BR112020019143A2

BR112020019143A2 - Linfócitos expressando construtos de direcionamento heterólogos

Info

Publication number: BR112020019143A2
Application number: BR112020019143-4A
Authority: BR
Inventors: Oliver NUSSBAUMER; Istvan Kovacs; Irene PIZZITOLA; Raj Mehta
Original assignee: Gammadelta Therapeutics Ltd
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2021-01-05
Also published as: EP4015525A3; EA202092261A1; AU2019239705A1; GB201804701D0; PH12020551538A1; CA3094766A1; CN112513067A; EP3768696A1; KR20220029292A; JP2021519063A; IL277517A; MX2020009859A; EP4015525A2; WO2019180279A1; US20210015867A1

Abstract

a presente invenção refere-se a linfócitos manipulados (por exemplo, células t gama-delta, células nk, células t semelhantes a nk, células linfoides inatas manipuladas, ou células mait) compreendendo um construto de direcionamento heterólogo que carece de um domínio de sinalização intracelular capaz de ativar o linfócito no qual o construto é expresso. são fornecidas ainda composições de linfócitos manipulados (por exemplo, células t gama-delta) e métodos de uso de linfócitos manipulados (por exemplo, células t gama-delta, por exemplo, uma parte de uma terapia com células t adotivas).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “LINFÓCI-

TOS EXPRESSANDO CONSTRUTOS DE DIRECIONAMENTO HETERÓLOGOS”. ANTECEDENTE

[0001] O câncer é um grupo de doenças que envolvem o cresci- mento anormal de células com o potencial para metastizar outras partes do corpo. A diversidade de tipos de câncer é bem conhecida, e muitos tipos de câncer podem variar drasticamente em sua composição genética entre os pacientes. Esta variação cria um fardo difícil na identificação de estratégias terapêuticas eficazes direcionadas a certos tipos de câncer. Em particular, existe uma necessidade de criar estratégias terapêuticas personalizadas para qualquer alvo de câncer. Como um resultado, um interesse crescente na imunoterapia com células T surgiu com base na identificação de que se pode aproveitar as células do sistema imunológico para reconhecer e destruir células estranhas ou patogênicas. Até o momento, as imunoterapias com células T envolveram a manipulação de células T αβ para expressar receptores de antígenos quiméricos (CARs). Essas células CAR T podem identificar um alvo de câncer com base na expressão de um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno associado a tumor) reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico. Após a ligação ao seu antígeno alvo, um ou mais domínios intracelulares da CAR propagam a ativação do sinal 1 e/ou ativação do sinal 2 (coestimulação) para ativar a célula CAR T, desencadeando assim a desgranulação e lise da célula alvo. No entanto, vários problemas permanecem com essas abordagens de células CAR T. Por exemplo, as células CAR T correm o risco de conferir citotoxicidade fora do alvo devido à expressão moderada do antígeno alvo por células saudáveis. Consequentemente, há uma necessidade no campo de métodos melhorados para manipular esses poderosos componentes do sistema imunológico enquanto aumentando a segurança e a eficácia do tratamento.

[0002] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção fornece uma abordagem alternativa para células CAR T. Especificamente, são apresentados aqui construtos de direcionamento heterólogos que carecem de um domínio intracelular funcional capaz de ativar a célula na qual ele é expresso. Quando expresso em linfócitos com funções efetoras semelhantes a inatas e/ou que não são restritas a MHC, tal como células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas, e células T invariantes associadas à mucosa (MAIT) manipuladas, o linfócito manipulado pode exibir especificidade aumentada para células doentes, evitando a ativação aberrante de TCR após a ligação a baixos níveis de antígeno alvo em células saudáveis.

[0004] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma célula T gama-delta (γδ) manipulada incluindo um construto de direcionamento heterólogo, em que o construto de direcionamento heterólogo inclui um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, em que o construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula T γδ manipulada (por exemplo, o domínio intracelular, se presente, não propaga a ativação do sinal 1 e não propaga a coestimulação do sinal 2). Em algumas modalidades, o construto de direcionamento heterólogo inclui ainda um domínio de haste que liga operacionalmente o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana.

[0005] Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula T γδ manipulada incluindo um construto de direcionamento heterólogo, em que o construto de direcionamento heterólogo inclui um domínio de ligação ao antígeno e um domínio transmembrana, em que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana terminal (ou seja, um domínio transmembrana tendo uma extremidade terminal não ligada, por exemplo, um terminal C que não está ligado a um peptídeo ou proteína). Assim, um domínio transmembrana terminal não está ligado a um domínio intracelular, tal como um domínio de sinalização intracelular. O domínio transmembrana não propaga a ativação do sinal

1. Em algumas modalidades, um domínio transmembrana terminal não participa de uma via de sinalização intracelular (por exemplo, uma via de TCR, por exemplo, uma via de sinalização de células T, tal como coestimulação de sinal 2). Em outras modalidades, o domínio transmembrana pode se associar a moléculas endógenas, propagando assim a coestimulação do sinal 2. Em algumas modalidades, o construto de direcionamento heterólogo inclui ainda um domínio de haste que liga operacionalmente o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana.

[0006] Em algumas modalidades de qualquer aspecto da invenção, o domínio transmembrana não ativa a célula T γδ manipulada.

[0007] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula T γδ manipulada incluindo um construto de direcionamento heterólogo que consiste em um domínio de ligação ao antígeno, um domínio de haste operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de haste.

[0008] Em algumas modalidades de qualquer aspecto da invenção, a célula T γδ manipulada é Vδ2-negativa (por exemplo, a célula T γδ Vδ2-negativa é Vδ1-positiva ou duplo negativa). Em modalidades alternativas de qualquer aspecto da invenção, a célula T γδ manipulada pode ser Vδ2-positiva.

[0009] O domínio de ligação ao antígeno pode incluir um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo monoclonal, um fragmento Fab, um receptor de células B, um receptor de células T, um arcabouço de anticorpo, um ligante receptor-específico, ou um receptor ligante-

específico (por exemplo, um receptor específico para um ligante expresso na superfície). Em algumas modalidades, o domínio de haste inclui um ou mais dos domínios selecionados a partir do grupo que consiste em uma haste de CD8, um domínio de dobradiça de IgG1-CH2, um domínio de dobradiça de IgG1-CH3, um domínio de dobradiça de IgG1-CH2-CH3, dobradiça (G4S)3, uma dobradiça de IgG1, uma haste de CD7, uma dobradiça de IgD, um domínio de dobradiça de IgD-CH2, um domínio de dobradiça de IgD-CH3, um domínio de dobradiça de IgD- CH2-CH3, uma dobradiça de IgG4, uma dobradiça de IgG4-CH2, um domínio de dobradiça de IgG4-CH3, um domínio de dobradiça de IgG4- CH2-CH3 ou um domínio de haste de FcεRI.

[0010] Em algumas modalidades de qualquer aspecto da invenção, o domínio transmembrana inclui um domínio transmembrana de CD8, um domínio transmembrana de CD4, um domínio transmembrana de CD3ε, um domínio transmembrana de CD3ζ, um domínio transmembrana de CD28, um domínio transmembrana de CD45, um domínio transmembrana de CD5, um Domínio transmembrana de CD8, um domínio transmembrana de CD9, um domínio transmembrana de CD16, um domínio transmembrana de CD22, um domínio transmembrana de CD33, um domínio transmembrana de CD37, um domínio transmembrana de CD64, um domínio transmembrana de CD80, um domínio transmembrana de CD86, um domínio transmem- brana de CD134, um domínio transmembrana de CD137, um domínio transmembrana de CD154, um domínio transmembrana de CD7, um domínio transmembrana de CD71, um domínio transmembrana de CD18, um domínio transmembrana de CD29, um domínio transmembrana de CD11a, um domínio transmembrana de CD11b, um domínio transmembrana de CD11c, um domínio transmembrana de CD11d, um domínio transmembrana de CD94, um domínio transmembrana de FcγR, ou um domínio transmembrana de NKG2D.

Em algumas modalidades, não mais do que 50% dos aminoácidos do domínio transmembrana terminal residem intracelularmente (por exemplo, não mais do que 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, ou 5% dos aminoácidos do domínio transmembrana terminal (por exemplo, domínio transmembrana C-terminal) residem intracelular- mente).

[0011] Em algumas modalidades de qualquer aspecto da invenção, o agrupamento do construto de direcionamento heterólogo após a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo não ativa substancialmente a via TCR na célula T γδ manipulada.

[0012] Em algumas modalidades de qualquer aspecto da invenção, o domínio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor. Por exemplo, o antígeno associado ao tumor pode ser um antígeno de proteína ou peptídeo expresso na superfície de uma célula tumoral (por exemplo, CD19). Alternativamente, o antígeno associado ao tumor pode ser um carboidrato expresso na superfície de uma célula tumoral. Em algumas modalidades, o antígeno associado ao tumor é gangliosídeo expresso na superfície de uma célula tumoral (por exemplo, GD2). Em algumas modalidades, o antígeno associado ao tumor é um antígeno imunossupressor. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno alvo que é expresso por uma célula de tumor sólido.

[0013] Em algumas das modalidades anteriores, a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo expresso em uma célula saudável desencadeia substancialmente menos citólise (por exemplo, pelo menos 5% menos, pelo menos 10% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 70% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos ou pelo menos 95% menos citólise) pela célula T γδ manipulada em relação a uma célula de referência tendo um domínio intracelular funcional (por exemplo, não desencadeia substancialmente a citólise pela célula T γδ manipulada). Em algumas modalidades, a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo expresso em uma célula tumoral ou em uma célula infectada desencadeia substancialmente a citólise pela célula T γδ manipulada. A citólise pode ser dependente da expressão endógena de NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 ou DNAM1 pela célula T γδ manipulada. Em algumas modalidades, a citólise é caracterizada por uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis respostas selecionadas a partir do grupo que consiste em desgranulação de CD107, liberação de granzima, liberação de perforina, liberação de granulisina, morte de células alvo, proliferação de células T γδ, e produção de citocinas.

[0014] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula NK manipulada ou célula T semelhante a NK com um construto de direcionamento heterólogo de qualquer uma das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, o construto de direcionamento heterólogo inclui um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno. O construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula NK manipulada ou a célula T semelhante a NK.

[0015] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula linfoide inata (ILC) manipulada. A ILC manipulada inclui um construto de direcionamento heterólogo de qualquer uma das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, o construto de direcionamento heterólogo inclui um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno. O construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula linfoide inata manipulada.

[0016] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula MAIT manipulada. A célula MAIT manipulada inclui um construto de direcionamento heterólogo de qualquer uma das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, o construto de direcionamento heterólogo inclui um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno. O construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula MAIT manipulada.

[0017] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma população de células isolada que inclui pelo menos dez células T γδ manipuladas, células NK manipuladas ou células T semelhantes a NK, células linfoides inatas manipuladas, ou células MAIT manipuladas de qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, as células T γδ manipuladas, células NK manipuladas ou células T semelhantes a NK, células linfoides inatas manipuladas ou células MAIT manipuladas representam mais de 2% (por exemplo, entre 2% e 100%, entre 10% e 95%, entre 20% e 90%, entre 30% e 80%, entre 40% e 70%, por exemplo, mais de 5%, mais de 10%, mais de 15%, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90%,mais de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) do número total de células na população de células isolada.

[0018] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma população de células isolada que inclui uma pluralidade de células T γδ manipuladas, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT de qualquer uma das modalidades anteriores. A população de células T γδ manipuladas, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT pode representar mais de 2% (por exemplo, entre 2% e 100%, entre 10% e 95%, entre 20 % e 90%, entre 30% e 80%, entre 40% e 70%, por exemplo, mais de 5%, mais de 10%, mais de 15%, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90%, mais de

95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) do número total de células na população de células isolada. Em algumas modalidades, a população de células isolada inclui pelo menos dez células T γδ manipuladas, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0019] Em outro aspecto, a invenção inclui uma célula T γδ, célula NK, célula T semelhante a NK, célula linfoide inata ou célula MAIT incluindo um polinucleotídeo heterólogo. O polinucleotídeo heterólogo pode codificar um construto de direcionamento heterólogo incluindo um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, em que o construto de direcionamento heterólogo não ativa diretamente a célula T γδ manipulada, célula NK, semelhante a NK Célula T, célula linfoide inata ou célula MAIT.

[0020] Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula T γδ, célula NK, célula T semelhante a NK, célula linfoide inata ou célula MAIT que inclui um polinucleotídeo heterólogo que codifica um construto de direcionamento que inclui um domínio de ligação ao antígeno e um domínio transmembrana terminal.

[0021] Uma célula T γδ manipulada, célula NK, célula T semelhante a NK, célula linfoide inata ou célula MAIT; população isolada de células T γδ manipuladas, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou de células MAIT; ou a célula T γδ, célula NK, célula T semelhante a NK, célula linfoide inata ou célula MAIT incluindo um polinucleotídeo heterólogo de qualquer uma das modalidades anteriores pode ser usada em um método de tratamento de um sujeito por terapia com células adotivas (por exemplo, para uso em um método de tratamento de um sujeito por terapia com células adotivas).

[0022] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de tratamento de um sujeito por terapia com células adotivas (por exemplo,

terapia com células T adotivas) que inclui administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz das células manipuladas, população de células isolada, ou células de qualquer uma das modalidades anteriores a um sujeito em necessidade de tratamento.

[0023] Em outro aspecto, a invenção fornece as células manipuladas, população de células isolada, ou células de qualquer uma das modalidades anteriores para uso em um método de tratamento de um sujeito por terapia com células adotivas (por exemplo, terapia com células T adotivas), em que o método inclui administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz das células manipuladas, população de células isolada, ou células de qualquer uma das modalidades anteriores a um sujeito em necessidade de tratamento.

[0024] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o sujeito é um humano. Por exemplo, o sujeito pode ser um paciente humano com câncer (por exemplo, um paciente humano com câncer sendo tratado para um tumor sólido). Alternativamente, o paciente humano pode ser um paciente humano sendo tratado para uma infecção viral.

[0025] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] A Figura 1 é um desenho esquemático que mostra um receptor de antígeno quimérico clássico (CAR) versus uma modalidade de um construto de direcionamento heterólogo, que não inclui um domínio intracelular.

[0027] As Figuras 2A-2C são uma série de desenhos esquemáticos que mostram como o construto de direcionamento heterólogo pode ser modificado com vários domínios extracelulares adaptados ao alvo desejado. A Figura 2A mostra um domínio extracelular generalizado que pode ser, por exemplo, um receptor de células B, um arcabouço ou mimético de anticorpo, um scFv, um mAb, um Fab, ou um receptor de células T. A Figura 2B mostra um domínio extracelular que é um receptor ligante-específico. A Figura 2C mostra um domínio extracelular que é um ligante receptor-específico.

[0028] As Figuras 3A e 3B são histogramas de citometria de fluxo. A Figura 3A mostra a expressão de um construto de direcionamento anti-CD19 sem um domínio intracelular (“sem sinalização ou nsCAR”) e um CAR anti-CD19 de comprimento total em células Vδ1 transduzidas. A Figura 3B mostra a expressão de NCR (receptores de citotoxicidade natural) NKp30 (coluna da esquerda), NKp44 (coluna do meio) e NKG2D (coluna da direita) em células Vδ1 que não são transduzidas (UTD; linha superior), transduzidas com CD19 CAR sem sinalização (linha do meio) e transduzidas com CD19 CAR (linha de baixo).

[0029] As Figuras 4A-4C são gráficos que mostram a expressão de CD19 em células Nalm-6 e células B (Figura 4A) e resultados a partir de um ensaio de morte de 16 horas na relação de efetoras - alvo de 1:1 (Figuras 4B e 4C). A Figura 4B mostra a morte de células CD19 + Nalm- 6, e a Figura 4C mostra a morte de células B-ALL primárias. Dois doadores independentes e experimentos são mostrados.

[0030] As Figuras 5A e 5B são gráficos que mostram a expressão de CAR sem sinalização anti-GD2 em células Vδ1 (Figura 5A) e um decorrer de tempo de 60 horas de crescimento da linhagem de células Kelly isoladamente ou na presença de células Vδ1 (Figura 5B). Os dados são expressos como a mudança em número na contagem de objetos verdes por imagem normalizada para o número na contagem de objetos verdes por imagem no tempo zero. Cada ponto de dados representa poços em triplicado.

