CN109224063A - 双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用，双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体由介孔二氧化硅、树状高分子聚合物、肽类抗癌药物、化疗药物通过物理包埋、静电吸附制备。通过十六烷基三甲基氯化铵为模板剂，三乙醇胺为pH调节剂，正硅酸乙酯为硅源，在一定的温度与时间下，合成了具有较小尺寸而较大孔径的介孔二氧化硅纳米粒。在介孔二氧化硅表面进行基团修饰，并与树状高分子聚合物组装，制备得到了双重载药的复合纳米载体。所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体可在协同高效地用于Bcl‑2靶点丰富的治疗癌症药物中应用，也可用于在制备克服耐药性癌症的治疗药物中应用。

Description

双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用
技术领域
本发明涉及双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，尤其是涉及双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备方法与应用。
背景技术
Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡途径中的一种重要的蛋白，Bcl-2家族蛋白有20多种，它们至少拥有四个Bcl-2同源结构域中的一种，目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是像Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1/Bfl-1等，而另一类具有促凋亡作用，又分为BH3-only蛋白和多结构蛋白两类，其中Bim、Bad、Bid、Puma和Noxa等属于BH3-only蛋白，而Bax和Bak属于多结构域促凋亡蛋白。Bcl-2家族蛋白通过促凋亡和抗凋亡家族成员的相互作用调控线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡"主开关"的作用。自1984年科学家们发现Bcl-2蛋白是细胞凋亡与肿瘤之间的重要诱导因子以来，后续的研究发现Bcl-2的过度表达可引起细胞凋亡异常，Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡，增强所观察细胞对大多数细胞毒素的抵抗性，并与肿瘤的发生发展密切相关(W.A.Siddiqui,et al.Arch Toxicol(2015)89:289–317)。
研究发现，抗凋亡Bcl-2家族蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)常在血液恶性肿瘤及一系列实体瘤如鼻咽癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌上存在过表达的现象(Callagy,G.M.；etal.Clin Cancer Res 2006,12,2468-75)。通常癌细胞内Bcl-2和Bcl-xL的过表达预示着对化疗药物耐受性的产生。Kang等人的研究也表明，Bcl-2蛋白家族数目的增多通常与各种癌症的化疗耐药性密切相关；联合使用抗癌化疗药物及Bcl-2蛋白靶向剂，可使疗效增加(Kang,M.H.,et al.Clin Cancer Res 2009,15,1126-32)。因此，靶向抗凋亡蛋白Bcl-2可以提高癌细胞凋亡效果，同时可克服化疗药物所带来的肿瘤多药耐药性问题。
我们团队早期发现，Nur77孤儿核受体在外界因素的刺激下能够从细胞核转位至线粒体，并与Bcl-2的N端环状结构域相互作用，引起Bcl-2构象转变，暴露出BH3区域，从而使Bcl-2从抑制细胞凋亡的作用转换为促进细胞凋亡的作用；且Nur77的LBD区域的9个氨基酸组成的小肽NuBCP-9是实现此功能的关键区域，能够有效地转换细胞内Bcl-2的抗凋亡作用为促凋亡作用，从而为临床治疗肿瘤特别是Bcl-2高度表达的恶性肿瘤提供了新的解决途径(Lin B,et al.Cell 2004,116(4):527-540；Kolluri,S.K.,et al.Cancer cell2008,14,285-98)。为此，该Bcl-2功能转换肽获得了具有独立自主知识产权的国际发明专利(授权号XS0010515)。但由于蛋白多肽类物质在体内不稳定，易被降解清除且本身不能穿透细胞膜，需依赖无选择性的细胞穿膜肽才能进入肿瘤细胞内发挥作用的弊端，使其在临床应用中受到限制。
