CN115463221A - 一种纳米靶向载药复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米复合物技术领域，具体涉及一种纳米靶向载药复合物及其制备方法和应用，为解决现有技术在肿瘤主动靶向特异性方面有所欠缺，且其靶标较少，存在应用局限的问题，本发明纳米靶向载药复合物以Ti3C2为载体，在其表面负载抗癌药物，并在其表面偶联能识别细胞表面特异性蛋白的核酸适体，Ti3C2的平面尺寸为80～200nm，抗癌药物为阿霉素，负载量为Ti3C2的15wt.％～50wt.％。所提供的阿霉素/Ti3C2/核酸适体纳米载药体系具有优良的主动靶向作用，对靶向的肿瘤细胞具有更强的杀伤能力，还能够降低药物的毒副作用。

Description

一种纳米靶向载药复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米复合物技术领域，具体涉及一种纳米靶向载药复合物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是现在威胁人类生命的主要疾病之一，随着纳米技术的发展，具有特殊性能的纳米材料被不断开发出来以克服传统癌症治疗的局限性。Ti3C2属于一种二维层状MXene纳米材料，其在近红外光区域具有很强的吸收能力和较高的光热转换性能，且具有高比表面积和低毒性的特点，因此可以用于肿瘤光热治疗，同时还可以装载和递送肿瘤治疗剂。目前，大多数Ti3C2纳米材料是通过被动靶向作用，即高渗透长滞留作用实现在体内肿瘤部位的积累。然而，Ti3C2纳米材料进入体内后大部分迅速被网状内皮系统吞噬，使到达肿瘤细胞的纳米粒子数量减少，降低了药效，这极大限制了Ti3C2纳米材料在医药领域中的研究和应用。因此，采用主动靶向可以更加有效的将Ti3C2纳米材料或其复合纳米材料运送到肿瘤部位。
到目前为止，制备具有主动靶向的MXenes纳米材料已有公开的报道。中国专利文件CN108273058A提供了一种肿瘤靶向治疗缓释制剂及其制备方法，所述制备方法包括将MXene纳米片与十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和三乙醇胺(TEA)的混合水溶液中共同反应；再加入正硅酸乙酯(TEOS)，于80℃下反应，离心，洗涤，得介孔氧化硅包裹的MXene纳米片。对介孔氧化硅包裹的MXene纳米片进行聚乙二醇表面修饰，再用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(RGD)共价结合，负载药物，即得。然而，RGD的化学本质是蛋白质，会受到温度、pH和酶抑制剂的影响，从而抑制其靶向效果的发挥。中国专利文件CN113144206A提供了叶酸-普朗尼克-MXenes肿瘤靶向载药体系，所述制备方法包括MXenes的制备、叶酸活化，叶酸-MXenes体系及活化和叶酸-普朗尼克-MXenes的制备及纯化实现，利用普朗尼克上含有的羟基与叶酸表面的羧基在缩合剂存在的条件下发生酯化反应，形成具有肿瘤靶向作用的叶酸-普朗尼克-MXenes肿瘤靶向载药体系。然而，传统的叶酸靶向制剂修饰方法存在缺点，尤其是该修饰方法使得叶酸基团大部分被包裹于制剂疏水内核、无法充分暴露进而影响与靶细胞表面受体发生相互作用。而且，上述MXenes通过表面修饰RGD或叶酸实现主动靶向的方法在靶向特异性方面有所欠缺，其靶标较少，存在应用局限。
发明内容
针对现有技术在肿瘤主动靶向特异性方面有所欠缺，且其靶标较少，存在应用局限的问题，本发明提供了一种纳米靶向载药复合物及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种纳米靶向载药复合物，以Ti3C2纳米材料为载体，在其表面负载抗癌药物，并在其表面偶联能识别细胞表面特异性蛋白的核酸适体(Aptamer,Apt)。
