CN115381965B - 一种γδT细胞功能化的磁性微球、制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种γδT细胞功能化的磁性微球、制备方法及其用途，所述磁性微球由中空的多孔二氧化硅微球中，磁性物质原位沉积在微球内部，微球表面经过聚多巴胺改性后，粘附γδT细胞，得到γδT细胞功能化的磁性微球。本发明γδT细胞功能化的磁性微球能够通过靶点作用，以及磁性物质的加热作用，特异性高效杀伤肿瘤细胞，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδT细胞，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来巨大的便利。

Description

一种γδT细胞功能化的磁性微球、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种γδT细胞功能化的磁性微球、制备方法及其用途。
背景技术
γδT细胞是免疫系统的天然监视细胞，在人体中不断巡逻，识别和靶向肿瘤细胞。γδT细胞还发挥着桥接先天免疫系统和适应性免疫系统的作用，在癌症治疗中，靶向这类细胞蕴含着巨大的潜力。γδT细胞具有先天性和适应性(双重特异性)免疫系统的特性，能够作为这两个关键系统之间的功能桥梁来影响肿瘤杀伤。因此，γδT细胞不仅能够被激活以立即有效地杀死肿瘤细胞，而且它们还具有促进级联反应的潜力，通过细胞因子释放和抗原呈递触发先天性和适应性免疫细胞，产生免疫记忆，诱导有效且持久的抗肿瘤反应。
众所周知，呈纳米颗粒形式即具有范围从几纳米到几十纳米的尺寸的磁铁矿，如果被浸没在无线电波范围内的可变磁场中，与电磁场相互作用，且然后向其周围的事物释放热能，因此产生所谓的过热作用或磁过热疗法。
在肿瘤学中，开发过热疗法以改进化学疗法或放射疗法的功效；事实上，将实体瘤的温度升高在41℃和45℃之间诱导了肿瘤细胞的凋亡；通常，这借助于用达到适当温度并且在受到肿瘤块影响的部位附近循环的液体洗涤来应用。就像天线直接插入到肿瘤块中，产生微波，并且因此与水的偶极分子相互作用，产生过热。
这些治疗通常是极具侵入性的并且具有差的功效(在第一种情况下)，并且在第二种情况下没有避免可能的负面作用诸如转移的风险、组织坏死等。使用到达紧邻肿瘤组织处或优选地渗透进入癌细胞的磁性纳米颗粒，克服以上问题并且实现高效的过热作用是可能的，所述过热作用以细胞水平被定位。
将微小结构特定地递送到实体瘤的肿瘤细胞中、或病理组织上或诸如阿尔茨海默病的淀粉样斑块的部位上、或多发性硬化的受损组织上，以有效的方式并且无副作用地传递多个配合的治疗诸如过热疗法和药理学治疗因此是可能的。
在文献中，存在杂化的无机聚合物或蛋白纳米颗粒的许多实例，所述杂化的无机聚合物或蛋白纳米颗粒包含生物相容的纳米颗粒磁铁矿核心以及为聚合物或蛋白的包衣，所述包衣可能装载有药物并且在表面上用合适的靶向剂功能化。这些纳米颗粒是潜在的治疗诊断剂，其中在电磁EM场的作用下产生热的能力(过热作用)、药物递送(DD)的可能性以及在其与成像技术(MRI)作用期间被识别出的能力被协同地组合。
国际专利申请WO 2004/071386描述了由单层或双层脂质体微胶囊组成的化合物，其含有磁性纳米颗粒和生物活性分子，具有到达并治疗肝脏肿瘤的主要目标。
在欧洲专利EP 1 979 365中，申请人已描述了由用双功能分子功能化的纳米级磁性颗粒组成的构建体，其中所述分子的一端与磁性颗粒的表面结合，而另一端是游离的并且因此能够与用于在制药和诊断领域中使用的复合单元诸如生物聚合物、环糊精、抗体和药物反应，允许获得纳米颗粒/粘合剂复合物，其中存在纳米颗粒的完全且紧实的包衣而不显著改变依赖于其的特性(例如光学或磁性特性)。
随后的专利EP 2 117 600描述了构建体，其中功能化的颗粒与在以上专利EP1979 365中描述的那些类似，用聚合物包覆，其中具有药理特性的分子可能已被分散。
欧洲专利申请2 512 992还描述了多元醇合成方法，其允许容易地获得具有均匀且受控制的尺寸的磁铁矿纳米颗粒(其因此具有高的过热疗法功效)。
因此，在文献中已经提出许多解决方案用于解决在体内选择性地指导颗粒的问题，所述颗粒能够通过单独地或与传统药物联合地应用过热疗法而执行治疗作用；但是，已知的产品由于多种尚未克服的问题而未完全满足用纳米结构实现肿瘤和其他疾病的有效治疗的应用需求。
免疫系统内的T淋巴细胞是抗肿瘤应答的主要角色。T淋巴细胞由于它们的被称为TCR的特异性受体而能够选择性地识别肿瘤细胞。只有抗原通过由单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)、小神经胶质细胞或还有B淋巴细胞代表的细胞来呈递时，才可以发生T淋巴细胞通过各自的肿瘤抗原肽的活化。
将T淋巴细胞与磁性微球结合，将为肿瘤治疗带来新的机遇。
发明内容
