KR20220029292A - 이종성 표적화 구조체를 발현하는 림프구 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)를 제공하며, 여기서 상기 조작된 림프구에는 구조체가 발현되는 림프구를 활성화할 수 있는 세포 내 신호전달 도메인이 없다. 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포)의 조성물, 및 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포)를 이용하는 방법(예를 들어, 적응성 T 세포 요법의 일부)이 또한 제공된다.

Description

이종성 표적화 구조체를 발현하는 림프구
암은 신체의 다른 부위로 전이될 잠재성을 갖는 비정상적인 세포의 성장을 수반하는 일군의 질병이다. 다양한 유형의 암은 잘 알려 있으며, 많은 유형의 암은 환자들 사이에서 이들의 유전자 구성이 상당히 다를 수 있다. 이러한 차이는 특정 암을 표적화하기 위한 효과적인 치료 전략을 확인하는데 어려운 부담을 준다. 특히, 임의의 주어진 암 표적에 대한 개인 맞춤형 치료 전략을 만들 필요성이 존재한다. 그 결과, T 세포 면역요법에 대한 점점 증가하는 관심이 본 발명자들이 외래 세포 또는 병원성 세포를 인식하고 파괴하기 위해 면역 시스템의 세포를 활용할 수 있다는 발견에 기초하여 부각되고 있다. 지금까지, T 세포 면역요법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 αβ T 세포를 조작하는 것과 관련이 있었다. 이 같은 CAR T 세포는 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 표적 항원(예를 들어, 종양-연관 항원)의 발현에 기초하여 암 표적을 식별할 수 있다. 이의 표적 항원에 결합할 때 CAR의 하나 이상의 세포 내 도메인은 신호 1 활성화 및/또는 신호 2 활성화(공동 자극)을 전파하여 CAR T 세포를 활성화하여, 표적 세포의 탈과립화(degranulation) 및 용해(lysis)를 야기한다. 그러나, 이 같은 CAR T 세포 접근법에는 몇몇 문제점이 남아 있다. 예를 들어, CAR T 세포는 건강한 세포에 의한 표적 항원의 중간 수준의 발현으로 인해 비표적 세포 독성(off-target cytotoxicity)을 부여할 위험성이 있다. 따라서, 상기 분야에서 치료 안전성 및 효능을 향상시키면서 면역 시스템의 이들의 강력한 구성성분을 조작하기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 CAR T 세포에 대한 대안적인 접근법을 제공한다. 구체적으로, 구조체가 발현되는 세포를 활성화할 수 있는 기능성 세포 내 도메인이 없는 이종성 표적화 구조체를 특징으로 한다. 선천적으로 유사한(innate-like) 효과기 기능을 갖는 림프구 상에서 발현되고/되거나 MHC에 제한되지 않는 경우, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 및 조작된 점막-연관 불변 T(mucosal-associated invariant T, MAIT) 세포와 같은 조작된 림프구는 건강한 세포 상에서 낮은 수준의 표적 항원에 결합할 때 비정상적인 TCR 활성화를 회피함으로써 병든 세포에 대한 향상된 특이성을 나타낼 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 감마-델타(γδ) T 세포를 특징으로 하며, 여기서 이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되는 막관통 도메인을 포함하며, 이때 이종성 표적화 구조체에는 조작된 γδ T 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없다(예를 들어, 세포 내 도메인은 존재하는 경우에 신호 1 활성화를 전파하지 않으며, 신호 2 공동 자극을 전파하지 않음). 일부 구현예에서, 이종성 표적화 구조체는 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 작동 가능하게 연결하는 줄기 도메인(stalk domain)을 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 γδ T 세포를 제공하며, 여기서 이종성 표적화 구조체는 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인을 포함하며, 이때 막관통 도메인은 말단 막관통 도메인(즉, 연결되지 않은 말단부, 예를 들어 펩티드 또는 단백질에 연결되지 않은 C-말단을 갖는 막관통 도메인)이다. 따라서, 말단 막관통 도메인은 세포 내 신호전달 도메인과 같은 세포 내 도메인에 연결되어 있지 않다. 막관통 도메인은 신호 1 활성화를 전파하지 않는다. 일부 구현예에서, 말단 막관통 도메인은 세포 내 신호전달 경로(예를 들어, TCR 경로(예를 들어, 신호 2 공동 자극과 같은 T 세포 신호전달 경로))에 참여하지 않는다. 기타 구현예에서, 막관통 도메인은 내생적 분자와 결부하여 신호 2 공동 자극을 전파할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 표적화 구조체는 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 작동 가능하게 연결하는 줄기 도메인을 더 포함한다.
본 발명의 임의의 양태의 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 조작된 γδ T 세포를 활성화하지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인, 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 줄기 도메인 및 줄기 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인으로 이루어진 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 γδ T 세포를 특징으로 한다.
본 발명의 임의의 양태의 일부 구현예에서, 조작된 γδ T 세포는 Vδ2-음성이다(예를 들어, Vδ2-음성 γδ T 세포는 Vδ1-양성이거나 이중 음성임). 본 발명의 임의의 양태의 대안적인 구현예에서, 조작된 γδ T 세포는 Vδ2-양성일 수 있다.
항원 결합 도메인은 단일쇄 가변 단편(scFv), 단클론성 항체, Fab 단편, B 세포 수용체, T 세포 수용체, 항체 스캐폴드(antibody scaffold), 수용체-특이적 리간드 또는 리간드-특이적 수용체(예를 들어, 표면-발현된 리간드에 특이적인 수용체)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 줄기 도메인은 CD8 줄기, IgG1 힌지-CH2 도메인, IgG1-힌지-CH3 도메인, IgG1-힌지-CH2-CH3 도메인, (G4S)3 힌지, IgG1 힌지, CD7 줄기, IgD 힌지, IgD 힌지-CH2 도메인, IgD 힌지-CH3 도메인, IgD 힌지-CH2-CH3 도메인, IgG4 힌지, IgG4 힌지-CH2 도메인, IgG4 힌지-CH3 도메인, IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인 또는 FcεRI 줄기 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 도메인들 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 임의의 양태의 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD3ε 막관통 도메인, CD3ζ 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD45 막관통 도메인, CD5 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, CD9 막관통 도메인, CD16 막관통 도메인, CD22 막관통 도메인, CD33 막관통 도메인, CD37 막관통 도메인, CD64 막관통 도메인, CD80 막관통 도메인, CD86 막관통 도메인, CD134 막관통 도메인, CD137 막관통 도메인, CD154 막관통 도메인, CD7 막관통 도메인, CD71 막관통 도메인, CD18 막관통 도메인, CD29 막관통 도메인, CD11a 막관통 도메인, CD11b 막관통 도메인, CD11c 막관통 도메인, CD11d 막관통 도메인, CD94 막관통 도메인, FcγR 막관통 도메인 또는 NKG2D 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 말단 막관통 도메인의 아미노산의 50% 이하는 세포 내에 상주(reside)한다(예를 들어, 말단 막관통 도메인(예를 들어, C-말단 막관통 도메인)의 아미노산의 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하는 세포 내에 상주함).
본 발명의 임의의 양태의 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 시에 이종성 표적화 구조체의 클러스터링(clustering)은 조작된 γδ T 세포에서 TCR 경로를 실질적으로 활성화하지 않는다.
본 발명의 임의의 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양-연관 항원과 결합한다. 예를 들어, 종양-연관 항원은 종양 세포(예를 들어, CD19)의 표면 상에서 발현되는 단백질 또는 펩티드 항원일 수 있다. 대안적으로, 종양-연관 항원은 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 탄수화물일 수 있다. 일부 구현예에서, 종양-연관 항원은 종양 세포(예를 들어, GD2)의 표면 상에서 발현되는 강글리오시드이다. 일부 구현예에서, 종양-연관 항원은 면역 억제 항원이다. 하나의 구현예에서, 항원 결합 도메인은 고형 종양 세포에 의해 발현되는 표적 항원과 결합한다.
임의의 이전 구현예 중 일부에서, 건강한 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합은 기능성 세포 내 도메인을 갖는 기준 세포(예를 들어, 이는 조작된 γδ T 세포에 의한 세포 용해를를 실질적으로 유발하지 않음)에 비해 상기 조작된 γδ T 세포에 의한 세포 용해를를 실질적으로 덜 유발(예를 들어, 적어도 5% 낮은 세포 용해를, 적어도 10% 낮은 세포 용해를, 적어도 20% 낮은 세포 용해, 적어도 30% 낮은 세포 용해, 적어도 40% 낮은 세포 용해, 적어도 50% 낮은 세포 용해, 적어도 60% 낮은 세포 용해, 적어도 70% 낮은 세포 용해, 적어도 80% 낮은 세포 용해, 적어도 90% 낮은 세포 용해 또는 적어도 95% 낮은 세포 용해)한다. 일부 구현예에서, 종양 세포 또는 감염 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합은 조작된 γδ T 세포에 의한 세포 용해를 실질적으로 유발한다. 세포 용해는 조작된 γδ T 세포에 의한 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 또는 DNAM1의 내생적 발현에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 용해는 CD107 탈과립화, 그랜자임(granzyme) 방출, 퍼포린(perforin) 방출, 그라눌리신(granulysin) 방출, 표적 세포 사멸, γδ T 세포의 증식 및 사이토카인 생산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 반응들 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두를 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술되어 있는 구현예들 중 임의의 것의 이종성 표적화 구조체를 갖는 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함한다. 이종성 표적화 구조체에는 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없다.
다른 양태에서, 본 발명은 조작된 선천성 림프계 세포(ILC)를 특징으로 한다. 조작된 ILC는 본원에 기술되어 있는 구현예들 중 임의의 것의 이종성 표적화 구조체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 결합되어 있는 막관통 도메인을 포함한다. 이종성 표적화 구조체에는 조작된 선천성 림프계 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없다.
다른 양태에서, 본 발명은 조작된 MAIT 세포를 특징으로 한다. 조작된 MAIT 세포는 본원에 기술되어 있는 구현예들 중 임의의 것의 이종성 표적화 구조체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함한다. 이종성 표적화 구조체에는 조작된 MAIT 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없다.
다른 양태에서, 본 발명은 선행 구현예들 중 임의의 것의 적어도 10개의 조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포 또는 조작된 MAIT 세포를 포함하는 분리된 세포 집단을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포 또는 조작된 MAIT 세포는 분리된 세포 집단에서 총 세포 수의 2% 초과(예를 들어, 2%와 100% 사이, 10%와 95% 사이, 20%와 90% 사이, 30%와 80% 사이, 40%와 70% 사이, 예를 들어 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96%, 97%, 98% 또는 99%)에 해당한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이전 구현예들 중 임의의 하나의 복수의 조작된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포를 포함하는 분리된 세포 집단을 특징으로 한다. 조작된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포의 집단은 분리된 세포 집단에서 총 세포 수의 2% 초과(예를 들어, 2%와 100% 사이, 10%와 95% 사이, 20%와 90% 사이, 30%와 80% 사이, 40%와 70% 사이, 예를 들어 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96%, 97%, 98% 또는 99%)에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 세포 집단은 이전 구현예들 중 임의의 하나의 적어도 10개의 조작된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포를 포함한다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함하는 이종성 표적화 구조체를 암호화할 수 있으며, 이때 이종성 표적화 구조체는 조작된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포를 직접 활성화하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인 및 말단 막관통 도메인을 포함하는 표적화 구조체를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포를 특징으로 한다.
조작된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포; 분리된 조작된 γδ T 세포 집단, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포 집단; 또는 선행 구현예들 중 임의의 것의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포는 적응성 세포 요법(adoptive T cell therapy)에 의해 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다(예를 들어, 적응성 세포 요법에 의해 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것임).
다른 양태에서, 본 발명은 적응성 세포 요법(예를 들어, 적응성 T 세포 요법)에 의해 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 여기서 상기 방법은 선행 구현예들 중 임의의 것의 조작된 세포, 분리된 세포 집단 또는 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 적응성 세포 요법(예를 들어, 적응성 T 세포 요법)에 의해 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 선행 구현예들 중 임의의 것의 조작된 세포, 분리된 세포 집단 또는 세포를 제공하며, 이때 상기 방법은 선행 구현예들 중 임의의 것의 조작된 세포, 분리된 세포 집단 또는 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
이전 양태들 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 예를 들어, 대상체는 인간 암 환자(예를 들어, 고형 종양 치료를 받고 있는 인간 암 환자)일 수 있다. 대안적으로, 인간 환자는 바이러스 감염 치료를 받고 있는 인간 환자일 수 있다.
도 1은 세포 내 도메인을 포함하지 않은 이종성 표적화 구조체의 하나의 구현예 대비 전형적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 보여주는 개략도이다.
도 2a 내지 도 2c는 목적하는 표적에 맞춘 다양한 세포 외 도메인을 이용하여 이종성 표적화 구조체를 변형할 수 있는 방법을 보여주는 일련의 개략도이다. 도 2a는, 예를 들어 B-세포 수용체, 항체 스캐폴드 또는 모방체, scFv, mAb, Fab 또는 T 세포 수용체일 수 있는 일반화된 세포 외 도메인을 보여준다. 도 2b는 리간드-특이적 수용체인 세포 외 도메인을 보여준다. 도 2c는 수용체-특이적 리간드인 세포 외 도메인을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 유세포 분석법 히스토그램이다. 도 3a는 형질 도입된 Vδ1 세포 상의 세포 내 도메인("비-신호전달 또는 nsCAR") 및 전장 항-CD19 CAR이 없는 항-CD19 표적화 구조체의 발현을 보여준다. 도 3b는 형질 도입되지 않은 Vδ1 세포(UTD; 상부 행), 비-신호전달 CD19 CAR로 형질 도입된 Vδ1 세포(중앙 행) 및 CD19 CAR로 형질 도입된 Vδ1 세포(하부 행) 상의 NCR(천연 세포 독성 수용체) NKp30(좌측 칼럼), NKp44(중앙 칼럼) 및 NKG2D(우측 칼럼)의 발현을 보여준다.
도 4a 내지 도 4c는 Nalm-6 및 B-세포 상의 CD19 발현을 보여주는 그래프(도 4a) 및 1:1의 효과기 대 표적 비율로 16시간 살해 검정으로 얻어진 결과를 보여주는 그래프(도 4b 및 도 4c)이다. 도 4b는 CD19+ Nalm-6 세포의 살해를 보여주고, 도 4c는 일차 B-ALL 세포의 살해를 보여준다. 2개의 독립적인 도너(donor) 및 실험이 나타나 있다.
도 5a 및 도 5b는 Vδ1 세포 상의 항-GD2 비-신호전달 CAR 발현을 보여주는 그래프(도 5a) 및 켈리(Kelly) 세포주 단독 또는 Vδ1 세포의 존재 하의 켈리 세포주의 60시간의 성장 시간 과정을 보여주는 그래프(도 5b)이다. 데이터는 0시 시점에 이미지 당 녹색 객체의 개수로 정규화된 이미지 당 녹색 객체의 개수의 변화로서 표시되어 있다. 각각의 측정점(data point)은 3중 웰(triplicate well)을 나타낸다.
본원에는 이종성 표적화 구조체를 발현하는 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 림프계 세포 또는 점막-연관 불변 T 세포와 같은 선천적으로 유사한 효과기 기능을 갖는 림프구)의 조성물이 제공된다. 이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인(예를 들어, 직접 연결되거나 줄기 도메인을 통해 연결되어 있음)을 포함한다. 이들의 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포)는 암 또는 바이러스 감염과 같은 질병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 이종성 구조체에는 T 세포 활성화를 전파할 수 있는 기능성 세포 내 도메인이 없기 때문에 이들 구조체는 γδ T 세포가 특징인 내생적 MHC 독립성 활성화 경로에 의존하며, 여기서 상기 활성화 경로에는 αβ T 세포가 없다. 따라서, 본원에 기술되어 있는 이종성 구조체는 림프구, 예를 들어 γδ T 세포(예를 들어, Vδ1 세포, Vδ2 세포 Vδ3 세포, Vδ5 세포 및 Vδ8 세포)의 표면 상에서 발현되도록 설계되어 있다.
