CN114903872A - 共递雷公藤红素和Bcl-2-功能转换肽的树状大分子自组装体及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

共递雷公藤红素和Bcl‑2‑功能转换肽的树状大分子自组装体及制备方法与应用。该自组装体由聚酰胺‑胺型树状大分子‑雷公藤红素前药、聚乙二醇化的靶向适配体和Bcl‑2‑结构功能转换肽自组装而成；雷公藤红素前药由亲水性PAMAM dendrimers载体表面部分羧基化，修饰二硫键，共价连接雷公藤红素得到；聚乙二醇化的靶向适配体由末端基团修饰的核酸适配体与异功能化的聚乙二醇共价连接而成；Bcl‑2‑结构功能转换肽包含NuBCP‑9和NuBCP‑20。所构建的树状大分子靶向自组装体可在制备治疗耐药性结肠癌、阻断结肠癌转移的防治药物中应用；也可在制备靶标EpCAM和Bcl‑2蛋白丰富的癌症治疗药物中应用。

Description

共递雷公藤红素和Bcl-2-功能转换肽的树状大分子自组装体 及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及天然药用化合物雷公藤红素和多肽蛋白类抗癌药物-Bcl-2-结构功能转换肽的共载纳米系统，尤其是涉及一种共递雷公藤红素和Bcl-2-功能转换肽的树状大分子自组装体及制备方法与应用。
背景技术
癌症严重危害人类健康，结肠癌的发病率和死亡率居高不下，呈现年轻化的趋势。化疗仍是现今临床癌症治疗采取的主要手段，长期的单一化疗药物治疗缺乏肿瘤部位靶向性，会对病人造成巨大的毒副作用，易引起肿瘤细胞对药物的耐受性；对肿瘤干细胞的杀伤力弱，且无法有效阻断肿瘤转移，从而限制癌症的临床疗效。
雷公藤红素(Celastrol)来源于传统中药雷公藤，是一种醌甲基三萜类化合物，分子式为C29H38O4，分子量为450.61，结构式如下：
Figure BDA0003669588530000011
雷公藤红素具有多种药理活性，研究表明它有很强的抗氧化作用，具有抗炎、抗新生血管生成作用，是具有应用潜力的天然药物。此外，它还是一种具有癌症临床治疗应用潜力的抗癌药用化合物，可通过调节肿瘤发生的多种分子靶点(NF-κB/IKKβ、AKT/mTOR等)来发挥多方面的抗癌作用，并且具有很好抗肿瘤细胞侵袭迁移的能力，能够抑制多发性骨髓瘤、肝癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、黑色素瘤和乳腺癌等多种肿瘤的增殖和侵袭。但是，雷公藤红素有许多脂溶性化学药物的通病，缺乏特异选择性、极难溶于水、口服会引起不良反应、导致全身毒副作用等(Eur J Med Chem,189(2020)112081)。目前celastrol还未有上市的药物制剂，研究者对其剂型的改造已成为雷公藤红素的研究特点。Li等人使用纳米胶束负载雷公藤红素，提高其水溶性，增强抑制视网膜细胞瘤增殖的疗效(InternationalJournal of Nanomedicine,7(2012)2389-2398)。将雷公藤红素制成雷公藤红素前药，改善其溶解度和生物利用度，提高其在体安全性，是雷公藤红素应用于临床肿瘤治疗的重要前提。
随着医学生物学技术革新，纳米材料和纳米技术在肿瘤靶向治疗中的应用越来越受到重视。纳米技术作为一个新兴的技术手段，为肿瘤的靶向治疗提供独特理化性质和生物功能的材料。聚酰胺-胺型树状大分子(Polyamidoamine,PAMAM dendrimers)近年来在生物医学领域备受关注。它是一类具有3D空腔结构，外表近似球形的高分子聚合物，表面连接有丰富的树枝状的官能团，所以形象地被研究者们称为树状大分子。树状大分子表面具有丰富的官能团可以连接药物、靶标分子及荧光分子等，又有疏水性内部空腔可以包载难溶性药物，具备纳米级的小尺寸和体内生物安全性高等优点，使得其成为目前肿瘤药物载体的聚焦热点。Pravinkumar M等人将难溶性药物酮洛芬包载于树枝状分子G3的疏水空腔内，能够实现酮洛芬在肿瘤部位的释放(Asian Journal of Pharmaceutical Sciences,24(2015)306-313)。HuXuefeng等人采用含有多巴胺分子的两亲性聚乙二醇树状大分子与硼替佐米反应，通过超声乳化方法构建了硼替佐米-树状大分子前药,从而提高了硼替佐米的血液稳定性、降低毒性(Adv.Funct.Mater.2019,29,1807941)。Li Hong-Jun等人利用PAMAMdendrimers，借助中间连接体CDM和PAEMA，分别合成铂类前药(PCL-CDM-PAMAM/Pt和PEG-b-PAEMA-PAMAM/Pt)，从而实现肿瘤内部酸敏感的药物释放、提高治疗效率(Proc Natl AcadSci U SA.2016Apr 12；113(15):4164-9；ACS Nano 2016,10,6753-6761)。然而，采用树状大分子进行雷公藤红素前药的制备，鲜有报道。此外，本申请人曾在专利公开号CN108888774 A中公开一种雷公藤红素-树状大分子缀合物及其制备与应用；其中树状大分子载体为本发明申请中所用同一种超枝化结构的不同代数(第五代、第六代)树状大分子载体。该方法极大改善雷公藤红素的水溶性，并且改善雷公藤红素生物毒性大的缺点，通过主动靶向使其能够富集于肿瘤部位实现肿瘤治疗。本申请在前期基础上，进一步探索肿瘤微环境控释药物的树状大分子前药，可见其创造性。