进一步，所述Ti3C2纳米材料的粒径为80～200nm。
进一步，所述抗癌药物为阿霉素(DOX)，负载量为MXenes的15wt.％～50wt.％。
进一步，所述核酸适体通过共价结合的方法偶联至Ti3C2纳米材料表面。
一种纳米靶向载药复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，Ti3C2基MXenes纳米材料的制备：以Ti3AlC2基MAX为原料，通过HF酸刻蚀法制备多层Ti3C2(M-Ti3C2)，再利用四丙基氢氧化铵(TPAOH)进行插层分散，制备少层Ti3C2纳米材料(F-Ti3C2)。
步骤2，抗癌药物的负载：利用静电相互作用将DOX负载至F-Ti3C2上，制备DOX/Ti3C2；
步骤3，PEG表面改性：利用双羧基PEG与步骤2中制备的DOX/Ti3C2进行混合搅拌反应，制备DOX/Ti3C2-PEG；
步骤4，核酸适体的偶联：使用EDC/NHS试剂通过共价结合的方法将能够靶向肿瘤细胞表面MUC1黏蛋白的Apt(Apt-M)偶联至DOX/Ti3C2-PEG表面，即可制得纳米靶向载药复合物DOX/Ti3C2/Apt-M。
一种纳米靶向载药复合物的应用，应用于对肿瘤进行光热治疗与化疗联合治疗。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
(1)本发明以Ti3C2基MXenes纳米材料作为抗肿瘤药物载体，并进行双羧基PEG修饰，使其能有效负载DOX，同时能够提高其生理环境分散性和生物相容性；
(2)本发明利用Apt作为靶向基团修饰于DOX/Ti3C2-PEG表面，能够使装载的药物有效靶向人体的肿瘤细胞，使其死亡。
(3)本发明所用到的Apt可以针对不同的靶细胞、不同细胞表面的特异性抗原而进行改变，因此可适用于治疗多种癌症。
(4)本发明一方面以Ti3C2基MXenes纳米材料为载体，以实现运送抗肿瘤药物DOX至肿瘤细胞，同时发挥化疗/光热治疗的目的；另一方面，以Apt作为靶向基团对DOX/Ti3C2-PEG进行共价结合偶联修饰，使其具有靶向目标细胞的能力，从而达到靶向治疗的目的。
附图说明
图1为本发明中实施例1中F-Ti3C2纳米片的TEM图像；
图2为本发明中实施例1中F-Ti3C2纳米片的EDS分析结果；
图3为本发明中实施例1中Ti3AlC2材料，以及M-Ti3C2和F-Ti3C2纳米片的XRD分析结果；
图4为本发明中F-Ti3C2、DOX/Ti3C2、DOX/Ti3C2-PEG和DOX/Ti3C2/Apt-M纳米片的动态光散射分析结果；
图5为本发明中F-Ti3C2、DOX/Ti3C2、DOX/Ti3C2-PEG和DOX/Ti3C2/Apt-M纳米片的zeta电位分析结果；
图6为本发明中F-Ti3C2、DOX/Ti3C2、DOX/Ti3C2-PEG和DOX/Ti3C2/Apt-M纳米片的FT-IR分析结果；
图7为本发明中不同浓度DOX/Ti3C2/Apt-M纳米片的水溶液在808nm激光照射下的温度变化结果；
图8为本发明中DOX/Ti3C2/Apt-M纳米片在PBS中激光照射下的DOX释放曲线结果；
图9为本发明中DOX/Ti3C2/Apt-M纳米片在MCF-7和HepG2细胞中不同时间(2、4和6小时)下的摄取情况比较图；
图10为本发明中MCF-7和HepG2细胞与不同纳米材料孵育4小时后的摄取情况比较图；
图11为本发明中各药物及纳米材料处理后的MCF-7细胞活力结果示意图；
图12为本发明中各药物及纳米材料处理后的MCF-7细胞凋亡结果示意图；
图13为本发明中各药物及纳米材料对小鼠肿瘤增殖的影响结果示意图。
