发明的原理的本发明的任何变化、用途或改编，该变化、用途或改编包括在与本发明所属技术领域内已知或惯例范围内的与本公开的偏离且可以应用于上文阐述的必要特征，并在权利要求的范围内。

其他实施方式在权利要求的范围内。要求保护的是：

Claims (45)

1.一种包含异源靶向构建体的工程化的γ-δ(γδ)T细胞，其中，所述异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至所述抗原结合结构域的跨膜结构域，其中所述异源靶向构建体缺乏能够激活所述工程化的γδT细胞的细胞内结构域。

2.根据权利要求1所述的工程化的γδT细胞，还包含将所述抗原结合结构域可操作地连接至所述跨膜结构域的茎结构域。

3.一种包含异源靶向构建体的工程化的γδT细胞，其中，所述异源靶向构建体包含抗原结合结构域和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域是不传播所述工程化的γδT细胞的信号1激活的末端跨膜结构域。

4.根据权利要求3中所述的工程化的γδT细胞，还包含将所述抗原结合结构域可操作地连接至所述跨膜结构域的茎结构域。

5.一种包含异源靶向构建体的工程化的γδT细胞，其中，所述异源靶向构建体由抗原结合结构域、可操作地连接所述抗原结合结构域的茎结构域和可操作地连接所述茎结构域的跨膜结构域组成，其中所述异源靶向构建体不传播所述工程化的γδT细胞的信号1激活。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述跨膜结构域不激活所述工程化的γδT细胞。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述工程化的γδT细胞是Vδ2阴性的。

8.根据权利要求6所述的工程化的γδT细胞，其中，所述Vδ2阴性γδT细胞是Vδ1阳性的。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)、单克隆抗体、Fab片段、B细胞受体、T细胞受体、抗体支架、受体特异性配体或配体特异性受体。

10.根据权利要求2或4至9中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述茎结构域包含从下列中选择的一种或多种结构域：CD8茎、IgG1铰链、IgG1铰链-CH₂结构域、IgG1-铰链-CH₃结构域、IgG1-铰链-CH₂-CH₃结构域、(G₄S)₃铰链、CD7茎、IgD铰链、IgD铰链-CH₂结构域、IgD铰链-CH₂-CH₃结构域、IgD铰链-CH₃结构域、IgG4铰链、IgG4铰链-CH₂结构域、IgG4铰链-CH₂-CH₃结构域、IgG4铰链-CH₃结构域或FcεRI茎。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD45跨膜结构域、CD5跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD9跨膜结构域、CD16跨膜结构域、CD22跨膜结构域、CD33跨膜结构域、CD37跨膜结构域、CD64跨膜结构域、CD80跨膜结构域、CD86跨膜结构域、CD134跨膜结构域、CD137跨膜结构域、CD154跨膜结构域、CD7跨膜结构域、CD71跨膜结构域、CD18跨膜结构域、CD29跨膜结构域、CD11a跨膜结构域、CD11b跨膜结构域、CD11c跨膜结构域、CD11d跨膜结构域、CD94跨膜结构域、FcγR跨膜结构域或NKG2D跨膜结构域。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，C末端跨膜结构域的氨基酸的不超过50％驻留在细胞内。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，在所述抗原结合结构域结合靶抗原后，所述异源靶向构建体的聚簇基本上不激活所述工程化的γδT细胞内的TCR途径。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原。

15.根据权利要求14所述的工程化的γδT细胞，其中，所述肿瘤相关抗原是表达在肿瘤细胞表面上的蛋白质或肽抗原。

16.根据权利要求15所述的工程化的γδT细胞，其中，所述肿瘤相关抗原是CD19。

17.根据权利要求16所述的工程化的γδT细胞，其中，所述肿瘤相关抗原是表达在肿瘤细胞表面上的碳水化合物。

18.根据权利要求14所述的工程化的γδT细胞，其中，所述肿瘤相关抗原是表达在肿瘤细胞表面上的神经节苷脂。

19.根据权利要求18所述的工程化的γδT细胞，其中，所述神经节苷脂是GD2。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述肿瘤相关抗原是免疫抑制抗原。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述抗原结合结构域结合实体肿瘤细胞表达的靶抗原。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，相对于具有功能性胞内结构域的参考细胞，所述抗原结合结构域与健康细胞上表达的靶抗原的结合触发基本上更少的通过所述工程化的γδT细胞的细胞溶解。

23.根据权利要求22所述的工程化的γδT细胞，其中，所述抗原结合结构域与健康细胞上表达的靶抗原的结合基本上不触发通过所述工程化的γδT细胞的细胞溶解。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的工程化的γδT细胞，其中，所述抗原结合结构域与肿瘤细胞或受感染的细胞上表达的靶抗原的结合基本上触发通过所述工程化的γδT细胞的细胞溶解。

25.根据权利要求22所述的工程化的γδT细胞，其中，所述细胞溶解取决于所述工程化的γδT细胞对NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46或DNAM1的内源性表达。

26.根据权利要求24或25所述的工程化的γδT细胞，其中，所述细胞溶解的特征是从CD107脱粒、颗粒酶释放、穿孔素释放、颗粒溶素释放、靶细胞杀伤、γδT细胞的增殖和细胞因子生产中选择的响应中的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个。