单一的化疗药物治疗很难阻断肿瘤的复发及转移，研究表明，肽类抗癌药物能够靶向治疗肿瘤细胞并且具有较好的生物安全性，正逐渐成为一种新兴的癌症治疗手段。Bcl-2家族蛋白是癌症细胞凋亡的关键因子，与肿瘤增殖及转移密切相关，因此受到许多研究者的关注。许多针对靶向Bcl-2的小分子抑制剂被开发出来用于治疗肿瘤(Clin.CancerRes.15(2009)1126–113)。发明人所在团队在2008年报道一种来源于孤儿核受体Nur77的含有9个氨基酸序列的小肽(NuBCP-9,简称N9)，通过转换Bcl2蛋白的功能，实现抑制癌细胞增殖及肿瘤转移的功效，生物安全性好，具有广阔的应用前景(CancerCell14(2008)285-298)。但是，作为一种肽类药物，Bcl2功能转换肽拥有蛋白肽类药物固有的应用局限性，比如体内不稳定易失活、穿膜能力较差等，因此，急需一种优良的运输载体可将抗癌肽有效地包裹于核心位置，避免体内的失活或降解；并且凭借载体本身的被动效应及修饰靶向配体的主动效应有效实现对实体肿瘤组织的靶向富集和深入穿透。本申请人曾在专利公开号CN 109224063 A中公开双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用；所用肽类包含但不限于Bcl-2-功能转换肽(NuBCP-9，简称N9)，能够实现肽类药物和化疗药物的共同负载和联合应用，对于耐药性肿瘤的治疗具有借鉴意义。不同于上述发明的是，本发明将利用树状大分子雷公藤前药本身的尺寸被动效应及借助靶向肿瘤干细胞关键表面标记物-上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适配体主动靶向效应，引入聚乙二醇修饰，构建可实现体内长循环、有效靶向肿瘤、实现肿瘤内部深入穿透和精准双药控释的纳米自组装体；具备发明内容新颖性和创造性的特点。
自组装体药物传递系统(Self-assembled drug delivery systems,SADDS)通常为两亲性前药的自组装体，已报到的自组装体的方法一般是将极性药物与长脂肪链共价结合形成两亲性前药，在水中发生分子自组装从而形成纳米自组装体，可利用载体改善药物分子溶解性差、生物安全性低等特点；SADDS相对于其它药物传递系统而言，具有不需要辅料参与、高载药量、药物稳定性好不发生泄漏、纳米级分散体实现体内靶向、在靶部位实现药物的控释、可进一步功能化、可构建不同药物的自组装体系等优点(J Int Pharm Res，37(2010)165-169)。而我们报道的共载雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换的树状大分子靶向自组装体集降低雷公藤红素的毒副作用和提高其水溶性、增强Bcl-2-结构功能转换肽在体稳定性、实现大分子肽类亲水性药物和小分子疏水性药物在肿瘤细胞内的控制释放、提高肿瘤部位靶向传递和内部深入穿透、延长药物作用时间等优点为一体，具备优良自组装体的特性，合成方法新颖，技术手段可控，可广泛应用于EpCAM和Bcl-2靶标蛋白丰富的结肠癌、肝癌、乳腺癌等及其耐药性癌症的治疗和阻断癌症转移的防治研究，具备治疗效果显著、应用广泛等特点。
发明内容
本发明的第一目的在于改善雷公藤红素在抗肿瘤应用中水溶性差、毒性大、无选择性的缺点，同时规避蛋白肽类药物体内稳定性差、穿膜能力差的弊端，提供一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，从而靶向协同作用于肿瘤部位，实现药物的深入递送和精准控释，为高效安全的原发肿瘤治疗和肿瘤转移阻断提供新思路，同时也为雷公藤红素和蛋白肽类药物在临床癌症治疗上的联合应用提供新的技术策略。
本发明的第二目的在于提供一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体在制备治疗耐药性结肠癌的药物和阻断结肠癌转移的防治药物中应用。
所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，由聚酰胺-胺型树状大分子-雷公藤红素前药、聚乙二醇化的靶向适配体和Bcl-2-结构功能转换肽自组装而形成。
所述树状大分子-雷公藤红素前药由聚酰胺-胺型树枝状有机高分子纳米载体与雷公藤红素通过环境响应键连接而制备。所述聚酰胺-胺型树状大分子包含第五代和第六代的PAMAM dendrimers，末端基团为氨基；所述雷公藤红素为抗癌天然药用化合物雷公藤红素(celastrol)；所述聚酰胺-胺型树状大分子-雷公藤红素前药，中间连接响应键包括但不限于二硫键，还包括二甲基马来酸酐(DMMA)、顺乌头酸酐(CA)等。
所述聚乙二醇化的靶向适配体由聚乙二醇与表面靶向适配体之间通过共价键连接而制备，所述靶向适配体为末端基团修饰的可靶向癌细胞表面生物标志物的核酸适配体；包含但不限于一种核酸适配体EpCAM，也可为靶向CD44、CD31、ALDH1等公认的肿瘤干细胞表面标志物的核酸适配体。
所述聚乙二醇为异功能化的聚乙二醇；包含但不限于NH2-PEG-COOH，分子量在3400～10000之间；所述聚乙二醇与表面靶向配体之间的共价连接键为酰胺键。
所述Bcl-2-结构功能转换肽包含NuBCP-9、NuBCP-20,其氨基酸序列分别为FSRSLHSLL、GDWIDSILAFSRSLHSLLVD。
所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体的制备方法，包括以下步骤：
1)将PAMAM表面的氨基用丁二酸酐进行部分羧基化，透析冷冻干燥，得到PAMAM-COOH衍生物；
2)将PAMAM-COOH衍生物用EDC/NHS活化后，用胱胺进行二硫键修饰，透析冷冻干燥，得到PAMAM-SS-NH2衍生物；
3)用溶剂溶解雷公藤红素，进行EDC/NHS活化后；将活化后的雷公藤红素共价络合在步骤2)所得到的PAMAM-SS-NH2衍生物表面，透析除去多余的雷公藤红素及溶剂，得到树状大分-雷公藤红素前药(PAMAM-SS-Ce)；
4)将末端为羧基的EpCAM适配体用EDC/NHS活化后，与异功能化的聚乙二醇NH2-PEG-COOH连接，透析除去未反应的聚乙二醇，冷冻干燥制备得到PEG-EpCAM；
5)用溶剂溶解步骤3)所得树状大分子纳米前药聚合物PAMAM-SS-Ce、Bcl-2-结构功能转换肽NuBCP9及步骤4)所得PEG-EpCAM衍生物，按一定质量比进行自组装，超滤除去未组装的NuBCP9及PEG-EpCAM，冷冻干燥得到纳米组装体PAMAM-SS-Ce/NuBCP9/PEG-EpCAM。