本发明的目的在于提出一种γδT细胞功能化的磁性微球、制备方法及其用途，能够通过γδT细胞的靶点作用，以及磁性物质的加热作用，特异性高效杀伤肿瘤细胞，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδT细胞，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来巨大的便利。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种γδT细胞功能化的磁性微球的制备方法，所述磁性微球由中空的多孔二氧化硅微球中，磁性物质原位沉积在微球内部，微球表面经过聚多巴胺改性后，粘附γδT细胞，得到γδT细胞功能化的磁性微球。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.二氧化硅微球的制备：将正硅酸烷基酯溶于有机溶剂中，加入含有致孔剂的水中，搅拌混合后，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加氨水，加热搅拌反应，过滤，洗涤，干燥，得到二氧化硅微球；
S2.磁性微球的制备：将步骤S1制得的二氧化硅微球分散在水中，加入氯化亚铁溶解，搅拌混合均匀后，滴加氨水，加热超声使其充分反应，过滤，洗涤，干燥，得到磁性微球；
S3.聚多巴胺改性磁性微球的制备：将步骤S2制得的磁性微球分散在水中，加入多巴胺盐酸盐和催化剂溶液，加热反应，过滤，洗涤，煅烧，得到聚多巴胺改性磁性微球；
S4.γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，离心，取细胞沉淀，加入培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入培养基，经过细胞因子的诱导培养扩增，混匀后离心，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞；
外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞称为外周血干细胞。正常人外周血中一般看不见幼稚的干细胞的，只存在有极少量的造血干细胞，其含量为0.01％左右。
密度梯度区带离心法(简称区带离心法)，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。具有分离效果好，适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性等优点。
S5.γδT细胞功能化的磁性微球的制备：将步骤S4制得的γδT细胞和步骤S3制得的聚多巴胺改性磁性微球均加入生理盐水中，搅拌混合反应，过滤，洗涤，得到γδT细胞功能化的磁性微球。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述正硅酸烷基酯为正硅酸乙酯和/或正硅酸甲酯；所述有机溶剂为酯类有机溶剂，选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯中的至少一种；所述SPG膜的孔隙为50-100μm；所述致孔剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚和聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中的至少一种；所述氨水浓度为25-35wt％；所述正硅酸烷基酯、致孔剂、氨水的质量比为100：(2-5)：(12-15)；所述加热温度为50-70℃，时间为3-5h。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述氨水浓度为25-35wt％；所述二氧化硅微球、氯化亚铁、氨水的质量比为100：(25-40)：(12-17)；所述加热至温度为60-90℃，超声功率为1000-1500W，反应时间为1-2h。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述磁性微球、多巴胺盐酸盐和催化剂溶液的质量比为100：(30-45)：(2-5)；所述催化剂溶液为含有0.01-0.05mol/L CoCl2，pH值为5.5-6的Tris-HCl溶液，所述加热温度为35-45℃，反应时间为2-4h；所述煅烧温度为300-500℃，时间为1-3h。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述离心转速为3000-4000r/min，时间为10-20min；所述培养基为含有1-3mM的谷氨酰胺的1640培养基；所述细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为(1-2)：1；所述细胞沉淀和培养基的质量比为1：(1-2)；所述单个核细胞和培养基的质量比为(1-3)：100。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述γδT细胞和聚多巴胺改性磁性微球的质量比为(1-3)：10；所述反应时间为1-2h。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的γδT细胞功能化的磁性微球。
