CN102973512A - 负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体为负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法。本发明通过Maillard反应，将葡聚糖-叶酸和葡聚糖同时接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物；然后在酸性条件下混合阿霉素和白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的水溶液，调整溶液pH值以后加热制备得稳定的具有叶酸受体靶向功能的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子。本发明得到的负载阿霉素的白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子，阿霉素的包埋量和包埋效率分别可以达到14%和90%以上；动态光散射结果表明纳米粒子的水合半径在14～100nm之间并保持长期稳定；透射电镜结果表明纳米粒子具有类似球形的外貌并且具有很好的分散性。该纳米粒子可在靶向输送药物方面广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法和应用。
背景技术
在癌症化疗中面临的一个主要问题是化疗药物缺乏对肿瘤细胞或组织的选择性或靶向性，这样药物容易对正常的细胞和组织造成损害。阿霉素（doxorubicin, DOX）属蒽环类抗肿瘤药物，具有抗瘤谱广、抗瘤活性强的特点，在临床上广泛用于治疗多种恶性肿瘤。但是阿霉素的半衰期短，对正常细胞和组织，特别是心脏、神经、骨髓产生严重毒副作用，从而限制了其在临床上的使用[Minotti, G., et al., Pharmacological Reviews, 2004. 56: p. 185-229.]，因此，肿瘤靶向输送阿霉素在治疗中是必要的。叶酸由于分子量小，免疫原性低，易于修饰，稳定性好，与叶酸受体的结合能力强等优点[Leamon, C. P., et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2004. 56: p. 1127–1141.]，因而被广泛地修饰在负载抗肿瘤药物纳米粒子的表面，使其具有肿瘤主动靶向的功能。通过肿瘤表面过度表达的叶酸受体与叶酸的识别、结合和所调节的內吞作用，可以降低抗肿瘤药物对正常组织的伤害，提高药物的抗肿瘤效果[Lu, Y., et al., Journal of Controlled Release, 2003. 91: p. 17–29.; Lu, Y., et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2004. 56: p. 1161–1176.]。
由白蛋白制备的纳米粒子，因具有良好的生物相容性、生物降解性和理想的药代动力学而被广泛地研究作为抗癌药物的载体。目前已经有一些关于白蛋白和阿霉素纳米粒子的专利公开和文章发表。在有关的专利中，有的是通过超声雾化方法制备的白蛋白纳米粒子，具有被巨噬细胞吞噬而到达肝和脾的特点[中国专利申请号：200910066561]；有的是通过水包油或者油包水的方法制备白蛋白–阿霉素纳米粒子[中国专利申请号：02114356.0]；有的是通过共价键连接阿霉素到白蛋白上 [中国专利申请号：200680034375.3]；也有的是通过超声波、微流化以及高压均质技术将白蛋白结合到阿霉素脂质囊泡上 [中国专利申请号：200810147342.0]，或者将白蛋白水溶液和阿霉素有机溶液进行乳化制备的[200810147344.X]；另外，还有利用白蛋白和小分子糖—半乳糖复合物制备的阿霉素纳米粒子[中国专利申请号：200410046650.6，200410046676.0，200680034375.3]。到目前为止，我们还没有发现表面接有叶酸同时负载阿霉素的白蛋白纳米粒子的报道。
在载阿霉素的纳米粒子表面接有葡聚糖可以使纳米粒子避免被巨噬细胞吞噬而成功地输送到靶向病灶[Liu, Z.G., et al., Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2007. 83A: p. 806-812.; Couvreur, P., et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004. 58: p. 327-341.; Labarre, D., et al., Pharmaceutical Research, 1998. 15: p. 1046-1050.]。除此而外，在载药纳米粒子的表面修饰葡聚糖还可以增加纳米粒子在水溶液中的稳定性。到目前为止，我们还没有发现表面接有葡聚糖和葡聚糖-叶酸同时负载阿霉素的白蛋白纳米粒子的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分散性好，稳定性好，具有肿瘤靶向释放药物功能的负载阿霉素的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法和应用。
本发明提供的负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂，是一种以葡聚糖和葡聚糖-叶酸为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子溶液。
所得到的纳米粒子溶液在肿瘤靶向输送药物的应用。
本发明提供的负载阿霉素的白蛋白纳米粒子制剂的制备方法，具体步骤如下：