在步骤1)中，所述PAMAM的代数为G6代，末端基团为氨基；PAMAM︰丁二酸酐的质量比为2.0～2.3︰1，优选2.27︰1。
在步骤2)中，所述PAMAM-COOH︰胱胺的质量比为1︰0.8～1，优选1︰0.84。
在步骤3)中，所述雷公藤红素︰PAMAM-SS-NH2的质量比为231～346︰5，优选231︰5。
在步骤4)中，所述EpCAM︰NH2-PEG-COOH的摩尔比为3︰160～180，优选3︰172。
在步骤1)、2)和3)中，所述透析袋截留分子量可为3.5KD；步骤4)中，所述透析袋截留分子量可为14KD；步骤5)所述超滤管的截留分子量可为50KD；在步骤5)中，所述Bcl-2-结构功能转换肽为NuBCP-9，序列为FSRSLHSLL。
所述PAMAM-SS-Ce︰NuBCP9︰PEG-EpCAM的最佳组装质量比为1︰3︰5；组装时间为24h。
所述溶剂为pH7.4的PBS溶液。
所述树状大分子自组装体PAMAM-SS-Ce/NuBCP9/PEG-EpCAM的形貌为近球形，颗粒粒径在30～40nm，水合粒径为678.4±32.03nm，zeta电势为2.85±0.136mV，呈现电正性。
所述共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体可在制备治疗耐药性结肠癌的药物和阻断结肠癌转移的防治药物中应用；还可在制备靶标EpCAM和Bcl-2蛋白丰富的肝癌、乳腺癌等癌症的治疗药物及防治癌症转移的药物中应用。其中所述树状大分子靶向自组装体PAMAM-SS-Ce/NuBCP9/PEG-EpCAM中雷公藤红素的体外最低有效剂量为1.0721μg/ml(2.38μM)，对应Bcl-2-结构功能转换肽NuBCP9的体外最低有效剂量为10.90μg/ml(10.29μM)；体内应用雷公藤红素的低剂量为0.4～0.8mg/kg，对应NuBCP9的剂量为4.066mg/kg～8.132mg/kg；其中0.8mg/kg的雷公藤红素作用效果较佳。
本发明的作用原理如下：
将雷公藤红素通过肿瘤微环境响应键(如二硫键)负载至PAMAM树状高分子表面形成前药分子，改善雷公藤红素水溶性差以及毒副作用大的问题，可利用纳米载体的EPR效应提高药物的肿瘤靶向性，使得雷公藤红素能够更好的应用于临床抗肿瘤和肿瘤转移治疗。自组装体通过聚乙二醇化的靶向EpCAM核酸适配体的修饰，不仅能够携带雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽主动靶向到肿瘤部位，延长了纳米药物的在体循环时间，有利于静脉注射给药和腹腔注射给药，并可实现双药在肿瘤部位的控制释放、提高肽类药物在体稳定性以及肿瘤组织的穿透力。自组装体同时负载雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽，载药量高，合成方法新颖，技术手段可控，且能够将两种药物共同递送至肿瘤部位，并在肿瘤部位控制释放，发挥协同治疗的效果。
本发明的有益效果是：
本发明可大大解决雷公藤红素水溶性差、生物利用度低和毒副作用大的问题，为雷公藤红素临床使用提供新剂型。
本发明可增强雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽在癌症治疗应用的靶向性，为肿瘤的联合靶向有效治疗提供新的方案。
本发明因引入了聚乙二醇化靶向核酸适配体修饰，可有效增强蛋白肽类大分子药物在肿瘤组织胞内的定点递送，为抗癌大分子药物的在体应用提供了可行性策略。
本发明因雷公藤红素前药的制备，有效的前药和肽类药物的自组装方式，大大降低了雷公藤红素的肝肾毒副作用及载体的自身毒性，提高雷公藤红素及其纳米制剂应用的在体生物安全性；为高效安全的肿瘤药物治疗提供策略。
本发明所述自组装体的最终粒径小于50nm，形貌近球形；水中电势为+2.85±0.136mV，可适用于患者的静脉注射或者腹腔给药，从而为雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的临床联合抗癌使用提供新途径。
本发明所述自组装体抗癌疗效显著(结肠肿瘤几乎完全消失不见)，在体安全性高；不仅适用于所有EpCAM和Bcl-2靶标丰富的肿瘤及肿瘤转移的预防和诊治，也为其它类似肿瘤干细胞标志物的癌症治疗提供纳米制剂设计新思路。
总之，本发明合成方法新颖，技术手段可控，有雷公藤红素和蛋白肽类药物联合新剂型进行产业化实施的良好前景。检索国内外相关文献和专利结果表明，一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体及其制备方法与应用未见其报道。
附图说明
图1为共递雷公藤红素和N9肽的第六代树状大分子自组装体的扫描电镜图。
图2为雷公藤红素、雷公藤红素-树状大分子前药、共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体的水溶性对比图。
图3为共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体的荧光图。
图4为共递雷公藤红素和N20肽的第五代树状大分子自组装体的扫描电镜图。
图5为共递雷公藤红素和N20肽的树状大分子自组装体的荧光图。
图6为共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体对LS174T细胞的靶向结合及内在化的荧光图。
图7为共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体不同浓度下体外作用24h对癌细胞LS174T(a)和正常细胞AD293(b)增殖抑制的效果图。
图8为雷公藤红素、雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体作用24h诱导癌细胞LS174T细胞凋亡的流式图。