介孔二氧化硅纳米粒子是指直径为纳米级别，并且内部具有的多孔结构的硅纳米材料。该纳米粒子以球形为主，也可以是椭圆形、短棒型或空壳结构。该纳米粒子因结构稳定，生物相容性好，并且内部具有丰富的多孔结构，因而常常被用作药物或者其它生物分子的载体应用于生物医药领域(Qianjun He,et al.Adv.Mater.2014,26,391–411)。传统方法制备的介孔二氧化硅纳米粒子尺寸通常在100nm以上，孔径在1～5nm，能够运载小分子抗肿瘤药物到达肿瘤部位，减少药物对机体的毒副作用，改善疏水药物的水溶性，便于机体对药物的吸收利用等，相关的孔径可调的介孔二氧化硅纳米粒制备方法如专利号CN 102583405B。然而，为了提高纳米载体的EPR效应，100nm以下的粒子则更有利于携带药物迅速达到肿瘤组织部位富集并滞留，进而进入肿瘤细胞内发挥作用。另外，孔径的大小决定着介孔二氧化硅所能负载的药物种类及数量，较大的孔径(>5nm)更有利于更多的药物负载量以及可以进行一些大分子药物如siRNA，DNA，多肽，蛋白等的负载。
聚酰胺-胺型树状高分子聚合物(PAMAMdendrimers)是一类人工合成的具有树形结构、高度支化、对称、呈辐射状的新型高分子聚合物，其结构由内到外可分为三个部分：初始核、内部重复亚单元和由表面基团构成的外壳。这类大分子具有良好的渗透性、稳定性和生物相容性，同时含有可用于载药的内部空腔结构，分子表面含有大量可修饰基团，是药物载体的理想选择，可作为药物、基因、疫苗的载体，并可用于药物缓释以及靶向释放，其独特的结构性质使其成为许多领域的研究热点(Hu Yang.Nanomedicine 2016,12(2):309–316.Marina Kalomiraki,et al.Int J Nanomedicine 2016；11:1–12)。
基于纳米载体的药物递送系统可提高药物稳定性、控释药物、促进药物体内吸收、改善治疗功效和降低毒副作用等优点，使之成为生物大分子类药物应用的良好传递系统。但多肽、蛋白类药物在储存、合成及载药等方面有较强严苛的条件，易被降解失活，如何设计合适的纳米复合载体系统能把小肽转运到目标位置并能保持其较强的生物活性是现代小肽转运载体研究中所面临的巨大挑战。
发明内容
本发明的目的在于针对肽类药物在储存、运输、体内循环中的不稳定、失活、难以有效穿透细胞膜的问题，以及化疗药物毒副作用大、难以在耐药性癌细胞内富集的特点，旨在提供双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备方法与应用，以望实现在癌细胞定点部位释放药物、发挥肽类药物及化疗药物对癌症，尤其是耐药性癌症的协同高效诊治作用；从而有望推动Bcl-2功能转换肽在癌症治疗中的临床应用。
所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体由介孔二氧化硅、树状高分子聚合物、肽类抗癌药物、化疗药物通过物理包埋、静电吸附等方式制备而成。
所述纳米复合载体为球形，粒径在30～100nm。
所述纳米复合载体是由介孔二氧化硅和树状高分子聚合物复合而成，其连接方式为静电吸附、共价连接。
所述介孔二氧化硅的颗粒尺寸为20～60nm，内部孔径为6～15nm，形貌为球形。
所述介孔二氧化硅的表面有可修饰的反应官能团，所述可修饰的反应官能团可为羧基。
所述树状高分子聚合物为聚酰胺-胺型树状高分子聚合物或聚赖氨酸型树状高分子聚合物，树状高分子聚合物的端基功能团可为氨基。
所述肽类抗癌药物为以Bcl-2为靶点的肽类药物，以Bcl-2为靶点的肽类药物通常为Bcl-2功能转换肽，其氨基酸序列为FSRSLHSLL(NuBCP9)或GDWIDSILAFSRSLHSLLVD(NuBCP20)。
所述化疗药物为阿霉素、紫杉醇等常见小分子抗癌药物。
所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体的制备方法包括以下步骤：
1)将十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺加入反应容器中，用水溶解；
在步骤1)中，所述十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺的质量比可为(0.4～10)︰(0.018～1.8)；所述用水溶解可采用60～120ml、80～95℃去离子水溶解并搅拌1～2h。
2)向反应体系中加入正硅酸乙酯后离心，洗涤，得含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒；