[0031] DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] São fornecidas aqui composições de linfócitos manipulados (por exemplo, linfócitos com funções efetoras semelhantes às inatas, tal como células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides ou células T invariantes associadas à mucosa) que expressam um construto de direcionamento heterólogo. O construto de direcionamento heterólogo inclui um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, diretamente ligado ou ligado através de um domínio de haste). Estes linfócitos modificados (por exemplo, células T γδ) podem ser usados para o tratamento de doenças, tal como cânceres ou infecções virais. Uma vez que os construtos heterólogos da presente invenção carecem de um domínio intracelular funcional capaz de propagar a ativação de células T, eles dependem de vias de ativação independentes de MHC endógenas características de células T γδ, que faltam em células T αβ. Assim, os construtos heterólogos aqui descritos são concebidos para serem expressos na superfície dos linfócitos, por exemplo, células T γδ (por exemplo, células Vδ1, células Vδ2, células Vδ3, células Vδ5 e células Vδ8).

[0033] Definições

[0034] Deve ser entendido que os aspectos e as modalidades da invenção aqui descritos incluem “compreendendo”, “consistindo” e “consistindo essencialmente de” aspectos e modalidades. Como aqui usado, a forma singular “um”, “uma” e “o”, “a” inclui referências no plural, a menos que indicado de outra forma.

[0035] O termo “cerca de”, conforme usado neste documento, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo versado na técnica. A referência a “cerca de” um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro propriamente dito. Em alguns casos, “cerca de” abrange variações de + 20%, em alguns casos + 10%, em alguns casos + 5%, em alguns casos + 1%, ou em alguns casos + 0,1% do valor especificado, à medida que tais variações são apropriadas para executar os métodos descritos.

[0036] Como aqui usado, os termos “substancial” e “substancial- mente” referem-se à condição qualitativa de exibir extensão ou grau total ou quase total de uma característica ou propriedade de interesse. Alguém com habilidade comum nas artes biológicas entenderá que fenômenos biológicos e químicos raramente, ou nunca, são completos e/ou prosseguem para a conclusão ou alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo “substancialmente” é, portanto, usado neste documento para capturar a potencial falta de conclusão inerente a muitos fenômenos biológicos e químicos. Ao descrever um cenário físico, tal como interação receptor/ligante ou contato célula/célula, o cenário é substancial se seu resultado funcional for detectável por meios convencionais disponíveis para a pessoa que executa o método. Por exemplo, “substancial ativação de TCR” refere-se a um nível detectável de ativação de TCR entre uma população de células (por exemplo, um grau estatisticamente significativo de ativação de TCR). Em algumas modalidades, um TCR é substancialmente ativado mediante exposição a até 0,1%, até 0,5%, até 1%, até 5%, até 10%, até 20%, até 30% ou até 40% do EC50 do agonista da via de TCR (por exemplo, um anticorpo, por exemplo, anti-CD3, ou uma lectina) na respectiva população de células.

[0037] Como aqui usado, um “construto de direcionamento heterólogo” refere-se a uma proteína ou conjunto de proteínas (por exemplo, duas ou mais proteínas que dimerizam para formar uma proteína quaternária funcional) que reside em uma célula hospedeira (ou seja, uma célula modificada) e se liga a um molécula alvo presente em outra célula, e que não é expressa naturalmente pela célula na qual reside. Um construto de direcionamento heterólogo pode ser codificado por um polinucleotídeo expresso dentro da célula manipulada.

[0038] Como aqui usado, “ativar” uma célula T significa iniciar ou amplificar a via do receptor de células T (TCR) propagando a ativação do sinal 1 ou ativação do sinal 2. Por exemplo, um receptor de antígeno quimérico tendo um domínio de ativação de células T de sinal funcional 1 (por exemplo, CD3ζ) ou domínio coestimulatório (por exemplo, CD28, 4-1BB, etc.) pode “ativar” sua célula T hospedeira por agrupamento em resposta à ligação ao antígeno. Um construto de direcionamento heterólogo sem um domínio intracelular funcional pode não ter meios de propagar a ativação do sinal 1 ou ativação do sinal 2 e, portanto, não pode ativar a via de TCR. Um construto de direcionamento heterólogo sem um domínio intracelular funcional pode ser capaz de “ativar” a célula T na qual ele é expresso se seu domínio transmembrana propagar a coestimulação, por exemplo, após associação de um domínio transmembrana NKG2D com DAP10 ou DAP12 endógeno. Em modalidades alternativas, a invenção refere-se a construtos de direcionamento heterólogos com domínios transmembrana que não são funcionais, e o domínio de direcionamento heterólogo não ativa a célula T na qual ele é expresso.

[0039] A ativação da “via de receptor de células T (TCR)” refere-se à indução da proliferação ou outras consequências da ativação de células T através da sinalização de TCR. A via de sinalização de TCR envolve a ativação do sinal 1, por exemplo, ativação sequencial das proteínas tirosina quinases relacionadas a Src (PTKs), Lck e Fyn, e proteína quinase associada à cadeia zeta (TCR) de 70 kDA (ZAP70). Essas PTKs levam à fosforilação de polipeptídeos, incluindo ativador de ligante para células T (LAT), o que leva à estimulação à jusante por meio de quinase regulada por sinal extracelular (ERK), quinase N-terminal c- Jun (JNK), e fator nuclear de células T ativadas (NFAT). O sinal 2 (isto é, coestimulação), por exemplo através de CD28, CD45, DAP10 ou DAP12, pode aumentar a fosforilação e aumentar a ativação de TCR. Assim, qualquer molécula que tenha como alvo uma parte do TCR ou via coestimulatória pode ativar diretamente a sinalização de células T.

Moléculas ligadas à superfície que simplesmente colocam uma célula T em contato com uma célula alvo podem facilitar que outras moléculas desencadeiem diretamente a ativação de células T (por exemplo, um construto de direcionamento heterólogo), mas essas moléculas de direcionamento não ativam diretamente a via de TCR.

[0040] Os agonistas da via de TCR incluem anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, por exemplo, anti-TCR Vδ1, anti-TCR δTCS-1, anti-TCR PAN γδ e anti-CD3), lectinas (por exemplo, lectinas vegetais, por exemplo, Concanavalin A, lectinas de Phaseolus vulgaris (PHA-P), Phytolacca Americana, Triticum vulgaris, Lens culinaris, Glycine max, Maackia amurensis, Pisum sativum e Sambucus nigra), fosfoantígenos sintéticos (por exemplo, BrHPP (bromo-hidrina pirofosfato), 2M3B1PP (2-metil-3-butenil-1-pirofosfato), HMBPP ((E)-4- Hidroxi-3-metil-but-2-enil pirofosfato), ou IPP (isopentenil pirofosfato)), e N-bisfosfonatos (por exemplo, zoledronato). Os agonistas da via de TCR incluem agonistas de co-receptor, incluindo anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, por exemplo, anti-CD2, anti-CD6, anti-CD9, anti-CD28, anti-CD43, anti-CD94, anti-CD160, anti-SLAM, anti-NKG2D, anti-2B4, anti-HLA-A, anti-HLA-b, anti-HLA-C e anti-ICAM-3) e proteínas (por exemplo, proteínas recombinantes, por exemplo, proteínas humanas recombinantes, por exemplo, CD7L, CD26, CD27L, CD30L, CD40L, OX40L, 4-1BBL, ICAM-1, fibronectina, hidrocortisona e suas variantes, por exemplo, proteínas de fusão a Fc, por exemplo, CD27L- Fc). Os agonistas da via de TCR podem ser solúveis ou ligados à membrana e podem, por exemplo, ser apresentados em células, tal como células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs), como é o caso de complexos MHC ou HLA. As aAPCs adequadas para ativar a sinalização de células T são conhecidas na técnica. Os métodos adequados de ativação de células T adicionando exogenamente agonistas da via de TCR são bem conhecidos na técnica e resumidos na Figura 1 de Deniger, e outros (Deniger, e outros Frontiers in Immunology. 2014. 5 (636): 1 a 10).

[0041] “Agonistas da via de TCR exógeno” referem-se a agonistas da via de TCR que não se originam do tecido não hematopoiético ou doador do mesmo (isto é, eles são adicionados exogenamente). Assim, será entendido que, em algumas modalidades da invenção, um agonista da via de TCR pode estar presente na cultura como material residual a partir do tecido não hematopoiético (por exemplo, fibronectina solúvel ou ICAM-1 ligado a células). Em algumas modalidades, um agonista da via de TCR residual tem uma concentração desprezível e não ativa substancialmente as células T.

[0042] Para um domínio de uma proteína, tal como um construto de direcionamento heterólogo, a ser “operacionalmente ligado” a outro domínio aqui significa residir na mesma proteína que o outro domínio, ou diretamente adjacente ao outro domínio ou separado por um ou mais aminoácidos ou domínios. Por exemplo, em um construto de direcionamento heterólogo tendo um domínio de ligação ao antígeno N- terminal, um domínio de haste intermediário, e um domínio transmembrana C-terminal, o domínio de ligação ao antígeno, e o domínio transmembrana são referidos como estando operacionalmente ligados. Em um construto de direcionamento heterólogo tendo um domínio de ligação ao antígeno N-terminal imediatamente adjacente a um domínio transmembrana C-terminal, o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembrana também são referidos como operacionalmente ligados, mas, mais especificamente, estão diretamente ligados.

[0043] Como aqui usado, o termo “arcabouço de anticorpo” refere- se a uma proteína de ligação ao antígeno não nativa, peptídeo, ou fragmento de anticorpo. Os arcabouços de anticorpos incluem adnectinas, affibodies, affilins, anticalins, atrimers, avimers, peptídeos bicíclicos, centyrins, cys-knots, DARPins, fynomers, domínios Kunitz, Obodies e Tn3s. Os arcabouços de anticorpos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, por Vazquz-Lombardi e outros, Drug Discovery Today, 2015, 20 (10): 1271-83, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0044] O termo “anticorpo” é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[0045] Como aqui usado, o termo “citotoxicidade” refere-se à capacidade das células imunes (por exemplo, células T γδ) de matar outras células (por exemplo, células alvo). As células imunes com funções citotóxicas liberam proteínas tóxicas (por exemplo, perforina e granzimas) capazes de matar células próximas.

[0046] Como aqui usado, o termo “desgranulação” refere-se a um processo celular no qual moléculas, incluindo moléculas antimicrobia- nas e citotóxicas, são liberadas a partir de vesículas secretoras intracelulares chamadas grânulos. A desgranulação faz parte da resposta imune a patógenos e micro-organismos invasores por células imunes, tal como células T citotóxicas. As moléculas liberadas durante a desgranulação variam de acordo com o tipo de célula e podem incluir moléculas concebidas para matar os patógenos e micro-organismos invasores ou para promover uma resposta imune, tal como inflamação.

[0047] Como aqui usado, o termo “célula linfoide inata” refere-se a um linfócito do tipo inato sem receptores de antígenos rearranjados, tal como aqueles expressos por células T e B. As células linfoides inatas incluem células NK, células linfoides inatas tipo 1 (ILC1), células intra- ILC1, células linfoides inatas tipo 2 (ILC2), células linfoides inatas tipo 3 (ILC3), etc.

[0048] Como aqui usado, os termos “célula T invariante associada à mucosa” e “célula MAIT” referem-se a uma célula T inata que expressa uma cadeia de receptor α (TCRα) de célula T invariante e uma cadeia TCRβ diversa e pode reconhecer um conjunto distinto de moléculas no contexto de uma molécula 1 relacionada ao complexo principal de histocompatibilidade evolutivamente conservado (MR1).

[0049] Como aqui usado, o termo “célula NK” refere-se a uma célula exterminadora natural, um linfócito do tipo inato que não expressa um TCR ou CD3 e é positivo para a expressão de CD56 e CD161. As células NK também podem expressar receptores naturais de citotoxicidade, tal como NKp44 e NKp46.

[0050] Como aqui usado, o termo “célula T semelhante a NK” refere- se a células T semelhantes a células exterminadoras naturais, ou células T exterminadoras naturais (células NKT), que são linfócitos semelhantes ao inatos que expressam e compartilham características funcionais e estruturais tanto com as células T quanto com as células NK, isto é, expressam um TCR (por exemplo, αβ TCR), CD3 e CD56. As células T semelhantes a NK reconhecem e reagem contra glicolipídios no contexto da glicoproteína semelhante a MHC classe I, CD1d, e podem produzir IFN-γ e IL-4 mediante ativação.

[0051] Como aqui usado, “células não hematopoiéticas” incluem células estromais e células epiteliais. As células estromais são células do tecido conjuntivo não hematopoiético de qualquer órgão e suportam a função das células parenquimatosas desse órgão. Exemplos de células estromais incluem fibroblastos, pericitos, células mesenquimais, queratinócitos, células endoteliais, e células tumorais não hematoló- gicas. As células epiteliais são células não hematopoéticas que revestem as cavidades e superfícies dos vasos sanguíneos e órgãos do corpo. Elas são normalmente escamosas, de forma colunar ou cuboide, e podem ser dispostas como uma única camada de células, ou como camadas de duas ou mais células.

[0052] Como aqui usado, “células T γδ residentes em tecido não hematopoiético”, “derivadas de tecido não hematopoiético” e “células T nativas de tecido não hematopoiético” referem-se a células T γδ que estavam presentes em um tecido não hematopoiético no momento em que o tecido é explantado. As células T γδ residentes em tecido não hematopoiético podem ser obtidas a partir de qualquer tecido não hematopoiético animal humano ou não humano adequado. O tecido não hematopoiético é um tecido que não o sangue ou a medula óssea. Em algumas modalidades, as células T γδ não são obtidas a partir de tipos particulares de amostras de fluidos biológicos, tal como sangue ou fluido sinovial. Exemplos de tais tecidos não hematopoiéticos humanos ou não humanos adequados incluem pele ou uma porção da mesma (por exemplo, derme ou epiderme), o trato gastrointestinal (por exemplo, epitélio gastrointestinal, cólon, intestino delgado, estômago, apêndice, ceco, ou reto), tecido da glândula mamária, pulmão (de preferência em que o tecido não é obtido por lavagem broncoalveolar), próstata, fígado e pâncreas. Em algumas modalidades, as células T γδ residentes em tecido não hematopoiético podem ser derivadas de um tecido linfoide, tal como timo, baço ou amídala. As células T γδ também podem ser residentes em tecidos cancerosos humanos, por exemplo, mama e próstata. Em algumas modalidades, as células T γδ não são obtidas a partir de tecido de câncer humano. As amostras de tecido não hematopoiético podem ser obtidas por técnicas padrão, por exemplo, por explante (por exemplo, biópsia). As células T γδ residentes em tecido não hematopoiético incluem, por exemplo, células T Vδ1, células T duplo negativas (DN), células T Vδ2, células T Vδ3, e células T Vδ5.

[0053] Qualquer um ou mais dos fatores acima podem ser incluídos em um protocolo de expansão em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de linfócitos (por exemplo, células T γδ), que pode ser transfectada com um ácido nucleico que codifica um construto de direcionamento heterólogo da invenção. Tal como aqui utilizada, a frase “em uma quantidade eficaz para” refere-se a uma quantidade que induz um resultado detectável (por exemplo, um número de células tendo um número estatisticamente aumentado significativamente em relação à sua população inicial, por exemplo, em p < 0,05). Em casos em que múltiplos fatores estão presentes ao mesmo tempo, uma quantidade eficaz se refere ao efeito composto de todos os fatores (por exemplo, o efeito composto de IL-2 e IL-15, ou o efeito composto de IL- 2, IL-4, IL-15 e IL-21).

[0054] Como aqui usado, uma “população expandida de células γδ” refere-se a uma população de células hematopoiéticas ou não hematopoiéticas, incluindo células T γδ que foram cultivadas em uma condição e por um período que induziu a expansão de células γδ, ou seja, aumentou número de células γδ. Da mesma forma, uma “população expandida de células T Vδ1”, tal como aqui utilizada, refere- se a uma população de células hematopoiéticas ou não hematopoiéti- cas, incluindo células T Vδ1, que foram cultivadas em uma condição e por um período que induziu a expansão de células T Vδ1, isto é, aumento do número de células Vδ1.

[0055] Como aqui usado, uma “célula alimentadora” refere-se a qualquer célula exógena adicionada a uma cultura para fornecer contato de superfície célula a célula com as células derivadas de tecido não hematopoiético. As células alimentadoras podem ser células primárias (por exemplo, derivadas de um tecido) ou derivadas de uma linhagem celular. As células alimentadoras podem ser vivas ou irradiadas, e incluem células tumorais, fibroblastos, células B, e outras células apresentadoras de antígeno.