图14为本发明中各药物及纳米材料处理后的小鼠肿瘤解剖结果示意图；
图15为本发明中各药物及纳米材料处理后的小鼠肿瘤瘤重结果示意图；
具体实施方式
实施例1
一种纳米靶向载药复合物，以Ti3C2基MXenes为载体，在其表面负载抗癌药物阿霉素，负载量为38.3wt.％，并在其表面偶联能识别细胞表面特异性蛋白的Apt，使其具有靶向能力。
一种纳米靶向载药复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，少层Ti3C2纳米材料的制备：室温下将1.0gTi3AlC2浸入20mL40％氟化氢水溶液中搅拌3d。通过离心收集多层Ti3C2(M-Ti3C2)沉淀物，并用水洗涤数次，直到HF被去除。然后，将M-Ti3C2沉淀物分散在20mLTPAOH水溶液(25wt.％)中，并在室温下搅拌3d。在超声处理15min后，获得少层Ti3C2(F-Ti3C2)纳米片，然后在3500rpm下离心60min，收集F-Ti3C2沉淀物。将制备的F-Ti3C2纳米片分散在去离子水中并在4℃下储存。所得F-Ti3C2纳米片如图1所示，粒径为80～200nm，平均粒径为100nm。图2和3所示，所得F-Ti3C2纳米片中Al元素已经被去除。
步骤2，抗癌药物的负载：将F-Ti3C2纳米片(2.5mL，1.0mg/mL)缓慢添加到DOX水溶液(2.5mL，0.4mg/mL)中，并在黑暗中搅拌过夜。将DOX/Ti3C2离心并用去离子水洗涤三次以去除多余的DOX。由图4和图5可见，由于表面负载了DOX，因此DOX/Ti3C2的水合粒径和zeta电位均高于F-Ti3C2。另外，由图6的FT-IR可见，DOX/Ti3C2在～1469cm-1处有特征吸收峰。以上结果表明DOX成功负载至F-Ti3C2表面。
步骤3，PEG表面改性：用COOH-PEG-COOH修饰DOX/Ti3C2纳米片的表面，将DOX/Ti3C2水溶液(2.5mL，1.0mg/mL)缓慢添加到COOH-PEG-COOH溶液(2.5mL，10.0mg/mL)中，并在黑暗中搅拌6小时。通过离心(12000rpm，10分钟)收集聚乙二醇化的DOX/Ti3C2纳米片(DOX/Ti3C2-PEG)，并用水洗涤两次以去除多余的PEG。由图4和图5可见，由于在DOX/Ti3C2表面负载了COOH-PEG-COOH，因此DOX/Ti3C2-PEG的水合粒径高于DOX/Ti3C2，而zeta电位则低于DOX/Ti3C2。另外，由图6可见，DOX/Ti3C2在～1727cm-1处有特征吸收峰。以上结果表明DOX/Ti3C2表面成功修饰COOH-PEG-COOH。
步骤4，Apt的偶联：用EDC·HCl(500μL，500mM)和NHS(500μL，100mM)活化DOX/Ti3C2-PEG(1.0mL，2.0mg/mL)纳米片，在磁力搅拌下进行30分钟的反应，通过离心获得活化的DOX/Ti3C2-PEG纳米片，随后洗涤3～4次。之后，将Apt-M(10OD)在85℃下变性10分钟，然后在冰浴中重新折叠10分钟。活化的DOX/Ti3C2-PEG纳米片在振荡条件下与Apt-M反应5小时，然后离心并用水洗涤3次，以获得Apt-M改性的DOX/Ti3C2/Apt-M纳米材料；同时，为了后续进行对照实验，将不具有靶向性能的随机序列(Apt-C)在相同条件下进行反应，制备DOX/Ti3C2/Apt-C纳米材料。由图4和图5可见，由于Apt-M成功连接至DOX/Ti3C2-PEG表面，因此DOX/Ti3C2/Apt-M的水合粒径高于DOX/Ti3C2-PEG，且zeta电位低于DOX/Ti3C2-PEG。另外，由图6可见，DOX/Ti3C2/Apt-M在～1342cm-1、～1573cm-1和～1644cm-1存在明显的酰胺键特征峰。说明DOX/Ti3C2/Apt-M纳米材料制备成功，且Apt-M是通过共价结合连接至纳米材料上。