정의
본원에 기술되어 있는 본 발명의 양태 및 구현예는 "포함하는", "이루어진" 및 "필수적으로 이루어진"이란 양태 및 구현예를 포함하는 것을 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "일" 및 "하나"란 단수 형태는 달린 표시하지 않는 한 복수의 인용대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약"이란 용어는 본 기술 분야에서 숙련자에게 용이하게 알려져 있는 개개의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약"의 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 자체로 이러한 값 또는 매개변수와 관련이 있는 구현예를 포함(및 기술)하고 있다. 일부의 경우, "약"은 명시된 값으로부터 +20%의 변화량, 일부의 경우 +10%의 변화량, 일부의 경우 +5%의 변화량, 일부의 경우 +1%의 변화량 또는 일부의 경우 +0.1%의 변화량을 포함하는데, 이 같은 변화량은 개시된 방법을 실시하는데 적당하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적인" 및 "실질적으로"란 용어는 관심 있는 특징 또는 특성의 전체 또는 전체에 가까운 규모 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 생물 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전하게 되고/되거나 완전성을 향해 가거나 절대적인 결과를 달성하거나 피하더라도 극히 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, "실질적으로"란 용어는 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 잠재적인 완전성 결여를 담아내기 위해 사용된다. 수용체/리간드 상호작용 또는 세포/세포 접촉과 같은 물리적 시나리오를 기술하는 경우, 시나리오는 이의 기능적 결과가 상기 방법을 실시하는 사람이 이용 가능한 통상적인 수단에 의해 검출 가능하다면 실속이 있다. 예를 들어, "실질적인 TCR 활성화"는 세포의 집단 중에서 검출 가능한 수준의 TCR 활성화(예를 들어, 통계적으로 유의한 정도의 TCR 활성화)를 지칭한다. 일부 구현예에서, TCR은 개개의 세포 집단 상의 TCR 경로 작용제(예를 들어, 항체(예를 들어, 항-CD3 또는 렉틴))의 EC50의 최대 0.1%, 최대 0.5%, 최대 1%, 최대 5%, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30% 또는 최대 40%까지 노출 시에 실질적으로 활성화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이종성 표적화 구조체"는 숙주 세포(즉, 조작된 세포) 상에 상주하고, 다른 세포 상에 존재하는 표적 분자와 결합하지만, 단백질이 상주하는 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 단백질 또는 단백질 세트(예를 들어, 이량화하여 기능성 4차 단백질을 형성하는 2개 이상의 단백질)을 지칭한다. 이종성 표적화 구조체는 조작된 세포 내에서 발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, T 세포를 "활성화"한다는 것은 신호 1 활성화 또는 신호 2 활성화를 전파함으로써 T 세포 수용체(TCR) 경로를 개시하거나 증폭한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 기능성 신호 1 T 세포 활성화 도메인(예를 들어, CD3ζ) 또는 공동 자극 도메인(예를 들어, CD28, 4-1BB 등)을 갖는 키메라 항원 수용체는 항원 결합에 대한 반응에서 클러스터링에 의해 이의 숙주 T 세포를 "활성화"할 수 있다. 기능성 세포 내 도메인이 없는 이종성 표적화 구조체는 신호 1 활성화 또는 신호 2 활성화를 전파하는 수단이 없을 수 있으며, 따라서 TCR 경로를 활성화할 수 없다. 기능성 세포 내 도메인이 없는 이종성 표적화 구조체는 이의 막관통 도메인이, 예를 들어 내생적 DAP10 또는 DAP12와 NKG2D 막관통 도메인의 연관 시에 공동 자극을 전파하면 발현되는 T 세포를 "활성화"할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본 발명은 기능성이 없는 막관통 도메인을 갖는 이종성 표적화 구조체를 특징으로 하며, 이종성 표적화 도메인은 상기 도메인이 발현되는 T 세포를 활성화하지 않는다.
"T 세포 수용체(TCR) 경로"의 활성화는 TCR 신호전달을 통한 T 세포의 증식 유도 또는 기타 활성화의 결과를 지칭한다. TCR 신호전달 경로는 신호 1 활성화, 예를 들어 Src-관련 단백질 티로신 키나아제(PTK), Lck 및 Fyn 및 70 kDa의 제타 사슬(TCR)-연관 단백질 키나아제(ZAP70)의 순차적인 활성화를 수반한다. 이들의 PTK에 의해 T 세포용 링커 활성화제(LAT)를 포함하는 폴리펩티드의 인산화가 초래되며, 그 결과 세포 외 신호-조절된 키나아제(ERK), c-Jun N-말단 키나아제(JNK) 및 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)를 통한 하류 자극이 초래된다. 예를 들어, CD28, CD45, DAP10 또는 DAP12를 통한 신호 2(즉, 공동 자극)는 인산화를 향상시키고 TCR 활성화를 향상시킬 수 있다. 따라서, TCR 또는 공동 자극 경로의 일부를 표적화하는 임의의 분자는 T 세포 신호전달을 직접 활성화할 수 있다. 단순히 T 세포를 표적 세포와 접촉하게 하는 표면 결합 분자(예를 들어, 이종성 표적화 구조체)는 기타 분자가 T 세포 활성화를 직접 야기하는 것을 용이하게 할 수 있지만, 이들의 표적화 분자는 TCR 경로를 직접 활성화하지 않는다.
TCR 경로 작용제는 항체(예를 들어, 단클론성 항체(예를 들어, 항-TCR Vδ1, 항-TCR δTCS-1, 항-TCR PAN γδ 및 항-CD3)), 렉틴(예를 들어, 식물 렉틴(예를 들어, 콘카나발린 A, 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)(PHA-P), 피톨라카 아메리카나(Phytolacca Americana), 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris), 렌스 쿨리나리스(Lens culinaris), 글리치네 막스(Glycine max), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis), 피숨 사티붐(Pisum sativum) 및 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra)에서 유래한 렉틴), 합성 인항원(phosphoantigen; 예를 들어 BrHPP(브로모하이드린 파이로포스페이트), 2M3B1PP(2-메틸-3-부텐일-1-파이로포스페이트), HMBPP((E)-4-하이드록시-3-메틸-부트-2-엔일 파이로포스페이트) 또는 IPP(이소펜텐일 파이로포스페이트)) 및 N-비스포스포네이트(예를 들어, 졸레드로네이트(zoledronate))를 포함한다. TCR 경로 작용제는 공동 수용체 작용제를 포함하며, 여기서 공동 수용체 작용제는 항체(예를 들어, 단클론성 항체(예를 들어, 항-CD2, 항-CD6, 항-CD9, 항-CD28, 항-CD43, 항-CD94, 항-CD160, 항-SLAM, 항-NKG2D, 항-2B4, 항-HLA-A, 항-HLA-b, 항-HLA-C, 및 항-ICAM-3)) 및 단백질(예를 들어, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 인간 단백질, 예를 들어 CD7L, CD26, CD27L, CD30L, CD40L, OX40L, 4-1BBL, ICAM-1, 피브로넥틴, 하이드로코르티손 및 이들의 변이체, 예를 들어 Fc-융합 단백질(예를 들어, CD27L-Fc)))을 포함한다. TCR 경로 작용제는 가용성이거나 막 결합형일 수 있으며, 예를 들어 MHC 또는 HLA 복합체에서와 같이 인공 항원 제시 세포(aAPC)와 같은 세포 상에서 제시될 수 있다. T 세포 신호전달을 활성화하는데 적합한 aAPC는 당해 기술분야에 알려져 있다. TCR 경로 작용제를 외생적으로 첨가함으로써 T 세포를 활성화하는 적합한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 데니거(Deniger) 등의 문헌[Deniger, et al. Frontiers in Immunology. 2014. 5(636):1-10]의 도 1에 요약되어 있다.
"외생적 TCR 경로 작용제"는 비조혈 조직 또는 이의 도너에서 기원하지 않은 TCR 경로 작용제를 지칭한다(즉, 이들은 외생적으로 첨가됨). 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서 TCR 경로 작용제가 비조혈 조직에서 유래한 잔류 물질(예를 들어, 가용성 피브로넥틴 또는 세포 결합형 ICAM-1)로서 배양액에 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 잔류 TCR 경로 작용제는 무시할 정도의 농도이며, T 세포를 실질적으로 활성화하지 않는다.
이종성 표적화 구조체와 같은 단백질의 도메인에 있어서, 본원에서 다른 도메인에 "작동 가능하게 연결된다"는 것은 기타 도메인과 바로 인접해 있거나 하나 이상의 아미노산 또는 도메인에 의해 분리되어 있는, 기타 도메인과 동일한 단백질 상에 상주한다는 것을 의미한다. 예를 들어, N-말단 항원 결합 도메인, 중간 줄기 도메인 및 C-말단 막관통 도메인을 갖는 이종성 표적화 구조체에서, 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인은 작동 가능하게 연결되어 있는 것으로 여겨진다. C-말단 막관통 도메인에 바로 인접한 N-말단 항원 결합 도메인을 갖는 이종성 표적화 구조체에서, 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인은 또한 작동 가능하게 연결되어 있는 것으로 여겨지지만, 보다 구체적으로는 직접 연결되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 스캐폴드"란 용어는 비고유 항원 결합 단백질, 펩티드 또는 항체 단편을 지칭한다. 항체 스캐폴드로는 애드넥틴(adnectin), 어피바디(affibody), 아필린(affilin), 안티칼린(anticalin), 아트리머(atrimer), 아비머(avimer), 이중환 펩티드, 센티린(centyrin), 시스틴 매듭(cys-knot), DARPin, 피노머(fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인, 오바디(Obody) 및 Tn3을 들 수 있다. 항체 스캐폴드는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있는 문헌[Vazquz-Lombardi et al., Drug Discovery Today, 2015, 20(10): 1271-83]에 기술되어 있다.
"항체"란 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단클론성 항체(전장 단클론성 항체를 포함함), 다클론성 항체, 다중 특이적 항체(예를 들어, 2중 특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포 독성"이란 용어는 면역 세포(예를 들어, γδ T 세포)가 기타 세포(예를 들어, 표적 세포)를 사멸시키는 능력을 지칭한다. 세포 독성 기능을 갖는 면역 세포는 주변 세포를 사멸시킬 수 있는 독성 단백질(예를 들어, 퍼포린 및 그랜자임)을 방출한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "탈과립화"란 용어는 항미생물 분자 및 세포 독성 분자를 포함하는 분자가 과립으로 지칭되는 세포 내 분비형 소포로부터 방출되는 세포 과정을 지칭한다. 탈과립화는 세포 독성 T 세포와 같은 면역 세포에 의한 병원균 및 침입 미생물에 대한 면역 반응의 일부이다. 탈과립화 동안에 방출되는 분자는 세포 유형에 따라 달라지며, 침입 병원균 및 미생물을 사멸시키거나 염증과 같은 면역 반응을 조장하도록 설계된 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "선천성 림프계 세포"란 용어는 T 및 B 세포에 의해 발현되는 항원 수용체와 같은 재배열된 항원 수용체가 없는 선천적으로 유사한 림프구를 지칭한다. 선천성 림프계 세포로는 NK 세포, 1형 선천성 림프계 세포(ILC1), 인트라-ILC1 세포, 2형 선천성 림프계 세포(ILC2), 3형 선천성 림프계 세포(ILC3) 등을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "점막-연관 불변 T 세포" 및 "MAIT 세포"란 용어는 불변 T 세포 수용체 α(TCRα) 사슬 및 다양성 TCRβ 사슬을 발현하고 진화상 보존된 주요 조직 적합성 복합체-관련 분자 1(MR1)의 맥락에서 별개의 분자 세트를 인식할 수 있는 선천적으로 유사한 T 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NK 세포"란 용어는 천연 살해 세포를 지칭하며, 이는 TCR 또는 CD3을 발현하지 않고 CD56 및 CD161의 발현에 양성인 선천적으로 유사한 림프구이다. 또한, NK 세포는 NKp44 및 NKp46과 같은 천연 세포 독성 수용체를 발현할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NK-유사 T 세포"란 용어는 T 세포 및 NK 세포 둘 모두와 기능적 및 구조적 특징을 공유하는 선천적으로 유사한 림프구인 천연 살해-유사 T 세포 또는 천연 살해 T 세포(NKT 세포)를 지칭하며, 즉 이들은 TCR (예를 들어, αβ TCR), CD3 및 CD56을 발현한다. NK-유사 T 세포는 MHC 클래스-1-유사 당단백질인 CD1d의 맥락에서 당지질을 인지하고 이에 대해 반작용을 하며, 활성화 시에 IFN-γ 및 IL-4를 생산할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비조혈 세포"는 기질 세포 및 상피 세포를 포함한다. 기질 세포는 임의의 기관의 비조혈 결합 조직 세포이며, 이러한 기관의 유조직 세포의 기능을 지원한다. 기질 세포의 예로는 섬유아세포, 혈관주위세포(pericyte), 중간엽 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 비혈액 종양 세포를 들 수 있다. 상피 세포는 신체 전체에 혈관 및 기관의 내강(cavity) 및 표면에 놓여있는 비조혈 세포이다. 이들은 정상적으로 형상이 편평하거나, 원주형 또는 입방형이며, 세포의 단일 층 또는 2개 이상의 세포의 층으로서 배열될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비조혈 조직-상주 γδ T 세포," "비조혈 조직 유래" 및 "비조혈 조직 고유 γδ T 세포"는 조직이 외식(explantation)되는 시간에 비조혈 조직 내에 존재하고 있는 γδ T 세포를 지칭한다. 비조혈 조직-상주 γδ T 세포는 임의의 적합한 인간 또는 비인간 동물의 비조혈 조직으로부터 수득될 수 있다. 비조혈 조직은 혈액 또는 골수를 제외한 조직이다. 일부 구현예에서, γδ T 세포는 혈액 또는 활액과 같은 특정 유형의 생물학적 유체 샘플로부터 수득되지 않는다. 이 같은 적합한 인간 또는 비인간 동물의 비조혈 조직의 예로는 피부 또는 이의 일부(예를 들어, 진피 또는 표피), 위장관 (예를 들어, 위장관 상피세포, 결장, 소장, 위, 충수(appendix), 맹장(cecum) 또는 직장), 유선 조직, 폐(바람직하게는, 이때 조직은 기관지폐포 세척(bronchoalveolar lavage)에 의해 수득되지 않음), 전립선, 간 및 췌장을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 비조혈 조직-상주 γδ T 세포는 흉선, 비장 또는 편도선과 같은 림프성 조직에서 유래할 수 있다. 또한, γδ T 세포는 인간 암 조직, 예를 들어 유방 및 전립선에 상주할 수 있다. 일부 구현예에서, γδ T 세포는 인간 암 조직으로부터 수득되지 않는다. 비조혈 조직 샘플은 표준 기법, 예를 들어 외식(예를 들어, 생검)에 의해 수득될 수 있다. 비조혈 조직-상주 γδ T 세포는, 예를 들어 Vδ1 T 세포, 이중 음성(DN) T 세포, Vδ2 T 세포, Vδ3 T 세포 및 Vδ5 T 세포를 포함한다.
상술한 인자들 중 임의의 하나 이상은, 본 발명의 이종성 표적화 구조체를 암호화하는 핵산으로 형질 감염될 수 있는 림프구(예를 들어, γδ T 세포)의 확장 집단을 생산하는데 효과적인 양으로 확장 프로토콜(expansion protocol)에 포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "~에 효과적인 양으로"란 문구는 검출 가능한 결과(예를 들어, 이의 출발 집단에 비해 통계적으로 유의한(예를 들어, p < 0.05) 증가 개수를 갖는 다수의 세포)를 유도하는 양을 지칭한다. 여러 인자가 동시에 존재하는 경우, 유효량은 모든 인자의 합성 효과(composite effect; 예를 들어, IL-2 및 IL-15의 합성 효과 또는 IL-2, IL-4, IL-15 및 IL-21의 합성 효과)를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "γδ 세포의 확장 집단"은 γδ 세포의 확장을 유도하는, 즉 γδ 세포 개수를 증가시키는 조건에서, 그리고 그 기간 동안 배양되었던 γδ T 세포를 포함하는 조혈 또는 비조혈 세포의 집단을 지칭한다. 마찬가지로, 본원에서 사용되는 바와 같이, "Vδ1 T 세포의 확장 집단"은 Vδ1 T 세포의 확장을 유도하는, 즉 Vδ1 세포 개수를 증가시키는 조건에서, 그리고 그 기간 동안 배양되었던 Vδ1 T 세포를 포함하는 조혈 또는 비조혈 세포의 집단을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지지 세포(feeder cell)"는 비조혈 조직-유래 세포에 대한 세포-대-세포 표면 접촉을 제공하기 위해 배양액에 첨가되는 임의의 외생적 세포를 지칭한다. 지지 세포는 일차 세포(예를 들어, 조직에서 유래함)이거나 세포주에서 유래할 수 있다. 지지 세포는 살아있을 수 있거나 방사선 조사될 수 있으며, 종양 세포, 섬유아세포, B 세포, 및 기타 항원 제시 세포를 포함한다.
본원에서 "마커"란 용어는 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 당지질 또는 세포 기반 분자 마커를 지칭하며, 여기서 환자의 샘플 내의 이의 발현 및 존재는 표준 방법(또는 본원에 개시되어 있는 방법)에 의해 검출될 수 있다.