图9为雷公藤红素、雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体不同浓度作用下斑马鱼胚胎发育72h的死亡率(a)和孵化率(b)统计图。
图10为游离的荧光染料及荧光标记的雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体在LS174T移植瘤裸鼠体内不同时间内的组织分布成像图。
图11为雷公藤红素、雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体体内抑瘤效果分析(肿瘤体积测定)。
图12为雷公藤红素、雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体体内抑瘤效果分析(肿瘤重量测定)。
图13为雷公藤红素、雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体对LS174T粘附于纤维连接蛋白(Fn)包被的人工底物膜的抑制作用效果图。
图14为雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体抗LS174T细胞迁移能力的对比图。划痕实验结果显示相同浓度的不同药物处理组在24h(a)和48h(b)的细胞迁移率比对。
图15为雷公藤红素-树状大分子前药和共递雷公藤红素和N9肽的树状大分子自组装体给药两周后裸鼠肺结节显示图片。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例，在本发明权利要求所阐明的范围，可进行各种改变或同等替换。
本发明一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体实施例，由聚酰胺胺型树状大分子-雷公藤红素前药、聚乙二醇化的靶向适配体和Bcl-2-结构功能转换肽自组装而形成。
所述树状大分子-雷公藤红素前药由聚酰胺-胺型树枝状有机高分子纳米载体与雷公藤红素通过环境响应键连接而制备。所述聚酰胺-胺型树状大分子包含第五代PAMAMdendrimers或第六代的PAMAM dendrimers，末端基团为氨基；所述雷公藤红素为抗癌天然药用化合物雷公藤红素(celastrol)；所述聚酰胺胺型树状大分子-雷公藤红素前药，中间连接响应键包括但不限于二硫键，还包括二甲基马来酸酐(DMMA)、顺乌头酸酐(CA)等。
所述聚乙二醇化的靶向适配体由聚乙二醇与表面靶向适配体之间通过共价键连接而制备，所述靶向适配体为靶向癌细胞表面生物标志物的核酸适配体；包含但不限于一种核酸适配体EpCAM，也可为靶向CD44、CD31、ALDH1等公认的肿瘤干细胞表面标志物的核酸适配体。
所述聚乙二醇为异功能化的聚乙二醇；包含但不限于NH2-PEG-COOH，分子量在3400～10000之间；所述聚乙二醇与表面靶向配体之间的共价连接键为酰胺键。
所述Bcl-2-结构功能转换肽包含NuBCP-9或NuBCP-20，其氨基酸序列分别为FSRSLHSLL、GDWIDSILAFSRSLHSLLVD。
所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体的制备方法，包括以下步骤：
1)将PAMAM表面的氨基用丁二酸酐进行部分羧基化，透析冷冻干燥，得到PAMAM-COOH衍生物；所述PAMAM的代数为G6代(或G5)，末端基团为氨基；PAMAM︰丁二酸酐的质量比为2.27︰1。
2)将PAMAM-COOH衍生物用EDC/NHS活化后，用胱胺进行二硫键修饰，透析冷冻干燥，得到PAMAM-SS-NH2衍生物；所述PAMAM-COOH︰EDC︰NHS︰胱胺的质量比为1︰3.5︰1.3︰0.84。
3)用pH7.4的PBS溶解雷公藤红素，进行EDC/NHS活化后；将活化后的雷公藤红素共价络合在步骤2)所得到的PAMAM-SS-NH2衍生物表面，透析除去多余的雷公藤红素及溶剂，得到树状大分-雷公藤红素前药(PAMAM-SS-Ce)；所述雷公藤红素︰EDC︰NHS︰PAMAM-SS-NH2的质量比为231︰98︰37︰5。
4)将末端为羧基的EpCAM适配体用EDC/NHS活化后，与异功能化的聚乙二醇NH2-PEG-COOH连接，透析除去未反应的聚乙二醇，冷冻干燥制备得到PEG-EpCAM；所述EpCAM︰EDC︰NHS︰NH2-PEG-COOH的摩尔比为15︰180︰56︰860。
5)用pH7.4的PBS溶液溶解步骤3)所得树状大分子纳米前药聚合物PAMAM-SS-Ce、Bcl-2-结构功能转换肽及步骤4)所得PEG-EpCAM衍生物，按一定质量比进行自组装，超滤除去未组装的Bcl-2-结构功能转换肽及PEG-EpCAM，冷冻干燥得到纳米组装体。所述PAMAM-SS-Ce︰NuBCP9︰PEG-EpCAM的最佳组装质量比为1︰3︰5；组装时间为24h。
以下给出具体实施例。
实施例1：一种共递雷公藤红素和N9小肽的第六代树状大分子自组装体的制备
(1)取10mL第六代PAMAM(G6-NH2)(10mg/mL)的甲醇溶液，利用旋转蒸发去除甲醇，然后分别用8mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)将旋蒸产物超声溶解，加入44.1mg丁二酸酐，室温避光过夜搅拌24h，反应结束后将反应液收集到截留分子量3500的透析袋中，在大量纯水中搅拌透析两天，期间4～6h更换透析液一次，然后冷冻干燥，得到G6-COOH聚合物。
(2)取10mg的G6-COOH聚合物，溶于DMF︰水＝7︰3(v︰v)的混合溶液中，加入35.0mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶液，室温避光搅拌15min后，再加入13.0mg的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液,室温避光搅拌45min，然后加入8.4mg的胱胺，室温下避光过夜搅拌，反应结束后，将终反应液收集至截留分子量3500的透析袋中，使用大量纯水中透析两天，期间隔4～6h更换一次纯水，然后冷冻干燥，得到G6-SS-NH2聚合物。