本发明进一步保护一种上述γδT细胞功能化的磁性微球用于制备用于诊断和治疗癌症、退行性疾病、脑部疾病、心血管疾病、传染病、移植相关疾病、自体免疫性疾病，或用于治疗肿瘤、脑部疾病、心血管疾病、退行性疾病、传染病、移植相关疾病、肝硬化和特征在于纤维发生的其他疾病、特征在于复发性胎儿丢失的疾病、子宫内胎儿死亡、新生儿疾病、先天性和获得性凝血功能障碍、遗传疾病、自体免疫性疾病，或用于疼痛缓解的药物的用途。
本发明进一步保护一种上述γδT细胞功能化的磁性微球用于制备用于诊断和治疗肿瘤及其并发症相关疾病的药物的用途。
本发明具有如下有益效果：
在磁性颗粒中，磁铁矿的效果最佳，本发明制得的γδT细胞功能化的磁性微球在致孔剂的作用下，表面形成大量的孔，亚铁离子通过孔道进入微球内，在微球内原位沉积了氧铁矿(四氧化三铁，由亚铁离子在碱性条件下反应生成氢氧化亚铁，加热氧化生成氢氧化铁和氢氧化亚铁的复合物，煅烧后生成四氧化三铁)，通过施加红外线激光辐射诸如通过CO2激光器产生的红外线激光辐射，增强由磁铁矿的簇结构赋予的过热作用，从而提高微球表面温度，起到一定的治疗作用。
同时，磁性微球表面经过聚多巴胺改性，聚多巴胺富含羟基和氨基，具有极好的粘性，能与γδT细胞表面的磷脂分子形成氢键，从而将γδT细胞稳定的固定在磁性微球表面，能够通过γδT细胞的靶点作用，以及磁性物质的加热作用，特异性高效杀伤肿瘤细胞，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδT细胞，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来巨大的便利。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制得的γδT细胞功能化的磁性微球的显微照片。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
提供一种γδT细胞功能化的磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
S1.二氧化硅微球的制备：将100g正硅酸烷基酯溶于有机溶剂中，加入2g含有致孔剂的水中，搅拌混合后，用孔隙为50μm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加12g 25wt％的氨水，加热至50℃，搅拌反应3h，过滤，洗涤，干燥，得到二氧化硅微球；
S2.磁性微球的制备：将100g步骤S1制得的二氧化硅微球分散在水中，加入25g氯化亚铁溶解，搅拌混合均匀后，滴加12g 25wt％的氨水，加热至60℃，1000W超声，反应1-2h，过滤，洗涤，干燥，得到磁性微球；
S3.聚多巴胺改性磁性微球的制备：将100g步骤S2制得的磁性微球分散在水中，加入多30g巴胺盐酸盐和2g催化剂溶液，所述催化剂溶液为含有0.01mol/L CoCl2，pH值为5.5的Tris-HCl溶液，加热至35℃，反应2h，过滤，洗涤，300℃煅烧1h，得到聚多巴胺改性磁性微球；
S4.γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，3000r/min离心10min，取细胞沉淀，加入含有1mM的谷氨酰胺的1640培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为1：1，细胞沉淀和培养基的质量比为1：1，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入含有1mM的谷氨酰胺的1640培养基，单个核细胞和培养基的质量比为1：100，经过细胞因子的诱导培养扩增，混匀后离心，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞；
S5.γδT细胞功能化的磁性微球的制备：将10g步骤S4制得的γδT细胞和100g步骤S3制得的聚多巴胺改性磁性微球均加入生理盐水中，搅拌混合反应1h，过滤，洗涤，得到γδT细胞功能化的磁性微球。图1为制得的γδT细胞功能化的磁性微球的显微照片，放大倍数为80×10倍。
实施例2
提供一种γδT细胞功能化的磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
S1.二氧化硅微球的制备：将100g正硅酸烷基酯溶于有机溶剂中，加入5g含有致孔剂的水中，搅拌混合后，用孔隙为100μm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加15g35wt％的氨水，加热至70℃，搅拌反应5h，过滤，洗涤，干燥，得到二氧化硅微球；
S2.磁性微球的制备：将100g步骤S1制得的二氧化硅微球分散在水中，加入40g氯化亚铁溶解，搅拌混合均匀后，滴加17g 35wt％的氨水，加热至90℃，1500W超声，反应2h，过滤，洗涤，干燥，得到磁性微球；
S3.聚多巴胺改性磁性微球的制备：将100g步骤S2制得的磁性微球分散在水中，加入多45g巴胺盐酸盐和5g催化剂溶液，所述催化剂溶液为含有0.05mol/L CoCl2，pH值为6的Tris-HCl溶液，加热至45℃，反应4h，过滤，洗涤，500℃煅烧3h，得到聚多巴胺改性磁性微球；