在步骤2)中，所述正硅酸乙酯的加入可为1～2ml；所述离心可继续搅拌1～2h后离心；所述洗涤可用乙醇和水分别洗涤。
3)在步骤2)所得的含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒中置于含氯化钠的甲醇溶液中，超声分散后洗涤，真空干燥，得表面基团为羟基的介孔二氧化硅纳米粒；
在步骤3)中，所述含氯化钠的甲醇溶液可按体积百分比含1％氯化钠的甲醇溶液；所述超声分散后洗涤可在旋转混匀仪上洗涤12h，重复1～6次。
4)取步骤3)中所得的表面基团为羟基的介孔二氧化硅纳米粒50～100mg超声分散于无水乙醇溶液，再油浴冷凝回流，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷200～800μl，稳定回流过夜，用乙醇洗去未反应物质，得氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；
在步骤4)中，所述油浴冷凝回流的条件可为80～90℃油浴冷凝回流4～6h。
5)取丁二酸酐于反应容器中，加入N，N-二甲基甲酰胺和超纯水混合溶液超声溶解，再加入步骤4)中所得的氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒，然后加入三乙醇胺，搅拌过夜；用去离子水洗去未反应物质，得羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；
在步骤5)中，所述丁二酸酐、N，N-二甲基甲酰胺、超纯水混合溶液、氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒和三乙醇胺的配比可为：(0.1～0.3g)︰(2～4ml)︰(5～10ml)︰(10～50mg)︰(100～300μl)，其中，丁二酸酐和氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒以质量计算，N，N-二甲基甲酰胺、超纯水混合溶液和三乙醇胺以体积计算。
6)取步骤5)中所制备得到的羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒与肽类抗癌药物(NuBCP9)混合后搅拌，洗涤得负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅纳米粒；
在步骤6)中，所述羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒的质量可为10～20mg；所述混合后搅拌的时间可为6～24h。
7)取步骤6)得到的负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅纳米粒加入第4～6代聚酰胺-胺型树状高分子聚合物(PAMAMdendrimers)，搅拌后洗涤，得负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体；
在步骤7)中，所述负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅纳米粒的质量可为10～20mg；所述搅拌的时间可为6～24h。
8)取步骤7)得到的负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体与化疗药物混合后搅拌，洗涤得同时负载肽类抗癌药物和化疗药物的双重载药介孔二氧化硅-树状高分子复合纳米载体。
在步骤8)中，所述负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体的质量可为10～20mg；所述化疗药物可采用盐酸阿霉素等；所述搅拌的时间可为6～24h。
所述肽类抗癌药物需物理包埋，装载在介孔二氧化硅的孔径内。
所述树状高分子聚合物需以静电吸附、可响应释放的共价键的形式附于介孔二氧化硅表面。
所述化疗药物需以物理包埋的方式装载在树状高分子聚合物的空腔内部。
所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体可在协同高效地用于Bcl-2靶点丰富的治疗癌症药物中应用，也可用于在制备克服耐药性癌症的治疗药物中应用。
本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒分散性好、孔径较大、生物相容性良好，可包载不同尺寸、亲疏水性的小/大分子药物；且可与树状高分子聚合物组装，双重载药，增强肿瘤细胞的穿透力；因此可作为优良的抗癌药物载体应用于生物医药领域。