관심 있는 마커를 "발현하는" 세포 또는 세포의 집단은 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 단백질 그 자체(이의 단편을 포함함)가 세포 또는 집단 내에 존재하는 것으로 확인된 것이다. 마커의 발현은 다양한 수단에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 마커의 발현은 하나의 세포 상의 마커의 표면 밀도를 지칭한다. 예를 들어, 유세포 분석법의 판독으로서 사용되는 바와 같이 평균 형광 세기(MFI)는 세포의 집단 상의 마커의 밀도를 나타낸다. 당해 기술분야의 숙련자라면 MFI 값이 염색 매개변수(예를 들어, 농도, 기간 및 온도) 및 형광색소(fluorochrome) 조성에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 그러나, MFI는 적당한 대조군의 맥락에서 고려되는 경우에 정량적일 수 있다. 예를 들어, 세포의 집단은 마커에 대한 항체의 MFI가 동일한 조건 하에서 염색된 동일한 세포의 집단 상의 적당한 아이소타입 대조군 항체의 MFI보다 유의하게 높으면 마커를 발현하는 것으로 여겨질 수 있다. 부가적이거나 대안적으로, 세포의 집단은 통상적인 유세포 분석 방법에 따라(예를 들어, 아이소타입 또는 "형광-마이너스-원"(FMO) 대조군에 따라 게이트를 설정함으로써) 양의 게이트(positive gate) 및 음의 게이트를 이용하여 세포별로 마커를 발현하는 것으로 여겨질 수 있다. 이러한 미터법(metric)에 의해, 집단은 마커에 대해 양성을 검출된 세포의 개수가 (예를 들어, 아이소타입 대조군에 대한 게이팅에 의해) 배경보다 유의하게 높으면 마커를 발현하는 것으로 여겨질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 집단의 발현이 양성 세포의 비율(%)로서 표시되고, 이러한 비율(%)이 기준 집단의 양성 세포의 상응하는 비율(%)과 비교하는 경우, 비율(%)의 차이는 개개의 집단 각각의 모 집단의 비율(%)이다. 예를 들어, 마커가 집단 A의 10%의 세포 상에서 발현되고, 동일한 마커가 집단 B의 1%의 세포 상에서 발현되면, 집단 A는 집단 B보다 9% 높은 마커-양성 세포의 빈도를 갖는 것으로 여겨진다(즉, 10% ÷ 1%가 아닌 10% - 1%임). 모 집단 내의 세포의 개수로 빈도를 곱하는 경우, 세포의 절대 개수의 차이가 계산된다. 상기에 주어진 예에서, 집단 A 내에 100개의 세포가 존재하고, 집단 B 내에 10개의 세포가 존재하면, 집단 A는 집단 B에 대해 100배의 세포 개수, 즉 (10% x 100) ÷ (1% x 10)을 갖는다.
마커의 발현 수준은 핵산 발현 수준(예를 들어, DNA 발현 수준 또는 RNA 발현 수준, 예를 들어 mRNA 발현 수준)일 수 있다. 핵산 발현 수준을 측정하는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 발현 수준은 qPCR, rtPCR, RNA-seq, 멀티플렉스(multiplex) qPCR 또는 RT-qPCR, 마이크로어레이(microarray) 분석, 유전자 발현의 연속 분석(SAGE), MassARRAY 기법, 원위치 혼성화(in situ hybridization; 예를 들어, FISH) 또는 이들의 조합을 이용하여 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "기준 집단"은 관심 있는 세포에 상응하는 세포의 집단을 지칭하며, 이때 이와 비교하여 관심 있는 세포의 표현형을 측정한다. 예를 들어, 분리된 비조혈 조직-유래 γδ 세포의 집단 상에서의 마커의 발현 수준은, 상이한 조건(예를 들어, 실질적인 TCR 활성화의 존재, 외생적 TCR 활성화제(예를 들어, 항-CD3)의 존재 또는 기질 세포(예를 들어, 섬유아세포)와의 실질적인 접촉) 하에 확장된 조혈 조직-유래 γδ T 세포(예를 들어, 혈액-상주 γδ 세포(예를 들어, 동일한 도너 또는 상이한 도너에서 유래한 혈액-상주 γδ 세포) 또는 비조혈 조직-유래 γδ T 세포 상에서의 동일한 마커의 발현 수준과 비교할 수 있다. 또한, 집단는 그 자체의 초기의 상태와 비교할 수 있다. 예를 들어, 기준 집단은 이의 확장 이전에 분리된 세포 집단일 수 있다. 이 경우, 확장 집단은 확장 단계 이전에 그 자신의 조성, 즉 이의 과거의 조성과 비교하며, 이 경우에 이는 기준 집단이다.
"암"은 악성 암세포의 비정상적인 증식을 지칭하며, 조혈 세포암(예를 들어, 혈액 악성 종양, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호산구 백혈병(CEL), 골수 이형성 증후군(MDS), 급성 림프모구 백혈병(ALL) 및 만성 림프성 백혈병(CLL)과 같은 백혈병, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 비호지킨 림프종(NHL)과 같은 림프종, 및 다발성 골수종 (MM)), 및 고형 암, 예를 들어 육종(예를 들어, 연조직 육종, 자궁 육종), 피부암, 흑색종(예를 들어, 악성 흑색종), 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 결장암 (예를 들어, 결장 선암종), 자궁경부암, 간암(즉, 간장암), 두경부암(예를 들어, 두경부 편평세포 암종), 식도암, 췌장암, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종), 부신암, 위 암, 위암 (예를 들어, 위 선암종), 고환암, 담낭 및 담도암, 갑상선암, 흉선암, 골암, 뇌암, 담낭암, 방광암, 골 및 연조직 암종, 뇌 종양, 자궁경부암, 결장암, 경성 섬유종(desmoid tumor), 배아암, 자궁 내막암, 식도암, 위 선암종, 다형성교아종, 부인과 종양, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장관 선암종, 원발성 성상세포 종양, 원발성 갑상선암, 횡문근 육종, 피부암, 고환 생식세포 종양, 요로 상피암 및 자궁암을 포함한다. 암 환자 내에서의 암세포는 개체에서 정상적인 체세포와는 면역학적으로 다를 수 있다(예를 들어, 암성 종양은 면역원성일 수 있음). 예를 들어, 암세포는 암세포에 의해 발현되는 하나 이상의 항원에 대항하여 암 환자에서 전신성 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역 반응을 유도하는 항원은 종양 항원일 수 있거나, 정상적인 세포와 공유할 수 있다. 암을 앓고 있는 환자는 당해 기술분야에 알려져 있는 임상 표준에 따라 암을 진단하기에 충분한 적어도 하나의 식별 가능한 징후, 증상 또는 검사 소견을 나타낼 수 있다. 이 같은 임상 표준의 예는 해리슨의 내과학 원리(Harrison's Principles of Internal Medicine)(문헌[Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Jameson J, Loscalzo J. eds. 18e. New York, NY: McGraw-Hill; 2012])와 같은 의학 교과서에 찾아볼 수 있다. 일부의 경우, 개체에서 암의 진단은 개체에서 수득된 체액 또는 조직 샘플에서 특정 세포 유형 (예를 들어, 암세포)의 식별을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "고형 종양"은 혈액, 골수 또는 림프계를 제외한 신체 조직의 임의의 암이다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 종양 및 비상피 세포 기원의 종양으로 추가로 분류될 수 있다. 상피 세포 기원의 고형 종양의 예로는 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 입술, 비인두(nasopharynx), 피부, 자궁, 남성 생식 기관, 비뇨기관, 방광 및 피부의 종양을 들 수 있다. 비상피세포 기원의 고형 종양으로는 육종, 뇌종양 및 골 종양을 들 수 있다.
상술한 바와 같은 치료에 적합한 환자, 대상체 또는 개체는 설치류(예를 들어, 기니피그, 햄스터, 래트, 마우스), 쥣과(예를 들어, 마우스), 개과(예를 들어, 개), 고양잇과(예를 들어, 고양이), 말과(예를 들어, 말), 영장류, 원숭이과(예를 들어, 원숭이 또는 유인원), 원숭이(예를 들어, 마모셋원숭이(marmoset) 또는 개코원숭이), 유인원(예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄 또는 긴팔원숭이) 또는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
일부 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다. 기타 바람직한 구현예에서, 인간에서 치료 효능을 증명하기 위한 모델로서 통상적으로 사용되는 비인간 포유동물, 특히 포유동물(예를 들어, 쥣과, 영장류, 돼지과, 개과 또는 토끼)이 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변경, 예를 들어 "치료하다" 또는 "치료하는")는 일부 목적하는 치료 효과, 예를 들어 상태 진행의 억제 또는 지연이 달성된 인간 또는 (예를 들어, 수의학 응용에서의) 동물과는 무관하게 임상적 중재를 지칭하며, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 상태의 개선, 상태의 치료 또는 소멸(부분적이든 전체이든), 상태의 하나 이상의 증상 및/또는 징후의 예방, 지연, 약화 또는 정지, 또는 치료의 부재 시에 예상되는 범위를 넘어선 대상체 또는 환자의 생존 연장을 포함한다.
예방 조치(즉, 예방)로서의 치료가 또한 포함된다. 예를 들어, 암의 발생 또는 재발에 민감하거나 이의 위험성이 있는 환자, 대상체, 또는 개체가 본원에 기술되어 있는 바와 같이 치료될 수 있다. 이 같은 치료는 환자, 대상체 또는 개체에서 암의 발생 또는 재발을 예방 또는 지연시킬 수 있다.
특히, 치료는 완전한 암 소멸을 비롯한 암 성장의 억제 및/또는 암 전이의 억제를 포함할 수 있다. 암 성장은 일반적으로 보다 진행된 형태로의 암 내에의 변화를 나타내는 다수의 지수들 중 임의의 하나를 지칭한다. 따라서, 암 성장의 억제를 측정하기 위한 지수로는 암세포 생존의 감소, 종양 부피 또는 형태의 감소(예를 들어, 컴퓨터 단층촬영(CT), 초음파 검사 또는 기타 이미지화 방법을 이용하여 측정된 바와 같음), 종양 성장의 지연, 종양 맥관 구조의 파괴, 지연성 과민증 피부 시험의 성능 개선, 세포 용해성 T-림프구 활성의 증가 및 종양-특이적 항원 수준의 감소를 들 수 있다. 개체에서 암성 종양에서의 면역 억제가 감소되면 개체가 암 성장, 특히 이미 대상체에 존재하는 암의 성장에 내성을 나타내는 능력이 개선될 수 있고/있거나, 개체에서 암 성장 경향이 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 확장된 γδ T 세포(예를 들어, 비조혈 조직-유래 γδ T 세포(예를 들어, 비조혈 조직-유래 Vδ1 T 세포))는 질병의 발생을 지연시키거나 질병 또는 질환의 진행을 늦추기 위해 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "투여하는"은 환자에게 요법제(예를 들어, 적응성 T 세포 요법제(예를 들어, 비조혈 조직-유래 γδ T 세포를 포함함)) 또는 조성물(예를 들어, 약학 조성물(예를 들어, 비조혈 조직-유래 γδ T 세포를 포함하는 약학 조성물))의 복용량을 제공하는 방법을 의미한다. 본원에 기술되어 있는 방법에 이용되는 조성물은, 예를 들어 근육 내, 정맥 내, 피부 내, 경피 내, 동맥 내, 복강 내, 병변 내, 두개 내, 관절 내, 전립선 내, 흉막 내, 기관 내, 경막 내, 비강 내, 질 내, 직장 내, 국소, 종양 내, 복막, 피하, 결막하, 방광 내, 점막, 심낭 내, 배꼽 내, 안 내, 안와 내, 유리체 내(예를 들어, 유리체 내 주사에 의해), 점안에 의해, 경구, 국소, 경피, 흡입에 의해, 주사에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접 국부화 관류 세척 표적 세포(localized perfusion bathing target cell)에 의해, 카테터(catheter)에 의해, 세척에 의해, 크림 내에서 또는 지질 조성물 내에서 투여될 수 있다. 또한, 본원에 기술되어 있는 방법에 이용되는 조성물은 전신 또는 국부 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자(예를 들어, 투여될 치료제 또는 조성물 및 치료될 상태, 질병 또는 질환의 중증도)에 따라 달라질 수 있다.
"치료학적 유효량"은 포유동물에서 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료학적 유효량의 치료제(예를 들어, 비조혈 조직-유래 γδ T)는 암세포의 개수를 감소시키고/시키거나; 원발성 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 말초 기관으로의 암세포 침투를 억제하고/하거나(즉, 어느 정도 지연하고 바람직하게는 중단시키고); 종양 전이를 억제하고/하거나(즉, 어느 정도 지연하고 바람직하게는 중단시키고); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나; 질환과 연관된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 상기 약물이 성장을 방지하고/하거나 기존의 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 이는 정균성(cytostaticity) 및/또는 세포 독성일 수 있다. 암 요법에 있어서, 생체 내(in vivo)의 효능은, 예를 들어 생존 기간, 질병 진행 시간(TTP), 반응 속도(예를 들어, 완전 반응 (CR) 및 부분 반응 (PR)), 반응 기간 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정될 수 있다.
"동시에"란 용어는 본원에서 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위해 사용되며, 여기서 투여의 적어도 일부는 시간이 중복된다. 따라서, 동시 투여는 하나 이상의 약제(들)의 투여가 하나 이상의 기타 약제(들)의 투여를 중단한 이후에 계속하는 경우의 복용 용법(dosing regimen)을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 비조혈 조직-유래 γδ T 세포 및 IL-2가 동시에 투여될 수 있다.
"약학 조성물"이란 용어는 그 내부에 함유된 하나 이상의 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이 되도록 하는 이 같은 형태이고, 제형이 투여될 환자에 대해 받아들이기 어려울 정도로 독성을 나타내는 부가적인 구성성분을 함유하지 않은 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "말단 막관통 도메인"은 연결되지 않은 말단부(예를 들어, 펩티드 또는 단백질에 연결되어 있지 않은 C-말단)을 갖는 막관통 도메인을 지칭한다. 따라서, 말단 막관통 도메인은 세포 내 신호전달 도메인과 같은 세포 내 도메인에 연결되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 말단 막관통 도메인은 세포 내 신호전달 경로(예를 들어, 신호 1 활성화 또는 신호 2 공동 자극과 같은 T 세포 신호전달 경로)에 참여하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"이란 용어는 세포 외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포를 활성화하는 활성화 신호를 전화하는 세포 내 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드 구조체를 지칭한다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 N-말단에 선택적인 선도 서열(leader sequence)을 포함한다.
본원에 개시되어 있는 정의와 본원에 참고로 포함되어 있는 인용문헌들 중 임의의 것에 제공된 정의 사이에 임의의 충돌 및 불일치가 존재하면, 본원에 개시되어 있는 정의가 우선할 것이다.
이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포 및 기타 선천적으로 유사한 림프구
γδ T 세포 및 기타 선천적으로 유사한 림프구(예를 들어, NK 세포 및 NK-유사 T 세포 및 점막-연관 불변 T(MAIT) 세포와 같은 선천성 림프계 세포)와 같은 림프구는 이들이 암세포 및 감염 세포와 같은 병원성 세포를 인식하는 이들의 선천적으로 유사한 능력을 보유하면서 이종성 표적화 구조체로 형질 도입될 수 있으므로 본원에 기술되어 있는 이종성 표적화 구조체용으로 매력적인 비히클이다. 형질 도입은 당해 기술분야에 알려져 있거나 본원에 기술되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어 전기 천공, 유전자 편집(예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR), 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN) 형질 감염), 트랜스포손 전달 등에 의해 실시될 수 있다. 뿐만 아니라, 예를 들어 γδ T 세포의 MHC 의존성 항원 인식의 결여는 이식편-대-숙주 질병 가능성을 감소시키고, 이들이 낮은 수준의 MHC를 발현하는 종양을 표적화하도록 허용한다. 마찬가지로, 예를 들어 CD28의 참여를 통한 통상적인 신호 2 공동 자극에 대한 γδ T 세포의 비의존성으로 인해 공동 자극 수용체를 위한 낮은 수준의 리간드를 발현하는 종양의 표적화가 향상된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 이들의 표면 상에서 이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 및 MAIT 세포 및 이들의 세포 집단을 제공한다. 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작된 이 같은 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 및 MAIT 세포는 이종성 구조체 상의 항원 결합 도메인을 통해 목적하는 항원을 표적화하기 위해 이용될 수 있다. γδ T 세포가 외래 병원균에 반응하는데 MHC 수용체에 의존하지 않기 때문에 이종성 표적화 구조체는 통상적인 (예를 들어, αβ) T 세포 적응성 면역요법 용법의 일부로서 사용되는 통상적인 키메라 항원 수용체(CAR) 시스템과는 대조적으로 세포 용해 또는 세포 독성을 유도하기 위해 세포 내 도메인을 필요로 하지 않는다. 대신, γδ T 세포는 고유의 표적-특이적 세포 용해를 유도하며, 이러한 반응은 이종성 구조체를 이용함으로써 표적 세포(예를 들어, 종양(예를 들어, 고형 종양))과의 접촉 시간을 개선 및 증가시킴으로써 추가로 향상될 수 있다. 이종성 구조체를 이용하여 조작된 γδ T 세포는 종양-연관 항원과 같은 표적 항원과 결합할 수 있으며, 세포 독성 및/또는 세포 용해를 유발할 수 있다. 이러한 세포 독성은 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 및/또는 DNAM1과 같은 활성화 수용체의 내생적 발현을 통해 매개될 수 있다.