（1）在无水二甲基亚砜（DMSO）溶液中以4-二甲氨基吡啶（DMAP）为催化剂和N,N’二环己基碳二亚胺（DCC）为偶合剂，通过酯化反应将叶酸（FA）接枝到葡聚糖（DEX）分子上，得到葡聚糖-叶酸共价复合物；
（2）通过Maillard反应，将葡聚糖-叶酸和葡聚糖同时接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物；（具体可按照专利号为2007100400288提出的方法，通过Maillard反应制备白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物；Maillard反应过程为：将葡聚糖-叶酸共价复合物和自由葡聚糖加入到白蛋白溶液中，将溶液混合均匀以后调节pH值，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中进行Maillard反应后得到BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物）；
（3）负载阿霉素：在酸性条件下混合阿霉素和白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的水溶液，调节混合溶液的pH在6.8～8.8之间，然后将混合溶液加热，使白蛋白变性并发生分子间交联，从而将阿霉素固定在纳米粒子的内部，共价连接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-叶酸复合物组成纳米粒子的外壳。本发明利用阿霉素在pH改变条件下自身的疏水性发生变化以及阿霉素与白蛋白之间的静电和疏水作用，形成以白蛋白和阿霉素为核的纳米复合物；最后将混合溶液加热，使白蛋白变性并发生分子间交联，从而将阿霉素固定在纳米粒子的内部。加热温度和/或者加热时间的增加将使白蛋白的交联程度增加因而导致阿霉素的释放速率降低。一般加热温度在 60℃以上（优选为60℃--100℃），加热时间至少30分钟（优选为30—1000分钟）。共价连接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-叶酸复合物组成了纳米粒子的外壳，使得纳米粒子在水溶液中保持稳定。
本发明的制备条件是：
（1）葡聚糖的分子质量从2000到100000；
（2）白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是动物白蛋白，如牛血清白蛋白；
（3）在葡聚糖-叶酸复合物中，叶酸的摩尔接枝度为1% ～ 10%之间；
（4）在制备白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物的Maillard反应中，葡聚糖-叶酸复合物与葡聚糖的摩尔比在0.005:1 ～ 2:1之间，白蛋白与总葡聚糖（包括葡聚糖-叶酸复合物和单独的葡聚糖）的摩尔比在5:1 ～ 1:20之间；
（5）在负载阿霉素的过程中，白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物中的白蛋白浓度在0.5～50 mg/mL，阿霉素与白蛋白的质量比在10:1 ～ 1:10之间。
本发明可以得到高效负载阿霉素的白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子，阿霉素的包埋量和包埋效率分别可以达到14%和90%以上。动态光散射结果表明纳米粒子的水合半径在14～100 nm之间并保持长期稳定（附图1）。透射电镜结果表明纳米粒子具有类似球形的外貌并且具有很好的分散性（附图2）。
在药物释放方面，与自由阿霉素相比，载阿霉素纳米粒子具有明显的缓释性质（附图3和附图4），纳米粒子在pH 7.4条件下释放阿霉素的速率很小，而降低pH值可以显著增加阿霉素的释放速率。由于肿瘤细胞的pH值低于正常细胞，纳米粒子的这个性质有利于其进入肿瘤细胞以后释放阿霉素。
荷瘤小鼠的实验表明，接有叶酸的阿霉素纳米粒子在肿瘤抑制和延长荷瘤小鼠生命方面具有明显的优势：肿瘤抑制率达到88.9%，生命延长率达73.8%。
附图说明
图 1. 新鲜制备和存放35天的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子溶液的水合半径分布。
图 2. 阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子经磷钨酸溶液负染以后的电子显微镜照片。
图3. 自由阿霉素（free DOX）、加热30分钟（min）和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖（DOX/BSA-DEX）纳米粒子及加热30分钟和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸（DOX/BSA-DEX-FA）纳米粒子在PBS（0.01 mol/L 7.4磷酸缓冲液 + 0.15 mol/L NaCl）中累计释放阿霉素曲线。
图4. 自由阿霉素（free DOX）、加热30分钟（min）和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖（DOX/BSA-DEX）纳米粒子及加热30分钟和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸（DOX/BSA-DEX-FA）纳米粒子在0.1 mol/L pH 5.0醋酸缓冲液中累计释放阿霉素曲线。
图5. 叶酸（A）、葡聚糖（B）和葡聚糖-叶酸复合物（C）的FTIR光谱图。
图6. 叶酸（A）、葡聚糖（B）和葡聚糖-叶酸复合物（C）在DMSO-d6溶剂中的1H NMR图。
具体实施方式