(3)称取雷公藤红素2.31mg溶于DMF溶液中，加入4.9mg EDC，室温避光搅拌15min，再加入0.74mg NHS，室温避光搅拌45min，然后加入用DMF︰ddH2O＝7︰3混合溶液溶解的5mg的G6-SS-NH2，室温避光搅拌过夜，反应结束后用分子量3500透析袋收集反应液在大量纯水中透析两天，期间隔4～6h更换一次纯水，然后冷冻干燥，得到负载雷公藤红素的G6-SS-Ce聚合物。
(4)将0.15μM的EpCAM aptamer/EpCAM aptamer-Cy3溶于Binding Buffer(5mMMgCl2的PBS，pH 7.4),加入0.285mg的EDC，黑暗条件下室温搅拌15min，加入0.064mg的NHS，黑暗环境室温搅拌45min，然后加入29.4mg的NH2-PEG-COOH，黑暗环境室温搅拌过夜，将反应结束后的反应液收集至截留分子量14000的透析袋中，使用大量纯水透析两天，然后冷冻干燥，得到PEG-Ep/PEG-Ep-Cy3聚合物。
(5)用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)将G6-SS-Ce配成1mg/ml溶液、N9/FI-N9肽配成3mg/ml溶液、PEG-Ep/PEG-Ep-Cy3配成5mg/ml溶液，按照体积比1︰1︰1混合，黑暗环境下室温搅拌过夜，反应结束后，用截留分子量50KDa的超滤管超滤3次，超滤结束后，用DEPC水稀释收集，然后冷冻干燥，得到负载雷公藤红素和N9肽的自组装体(G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep或G6-SS-Ce/FI-N9/PEG-Ep-Cy3)。
通过扫描电镜表征，图1可观察到所制备得到的自组装体纳米粒子形状近似球形。纳米粒子粒径统计得到自组装体的粒径为34.43±5.005nm，有利于携带雷公藤红素和N9小肽作用于肿瘤部位。
对比雷公藤红素、雷公藤红素-树状大分子前药以及自组装体的水溶性差异，由图2可看到游离的雷公藤红素几乎不溶于水，而雷公藤红素-树状大分子前药以及自组装体具有良好的水溶性和分散性，有利用进行静脉注射应用。
自组装体的荧光成像图(图3)可以看到共递小肽和雷公藤红素的树状大分子自组装体同时携带FITC-N9和Ep-Cy3的光，且两者荧光重叠，表明共递小肽和雷公藤红素的树状大分子自组装体的成功构建。
实施例2：一种共递雷公藤红素和N20小肽的第五代树状大分子自组装体的制备
(1)取10mL第五代PAMAM(G5-NH2)(10mg/mL)的甲醇溶液，利用旋转蒸发去除甲醇，然后分别用8mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)将旋蒸产物超声溶解，加入44.4mg丁二酸酐，室温避光过夜搅拌24h，反应结束后将反应液收集到截留分子量3500的透析袋中，在大量纯水中搅拌透析两天，期间4～6h更换透析液一次，然后冷冻干燥，得到G5-COOH聚合物。
(2)取10mg的G5-COOH聚合物，溶于DMF︰水＝7︰3(v︰v)的混合溶液中，加入34.9mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶液，室温避光搅拌15min后，再加入13.1mg的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液,室温避光搅拌45min，然后加入8.41mg的胱胺，室温下避光过夜搅拌，反应结束后，将终反应液收集至截留分子量3500的透析袋中，使用大量纯水中透析两天，期间隔4～6h更换一次纯水，然后冷冻干燥，得到G5-SS-NH2聚合物。
(3)称取雷公藤红素1.975mg溶于DMF溶液中，加入4.2mg EDC，室温避光搅拌15min，再加入0.63mg NHS，室温避光搅拌45min，然后加入用DMF︰ddH2O＝7︰3混合溶液溶解的5mg的G5-SS-NH2，室温避光搅拌过夜，反应结束后用分子量3500透析袋收集反应液在大量纯水中透析两天，期间隔4～6h更换一次纯水，然后冷冻干燥，得到负载雷公藤红素的G5-SS-Ce聚合物。
(4)将0.15μM的EpCAM aptamer/EpCAM aptamer-Cy3溶于Binding Buffer(5mMMgCl2的PBS，pH 7.4),加入0.285mg的EDC，黑暗条件下室温搅拌15min，加入0.064mg的NHS，黑暗环境室温搅拌45min，然后加入29.4mg的NH2-PEG-COOH，黑暗环境室温搅拌过夜，将反应结束后的反应液收集至截留分子量14000的透析袋中，使用大量纯水透析两天，然后冷冻干燥，得到PEG-Ep/PEG-Ep-Cy3聚合物。
(5)用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)将G5-SS-Ce配成1mg/ml溶液、N20/FI-N20肽配成1mg/ml溶液、PEG-Ep/PEG-Ep-Cy3配成1mg/ml溶液，按照体积比1︰1︰1混合，黑暗环境下室温搅拌过夜，反应结束后，用截留分子量30KDa的超滤管超滤3次，超滤结束后，用DEPC水稀释收集，然后冷冻干燥，得到负载雷公藤红素和N20肽的自组装体(G5-SS-Ce/N20/PEG-Ep或G5-SS-Ce/FI-N20/PEG-Ep-Cy3)。
通过扫描电镜表征，图4可观察到所制备得到的自组装体纳米粒子形状近似球形。自组装体的荧光成像图(图5)可以看到共递小肽和雷公藤红素的树状大分子自组装体同时携带FITC-N20和Ep-Cy3的光，且两者荧光重叠，表明共递小肽N20和雷公藤红素的树状大分子自组装体的成功构建。
实施例3：自组装体对LS174T细胞的靶向结合及内在化