本发明提供了一种尺寸在50nm以下，孔径分布在6～15nm的介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，其较小的尺寸能够顺利穿透各种肿瘤细胞以及耐药细胞，较大的孔径能够实现NuBCP-9小肽等生物大分子药物的负载；在其基础上进行了一系列的表面基团修饰，并与树状高分子聚合物进行组装，利用树状高分子聚合物内部巨大的可载药空腔的结构特点，最终制备得到了一种双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体。
本发明所制备的双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体拥有较小的尺寸，能够顺利穿透各种肿瘤细胞以及耐药细胞；内部介孔二氧化硅有较大的孔径能够实现NuBCP-9小肽等生物大分子药物的负载；表面树状高分子聚合物能够有效保护介孔二氧化硅所包载药物的稳定性，增强纳米载体的细胞穿透性，且能进行药物负载，实现复合纳米载体的双重载药功能，最终发挥其在癌症治疗应用的高效安全性应用。
本发明能同时运载NuBCP-9小肽和化疗药物，可用于Bcl-2含量丰富的恶性肿瘤治疗及多药耐药性癌症治疗，从而推动了Bcl-2靶点抗癌小肽的临床应用及肽类药物和化疗药物的联合应用，降低化疗药物的使用剂量和毒副作用，提高癌症病人治疗的顺应性。
本发明通过十六烷基三甲基氯化铵为模板剂，三乙醇胺为pH调节剂，正硅酸乙酯为硅源，在一定的温度与时间下，合成了具有较小尺寸而较大孔径的介孔二氧化硅纳米粒。在介孔二氧化硅表面进行基团修饰，并与树状高分子聚合物组装，制备得到了双重载药的复合纳米载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1)本发明提供的双重载药复合纳米载体的制备方法简单，在水相体系中，无需高温或惰性气体保护，除去模板剂的方法温和，避免使用强酸强碱，易于大规模生产，可广泛用于催化、分离与生物医药等领域，特别是应用于载药和药物控制释放领域。
2)本发明制备所得的双重载药复合纳米载体具有较小的尺寸，可在30～100nm之间进行调节，该尺寸有利于通过EPR效应快速到达肿瘤部位，适合作为纳米药物载体进行抗肿瘤治疗；
3)本发明制备所得的双重载药复合纳米载体，位于内部的介孔二氧化硅具有较大的孔径(6～15nm)，能够实现小分子药物或大分子药物如蛋白、多肽等的包载运输，确保多肽蛋白类药物体内循环的稳定性和活性；位于表面的树状高分子聚合物具有较大的内部空腔以及大量表面可修饰基团，可用于药物负载，基因传递以及靶向探针修饰等，同时也作为门控开关，实现肽类药物的缓释控释；因此，两者能共同负载不同作用机制或作用机制类似的药物进行癌症治疗，是良好的药物传递载体。
4)本发明所选取的介孔二氧化硅和树状高分子聚合物纳米材料均具有良好的生物相容性和生物安全性，部分基于此载体的产物已处于FDA批准的临床试验阶段，因此有望用两者的复合载体作为药物传递的安全载体使用。
5)本发明制备所得的双重载药复合纳米体能够包载Bcl-2转换肽NuBCP-9发挥功能，在临床肿瘤治疗特别是Bcl-2高表达的恶性肿瘤治疗及多药耐药性癌症治疗中具有极大潜力。
6)本发明提供的采用肽类药物和化疗药物联合应用治疗癌症的模式，可有助于提高癌症病人的治疗效率，降低化疗药物的毒副作用及耐受性。
附图说明
图1为实施例1所制得的介孔二氧化硅纳米粒的透射电镜图。
图2为实施例1所制得的介孔二氧化硅纳米粒的扫描电镜图。
图3为实施例1所制得的介孔二氧化硅纳米粒的氮吸附孔径分析图。
图4为实施例1所制得的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物纳米复合载体同时负载NuBCP9-FITC和DOX的荧光图。
图5为实施例1中双重载药纳米复合载体制备过程中的水合粒径分布变化图。
图6为实施例1中双重载药纳米复合载体制备过程中的表面电势分布变化图。
图7为实施例2所得的双重载药纳米复合载体在Bcl-2过表达的hela肿瘤细胞内的分布图。
图8为实施例3所得的双重载药纳米复合载体对Bcl-2过表达hela肿瘤细胞的增殖抑制研究。
图9为实施例4所得的双重载药纳米复合载体对Bcl-2过表达hela癌细胞的诱导凋亡能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：制备同时负载Bcl-2功能转换肽(NuBCP9)和化疗药物DOX的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物纳米复合载体
(1)取2g十六烷基三甲基氯化铵和0.18g三乙醇胺于反应容器中，加入80ml、95℃去离子水溶解并搅拌1h；