[0056] O termo “marcador”, neste documento, refere-se a um DNA, RNA, proteína, carboidrato, glicolipídio ou marcador molecular baseado em células, cuja expressão ou presença na amostra de um paciente pode ser detectada por métodos padrão (ou métodos aqui descritos).

[0057] Uma célula ou população de células que “expressa” um marcador de interesse é aquela em que o mRNA que codifica a proteína, ou a própria proteína, incluindo seus fragmentos, é determinado como estando presente na célula ou na população. A expressão de um marcador pode ser detectada por vários meios. Por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um marcador refere-se a uma densidade de superfície do marcador em uma célula. A intensidade média de fluorescência (MFI), por exemplo, usada como uma leitura de citometria de fluxo, é representativa da densidade de um marcador em uma população de células. Um versado na técnica entenderá que os valores de MFI dependem dos parâmetros de coloração (por exemplo, concentração, duração e temperatura) e da composição de fluorocromo. No entanto, a MFI pode ser quantitativa quando considerada no contexto de controles apropriados. Por exemplo, pode-se dizer que uma população de células expressa um marcador se a MFI de um anticorpo para esse marcador for significativamente maior do que a MFI de um anticorpo de controle de isotipo apropriado na mesma população de células, corado em condições equivalentes. Adicionalmente ou alternati- vamente, pode-se dizer que uma população de células expressa um marcador em uma base de célula a célula usando uma entrada positiva e negativa de acordo com métodos analíticos de citometria de fluxo convencionais (por exemplo, definindo a entrada de acordo com controles isotipo ou “fluorescência-menos-um” (FMO)). Por esta métrica, pode-se dizer que uma população “expressa” um marcador se o número de células detectadas positivas para o marcador for significativamente maior do que a linha de base (por exemplo, ativando um controle isotipo).

[0058] Como aqui usado, quando a expressão de uma população é declarada como uma porcentagem de células positivas e essa porcentagem é comparada com uma porcentagem correspondente de células positivas de uma população de referência, a diferença percentual é uma porcentagem da população parental de cada respectiva população. Por exemplo, se um marcador é expresso em 10% das células da população A, e o mesmo marcador é expresso em 1% das células da população B, então diz-se que a população A tem uma frequência 9% maior de marcador-células positivas do que a população B (ou seja, 10% -1%, não 10% ÷ 1%). Quando uma frequência é multiplicada pelo número de células na população parental, a diferença em número absoluto de células é calculada. No exemplo dado acima, se houver 100 células na população A, e 10 células na população B, então a população A terá 100 vezes o número de células em relação à população B, ou seja, (10% x 100) ÷ (1% x 10).

[0059] Um nível de expressão de um marcador pode ser um nível de expressão de ácido nucleico (por exemplo, um nível de expressão de DNA ou um nível de expressão de RNA, por exemplo, um nível de expressão de mRNA). Qualquer método adequado para determinar um nível de expressão de ácido nucleico pode ser usado. Em algumas modalidades, o nível de expressão de ácido nucleico é determinado usando qPCR, rtPCR, RNA-seq, qPCR multiplex ou RT-qPCR, análise de microarranjo, análise serial de expressão gênica (SAGE), técnica MassARRAY, hibridização in situ (por exemplo, FISH), ou combinações das mesmas.

[0060] Como aqui usado, uma “população de referência” de células refere-se a uma população de células correspondente às células de interesse, contra as quais um fenótipo das células de interesse é medido. Por exemplo, um nível de expressão de um marcador em uma população separada de células γδ derivadas de tecido não hematopoiético pode ser comparado com o nível de expressão do mesmo marcador em uma célula T γδ derivada de tecido hematopoiético (por exemplo, uma célula T γδ derivada residente no sangue, por exemplo, uma célula γδ residente no sangue derivada do mesmo doador ou de um doador diferente) ou uma célula T γδ derivada de tecido não hematopoiético expandida sob diferentes condições (por exemplo, na presença de substancial ativação de TCR, na presença de um agente de ativação de TCR exógeno (por exemplo, anti-CD3), ou em contato substancial com células estromais (por exemplo, fibroblastos). Uma população também pode ser comparada a si mesma em um estado anterior. Por exemplo, uma população de referência pode ser uma população de células separadas antes de sua expansão. Neste caso, a população expandida é comparada com sua própria composição antes da etapa de expansão, ou seja, sua composição anterior, neste caso, é a população de referência.

[0061] “Câncer” refere-se à proliferação anormal de células cancerosas malignas e inclui câncer hematopoiético (por exemplo, uma malignidade hematológica, tal como uma leucemia, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia eosinofílica crônica (CEL), síndrome mielodisplásica (MDS), leucemia linfoblástica aguda (ALL), e leucemia linfocítica crônica (CLL), linfomas tal como linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin (NHL) e mieloma múltiplo (MM)), e cânceres sólidos tal como sarcomas (por exemplo, sarcoma de tecidos moles, sarcoma uterino), câncer de pele, melanoma (por exemplo, melanoma maligno), câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de útero, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer colorretal (por exemplo, adenocarcinoma colorretal), câncer cervical, câncer de fígado (ou seja, câncer hepático), câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço), câncer de esôfago, câncer de pâncreas, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais),

câncer adrenal, câncer de estômago, câncer gástrico (por exemplo, adenocarcinoma gástrico), câncer testicular, câncer de vesícula biliar e tratos biliares, câncer de tireoide, câncer de timo, câncer de osso, câncer cerebral, câncer biliar, câncer de bexiga, carcinoma ósseo e de tecidos moles, tumor cerebral, câncer cervical, câncer de cólon, tumor desmoide, câncer embrionário, câncer endometrial, câncer esofágico, adenocarcinoma gástrico, glioblastoma multiforme, tumor ginecológico, osteossarcoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, tumor astrocítico primário, câncer de tireoide primário, rabdomiossarcoma, câncer de pele, tumor testicular de células germinativas, câncer urotelial, e câncer uterino. As células cancerosas no paciente com câncer podem ser imunologicamente distintas das células somáticas normais no indivíduo (por exemplo, o tumor canceroso pode ser imunogênico). Por exemplo, as células cancerosas podem ser capazes de desencadear uma resposta imune sistêmica no paciente com câncer contra um ou mais antígenos expressos pelas células cancerosas. Os antígenos que induzem a resposta imune podem ser antígenos tumorais ou podem ser compartilhados por células normais. Um paciente com câncer pode exibir pelo menos um sinal, sintoma ou achado laboratorial identificável que é suficiente para fazer um diagnóstico de câncer de acordo com os padrões clínicos conhecidos na técnica. Exemplos de tais padrões clínicos podem ser encontrados em livros didáticos de medicina, tal como Harrison’s Principles of Internal Medicine (Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Jameson J, Loscalzo J. eds. 18e. Nova Iorque, NY: McGraw-Hill; 2012). Em alguns casos, um diagnóstico de câncer em um indivíduo pode incluir a identificação de um tipo de célula particular (por exemplo, uma célula cancerosa) em uma amostra de um fluido corporal ou tecido obtido do indivíduo.

[0062] Como aqui usado, um “tumor sólido” é qualquer câncer de tecido corporal que não sangue, medula óssea ou sistema linfático. Os tumores sólidos podem ser divididos naqueles de origem em células epiteliais e naqueles de origem em células não epiteliais. Exemplos de tumores sólidos de células epiteliais incluem tumores do trato gastrointestinal, cólon, mama, próstata, pulmão, rim, fígado, pâncreas, ovário, cabeça e pescoço, cavidade oral, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, ânus, vesícula biliar, lábio, nasofaringe, pele, útero, órgão genital masculino, órgãos urinários, bexiga, e pele. Os tumores sólidos de origem não epitelial incluem sarcomas, tumores cerebrais, e tumores ósseos.

[0063] Um paciente, sujeito ou indivíduo adequado para o tratamento como descrito acima pode ser um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, um porquinho-da-Índia, um hamster, um rato, um camundongo), murino (por exemplo, um camundongo), canino (por exemplo, um cão), felino (por exemplo, um gato), equino (por exemplo, um cavalo), um primata, símio (por exemplo, um macaco ou símio), um macaco (por exemplo, um sagui ou babuíno), um macaco de grande porte (por exemplo, um gorila, chimpanzé, orangotango ou gibão), ou um humano.

[0064] Em algumas modalidades, o paciente, sujeito ou indivíduo é um humano. Em outras modalidades preferenciais, mamíferos não humanos, especialmente mamíferos que são convencionalmente usados como modelos para demonstrar a eficácia terapêutica em humanos (por exemplo, murino, primata, suíno, canino ou coelho) podem ser empregues.

[0065] Como aqui usado, “tratamento” (e suas variações gramati- cais, como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica, seja de um humano ou animal (por exemplo, em aplicações veterinárias), na qual algum efeito terapêutico desejado é alcançado, por exemplo, a inibição ou atraso do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa de progresso, uma interrupção na taxa de progresso, melhora da condição, cura ou remissão (seja parcial ou total) da condição, prevenir, retardar, diminuir ou interromper um ou mais sintomas e/ou sinais da condição ou prolongar a sobrevida de um sujeito ou paciente além do esperado na ausência de tratamento.

[0066] O tratamento como medida profilática (isto é, profilaxia) também está incluído. Por exemplo, um paciente, sujeito ou indivíduo susceptível ou em risco de ocorrência ou recorrência de câncer pode ser tratado conforme descrito neste documento. Tal tratamento pode prevenir ou atrasar a ocorrência ou recorrência de câncer no paciente, sujeito ou indivíduo.

[0067] Em particular, o tratamento pode incluir a inibição do crescimento do câncer, incluindo a remissão completa do câncer e/ou inibição da metástase do câncer. O crescimento do câncer geralmente se refere a qualquer um de uma série de índices que indicam mudança dentro do câncer para uma forma mais desenvolvida. Assim, os índices para medir uma inibição do crescimento do câncer incluem uma diminuição na sobrevida das células cancerosas, uma diminuição no volume ou morfologia do tumor (por exemplo, conforme determinado usando tomografia computadorizada (TC), ultrassonografia ou outro método de imagem), um crescimento retardado do tumor, uma destruição da vasculatura do tumor, desempenho melhorado no teste cutâneo de hipersensibilidade retardada, um aumento na atividade dos linfócitos T citolíticos, e uma diminuição nos níveis de antígenos tumor- específicos. A redução da supressão imune em tumores cancerosos em um indivíduo pode melhorar a capacidade do indivíduo de resistir ao crescimento do câncer, em particular ao crescimento de um câncer já presente no sujeito e/ou diminuir a propensão para o crescimento do câncer no indivíduo.

[0068] Em algumas modalidades, as células T γδ expandidas (por exemplo, células T γδ derivadas de tecido não hematopoiético, por exemplo, células T Vδ1 derivadas de tecido não hematopoiético) são administradas para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença ou distúrbio.

[0069] Como aqui usado, “administrar” significa um método de fornecer uma dosagem de uma terapia (por exemplo, uma terapia com células T adotivas incluindo, por exemplo, células T derivadas de tecido não hematopoiético) ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica, por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo células T γδ derivadas de tecido não hematopoiético) a um paciente. As composições utilizadas nos métodos aqui descritos podem ser administradas, por exemplo, por via intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutânea, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intraretal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, intraorbital, intravítrea (por exemplo, por injeção intravítrea), por colírio, por via oral, tópica, transdérmica, por inalação, por injeção, por implantação, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada banhando as células alvo diretamente, por cateter, por lavagem, em cremes ou em composições lipídicas. As composições utilizadas nos métodos aqui descritos também podem ser administradas sistemicamente ou localmente. O método de administração pode variar dependendo de vários fatores (por exemplo, o agente terapêutico ou composição a ser administrada e a gravidade da condição, doença ou distúrbio a ser tratado).

[0070] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um mamífero. No caso de cânceres, a quanti- dade terapeuticamente eficaz do agente terapêutico (por exemplo, uma célula T γδ derivada de tecido não hematopoiético) pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor primário; inibir (isto é, desacelerar até certo ponto e de preferência parar) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e de preferência parar) a metástase do tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Na medida em que o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapia de câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida avaliando-se a duração da sobrevida, o tempo de progressão da doença (TTP), as taxas de resposta (por exemplo, resposta completa (CR) e resposta parcial (PR)), a duração da resposta, e/ou a qualidade de vida.

[0071] O termo “simultaneamente” é usado neste documento para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, onde pelo menos parte da administração se sobrepõe no tempo. Consequen- temente, a administração simultânea inclui um regime de dosagem quando a administração de um ou mais agentes continua após a interrupção da administração de um ou mais outros agentes. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula T γδ derivada de tecido não hematopoiético e IL-2 podem ser administradas simultaneamente.

[0072] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma de modo a permitir que a atividade biológica de um ou mais ingredientes ativos nela contidos seja eficaz e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um paciente ao qual a formulação seria administrada.

[0073] Como aqui usado, um “domínio transmembrana terminal” refere-se a um domínio transmembrana com uma extremidade terminal não ligada (por exemplo, um C terminal que não está ligado a um peptídeo ou proteína). Assim, um domínio transmembrana terminal não está ligado a um domínio intracelular, tal como um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, um domínio trans- membrana terminal não participa de uma via de sinalização intracelular (por exemplo, uma via de sinalização de células T, tal como ativação do sinal 1 ou coestimulação do sinal 2).

[0074] Como aqui usado, o termo “receptor de antígeno quimérico” ou, alternativamente, um “CAR” refere-se a um construto polipeptídico recombinante incluindo um domínio de ligação ao antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio intracelular que propaga um sinal de ativação que ativa a célula. Em algumas modalidades, o CAR inclui uma sequência líder opcional no N terminal da proteína de fusão do CAR.

[0075] No caso de quaisquer conflitos ou inconsistências entre as definições estabelecidas neste documento e as definições fornecidas em qualquer uma das referências aqui incorporadas por referência, as definições estabelecidas neste documento devem prevalecer.

[0076] Células T γδ e outros linfócitos semelhantes ao inato que expressam construtos de direcionamento heterólogos

[0077] Os linfócitos, tal como células T γδ e outros linfócitos semelhantes ao inato (por exemplo, células linfoides inatas, tal como células NK e células T semelhantes a NK e células T invariantes associadas à mucosa (MAIT)) são veículos atrativos para os construtos de direcionamento heterólogos aqui descritos, uma vez que podem ser transduzidos com construtos de direcionamento heterólogos enquanto mantêm suas capacidades semelhantes ao inato de reconhecer células patogênicas, tal como células cancerosas e células infectadas. A transdução pode ser realizada usando qualquer método adequado conhecido na técnica ou aqui descrito, tal como por eletroporação, edição de genes (por exemplo, por repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR), transfecção de nuclease de dedo de zinco (ZFN)), entregue por transposon, etc. Além disso, a falta de reconhecimento de antígeno dependente de MHC, por exemplo, por células T γδ, reduz o potencial para doença de enxerto versus hospedeiro e permite que elas tenham como alvo tumores que expressam baixos níveis de MHC. Da mesma forma, a não dependência de células T γδ da coestimulação convencional do sinal 2, por exemplo, via engajamento de CD28, aumenta o direcionamento de tumores que expressam baixos níveis de ligantes para receptores coestimuladores.

[0078] Em um aspecto, a invenção fornece células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas, e células MAIT e populações de células das mesmas, expressando um construto de direcionamento heterólogo em sua superfície. Tais células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas e células MAIT manipuladas para expressar um construto de direcionamento heterólo- go podem ser utilizadas para direcionar um antígeno desejado através de um domínio de ligação ao antígeno no construto heterólogo. Como as células T γδ não dependem de receptores de MHC para responder a patógenos estranhos, o construto de direcionamento heterólogo não requer um domínio intracelular para induzir citólise ou citotoxicidade, em contraste com sistemas convencionais de receptor de antígeno quimérico (CAR) usados como parte dos regimes de imunoterapia com células T adotivas convencionais (por exemplo, αβ). Em vez disso, as células T γδ induzem uma citólise intrínseca específica para o alvo, e esta resposta pode ser ainda mais intensificada, melhorando e aumentando o tempo de contato com a célula alvo (por exemplo, um tumor, por exemplo, um tumor sólido) usando um construto heterólogo. A célula T γδ manipulada com um construto heterólogo pode se ligar a um antígeno alvo, tal como um antígeno associado a tumor, e induzir citotoxicidade e/ou citólise. Esta citotoxicidade pode ser mediada através da expressão endógena de receptores ativadores, tal como

NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 e/ou DNAM1.