实施例1. 称取叶酸（FA）0.4586g、N,N’二环己基碳二亚胺（DCC）0.2144g和4-二甲氨基吡啶（DMAP）0.1271g置于烧瓶中，加入25mL 无水二甲基亚砜（DMSO）溶液，在30℃和氮气的气氛下避光活化叶酸的羧基30分钟，然后加入分子量为10 kDa的葡聚糖（DEX）1.0012g，反应20小时。反应结束后先抽滤除去沉淀，然后用截留分子量为3500的透析袋对10 mmol/L pH 7.4磷酸缓冲液透析，除去没有反应的叶酸。然后再对去离子水透析，透析期间离心（12000rpm，30min）除去沉淀。最后将纯化后的葡聚糖-叶酸（DEX-FA）复合物冻干备用。所合成的DEX-FA共价复合物用傅立叶转换红外光谱（FTIR，附图5）及核磁共振（1H NMR，附图6）对其结构进行了表征。通过对叶酸分子中苯环上7.63ppm位置的两个H与葡聚糖异头碳上4.9ppm位置的一个H进行峰面积比较，得到叶酸的摩尔取代度为5.0%，即每100个葡萄糖单元中有5个连接了叶酸。
实施例2. 将牛血清白蛋白（BSA）用去离子水溶解，配制成10 mg/mL的白蛋白溶液。然后将实施例1制备的10 kDa葡聚糖-叶酸复合物和10 kDa自由葡聚糖加入到白蛋白溶液中，白蛋白与总的葡聚糖的摩尔比为1:4。葡聚糖-叶酸和自由葡聚糖的摩尔比在0:1 ～ 2:1区间，将溶液混合均匀以后调节pH值到8.0，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中（容器内相对湿度为79%），在60 ℃下进行48小时Maillard反应后得到BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物。
将BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1:4，白蛋白的最终浓度是5 mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH溶液调节混合溶液的pH到7.4形成阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80℃水浴中加热60分钟，就可以得到阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子水溶液。
纳米粒子的水合半径（Rh）和多分散系数（PDI）通过动态光散射分析得到，测量时溶液被稀释到白蛋白浓度为0.1 mg/mL。在纳米粒子溶液中的自由阿霉素通过超滤与纳米粒子分离（超滤截留分子量50 kDa），超滤液中的阿霉素浓度利用紫外-可见光谱在480 nm的吸收测定。阿霉素在纳米粒子中的包埋效率和包埋量通过以下公式计算：
。
表1的结果表明，在葡聚糖-叶酸与自由葡聚糖的摩尔比为0:1 ~ 1:2.5范围内、通过Maillard反应得到的白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物可以与阿霉素形成稳定的纳米粒子。阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子的平均水合半径约为43nm（水合直径约为86nm），比阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子的平均水合半径（34nm）稍大，两种纳米粒子对阿霉素的包埋量和包埋效率都分别达到14%和90%以上。
在Maillard反应中，当进一步增加葡聚糖-叶酸与自由葡聚糖的摩尔比到1:1以上时，所得到的白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的溶解性不好，原因是叶酸分子之间可以通过氢键和stacking相互作用形成聚集体 [Ciuchi, F., et al., Journal of the American Chemical society, 1994. 116: p.7064-7071.]。为了得到分散很好的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子，在Maillard反应中，除了葡聚糖-叶酸共价复合物以外，必须加入足够的自由葡聚糖阻止叶酸分子之间的聚集。因此，所得到的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子表面是由葡聚糖-叶酸和葡聚糖共同组成的。
表1. 不同的葡聚糖-叶酸复合物与葡聚糖的摩尔比对载阿霉素纳米粒子的半径（Rh）、分散性（PDI）、以及对阿霉素的包埋量（LA）、包埋效率（LE）和长期稳定性的影响。
实施例3. 将牛血清白蛋白（BSA）用去离子水溶解，配制成10 mg/mL的白蛋白溶液。然后将实施例1制备的10 kDa葡聚糖-叶酸复合物和10 kDa自由葡聚糖加入到白蛋白溶液中，白蛋白与总的葡聚糖的摩尔比为1:4。葡聚糖-叶酸和自由葡聚糖的摩尔比为1:5，将溶液混合均匀以后调节pH值到8.0，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中（容器内相对湿度为79%），在60 ℃下进行48小时Maillard反应后得到BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物。
将BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1:4，白蛋白的最终浓度是5 mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH溶液调节混合溶液的pH到7.4形成阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80 ℃水浴中加热30或者70分钟，就可以得到阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子水溶液。