实施例2
用808nm激光以1.5w/cm2功率密度分别照射不同浓度(0～100μg/mL)的DOX/Ti3C2/Apt-M(1.0mL)水溶液10min，同时记录温度变化。由图7可见，不同浓度的DOX/Ti3C2/Apt-M在808nm激光照射下均可使溶液温度上升，且溶液温度上升情况与DOX/Ti3C2/Apt-M浓度有关，说明DOX/Ti3C2/Apt-M可以用于肿瘤光热治疗。
将DOX/Ti3C2/Apt-M(0.5mL，1.0mg/mL)封装在截止分子量为3000道尔顿的透析袋中，将透析袋浸入30mL不同pH值(pH7.4、6.0和4.5)的PBS中，然后在37℃和150rpm下孵育。分别在5小时和10小时的时间点用808nm激光(1.5W/cm2，10分钟)照射浸泡在PBS中的透析袋，用紫外-可见分光光度计测量透析液的吸光度，计算DOX释放率。由图8可见，DOX从DOX/Ti3C2/Apt-M释放与溶液中的pH有关，pH呈酸性环境有利于DOX释放，而且激光照射也会促进DOX释放。
实施例3
将癌细胞接种在6孔板(1×105个细胞/孔)中并培养24小时。将原始培养基替换为2.0mL含有DOX/Ti3C2/Apt-M纳米片(100μg/mL)的培养基，然后培养2、4和6小时。用PBS轻轻洗涤细胞7～8次，并通过流式细胞术分析各组细胞DOX荧光强度。由图9可见，随着时间的增加，MCF-7和HepG2细胞对DOX/Ti3C2/Apt-M的摄取逐渐增加，但是由于Apt-M存在的靶向作用，MCF-7在4小时内完成对DOX/Ti3C2/Apt-M的摄取。
为了验证靶向性能，将癌细胞接种在6孔板(1×105个细胞/孔)中并培养24小时。用含有DOX/Ti3C2-PEG(100μg/mL)、DOX/Ti3C2/Apt-M(100μg/mL)、DOX/Ti3C2/Apt-M(100μg/mL)+2ODApt-M、DOX/Ti3C2/Apt-M(100μg/mL)+2ODApt-C的培养基替换6孔板内的培养基，然后分别培养4小时。然后，通过流式细胞仪分析各组细胞DOX荧光强度。由图10可见，因为Apt-M存在的靶向作用，所以MCF-7对DOX/Ti3C2/Apt-M摄入量提高，如果MCF-7的细胞表面被游离的Apt-M占据，则DOX/Ti3C2/Apt-M无法有效发挥其靶向作用。
实施例4
将MCF-7细胞接种在96孔板(5×103个细胞/孔)中并培养24小时。弃置原始培养基，分别加入含有各组药物和纳米材料的新鲜培养基，再培养4小时。随后，用PBS缓慢清洗细胞，所有激光处理组使用功率强度为1.5W/cm2的808nm激光照射10分钟。再培养12小时后，用MTT法检测细胞活力。由图11可见，因为Apt-M存在的靶向作用，所以DOX/Ti3C2/Apt-M+Laser治疗组在化疗和光热治疗的联合作用下对MCF-7细胞生长的抑制效果显著优于其他各组。
实施例5
用MCF-7细胞建立裸鼠肿瘤模型，将100μL悬浮在PBS溶液中的MCF-7细胞(5×107细胞/毫升)注射到小鼠皮下。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分为六组(每组n＝5)，并向尾部静脉注射PBS或纳米材料：(1)对照组(PBS)，(2)DOX组(DOX剂量＝3mg/kg)，(3)Ti3C2-PEG+激光组(Ti3C2-PEG剂量＝12mg/kg)，(4)DOX/Ti3C2-PEG+激光组(DOX/Ti3C2-PEG剂量＝12mg/kg)，(5)DOX/Ti3C2/Apt-C+激光组(DOX/Ti3C2/Apt-C剂量＝12mg/kg)，(6)DOX/Ti3C2/Apt-M+激光组(DOX/Ti3C2/Apt-M剂量＝12mg/kg)。4小时后，用808nm激光(1.5W/cm2)照射(3)、(4)、(5)和(6)组小鼠肿瘤10min。每隔两天测量并记录肿瘤大小和小鼠体重，肿瘤体积由以下等式确定：肿瘤体积＝(肿瘤长度)×(肿瘤宽度)2/2。由图13、图14和图15可见，DOX/Ti3C2/Apt-M+激光治疗组的小鼠肿瘤体积被有效抑制，表明在主动靶向作用下，联合化疗和光热治疗可以获得更好的治疗效果。