[0079] O construto de direcionamento heterólogo pode apresentar um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno. Um domínio de haste pode ainda ser incluído como parte do construto de direcionamento heterólogo para ligar o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana. Em algumas modalidades, o construto de direcionamento heterólogo fornecido neste documento carece de um domínio intracelular (Figura 1) e também carece da capacidade de ativar a sinalização de TCR (por exemplo, através da ativação do sinal 1 e/ou ativação do sinal 2 (ou seja, coestimulação).

[0080] Em algumas modalidades, a citólise é caracterizada por desgranulação (por exemplo, desgranulação de CD107) da célula T γδ, liberação de granzima pela célula T γδ, liberação de perforina pela célula T γδ, morte de célula alvo, proliferação da célula T γδ ou produção de citocinas pela célula T γδ. Um versado na técnica reconhecerá que vários ensaios que medem essas propriedades ou atividades podem ser usados para avaliar a eficácia de uma célula T manipulada, por exemplo, no tratamento de câncer.

[0081] Em geral, a desgranulação é um pré-requisito para a citólise. As células de desgranulação podem ser identificadas, por exemplo, pela expressão na superfície de LAMP-1 (proteína de membrana associada ao lisossoma 1, também conhecida como CD107). CD107 é expressa transientemente na superfície e rapidamente se internaliza após a desgranulação. Em um estado não ativado, CD107a reside no citoplasma da membrana granular citolítica. A indução pode ser medida (por exemplo, por FACS) por coloração de CD107 na presença de monensina para evitar a acidificação de vesículas contendo CD107a internalizadas marcadas com anticorpo.

[0082] Os ensaios de perforina e granzima também podem ser medidos por FACS, de acordo com métodos conhecidos na técnica. As células T γδ citotóxicas matam seu alvo por mecanismos mediados por grânulos ou receptor. Os grânulos citotóxicos são lisossomas secretores pré-formados no citoplasma contendo proteínas líticas (perforina e granzimas). Após o reconhecimento da célula alvo, as proteínas líticas são secretadas por exocitose. Após o reconhecimento da célula alvo, a diminuição do nível de granzima e/ou perforina intracelular pode, assim, ser medida por FACS.

[0083] Os ensaios de morte celular podem ser usados para monitorar o efeito de uma célula T γδ expressando um construto de direcionamento heterólogo. Um ensaio cinético de lise de células alvo pode ser usado para rastrear a porcentagem de morte ao longo do tempo em várias relações efetoras - alvo. Um ensaio de lise de célula alvo de desfecho (por exemplo, ensaio de luciferase) pode ser usado para rastrear a porcentagem de morte em um tempo de desfecho específico em várias relações efetoras - alvo. A formação de sinapse imunológica (por exemplo, observada por imagem de células vivas) pode ser usada para medir a cinética de ligação, o reconhecimento do alvo (por exemplo, fluxo de Ca em células efetoras), golpe letal (por exemplo, medido por blush de iodeto de propídio nas células alvo), ou arredondamento de células alvo.

[0084] Em algumas modalidades, a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo expresso em uma célula saudável não desencadeia substancialmente a citólise na célula T γδ manipulada. Em algumas modalidades, a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo expresso em uma célula tumoral ou uma célula infectada substancialmente desencadeia a citólise na célula T γδ manipulada.

[0085] Em um aspecto, a invenção fornece uma célula (por exem- plo, célula T γδ, célula NK, célula T semelhante a NK, célula linfoide inata ou célula MAIT) manipulada para expressar um construto de direcionamento heterólogo, em que a célula manipulada exibe uma propriedade antitumoral. Em um aspecto, uma célula é transfectada (por exemplo, por nucleofecção, eletroporação, etc.) com o construto de direcionamento heterólogo e o construto de direcionamento heterólogo é expresso na superfície da célula. Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, célula T γδ, célula NK, célula T semelhante a NK, célula linfoide inata ou célula MAIT) é transduzida com um vetor viral que codifica um construto de direcionamento heterólogo. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral. Em algumas modali- dades, o vetor viral é um vetor lentiviral. Em algumas de tais modalidades, a célula pode expressar de forma estável o construto de direcionamento heterólogo. Em outra modalidade, a célula (por exemplo, célula T γδ, célula NK, célula T semelhante a NK, célula linfoide inata ou célula MAIT) é transfectada (por exemplo, por nucleofecção, eletroporação, etc.) com um ácido nucleico, por exemplo, mRNA, cDNA, DNA, que codifica um construto de direcionamento heterólogo. Em algumas modalidades, a célula pode expressar transientemente o construto de direcionamento heterólogo.

[0086] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma população de células (por exemplo, uma população de células isolada) de células T γδ manipuladas (por exemplo, pelo menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 ou 1013 células), onde pelo menos 10% (por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou substancialmente toda) da população de células são de células T γδ manipuladas que expressam um construto de direcionamento heterólogo.

[0087] Alternativamente, a invenção refere-se a uma população de células (por exemplo, uma população de células isolada) de células NK manipuladas ou células T semelhantes a NK (por exemplo, pelo menos

10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 ou 1013 células NK ou células T semelhantes a NK), onde pelo menos 10% (por exemplo, 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou substancialmente toda) da população de células é manipulada para expressar um construto de direcionamento heterólogo.

[0088] Alternativamente, a invenção refere-se a uma população de células (por exemplo, uma população de células isolada) de células linfoides inatas manipuladas (por exemplo, pelo menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 ou 1013 células NK ou células T semelhantes a NK), onde pelo menos 10% (por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou substancialmente toda) da população de células é manipulada para expressar um construto de direcionamento heterólogo. Alternativamente, a invenção refere-se a uma população de células (por exemplo, uma população de células isolada) de células MAIT manipuladas (por exemplo, pelo menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 ou 1013 células NK ou células T semelhantes a NK), onde pelo menos 10% (por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ou substancialmente toda) da população de células é manipulada para expressar um construto de direcionamento heterólogo. Construtos de Direcionamento Heterólogos

[0089] Vários tipos de células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT podem ser modificados para incluir um construto de direcionamento heterólogo para produzir uma célula T γδ manipulada, célula NK, célula T semelhante a NK, inata célula linfoide ou célula MAIT. O construto de direcionamento heterólogo inclui um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana. Por exemplo, o construto de direcionamento heterólogo pode incluir um domínio de ligação ao antígeno extracelular operacionalmente ligado a um domínio transmembrana por 1 a 1.000 resíduos de aminoácidos (por exemplo, por 1 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 100, 100 a 250, 250 a 500 ou 500 a 1.000 resíduos de aminoácidos). Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno está conectado a um domínio transmembrana por um domínio de haste. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno extracelular, o domínio de haste, e o domínio transmembrana estão operacionalmente ligados em uma orientação N- a C-terminal (por exemplo, N - domínio de ligação de antígeno - domínio de haste - domínio transmembrana - C). Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno extracelular, o domínio de haste, e o domínio transmembrana estão diretamente ligados em uma orientação N- a C-terminal.

[0090] Em geral, um construto de direcionamento heterólogo descri- to neste documento inclui um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo específico sem um domínio de sinalização intracelular. Em contraste com as células T αβ manipuladas (por exemplo, células CAR T), que não são eficazes sem um domínio intracelular funcional (Ghosh e outros, Nat. Med., 23: 242 a 251, 2017; Whilding e outros Mol. Ther., 25: 259 a 273, 2017; e Wilkie e outros J. Biol. Chem., 285: 25538 a 25544, 2010), a ativação de linfócitos semelhantes ao inato, tal como células T γδ, pode ser mediada por um construto de direcionamento heterólogo sem um domínio intracelular funcional. Um versado na técnica apreciará que o polipeptídeo pode conter resíduos de aminoácidos intracelulares não funcionais, por exemplo, como uma extensão do domínio transmembrana, que não ativa diretamente a célula T manipulada. Por exemplo, em alguns aspectos, o domínio transmembrana pode incluir resíduos extras para fins estruturais, de estabilidade e/ou expressão, ou pode ter um domínio intracelular não funcional. Em algumas modalidades, não mais que 50% (por exemplo, não mais que 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%) do domínio transmembrana C-terminal reside intracelularmente. Domínio de Ligação ao Antígeno

[0091] O domínio de ligação ao antígeno pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo manipulado para se ligar especificamente a um alvo. Os domínios de ligação ao antígeno podem assumir a forma de várias estruturas, por exemplo, um receptor de células B, um arcabouço ou mimético de anticorpo (por exemplo, um affibody, uma affilin, uma anticalin, um aptamer, um atrimer, um DARPin, um arcabouço FN3, um fynomer, um domínio Kunitz, uma pronectina, um Obody, um peptídeo bicíclico, um cys-knot, etc.), um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo monoclonal (mAb), um fragmento de ligação ao antígeno (Fab), ou receptor de células T (TCR) (Figura 2A). O domínio de ligação ao antígeno pode se ligar a um alvo, tal como um antígeno associado a tumor (TAA; por exemplo, um TAA expresso em um tumor sólido). O TAA pode ser, por exemplo, um antígeno de proteína ou de peptídeo expresso na superfície de uma célula tumoral. Alternativa- mente, os TAAs incluem carboidratos ou gangliosídeos expressos na superfície de uma célula tumoral. Em algumas modalidades, o TAA é um antígeno imunossupressor. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um receptor ligante-específico, conforme ilustrado na Figura 2B. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um ligante receptor-específico, conforme ilustrado na Figura 2C.

[0092] Em um aspecto, a porção de ligação ao alvo do construto de direcionamento heterólogo é um scFv. Em um aspecto, tais fragmentos de anticorpo são funcionais na medida em que mantêm a afinidade de ligação equivalente, por exemplo, eles se ligam ao mesmo antígeno com eficácia comparável, como o anticorpo IgG do qual é derivado. Alternativamente, eles podem ser manipulados para afinidade de ligação aumentada ou afinidade de ligação mais fraca conforme necessário, por exemplo, para atingir cinética de ligação ideal (por exemplo, avidez) com base, por exemplo, na densidade de expressão de um antígeno alvo. Em um aspecto, tais fragmentos de anticorpo são funcionais no sentido de que fornecem uma resposta biológica que pode incluir, mas não está limitada à ativação de uma resposta imune, à inibição da origem de transdução de sinal a partir de seu antígeno alvo, à inibição da atividade de quinase, e similares, como será entendido por um versado na técnica.

[0093] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno do construto de direcionamento heterólogo é um fragmento de anticorpo scFv murino. Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno do construto de direcionamento heterólogo é um fragmento de anticorpo scFv que é humanizado em comparação com a sequência murina do scFv do qual é derivado. A humanização de um scFv de camundongo pode ser desejada para o ambiente clínico, onde os resíduos específicos de camundongo podem induzir uma resposta de antígeno anti-camundongo humano (HAMA) em pacientes que recebem tratamento com células T manipuladas.

[0094] Em um aspecto, a porção do domínio de ligação ao antígeno de um construto de direcionamento heterólogo é codificada por um transgene cuja sequência foi códon-otimizada para expressão em uma célula de mamífero. Em um aspecto, todo o construto de direcionamento heterólogo da invenção é codificado por um transgene tendo uma sequência que foi códon-otimizada para expressão em uma célula de mamífero. A otimização de códons refere-se à descoberta de que a frequência de ocorrência de códons sinônimos (isto é, códons que codificam para o mesmo aminoácido) no DNA codificante é diferente em espécies diferentes. Tal degenerescência de códons permite que um polipeptídeo idêntico seja codificado por uma variedade de sequências de nucleotídeos. Uma variedade de métodos de otimização de códons é conhecida na técnica e inclui, por exemplo, os métodos descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.786.464 e 6.114.148, ambas as quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[0095] Em um aspecto, o construto de direcionamento heterólogo da invenção inclui um elemento de ligação específico do alvo ao domínio de ligação ao antígeno. A escolha da porção depende do tipo e do número de ligantes que definem a superfície de uma célula alvo. Por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno pode ser escolhido para reconhecer um ligante que atua como um marcador de superfície celular em células alvo associadas a um estado de doença particular. Exemplos de marcadores de superfície celular que podem atuar como ligantes para o domínio de ligação ao antígeno em um construto de direcionamento heterólogo da invenção incluem aqueles associados com câncer, bem como infecções virais, bacterianas, parasitárias.

[0096] Em um aspecto, a resposta de célula T mediada pelo construto de direcionamento heterólogo pode ser direcionada a um antígeno de interesse por meio de manipulação de um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno desejado no construto de direcionamento heterólogo. O domínio de ligação ao antígeno pode ser qualquer domínio que se liga ao antígeno, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado e um fragmento funcional do mesmo, incluindo, mas não limitado a um anticorpo de domínio único tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de nanocorpo derivado de camelídeo, e a uma estrutura alternativa conhecida na técnica para funcionar como domínio de ligação ao antígeno, tal como um domínio de fibronectina recombinante e similares. Em alguns casos, é benéfico para o domínio de ligação ao antígeno ser derivado da mesma espécie em que o construto de direcionamento heterólogo será finalmente utilizado. Por exemplo, para uso em humanos, pode ser benéfico para o domínio de ligação ao antígeno do construto de direcionamento heterólogo incluir resíduos humanos ou humanizados para o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0097] Em algumas modalidades de qualquer aspecto da invenção, um construto de direcionamento heterólogo inclui características de um domínio de ligação ao antígeno que é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Um anticorpo humanizado pode ser produzido usando uma variedade de técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a, enxerto de CDR (ver, por exemplo, Patente Europeia No. EP 239.400; Publicação PCT No. WO 91/09967; e Patentes US. Nos. 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089, cada um dos quais é incorporado aqui em sua totalidade por referência), remodelagem da superfície (ver, por exemplo, Patentes Europeias Nos. EP 592.106 e EP 519.596, cada uma das quais é incorporada neste documento em sua totalidade por referência), embaralhamento de cadeia (ver, por exemplo, Patente US. 5.565.332, que é incorporada neste documento em sua totalidade por referência) e técnicas descritas, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US No. 2005/0042664, Publicação de Pedido de Patente US. No. 2005/0048617, Patentes US. Nos. 6.407.213 e 5.766.886, e Publicação Internacional No. WO 93/17105, cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade por referência. Frequentemente, os resíduos da estrutura nas regiões da estrutura serão substituídos pelo resíduo correspondente a partir do anticorpo doador de CDR para alterar, por exemplo, melhorar a ligação ao antígeno. Essas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações da CDR e resíduos de estrutura para identificar resíduos de estrutura importantes para a ligação ao antígeno e comparação de sequências para identificar resíduos de estrutura não usuais em posições particulares. Ver, por exemplo, Patente US. No. 5.585.089, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0098] Um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tem um ou mais resíduos de aminoácidos restantes nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente chamados de resíduos de “importação”, que são tipicamente retirados de um domínio variável de “importação”. Conforme fornecido neste documento, os anticorpos humanizados ou fragmentos de anticorpos incluem uma ou mais CDRs a partir de moléculas de imunoglobulina não humana e regiões estruturais em que os resíduos de aminoácidos incluindo a estrutura são derivados completamente ou principalmente da linhagem germinativa humana. Múltiplas técnicas para humanização de anticorpos ou fragmentos de anticorpos são bem conhecidas e podem essencialmente ser realizadas seguindo os métodos de Jones e outros, Nature, 1986, 321: 522 a 525; Riechmann e outros, Nature, 1988, 332: 323 a 327; e Verhoeyen e outros, Science, 1988, 239: 1534 a 1536, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade, substituindo as CDRs ou sequências de CDR de roedores pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano, isto é, enxerto de CDR. Em tais anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Os anticorpos humanizados são frequentemente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de estrutura (FR) são substituídos por resíduos a partir de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[0099] Em alguns aspectos, a porção de um construto de direcionamento heterólogo da invenção que inclui um fragmento de anticorpo é humanizada com retenção de alta afinidade com o antígeno alvo e outras propriedades biológicas favoráveis. De acordo com um aspecto da invenção, os anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpos são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Programas de computador que estão disponíveis ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, por exemplo, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao antígeno alvo. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptora e de importação de modo que o anticorpo desejado ou a característica do fragmento de anticorpo, tal como afinidade aumentada com o antígeno alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR estão direta e substancial- mente envolvidos em influenciar a ligação ao antígeno.