이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 특징으로 할 수 있다. 줄기 도메인은 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 연결하기 위해 이종성 표적화 구조체의 일부로서 더 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되어 있는 이종성 표적화 구조체에는 세포 내 도메인(도 1)이 없으며, 또한 (예를 들어 신호 1 활성화 및/또는 신호 2 활성화(즉, 공동 자극)을 통한) TCR 신호전달을 활성화하는 능력이 없다.
일부 구현예에서, 세포 용해는 γδ T 세포의 탈과립화(예를 들어, CD107 탈과립화), γδ T 세포에 의한 그랜자임 방출, γδ T 세포에 의한 퍼포린 방출, 표적 세포 사멸, γδ T 세포의 증식 또는 γδ T 세포에 의한 사이토카인 생산을 특징으로 한다. 당해 기술분야의 숙련자라면 이들의 특성 또는 활성을 측정하는 다양한 검정이, 예를 들어 암을 치료할 때 조작된 T 세포의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일반적으로, 탈과립화는 세포 용해를 위한 전제 조건이다. 탈과립화 세포는, 예를 들어 LAMP-1(CD107로도 알려져 있는 리보솜 연관 막 단백질 1)의 표면 발현에 의해 식별될 수 있다. CD107은 표면 상에서 일시적으로 발현되며, 탈과립화 이후에 빠르게 내부화(internalization)된다. 비활성 상태에서, CD107a는 세포 용해성 과립막 내의 세포질 내에서 상주한다. 상향 조절(upregulation)은 항체-표지된 내부화된 CD107a 함유 소포의 산성화를 방지하기 위해 모네신(monensin)의 존재 하에 CD107을 염색함으로써 (예를 들어, FACS에 의해) 측정될 수 있다.
또한, 퍼포린 및 그랜자임 검정은 당해 기술분야에 알려져 있는 방법에 따라 FACS에 의해 측정될 수 있다. 세포 독성 γδ T 세포는 과립 또는 수용체 매개 기작에 의해 이들의 표적을 사멸시킨다. 세포 독성 과립은 용해성 단백질(퍼포린 및 그랜자임)을 함유하는 세포질에 미리 형성된 분비형 리소좀이다. 표적 세포의 인식 시, 용해성 단백질은 세포외유출(exocytosis)에 의해 분비된다. 따라서, 표적 세포 인식 시에 세포 내 그랜자임 및/또는 퍼포린 수준의 감소는 FACS에 의해 측정될 수 있다.
세포 살해 검정은 이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포의 효과를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 동적 표적 세포 용해 검정은 시간이 지남에 따라 다양한 효과기 대 표적 비율로 살해 비율(%)을 추적하기 위해 사용될 수 있다. 종료점 표적 세포 용해 검정(예를 들어, 루시페라아제 검정)은 다양한 효과기 대 표적 비율로 특정 종료점 시간에 살해 비율(%)을 추적하기 위해 사용될 수 있다. 면역 시냅스 형성(예를 들어, 생세포 이미지화에 의해 관찰됨)은 결합 동력학(binding kinetics), 표적 인식(예를 들어, 효과기 세포에서의 Ca 흐름), 치사 가격(lethal hit; 예를 들어 표적 세포에서의 프로피듐 아이오다이드 블러시(propidium iodide blush)에 의해 측정된 바와 같음) 또는 표적 세포 구형화(target cell rounding)를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 건강한 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합은 조작된 γδ T 세포에서 세포 용해를 실질적으로 유발하지 않는다. 일부 구현예에서, 종양 세포 또는 감염 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합은 조작된 γδ T 세포에서 세포 용해를 실질적으로 유발한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작된 세포(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)를 제공하며, 이때 조작된 세포는 항종양 특성을 나타낸다. 하나의 양태에서, 세포는 (예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기 천공 등에 의해) 이종성 표적화 구조체로 형질 감염되며, 이종성 표적화 구조체는 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)는 이종성 표적화 구조체를 암호화하는 바이러스 벡터로 형질 도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 이 같은 구현예에서, 세포는 이종성 표적화 구조체를 안정하게 발현할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)는 (예를 들어, 뉴클레오펙션, 전기 천공 등에 의해) 이종성 표적화 구조체를 암호화하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질 감염된다. 일부 구현예에서, 세포는 이종성 표적화 구조체를 일시적으로 발현할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 조작된 γδ T 세포(예를 들어, 적어도 10개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개 또는 1013개의 세포)의 세포 집단(예를 들어, 분리된 세포 집단)을 특징으로 하며, 여기서 세포 집단의 적어도 10%(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 실질적으로 모두)는 이종성 표적화 구조체를 발현하는 조작된 γδ T 세포이다.
대안적으로, 본 발명은 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포(예를 들어, 적어도 10개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개 또는 1013개의 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포)의 세포 집단(예를 들어, 분리된 세포 집단)을 특징으로 하며, 여기서 세포 집단의 적어도 10%(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 실질적으로 모두)는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작된다.
대안적으로, 본 발명은 조작된 선천성 림프계 세포(예를 들어, 적어도 10개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개 또는 1013개의 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포)의 세포 집단(예를 들어, 분리된 세포 집단)을 특징으로 하며, 여기서 세포 집단의 적어도 10%(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 실질적으로 모두)는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작된다. 대안적으로, 본 발명은 조작된 MAIT 세포(예를 들어, 적어도 10개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개 또는 1013개의 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포)의 세포 집단(예를 들어, 분리된 세포 집단)을 특징으로 하며, 여기서 세포 집단의 적어도 10%(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 실질적으로 모두)는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작된다.
이종성 표적화 구조체
다양한 유형의 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포는 조작된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포를 생산하기 위해 이종성 표적화 구조체를 포함하도록 개질될 수 있다. 이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 예를 들어, 이종성 표적화 구조체는 1개 내지 1,000개의 아미노산 잔기(예를 들어, 1개 내지 10개, 10개 내지 20개, 20개 내지 30개, 30개 내지 40개, 40개 내지 50개, 50개 내지 100개, 100개 내지 250개, 250개 내지 500개 또는 500개 내지 1,000개의 아미노산 잔기)에 의해 막관통 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 세포 외 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 줄기 도메인에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 외 항원 결합 도메인, 줄기 도메인 및 막관통 도메인은 N-말단에서 C-말단 배향 (예를 들어, N-항원 결합 도메인-줄기 도메인-막관통 도메인-C)으로 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 외 항원 결합 도메인, 줄기 도메인 및 막관통 도메인은 N-말단에서 C-말단 배향으로 직접 연결된다.
일반적으로, 본원에 개시되어 있는 이종성 표적화 구조체는 세포 내 신호전달 도메인이 없이 특정 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 기능성 세포 내 도메인 없이는 비효과적인 조작된 αβ T 세포(예를 들어, CAR T 세포)(문헌[Ghosh et al., Nat. Med., 23: 242-251, 2017]; 문헌[Whilding et al., Mol. Ther., 25: 259-273, 2017]; 및 문헌[Wilkie et al., J. Biol. Chem., 285: 25538-25544, 2010])와는 달리, γδ T 세포와 같은 선천적으로 유사한 림프구의 활성화는 기능성 세포 내 도메인이 없는 이종성 표적화 구조체에 의해 매개될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련자라면 폴리펩티드가, 예를 들어 조작된 T 세포를 직접 활성화하지 않는 막관통 도메인의 확장부로서 비기능성 세포 내 아미노산 잔기를 함유할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 양태에서 막관통 도메인은 구조적 안정성 및/또는 발현 목적을 위해 여분의 잔기를 포함할 수 있거나, 비기능성 세포 내 도메인을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, C-말단 막관통 도메인의 잔기의 50% 이하(예를 들어, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하)가 세포 내에 상주한다.
항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 표적에 특이적으로 결합하도록 조작된 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항원 결합 도메인은 다양한 구조, 예를 들어 B 세포 수용체, 항체 스캐폴드 또는 모방체(예를 들어, 어피바디, 아필린, 안티칼린, 압타머(aptamer), 아트리머, DARPin, FN3 스캐폴드, 피노머, 쿠니츠 도메인, 프로넥틴(pronectin), 오바디, 이중환 펩티드, 시스틴 매듭 등), 단일쇄 가변 단편(scFv), 단클론성 항체(mAb), 항원 결합 단편(Fab) 또는 T 세포 수용체(TCR)의 형태를 취할 수 있다(도 2a). 항원 결합 도메인은 종양-연관 항원(TAA; 예를 들어, 고형 종양 상에서 발현되는 TAA)와 같은 표적에 결합할 수 있다. TAA는, 예를 들어 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질 또는 펩티드 항원일 수 있다. 대안적으로, TAA는 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 탄수화물 또는 강글리오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, TAA는 면역 억제 항원이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 도 2b에 나타나 있는 바와 같이 리간드-특이적 수용체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 도 2c에 나타나 있는 바와 같이 수용체-특이적 리간드이다.
하나의 양태에서, 이종성 표적화 구조체의 표적 결합 일부는 scFv이다. 하나의 양태에서, 이 같은 항체 단편들이 동일한 결합 친화도를 갖는다는 점, 예를 들어 이것이 유래하는 IgG 항체와 같이 비슷한 효능으로 동일한 항원과 결합한다는 점에서 이들은 기능성이다. 대안적으로, 이들은, 예를 들어 표적 항원의 발현 밀도에 근거하여 최적의 결합 동력학(예를 들어, 친화력(avidity))을 달성하기 위해, 예를 들어 필요한 경우 향상된 결합 친화도 또는 보다 약한 결합 친화도를 위해 조작될 수 있다. 하나의 양태에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이 같은 항체 단편들이 면역 반응의 활성화, 이의 표적 항원으로부터의 신호-형질 도입 기원(origination)의 억제, 키나아제 활성의 억제 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 이들은 기능성이다.
하나의 양태에서, 이종성 표적화 구조체의 항원 결합 도메인은 쥐의 scFv 항체 단편이다. 다른 양태에서, 이종성 표적화 구조체의 항원 결합 도메인은 이것이 유래하는 scFv의 쥐 서열과 비교하여 인간화되어 있는 scFv 항체 단편이다. 마우스 scFv의 인간화는, 마우스-특이적 잔기가 조작된 T 세포 치료를 받고 있는 환자에서 인간 항-마우스 항원(HAMA) 반응을 유도할 수 있는 임상 환경을 위해 요구될 수 있다.
하나의 양태에서, 이종성 표적화 구조체의 항원 결합 도메인 일부는 서열이 포유동물 세포에서의 발현에 코돈-최적화되어 있는 이식 유전자에 의해 암호화된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 이종성 표적화 구조체 전체는 포유동물 세포에서의 발현에 코돈-최적화되어 있는 서열을 갖는 이식 유전자에 의해 암호화된다. 코돈 최적화는 암호화 DNA 내의 동의 코돈(즉, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향되어 있다는 발견을 지칭한다. 이 같은 코돈 축퇴성(codon degeneracy)으로 인해 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 둘 모두가 본원에서 그 전체가 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제5,786,464호 및 제6,114,148호에 개시되어 있는 방법을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 이종성 표적화 구조체는 표적-특이적 결합 요소인 항원 결합 도메인을 포함한다. 모이어티(moiety)의 선택은 표적 세포의 표면을 한정하는 리간드의 유형 및 개수에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정 질병 상태와 연관이 있는 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 본 발명의 이종성 표적화 구조체에서 항원 결합 도메인용 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예로는 바이러스, 박테리아, 기생충 감염뿐만 아니라 암과 연관이 있는 리간드를 들 수 있다.
하나의 양태에서, 이종성 표적화 구조체 매개 T 세포 반응은 목적하는 항원과 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 이종성 표적화 구조체 내로 조작하는 방식으로 관심 있는 항원에 유도될 수 있다. 항원 결합 도메인은 단클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및 이들의 기능성 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있으며, 이는 낙타-유래 나노바디(nanobody)의 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 가변 도메인과 같은 단일 도메인 항체, 및 재조합 피브로넥틴 도메인과 같은 항원 결합 도메인으로서 작용하도록 당해 기술분야에 알려져 있는 대안적인 스캐폴드 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부의 경우, 항원 결합 도메인이 이종성 표적화 구조체가 궁극적으로 사용될 동일한 종에서 유래하는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해 이종성 표적화 구조체의 항원 결합 도메인이 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인을 위한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익하다.
본 발명의 임의의 양태의 일부 구현예에서, 이종성 표적화 구조체는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항원 결합 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 기법에 의해 생산될 수 있으며, 이때 상기 기법으로는 CDR-이식(예를 들어, 각각이 그 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 유럽 특허 제EP 239,400호; PCT 공개공보 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호 및 제5,585,089호 참조), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(예를 들어, 각각이 그 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 유럽 특허 제EP 592,106호 및 제EP 519,596호 참조), 사슬 셔플링(chain shuffling)(예를 들어, 그 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제5,565,332호 참조), 및 예를 들어 각각이 그 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 미국 특허 출원 공개공보 제2005/0042664호, 미국 특허 출원 공개공보 제2005/0048617호, 미국 특허 제6,407,213호 및 제5,766,886호 및 국제 공개공보 제WO 93/17105호에 기술되어 있는 기법을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 종종, 골격 영역 내의 골격 잔기는 항원 결합을 변경, 예를 들어 개선하기 위해 CDR 도너 항체에서 유래한 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들의 골격 치환은, 예를 들어 특정 위치에서 특이한 골격 잔기를 식별하기 위해 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 식별하도록 CDR 및 골격 잔기의 상호작용을 모델링함으로써 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 식별된다. 예를 들어, 그 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제5,585,089호를 참조한다.
인간화 항체 또는 항체 단편은 그 내부에 잔류하는, 비인간인 공급원에서 유래한 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들의 비인간 아미노산 잔기는 전형적으로 "유입(import)" 가변 도메인으로부터 얻어지는 "유입" 잔기로서 종종 지칭된다. 본원에 제공되어 있는 바와 같이, 인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간 면역 글로불린 분자 및 골격 영역에서 유래한 하나 이상의 CDR를 포함하며, 이때 골격을 포함하는 아미노산 잔기는 전적으로 또는 주로 인간 생식계열에서 유래한 것이다. 항체 또는 항체 단편을 인간화하기 위한 다수의 기법이 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 각각이 본원에서 그 전체가 참고로 포함되어 있는 문헌[Jones et al., Nature, 1986, 321: 522-525]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 1988, 332: 323-327]; 및 문헌[Verhoeyen et al., Science, 1988, 239: 1534-1536]의 방법에 따라 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써, 즉 CDR-이식에 의해 본질적으로 실시될 수 있다. 이 같은 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편에서, 실질적으로 보다 덜 온전한 인간 가변 도메인이 비인간 종에서 유래한 상응하는 서열로 치환되어 있었다. 인간화 항체는 종종 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 골격(FR) 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위에서 유래한 잔기로 치환되어 있는 인간 항체이다.
일부 양태에서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 이종성 표적화 구조체의 일부는 표적 항원에 대한 높은 친화도 및 기타 바람직한 생물학적 특성을 보유한 상태에서 인간화된다. 본 발명의 하나의 양태에 따르면, 인간화 항체 및 항체 단편은 모 서열(parental sequence) 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화 생성물을 분석하는 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역 글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하며, 당해 기술분야의 숙련자에게 익숙한 것이다. 선택된 후보물질인 면역 글로불린 서열의 가능한 3차원 배열 구조를 예시 및 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이들의 표시물의 검사에 의해 후보자 면역 글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어 표적 항원과 결합하는 후보자 면역 글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하게 된다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 표적 항원에 대한 친화도의 증가와 같은 목적하는 항체 또는 항체 단편의 특징이 달성되도록 수혜자 서열 및 유입 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 데 관여한다.
