CN101653611B - 一种白蛋白-阿霉素纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体为一种具有双多糖外壳的白蛋白-阿霉素纳米制剂及其制备方法和应用。该纳米制剂是以壳聚糖和葡聚糖为外壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子的溶液。其制备步骤包括将壳聚糖和白蛋白-葡聚糖共价复合物混合，然后加热，形成以白蛋白为核，葡聚糖和壳聚糖为壳的纳米粒子溶液；再在酸性条件下混合上述纳米粒子溶液和盐酸阿霉素溶液，在一定的pH值下，通过扩散将阿霉素包裹在纳米粒子内部。本发明中白蛋白的肿瘤靶向性质可以提高阿霉素的疗效并降低阿霉素的毒副作用。纳米粒子表面的壳聚糖也具有抗肿瘤的作用并且可以增强免疫力，葡聚糖可以使纳米粒子避免被巨噬细胞快速清除而增加其到达肿瘤的机会。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种阿霉素纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是直接威胁人类健康的重大疾病。许多有效的化疗药物因为对癌细胞、癌组织缺乏选择性或靶向性，容易损害正常的组织和细胞，因而严重限制了这些药物在肿瘤治疗中的应用。阿霉素是一个广谱抗肿瘤药物，但是在有效剂量下显示了严重的不良反应[J.M.Llovet，Journal of Gastroenterology 40(2005)225-235]，其毒害效应主要产生在心脏、骨髓和肠道[G.Mazue et al.，International Journal of Oncology 7(1995)713-726]。研究表明肿瘤组织有直径在100nm到1000nm的微孔，而在绝大多数正常的健康组织中，细胞间的连接缝隙小于10nm。因此，通过制备介于这两种尺寸之间的载药纳米粒子，就可能把治疗药物选择性地输送到肿瘤组织中，纳米药物在肿瘤组织中的这种增强的渗透和滞留效应被称为EPR效应[H.Maeda et al.，Journal of Controlled Release 65(2000)271-284]。通常，利用大分子制备的纳米粒子具有体内稳定，药物不容易渗漏，易于修饰，化学组成易于调控等优点。而在纳米粒子的表面修饰多糖，如茁霉多糖(pullulan)、壳聚糖、葡聚糖等可以增加纳米粒子在体内的循环时间，使纳米药物避免被巨噬细胞吞噬而成功地输送到靶向病灶[Z.Liu et al.，Journal of Biomedical Materials Research Part A，83(2007)806-812；C.Lemarchand et al.，European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58(2004)327-341；C.Passirani et al.，Pharmaceutical Research 15(1998)1046-1050]。此外，壳聚糖及其衍生物具有抗肿瘤的作用，其抗肿瘤机制既可直接作用于肿瘤细胞，干扰细胞代谢，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，又可以通过增强机体免疫功能，发挥抗肿瘤作用[曹俊等，中国生化药物杂志，26(2005)126-127]。而利用白蛋白制备的纳米粒子除了利用EPR效应以外，还利用细胞膜上的白蛋白受体Gp60及细胞膜穴样内凹(caveolae)，以及肿瘤组织中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)的作用，促进药物进入肿瘤细胞内，增加化疗疗效[M.J.Hawkins et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 60(2008)876-885]。
目前已经有一些关于白蛋白和阿霉素纳米粒子的专利申请。在这些有关的专利中，有的是通过水包油或者油包水的方法制备白蛋白-阿霉素纳米粒子[中国专利申请号：02114356.0]；有的是通过共价键连接阿霉素到白蛋白上[中国专利申请号： 200680034375.3]；也有的是通过超声波、微流化以及高压均质技术将白蛋白结合到阿霉素脂质囊泡上[中国专利申请号：200810147342.0]，或者将白蛋白水溶液和阿霉素有机溶液进行乳化制备的[200810147344.X]。另外，还有利用白蛋白和小分子糖-半乳糖复合物制备阿霉素纳米粒子的专利[中国专利申请号：200410046650.6，200410046676.0，200680034375.3]。这种纳米粒子具有较好的肿瘤靶向作用，但是不具有在体内长循环的性质。
到目前为止，我们还没有发现关于以葡聚糖和壳聚糖为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可增强肿瘤靶向作用，提高阿霉素疗效，显著降低阿霉素毒副作用的阿霉素纳米制剂及其制备方法和应用。
本发明提供阿霉素纳米制剂是一种利用白蛋白-葡聚糖共价复合物、壳聚糖和阿霉素制备得到的以壳聚糖和葡聚糖为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子溶液。