[0100] Em alguns casos, os scFvs podem ser preparados de acordo com o método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Bird e outros, Science, 1988, 242: 423 a 426 e Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 5879 a 5883; cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade). As moléculas de ScFv podem ser produzidas ligante as regiões VH e VL usando ligantes polipeptídicos flexíveis. As moléculas de scFv incluem um ligante (por exemplo, um ligante Ser-Gly) com um comprimento e/ou composição de aminoácidos otimizada. O comprimento do ligante pode afetar muito como as regiões variáveis de um scFv se dobram e interagem. Na verdade, se um ligante polipeptídico curto for empregue (por exemplo, entre 5 a 10 aminoácidos), o dobramento intracadeia é evitado. O dobramento intercadeia também é necessário para reunir as duas regiões variáveis para formar um sítio de ligação ao epítopo funcional. Para exemplos de orientação e tamanho do ligante, consultar, por exemplo, Hollinger e outros Proc Natl Acad. Sci. USA, 1993, 90: 6444 a 6448, Publicações US. Nos. 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, e Publicações de Patentes Internacionais Nos. WO 2006/020258 e WO 2007/024715, que são aqui incorporadas por referência.

[0101] Um scFv pode incluir um ligante de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais resíduos de aminoácidos entre suas regiões VL e VH. A sequência do ligante pode incluir qualquer aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a sequência do ligante inclui os aminoácidos glicina e serina. Em outra modalidade, a sequência do ligante inclui conjuntos de repetições de glicina e serina, tal como (GGGGS)n, onde n é um número inteiro positivo maior ou igual a 1 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais). A variação no comprimento do ligante pode manter ou aumentar a atividade, dando origem a uma eficácia superior na ligação e atividade.

[0102] A cinética da citólise de uma célula alvo por uma célula T γδ manipulada da invenção é determinada, em parte, pela afinidade de ligação do domínio de ligação ao antígeno. Qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno fornecidos neste documento pode ser modificado de acordo com métodos conhecidos para aumentar ou reduzir a afinidade de ligação a um alvo particular, conforme desejado. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno tem uma afinidade de ligação ou constante de dissociação (KD) para seu antígeno de 10-4 M a 10-10 M (por exemplo, de 10-4 M a 10-5 M, de 10-5 M a 10-6

M, de 10-6 M a 10-7 M, de 10-7 M a 10-8 M, de 10-8 M a 10-9 M, de 10-9 M a 10-10 M, por exemplo, de 10-5 M a 10-9 M, de 10-5 M a 10-8 M, de 10-5 M a 10-7 M, de 10-5 M a 10-6 M, de 10-6 M a 10-10 M, de 10-6 M a 10-9 M, de 10-6 M a 10-8 M, de 10-6 M a 10-7 M, de 10-7 M a 10-10 M, de 10-7 M a 10-9 M, de 10-7 M a 10-8 M, de 10-8 M a 10-10 M, de 10-8 M a 10-9 M, ou de 10-9 M a 10-10 M, conforme medido sob temperaturas e pressões fisiológicas padrão, por exemplo, por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIAcore).

[0103] Além da afinidade de ligação do domínio de ligação ao antígeno da célula T γδ manipulada com uma célula alvo, as interações de avidez também desempenham um papel na ligação eficaz e subsequente lise das células alvo. A avidez é ditada por (a) a afinidade de ligação do domínio de ligação ao antígeno e (b) o número de interações entre o domínio de ligação ao antígeno e o antígeno ao longo de uma determinada interface entre a célula T e o alvo. Em algumas modalidades, uma célula T γδ manipulada contém, em sua superfície, de 102 a 106 domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, de 102 a 103, de 103 a 104, de 104 a 105, de 105 a 106, de 102 a 104, de 102 a 105, de 103 a 104, de 103 a 105, de 103 a 106, de 104 a 105, de 104 a 106, ou de 105 a 106) domínios de ligação ao antígeno. Domínio de Haste

[0104] Os construtos de direcionamento heterólogos da presente invenção podem incluir um domínio de haste localizado entre o domínio transmembrana e o domínio de ligação ao antígeno extracelular. Em algumas modalidades, o domínio de haste inclui um ou mais dos domínios selecionados a partir do grupo que consiste em uma haste de CD8, um domínio constante (CH) de dobradiça de IgG (por exemplo, um domínio de dobradiça de IgG1-CH2, um domínio de dobradiça de IgG1- CH3, ou um domínio de dobradiça de IgG1-CH2-CH3), uma dobradiça (G4S)3, uma dobradiça de IgG1, uma haste de CD7, um domínio de dobradiça de IgD-CH2, um domínio de dobradiça de IgD-CH3, um domínio de dobradiça de IgD-CH2-CH3, um domínio de dobradiça de IgG4-CH2, um domínio de dobradiça de IgG4-CH3, um domínio de dobradiça de IgG4-CH2-CH3 ou uma haste de FcεRI. A haste pode fornecer flexibilidade entre os domínios extracelular e transmembrana e pode auxiliar no reconhecimento do alvo. Será entendido por um versado na técnica que o domínio de haste pode incluir um ou mais aminoácidos adicionais adjacentes à região extracelular ou transmem- brana, por exemplo, um ou mais aminoácidos associados às regiões extracelular ou transmembrana da proteína a partir da qual a haste foi derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos das regiões extracelular ou transmembrana). A haste pode incluir opcionalmente um ou mais ligantes, tal como (GGGGS)n ou GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1).

[0105] Domínio Transmembrana

[0106] Em várias modalidades de qualquer aspecto da invenção, um construto de direcionamento heterólogo pode ser manipulado para incluir um domínio transmembrana que está ligado ao(s) domínio(s) extracelular(es). Um domínio transmembrana pode incluir um ou mais aminoácidos adicionais adjacentes à região transmembrana, por exemplo, um ou mais aminoácidos associados à região extracelular da proteína da qual a transmembrana foi derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos da região extracelular) e/ou um ou mais aminoácidos adicionais associados com a região intracelular da proteína a partir da qual a proteína transmembrana é derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região intracelular). Em um aspecto, o domínio transmembrana é aquele que está associado a um dos outros domínios do construto de direcionamento heterólogo. Em alguns casos, o domínio transmem- brana pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembrana das mesmas ou diferentes proteínas de membrana de superfície, por exemplo, para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor. Assim, em alguns casos, o domínio transmembrana não propaga substancialmente a ativação do sinal 1 e/ou a ativação do sinal 2 (coestimulação).

[0107] Alternativamente, um domínio transmembrana pode ser selecionado quanto à sua capacidade de se ligar a, induzir agrupamento de, ativar, fosforilar, desfosforilar ou, de outra forma, interagir com outras proteínas (por exemplo, proteínas endógenas, por exemplo, proteínas endógenas associadas à membrana, tal como proteínas transmembrana). Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio transmembrana pode se associar a uma proteína coestimuladora, ativando assim indiretamente a célula (por exemplo, a célula T γδ) por meio da propagação de um sinal coestimulador de sinal 2. Em modalidades particulares, um domínio transmembrana é derivado de uma porção transmembrana de NKG2D, que pode se associar com DAP10 expresso endogenamente para propagar a ativação do sinal 2 (coestimulação) da célula hospedeira. Em tais casos, o construto de direcionamento heterólogo não tem um domínio intracelular funcional capaz de ativar a célula. Por exemplo, o construto de direcionamento heterólogo pode ser desprovido de um domínio intracelular, ou pode conter um domínio intracelular inerte, que não transmite a ativação do sinal 1 ou do sinal 2. Por exemplo, um domínio transmembrana que pode propagar o sinal 2 por recrutamento ou associação com uma molécula coestimuladora endógena pode ser um domínio transmem- brana terminal (por exemplo, não há domínios adicionais ligados a um de seus terminais).

[0108] Em um aspecto, o domínio transmembrana é capaz de heterodimerização ou homodimerização com outro construto de direcionamento heterólogo na superfície da célula T γδ. Em um aspecto diferente, a sequência de aminoácidos do domínio transmembrana pode ser modificada ou substituída de modo a minimizar as interações com os domínios de ligação do parceiro de ligação nativo presente na mesma célula T manipulada.

[0109] O domínio transmembrana pode ser derivado ou de uma fonte natural ou de uma fonte recombinante. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. Um domínio transmembrana de uso particular nesta invenção pode incluir pelo menos a(s) região(ões) transmembrana de, por exemplo, a cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD18, CD22, CD29, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD94, CD134, CD137, CD154, CD7, CD3 zeta, CD71, receptor Fc gama (FcγR) ou NKG2D. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana pode incluir, por exemplo, um domínio transmembrana de CD8, um domínio transmembrana de CD4, um domínio transmembrana de CD3ζ ou um domínio transmembrana de CD28. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é um domínio transmembrana terminal (por exemplo, não há domínios adicionais anexados a um de seus terminais).

[0110] Em alguns casos, o domínio transmembrana pode ser anexado à região extracelular do construto de direcionamento heterólogo, por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno do construto de direcionamento heterólogo, através de uma dobradiça, por exemplo, uma dobradiça a partir de uma proteína humana. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça pode ser uma dobradiça de Ig (imunoglobulina) humana, por exemplo, uma dobradiça de IgG1, uma dobradiça de IgG4, uma dobradiça de IgD, ou uma dobradiça de CD8α.

[0111] Em uma modalidade, o domínio transmembrana é recombinante, caso em que incluirá resíduos predominantemente hidrofóbicos, tal como leucina e valina. Em um aspecto, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina pode ser encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana recombinante.

[0112] Opcionalmente, um ligante polipeptídico curto, por exemplo, entre dois e dez aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e a região citoplasmática do construto de direcionamento heterólogo. Um dupleto de glicina e serina é um exemplo de um ligante adequado. Por exemplo, em um aspecto, o ligante inclui a sequência de aminoácidos de (GGGGS)n ou GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1). Métodos de Colheita e Expansão de Células T γδ

[0113] As células T γδ manipuladas da invenção podem ser derivadas de qualquer célula T γδ autóloga ou alogênica adequada ou uma população das mesmas. Em algumas modalidades, as células T γδ adequadas para uso como uma fonte para as células T γδ manipuladas presentemente descritas incluem células Vδ1, células Vδ2, células Vδ3, células Vδ5 e células Vδ8. Em algumas modalidades, a população de células T γδ manipuladas é derivada de uma população de células Vδ1, células Vδ3, células Vδ5 ou células Vδ8.

[0114] Por exemplo, são fornecidos aqui métodos para separar e expandir células Vδ1 a partir de um tecido não hematopoiético, tal como pele ou intestino. Por exemplo, as células Vδ1 podem ser isoladas a partir de biópsias de pele humana, conforme descrito em US. 2018/0312808, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade e especificamente para métodos de isolamento de células Vδ1 a partir de tecido.

[0115] Em outras modalidades, as células T γδ adequadas podem ser derivadas de sangue (por exemplo, sangue periférico). Os métodos de isolamento e expansão das células Vδ1 a partir do sangue incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente US. No. 9.499.788 e na Publicação de Patente Internacional No. WO 2016/198480, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, as células T γδ adequadas podem ser derivadas de tecido tumoral (por exemplo, células T γδ infiltrantes em tumor). Alternativamente, as células T γδ adequadas que podem ser manipu- ladas para expressar um construto de direcionamento heterólogo podem ser derivadas de tecido não hematopoiético de acordo com aos métodos descritos abaixo. Isolamento e Expansão de Células T γδ a Partir do Sangue

[0116] Em algumas modalidades, as células T γδ manipuladas da presente invenção são derivadas do sangue (por exemplo, sangue periférico) de um sujeito. Por exemplo, as células T γδ manipuladas podem ser derivadas de células Vδ2 derivadas do sangue ou células Vδ1 derivadas do sangue.

[0117] Em algumas modalidades, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) podem ser obtidas a partir de um sujeito de acordo com qualquer método adequado conhecido na técnica. As PBMCs podem ser cultivadas na presença de aminobifosfonatos (por exemplo, ácido zoledrônico), fosfoantígenos sintéticos (por exemplo, bromoidrina pirofosfato; BrHPP), 2M3B1PP, ou 2-metil-3-butenil-1- pirofosfato na presença de IL-2 por uma a duas semanas para gerar uma população enriquecida de células Vδ2. Alternativamente, o anti- TCRγδ imobilizado (por exemplo, pan TCRγδ) pode induzir a expansão preferencial de células Vδ2 a partir de uma população de PBMCs na presença de IL-2, por exemplo, por aproximadamente 14 dias. Em algumas modalidades, a expansão preferencial de células Vδ2 a partir de PBMCs pode ser alcançada mediante cultura de anticorpos anti-CD3 imobilizados (por exemplo, OKT3) na presença de IL-2 e IL-4. Em algumas modalidades, a cultura mencionada acima é mantida por cerca de sete dias antes da subcultura em anti-CD3 solúvel, IL-2 e IL-4. Alternativamente, células apresentadoras de antígenos artificiais podem ser usadas para promover a expansão preferencial de células T γδ, tal como células Vδ2. Por exemplo, as células T γδ derivadas de PBMC cultivadas na presença de aAPC, IL-2 e/ou IL-21 irradiados podem se expandir para gerar uma população de células T γδ incluindo uma alta proporção de células Vδ2, proporção moderada de células Vδ1, e algumas células duplo negativas. Em algumas modalidades dos métodos mencionados acima, as PBMCs podem ser pré-enriquecidas ou pós-enriquecidas (por exemplo, através da seleção positiva com agentes específicos de TCRγδ ou seleção negativa de agentes específicos de TCRαβ). Tais métodos e outros métodos adequados para a expansão de células T γδ, tal como células Vδ2, são descritos em detalhes por Deniger e outros, Frontiers in Immunology 2014, 5, 636: 1 a 10, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

[0118] Em algumas modalidades, as células T Vδ1 podem ser manipuladas para expressar um construto de direcionamento heterólogo. Qualquer método adequado de obtenção de uma população de células T Vδ1 pode ser usado. Por exemplo, Almeida e outros (Clinical Cancer Research 2016, 22, 23; 5795 a 5805), incorporado aqui por referência em sua totalidade, fornece métodos adequados de obtenção de uma população de células T Vδ1 que podem ser manipuladas para expressar um construto de direcionamento heterólo- go aqui descrito. Por exemplo, em algumas modalidades, as PBMCs são pré-enriquecidas usando classificação de microesferas magnéticas, que pode render mais de 90% de células T γδ. Essas células podem ser cultivadas na presença de um ou mais fatores (por exemplo, agonistas de TCR, agonistas de co-receptor, e/ou citocinas, por exemplo, IL-4, IL- 15 e/ou IFN-γ) em sacos de biorreator permeáveis a gás por até 21 dias ou mais. Variações deste método e de outros métodos de obtenção de células T Vδ1 são adequadas como parte da presente invenção. Por exemplo, as células T Vδ1 derivadas do sangue podem ser obtidas alternativamente usando métodos descritos, por exemplo, na Patente US. No. 9.499.788 e na Publicação de Patente Internacional No. WO 2016/198480, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade, como bem como WO2017197347 e WO2016081518 (Publicação US. No. 20160175338), cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Separação e Expansão de Células T γδ Residentes em Tecido Não Hematopoiético a partir de Tecido Não Hematopoiético

[0119] As células T γδ residentes em tecido não hematopoiético obtidas conforme descrito abaixo são provavelmente veículos adequados para os construtos de direcionamento heterólogos aqui descritos, uma vez que podem exibir boas capacidades de penetração e retenção de tumor. Métodos mais detalhados para isolamento e expansão de células T γδ residentes em tecido não hematopoiético podem ser encontrados, por exemplo, no Pedido GB No. 1707048.3 (WO2018/202808) e na Publicação de Patente Internacional No. WO 2017/072367 (Publicação US. No. 20180312808), cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

[0120] As células T γδ residentes em tecido não hematopoiético (por exemplo, células T γδ derivadas da pele e/ou células T não Vδ2, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN) podem ser isoladas a partir de tecido não hematopoiético de qualquer animal humano ou não humano que pode ser removido de um paciente para obter células adequadas para manipulação de acordo com os métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, o tecido não hematopoiético do qual as células T γδ são derivadas e expandidas é pele (por exemplo, pele humana), que pode ser obtido por métodos conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades, a pele é obtida por biópsia de punção. Alternativamente, os métodos de isolamento e expansão de células T γδ fornecidos neste documento podem ser aplicados ao trato gastrointestinal (por exemplo, cólon), glândula mamária, pulmão, próstata, fígado, baço e pâncreas. As células T γδ também podem ser residentes em tecidos cancerosos humanos, por exemplo, tumores da mama ou da próstata. Em algumas modalidades, as células T γδ podem ser de tecidos cancerosos humanos (por exemplo, tecidos de tumor sólido). Em outras modalidades, as células T γδ podem ser de tecido não hematopoiético que não o tecido de câncer humano (por exemplo, um tecido sem um número substancial de células tumorais). Por exemplo, as células T γδ podem ser de uma região da pele (por exemplo, pele saudável) separada de um tecido canceroso próximo ou adjacente.