S4.γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，4000r/min离心20min，取细胞沉淀，加入含有3mM的谷氨酰胺的1640培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为2：1，细胞沉淀和培养基的质量比为1：2，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入含有3mM的谷氨酰胺的1640培养基，单个核细胞和培养基的质量比为3:100，混匀后离心，经过细胞因子的诱导培养扩增，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞；
S5.γδT细胞功能化的磁性微球的制备：将30g步骤S4制得的γδT细胞和100g步骤S3制得的聚多巴胺改性磁性微球均加入生理盐水中，搅拌混合反应2h，过滤，洗涤，得到γδT细胞功能化的磁性微球。
实施例3
提供一种γδT细胞功能化的磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
S1.二氧化硅微球的制备：将100g正硅酸烷基酯溶于有机溶剂中，加入3.5g含有致孔剂的水中，搅拌混合后，用孔隙为70μm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加13.5g30wt％的氨水，加热至60℃，搅拌反应4h，过滤，洗涤，干燥，得到二氧化硅微球；
S2.磁性微球的制备：将100g步骤S1制得的二氧化硅微球分散在水中，加入32g氯化亚铁溶解，搅拌混合均匀后，滴加15g 30wt％的氨水，加热至75℃，1250W超声，反应1.5h，过滤，洗涤，干燥，得到磁性微球；
S3.聚多巴胺改性磁性微球的制备：将100g步骤S2制得的磁性微球分散在水中，加入多37g巴胺盐酸盐和3.5g催化剂溶液，所述催化剂溶液为含有0.03mol/L CoCl2，pH值为5.7的Tris-HCl溶液，加热至40℃，反应3h，过滤，洗涤，400℃煅烧2h，得到聚多巴胺改性磁性微球；
S4.γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，3500r/min离心15min，取细胞沉淀，加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为1.5：1，细胞沉淀和培养基的质量比为1：1.5，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基，单个核细胞和培养基的质量比为2:100，混匀后离心，经过细胞因子的诱导培养扩增，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞；
S5.γδT细胞功能化的磁性微球的制备：将20g步骤S4制得的γδT细胞和100g步骤S3制得的聚多巴胺改性磁性微球均加入生理盐水中，搅拌混合反应1.5h，过滤，洗涤，得到γδT细胞功能化的磁性微球。
对比例1
与实施例3相比，未进行步骤S3，其他条件均不改变。
包括以下步骤：
S1.二氧化硅微球的制备：将100g正硅酸烷基酯溶于有机溶剂中，加入3.5g含有致孔剂的水中，搅拌混合后，用孔隙为70μm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加13.5g30wt％的氨水，加热至60℃，搅拌反应4h，过滤，洗涤，干燥，得到二氧化硅微球；
S2.磁性微球的制备：将100g步骤S1制得的二氧化硅微球分散在水中，加入32g氯化亚铁溶解，搅拌混合均匀后，滴加15g 30wt％的氨水，加热至75℃，1250W超声，反应1.5h，过滤，洗涤，干燥，得到磁性微球；
S3.γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，3500r/min离心15min，取细胞沉淀，加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为1.5：1，细胞沉淀和培养基的质量比为1：1.5，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基，单个核细胞和培养基的质量比为2:100，混匀后离心，经过细胞因子的诱导培养扩增，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞；
S4.γδT细胞功能化的磁性微球的制备：将20g步骤S3制得的γδT细胞和100g步骤S2制得的磁性微球均加入生理盐水中，搅拌混合反应1.5h，过滤，洗涤，得到γδT细胞功能化的磁性微球。
对比例2
与实施例3相比，未进行步骤S2，其他条件均不改变
包括以下步骤：