在Maillard反应的时候不加入葡聚糖-叶酸复合物，利用上面同样的方法制备没有叶酸的阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子。
增加加热时间可使白蛋白变性或聚集/凝胶化加剧，从而可获得交联度较高的纳米粒子。表2的结果表明加热时间对载药纳米粒子的半径及包埋量和包埋效率影响不大。
载药纳米粒子在体外释放阿霉素按照以下方法测定：取0.5mL阿霉素纳米粒子溶液置于透析袋中（截留分子量为14 kDa），然后将透析袋浸入24.5mL释放介质溶液中，在37 ℃以100 rpm的速度磁力搅拌，每隔一定时间从介质溶液中取出5 mL样品，同时加入相同体积的新鲜释放介质。样品中阿霉素的含量通过紫外-可见光谱在480 nm的吸收测定。体外释放的结果见附图3和附图4。结果表明，阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子与自由阿霉素相比表现出明显的缓释性质，并且其在pH 5.0条件下的释放速率明显大于在pH 7.4条件下的释放速率（附图4），这个性质将有利于纳米粒子进入肿瘤细胞以后释放阿霉素，从而达到有效降低阿霉素毒副作用的目的。同时从附图3和附图4可以看出，加热时间越长，释放速率越慢。从而可以通过控制加热时间来调节药物的释放速率。
表2. 不同加热时间对阿霉素纳米粒子的水合半径（Rh）、分散性（PDI）、阿霉素的包埋量（LA）和包埋效率（LE）的影响。
实施例4. 将人血清白蛋白（HSA）用去离子水溶解，配制成10 mg/mL的白蛋白溶液。然后将葡聚糖（62 kDa）加入到白蛋白溶液中，葡聚糖与白蛋白的摩尔比为1:2。溶液混合均匀以后调节其pH值到8.0，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中（容器内相对湿度为79%），在60 ℃下进行Maillard反应48小时以后得到白蛋白-葡聚糖共价复合物。
将得到的人血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1:2～1:4，人血清白蛋白的最终浓度是5～20 mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节溶液到pH 7.4形成阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80 ℃水浴中加热60分钟得到阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子水溶液。
表3的结果表明在很宽的质量比和浓度范围内都可以得到稳定的纳米粒子，阿霉素的最高包埋量和包埋效率分别可以达到30%和90%以上。
表3. 在不同人血清白蛋白最终浓度和不同阿霉素与白蛋白质量比条件下制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子的水合半径（Rh）、分散性（PDI）以及对阿霉素的包埋量（LA）和包埋效率（LE）的影响。
实施例5. 将62 kDa葡聚糖与牛血清白蛋白（BSA）按照摩尔比为1:2混合并冻干后进行48小时Maillard反应。所得到的BSA-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与BSA的质量比为1:2，BSA的最终浓度是5mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节混合溶液的pH到7.4形成阿霉素/BSA-葡聚糖纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80 ℃水浴中加热60分钟得到阿霉素/BSA-葡聚糖纳米粒子水溶液。所得到的纳米粒子的水合半径约为100 纳米（水合直径约为200纳米），阿霉素的包埋效率达到90%以上。
取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1:4稀释（细胞浓度约为1～2 × 107个/mL），每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL，随机分组，每组10只。设计空白对照组，阿霉素原料（5 mg/kg）组，阿霉素/BSA-葡聚糖纳米粒子（阿霉素8mg/kg）组，阿霉素/BSA-葡聚糖纳米粒子（阿霉素12mg/kg）组。接种后第3日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重每天给药，共给药5次。接种后第11日称体重后脱臼处死小鼠，解剖取瘤块，称瘤重，计算各组平均瘤重。对照组的平均瘤重应在1g以上。实体瘤的疗效评价以瘤重抑制百分率IR表示，将给药组的平均瘤重WT与对照组的平均瘤重WC按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率IR (%) = (1-WT/WC) × 100% 。
表4的结果表明分子量较高的葡聚糖（62 kDa）形成的纳米粒子对荷瘤小鼠的肿瘤抑制率较自由的阿霉素低，8mg/kg阿霉素剂量的纳米粒子组的肿瘤抑制率只有自由阿霉素组（5mg/kg）肿瘤抑制率的55.7%。虽然高剂量的纳米粒子组（12mg/kg）的肿瘤抑制率接近自由阿霉素组，但从小鼠的体重和存活的情况来看，高剂量时纳米粒子的毒副作用也很大。
表4. 阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子对荷H22瘤小鼠瘤重抑制结果。