[0121] As células T γδ que são dominantes no sangue são principalmente células T Vδ2, enquanto as células T γδ que são dominantes nos tecidos não hematopoiéticos são principalmente células T Vδ1, de modo que as células T Vδ1 incluem cerca de 70 a 80% da população de células T γδ residentes no tecido não hematopoiético. No entanto, algumas células T Vδ2 também são encontradas em tecidos não hematopoiéticos, por exemplo, no intestino, onde podem incluir cerca de 10 a 20% de células T γδ. Algumas células T γδ que residem em tecidos não hematopoiéticos não expressam nem Vδ1 nem Vδ2 TCR e são denominadas de células T γδ duplo negativas (DN). É provável que essas células T γδ DN expressem principalmente Vδ3 com uma minoria de células T expressando Vδ5. Portanto, as células T γδ que são normalmente residentes em tecidos não hematopoiéticos e que são expandidas pelo método da invenção são preferencialmente células T não Vδ2, por exemplo, células T Vδ1, com a inclusão de uma quantidade menor de células T γδ DN.

[0122] Em algumas modalidades, uma etapa crucial é a separação deliberada, por exemplo, após alguns dias ou semanas de cultura, de células T residentes em tecido não hematopoiético (por exemplo, dentro de uma população de linfócitos mista, que pode incluir, por exemplo, células αβ, células exterminadoras naturais (NK), células B e células T γδ2 e não γδ2) para longe das células não hematopoiéticas (por exemplo, células estromais, particularmente fibroblastos) do tecido a partir do qual as células T foram obtidas. Isso permite a expansão rápida e preferencial ao longo dos dias e semanas seguintes de células T Vδ1 derivadas de tecido não hematopoiético e células T γδ DN.

[0123] Em geral, as células T γδ residentes em tecido não hematopoiético são capazes de se expandir espontaneamente após a remoção do contato físico com células do estroma (por exemplo, fibroblastos da pele). Assim, os métodos de cultura baseados em arcabouço descritos acima podem ser usados para induzir tal sepa- ração, resultando na des-repressão das células T γδ para desencadear a expansão. Por conseguinte, em algumas modalidades, nenhuma ativação substancial da via de TCR está presente durante a etapa de expansão (por exemplo, nenhum ativador exógeno da via de TCR está incluído na cultura). Além disso, a invenção fornece métodos de expansão de células T γδ residentes em tecido não hematopoiético, em que os métodos não envolvem contato com células alimentadoras, células tumorais, e/ou células apresentadoras de antígeno.

[0124] Os protocolos de expansão envolvem a cultura de células T γδ residentes em tecido não hematopoiético na presença de coquetéis eficazes de fatores biológicos para suportar a expansão eficiente de células T γδ. Em uma modalidade, o método de expansão de células T γδ inclui fornecer uma população de células T γδ obtidas a partir de um tecido não hematopoiético (por exemplo, uma população separada de células T γδ derivadas de tecido não hematopoiético, por exemplo, uma população separada de acordo com os métodos aqui descritos) e a cultura das células T γδ na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e/ou IL-21. Essas citocinas ou seus análogos podem ser cultivados com as células por uma duração (por exemplo, de pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 13 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 28 dias ou mais, por exemplo, de 5 dias a 40 dias, de 7 dias a 35 dias, de 14 dias 28 dias, ou cerca de 21 dias) em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células T γδ.

[0125] Populações de Células T γδ Expandidas

[0126] A população de células T γδ expandidas é maior em número do que a população de células T γδ separadas antes da etapa de expansão (por exemplo, pelo menos 2 vezes em número, pelo menos 3 vezes em número, pelo menos 4 vezes em número, pelo menos 5 vezes em número, pelo menos 6 vezes em número, pelo menos 7 vezes em número, pelo menos 8 vezes em número, pelo menos 9 vezes em número, pelo menos 10 vezes em número, em pelo menos 15 vezes em número, pelo menos 20 vezes em número, pelo menos 25 vezes em número, pelo menos 30 vezes em número, pelo menos 35 vezes em número, pelo menos 40 vezes em número, pelo menos 50 vezes em número, pelo menos 60 vezes em número, pelo menos 70 vezes em número, pelo menos 80 vezes em número, pelo menos 90 vezes em número, pelo menos 100 vezes em número, pelo menos 200 vezes em número, pelo menos 300 vezes em número, pelo menos 400 vezes em número, pelo menos 500 vezes em número, pelo menos 600 vezes em número, pelo menos 700 vezes em número, pelo menos 800 vezes em número, pelo menos 900 vezes em número, pelo menos 1.000 vezes em número, pelo menos 5.000 vezes em número, pelo menos 10.000 vezes em número ou mais em relação à população de células T γδ separadas antes da etapa de expansão). Assim, grandes populações de células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele e/ou células T não Vδ2, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN) podem ser expandidas em altas taxas. Em algumas modalidades, a etapa de expansão aqui descrita expande as células T γδ em um baixo tempo de duplicação da população, que é dado pela seguinte equação:

[0127] 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑑𝑢𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎çã𝑜 = 𝑑𝑢𝑟𝑎çã𝑜∗log(2) log(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙)−log(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)

[0128] Dada a informação fornecida neste documento, um versado na técnica reconhecerá que a invenção fornece métodos de expansão de células T γδ (por exemplo, células T γδ ou células T γδ manipuladas que são expandidas e/ou selecionadas para manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo) em um tempo de duplicação da população de menos de 5 dias (por exemplo, menos de 4,5 dias, menos de 4,0 dias, menos de 3,9 dias, menos de 3,8 dias, menos de 3,7 dias, menos de 3,6 dias, menos de 3,5 dias, menos de 3,4 dias, menos de 3,3 dias, menos de 3,2 dias, menos de 3,1 dias, menos de 3,0 dias, menos de 2,9 dias, menos de 2,8 dias, menos de 2,7 dias, menos de 2,6 dias, menos de 2,5 dias, menos de 2,4 dias, menos de 2,3 dias, menos de 2,2 dias, menos de 2,1 dias, menos de 2,0 dias, menos de 46 horas, menos de 42 horas, menos de 38 horas, menos de 35 horas, menos de 32 horas).

[0129] Em algumas modalidades, as células T γδ (por exemplo, células T γδ manipuladas ou células T γδ que são expandidas e/ou selecionadas para a manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo) isoladas e expandidas pelos métodos fornecidos neste documento podem ter um fenótipo bem adequado para eficácia antitumoral. Em algumas modalidades, a população de células T γδ expandidas tem uma expressão média maior de CD27 do que uma população de referência (por exemplo, a população de células T γδ separadas antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população de células T γδ expandidas tem uma expressão média de CD27 que é pelo menos 2 vezes em relação à população de células T γδ separadas (por exemplo, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 150 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes, pelo menos 400 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 600 vezes, pelo menos 700 vezes, pelo menos 800 vezes, pelo menos 900 vezes, pelo menos 1.000 vezes, pelo menos

5.000 vezes, pelo menos 10.000 vezes, pelo menos 20.000 vezes ou mais, em relação à população de células T γδ separadas).

[0130] Uma porção distinta da população de células T γδ expandidas (por exemplo, células T γδ manipuladas ou células T γδ que são expandidas e/ou selecionadas para manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo) pode induzir CD27, enquanto outra porção é CD27low ou CD27-. Neste caso, a frequência de células CD27+ na população expandida em relação à população separada de células T γδ pode ser maior. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos uma frequência 5% maior de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% maior frequência de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de células CD27+ na população expandida em relação à população separada de células T γδ pode ser aumentado. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos 2 vezes o número de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, em pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos um 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% mais frequência de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ antes da expansão).

[0131] Os métodos de expansão, conforme fornecidos aqui, em algumas modalidades, produzem uma população expandida de células T γδ (por exemplo, células T γδ ou células T γδ manipuladas que são expandidas e/ou selecionadas para a manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo) com uma baixa expressão de TIGIT, em relação a uma população de referência (por exemplo, a população separada de células T γδ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ tem uma expressão média inferior de TIGIT do que uma população de referência (por exemplo, a população separada de células T γδ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ tem uma expressão média de TIGIT que é pelo menos 10% menor do que a população separada de células T γδ (por exemplo, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor, ou até 100% menor do que a população separada de células T γδ).

[0132] Uma porção distinta da população expandida de células T γδ (por exemplo, células T γδ manipuladas ou células T γδ que são expandidas e/ou selecionadas para a manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo) pode expressar TIGIT, por exemplo, altos níveis de TIGIT, enquanto outra parte é TIGIT low ou TIGIT-. Neste caso, a frequência de células TIGIT+ na população expandida em relação à população separada de células T γδ pode ser menor. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos uma frequência 5% menor de células TIGIT+ em relação à população separada de células T γδ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% de frequência menor de células TIGIT+ em relação à população separada de células T γδ antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de células TIGIT+ na população expandida em relação à população separada de células T γδ antes da expansão pode ser menor. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos 10% menos células TIGIT+ em relação ao número de células TIGIT+ na população separada de células T γδ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% menos células TIGIT+ em relação ao número de células TIGIT+ na população separada de células T γδ antes da expansão).

[0133] Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ (por exemplo, células T γδ manipuladas ou células T γδ que são expandidas e/ou selecionadas para manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo) tem um alto número ou frequência de células CD27+ e uma baixa frequência de células TIGIT+. Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ tem uma alta frequência de células CD27+ TIGIT- em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação a uma população separada de células T γδ antes da expansão). Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos uma frequência 5% maior de células CD27+ TIGIT- em relação à população separada de células T γδ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos um 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% maior frequência de células CD27+ TIGIT- em relação à população separada de células T γδ antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de células CD27+ TIGIT- na população expandida em relação à população separada de células T γδ pode ser aumentado. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos 2 vezes o número de células CD27+ TIGIT- em relação à população separada de células T γδ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% maior frequência de células CD27+ TIGIT- em relação à população separada de células T γδ antes da expansão).

[0134] Em alguns casos, a expressão média de TIGIT em uma população de células T γδ CD27+ em uma população expandida de células T γδ (por exemplo, células T γδ manipuladas ou células T γδ que são expandidas e/ou selecionadas para manipulação para expressar um direcionamento heterólogo construção) é baixa em relação a uma população de referência. Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ CD27+ tem uma expressão média inferior de TIGIT do que uma população de referência (por exemplo, a população separada de células T γδ CD27+ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ CD27+ tem uma expressão média de TIGIT que é pelo menos 10% menor do que a população separada de células T γδ CD27+ (por exemplo, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, em pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor, pelo menos 80% menor, pelo menos 90% menor ou até 100% menor do que a população separada de células T γδ CD27+).

[0135] Adicionalmente ou alternativamente, a expressão média de CD27 em uma população de células T γδ TIGIT- em uma população expandida de células T γδ (por exemplo, células T γδ manipuladas ou células T γδ que são expandidas e/ou selecionadas para manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo) é alta em relação a uma população de referência. Por exemplo, a população expandida de células T γδ TIGIT- pode ter pelo menos uma frequência 5% maior de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ TIGIT- antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos um 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% maior frequência de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ TIGIT- antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de células CD27+ na população expandida em relação à população separada de células T γδ TIGIT- pode ser aumentado. Por exemplo, a população expandida de células T γδ TIGIT- pode ter pelo menos 2 vezes o número de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ TIGIT- antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos um 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou até 100% maior frequência de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ TIGIT- antes da expansão).

[0136] Um aumento ou uma diminuição na expressão de outros marcadores pode ser adicional ou alternativamente usado para caracterizar uma ou mais populações expandidas de células T γδ (por exemplo, células T γδ manipuladas ou células T γδ que são expandidas e/ou selecionadas para manipulação para expressar um construto de direcionamento heterólogo), incluindo CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30, CD2, NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64. Em alguns casos, a população expandida de células T γδ tem uma expressão média maior, igual ou menor de um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células T γδ, por exemplo, antes da expansão. Adicionalmente ou alternativamente, a população expandida de células T γδ pode ter uma frequência maior, igual ou menor de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células T γδ. Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ tem uma expressão média maior, igual ou menor de um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação à população separada de células T γδ. A população expandida pode, da mesma forma, ter uma frequência maior, igual ou menor de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em NKp44,

NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação à população de referência separada de células T γδ.

[0137] Numerosos meios de cultura basais adequados para utilização na proliferação de células T γδ estão disponíveis, em particular meios completos, tal como AIM-V, meio Iscoves e RPMI-1640 (Life Technologies). O meio pode ser suplementado com outros fatores de meio, tal como soro, proteínas séricas e agentes seletivos, tal como antibióticos. Por exemplo, em algumas modalidades, o meio RPMI-1640 contendo 2 mM de glutamina, FBS a 10%, 10 mM de HEPES, pH 7,2, penicilina-estreptomicina a 1%, piruvato de sódio (1 mM; Life Technologies), aminoácidos não essenciais (por exemplo, 100 µM de Gly, Ala, Asn, Asp, Glu, Pro e Ser; aminoácidos não essenciais 1X MEM, Life Technologies) e 10 μl/L de β-mercaptoetanol. Convenientemente, as células são cultivadas a 37° C em uma atmosfera umidificada contendo CO2 a 5% em um meio de cultura adequado.

[0138] As células T γδ podem ser cultivadas conforme descrito neste documento em qualquer sistema adequado, incluindo fermen- tadores do tipo tanque agitado, fermentadores de transporte aéreo, garrafas rotativas, sacos ou pratos de cultura, e outros biorreatores, tal como biorreatores de fibra oca. O uso de tais sistemas é bem conhecido na técnica. Métodos e técnicas gerais para cultura de linfócitos são bem conhecidos na técnica.

[0139] Os métodos descritos neste documento podem incluir mais de uma etapa de seleção, por exemplo, mais de uma etapa de depleção. O enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser realizado, por exemplo, com uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície únicos para as células selecionadas negativamente. Um método é a classificação e/ou seleção de células por meio de imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais direcionados a marcadores de superfície celular presentes nas células selecionadas negativamente. V. Composições Farmacêuticas e Métodos de Tratamento

[0140] Os linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas, ou células MAIT) descritos neste documento (por exemplo, células manipuladas (por exemplo, células T γδ) tendo um construto de direcionamento heterólogo) podem ser usados como um medicamento, por exemplo, como uma terapia com células T adotivas. Tal uso envolve a transfe- rência de linfócitos (por exemplo, células T γδ) obtidos pelo método da invenção para um paciente. A terapia pode ser autóloga, ou seja, os linfócitos (por exemplo, células T γδ) podem ser transferidos de volta para o mesmo paciente a partir do qual foram obtidos, ou a terapia pode ser alogênica, ou seja, os linfócitos (por exemplo, células T γδ) de uma pessoa podem ser transferidos para um paciente diferente. Em casos envolvendo transferência alogênica, os linfócitos (por exemplo, células T γδ) podem estar substancialmente livres de células T αβ. Por exemplo, as células T αβ podem ser depletadas da população de linfócitos (por exemplo, células T γδ), por exemplo, após a expansão, usando qualquer meio adequado conhecido na técnica (por exemplo, por seleção negativa, por exemplo, usando microesferas magnéticas).

[0141] Em algumas modalidades em que as células T γδ são manipuladas para expressar um construto de direcionamento heteró- logo, as células T γδ são células Vδ1, células Vδ2, células Vδ3, células Vδ5 ou células Vδ8. Um método de tratamento pode incluir: fornecer uma amostra de células T γδ endógenas a partir de um paciente; cultivar as células T γδ a partir da amostra na presença de um vetor carregando um polinucleotídeo que codifica um construto de direcionamento heterólogo para gerar uma população de células T γδ manipuladas que expressam o construto de direcionamento heterólogo (por exemplo, uma população expandida de células T γδ manipuladas expressando o construto de direcionamento heterólogo); e administrar a população de células T γδ a um paciente receptor. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica um construto de direcionamento heterólogo é entregue às células T γδ endógenas por meio de eletroporação ou qualquer outro método adequado de transfecção conhecido na técnica ou aqui descrito.