本发明的制备步骤如下：
将壳聚糖与白蛋白-葡聚糖共价复合物以一定质量比混合，壳聚糖的分子量在20～500kDa之间，壳聚糖与白蛋白的质量比在0.05～5之间；调节pH到4.5～6.5范围内，使壳聚糖与白蛋白形成静电复合物。然后将上述溶液加热至60℃～100℃，维持1～1000分钟，优选10～100分钟，使白蛋白变性并发生分子间交联，形成以白蛋白为核，葡聚糖和壳聚糖为壳的稳定的纳米粒子溶液。再在酸性条件下混合上述纳米粒子溶液和盐酸阿霉素溶液，壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子溶液中，白蛋白的最终浓度为0.1～50mg/mL，阿霉素与白蛋白的质量比为10∶1～1∶10之间；将混合溶液的pH调到6.2～8.2范围内，利用白蛋白与阿霉素之间的静电和疏水作用，通过扩散的方法将阿霉素包埋在纳米粒子的内部，即得到以白蛋白和阿霉素为核，壳聚糖和葡聚糖为壳的纳米粒子溶液。
本发明中，白蛋白-葡聚糖共价复合物是通过Maillard反应制备获得[中国专利申请号：2007100400288]。白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是动物白蛋白，如牛血清白蛋白。
本发明制备的阿霉素纳米粒子在pH 7.4条件下保持长期稳定，说明葡聚糖存在于纳米粒子的壳层。原子力显微镜结果表明阿霉素纳米粒子具有球型外貌(附图1)，图中纳米粒子的平均粒径为163纳米。ζ-电位的结果表明纳米粒子的表面带有正电荷(附图2)，说明壳聚糖和葡聚糖共同组成了纳米粒子的外壳。通过调节pH值的方法可以将阿霉素高 效地包埋在纳米粒子的内部。与自由阿霉素相比，包埋在纳米粒子内部的阿霉素具有明显的缓释性质(附图3)。纳米粒子在pH 7.4条件下释放阿霉素的速率很小，降低pH值可以显著增加阿霉素的释放速率。由于肿瘤细胞的pH值低于正常细胞，纳米粒子的这个性质有利于其进入肿瘤细胞后释放阿霉素。此外，白蛋白的肿瘤靶向性质可以提高阿霉素的疗效并降低阿霉素的毒副作用。纳米粒子表面的壳聚糖也具有抗肿瘤的作用并且可以增强免疫力，葡聚糖可以使纳米粒子避免被巨噬细胞快速清除而增加其到达肿瘤的机会。本发明制备的纳米制剂可以显著地降低阿霉素的毒副作用，延长荷瘤小鼠的生命达46.8％。
在本发明中，除了pH调节所使用的酸和碱以外，不使用其他的化学试剂，因而是一种绿色的阿霉素纳米制剂的制备方法。
附图说明
图1为阿霉素纳米粒子的原子力显微镜照片。
图2为白蛋白(BSA)、白蛋白-葡聚糖共价复合物(Conjugates)、壳聚糖(Chitosan)，以及纳米粒子(Nanoparticles)在不同pH条件下的ζ-电位。
图3为自由阿霉素(DOX)和阿霉素纳米粒子(DOX-nanoparticles)在体外释放阿霉素的累计释放曲线。释放介质是0.01mol/LpH 7.4磷酸缓冲液和0.2mol/LpH 5.0醋酸缓冲液。
具体实施方式
实施例1.将牛血清白蛋白(BSA)与葡聚糖(62kDa)用去离子水溶解，其摩尔投料比为2∶1，待溶液混合均匀以后调节其pH值到7.1，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重，然后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中(容器内相对湿度为79％)，在60℃下进行Maillard反应24小时后得到白蛋白-葡聚糖共价复合物。将白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，配制白蛋白浓度为1mg/mL的溶液，与壳聚糖(分子量50kDa)的醋酸溶液混合，使得壳聚糖与白蛋白的质量比为1∶10，白蛋白的终浓度为0.5mg/mL。调节混合溶液的pH值以后在80℃加热1小时，即可制得壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。
纳米粒子的粒径和多分散系数通过动态光散射分析得到，测量时溶液被稀释到白蛋白浓度为0.17mg/mL。表1的结果表明在很宽的pH条件下加热壳聚糖与白蛋白-葡聚糖共价复合物都可以得到壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。
表1.在不同pH值下加热壳聚糖与白蛋白-葡聚糖共价复合物溶液对纳米粒子形成的影响。
| pH | 粒径 | 多分散系数 |
| 5.0 | 103±7 | 0.21±0.02 |
| 5.2 | 109±4 | 0.11±0.03 |
| 5.4 | 111±4 | 0.12±0.01 |
| 5.6 | 130±10 | 0.11±0.06 |
| 5.8 | 220±24 | 0.18±0.04 |
| 6.0 | 643±147 | 0.93±0.13 |
实施例2.将进行了24小时Maillard反应后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，加入不同比例的壳聚糖(分子量50kDa)醋酸溶液，然后调节溶液pH至5.6，在80℃加热1小时制备壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。表2的结果表明在一定的壳聚糖与白蛋白质量比的范围内都可以制备壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。