27.一种包含异源靶向构建体的工程化的NK细胞或NK样T细胞，其中，所述异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至所述抗原结合结构域的跨膜结构域，其中所述异源靶向构建体缺乏能够激活所述工程化的NK细胞或NK样T细胞的细胞内结构域。

28.一种包含异源靶向构建体的工程化的先天淋巴样细胞，其中，所述异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至所述抗原结合结构域的跨膜结构域，其中所述异源靶向构建体缺乏能够激活所述工程化的先天淋巴样细胞的细胞内结构域。

29.一种包含异源靶向构建体的工程化的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞，其中，所述异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至所述抗原结合结构域的跨膜结构域，其中所述异源靶向构建体缺乏能够激活所述工程化的粘膜相关恒定T细胞的细胞内结构域。

30.一种分离的细胞群，所述群包含至少十个权利要求1至26中任一项所述的工程化的γδT细胞、权利要求27所述的工程化的NK细胞或NK样T细胞、权利要求28所述的工程化的先天淋巴样细胞或权利要求29所述的工程化的MAIT细胞。

31.根据权利要求30所述的分离的细胞群，其中，所述工程化的γδT细胞、工程化的NK细胞或NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞或工程化的MAIT细胞占该分离的细胞群中细胞总数的大于2％。

32.一种分离的细胞群，所述群包含权利要求1至26中任何一项所述的工程化的γδT细胞的群、权利要求27所述的工程化的NK细胞或NK样T细胞的群、权利要求28所述的工程化的先天淋巴样细胞的群或权利要求29所述的工程化的MAIT细胞的群，其中所述群占该分离的细胞群中细胞总数的大于2％。

33.根据权利要求31或32所述的分离的细胞群，包含至少十个权利要求1至26中任一项所述的工程化的γδT细胞和/或至少十个权利要求27所述的工程化的NK细胞或NK样T细胞和/或至少十个权利要求28所述的工程化的先天淋巴样细胞和/或至少十个权利要求29所述的工程化的MAIT细胞。

34.一种包含异源多核苷酸的γδT细胞，所述多核苷酸编码异源靶向构建体，其中所述异源靶向构建体包含细胞外抗原结合结构域和可操作地连接至所述抗原结合结构域的跨膜结构域，其中所述异源靶向构建体缺乏能够激活所述工程化的γδT细胞的细胞内结构域。

35.一种包含异源多核苷酸的γδT细胞，所述多核苷酸编码靶向构建体，其中所述异源靶向构建体包含抗原结合结构域和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域是不参与所述工程化的γδT细胞的信号1激活的末端跨膜结构域。

36.根据权利要求1至26中任一项所述的工程化的γδT细胞、根据权利要求27所述的工程化的NK细胞或NK样T细胞、根据权利要求28所述的工程化的先天淋巴样细胞、根据权利要求29所述的工程化的MAIT细胞、根据权利要求30至33中任一项所述的分离的细胞群或根据权利要求34或35所述的包含异源多核苷酸的γδT细胞，用于在通过过继性T细胞疗法治疗受试者的方法中使用，其中，所述方法包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的权利要求1至24中任一项的工程化的γδT细胞、权利要求25的工程化的NK细胞或NK样T细胞、权利要求26的工程化的先天淋巴样细胞、权利要求27的工程化的MAIT细胞、权利要求28至31中任一项的分离的细胞群或权利要求32或33的包含异源多核苷酸的γδT细胞。

37.根据权利要求36所述的用于使用的工程化的γδT细胞、工程化的NK细胞或NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞、工程化的MAIT细胞、分离的细胞群或包含异源多核苷酸的γδT细胞，其中，所述受试者是人类。

38.根据权利要求37所述的用于使用的工程化的γδT细胞、工程化的NK细胞或NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞、工程化的MAIT细胞、分离的细胞群或包含异源多核苷酸的γδT细胞，其中，所述人类是人类癌症患者。

39.根据权利要求38所述的用于使用的工程化的γδT细胞、工程化的NK细胞或NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞、工程化的MAIT细胞、分离的细胞群或包含异源多核苷酸的γδT细胞，其中，所述人类癌症患者正在接受实体瘤治疗。

40.根据权利要求37所述的用于使用的工程化的γδT细胞、工程化的NK细胞或NK样T细胞、工程化的先天淋巴样细胞、工程化的MAIT细胞、分离的细胞群或包含异源多核苷酸的γδT细胞，其中，所述人类是正在接受病毒感染治疗的人类患者。

41.一种通过过继性T细胞疗法治疗受试者的方法，其中，所述方法包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的权利要求1至26中任一项所述的工程化的γδT细胞、权利要求27所述的工程化的NK细胞或NK样T细胞、权利要求28所述的工程化的先天淋巴样细胞、权利要求29所述的工程化的MAIT细胞、权利要求30至33中任一项所述的分离的细胞群或权利要求34或35所述的包含异源多核苷酸的γδT细胞。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述受试者是人类。

43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述人类是人类癌症患者。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述人类癌症患者正接受实体瘤治疗。

45.根据权利要求42所述的方法，其中，所述人类是正接受病毒感染治疗的人类患者。

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