实施例6
一种纳米靶向载药复合物，以Ti3C2基MXenes为载体，在其表面负载抗癌药物阿霉素，负载量为14.46wt.％，并在其表面偶联能识别细胞表面特异性蛋白的Apt，使其具有靶向能力。
一种纳米靶向载药复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，少层Ti3C2纳米材料的制备：室温下将1.0gTi3AlC2浸入在20mL40％氟化氢水溶液中搅拌3d。通过离心收集多层Ti3C2(M-Ti3C2)沉淀物，并用水洗涤数次，直到HF被去除。然后，将M-Ti3C2沉淀物分散在20mLTPAOH水溶液(25wt.％)中，并在室温下搅拌3d。在超声处理15min后，获得少层Ti3C2(F-Ti3C2)纳米片，然后在3500rpm下离心60min。将制备的F-Ti3C2纳米片分散在去离子水中并在4℃下储存。
步骤2，抗癌药物的负载：将F-Ti3C2纳米片(2.5mL，1.0mg/mL)缓慢添加到DOX水溶液(2.5mL，0.15mg/mL)中，并在黑暗中搅拌过夜。将DOX/Ti3C2离心并用去离子水洗涤三次以去除多余的DOX。
步骤3，PEG表面改性：用COOH-PEG-COOH修饰DOX/Ti3C2纳米片的表面，将DOX/Ti3C2水溶液(2.5mL，1.0mg/mL)缓慢添加到COOH-PEG-COOH溶液(2.5mL，10.0mg/mL)中，并在黑暗中搅拌6小时。通过离心(12000rpm，10min)收集聚乙二醇化的DOX/Ti3C2纳米片(DOX/Ti3C2-PEG)，并用水洗涤两次以去除多余的PEG。
步骤4，Apt的偶联：用EDC·HCl(500μL，500mM)和NHS(500μL，100mM)活化DOX/Ti3C2-PEG(1.0mL，2.0mg/mL)纳米片，在磁搅拌下进行30分钟的反应，通过离心获得活化的DOX/Ti3C2-PEG纳米片，随后洗涤3～4次。之后，将Apt(4OD)在85℃下变性10分钟，然后在冰浴中重新折叠10分钟。活化的DOX/Ti3C2-PEG纳米片在振荡条件下与Apt反应5小时，然后离心并用水洗涤3次，以获得Apt改性的DOX/Ti3C2/Apt-M纳米材料。
实施例7
一种纳米靶向载药复合物，以Ti3C2基MXenes为载体，在其表面负载抗癌药物阿霉素，负载量为47.15wt.％，并在其表面偶联能识别细胞表面特异性蛋白的Apt，使其具有靶向能力。
一种纳米靶向载药复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，少层Ti3C2纳米材料的制备：室温下将1.0gTi3AlC2浸入在20mL40％氟化氢水溶液中搅拌3d。通过离心收集多层Ti3C2(M-Ti3C2)沉淀物，并用水洗涤数次，直到HF被去除。然后，将M-Ti3C2沉淀物分散在20mLTPAOH水溶液(25wt.％)中，并在室温下搅拌3d。在超声处理15min后，获得少层Ti3C2(F-Ti3C2)纳米片，然后在3500rpm下离心60min。将制备的F-Ti3C2纳米片分散在去离子水中并在4℃下储存。
步骤2，抗癌药物的负载：将F-Ti3C2纳米片(2.5mL，1.0mg/mL)缓慢添加到DOX水溶液(2.5mL，0.5mg/mL)中，并在黑暗中搅拌过夜。将DOX/Ti3C2离心并用去离子水洗涤三次以去除多余的DOX。