일부의 경우, scFv는 당해 기술분야에 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, 각각이 본원에서 그 전체가 참고로 포함되어 있는 문헌[Bird et al., Science, 1988, 242: 423-426] 및 문헌[Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 5879-5883] 참조). ScFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 이용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 접히고 상호작용하는 방법에 크게 영향을 미칠 수 있다. 사실 상, 짧은 폴리펩티드 링커(예를 들어, 5개와 10개 사이의 아미노산)를 이용하면 사슬 내 접힘(intrachain folding)이 방지된다. 또한 사슬 간 접힘은 기능성 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 2개의 가변 영역을 합치기 위해 요구된다. 링커의 배향 및 크기의 실시예는, 예를 들어 본원에서 참고로 포함되어 있는 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad. Sci. USA, 1993, 90: 6444-6448], 미국 공개공보 제2005/0100543호, 제2005/0175606호, 제2007/0014794호 및 국제 특허 공개공보 제WO 2006/020258호 및 제WO 2007/024715호를 참고한다.
scFv는 이의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린과 같은 아미노산을 포함한다. 다른 구현예에서, 링커 서열은 (GGGGS)n(여기서, n은 1 이상의 양의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)임)과 같은 글리신 및 세린 반복단위 세트를 포함한다. 링커 길이의 변경에 의해 활성이 보유 또는 향상될 수 있어서, 우수한 결합 효능 및 활성을 초래한다.
본 발명의 조작된 γδ T 세포에 의한 표적 세포의 세포 용해 동력학은 부분적으로는 항원 결합 도메인의 결합 친화도에 의해 결정된다. 본원에 제공되어 있는 항원 결합 도메인들 중 임의의 것은 필요한 경우 특정 표적에 대한 결합 친화도를 향상 또는 감소시키기 위해 알려져 있는 방법에 따라 개질될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 10-4 M 내지 10-10 M(예를 들어, 표면 플라스몬 공명(예를 들어, 비아코어(BIAcore))에 의해 예를 들어 표준 생리학적 온도 및 압력을 이용하여 측정된 바와 같이 10-4 M 내지 10-5 M, 10-5 M 내지 10-6 M, 10-6 M 내지 10-7 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 예를 들어 10-5 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-5 M 내지 10-6 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-7 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-9 M 또는 10-9 M 내지 10-10 M)의 이의 항원에 대한 결합 친화도 또는 해리 상수(KD)를 갖는다.
표적 세포에 대한 조작된 γδ T 세포의 항원 결합 도메인의 결합 친화도 이 외에, 친화력 상호작용이 또한 표적 세포의 효과적인 결합 및 후속적인 용해에 역할을 한다. 친화력은 (a) 항원 결합 도메인의 결합 친화도 및 (b) T 세포와 표적 사이의 주어진 계면을 따라 있는 항원 결합 도메인과 항원 사이의 상호작용 개수에 의해 판단된다. 일부 구현예에서, 조작된 γδ T 세포는 그 표면 상에 102개 내지 106개의 항원 결합 도메인(예를 들어, 102개 내지 103개, 103개 내지 104개, 104개 내지 105개, 105개 내지 106개, 102개 내지 104개, 102개 내지 105개, 103개 내지 104개, 103개 내지 105개, 103개 내지 106개, 104개 내지 105개, 104개 내지 106개 또는 105개 내지 106개의 항원 결합 도메인)을 함유한다.
줄기 도메인
본 발명의 이종성 표적화 구조체는 막관통 도메인과 세포 외 항원 결합 도메인 사이에 위치한 줄기 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 줄기 도메인은 CD8 줄기, IgG 힌지 중쇄 불변(CH) 도메인(예를 들어, IgG1 힌지-CH2 도메인, IgG1 힌지-CH3 도메인 또는 IgG1 힌지-CH2-CH3 도메인), (G4S)3 힌지, IgG1 힌지, CD7 줄기, IgD 힌지-CH2 도메인, IgD 힌지-CH3 도메인, IgD 힌지-CH2-CH3 도메인, IgG4 힌지-CH2 도메인, IgG4 힌지-CH3 도메인, IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인 또는 FcεRI 줄기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 도메인들 중 하나 이상을 포함한다. 줄기는 세포 외 도메인과 막관통 도메인 사이에 가요성을 제공할 수 있으며, 표적 인식을 도와줄 수 있다. 당해 기술분야의 숙련자라면 줄기 도메인이 세포 외 또는 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 부가적인 아미노산, 예를 들어 줄기가 유래하는 단백질의 세포 외 또는 막관통 영역과 연관이 있는 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 세포 외 또는 막관통 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산)을 함유할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 줄기는 선택적으로 (GGGGS)n 또는 GGGGSGGGGS(서열 번호 1)와 같은 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다.
막관통 도메인
본 발명의 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 이종성 표적화 구조체는 세포 외 도메인(들)에 부착되어 있는 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 부가적인 아미노산, 예를 들어 막관통 단백질이 유래하는 단백질의 세포 외 영역과 연관이 있는 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 세포 외 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래하는 단백질의 세포 내 영역과 연관이 있는 하나 이상의 부가적인 아미노산(예를 들어, 세포 내 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 막관통 도메인은 이종성 표적화 구조체의 기타 도메인들 중 하나와 연관이 있는 도메인이다. 일부의 경우, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이 같은 도메인의 결합을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 아미노산 치환에 의해 개질될 수 있다. 따라서, 일부의 경우 막관통 도메인은 신호 1 활성화 및/또는 신호 2 활성화(공동 자극)을 실질적으로 전파하지 않는다.
대안적으로, 막관통 도메인은 기타 단백질(예를 들어, 내생적 단백질(예를 들어, 막관통 단백질과 같은 내생적 막-연관 단백질))에 결합하거나, 이의 클러스터링을 유도하거나, 기타 단백질을 활성화, 인산화 또는 탈인산화하거나, 그 외에 기타 단백질과 상호작용하는 이의 능력으로 인해 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 공동 자극 단백질과 결부하여, 신호 2 공동 자극 신호를 전파함으로써 간접적으로 세포(예를 들어, γδ T 세포)를 활성화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 내생적으로 발현된 DAP10과 결부하여 숙주 세포의 신호 2 활성화(공동 자극)를 전파할 수 있는 NKG2D의 막관통 일부에서 유래한다. 이 같은 경우, 이종성 표적화 구조체는 세포를 활성화할 수 있는 기능성 세포 내 도메인을 갖지 않는다. 예를 들어, 이종성 표적화 구조체에는 세포 내 도메인이 없을 수 있거나, 이는 신호 1 또는 신호 2 활성화를 전달하지 못하는 불활성의 세포 내 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, 내생적 공동 자극 분자를 보충하거나 이와 결부함으로써 신호 2를 전파할 수 있는 막관통 도메인은 말단 막관통 도메인일 수 있다(예를 들어, 이의 말단들 중 하나에 부착되어 있는 부가적인 도메인이 존재하지 않음).
하나의 양태에서, 막관통 도메인은 γδ T 세포 표면 상에서 다른 이종성 표적화 구조체와 헤테로 이량화 또는 호모 이량화할 수 있다. 상이한 양태에서, 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 조작된 T 세포에 존재하는 고유 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하기 위해 개질 또는 치환될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 공급원 또는 재조합 공급원 중 하나로부터 유래할 수 있다. 공급원이 천연 유래인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질에서 유래할 수 있다. 본 발명에서 특별한 용도를 갖는 막관통 도메인은 적어도 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 영역(들), 예를 들어 CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD18, CD22, CD29, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD94, CD134, CD137, CD154, CD7, CD3 제타, CD71, Fc 감마 수용체(FcγR) 또는 NKG2D를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은, 예를 들어 CD8 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD3ζ 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 말단 막관통 도메인이다(예를 들어, 이의 말단들 중 하나에 부착되어 있는 부가적인 도메인이 존재하지 않음).
일부의 경우, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질에서 유래한 힌지를 통해 이종성 표적화 구조체의 세포 외 영역, 예를 들어 이종성 표적화 구조체의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 힌지는 인간 Ig(면역 글로불린) 힌지, 예를 들어 IgG1 힌지, IgG4 힌지, IgD 힌지 또는 CD8α 힌지일 수 있다.
하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 재조합이며, 이 경우에 이는 류신 및 발린과 같은 대개 소수성인 잔기를 포함할 것이다. 하나의 양태에서, 페닐알리닌, 트립토판 및 발린의 삼중자(triplet)는 재조합 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
선택적으로, 예를 들어 2개와 10개 사이의 아미노산 길이를 갖는 짧은 폴리펩티드 링커는 이종성 표적화 구조체의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이의 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중자(doublet)는 적합한 링커의 예이다. 예를 들어, 하나의 양태에서 링커는 (GGGGS)n 또는 GGGGSGGGGS의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 포함한다.
γδ T 세포를 수확하고 확장시키는 방법
본 발명의 조작된 γδ T 세포는 임의의 적합한 자가 유래 또는 동종 이계 γδ T 세포 또는 이의 집단에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 기술되어 있는 조작된 γδ T 세포용 공급원으로 사용하기에 적합한 γδ T 세포로는 Vδ1 세포, Vδ2 세포, Vδ3 세포, Vδ5 세포 및 Vδ8 세포를 들 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 γδ T 세포의 집단은 Vδ1 세포, Vδ3 세포, Vδ5 세포 또는 Vδ8 세포의 집단에서 유래한다.
예를 들어, 본원에는 피부 또는 내장과 같은 비조혈 조직으로부터 Vδ1 세포를 분리하고 확장시키기 위한 방법이 제공된다. 예를 들어, 그 전체가 본원에서 참고로 포함되며 구체적으로는 조직으로부터 Vδ1 세포를 분리하는 방법에 대해 참고로 포함되어 있는 U.S. 2018/0312808에 기술되어 있는 바와 같이, Vδ1 세포를 인간 피부 생검으로부터 분리할 수 있다.
기타 구현예에서, 적합한 γδ T 세포는 혈액(예를 들어, 말초 혈액)에서 유래할 수 있다. 혈액으로부터 δ1 세포를 분리하고 확장시키는 방법으로는, 예를 들어 각각이 본원에서 그 전체가 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제9,499,788호 및 국제 특허 공개공보 제WO 2016/198480호에 기술되어 있는 방법을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 γδ T 세포는 종양 조직(예를 들어, 종양 침윤성 γδ T 세포)에서 유래할 수 있다. 대안적으로, 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작될 수 있는 적합한 γδ T 세포는 하기에 기술되어 있는 방법에 따라 비조혈 조직에서 유래할 수 있다.
혈액으로부터 γδ T 세포의 분리 및 확장
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 γδ T 세포는 대상체의 혈액(예를 들어, 말초 혈액)에서 유래한다. 예를 들어, 조작된 γδ T 세포는 혈액-유래 Vδ2 세포 또는 혈액-유래 Vδ1 세포에서 유래할 수 있다.
일부 구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법에 따라 대상체로부터 수득될 수 있다. PBMC는 부유화된 Vδ2 세포의 집단을 생성하기 위해 1주 내지 2주 동안 IL-2의 존재 하에서 아미노비스포스포네이트(예를 들어, 졸레드론산(zoledronic acid)), 합성 인항원(예를 들어, 브로모하이드린 파이로포스페이트; BrHPP), 2M3B1PP(즉, 2-메틸-3-부텐일-1-파이로포스페이트)의 존재 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 고정화 항-TCRγδ(예를 들어, pan TCRγδ)는, 예를 들어 대략 14일 동안 IL-2의 존재 하에 PBMC의 집단으로부터 Vδ2 세포의 우선적인 확장을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC로부터의 Vδ2 세포의 우선적인 확장은 IL-2 및 IL-4의 존재 하에 고정화 항-CD3 항체(예를 들어, OKT3)의 배양 시에 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 상술한 배양은 가용성 항-CD3, IL-2 및 IL-4에서의 계대배양 이전에 약 7일 동안 유지된다. 대안적으로, 인공 항원 제시 세포는 Vδ2 세포와 같은 γδ T 세포의 우선적인 확장을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 조사된 aAPC, IL-2 및/또는 IL-21의 존재 하에 배양된 PBMC-유래 γδ T 세포는 확장시켜 높은 비율의 Vδ2 세포, 중간 비율의 Vδ1 세포 및 일부 이중 음성 세포를 포함하는 γδ T 세포의 집단을 생성할 수 있다. 상술한 방법의 일부 구현예에서, PBMC는 (예를 들어, TCRγδ-특이적 약제를 이용한 양의 선별 또는 TCRαβ-특이적 약제의 음의 선별을 통해) 예비-부유화 또는 추후-부유화될 수 있다. Vδ2 세포와 같은 γδ T 세포를 확장시키기 위한 이 같은 방법 및 기타 적합한 방법은 그 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 문헌[Deniger et al., Frontiers in Immunology 2014, 5, 636: 1-10]에 상세하게 기술되어 있다.
일부 구현예에서, Vδ1 T 세포는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작될 수 있다. Vδ1 T 세포의 집단을 수득하는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 알메이다(Almeida) 등(그 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 문헌[Clinical Cancer Research 2016, 22, 23; 5795-5805])은 본원에 기술되어 있는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작될 수 있는 Vδ1 T 세포의 집단을 수득하는 적합한 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 PBMC는 자성 비드 분류를 이용하여 예비 부유화되며, 이는 90% 초과의 γδ T 세포를 얻을 수 있다. 이들 세포는 최대 21일 이상 동안 가스 투과성 생물 반응기 백(bioreactor bag)에서 하나 이상의 인자(예를 들어, TCR 작용제, 공동 수용체 작용제 및/또는 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-15 및/또는 IFN-γ))의 존재 하에 배양될 수 있다. Vδ1 T 세포를 수득하는 이러한 방법 및 기타 방법의 변경은 본 발명의 일부로서 적합하다. 예를 들어, 혈액-유래 Vδ1 T 세포는 대안적으로 각각이 본원에 그 전체가 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제9,499,788호 및 국제 특허 공개공보 제WO 2016/198480호뿐만 아니라 각각이 본원에 그 전체가 참고로 포함되어 있는 제WO2017197347호 및 제WO2016081518호(미국 공개공보 제20160175338호)에 예를 들어 기술되어 있는 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
비조혈 조직으로부터 비조혈 조직-상주 γδ T 세포의 분리 및 확장
하기에 기술되어 있는 바와 같이 수득된 비조혈 조직-상주 γδ T 세포는 양호한 종양 침투 및 보존 능력을 나타낼 수 있기 때문에 본원에 기술되어 있는 이종성 표적화 구조체에 적합한 비히클일 가능성이 있다. 비조혈 조직-상주 γδ T 세포를 분리하고 확장시키기 위한 보다 상세한 방법은, 예를 들어 각각이 본원에서 그 전체가 참고로 포함되어 있는 독일 출원 제1707048.3호(WO2018/202808) 및 국제 특허 공개공보 제WO 2017/072367호(미국 공개공보 제20180312808호)에서 찾아볼 수 있다.
비조혈 조직-상주 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 비-Vδ2 T 세포(예를 들어, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포))는 본 발명의 방법에 따른 조작에 적합한 세포를 수득하기 위해 환자로부터 제거될 수 있는 임의의 인간 또는 비인간 동물 비조혈 조직으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, γδ T 세포가 유래하고 확장되는 비조혈 조직은 당해 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 수득될 수 있는 피부(예를 들어, 인간 피부)이다. 일부 구현예에서, 피부는 펀치 생검에 의해 수득된다. 대안적으로, 본원에 제공되어 있는 γδ T 세포를 분리하고 확장시키는 방법은 위장관(예를 들어, 결장), 유선, 폐, 전립선, 간, 비장 및 췌장에 적용될 수 있다. 또한, γδ T 세포는 인간 암 조직, 예를 들어 유방 또는 전립선의 종양에 상주할 수 있다. 일부 구현예에서, γδ T 세포는 인간 암 조직(예를 들어, 고형 종양 조직)에서 유래할 수 있다. 기타 구현예에서, γδ T 세포는 인간 암 조직(예를 들어, 상당한 수의 종양 세포가 없는 조직)을 제외한 비조혈 조직에서 유래할 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포는 주변 또는 인접한 암 조직으로부터 분리된 피부(예를 들어, 건강한 피부의 영역에서 유래할 수 있다.