选取人结肠癌LS174T细胞作为体外EpCAM高表达肿瘤干细胞细胞系。将LS174T细胞以每孔(2～10)×103个细胞量接种于预铺小玻片的24孔板，于细胞培养箱培养24h，去除旧培养基，加入含有5％FBS的Binding Buffer封闭30min，在24、12、2h进行倒序加药，加入浓度为12.5μg/ml的G6-SS-Ce/FI-N9/PEG-Ep-Cy3。作用时间到后，吸弃培养液，PBS洗涤两遍，按比例加入线粒体探针(deep red)孵育30min，然后吸去孔板内所有液体，用PBS洗涤两次，4％多聚甲醛室温固定30min，用含DAPI的封片油封片，阴凉处晾干，用共聚焦显微镜进行观察拍摄。
激光共聚焦显微镜分析(图6)可看到，自组装体G6-SS-Ce/FI-N9/PEG-Ep-Cy3可在2h内结合LS174T细胞，并且自组装体进入细胞的数量呈时间依赖性。随着时间的延长，进入细胞内的纳米递送药物显著增多。说明自组装体能够与LS174T细胞靶向特异性结合。
实施例3：自组装体对结肠癌细胞增殖的选择性抑制
将LS174T细胞或AD293细胞按照每孔约2x103个细胞量接种到96孔板，细胞培养箱培养24h，分别加入0.01、0.1、0.3、0.5、0.8、1.5μg/ml浓度梯度的celastrol、Ce+N9、G6-SS-Ce、G6-SS-Ce+N9、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep，不加任何药物的孔作为阴性对照，细胞培养箱培养。药物作用24h后，吸去每孔内旧的含药培养基，加入100μl无血清DMEM培养基(含20％MTT)，细胞培养箱内孵育4h。MTT孵育结束后小心的吸去每孔内所有液体，每孔加入100μLDMSO溶液，孔板置于恒温震荡器上震荡10min，使用多功能酶标仪上检测490nm处的吸光度。按照以下公式计算：细胞存活率％＝(试验组平均A值-溶剂对照组A值)/(阴性对照组平均A值-溶剂对照组A值)×100％。
MTT增殖实验(图7)表明，各给药组抑制LS174T细胞的增殖呈浓度依赖性，24h雷公藤红素-树状大分子前药对LS174T的IC50值为1.6388μM；自组装体对LS174T细胞的IC50值为1.06μM。雷公藤红素对AD293细胞具有极强的毒性作用，24h对AD293细胞的IC50值为0.6646μM。但是雷公藤红素经过树状大分子包载以及与N9肽形成靶向自组装体后，对正常细胞AD293的细胞毒性明显降低，24h的IC50值从0.6646μM升高至2.3792μM。同时，自组装体可以发挥雷公藤红素和N9肽协同抗肿瘤的作用，选择性的增强抑制肿瘤细胞LS174T的增殖能力，24h的IC50值从2.5369μM降至1.0612μM。雷公藤红素-树状大分子前药也表现出类似但弱于自组装体的选择性抑制效果。上述结果，证明了自组装体对肿瘤细胞的特异靶向性，以及协同抗肿瘤效果。
实施例4：自组装体体外诱导结肠癌细胞凋亡的分析
将LS174T细胞，按每孔约30～50万个细胞量接种于6孔板中，细胞培养箱中培养24h。吸去旧培养基，每孔加入celastrol浓度为1μM的free celastrol、G6-SS-Ce、G6-SS-Ce+N9、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep的含药培养基以及对应自组装体浓度的N9含药培养基，同时设置空白培养基为阴性对照组，细胞培养箱培养。药物作用24h后收样，小心收集每孔的含药培养基及细胞，每孔加入含5μLAnnexinⅤ-FITC染液的200μL的1×Binding Buffer中，室温避光染色15min，再加入含5μLPI染液的200μL的1×Binding Buffer，室温避光染色5min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
流式凋亡结果(见图8)分析，N9小肽难以穿透细胞膜进入细胞，因此，free N9组与control对照组的凋亡情况无明显差别；Ce组引起约32.8％的细胞凋亡，其中早期凋亡占27.46％，晚期凋亡占5.34％；G6-SS-Ce和G6-SS-Ce+N9组引起约45％左右的细胞凋亡；而G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep能引起约55％左右的细胞凋亡，其中，早期凋亡占37.46％，晚期凋亡占16.46％。证明共递雷公藤红素和小肽的树状大分子自组装体具有良好的协同抗肿瘤作用。
实施例5：自组装体体内安全性评价
在24孔板每孔中加入10枚在显微镜下挑选的形状圆润、健康的鱼卵，置于(27±1)℃的恒温光照培养箱中。用斑马鱼培养液将celastrol、G6-SS-Ce+N9、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep分别配制成ce浓度为0.5、1、1.5、2μM的溶液，并设置空白斑马鱼培养液为阴性对照，每个浓度设置三个副孔。记录设定时间点斑马鱼胚胎的死亡数、孵化数和畸形数。
斑马鱼胚胎发育过程72h的死亡数、孵化数统计(图9)分析，雷公藤红素对斑马鱼胚胎表现出较强的毒性作用，影响着斑马鱼胚胎的孵化速度和存活率，2μM和4μM给药组死亡率已达100％，0.5μM给药组也有约30％的死亡率，且0.5μM组斑马鱼胚胎仍未孵化完全。而构建的自组装体表现出了较高的生物安全性，72h时各浓度组斑马鱼全部孵化，并且未出现死亡幼鱼。雷公藤红素-树状大分子前药组表现出次于自组装体组的生物安全性，72h时基本全部孵化且仅4μM给药组出现约40％的死亡率。证明构建的共递雷公藤红素和小肽的树状大分子自组装体，显著降低了雷公藤红素本身的毒副作用，提高了其生物安全性。
实施例6：自组装体体内肿瘤靶向和分布