步骤3，PEG表面改性：用COOH-PEG-COOH修饰DOX/Ti3C2纳米片的表面，将DOX/Ti3C2水溶液(2.5mL，1.0mg/mL)缓慢添加到COOH-PEG-COOH溶液(2.5mL，10.0mg/mL)中，并在黑暗中搅拌6小时。通过离心(12000rpm，10分钟)收集聚乙二醇化的DOX/Ti3C2纳米片(DOX/Ti3C2-PEG)，并用水洗涤两次以去除多余的PEG。
步骤4，Apt的偶联：用EDC·HCl(500μL，500mM)和NHS(500μL，100mM)活化DOX/Ti3C2-PEG(1.0mL，2.0mg/mL)纳米片，在磁搅拌下进行30分钟的反应，通过离心获得活化的DOX/Ti3C2-PEG纳米片，随后洗涤3～4次。之后，将Apt(20OD)在85℃下变性10分钟，然后在冰浴中重新折叠10分钟。活化的DOX/Ti3C2-PEG纳米片在振荡条件下与Apt反应5小时，然后离心并用水洗涤3次，以获得Apt改性的DOX/Ti3C2/Apt-M纳米材料。
以上实施例中，Apt-M和Apt-C的序列如下：
Apt-M序列为：
NH2-(CH2)6-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGTTTTTTTTTT；
Apt-C序列为：
NH2-(CH2)6-ATTGCACTTACTATATTGCACTTACTATATTGCAC。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上说明仅为本发明的较佳实施例，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (6)

1.一种纳米靶向载药复合物，其特征在于，以Ti3C2纳米材料为载体，在其表面负载抗癌药物，并在其表面偶联能识别细胞表面特异性蛋白的核酸适体。
2.根据权利要求1所述的一种纳米靶向载药复合物，其特征在于，所述Ti3C2纳米材料粒径为80～200nm。
3.根据权利要求1所述的一种纳米靶向载药复合物，其特征在于，所述抗癌药物为阿霉素，负载量为Ti3C2纳米材料的15wt.％～50wt.％。
4.根据权利要求1所述的一种纳米靶向载药复合物的制备方法，其特征在于，所述核酸适体通过共价结合的方法偶联至Ti3C2纳米材料表面。
5.一种权利要求1所述纳米靶向载药复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，Ti3C2纳米材料的制备：以Ti3AlC2为原料，通过HF酸刻蚀Ti3AlC2材料，再利用四丙基氢氧化铵进行插层分散，制备少层Ti3C2纳米材料。
步骤2，抗癌药物的负载：利用静电相互作用将阿霉素负载至Ti3C2纳米材料上，制备阿霉素/Ti3C2；
步骤3，PEG表面改性：利用双羧基PEG与步骤2中制备的阿霉素/Ti3C2进行混合搅拌反应，制备阿霉素/Ti3C2-PEG；
步骤4，核酸适体的偶联：使用EDC/NHS试剂通过共价结合的方法将核酸适体偶联至阿霉素/Ti3C2-PEG表面，即可制得纳米靶向载药复合物。
6.一种权利要求1所述纳米靶向载药复合物的制备方法，其特征在于，应用在制备对肿瘤进行光热治疗与化疗联合治疗的药物上。
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CN116650665A (zh) * 2023-06-06 2023-08-29 中山大学附属第八医院（深圳福田） 一种纳米靶向载药复合物及其制备方法和在防治血管钙化中的应用

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