혈액 내에서 우세한 γδ T 세포는 주로 Vδ2 T 세포인 반면, 비조혈 조직 내에서 우세한 γδ T 세포는 주로 Vδ1 T 세포이어서, Vδ1 T 세포는 약 70% 내지 80%의 비조혈 조직-상주 γδ T 세포 집단을 포함한다. 그러나, 일부 Vδ2 T 세포는 또한 비조혈 조직, 예를 들어 이들이 약 10% 내지 20%의 γδ T 세포를 포함하는 내장에서 발견된다. 비조혈 조직에 상주하는 일부 γδ T 세포는 Vδ1 또는 Vδ2 TCR 중 어느 것도 발현하지 않으며, 본 발명자들은 이들은 이중 음성(DN) γδ T 세포로 명명하였다. 이들 DN γδ T 세포는 소수의 Vδ5 발현 T 세포와 함께 주로 Vδ3 발현 T 세포일 가능성이 있다. 따라서, 보통 비조혈 조직에 상주하고 본 발명의 방법에 의해 확장되는 γδ T 세포는 바람직하게는 비-Vδ2 T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포이며, 보다 소량의 DN γδ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 임상 단계는, 예를 들어 수일 또는 수주 동안의 배양 이후에 T 세포가 수득되는 조직의 비조혈 세포(예를 들어, 기질 세포, 특히 섬유아세포)로부터 비조혈 조직-상주 T 세포(예를 들어, αβ 세포, 천연 살해(NK) 세포, B 세포 및 γδ2 및 비-γδ2 T 세포를 포함할 수 있는 혼합 림프구 집단 내의 T 세포)를 신중하게 분리하는 단계이다. 이로 인해 그 다음 수일 또는 수주에 걸쳐 비조혈 조직-유래 Vδ1 T 세포 및 DN γδ T 세포의 우선적이고 빠른 확장이 가능하게 된다.
일반적으로, 비조혈 조직-상주 γδ T 세포는 기질 세포(예를 들어, 피부 섬유아세포)와의 물리적 접촉이 제거될 때 자발적으로 확장시킬 수 있다. 따라서, 상술한 스캐폴드 기반 배양 방법은 이 같은 분리를 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 그 결과 확장을 야기하도록 γδ T 세포가 탈억제된다. 따라서, 일부 구현예에서 확장 단계 동안에는 어떠한 실질적인 TCR 경로 활성화도 존재하지 않는다(예를 들어, 어떠한 외생적 TCR 경로 활성화제도 배양액에 포함되지 않음). 게다가, 본 발명은 비조혈 조직-상주 γδ T 세포를 확장시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 지지 세포, 종양 세포 및/또는 항원 제시 세포와의 접촉을 수반하지 않는다.
확장 프로토콜은 효율적인 γδ T 세포 확장을 지원하기 위해 효과적인 생물학적 인자 칵테일의 존재 하에 비조혈 조직-상주 γδ T 세포를 배양하는 단계를 수반한다. 하나의 구현예에서, γδ T 세포를 확장시키는 방법은 비조혈 조직으로부터 수득된 γδ T 세포의 집단(예를 들어, 비조혈 조직-유래 γδ T 세포의 분리된 집단, 예를 들어 본원에 기술되어 있는 방법에 따라 분리된 집단)을 제공하는 단계; 및 IL-2, IL-4, IL-15 및/또는 IL-21의 존재 하에 γδ T 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이들의 사이토카인 또는 이들의 유사체는 소정의 기간(예를 들어, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 21일, 적어도 28일 또는 그 이상, 예를 들어, 5일 내지 40일, 7일 내지 35일, 14일 내지 28일 또는 약 21일) 동안 γδ T 세포의 확장 집단을 생산하는데 효과적인 양으로 세포와 함께 배양될 수 있다.
γδ T 세포의 확장 집단
γδ T 세포의 확장 집단은 확장 단계 이전에 γδ T 세포의 분리된 집단보다 개수가 높다(예를 들어, 확장 단계 이전의 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 개수가 적어도 2배, 개수가 적어도 3배, 개수가 적어도 4배, 개수가 적어도 5배, 개수가 적어도 6배, 개수가 적어도 7배, 개수가 적어도 8배, 개수가 적어도 9배, 개수가 적어도 10배, 개수가 적어도 15배, 개수가 적어도 20배, 개수가 적어도 25배, 개수가 적어도 30배, 개수가 적어도 35배, 개수가 적어도 40배, 개수가 적어도 50배, 개수가 적어도 60배, 개수가 적어도 70배, 개수가 적어도 80배, 개수가 적어도 90배, 개수가 적어도 100배, 개수가 적어도 200배, 개수가 적어도 300배, 개수가 적어도 400배, 개수가 적어도 500배, 개수가 적어도 600배, 개수가 적어도 700배, 개수가 적어도 800배, 개수가 적어도 900배, 개수가 적어도 1,000배, 개수가 적어도 5,000배, 개수가 적어도 10,000배 또는 그 이상 높음). 따라서, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 비-Vδ2 T 세포(예를 들어, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포))의 대형 집단은 높은 속도로 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술되어 있는 확장 단계는 하기 방정식으로 나타나 있는 낮은 집단 배가 시간으로 γδ T 세포를 확장시킨다:
Figure pct00001
본원에 제공되어 있는 정보를 고려하면, 당업자라면 본 발명은 5일 미만(예를 들어, 4.5일 미만, 4.0일 미만, 3.9일 미만, 3.8일 미만, 3.7일 미만, 3.6일 미만, 3.5일 미만, 3.4일 미만, 3.3일 미만, 3.2일 미만, 3.1일 미만, 3.0일 미만, 2.9일 미만, 2.8일 미만, 2.7일 미만, 2.6일 미만, 2.5일 미만, 2.4일 미만, 2.3일 미만, 2.2일 미만, 2.1일 미만, 2.0일 미만, 46시간 미만, 42시간 미만, 38시간 미만, 35시간 미만, 32시간 미만)의 집단 배가 시간에 γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)를 확장시키는 방법을 제공한다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되어 있는 방법에 의해 분리되고 확장된 γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)는 항종양 효능에 매우 적합한 표현형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, γδ T 세포의 확장 집단은 기준 집단(예를 들어, 확장 단계 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단)보다 높은 CD27 평균 발현량을 갖는다. 일부 구현예에서, γδ T 세포의 확장 집단은 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 적어도 2배(예를 들어, 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1,000배, 적어도 5,000배, 적어도 10,000배, 적어도 20,000배 또는 그 이상)인 CD27 평균 발현량을 갖는다.
γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)의 확장 집단의 별도의 일부는 CD27을 상향 조절할 수 있는 반면, 다른 일부는 CD27낮음 또는 CD27-이다. 이 경우, 분리된 γδ T 세포의 집단 대비 확장 집단 내의 CD27+ 세포의 빈도는 더 높을 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 5% 높은 CD27+ 세포의 빈도(예를 들어, 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 높은 CD27+ 세포의 빈도)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 γδ T 세포의 집단 대비 확장 집단 내의 CD27+ 세포의 개수는 증가할 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 적어도 2배의 CD27+ 세포의 개수(예를 들어, 확장 전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 높은 CD27+ 세포의 빈도)를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되어 있는 바와 같은 확장 방법에 의해 기준 집단(예를 들어, 확장 단계 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단)에 비해 낮은 TIGIT 발현량을 갖는 γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)의 확장 집단이 수득된다. 일부 구현예에서, γδ T 세포의 확장 집단은 기준 집단(예를 들어, 확장 단계 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단)보다 낮은 평균 TIGIT 발현량을 갖는다. 일부 구현예에서, γδ T 세포의 확장 집단은 분리된 γδ T 세포의 집단보다 적어도 10% 낮은 평균 TIGIT 발현량(예를 들어, 분리된 γδ T 세포의 집단보다 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 또는 최대 100% 낮은 평균 TIGIT 발현량)을 갖는다.
γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)의 확장 집단의 별도의 일부는 TIGIT, 예를 들어 높은 수준의 TIGIT를 발현할 수 있는 반면, 다른 일부는 TIGIT낮음 또는 TIGIT-이다. 이 경우, 분리된 γδ T 세포의 집단 대비 확장 집단 내의 TIGIT+ 세포의 빈도는 보다 낮을 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 5% 낮은 TIGIT+ 세포의 빈도(예를 들어, 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 낮은 TIGIT+ 세포의 빈도)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단 대비 확장 집단 내의 TIGIT+ 세포의 개수는 보다 낮을 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단 내의 TIGIT+ 세포의 개수에 비해 적어도 10% 낮은 TIGIT+ 세포(예를 들어, 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단 내의 TIGIT+ 세포의 개수에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 낮은 TIGIT+ 세포)를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)의 확장 집단은 높은 CD27+ 세포의 개수 또는 빈도 및 낮은 TIGIT+ 세포의 빈도를 갖는다. 일부 구현예에서, γδ T 세포의 확장 집단은 기준 집단(예를 들어, 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단)에 비해 높은 CD27+TIGIT- 세포의 빈도를 갖는다. 예를 들어, γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 5% 높은 CD27+TIGIT- 세포의 빈도(예를 들어, 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 높은 CD27+TIGIT- 세포의 빈도)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 γδ T 세포의 집단 대비 확장 집단 내의 CD27+TIGIT- 세포의 개수는 증가할 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 적어도 2배의 CD27+TIGIT- 세포의 개수(예를 들어, 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 높은 CD27+TIGIT- 세포의 빈도)를 가질 수 있다.
일부의 경우, γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)의 확장 집단 내에서의 CD27+ γδ T 세포의 집단 상의 TIGIT의 평균 발현량은 기준 집단에 비해 낮다. 일부 구현예에서, CD27+ γδ T 세포의 확장 집단은 기준 집단(예를 들어, 확장 단계 이전에 분리된 CD27+ γδ T 세포의 집단)보다 낮은 평균 TIGIT 발현량을 갖는다. 일부 구현예에서, CD27+ γδ T 세포의 확장 집단은 분리된 CD27+ γδ T 세포의 집단보다 적어도 10% 낮은 평균 TIGIT 발현량(예를 들어, 분리된 CD27+ γδ T 세포의 집단보다 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 또는 최대 100% 낮은 평균 TIGIT 발현량)을 갖는다.
부가적이거나 대안적으로, γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)의 확장 집단 내에서의 TIGIT- γδ T 세포의 집단 상의 CD27의 중간 발현량은 기준 집단이 비해 높다. 예를 들어, TIGIT- γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 TIGIT- γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 5% 높은 CD27+ 세포의 빈도(예를 들어, 확장 이전에 분리된 TIGIT- γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 높은 CD27+ 세포의 빈도)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 TIGIT- γδ T 세포의 집단 대비 확장 집단 내의 CD27+ 세포의 개수는 증가할 수 있다. 예를 들어, TIGIT- γδ T 세포의 확장 집단은 확장 이전에 분리된 TIGIT- γδ T 세포의 집단에 비해 적어도 2배의 CD27+ 세포의 개수(예를 들어, 확장 이전에 분리된 TIGIT- γδ T 세포의 집단의 빈도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 최대 100% 높은 CD27+ 세포의 빈도)를 가질 수 있다.
기타 마커의 발현량의 증가 또는 감소는 부가적이거나 대안적으로 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30, CD2, NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64를 포함하는 γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 또는 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작을 위해 확장 및/또는 선택되는 γδ T 세포)의 하나 이상의 확장 집단을 특성 분석하기 위해 사용될 수 있다. 일부의 경우, γδ T 세포의 확장 집단은, 예를 들어 확장 이전에 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커들 중 하나 이상의 보다 높거나, 동일하거나 또는 보다 낮은 평균 발현량을 갖는다. 부가적이거나 대안적으로, γδ T 세포의 확장 집단은 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포의 보다 높거나, 동일하거나 또는 보다 낮은 빈도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, γδ T 세포의 확장 집단은 분리된 γδ T 세포의 집단에 비해 NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커들 중 하나 이상의 보다 높거나, 동일하거나 또는 보다 낮은 평균 발현량을 갖는다. 확장 집단은 유사하게는 분리된 γδ T 세포의 기준 집단에 비해 NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포의 보다 높거나, 동일하거나 또는 보다 낮은 빈도를 가질 수 있다.
γδ T 세포의 증식에 사용하기에 적합한 다수의 기초 배양 배지, 특히 AIM-V, 이스코브 배지(Iscoves medium) 및 RPMI-1640(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))과 같은 완전 배지가 이용 가능하다. 배지에는 혈청, 혈청 단백질 및 선별제(selective agent; 예를 들어 항생제)와 같은 기타 배지 인자를 보충할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 RPMI-1640 배지는 2 mM 글루타민, 10% FBS, 10 mM HEPES(pH 7.2), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 피루브산나트륨(1 mM; 라이프 테크놀로지스), 비필수 아미노산(예를 들어 100 μM Gly, Ala, Asn, Asp, Glu, Pro 및 Ser; 1X MEM 비필수 아미노산(라이프 테크놀로지스)) 및 10 ㎕/ℓ의 β-메르캅토에탄올을 함유한다. 편리하게, 세포를 5% CO2를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 적합한 배양 배지에서 배양한다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 교반 탱크 발효조, 공수 발효조, 롤러 병(roller bottle), 배양 백(culture bag) 또는 접시를 포함하는 임의의 적합한 시스템, 및 중공 섬유 생물 반응기와 같은 기타 생물 반응기에서 γδ T 세포를 배양할 수 있다. 이 같은 시스템의 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 림프구를 배양하기 위한 일반적인 방법 및 기법이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본원에 기술되어 있는 방법은 하나 초과의 선별 단계, 예를 들어 하나 초과의 고갈(depletion) 단계를 포함할 수 있다. 음의 선별에 의한 T 세포 집단의 부유화는, 예를 들어 음으로 선별된 세포에 특유한 표면 마커로 유도되는 항체의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음으로 선별된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커로 유도되는 단클론성 항체의 칵테일을 이용하는 음의 자성 면역 부착 또는 유세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선별이다.
V. 약학 조성물 및 치료 방법
본원에 기술되어 있는 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)(예를 들어, 이종성 표적화 구조체를 갖는 조작된 세포(예를 들어, γδ T 세포))는 약제, 예를 들어 적응성 T 세포 요법제로서 사용될 수 있다. 이 같은 사용은 본 발명의 방법에 의해 수득된 림프구(예를 들어, γδ T 세포)를 환자로 전달하는 것을 수반한다. 요법제는 자가 유래일 수 있으며, 즉 림프구(예를 들어, γδ T 세포)는 이들이 수득되는 동일한 환자로 다시 전달될 수 있거나, 요법제는 동종 이계일 수 있으며, 즉 한 사람에서 유래한 림프구(예를 들어, γδ T 세포)는 상이한 환자로 전달될 수 있다. 동종 이계 전달을 수반하는 경우, 림프구(예를 들어, γδ T 세포)에는 실질적으로 αβ T 세포가 없을 수 있다. 예를 들어, αβ T 세포에는, 예를 들어 확장 이후에 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 수단을 이용하여(예를 들어, 자성 비드를 이용하는 음의 선별에 의해) 예를 들어 림프구(예를 들어, γδ T 세포) 집단이 고갈될 수 있다.
γδ T 세포가 이종성 표적화 구조체를 발현하도록 조작되는 일부 구현예에서, γδ T 세포는 Vδ1 세포, Vδ2 세포, Vδ3 세포, Vδ5 세포 또는 Vδ8 세포이다. 치료 방법은 환자에서 유래한 내생적 γδ T 세포의 샘플을 제공하는 단계; 이종성 표적화 구조체를 발현하는 조작된 γδ T 세포의 집단(예를 들어, 이종성 표적화 구조체를 발현하는 조작된 γδ T 세포의 확장 집단)을 생성하기 위해 이종성 표적화 구조체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터의 존재 하에 샘플로부터 γδ T 세포를 배양하는 단계; 및 수혜자 환자에게 γδ T 세포의 집단을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 표적화 구조체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전기 천공 또는 당해 기술분야에 알려져 있거나 본원에 기술되어 있는 임의의 기타 적합한 형질 감염 방법을 통해 내생적 γδ T 세포로 전달된다.
치료될 환자 또는 대상체는 인간 암 환자(예를 들어, 고형 종양 치료를 받고 있는 인간 암 환자) 또는 바이러스 감염 환자(예를 들어, CMV 감염 또는 HIV 감염 환자)일 수 있다. 일부의 경우, 환자는 고형 종양 치료를 받아 왔고/왔거나, 치료를 받고 있는 중이다.
γδ T 세포가 비-MHC 제한적이므로 이들은 자신이 외래 물질로서 전달되는 숙주를 인식하지 못하며, 이는 이들이 이식편-대-숙주 질병을 야기할 가능성이 낮다는 것을 의미한다. 이는 이들이 "기성품으로" 사용될 수 있으며, 예를 들어 동종 이계 적응성 T 세포 요법을 위해 임의의 수혜자로 전달될 수 있다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 γδ T 세포는 NKG2D를 발현하고, 악성 종양과 연관성이 높은 NKG2D 리간드(예를 들어 MICA)에 반응한다. 또한, 이들은 임의의 활성화의 부재 하에 세포 독성 프로파일을 나타내며, 따라서 종양 세포를 사멸시키는데 효과적일 가능성이 있다. 예를 들어, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 수득된 조작된 γδ T 세포는 임의의 활성화의 부재 하에 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, CCL4, IL-13, 그라눌리신, 그랜자임 A 및 B 및 퍼포린 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 발현시킬 수 있다. IL-17A는 발현되지 않을 수 있다.