与对照组比较：*P < 0.001, **P < 0.01。
实施例6. 将BSA用去离子水溶解，配制成10 mg/mL溶液。然后将实施例1制备的10 kDa葡聚糖-叶酸复合物和5 kDa自由葡聚糖加入到BSA溶液中，其中10 kDa葡聚糖-叶酸复合物与5 kDa自由葡聚糖的摩尔比为1:6，BSA与总葡聚糖的摩尔比为1:7（即10 kDa葡聚糖-叶酸复合物与BSA的摩尔比为1:1，5 kDa自由葡聚糖与BSA的摩尔比为6:1）。将溶液混合均匀以后调节其pH值到8.0，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中（容器内相对湿度为79%），在60 ℃下进行Maillard反应48小时后得到BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物。用去离子水将BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物溶解，加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1:4，白蛋白的最终浓度是5 mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节溶液到pH7.4，然后将此纳米复合物溶液置于80 ℃水浴中加热30分钟，得到阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子水溶液。
在Maillard反应的时候不加入葡聚糖-叶酸复合物，利用上面同样的方法制备没有叶酸的阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子。
取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1:4稀释（细胞浓度约为1～2×107个/mL），每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL，随机分组，每组10只。设空白对照组，阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子(阿霉素10mg/kg)组，阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子（阿霉素10mg/kg）组和阿霉素原料5mg/kg组。接种后第三日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重每天给药，共给药6次。接种后第11日称重后脱臼处死小鼠，解剖取瘤块，称瘤重，计算各组平均瘤重。对照组的平均瘤重应在lg以上。实体瘤的疗效评估以瘤重抑制百分率IR表示，将给药组的平均瘤重WT与对照组的平均瘤重WC按下列公式计算抑瘤率：
抑瘤率IR (%) = (1-WT/WC) × 100% 。
表5的结果表明，5 kDa葡聚糖制备的纳米粒子与62 kDa葡聚糖制备的纳米粒子（实施例5）相比，抗肿瘤能力有较大的提高；同时接有叶酸的载药纳米粒子的肿瘤抑制率更高，达到自由阿霉素的95.8%。从表5还可以看出，自由阿霉素组的小鼠平均体重下降较多，说明其毒副作用较大；而纳米粒子组的体重几乎没有下降。表明其毒副作用较小。
表5. 阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子对荷H22瘤小鼠瘤重抑制结果。
与对照组比较：*P < 0.001。
实施例7. 将实施例3制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子进行小鼠体内肿瘤抑制实验，同时制备没有叶酸的阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子进行比较。取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1:4稀释（细胞浓度约为1～2 × 107个/mL），每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL，随机分组，每组10只。设空白对照组，空白载体组，载药纳米粒子分别为阿霉素10mg/kg组和阿霉素5mg/kg组，阿霉素原料5mg/kg组。接种后第3日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重每天给药，共给药6次。接种后第12日称体重后脱臼处死小鼠，解剖取瘤块，称瘤重，计算各组平均瘤重。对照组的平均瘤重应在1g以上。实体瘤的疗效评价以瘤重抑制百分率IR表示，将给药组的平均瘤重WT与对照组的平均瘤重WC按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率IR (%) = (1-WT/WC) × 100%
表 6 的结果说明，和生理盐水相比较，白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物，也就是空白载体并且也加热70分钟以后既没有抑制肿瘤的效果也没有毒副作用。在给药剂量为5mg/kg的条件下，加热70分钟制备的纳米粒子的肿瘤抑制率都比自由阿霉素低。在剂量为10mg/kg时，阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子的肿瘤抑制率提高到79.7%，但与自由阿霉素的肿瘤抑制率89.3%（5 mg/kg剂量）相比还是低了很多。在相同的给药剂量下，阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子的肿瘤抑制率相比于没有接叶酸的纳米粒子稍高一点。