[0142] O paciente ou sujeito a ser tratado pode ser um paciente humano com câncer (por exemplo, um paciente humano com câncer sendo tratado para um tumor sólido) ou um paciente infectado por vírus (por exemplo, um paciente infectado por CMV ou HIV). Em alguns casos, o paciente tem um tumor sólido e/ou está sendo tratado para um tumor sólido.

[0143] Como as células T γδ não são restritas ao MHC, elas não reconhecem um hospedeiro para o qual são transferidas como estranho, o que significa que são menos propensas a causar a doença do enxerto versus hospedeiro. Isso significa que elas podem ser usadas “imediata- mente” e transferidas para qualquer recipiente, por exemplo, para terapia com células T adotivas alogênicas.

[0144] Em algumas modalidades, as células T γδ da invenção expressam NKG2D e respondem a um ligante de NKG2D (por exemplo, MICA), que está fortemente associado à malignidade. Elas também expressam um perfil citotóxico na ausência de qualquer ativação e, portanto, são provavelmente eficazes em matar células tumorais. Por exemplo, as células T γδ manipuladas obtidas conforme descrito neste documento podem expressar um ou mais, de preferência todos dentre IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, CCL4, IL-13, granulisina, granzima A e B, e perforina na ausência de qualquer ativação. IL-17A pode não ser expresso.

[0145] As composições farmacêuticas podem incluir linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ), conforme descrito neste documento, em combinação com um ou mais carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Essas composições podem incluir tampões tal como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato, e similares; carboidratos tal como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos tal como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tal como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As soluções de criopreservação que podem ser utilizadas nas composições farmacêuticas da invenção incluem, por exemplo, DMSO. As composições podem ser formuladas, por exemplo, para administração intravenosa.

[0146] Em uma modalidade, a composição farmacêutica está substancialmente livre, por exemplo, não há níveis detectáveis de um contaminante, por exemplo, de endotoxina ou micoplasma.

[0147] Em alguns casos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) obtidos por qualquer um dos métodos descritos acima pode ser administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um sujeito (por exemplo, para tratamento de câncer, por exemplo, para tratamento de um tumor sólido). Em alguns casos, a quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ manipuladas, células T derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1, células T Vδ2 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) é menor do que 10 x 1012 células por dose (por exemplo, menor do que 9 x 1012 células por dose, menor do que 8 x 1012 células por dose, menor do que 7 x 1012 células por dose, menor do que 6 x 1012 células por dose, menor do que 5 x 1012 células por dose, menor do que 4 x 1012 células por dose, menor do que 3 x 1012 células por dose, menor do que 2 x 1012 células por dose, menor do que 1 x 1012 células por dose, menor do que 9 x 1011 células por dose, menor do que 8 x 1011 células por dose, menor do que 7 x 1011 células por dose, menor do que 6 x 1011 células por dose, menor do que 5 x 1011 células por dose, menor do que 4 x 1011 células por dose, menor do que 3 x 1011 células por dose, menor do que 2 x 1011 células por dose, menor do que 1 x 1011 células por dose, menor do que 9 x 1010 células por dose, menor do que 7,5 x 1010 células por dose, menor do que 5 x 1010 células por dose, menor do que 2,5 x 1010 células por dose, menor do que 1 x 1010 células por dose, menor do que 7,5 x 109 células por dose, menor do que 5 x 109 células por dose, menor do que 2,5 x 109 células por dose, menor do que 1 x 109 células por dose, menor do que 7,5 x 108 células por dose, menor do que 5 x 108 células por dose, menor do que 2,5 x 108 células por dose, menor do que 1 x 108 células por dose, menor do que 7,5 x 107 células por dose, menor do que 5 x 107 células por dose, menor do que 2,5 x 107 células por dose, menor do que 1 x 107 células por dose, menor do que 7,5 x 106 células por dose, menor do que 5 x 106 células por dose, menor do que 2,5 x 106 células por dose, menor do que 1 x 106 células por dose, menor do que 7,5 x 105 células por dose, menor do que 5 x 105 células por dose, menor do que 2,5 x 105 células por dose, ou menor do que 1 x 105 células por dose).

[0148] Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele manipuladas, células T γδ derivadas de sangue manipuladas, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) é menor do que 10 x 1012 células ao longo do tratamento (por exemplo, menor do que 9 x 1012 células, menor do que

8 x 1012 células, menor do que 7 x 1012 células, menor do que 6 x 1012 células, menor do que 5 x 1012 células, menor do que 4 x 1012 células, menor do que 3 x 1012 células, menor do que 2 x 1012 células, menor do que 1 x 1012 células, menor do que 9 x 1011 células, menor do que 8 x 1011 células, menor do que 7 x 1011 células, menor do que 6 x 1011 células, menor do que 5 x 1011 células, menor do que 4 x 1011 células, menor do que 3 x 1011 células, menor do que 2 x 1011 células, menor do que 1 x 1011 células, menor do que 9 x 1010 células, menor do que 7,5 x 1010 células, menor do que 5 x 1010 células, menor do que 2,5 x 1010 células, menor do que 1 x 1010 células, menor do que 7,5 x 109 células, menos do que 5 x 109 células, menor do que 2,5 x 109 células, menor do que 1 x 109 células, menor do que 7,5 x 108 células, menor do que 5 x 108 células, menor do que 2,5 x 108 células, menor do que 1 x 108 células, menor do que 7,5 x 107 células, menor do que 5 x 107 células, menor do que 2,5 x 107 células, menor do que 1 x 107 células, menor do que 7,5 x 106 células, menor do que 5 x 106 células, menor do que 2,5 x 106 células, menor do que 1 x 106 células, menor do que 7,5 x 105 células, menor do que 5 x 105 células, menor do que 2,5 x 105 células ou menor do que 1 x 105 células ao longo do tratamento).

[0149] Em algumas modalidades, uma dose de linfócitos manipu- lados (por exemplo, células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT), conforme descrito neste documento, inclui cerca de 1 x 106, 1,1 x 106, 2 x 106, 3,6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 ou 5 x 108 células/kg. Em algumas modalidades, uma dose de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele, células T γδ derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) inclui pelo menos cerca de 1 x 106, 1,1 x 106, 2 x 106, 3,6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x

108 ou 5 x 108 células/kg.

Em algumas modalidades, uma dose de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele, células T γδ derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) inclui até cerca de 1 x 106, 1,1 x 106, 2 x 106, 3,6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 ou 5 x 108 células/kg.

Em algumas modalidades, uma dose de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele, células T γδ derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) inclui cerca de 1,1 x 106 a 1,8 x 107 células/kg.

Em algumas modalidades, uma dose de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele, células T γδ derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) inclui cerca de 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 ou 5 x 109 células.

Em algumas modalidades, uma dose de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele, células T γδ derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) inclui pelo menos cerca de 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 ou 5 x 109 células.

Em algumas modalidades, uma dose de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele, células T γδ derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) inclui até cerca de 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 ou 5 x 109 células.

[0150] Em uma modalidade, ao sujeito é administrado de 104 a 106 linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ (por exemplo, células T γδ derivadas da pele, células T γδ derivadas do sangue, por exemplo, células T Vδ1 e/ou células T DN), NK células, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) por kg de peso corporal do sujeito.

Em uma modalidade, o sujeito recebe uma administração inicial de uma população de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT (por exemplo, uma administração inicial de 104 a 106 Células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT por kg de peso corporal do sujeito, por exemplo, 104 a 105 células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou Células MAIT por kg de peso corporal do sujeito)), e uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) administrações subsequentes de linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, inatas células linfoides ou células MAIT (por exemplo, uma ou mais administrações subsequentes de 104 a 106 células T γδ manipuladas, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT por kg de peso corporal do sujeito, por exemplo, 104 a 105 células T γδ manipuladas por kg de peso corporal do sujeito)). Em uma modalidade, uma ou mais administrações subsequentes são administradas em menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior, por exemplo, menos de 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior.

Em uma modalidade, o sujeito recebe um total de cerca de 106 células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT por kg de peso corporal do sujeito ao longo de pelo menos três administrações de uma população de células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT, por exemplo, o sujeito recebe uma dose inicial de 1 x 105 células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas, ou células MAIT, uma segunda administração de 3 x 105 células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT e uma terceira administração de 6 x 105 células T γδ, células NK, NK- como células T, células linfoides inatas ou células MAIT e, por exemplo, cada administração é administrada menos de 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior.

[0151] Em algumas modalidades, um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados ao sujeito. O agente terapêutico adicional pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um agente imunoterápico, um agente citotóxico, um agente inibidor de crescimento, um agente de terapia de radiação, um agente antiangiogê- nico, ou uma combinação de dois ou mais agentes dos mesmos. O agente terapêutico adicional pode ser administrado simultaneamente com, antes ou após a administração dos linfócitos manipulados (por exemplo, células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT). O agente terapêutico adicional pode ser um agente imunoterápico, que pode atuar em um alvo dentro do corpo do sujeito (por exemplo, o próprio sistema imunológico do sujeito) e/ou nas células T γδ transferidas, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas, ou células MAIT.

[0152] A administração das composições pode ser realizada de qualquer maneira conveniente. As composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa ou intraperitoneal, por exemplo, por injeção intradérmica ou subcutânea. As composições de linfócitos modificados (por exemplo, células T γδ, células NK, células T semelhantes a NK, células linfoides inatas ou células MAIT) podem ser injetadas diretamente em um tumor, nódulo linfático, ou sítio de infecção.

EXEMPLOS

[0153] Os exemplos a seguir fornecem métodos não limitantes para a manipulação de células T γδ para expressar um construto de direcionamento heterólogo, triagem funcional das células T γδ manipuladas, e métodos terapêuticos de uso das células T γδ manipuladas. Exemplo 1: Caracterização funcional de células T γδ manipuladas que expressam um construto de direcionamento heterólogo

[0154] As células T Vδ1 manipuladas tendo um receptor de direcionamento heterólogo são funcionalmente caracterizadas in vitro por cocultura com células alvo (por exemplo, células cancerosas, por exemplo, células de uma linhagem de células tumorais). As células T Vδ1 modificadas são comparadas com três tipos de células de controle: (1) células T Vδ1 não transduzidas; (2) células T Vδ1 com transdução simulada que expressam GFP heterólogo; e (3) células T Vδ1 transduzidas por receptor de antígeno quimérico convencional (CAR) tendo um domínio de sinalização intracelular funcional. Cada grupo é co-cultivado com pelo menos dois grupos de células tumorais alvo: (A) um grupo de células saudáveis que expressa níveis nominais de um antígeno associado ao tumor (TAA), e (B) um grupo de células tumorais que expressa altos níveis de um TAA. Várias relações efetoras - alvo (relações de células T γδ – células alvo) são testadas. As células Vδ1 não transduzidas ou simuladas são usadas como um controle para identificar o efeito conferido pelo receptor de direcionamento heterólogo, e as células CAR T são usadas como um controle para identificar o efeito da falta de um domínio intracelular funcional configurado para propagar um estímulo de sinal 1 e/ou de sinal 2. Os seguintes ensaios são realizados:

[0155] 1. Um ensaio de proliferação é realizado de acordo com um protocolo de diluição CFSE padrão para quantificar o efeito da interação entre células T γδ manipuladas e células alvo na proliferação de células T γδ manipuladas, o que é indicativo de ativação contra a célula alvo. As células T γδ que expressam um construto de direcionamento heterólogo se proliferam em um grau maior em resposta às células cancerosas em relação às células saudáveis.

[0156] 2. Um ensaio de desgranulação de CD107 é realizado quantificando a expressão da proteína de membrana associada ao lisossoma 1 (LAMP-1; isto é, CD107), que é expressa transientemente na superfície das células T γδ após a desgranulação. As células são coradas em vários pontos de tempo para monitorar a cinética de desgranulação. As células T γδ que expressam um construto de direcionamento heterólogo exibem preferencialmente desgranulação em resposta às células cancerosas em relação às células saudáveis.

[0157] 3. Um ensaio de perforina/granzima é realizado por coloração para perforina e granzima usando FACS. As células T γδ que expressam um construto de direcionamento heterólogo expressam preferencialmente perforina e/ou granzima em resposta às células cancerosas em relação às células saudáveis.

[0158] 4. Um ensaio de lise celular é realizado para quantificar o grau de lise de células alvo (isto é, citólise). A cinética da lise celular é medida pelo ensaio Incucyte ou de luciferase como uma porcentagem de morte ao longo do tempo, e a lise celular final é medida usando um ensaio de luciferase como a porcentagem de morte em um determinado ponto no tempo. As células T γδ que expressam um construto de direcionamento heterólogo lisam preferencialmente as células cancero- sas em relação às células saudáveis.

[0159] 5. A formação de sinapses imunológicas é monitorada por imagens de células vivas. A partir da observação da sinapse imunológica entre as células T γδ e as células alvo, a cinética de ligação é monitorada. Além disso, o fluxo de cálcio nas células T γδ (indicando o reconhecimento) e o blush de PI nas células alvo (identificando um golpe letal) são observados. O arredondamento de células alvo também é observado. A cinética de ligação e o fluxo de cálcio são preferencialmente aumentados em células T γδ que expressam um construto de direcionamento heterólogo quando co-cultivadas com células cancerosas, em relação às células saudáveis. Exemplo 2: Células T γδ manipuladas derivadas do sangue periférico que expressam um construto de direcionamento heteró- logo

[0160] Uma das propriedades únicas das células T γδ Vδ1 em comparação com as células T αβ convencionais é matar seletivamente as células transformadas de forma maligna enquanto preservando o tecido saudável, um processo que pode ser mediado pela ação de receptores naturais de citotoxicidade. Os presentes resultados demonstram que a capacidade das células Vδ1 de erradicar as células tumorais pode ser ainda melhorada usando construtos de direciona- mento heterólogos sem domínios de sinalização intracelular. A manipulação de células Vδ1 com tais construtos manteve ou mesmo aumentou a citotoxicidade dessas células em relação às células transformadas de forma maligna, enquanto ainda preservava as células saudáveis. Esta abordagem supera os efeitos fora do tumor no alvo observados das abordagens de imunoterapia com receptor de antígeno quimérico (CAR) convencionais, tal como a depleção de células B após o tratamento com CAR direcionado a CD19. Materiais e Métodos

[0161] Isolamento e expansão de células T γδ do sangue periférico

[0162] As células Vδ1 derivadas do sangue foram geradas a partir de sangue periférico de doadores saudáveis, conforme descrito anteriormente em US. 2018/0169147, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, em particular para seus métodos de isolamento de células Vδ1 a partir do sangue. Em resumo, as células T αβ MACS-depletadas foram ressuspensas em meio de cultura sem soro (CTS OpTmizer) suplementado com plasma autólogo e expandidas na presença de IL-4, IFN-γ, IL-21, IL-1, IL-15 e OKT3 solúvel. As células foram transduzidas com vetor lentiviral que codifica os construtos descritos abaixo. Essencialmente, os construtos CAR de comprimento total incluem uma região ligante de scFv direcionada ao antígeno tumoral CD19 ou GD2, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização intracelular (de acordo com o modelo de construto CAR convencional). O construto sem sinalização ou “nsCAR” carece do domínio intracelular.