약학 조성물은 하나 이상의 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본원에 기술되어 있는 바와 같은 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포)를 포함할 수 있다. 이 같은 조성물은 중성 완충 식염수, 인산 완충 식염수 등과 같은 완충제; 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산(예를 들어, 글리신); 산화 방지제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 냉동 보존 용액은, 예를 들어 DMSO를 포함한다. 조성물은, 예를 들어 정맥 내 투여용으로 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 약학 조성물에는, 예를 들어 실질적으로 내독소 또는 마이코플라스마(mycoplasma)의 오염물질이 없으며, 예를 들어 검출 가능한 수준의 오염물질이 없다.
일부의 경우, 상기에 기술되어 있는 방법들 중 임의의 것에 의해 수득된 치료학적 유효량의 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)를 (예를 들어, 암의 치료, 예를 들어 고형 종양의 치료를 위해) 대상체에 치료학적 유효량으로 투여할 수 있다. 일부 경우, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 조작된 γδ T 세포, 혈액-유래 T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포, Vδ2 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 치료학적 유효량은 투여 당 10 x 1012개 미만의 세포(예를 들어, 투여 당 9 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 8 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 7 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 6 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 5 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 4 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 3 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 2 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 1 x 1012개 미만의 세포, 투여 당 9 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 8 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 7 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 6 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 5 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 4 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 3 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 2 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 1 x 1011개 미만의 세포, 투여 당 9 x 1010개 미만의 세포, 투여 당 7.5 x 1010개 미만의 세포, 투여 당 5 x 1010개 미만의 세포, 투여 당 2.5 x 1010개 미만의 세포, 투여 당 1 x 1010개 미만의 세포, 투여 당 7.5 x 109개 미만의 세포, 투여 당 5 x 109개 미만의 세포, 투여 당 2.5 x 109개 미만의 세포, 투여 당 1 x 109개 미만의 세포, 투여 당 7.5 x 108개 미만의 세포, 투여 당 5 x 108개 미만의 세포, 투여 당 2,5 x 108개 미만의 세포, 투여 당 1 x 108개 미만의 세포, 투여 당 7.5 x 107개 미만의 세포, 투여 당 5 x 107개 미만의 세포, 투여 당 2,5 x 107개 미만의 세포, 투여 당 1 x 107개 미만의 세포, 투여 당 7.5 x 106개 미만의 세포, 투여 당 5 x 106개 미만의 세포, 투여 당 2,5 x 106개 미만의 세포, 투여 당 1 x 106개 미만의 세포, 투여 당 7.5 x 105개 미만의 세포, 투여 당 5 x 105개 미만의 세포, 투여 당 2,5 x 105개 미만의 세포 또는 투여 당 1 x 105개 미만의 세포)이다.
일부 구현예에서, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 조작된 피부-유래 γδ T 세포, 조작된 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 치료학적 유효량은 치료 과정 동안에 10 x 1012개 미만의 세포(예를 들어, 치료 과정 동안에 9 x 1012개 미만의 세포, 8 x 1012개 미만의 세포, 7 x 1012개 미만의 세포, 6 x 1012개 미만의 세포, 5 x 1012개 미만의 세포, 4 x 1012개 미만의 세포, 3 x 1012개 미만의 세포, 2 x 1012개 미만의 세포, 1 x 1012개 미만의 세포, 9 x 1011개 미만의 세포, 8 x 1011개 미만의 세포, 7 x 1011개 미만의 세포, 6 x 1011개 미만의 세포, 5 x 1011개 미만의 세포, 4 x 1011개 미만의 세포, 3 x 1011개 미만의 세포, 2 x 1011개 미만의 세포, 1 x 1011개 미만의 세포, 9 x 1010개 미만의 세포, 7.5 x 1010개 미만의 세포, 5 x 1010개 미만의 세포, 2.5 x 1010개 미만의 세포, 1 x 1010개 미만의 세포, 7.5 x 109개 미만의 세포, 5 x 109개 미만의 세포, 2.5 x 109개 미만의 세포, 1 x 109개 미만의 세포, 7.5 x 108개 미만의 세포, 5 x 108개 미만의 세포, 2,5 x 108개 미만의 세포, 1 x 108개 미만의 세포, 7.5 x 107개 미만의 세포, 5 x 107개 미만의 세포, 2,5 x 107개 미만의 세포, 1 x 107개 미만의 세포, 7.5 x 106개 미만의 세포, 5 x 106개 미만의 세포, 2,5 x 106개 미만의 세포, 1 x 106개 미만의 세포, 7.5 x 105개 미만의 세포, 5 x 105개 미만의 세포, 2,5 x 105개 미만의 세포, 1 x 105개 미만의 세포)이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여량은 약 1 x 106개의 세포/㎏, 1.1 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏, 3.6 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏, 1 x 107개의 세포/㎏, 1.8 x 107개의 세포/㎏, 2 x 107개의 세포/㎏, 5 x 107개의 세포/㎏, 1 x 108개의 세포/㎏, 2 x 108개의 세포/㎏ 또는 5 x 108개의 세포/㎏을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포, 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여량은 적어도 약 1 x 106개, 1.1 x 106개, 2 x 106개, 3.6 x 106개, 5 x 106개, 1 x 107개, 1.8 x 107개, 2 x 107개, 5 x 107개, 1 x 108개, 2 x 108개 또는 5 x 108개의 세포/㎏을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포, 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여량은 최대 약 1 x 106개, 1.1 x 106개, 2 x 106개, 3.6 x 106개, 5 x 106개, 1 x 107개, 1.8 x 107개, 2 x 107개, 5 x 107개, 1 x 108개, 2 x 108개 또는 5 x 108개 세포/㎏을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포, 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여량은 약 1.1 x 106개 내지 1.8 x 107개의 세포/㎏을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포, 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여량은 약 1 x 107개, 2 x 107개, 5 x 107개, 1 x 108개, 2 x 108개, 5 x 108개, 1 x 109개, 2 x 109개 또는 5 x 109개의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포, 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여량은 적어도 약 1 x 107개, 2 x 107개, 5 x 107개, 1 x 108개, 2 x 108개, 5 x 108개, 1 x 109개, 2 x 109개 또는 5 x 109개의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포, 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여량은 최대 약 1 x 107개, 2 x 107개, 5 x 107개, 1 x 108개, 2 x 108개, 5 x 108개, 1 x 109개, 2 x 109개 또는 5 x 109개의 세포를 포함한다.
하나의 구현예에서, 대상체에게 대상체 체중(㎏) 당 104개 내지 106개의 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포, 혈액-유래 γδ T 세포, 예를 들어 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포), NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)를 투여한다. 하나의 구현예에서, 대상체는 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 집단의 초기 투여(예를 들어, 대상체의 체중(㎏) 당 104개 내지 106개의 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포, 예를 들어 대상체의 체중(㎏) 당 104개 내지 105개의 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포의 초기 투여)를 받고, 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 1회 이상(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 5회)의 후속적인 투여(예를 들어, 대상체의 체중(㎏) 당 104개 내지 106개의 조작된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포, 예를 들어 대상체의 체중(㎏) 당 104개 내지 105개의 조작된 γδ T 세포의 1회 이상의 후속적인 투여)를 받는다. 하나의 구현예에서, 1회 이상의 후속적인 투여는 이전 투여 이후 15일 미만, 예를 들어 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만 또는 2일 미만, 예를 들어 이전 투여 이후 4일 미만, 3일 미만 또는 2일 미만이 되는 날에 투여한다. 하나의 구현예에서, 대상체는 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포의 집단의 적어도 3회의 투여 과정 동안에 대상체의 체중(㎏) 당 총 약 106개의 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포를 투여 받으며, 예를 들어 대상체는 1 x 105개의 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포의 초기 투여, 3 x 105개의 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포의 2번째 투여 및 6 x 105개의 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포의 3번째 투여를 받는다. 예를 들어, 각각의 투여는 이전 투여 이후 4일 미만, 3일 미만 또는 2일 미만이 되는 날에 투여한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 부가적인 치료제가 대상체에 투여될 수 있다. 부가적인 치료제는 면역 치료제, 세포 독성제, 성장 억제제, 방사선 요법제, 혈관 신생 억제제 또는 이들의 2개 이상의 약제의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 부가적인 치료제는 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 투여와 동시, 투여 이전 또는 투여 이후에 투여될 수 있다. 부가적인 치료제는 대상체의 신체(예를 들어, 대상체 자신의 면역 시스템) 내의 표적에 대해 작용할 수 있고/있거나 전달된 γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포에 작용할 수 있는 면역 치료제일 수 있다.
조성물의 투여는 임의의 편리한 방식으로 실시될 수 있다. 본원에 기술되어 있는 조성물은 환자에게 동맥을 통해(transarterially), 피하, 피부 내, 종양 내, 노드 내(intranodally), 척수 내, 근육 내, 정맥 내 주사에 의해 또는 복강 내로 투여될 수 있으며 예를 들어, 피내 주사 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 조작된 림프구(예를 들어, γδ T 세포, NK 세포, NK-유사 T 세포, 선천성 림프계 세포 또는 MAIT 세포)의 조성물은 종양, 림프노드 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
실시예
하기 실시예에서는 이종성 표적화 구조체를 발현하기 위해 γδ T 세포를 조작하는 비제한적인 방법, 조작된 γδ T 세포의 기능성 스크리닝 및 조작된 γδ T 세포를 이용하는 치료 방법이 제공된다.
실시예 1: 이종성 표적화 구조체를 발현하는 조작된 γδ T 세포의 기능적 특성 분석
이종성 표적화 수용체를 갖는 조작된 Vδ1 T 세포를 표적 세포(예를 들어, 암세포, 예를 들어 종양 세포주의 세포)와의 공동 배양에 의해 시험관 내(in vitro)에서 기능적으로 특성 분석하였다. 조작된 Vδ1 T 세포는 3개의 대조군 세포 유형, 즉 (1) 형질 도입되지 않은 Vδ1 T 세포; (2) 이종성 GFP를 발현하는 모의-형질 도입된 Vδ1 T 세포; 및 (3) 기능성 세포 내 신호전달 도메인을 갖는, 통상적인 키메라 항원 수용체(CAR)로 형질 도입된 Vδ1 T 세포와 비교한다. 각각의 그룹을 표적 종양 세포의 적어도 2개의 그룹, 즉 (A) 명목상의 수준의 종양-연관 항원(TAA)을 발현하는 건강한 세포 그룹 및 (B) 높은 수준의 TAA를 발현하는 종양 세포 그룹과 함께 공동 배양한다. 다양한 효과기-대-표적 비율(γδ T 세포-대-표적 세포 비율)을 시험하였다. 형질 도입되지 않거나 모의-형질 도입된 Vδ1 세포를 대조군으로 사용하여 이종성 표적화 수용체에 의해 부여되는 효과를 확인하고, CAR T 세포를 대조군으로 사용하여 신호 1 및/또는 신호 2 자극을 전파하도록 구성된 기능성 세포 내 도메인의 결여 효과를 확인한다. 하기 검정을 실시한다:
1. 표적 세포 대비 활성화를 나타내는, 조작된 γδ T 세포 증식에 미치는 조작된 γδ T 세포와 표적 세포 사이의 상호작용의 효과를 정량화하기 위해 표준 CFSE 희석 프로토콜에 따라 증식 검정을 실시한다. 이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포는 건강한 세포에 비해 암세포에 반응하여 보다 높은 정도로 증식한다.
2. 탈과립화 시에 γδ T 세포의 표면 상에서 일시적으로 발현되는 리소좀-연관 막 단백질 1(LAMP-1; 즉, CD107)의 발현을 정량화함으로써 CD107 탈과립화 검정을 실시한다. 다양한 시점에 세포를 염색하여 탈과립화의 동력학을 모니터링한다. 이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포는 우선적으로 건강한 세포에 비해 암세포에 반응하여 탈과립화를 나타낸다.
3. FACS를 이용하여 퍼포린 및 그랜자임에 대해 염색함으로써 퍼포린/그랜자임 검정을 실시한다. 이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포는 우선적으로 건강한 세포에 비해 암세포에 반응하여 퍼포린 및/또는 그랜자임을 발현한다.
4. 표적 세포 용해(즉, 세포 용해) 정도를 정량화하기 위해 세포 용해 검정을 실시한다. 인큐사이트(Incucyte) 또는 루시페라아제 검정에 의해 세포 용해의 동력학을 시간의 경과에 따른 사멸 비율(%)로서 측정하고, 루시페라아제 검정을 이용하여 주어진 시점에서의 사멸 비율(%)로서 종료점 세포 용해를 측정한다. 이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포는 우선적으로 건강한 세포에 비해 암세포를 용해시킨다.
5. 생세포 이미지화에 의해 면역 시냅스 형성을 모니터링한다. γδ T 세포와 표적 세포 사이의 면역 시냅스의 관찰을 통해 결합 동력학을 모니터링한다. 또한, γδ T 세포에서의 칼슘 흐름(인식을 나타냄) 및 표적 세포에서의 PI 블러시(치사 가격을 확인함)를 관찰한다. 또한, 표적 세포 구형화를 관찰한다. 결합 동력학 및 칼슘 흐름은 이종성 표적화 구조체를 발현하는 γδ T 세포를 암세포와 공동 배양하는 경우에 건강한 세포에 비해 상기 γδ T 세포에서 우선적으로 향상된다.
실시예 2: 이종성 표적화 구조체를 발현하는 말초 혈액-유래 조작된 γδ T 세포
통상적인 αβ T 세포와 비교하여 Vδ1 γδ T 세포의 고유 특성들 중 하나는 건강한 조직은 남겨둔 채로 악성 형질 전환된 세포를 선택적으로 사멸시키는 것이며, 이의 과정은 천연 세포 독성 수용체의 작용을 통해 매개될 수 있다. 본 결과에 따르면 종양 세포를 제거하는 Vδ1 세포의 능력이 세포 내 신호전달 도메인이 없는 이종성 표적화 구조체를 이용하여 추가로 향상될 수 있는 것으로 증명된다. 이 같은 구조체를 이용한 Vδ1 세포의 조작에 의해 여전히 건강한 조직은 남겨둔 채로 악성 형질 전환된 세포에 대한 이들의 세포의 세포 독성이 유지되거나 심지어 증가한다. 이러한 접근법에 의해 CD19 표적화 CAR 처리 이후에 통상적인 키메라 항원 수용체(CAR) 면역요법 접근법의 관찰된 종양 외 표적 효과(on-target off-tumor effect; 예를 들어, B-세포 고갈)가 극복된다.
재료 및 방법
말초 혈액 γδ T-세포 분리 및 확장
그 전체가 본원에서 참고로 포함되며 특히 혈액으로부터 Vδ1 세포를 분리하는 이의 방법에 대해 참고로 포함되어 있는 U.S. 2018/0169147에 앞서 기술한 바와 같이, 혈액-유래 Vδ1 세포를 건강한 도너의 말초 혈액으로부터 생성하였다. 간단하게 말해, MACS-고갈된 αβ T 세포를 자가 유래 혈장이 보충된 무혈청 배양 배지(CTS OpTmizer)에 재현탁하고, IL-4, IFN-γ, IL-21, IL-1β, IL-15 및 가용성 OKT3의 존재 하에 확장시켰다. 하기에 기술되어 있는 구조체를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 세포를 형질 도입하였다. 본질적으로, 전장 CAR 구조체는 종양 항원 CD19 또는 GD2를 표적화하는 scFv 결합제 영역, 막관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인(통상적인 CAR 구조체의 설계에 따름)을 포함하고 있었다. 비-신호전달 또는 "nsCAR" 구조체에는 세포 내 도메인이 없었다.
혈액으로부터 Vd1 세포를 수득하기 위한 기타 수단은 US 9499788, WO2017197347, WO2016081518과 같이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 그 전체가 본원에서 참고로 포함되며 구체적으로는 조직으로부터 Vδ1 세포를 분리하는 방법에 대해 참고로 포함되어 있는 U.S. 2018/0312808에 기술되어 있는 바와 같이, Vδ1 세포를 인간 피부 생검으로부터 분리한다. 피부-유래 Vδ1 세포를 상기와 같이 형질 도입한다.
유세포 분석
BD FACS Lyric 유세포 분석기를 이용하여 면역 표현형 검사(immunophenotyping)를 실시하였다. PerCP-Vio700 항-TCR a/b(밀테나이(Miltenyi)), APC 항-TCR g/d(밀테나이), VioBlue 항-TCR Vδ1(밀테나이), PE 항-NKp30(바이오레전드(BioLegend)), APC 항-NKp44(바이오레전드), PerCP.Cy5.5 항-NKG2D(바이오레전드)를 이용하여 세포를 표면 마커의 발현에 대해 분석하였다. 통상적인 CD19 CAR 및 비-신호전달 CD19 CAR 구조체의 발현은 FITC 항-STREP 태그 항체(엘에스바이오(LSBio))를 이용하여 검출하였다. 비-신호전달 GD2 CAR 발현은 PE 항-FC 항체(바이오레전드)를 이용하여 모니터링하였다.