(2)向反应体系中缓慢滴加1.5ml正硅酸乙酯，继续搅拌2h后离心，用大量乙醇和水分别洗涤，得到含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒；
(3)取步骤(1)所得的含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒置于含1％氯化钠的甲醇溶液中，超声分散后室温于旋转混匀仪上洗涤12h，重复4次，经水洗涤后真空干燥，得到表面基团为羟基的介孔二氧化硅纳米粒；
(4)取步骤(3)中所合成的介孔二氧化硅50mg超声分散于无水乙醇溶液，置于85℃油浴冷凝回流4h，缓慢逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷200μl，稳定回流过过夜，用大量乙醇洗去未反应物质，得到氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；
(5)取丁二酸酐0.1g于反应容器中，加入N，N-二甲基甲酰胺2ml和超纯水5ml混合溶液超声溶解；取步骤(4)中所合成的氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒10mg加入上述反应体系中，然后加入三乙醇胺100μl，室温搅拌过夜；用大量去离子水洗去未反应物质，得到羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；
(6)取步骤(5)中所制备得到的羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒10mg，与有无荧光标记的NuBCP-9小肽混合后低温搅拌24h，洗涤得到包载小肽(有无荧光标记)的介孔二氧化硅纳米粒；
(7)取步骤(6)中的载药介孔二氧化硅纳米粒10mg，加入第五代PAMAMdendrimers，搅拌12h后洗涤，得到包载NuBCP-9小肽的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体；
(8)取步骤(7)中的复合纳米粒10mg，与DOX混合后搅拌24h，洗涤得到同时包载NuBCP-9小肽和DOX的双重载药复合纳米载体。
实施例1中步骤3所制备的介孔二氧化硅的透射电镜图(TEM)见图1。可见，采用温和简单的制备工艺，可合成外貌球形的介孔二氧化硅纳米粒子，且粒子直径维持在30nm左右，颗粒内部富有分支状的大孔结构。
实施例1中步骤3所制备的介孔二氧化硅的扫描电镜图(SEM)见图2。SEM分析结果进一步显示，介孔二氧化硅纳米粒子分散性好，尺寸均一，展现出较好的球形颗粒特征，颗粒尺寸大小与TEM结果接近。
实施例1中步骤3所制备的介孔二氧化硅的氮吸附孔径分析见图3。所制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子平均孔径在13nm左右，内部保持大孔径的特性。
实施例1中步骤8所最终制备得到的双重负载NuBCP-9-FITC荧光肽和DOX的纳米药物复合载体见图4。荧光成像结果显示，该双重载药的纳米复合载体溶液，可展现出两种药物NuBCP-9-FITC和DOX特有的荧光颜色，从而证实两种药物的成功负载。
实施例1中所制备的双重载药纳米药物复合体制备过程中的水合粒径分布变化图见图5。随着介孔二氧化硅纳米粒表面基团的逐步修饰，及表面树状高分子聚合物的组装，最终得到的双重载药纳米复合载体呈现出水合粒径增大的趋势，且粒径维持在176.9±2.0nm左右。而颗粒的PDI始终维持在0.1左右，呈现出良好的溶液单分散性。
实施例1中所制备的双重载药纳米药物复合体制备过程中的表面电势分布变化图见图6。随着介孔二氧化硅纳米粒表面基团由羟基，到氨基，再到羧基；其zeta电位呈现由负到正再到负的明显变化。尤其是表面树状高分子聚合物的吸附，颗粒的溶液电势从-27.8±2.5mV变为+35.3±1.01mV,从而证实无机-有机纳米复合载体的成功制备。而最终获得的双重载药复合纳米载体因保持较高的正电荷特性，故更有利于肿瘤组织及细胞膜的有力穿透和胞内药物递送。
实施例2：双重负载NuBCP9抗癌小肽和化疗药物DOX的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体入胞能力分析
将1μg/ml DOX以及其对应浓度NuBCP-9-FITC和NuBCP-9-FITC@MSNs～G5～DOX与Bcl-2稳转细胞HeLa-Bcl2共孵育10h后，用线粒体远红探针定位线粒体，用1μg/ml DAPI染料定位细胞核，进行激光共聚焦成像分析。