首先皮下接种结肠癌LS174T细胞，每只裸鼠接种0.1ml上述细胞悬液(细胞浓度为107/ml)，当裸鼠移植瘤体积达到100-150mm3时，选择无出血、坏死、感染的裸鼠进行实验，将裸鼠按照每组6只，随机分为三组，根据LS174T移植瘤小鼠的体重，尾静脉注射以相同量的CY7(250μg/kg)分别给予生理盐水配制的CY7，CY7-G6-SS-Ce、CY7-G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep-CY3。在注射后的不同时间点(1h、3h、8h、12h、24h、48h)，用异氟烷麻醉小鼠，并用体内动物成像系统进行实时成像拍摄，从而观察树状大分子靶向自组装体在体内肿瘤及各器官组织的分布情况。
小动物荧光成像结果(图10)分析，与游离Cy7和Cy7标记的雷公藤红素-树状大分子前药相比相比，自组装体3h时在肿瘤部位可观察到较强Cy7荧光，24h荧光信号达到最大值，48h时仍见强烈的荧光信号。雷公藤红素-树状大分子前药在24h时肿瘤部位荧光明显减弱，48h时肿瘤部位荧光消失。而游离的荧光物质Cy7在体内快速代谢，24h时仅剩微弱的荧光，48h时荧光完全消失。可见，所构建的树状大分子靶向自组装体具有很强的肿瘤靶向性和肿瘤滞留能力。
实施例7：自组装体体内抑瘤效果分析
首先皮下接种结肠癌LS174T细胞，每只裸鼠接种0.1ml上述细胞悬液(细胞浓度为107/ml)，当裸鼠移植瘤体积达到100-150mm3时，选择无出血、坏死、感染的裸鼠进行实验。随机将LS174T移植瘤裸鼠每组五只，分为六组。分为对照组(生理盐水组)和给药组(N9、Ce、G6-SS-Ce、G6-SS-Ce+N9、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep)，给药组按照每只裸鼠Ce剂量0.8mg/kg尾静脉给药(N9也为对应的剂量)，在第1、4、7、10、13天分别尾静脉给药，并每天监测小鼠肿瘤的大小、体重，观察抑瘤效果。
通过统计小鼠肿瘤大小(图11)，间隔2天给药，两周后，相对于生理盐水组，各给药组可不同程度抑制裸鼠的肿瘤生长。自组装体组的裸鼠肿瘤体积给要两周后已无法测量，雷公藤红素-树状大分子组相较于雷公藤红素组肿瘤体积下降了4倍，可见，同等雷公藤红素剂量下，雷公藤红素-树状大分子组和自组装体组都展现出了更好的抗肿瘤能力。肿瘤重量结果(图12)也显示，给药组的裸鼠肿瘤相对于生理盐水组，肿瘤瘤重明显减少，可见，肿瘤大小的变化与肿瘤生长抑制的趋势是一致的，从而证实了自组装体强大的协同抗肿瘤能力。
实施例8：自组装体体外抗肿瘤转移粘附实验
将1μg/ml的Fn纤连蛋白的PBS溶液预涂在96孔板的基板上过夜，然后吸弃含纤连蛋白的PBS溶液，用含2％BSA的PBS溶液封闭30min。按照每孔约2000个细胞的数量将100μL的LS174T细胞和三种给药组Ce+N9、G6-SS-Ce+N9、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep按照对应的雷公藤红素浓度(0、0.5、1、2、5μg/ml)添加到每个孔内，不加任何药物的孔作为阴性对照，置于细胞培养箱中孵育1h。然后用泵小心吸去每孔内液体，每孔加入100μL无血清DMEM培养基(20％MTT)，细胞培养箱内孵育4h。MTT作用结束后用泵小心吸去每孔内液体，分别加入100μL DMSO溶液，将96孔板置于震荡器上震荡10min，酶标仪检测490nm处的吸光度，测定处理组与对照组的相对粘附率。按照以下公式计算：细胞粘附率％＝(试验组平均A值-溶剂对照组A值)/(阴性对照组平均A值-溶剂对照组A值)×100％。
粘附实验结果(图13)分析，自组装体抑制癌细胞与Fn基底的粘附能力呈浓度依赖性。雷公藤红素浓度为5μg/ml时，LS174T细胞株与Ce+N9、G6-SS-Ce+N9、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep的结合率分别为62.97％、36.46％和24.35％。雷公藤红素-树状大分子药物有较为明显的阻断LS174T细胞粘附的作用，而共递小肽和雷公藤红素的树状大分子自组装体对比雷公藤红素树状大分子药物具有显著性增强的阻断LS174T细胞的粘附作用。这表明自组装体具有抗肿瘤细胞粘附的能力。
实施例9：自组装体体外抗肿瘤转移划痕实验
在6孔板中按照每孔接种50万-100万个LS174T细胞，放入细胞培养箱培养至细胞贴壁长满，密度约90％时，用消毒灭菌过的小枪头，垂直孔板划痕，使用无菌PBS清洗三遍，洗去漂浮的细胞碎屑，每孔加入celastrol浓度为0.02、0.1、0.2、0.3μg/ml的G6-SS-Ce、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep的含药培养基，放于细胞培养箱培育，在0、24、48h取出细胞置于显微镜下观察并拍照，记录拍照的位置坐标，每次拍摄都在显微镜对应坐标下进行。使用Image J软件统计，选择7-8条平行线进行细胞迁移率统计。
从图14的划痕实验数据统计中，可以更直观的看出，G6-SS-Ce组和G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep的细胞迁移率随时间和浓度的增大而减小，即抗细胞迁移能力随时间延长和浓度的增大而增强。当Ce浓度为0.02μg/ml时，作用48h，G6-SS-Ce组细胞迁移率为17.4％，G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep组的细胞迁移率为13.06％，而对照组的细胞迁移率为42.61％。Ce浓度为0.3μg/ml时，作用24h，G6-SS-Ce组细胞迁移率为-0.45％，G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep组的细胞迁移率为-11.9％，而对照组的细胞迁移率为25.71％。说明自组装体具有协同抗细胞迁移的能力。
实施例10：自组装体体内抗肿瘤转移效果分析