[0163] Outros meios para obter células Vd1 a partir do sangue são bem conhecidos na técnica, tal como US 9499788, WO2017197347, WO2016081518. Alternativamente, as células Vδ1 são isoladas a partir de biópsias de pele humana, conforme descrito em US. 2018/0312808, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade e especifi- camente para métodos de isolamento de células Vδ1 a partir de tecido. As células Vδ1 derivadas da pele são transduzidas como acima. Análise de Citometria de Fluxo

[0164] A imunofenotipagem foi conduzida usando um citômetro de fluxo BD FACS Lyric. As células foram analisadas quanto à expressão de marcadores de superfície usando um PerCP-Vio700 anti-TCR a/b (Miltenyi), APC anti-TCR g/d (Miltenyi), VioBlue anti-TCR Vδ1 (Miltenyi), PE anti-NKp30 (BioLegend), APC anti NKp44 (BioLegend), PerCP.Cy5.5 anti-NKG2D (BioLegend). A expressão do construto CD19 CAR convencional e CD19 CAR sem sinalização foi detectada com um anticorpo marcado anti-STREP FITC (LSBio). A expressão de GD2 CAR sem sinalização foi monitorada usando anticorpo PE anti-FC (BioLegend). Ensaio de Citotoxicidade

[0165] Células Nalm-6 (ATCC, CRL-1567) e células B primárias foram marcadas com CTV ou CFSE e combinadas com células T na relação de efetoras - alvo de 1:1. As culturas foram incubadas durante 16 horas a 37° C. Após a incubação, SytoxAADvanced (Invitrogen) e microesferas de contagem absoluta foram adicionadas aos poços e a aquisição por citometria de fluxo foi realizada. A citotoxicidade foi calculada da seguinte forma:

[0166] 100 - (contagens de amostra/contagens máximas) × 100

[0167] onde a contagem máxima é o número de células alvo na ausência de quaisquer células efetoras. Imagem de Células Vivas

[0168] A linhagem de células Kelly de neuroblastoma que expressa GD2 humano (DSMZ ACC-355) foi transduzida de forma estável com vetor lentiviral que codifica NucLight Green (Essen BioScience) para permitir a contagem automática de células. O crescimento celular foi monitorado usando o Sistema de Imagem de Células Vivas Incucyte Zoom Live-Cell (Essen Bioscience) por 60 horas em intervalos de uma hora. Os dados foram expressos como a mudança na relação do número de contagem de objetos verdes por imagem em determinado ponto no tempo normalizado para o número de contagem de objetos verdes por imagem no tempo zero. Cada ponto de dados representa poços em triplicado. Comparação com Células T αβ CAR

[0169] As células γδ foram manipuladas com construtos de CAR de comprimento total ou sem sinalização como acima. Da mesma forma, células T αβ derivadas do sangue ou tecido também são manipuladas com construtos de CAR de comprimento total ou sem sinalização. As células modificadas são medidas quanto à atividade citolítica contra células saudáveis e malignas que expressam o antígeno alvo para demonstrar a citotoxicidade fora do tumor no alvo de cada população.

Resultados

[0170] A transdução de células Vδ1 derivadas do sangue com vetor lentiviral que codifica para construtos de direcionamento de comprimento total (CAR19) ou anti-CD19 sem sinalização resultou em mais de 90% de eficiência de transdução (Figura 3A). Não houve diferença significativa na expressão em superfície das moléculas de CAR. Nem o imunofenótipo, nem a capacidade proliferativa das células transduzidas foram alterados pela transdução lentiviral. A análise FACS de células Vδ1 não transduzidas (UTD) e transduzidas não revelou qualquer diferença significativa na expressão em superfície das moléculas do receptor de citotoxicidade natural chave (NCR) (NKp30, NKp44 e NKG2D; Figura 3B).

[0171] As células Vδ1 reconheceram e mataram as células do CD19 que expressam a linhagem de células de leucemia linfoide aguda NALM-6. A expressão de CD19 CAR de comprimento total ou sem sinalização em células Vδ1 resultou em um aumento de duas vezes na morte de células alvo (Figuras 4A e 4B; porcentagem de morte de 21,4% (UTD) vs. 46% (nsCAR19) vs. 58% (CAR19) e 42,8% (UTD) vs. 83% (nsCAR19) vs. 88% (CAR19) para doador 1 e doador 2, respecti- vamente, em uma relação de efetoras - alvo 1:1). É importante notar que as células Vδ1 que expressam CAR anti-CD19 sem sinalização não mataram células B humanas saudáveis (Figura 4C).

[0172] Para provar ainda mais a aplicabilidade geral da abordagem de CAR sem sinalização, as células Vδ1 foram redirecionadas para as células tumorais que expressam o antígeno GD2. A transdução de células Vδ1 derivadas do sangue com a molécula nsCAR específica de GD2 resultou em uma eficiência de transdução de 54% medida por FACS (Figura 5A). As células Vδ1 não transduzidas e transduzidas por nsCAR foram co-cultivadas com a linhagem de células de neuroblastoma que expressa GD2 (Kelly) em uma relação de efetoras -

alvo 1:1. A morte das células alvo foi medida usando imagens de células vivas (Incucyte, Essen Bioscience). A co-cultura de células Kelly com células Vδ1 que expressam nsCAR resultou em uma redução de 40% no número total de células alvo em comparação com células alvo cultivadas na presença de células Vδ1 não transduzidas (Figura 5B). Exemplo 3: Tratamento de câncer com uma célula T γδ manipulada com um construto de direcionamento heterólogo

[0173] Um construto de direcionamento heterólogo é sintetizado usando métodos de clonagem e PCR conhecidos na técnica. Um fragmento de proteína codificando um scFv que tem como alvo um antígeno associado ao tumor (TAA) é fusionado ao N terminal de um domínio de haste, que é fusionado ao N terminal de um domínio transmembrana de CD8. O construto de direcionamento heterólogo é então clonado em um vetor lentiviral.

[0174] Um paciente é submetido a um procedimento de leucaférese em que uma amostra de sangue é obtida e os glóbulos vermelhos são depletados. As células T αβ são depletadas usando protocolos de separação magnética padrão. A população restante, que inclui células T γδ, é expandida usando qualquer método adequado de expansão de células T γδ conhecido na técnica ou aqui descrito. Durante a expansão, as células são incubadas com o vetor lentiviral contendo o polinucleotídeo que codifica o construto de direcionamento heterólogo, e o polinucleotídeo é integrado no genoma das células T γδ por transcrição reversa. As células transduzidas com o vetor lentiviral expressarão o construto de direcionamento heterólogo na superfície. As células transduzidas que expressam o construto de direcionamento heterólogo são então separadas das células não transduzidas e colhidas para infusão como uma terapia autóloga ou alogênica.

[0175] As células são administradas por via intravenosa ao paciente durante um período de duas horas. A administração intravenosa é repetida uma vez por semana durante 12 semanas e os sintomas do câncer são monitorados. Outras Modalidades

[0176] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são incorporados aqui por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente independente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[0177] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com modalidades específicas da mesma, será entendido que ela é capaz de modificações adicionais e este pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios do invenção e incluindo tais desvios da presente descrição que se enquadram na prática conhecida ou habitual dentro da técnica à qual a invenção pertence e podem ser aplicados às características essenciais aqui expostas, e segue no escopo das reivindicações.

[0178] Outras modalidades estão dentro das reivindicações. O que é reivindicado é:

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula T gama-delta (γδ) manipulada compreendendo um construto de direcionamento heterólogo, caracterizada pelo fato de que o construto de direcionamento heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, em que o construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula T gama-delta manipulada.

2. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicional- mente um domínio de haste que liga operacionalmente o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana.

3. Célula T gama-delta manipulada compreendendo um construto de direcionamento heterólogo, caracterizada pelo fato de que o construto de direcionamento heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio transmembrana, em que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana terminal que não propaga a ativação do sinal 1 da célula T gama-delta manipulada.

4. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicional- mente um domínio de haste que liga operacionalmente o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana.

5. Célula T gama-delta manipulada compreendendo um construto de direcionamento heterólogo, caracterizada pelo fato de que o construto de direcionamento heterólogo consiste em um domínio de ligação ao antígeno, um domínio de haste operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de haste, em que o construto de direcionamento heterólogo não propaga a ativação do sinal 1 da célula T gama-delta manipulada.

6. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana não ativa a célula T gama-delta manipulada.

7. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a célula T gama-delta manipulada é Vδ2-negativa.

8. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a célula T gama-delta Vδ2-negativa é Vδ1-positiva.

9. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo monoclonal, um fragmento Fab, um receptor de células B, um receptor de células T, um arcabouço de anticorpo, um ligante receptor-específico, ou um receptor ligante-específico.

10. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 4 a 9, caracterizada pelo fato de que o domínio de haste compreende um ou mais dos domínios selecionados a partir do grupo que consiste em uma haste de CD8, uma dobradiça de IgG1, um domínio de dobradiça de IgG1-CH2, um domínio de dobradiça de IgG1-CH3, um domínio de dobradiça de IgG1-CH2-CH3, uma dobradiça de (G4S)3, uma haste de CD7, uma dobradiça de IgD, um domínio de dobradiça de IgD -CH2, um domínio de dobradiça de IgD- CH2-CH3, um domínio de dobradiça de IgD-CH3, uma dobradiça de IgG4, um domínio de dobradiça de IgG4-CH2, um domínio de dobradiça de IgG4-CH2-CH3, um domínio de dobradiça de IgG4-CH3, ou uma haste de FcépsilonRI.

11. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de

CD8, um domínio transmembrana de CD4, um domínio transmembrana de CD3zeta, um domínio transmembrana de CD28, um domínio transmembrana de CD45, um domínio transmembrana de CD5, um domínio transmembrana de CD8, um domínio transmembrana de CD9, um domínio transmembrana de CD16, um domínio transmembrana de CD22, um domínio transmembrana de CD33, um domínio transmem- brana de CD37, um domínio transmembrana de CD64, um domínio transmembrana de CD80, um domínio transmembrana de CD86, um domínio transmembrana de CD134, um domínio transmembrana de CD137, um domínio transmembrana de CD154, um domínio transmembrana de CD7, um domínio transmembrana de CD71, um domínio transmembrana de CD18, um domínio transmembrana de CD29, um domínio transmembrana de CD11a, um domínio transmem- brana de CD11b, um domínio transmembrana de CD11c, um domínio transmembrana de CD11d, um domínio transmembrana de CD94, um domínio transmembrana de FcgamaR, ou um domínio transmembrana de NKG2D.

12. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que não mais do que 50% dos aminoácidos do domínio transmembrana C- terminal residem intracelularmente.

13. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o agrupamento do construto de direcionamento heterólogo após a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo não ativa substancialmente a via de TCR na célula T gama-delta manipulada.

14. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor.

15. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado ao tumor é um antígeno de proteína ou peptídeo expresso na superfície de uma célula tumoral.

16. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado ao tumor é CD19.

17. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado ao tumor é um carboidrato expresso na superfície de uma célula tumoral.

18. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado ao tumor é gangliosídeo expresso na superfície de uma célula tumoral.

19. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o gangliosídeo é GD2.

20. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado ao tumor é um antígeno imunossupressor.

21. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno alvo que é expresso por uma célula de tumor sólido.

22. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo expresso em uma célula saudável desencadeia substancialmente menos citólise pela célula T gama-delta manipulada em relação a uma célula de referência tendo um domínio intracelular funcional.

23. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a ligação do domínio de ligação ao antígeno ao antígeno alvo expresso em uma célula saudável não desencadeia substancialmente a citólise pela célula T gama-delta manipulada.

24. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que a ligação do domínio de ligação ao antígeno a um antígeno alvo expresso em uma célula tumoral ou uma célula infectada substancialmente desencadeia a citólise pela célula T gama-delta manipulada.

25. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a citólise é dependente da expressão endógena de NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 ou DNAM1 pela célula T gama-delta manipulada.

26. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que a citólise é distinguida por uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis respostas selecionadas a partir do grupo que consiste em desgranulação de CD107, liberação de granzima, liberação de perforina, liberação de granulisina, morte de células alvo, proliferação de células T gama-delta, e produção de citocinas.

27. Célula NK ou célula T semelhante a NK manipulada, compreendendo um construto de direcionamento heterólogo, caracte- rizada pelo fato de que o construto de direcionamento heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, em que o construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula NK ou célula T semelhante a NK manipulada.

28. Célula linfoide inata manipulada compreendendo um construto de direcionamento heterólogo, caracterizada pelo fato de que o construto de direcionamento heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, em que o construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula linfoide inata manipulada.

29. Célula T invariante associada à mucosa (MAIT) manipulada compreendendo um construto de direcionamento heteró- logo, caracterizada pelo fato de que o construto de direcionamento heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, em que o construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula T invariante associada à mucosa manipulada.

30. População de células isoladas, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dez células T gama-delta manipuladas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, células NK ou células T semelhantes a NK manipuladas, como definidas na reivindicação 27, células linfoides inatas manipuladas, como definidas na reivindicação 28, ou células MAIT manipuladas, como definidas na reivindicação 29.

31. População de células isoladas, de acordo com a reivin- dicação 30, caracterizada pelo fato de que as células T gama-delta manipuladas, as células NK ou células T semelhantes a NK manipu- ladas, as células linfoides inatas manipuladas ou células MAIT manipuladas representam mais de 2% do número total de células na população de células isoladas.

32. População de células isoladas, caracterizada pelo fato de que compreende uma população das células T gama-delta manipu- ladas, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, população das células NK ou células T semelhantes a NK manipuladas,

como definida na reivindicação 27, população das células linfoides inatas manipuladas, como definida na reivindicação 28, ou população das células MAIT manipuladas, como definida na reivindicação 29, em que a população representa mais de 2% do número total de células na população de células isoladas.

33. População de células isoladas de acordo com a reivin- dicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dez células T gama-delta manipuladas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, e/ou pelo menos dez células NK ou células T semelhantes a NK manipuladas, como definida na reivindicação 27, e/ou pelo menos dez células linfoides inatas manipuladas, como definidas na reivindicação 28, e/ou pelo menos dez células MAIT manipuladas, como definidas na reivindicação 29.

34. Célula T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo, o polinucleotídeo codificando o construto de direcionamento heterólogo, caracterizada pelo fato de que o construto de direcio- namento heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular e um domínio transmembrana operacionalmente ligado ao domínio de ligação ao antígeno, em que o construto de direcionamento heterólogo carece de um domínio intracelular capaz de ativar a célula T gama-delta manipulada.

35. Célula T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo, o polinucleotídeo codificando um construto de direciona- mento, caracterizada pelo fato de que o construto de direcionamento heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio transmembrana, em que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana terminal que não participa da ativação do sinal 1 da célula T gama-delta manipulada.

36. Célula T gama-delta manipulada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 26, célula NK ou célula T semelhante a NK manipulada, de acordo com a reivindicação 27, célula linfoide inata manipulada, de acordo com a reivindicação 28, célula MAIT manipulada, de acordo com a reivindicação 29, população de células isoladas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, ou célula T gama- delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de um sujeito por terapia com células T adotivas, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuti- camente eficaz das células T gama-delta manipuladas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, células NK ou células T semelhante a NK manipuladas, como definidas na reivindicação 25, células linfoides inatas manipuladas, como definidas na reivindicação 26, células MAIT manipuladas, como definidas na reivindicação 27, população de células isoladas, como definida em qualquer uma das reivindicações 28 a 31, ou células T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo, como definidas na reivindicação 32 ou 33, a um sujeito em necessidade de tratamento.

37. Célula T gama-delta manipulada, célula NK ou célula T semelhante a NK manipulada, célula linfoide inata manipulada, célula MAIT manipulada, população de células isoladas ou célula T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo para uso como definida na reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

38. Célula T gama-delta manipulada, célula NK ou célula T semelhante a NK manipulada, célula linfoide inata manipulada, célula MAIT manipulada, população de células isoladas ou célula T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo para uso como definida na reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o ser humano é um paciente humano com câncer.

39. Célula T gama-delta manipulada, célula NK ou célula T semelhante a NK manipulada, célula linfoide inata manipulada, célula MAIT manipulada, população de células isoladas ou célula T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo para uso, como definida na reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o paciente humano com câncer está sendo tratado para um tumor sólido.

40. Célula T gama-delta manipulada, célula NK ou célula T semelhante a NK manipulada, célula linfoide inata manipulada, célula MAIT manipulada, população de células isoladas ou célula T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo para uso, como definida na reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o ser humano é um paciente humano sendo tratado para uma infecção viral.

41. Método de tratamento de um sujeito por terapia com células T adotivas, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar uma quantidade terapeuticamente eficaz das células T gama- delta manipuladas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, células NK ou células T semelhantes a NK manipuladas, como definidas na reivindicação 27, células linfoides inatas manipuladas, como definidas na reivindicação 28, célula MAIT manipulada, como definida na reivindicação 29, população de células isoladas, como definida em qualquer uma das reivindicações 30 a 33, ou células T gama-delta compreendendo um polinucleotídeo heterólogo, como definidas na reivindicação 34 ou 35, a um sujeito em necessidade de tratamento.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o ser humano é um paciente humano com câncer.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o paciente humano com câncer está sendo tratado para um tumor sólido.

45. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o ser humano é um paciente humano sendo tratado para uma infecção viral.