表6的结果表明，在给药剂量10mg/kg时，加热30分钟的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子的肿瘤抑制率达到了88.9%，几乎与自由阿霉素的肿瘤抑制率89.3%（5mg/kg剂量）相当。同时小鼠的平均体重为19.1g，高于自由阿霉素组的小鼠平均体重16.9g，这结果说明加热30分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子有较好的肿瘤抑制率。而加热70分钟可能导致叶酸部分分解，从而使阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子的肿瘤抑制率降低。
表6. 自由阿霉素、空白载体及载阿霉素纳米粒子治疗荷H22瘤小鼠的肿瘤抑制效果。
与生理盐水组1比较：*P < 0.01,
与生理盐水组2比较：**P < 0.001。
实施例8. 将实施例3制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子进行荷瘤小鼠延命实验，同时制备没有叶酸的阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子进行比较。肝癌H22腹水用生理盐水以1:4稀释（细胞浓度约为1～2×107个/mL），每只小鼠腹腔接种0.2 mL，随机分组，每组10只。第4日开始尾静脉注射给药，每4日给药1次。每次给药前称量体重，按实际体重给药，试验期间逐日记录小鼠的死亡情况。分别记录对照组和治疗组的平均生存时间，按照下面的公式计算生命延长率SR：SR (%) = (T/C - 1) × 100%，式中T表示阿霉素组小鼠的平均存活时间，C表示空白组小鼠的平均存活时间。
延命实验所用的阿霉素纳米粒子是通过加热30分钟制备的。表7的结果表明当给药剂量为5mg/kg时，阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子组的小鼠平均生存时间比自由阿霉素组低很多，而阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子组的小鼠平均生存时间稍低于自由阿霉素组。当给药剂量增加到10mg/kg时，阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子组的小鼠平均生存时间显著增加，其生命延长率达到了73.8%，分别是自由阿霉素组和阿霉素/白蛋白-葡聚糖纳米粒子组的2.6倍和1.6倍。表7的结果进一步证明了在纳米粒子表面接上叶酸以后可以促进阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子聚集到肿瘤部位，减少毒副作用，提高抗肿瘤和生命延长效果。
表7. 自由阿霉素和阿霉素纳米粒子治疗荷H22瘤小鼠的生命延长效果。
与生理盐水组比较：*P < 0.05, **P > 0.05, ***P < 0.005。
Claims (6)
1. 一种负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）在无水二甲基亚砜溶液中以4-二甲氨基吡啶为催化剂，以N,N’二环己基碳二亚胺为偶合剂，通过酯化反应将叶酸接枝到葡聚糖分子上，得到葡聚糖-叶酸共价复合物；
（2）通过Maillard反应，将葡聚糖-叶酸和葡聚糖同时接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物；
（3）负载阿霉素：在酸性条件下混合阿霉素和白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的水溶液，调节混合溶液的pH在6.8～8.8之间，然后将混合溶液加热，使白蛋白变性并发生分子间交联，从而将阿霉素固定在纳米粒子的内部，共价连接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-叶酸复合物组成纳米粒子的外壳。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其他动物血清白蛋白。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的葡聚糖的分子量在2000～100000之间。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
（1）在葡聚糖-叶酸共价复合物中，叶酸的摩尔接枝度为1% ～ 10%；
（2）在Maillard反应中，葡聚糖-叶酸共价复合物与葡聚糖的摩尔比在0.005:1～2:1之间，白蛋白与总葡聚糖的摩尔比在5:1～1:20之间；
（3）在负载阿霉素的过程中，白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物中的白蛋白浓度为0.5～50 mg/mL，阿霉素与白蛋白的质量比为10:1～1:10，加热温度在60 ℃～100 ℃，加热时间是30～1000分钟。
5. 由权利要求1-4所述方法制备得到的负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂，是一种以葡聚糖和葡聚糖-叶酸为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子的溶液。
6. 根据权利要求5所述的负载阿霉素的白蛋白纳米粒子制剂在靶向输送药物方面的应用。
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