首先尾静脉接种鼠源结肠癌MC38细胞，每只裸鼠接种0.1ml上述细胞悬液(细胞浓度为107/ml)，每组两只，分为对照组(生理盐水组)和给药组(G6-SS-Ce、G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep)，给药组按照每只裸鼠celastrol剂量0.8mg/kg尾静脉给药，在第1,4,7,10,13天分别尾静脉给药，给药两周后隔天处死并解剖，剖取收集可见肿瘤和肺进行拍照。
从图15各组裸鼠的肺图片可以看到，对照组裸鼠的肺有明显的肺结节，数量为4个，而G6-SS-Ce组的裸鼠经过治疗有2个肺结节，G6-SS-Ce/N9/PEG-Ep组经过治疗未发现明显的肺结节。说明雷公藤红素-树状大分子前药对肿瘤转移有一定的抑制能力，而共递雷公藤红素和N9小肽的树状大分子自组装体能够发挥两种药物协同的抗肿瘤转移能力。
上述实施例仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，其特征在于由聚酰胺-胺型树状大分子-雷公藤红素前药、聚乙二醇化的靶向适配体和Bcl-2-结构功能转换肽自组装而成。
2.如权利要求1所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，其特征在于聚酰胺-胺型树状大分子-雷公藤红素前药由聚酰胺-胺型树状有机高分子纳米载体PAMAM dendrimers与雷公藤红素通过环境响应键连接而制备。
3.如权利要求1所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，其特征在于所述聚乙二醇化的靶向适配体由聚乙二醇与表面靶向适配体之间通过共价键连接而制备，所述表面靶向适配体为末端基团修饰的核酸适配体；所述聚乙二醇为异功能化的聚乙二醇。
4.如权利要求1所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，其特征在于所述Bcl-2-结构功能转换肽包括抗癌肽NuBCP-9和NuBCP-20，其氨基酸序列分别为FSRSLHSLL、GDWIDSILAFSRSLHSLLVD。
5.如权利要求2所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，其特征在于所述聚酰胺-胺型树状大分子包含第五代和第六代的PAMAMdendrimers，末端基团为氨基；所述雷公藤红素为抗癌天然药用化合物雷公藤红素；所述聚酰胺-胺型树状大分子-雷公藤红素前药的中间连接环境响应键不局限于二硫键，还包括二甲基马来酸酐或顺乌头酸酐。
6.如权利要求3所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体，其特征在于所述聚乙二醇化的靶向适配体包含但不限于一种核酸适配体EpCAM；所述聚乙二醇为异功能化的聚乙二醇，包含但不限于NH2-PEG-COOH，分子量在3400～10000之间；所述聚乙二醇与表面靶向适配体之间的共价连接键为酰胺键。
7.如权利要求1所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将PAMAM表面的氨基用丁二酸酐进行部分羧基化，透析冷冻干燥而得到PAMAM-COOH衍生物；
2)将PAMAM-COOH衍生物用EDC/NHS活化后，用胱胺进行二硫键修饰，透析冷冻干燥而得到PAMAM-SS-NH2衍生物；
3)将雷公藤红素进行EDC/NHS活化后，共价络合在步骤2)所得到的二硫键修饰的PAMAM-SS-NH2衍生物表面，透析除去多余的雷公红藤素及溶剂，冷冻干燥而得到负载雷公藤红素的树状大分子前药PAMAM-SS-Ce；
4)将末端为羧基的EpCAM靶向核酸适配体用EDC/NHS活化后，与异功能化的聚乙二醇NH2-PEG-COOH连接，透析除去未反应的聚乙二醇，冷冻干燥而得到聚乙二醇化的靶向适配体PEG-EpCAM；
5)用溶剂溶解步骤3)所得到的PAMAM-SS-Ce、Bcl-2-结构功能转换肽NuBCP9及步骤4)所得到的PEG-EpCAM,并进行混合自由组装，超滤除去未组装的NuBCP9及PEG-EpCAM，冷冻干燥得到纳米靶向组装体PAMAM-SS-Ce/NuBCP9/PEG-EpCAM。
8.如权利要求7所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体的制备方法，其特征在于：
在步骤1)中，所述PAMAM的代数为G6代，末端基团为氨基；PAMAM︰丁二酸酐的质量比为2.0～2.3︰1，优选2.27︰1；
在步骤2)中，所述PAMAM-COOH︰胱胺的质量比为1︰0.8～1，优选1︰0.84；
在步骤3)中，所述雷公藤红素︰PAMAM-SS-NH2的质量比为231～346︰5，优选231︰5；
在步骤4)中，所述EpCAM︰NH2-PEG-COOH的摩尔比为3︰160～180；优选3︰172；
在步骤5)中，所述PAMAM-SS-Ce︰NuBCP9︰PEG-EpCAM的最佳组装质量比为1︰3︰5；所述溶剂为pH7.4的PBS溶液；组装时间为24h。
9.如权利要求7所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体的制备方法，其特征在于在步骤1)、2)和3)中所用透析袋的截留分子量为3.5KD；步骤4)中所用透析袋的截留分子量为14KD；步骤5)中，所用超滤管的截留分子量为50KD；所述树状大分子自组装体PAMAM-SS-Ce/NuBCP9/PEG-EpCAM的形貌为近球形，颗粒粒径在30～40nm，水合粒径为678.4±32.03nm，zeta电势为2.85±0.136mV，呈现电正性。
10.如权利要求1所述一种共递雷公藤红素和Bcl-2-结构功能转换肽的树状大分子靶向自组装体在制备治疗耐药性结肠癌和阻断结肠癌转移的防治药物中应用；还可在制备靶标EpCAM和Bcl-2蛋白丰富的癌症治疗药物及防治癌症转移的药物中应用。
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