实施例2中所制备的双重载药纳米药物复合体对hela-Bcl2肿瘤细胞的穿透载药进入细胞内分布共聚焦图见图7。游离NuBCP-9小肽不能进入hela细胞内部，游离的DOX药物可自由穿透癌细胞，进入细胞核内；但在复合纳米载体的运输下，NuBCP9小肽和DOX均可进入细胞内部，并到达各自的位置，使小肽结合到达线粒体上，DOX释放入核，从而有利于两种药物的功能发挥。
实施例3：双重负载NuBCP9抗癌小肽和化疗药物DOX的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体抑制癌细胞增殖的能力分析
分别配制DOX浓度为0.1，0.5，1，2，5，10μg/ml或相对应NuBCP-9浓度的含NuBCP-9，DOX，N9+DOX,N9@M～G5,N9@M～G5～DOX培养基，与HeLa-Bcl2细胞共培养48h后用MTT检测细胞活力，得到不同组别药物的细胞毒性。
实施例3中所制备的双重载药纳米复合载体对hela-Bcl2肿瘤细胞的细胞毒性实验研究见图8。因游离小肽本身不能进入细胞内部，故对肿瘤细胞无杀伤作用；但在复合纳米载体的携带下，N9可以入胞，并发挥抑制癌细胞生长的功能，在对应5μg/ml的剂量下，癌细胞死亡率在70％左右。而DOX和DOX及N9联用组有相似的杀伤癌细胞的作用，呈现浓度依赖性，2μg/ml的剂量可使hela-Bcl2细胞死亡率在90％左右。与此对比，双重载药组N9@M～G～DOX表现出相对于游离药物组及DOX和N9合用组都更好的细胞杀伤效果，在1μg/ml的剂量下，杀伤癌细胞的抑制率可达到100％。
实施例4：双重负载NuBCP9抗癌小肽和化疗药物DOX的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体诱导癌细胞凋亡的能力分析
配制1μg/ml DOX及对应浓度的NuBCP-9,N9+DOX,N9@M～G5,N9@M～G5～DOX的含药培养基，与HeLa-Bcl2细胞共培养48h后，进行Annexin V-FITC/SYTOX-Blue染色，流式分析不同药物组诱导癌细胞凋亡的能力。
实施例4中所制备的双重载药纳米药物复合体对肿瘤细胞的诱导凋亡能力分析见图9。Annexin V-FITC/SYTOX-Blue染色发现，游离的DOX能够使将近50％的细胞发生凋亡，而游离小肽因不能进入细胞，对细胞凋亡无影响，两者合用与游离DOX组结果相近。但当纳米复合载体同时负载DOX和N9进入细胞后，会诱导将近80％的癌细胞发生了早期或晚期凋亡，该结果进一步表明了双重载药纳米复合载体抗癌效果显著，能更好地诱导肿瘤细胞凋亡。
本发明所述药物包括大分子肽类抗癌药物及小分子化疗药物，特别涉及以Bcl-2为靶点的肽类药物。而纳米复合载体则是由大孔径的介孔二氧化硅和小尺寸的树状高分子聚合物复合而成。故该双重载药纳米颗粒是先由大孔径的介孔二氧化硅孔内负载肽类药物，后表面吸附树状高分子聚合物聚合物，然后腔内负载化疗药物而得到。经上述方法得到的双重载药复合纳米粒具有较好的溶液分散性、较高的药物负载率、较强的肿瘤胞内穿透能力，可有效保护体内循环及运输过程中肽类药物的生物稳定性，并在肿瘤靶部位控制孔内药物的释放,从而应用于癌症的高效协同治疗。此外，该双重载药复合纳米粒还可增加耐药癌细胞株胞内的药物浓度，从而可拓宽Bcl-2肽类药物及化疗药物在癌症多药耐药性方面的治疗应用。

Claims (10)

1.双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于由介孔二氧化硅、树状高分子聚合物、肽类抗癌药物、化疗药物通过物理包埋、静电吸附方式制备而成。
2.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述纳米复合载体为球形，粒径在30～100nm；
所述纳米复合载体由介孔二氧化硅和树状高分子聚合物复合而成，其连接方式为静电吸附、共价连接。
3.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述介孔二氧化硅的颗粒尺寸为20～60nm，内部孔径为6～15nm，形貌为球形；所述介孔二氧化硅的表面有可修饰的反应官能团，所述可修饰的反应官能团为羧基。
4.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述树状高分子聚合物为聚酰胺-胺型树状高分子聚合物或聚赖氨酸型树状高分子聚合物，树状高分子聚合物的端基功能团为氨基。
5.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述肽类抗癌药物为以Bcl-2为靶点的肽类药物，以Bcl-2为靶点的肽类药物通常为Bcl-2功能转换肽，其氨基酸序列为FSRSLHSLL或GDWIDSILAFSRSLHSLLVD；