S1.二氧化硅微球的制备：将100g正硅酸烷基酯溶于有机溶剂中，加入3.5g含有致孔剂的水中，搅拌混合后，用孔隙为70μm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加13.5g30wt％的氨水，加热至60℃，搅拌反应4h，过滤，洗涤，干燥，得到二氧化硅微球；
S2.聚多巴胺改性磁性微球的制备：将100g步骤S1制得的二氧化硅微球分散在水中，加入多37g巴胺盐酸盐和3.5g催化剂溶液，所述催化剂溶液为含有0.03mol/L CoCl2，pH值为5.7的Tris-HCl溶液，加热至40℃，反应3h，过滤，洗涤，400℃煅烧2h，得到聚多巴胺改性微球；
S3.γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，3500r/min离心15min，取细胞沉淀，加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为1.5：1，细胞沉淀和培养基的质量比为1：1.5，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基，单个核细胞和培养基的质量比为2:100，混匀后离心，经过细胞因子的诱导培养扩增，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞；
S4.γδT细胞功能化的磁性微球的制备：将20g步骤S3制得的γδT细胞和100g步骤S2制得的聚多巴胺改性微球均加入生理盐水中，搅拌混合反应1.5h，过滤，洗涤，得到γδT细胞功能化的微球。
对比例3
与实施例3相比，仅包括步骤S4制得的γδT细胞。
γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，3500r/min离心15min，取细胞沉淀，加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为1.5：1，细胞沉淀和培养基的质量比为1：1.5，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入含有2mM的谷氨酰胺的1640培养基，单个核细胞和培养基的质量比为2:100，混匀后离心，经过细胞因子的诱导培养扩增，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞。
测试例1对癌症细胞的杀瘤活性
用含10％FBS、1％双抗的DMEM高糖培养基培养乳腺癌MCF-7、肺癌A549、前列腺癌PC-3、结肠癌HT-29、肺癌HepG2，取对数生长期细胞，消化、计数后种96孔板，每孔细胞数(6-8)×103个，每组4个复孔，每孔135μL。96孔板置于培养箱常规培养24h后加入试样，设置实施例1-3组和对比例1-3组、阿霉素组，每孔加不同受试物15μL，受试物浓度为10wt％，受试物为实施例1-3和对比例1-3制得的微球或阿霉素。通过CO2激光器产生的红外线激光辐射，孵育24h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续培养4h，然后加入三联裂解液，每孔100μL，于37℃过夜后，酶标仪检测OD570，计算不同药物对不同肿瘤细胞生长的抑制率，并计算IC50，结果见表1。
表1不同细胞株在不同组中的IC50值(μg/ml)
组别 肺癌A549 乳腺癌MCF7 前列腺癌PC-3 结肠癌HT-29 肝癌HepG2
实施例1 12.2 2.4 20.4 3.1 25.4
实施例2 11.7 2.2 19.5 2.7 24.2
实施例3 11.2 1.8 19.0 2.4 23.7
对比例1 145.7 89.5 325.3 92.4 257.4
对比例2 54.6 35.7 67.5 40.2 85.6
对比例3 35.4 22.4 45.6 27.9 50.2
阿霉素 14.0 4.1 35.4 4.2 30.2
由上表可知，在CO2激光器产生的红外线激光辐射的辅助作用下，本发明实施例1-3制得的γδT细胞功能化的磁性微球具有极好的杀灭肿瘤细胞的作用，明显优于阿霉素。
对比例1中未进行步骤S3聚多巴胺改性，制得的磁性微球表面没有附着一层聚多巴胺层，无法起到很好粘附γδT细胞的效果，因此，各组IC50值明显提高。磁性微球表面经过聚多巴胺改性，聚多巴胺富含羟基和氨基，具有极好的粘性，能与γδT细胞表面的磷脂分子形成氢键，从而将γδT细胞稳定的固定在磁性微球表面，能够通过γδT细胞的靶点作用，以及磁性物质的加热作用，特异性高效杀伤肿瘤细胞，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδT细胞。
对比例2中未进行步骤S2原位生成磁性氧铁矿，制得的γδT细胞功能化的微球不具备磁性，在CO2激光器产生的红外线激光辐射作用下无法产生过热，而对肿瘤细胞的杀灭作用减弱。本发明制得的γδT细胞功能化的磁性微球在致孔剂的作用下，表面形成大量的孔，亚铁离子通过孔道进入微球内，在微球内原位沉积了氧铁矿(四氧化三铁，由亚铁离子在碱性条件下反应生成氢氧化亚铁，加热氧化生成氢氧化铁和氢氧化亚铁的复合物，煅烧后生成四氧化三铁)，通过施加红外线激光辐射诸如通过CO2激光器产生的红外线激光辐射，增强由磁铁矿的簇结构赋予的过热作用，从而提高微球表面温度，起到一定的治疗作用。