세포 독성 검정
Nalm-6(ATCC, CRL-1567) 및 일차 B 세포를 CTV 또는 CFSE로 표지하고, 1:1의 효과기-대-표적 비율로 T 세포와 조합하였다. 배양액을 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 이후, SytoxAADvanced(인비트로젠(Invitrogen)) 및 절대 계수용 비드(absolute counting bead)를 웰에 첨가하고, 유세포 분석 획득을 실시하였다. 세포 독성은 하기와 같이 계산하였다:
Figure pct00002
상기 식에서, 최대 계수는 임의의 효과기 세포의 부재 시의 표적 세포의 개수이다.
생세포 이미지화
자동화 세포 계수를 가능케 하기 위해 인간 GD2를 발현하는 신경아세포종 세포주 켈리(DSMZ ACC-355)를 렌티바이러스 벡터를 암호화하는 NucLight Green(에센 바이오사이언스(Essen Bioscience))으로 안정하게 형질 도입하였다. 인큐사이트 줌 생세포 이미지화 시스템(Incucyte Zoom Live-Cell Imaging System; 에센 바이오사이언스)을 이용하여 1시간의 간격으로 60시간 동안 세포 성장을 모니터링하였다. 데이터는 0시 시점에 이미지 당 녹색 객체의 개수로 정규화된 주어진 시점에서의 이미지 당 녹색 객체의 개수 비율의 변화로서 표시되어 있었다. 각각의 측정점은 3중 웰을 나타낸다.
αβ T 세포 CAR과의 비교
상기와 같은 전장 또는 비-신호전달 CAR 구조체를 이용하여 γδ 세포를 조작하였다. 유사하게, 전장 또는 비-신호전달 CAR 구조체를 이용하여 혈액 또는 조직에서 유래한 αβ-유래 T 세포를 또한 조작한다. 각각의 집단의 종양 외 표적 세포 독성을 증명하기 위해 표적 항원을 발현하는 건강하고 악성인 세포에 대한 조작된 세포의 세포 용해성 활성을 측정하였다.
결과
전장(CAR19) 또는 비-신호전달 항-CD19 표적화 구조체를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 이용한 혈액-유래 Vδ1 세포의 형질 도입으로 인해 90% 초과의 형질 도입 효율이 얻어졌다(도 3a). CAR 분자의 표면 발현에서의 유의한 차이는 없었다. 형질 도입된 세포의 면역 표현형과 증식 능력 중 어떠한 것도 렌티바이러스 형질 도입에 의해 변경되지 않았다. 형질 도입되지 않은 Vδ1 세포(UTD) 및 형질 도입된 Vδ1 세포에 대한 FACS 분석에 따르면 중요한 천연 세포 독성 수용체(NCR) 분자의 표면 발현에서 임의의 유의한 차이가 나타나지 않았다(NKp30, NKp44 및 NKG2D; 도 3b).
Vδ1 세포는 CD19를 발현하는 급성 림프성 백혈병 세포주 NALM-6의 세포를 인식하고 사멸시켰다. Vδ1 세포 상의 전장 또는 비-신호전달 CD19 CAR의 발현으로 인해 표적 세포 사멸이 2배 증가하게 되었다(도 4a 및 도 4b; 1:1의 효과기-대-표적 비율에서 각각 도너 1 및 도너 2에 대한 사멸 비율(%)은 21.4%(UTD) 대 46%(nsCAR19) 대 58%(CAR19) 및 42.8%(UTD) 대 83%(nsCAR19) 대 88%(CAR19)임). 중요하게는, 비-신호전달 항-CD19 CAR을 발현하는 Vδ1 세포는 건강한 인간 B 세포를 사멸시키지 않았다(도 4c).
비-신호전달 CAR 접근법의 일반적인 응용 가능성을 추가로 입증하기 위해, Vδ1 세포를 GD2 항원을 발현하는 종양 세포를 향해 재유도하였다. GD2-특이적 nsCAR 분자를 이용한 혈액-유래 Vδ1 세포의 형질 도입으로 인해 FACS에 의해 측정된 54%의 형질 도입 효율이 얻어졌다(도 5a). 형질 도입되지 않은 Vδ1 세포 및 nsCAR 형질 도입된 Vδ1 세포를 1:1의 효과기-대-표적 비율로 신경아세포종 세포주(켈리)를 발현하는 GD2와 함께 공동 배양하였다. 생세포 이미지화(인큐사이트; 에센 바이오사이언스)를 이용하여 표적 세포 사멸을 측정하였다. Vδ1 세포를 발현하는 nsCAR와 함께 켈리 세포 공동 배양에 의해 형질 도입되지 않은 Vδ1 세포의 존재 하에 배양된 표적 세포와 비교하여 표적 세포의 총 개수가 40% 감소하게 되었다(도 5b).
실시예 3: 이종성 표적화 구조체를 이용하여 조작된 γδ T 세포에 의한 암의 치료
당해 기술분야에 알려져 있는 클로닝 및 PCR 방법을 이용하여 이종성 표적화 구조체를 합성한다. 종양-연관 항원(TAA)을 표적화하는 scFv를 암호화하는 단백질 단편은 줄기 도메인의 N-말단에 융합되며, 이는 CD8 막관통 도메인의 N-말단에 융합된다. 이어서, 이종성 표적화 구조체를 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝한다.
환자는 혈액 샘플을 수득하고 적혈구 세포를 고갈시키는 성분채집(leukapheresis) 절차를 겪게 된다. 표준 자성 분리 프로토콜을 이용하여 αβ T 세포를 고갈시킨다. 당해 기술분야에 알려져 있거나 본원에 기술되어 있는 임의의 적합한 γδ T 세포 확장 방법을 이용하여 γδ T 세포를 포함하는 나머지 집단을 확장시킨다. 확장 동안, 세포를 이종성 표적화 구조체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 렌티바이러스 벡터와 함께 배양하고, 역전사에 의해 폴리뉴클레오티드를 γδ T 세포의 게놈 내에 통합시킨다. 렌티바이러스 벡터로 형질 도입된 세포는 표면 상에서 이종성 표적화 구조체를 발현시킬 것이다. 이어서, 이종성 표적화 구조체를 발현하는 형질 도입된 세포를 형질 도입되지 않은 세포로부터 분리하고, 자가 유래 또는 동종 이계 요법으로서 주입용으로 수확한다.
세포를 2시간에 걸쳐 환자에게 정맥 내 투여한다. 정맥 내 투여는 12주 동안 1주 당 1회 반복하고, 암의 증상을 모니터링한다.
기타 구현예
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 독립적인 간행물 또는 특허 출원이 참고로 포함되어 있도록 구체적이고 개별적으로 나타나 있는 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로 포함되어 있다.
본 발명이 이의 특정 구현예와 관련하여 기술되어 있지만, 이는 추가의 변경이 가능하며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르는 본 발명의 임의의 변경, 사용 또는 개조를 포함하도록 의도되며, 이때 이 같은 변경, 사용 또는 개조는 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 공지 또는 통상의 실시 내에 있고, 앞서 개시된 필수 특징부에 적용될 수 있는 본 개시 내용에서 벗어난 것들을 포함하며, 특허청구범위의 범주에 따르는 것으로 이해될 것이다.
기타 구현예는 특허청구범위 내에 있으며, 특허청구범위는 하기와 같다:

Claims (45)

  1. 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 감마-델타(γδ) T 세포로서,
    이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함하며,
    여기에서 이종성 표적화 구조체에는 조작된 γδ T 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없는 것인, 조작된 γδ T 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 작동 가능하게 연결하는 줄기 도메인(stalk domain)을 더 포함하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  3. 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 γδ T 세포로서,
    이종성 표적화 구조체는 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인을 포함하며,
    여기에서 막관통 도메인은 조작된 γδ T 세포의 신호 1 활성화를 전파하지 않는 말단 막관통 도메인인 것인, 조작된 γδ T 세포.
  4. 제3항에 있어서,
    항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 작동 가능하게 연결하는 줄기 도메인을 더 포함하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  5. 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 γδ T 세포로서,
    이종성 표적화 구조체는 항원 결합 도메인, 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 줄기 도메인 및 줄기 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인으로 이루어져 있으며,
    여기에서 이종성 표적화 구조체는 조작된 γδ T 세포의 신호 1 활성화를 전파하지 않는 것인, 조작된 γδ T 세포.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 도메인은 조작된 γδ T 세포를 활성화하지 않는 것인 조작된 γδ T 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 γδ T 세포는 Vδ2-음성인 것인 조작된 γδ T 세포.
  8. 제6항에 있어서,
    Vδ2-음성 γδ T 세포는 Vδ1-양성인 것인 조작된 γδ T 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 단일쇄 가변 단편(scFv), 단클론성 항체, Fab 단편, B 세포 수용체, T 세포 수용체, 항체 스캐폴드(antibody scaffold), 수용체-특이적 리간드 또는 리간드-특이적 수용체를 포함하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  10. 제2항 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    줄기 도메인은 CD8 줄기, IgG1 힌지, IgG1 힌지-CH2 도메인, IgG1-힌지-CH3 도메인, IgG1-힌지-CH2-CH3 도메인, (G4S)3 힌지, CD7 줄기, IgD 힌지, IgD 힌지-CH2 도메인, IgD 힌지-CH2-CH3 도메인, IgD 힌지-CH3 도메인, IgG4 힌지, IgG4 힌지-CH2 도메인, IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인, IgG4 힌지-CH3 도메인 또는 FcεRI 줄기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 도메인들 중 하나 이상을 포함하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD3ζ 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD45 막관통 도메인, CD5 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, CD9 막관통 도메인, CD16 막관통 도메인, CD22 막관통 도메인, CD33 막관통 도메인, CD37 막관통 도메인, CD64 막관통 도메인, CD80 막관통 도메인, CD86 막관통 도메인, CD134 막관통 도메인, CD137 막관통 도메인, CD154 막관통 도메인, CD7 막관통 도메인, CD71 막관통 도메인, CD18 막관통 도메인, CD29 막관통 도메인, CD11a 막관통 도메인, CD11b 막관통 도메인, CD11c 막관통 도메인, CD11d 막관통 도메인, CD94 막관통 도메인, FcγR 막관통 도메인 또는 NKG2D 막관통 도메인을 포함하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    C-말단 막관통 도메인의 아미노산의 50% 이하는 세포 내에 상주(reside)하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 시에 이종성 표적화 구조체의 클러스터링(clustering)은 조작된 γδ T 세포에서 TCR 경로를 실질적으로 활성화하지 않는 것인 조작된 γδ T 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 종양-연관 항원과 결합하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    종양-연관 항원은 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질 또는 펩티드 항원인 것인 조작된 γδ T 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    종양-연관 항원은 CD19인 것인 조작된 γδ T 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    종양-연관 항원은 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 탄수화물인 것인 조작된 γδ T 세포.
  18. 제14항에 있어서,
    종양-연관 항원은 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 강글리오시드인 것인 조작된 γδ T 세포.
  19. 제18항에 있어서,
    강글리오시드는 GD2인 것인 조작된 γδ T 세포.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양-연관 항원은 면역 억제 항원인 것인 조작된 γδ T 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 고형 종양 세포에 의해 발현되는 표적 항원에 결합하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    건강한 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합은 기능성 세포 내 도메인을 갖는 기준 세포(reference cell)에 비해 조작된 γδ T 세포에 의한 세포 용해를 실질적으로 덜 유발하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  23. 제22항에 있어서,
    건강한 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합은 조작된 γδ T 세포에 의한 세포 용해를 실질적으로 유발하지 않는 것인 조작된 γδ T 세포.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양 세포 또는 감염 세포 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합은 조작된 γδ T 세포에 의한 세포 용해를 실질적으로 유발하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  25. 제22항에 있어서,
    세포 용해는 조작된 γδ T 세포에 의한 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 또는 DNAM1의 내생적 발현에 의존하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    세포 용해는 CD107 탈과립화(degranulation), 그랜자임(granzyme) 방출, 퍼포린(perforin) 방출, 그라눌리신(granulysin) 방출, 표적 세포 살해, γδ T 세포의 증식 및 사이토카인 생산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 반응 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두를 특징으로 하는 것인 조작된 γδ T 세포.
  27. 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포로서,
    이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함하며,
    여기에서 이종성 표적화 구조체는 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없는 것인, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포.
  28. 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 선천성(innate) 림프계 세포로서,
    이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함하며,
    여기에서 이종성 표적화 구조체는 조작된 선천성 림프계 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없는 것인, 조작된 선천성 림프계 세포.
  29. 이종성 표적화 구조체를 포함하는 조작된 점막-연관 불변 T(MAIT) 세포로서,
    이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함하며,
    여기에서 이종성 표적화 구조체는 조작된 점막-연관 불변 T 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없는 것인, 조작된 점막-연관 불변 T(MAIT) 세포.
  30. 분리된 세포 집단으로서,
    제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 적어도 10개의 조작된 γδ T 세포, 제27항에 따른 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 제28항에 따른 조작된 선천성 림프계 세포 또는 제29항에 따른 조작된 MAIT 세포를 포함하는 것인, 분리된 세포 집단.
  31. 제30항에 있어서,
    조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포 또는 조작된 MAIT 세포는 분리된 세포 집단에서 총 세포 수의 2% 초과에 해당하는 것인 분리된 세포 집단.
  32. 분리된 세포 집단으로서,
    집단은 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조작된 γδ T 세포의 집단, 제27항에 따른 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포의 집단, 제28항에 따른 조작된 선천성 림프계 세포의 집단 또는 제29항에 따른 조작된 MAIT 세포의 집단을 포함하며,
    여기에서 집단은 분리된 세포 집단에서 총 세포 수의 2% 초과에 해당하는 것인, 분리된 세포 집단.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 적어도 10개의 조작된 γδ T 세포, 및/또는 제27항에 따른 적어도 10개의 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 및/또는 제28항에 따른 적어도 10개의 조작된 선천성 림프계 세포, 및/또는 제29항에 따른 적어도 10개의 조작된 MAIT 세포를 포함하는 것인 분리된 세포 집단.
  34. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포로서,
    폴리뉴클레오티드는 이종성 표적화 구조체를 암호화하며,
    여기에서 이종성 표적화 구조체는 세포 외 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되어 있는 막관통 도메인을 포함하고, 이종성 표적화 구조체에는 조작된 γδ T 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 도메인이 없는 것인, γδ T 세포.
  35. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포로서,
    폴리뉴클레오티드는 표적화 구조체를 암호화하며,
    여기에서 이종성 표적화 구조체는 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 조작된 γδ T 세포의 신호 1 활성화에 참여하지 않는 말단 막관통 도메인인 것인, γδ T 세포.
  36. 적응성 T 세포 요법(adoptive T cell therapy)에 의해 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조작된 γδ T 세포, 제27항에 따른 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 제28항에 따른 조작된 선천성 림프계 세포, 제29항에 따른 조작된 MAIT 세포, 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 분리된 세포 집단, 또는 제34항 또는 제35항에 따른 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 조작된 γδ T 세포, 제25항에 따른 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 제26항에 따른 조작된 선천성 림프계 세포, 제27항에 따른 조작된 MAIT 세포, 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 분리된 세포 집단, 또는 제32항 또는 제33항에 따른 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것인, 조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포, 조작된 MAIT 세포, 분리된 세포 집단 또는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 것인 조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포, 조작된 MAIT 세포, 분리된 세포 집단 또는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 대상체는 인간 암 환자인 것인 조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포, 조작된 MAIT 세포, 분리된 세포 집단 또는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 인간 암 환자는 고형 종양 치료를 받고 있는 것인 조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포, 조작된 MAIT 세포, 분리된 세포 집단 또는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포.
  40. 제37항에 있어서,
    상기 인간은 바이러스 감염 치료를 받고 있는 인간 환자인 것인 조작된 γδ T 세포, 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 조작된 선천성 림프계 세포, 조작된 MAIT 세포, 분리된 세포 집단 또는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포.
  41. 적응성 T 세포 요법에 의해 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조작된 γδ T 세포, 제27항에 따른 조작된 NK 세포 또는 NK-유사 T 세포, 제28항에 따른 조작된 선천성 림프계 세포, 제29항에 따른 조작된 MAIT 세포, 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 분리된 세포 집단 또는 제34항 또는 제35항에 따른 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 γδ T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 인간은 인간 암 환자인 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 인간 암 환자는 고형 종양 치료를 받고 있는 것인 방법.
  45. 제42항에 있어서,
    상기 인간은 바이러스 감염 치료를 받고 있는 인간 환자인 것인 방법.
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