所述化疗药物为阿霉素、紫杉醇小分子抗癌药物。
6.如权利要求1～5所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺加入反应容器中，用水溶解；
2)向反应体系中加入正硅酸乙酯后离心，洗涤，得含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒；
3)在步骤2)所得的含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒中置于含氯化钠的甲醇溶液中，超声分散后洗涤，真空干燥，得表面基团为羟基的介孔二氧化硅纳米粒；
4)取步骤3)中所得的表面基团为羟基的介孔二氧化硅纳米粒50～100mg超声分散于无水乙醇溶液，再油浴冷凝回流，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷200～800μl，稳定回流过夜，用乙醇洗去未反应物质，得氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；
5)取丁二酸酐于反应容器中，加入N，N-二甲基甲酰胺和超纯水混合溶液超声溶解，再加入步骤4)中所得的氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒，然后加入三乙醇胺，搅拌过夜；用去离子水洗去未反应物质，得羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；
6)取步骤5)中所制备得到的羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒与肽类抗癌药物(NuBCP9)混合后搅拌，洗涤得负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅纳米粒；
7)取步骤6)得到的负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅纳米粒加入第4～6代聚酰胺-胺型树状高分子聚合物，搅拌后洗涤，得负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体；
8)取步骤7)得到的负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体与化疗药物混合后搅拌，洗涤得同时负载肽类抗癌药物和化疗药物的双重载药介孔二氧化硅-树状高分子复合纳米载体。
7.如权利要求6所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺的质量比为(0.4～10)︰(0.018～1.8)；所述用水溶解采用60～120ml、80～95℃去离子水溶解并搅拌1～2h；
在步骤2)中，所述正硅酸乙酯的加入可为1～2ml；所述离心可继续搅拌1～2h后离心；所述洗涤可用乙醇和水分别洗涤；
在步骤3)中，所述含氯化钠的甲醇溶液可按体积百分比含1％氯化钠的甲醇溶液；所述超声分散后洗涤可在旋转混匀仪上洗涤12h，重复1～6次。
8.如权利要求6所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述油浴冷凝回流的条件为80～90℃油浴冷凝回流4～6h；
在步骤5)中，所述丁二酸酐、N，N-二甲基甲酰胺、超纯水混合溶液、氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒和三乙醇胺的配比为：(0.1～0.3g)︰(2～4ml)︰(5～10ml)︰(10～50mg)︰(100～300μl)，其中，丁二酸酐和氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒以质量计算，N，N-二甲基甲酰胺、超纯水混合溶液和三乙醇胺以体积计算；
在步骤6)中，所述羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒的质量可为10～20mg；所述混合后搅拌的时间可为6～24h。
9.如权利要求6所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体的制备方法，其特征在于在步骤7)中，所述负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅纳米粒的质量为10～20mg；所述搅拌的时间为6～24h；