对比例3中仅包括γδT细胞，其没有氧铁矿的辅助过热作用的协助，也没有聚多巴胺层对于肿瘤细胞的粘附，减弱了对肿瘤细胞的杀灭效果。γδT细胞功能化的磁性微球不仅具有磁性氧铁矿，通过施加红外线激光辐射诸如通过CO2激光器产生的红外线激光辐射，增强由磁铁矿的簇结构赋予的过热作用，从而提高微球表面温度，起到一定的治疗作用，同时，其表面附着的一层聚多巴胺层，可以起到有效的吸附肿瘤细胞，从而提高γδT细胞与肿瘤细胞的接触，加快γδT细胞对肿瘤细胞的杀灭作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种γδT细胞功能化的磁性微球的制备方法，其特征在于，磁性物质原位沉积在中空的多孔二氧化硅微球内部，微球表面经过聚多巴胺改性后，粘附γδT细胞，得到γδT细胞功能化的磁性微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.二氧化硅微球的制备：将正硅酸烷基酯溶于有机溶剂中，加入含有致孔剂的水中，搅拌混合后，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加氨水，加热搅拌反应，过滤，洗涤，干燥，得到二氧化硅微球；
S2.磁性微球的制备：将步骤S1制得的二氧化硅微球分散在水中，加入氯化亚铁溶解，搅拌混合均匀后，滴加氨水，加热超声使其充分反应，过滤，洗涤，干燥，得到磁性微球；
S3.聚多巴胺改性磁性微球的制备：将步骤S2制得的磁性微球分散在水中，加入多巴胺盐酸盐和催化剂溶液，加热反应，过滤，洗涤，煅烧，得到聚多巴胺改性磁性微球；
S4.γδT细胞的分离和提取：将人外周血抗凝处理，离心，取细胞沉淀，加入培养基中重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液加入人淋巴细胞分离液中，离心，得到多层液体，取白膜层的单个核细胞再次加入培养基，经过多种细胞因子诱导增殖，混匀后离心，取细胞沉淀，生理盐水洗涤，得到γδT细胞；
S5.γδT细胞功能化的磁性微球的制备：将步骤S4制得的γδT细胞和步骤S3制得的聚多巴胺改性磁性微球均加入生理盐水中，搅拌混合反应，过滤，洗涤，得到γδT细胞功能化的磁性微球。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述正硅酸烷基酯为正硅酸乙酯和/或正硅酸甲酯；所述有机溶剂为酯类有机溶剂，选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯中的至少一种；所述SPG膜的孔隙为50-100μm；所述致孔剂选自聚乙二醇辛基苯基醚和聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中的至少一种；所述氨水浓度为25-35wt％；所述正硅酸烷基酯、致孔剂、氨水的质量比为100：(2-5)：(12-15)；所述加热温度为50-70℃，时间为3-5h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述氨水浓度为25-35wt％；所述二氧化硅微球、氯化亚铁、氨水的质量比为100：(25-40)：(12-17)；所述加热至温度为60-90℃，超声功率为1000-1500W，反应时间为1-2h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述磁性微球、多巴胺盐酸盐和催化剂溶液的质量比为100：(30-45)：(2-5)；所述催化剂溶液为含有0.01-0.05mol/LCoCl2，pH值为5.5-6的Tris-HCl溶液，所述加热温度为35-45℃，反应时间为2-4h；所述煅烧温度为300-500℃，时间为1-3h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中第一次所述离心转速为3000-4000r/min，时间为10-20min；两次所述的培养基均为含有1-3mM的谷氨酰胺的1640培养基；所述细胞悬液和人淋巴细胞分离液的质量比为(1-2)：1；所述细胞沉淀和培养基的质量比为1：(1-2)；所述单个核细胞和培养基的质量比为(1-3)：100。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述γδT细胞和聚多巴胺改性磁性微球的质量比为(1-3)：10；所述反应时间为1-2h。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的γδT细胞功能化的磁性微球。
9.一种如权利要求8所述γδT细胞功能化的磁性微球用于制备用于治疗癌症的药物的用途，所述癌症为肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌。
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