在步骤8)中，所述负载肽类抗癌药物的介孔二氧化硅-树状高分子聚合物复合纳米载体的质量可为10～20mg；所述化疗药物可采用盐酸阿霉素等；所述搅拌的时间可为6～24h。
10.如权利要求1～5所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体在协同高效地用于Bcl-2靶点丰富的治疗癌症药物中应用或在制备克服耐药性癌症的治疗药物中应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111467499A (zh) * 2020-04-18 2020-07-31 中山市君泽科技有限公司 一种石墨烯负载联合治疗癌症方法
CN112190697A (zh) * 2020-10-09 2021-01-08 暨南大学 一种高负载藻蓝蛋白的纳米颗粒及其制备方法与应用
CN114903872A (zh) * 2022-05-30 2022-08-16 厦门大学 共递雷公藤红素和Bcl-2-功能转换肽的树状大分子自组装体及制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104027814A (zh) * 2014-05-29 2014-09-10 福州大学 一种通过氨基修饰后双重载药的介孔二氧化硅
CN104225609A (zh) * 2014-09-20 2014-12-24 中国药科大学 一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104027814A (zh) * 2014-05-29 2014-09-10 福州大学 一种通过氨基修饰后双重载药的介孔二氧化硅
CN104225609A (zh) * 2014-09-20 2014-12-24 中国药科大学 一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEX M. CHEN等: "Co-delivery of Doxorubicin and Bcl-2 siRNA by Mesoporous Silica Nanoparticles Enhances the Efficacy of Chemotherapy in Multidrug-Resistant Cancer Cells", 《SMALL》 *
DONG XIAO等: "A redox-responsive mesoporous silica nanoparticle with a therapeutic peptide shell for tumor targeting synergistic therapy", 《NANOSCALE》 *
LIMIN PAN等: "Nuclear-Targeted Drug Delivery of TAT Peptide-Conjugated Monodisperse Mesoporous Silica Nanoparticles", 《AM. CHEM. SOC.》 *
吴范宏等: "《应用化学》", 31 August 2016, 华东理工大学出版社 *
方亮: "《药剂学 第3版》", 31 March 2016, 中国医药科技出版社 *
杨小浪: "基于介孔硅的蜂毒肽控制释放研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
王国建等: "《高分子现代合成方法与技术》", 31 July 2013, 济大学出版社 *
胡林: "《有序介孔材料与电化学传感器》", 31 December 2013, 合肥工业大学出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111467499A (zh) * 2020-04-18 2020-07-31 中山市君泽科技有限公司 一种石墨烯负载联合治疗癌症方法
CN112190697A (zh) * 2020-10-09 2021-01-08 暨南大学 一种高负载藻蓝蛋白的纳米颗粒及其制备方法与应用
CN112190697B (zh) * 2020-10-09 2024-05-28 暨南大学 一种高负载藻蓝蛋白的纳米颗粒及其制备方法与应用
CN114903872A (zh) * 2022-05-30 2022-08-16 厦门大学 共递雷公藤红素和Bcl-2-功能转换肽的树状大分子自组装体及制备方法与应用
CN114903872B (zh) * 2022-05-30 2023-10-13 厦门大学 共递雷公藤红素和Bcl-2-功能转换肽的树状大分子自组装体及制备方法与应用

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