表2.在不同壳聚糖和白蛋白质量比条件下制备的壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。
| 壳聚糖与白蛋白质量比 | 粒径 | 多分散系数 |
| 0 | 187 | 0.13 |
| 0.1 | 127 | 0.14 |
| 0.2 | 131 | 0.22 |
| 0.3 | 131 | 0.24 |
| 0.4 | 139 | 0.26 |
| 1.0 | 377 | 0.37 |
| 1.2 | 410 | 0.27 |
| 1.4 | 429 | 0.40 |
| 1.6 | 459 | 0.42 |
| 1.8 | 510 | 0.38 |
| 2.0 | 476 | 0.41 |
实施例3.将进行了24小时Maillard反应后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，加入壳聚糖(分子量50～190kDa)醋酸溶液，壳聚糖与白蛋白的质量比为1∶10，然后调节溶液pH至5.6，在80℃加热1小时制备壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。
通过这种方法制备的纳米粒子非常稳定，在pH 7.4PBS溶液中经过长时间的放置粒径 几乎不发生变化，说明葡聚糖存在于纳米粒子的外壳，阻止了壳聚糖由于氢键交联而发生的聚集。ζ-电位分析表明(附图2)，所制备的纳米粒子在pH较低时其ζ-电位与单独的壳聚糖相似，说明壳聚糖与葡聚糖共同组成纳米粒子的外壳，而纳米粒子的核由白蛋白组成。
表3.由不同分子量的壳聚糖制备的壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子在PBS缓冲液中的长期稳定性。
实施例4.将进行了24小时Maillard反应后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，加入壳聚糖醋酸溶液，壳聚糖与白蛋白的质量比为1∶10，白蛋白的终浓度为5mg/mL。调节溶液pH至5.6，在80℃加热1小时制备壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。然后将纳米粒子溶液与盐酸阿霉素溶液混合，白蛋白与阿霉素的质量比为1∶1，二者的终浓度分别为4mg/mL。搅拌过夜后，用NaOH调节溶液的pH值并继续搅拌24小时，即可得到包埋阿霉素的纳米粒子。在纳米粒子溶液中的自由阿霉素通过超滤与纳米粒子分离(超滤膜截留分子量30kDa)，超滤液中的阿霉素浓度利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定。阿霉素在纳米粒子中的包埋效率(LE)和包埋量(LA)通过以下公式计算：
表4.不同pH条件对壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子包埋阿霉素的影响。
| pH | 包埋效率(％) | 包埋量(％) |
| 7.4 | 62％ | 42％ |
| 7.9 | 70％ | 48％ |
| 8.2 | 77％ | 52％ |
表4的结果显示增加pH可以增加纳米粒子对阿霉素的包埋，阿霉素的最高包埋效率和包埋量分别可以达到77％和52％。
纳米粒子在体外释放阿霉素按照以下方法测定：取一定量的阿霉素纳米粒子溶液置于透析袋中(截留分子量为14kDa)，然后将透析袋浸入不同释放介质溶液中，在37℃下以100rpm的速度磁力搅拌，每隔一定时间从介质溶液中取出3mL样品，同时加入相同体积的新鲜释放介质。样品中阿霉素的含量通过紫外-可见光谱在480nm的吸收测定。体外释放的结果见附图3。
附图3的结果表明，阿霉素纳米粒子与自由阿霉素相比表现出明显的缓释性质，并且其在pH 5.0条件下的释放速率明显大于在pH 7.4条件下的释放速率，这个性质将有利于纳米粒子进入肿瘤细胞以后释放阿霉素以达到有效降低阿霉素毒副作用的目的。
实施例5.将进行了24小时Maillard反应后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，加入壳聚糖醋酸溶液，壳聚糖与白蛋白的质量比为1∶10，白蛋白的终浓度为5mg/mL。调节溶液pH至5.6，在80℃加热1小时制备壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。然后将纳米粒子溶液与不同比例的盐酸阿霉素溶液混合，混合后白蛋白的终浓度为4mg/mL。搅拌过夜后，用NaOH调节溶液的pH值到7.4并继续搅拌24小时，即可得到包埋阿霉素的纳米粒子。表5的结果表明增加阿霉素的比值可以增加阿霉素的包埋量但是降低其包埋效率。
表5.不同阿霉素与白蛋白质量比对壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子包埋阿霉素的影响。
| 阿霉素与白蛋白质量比 | 包埋效率(％) | 包埋量(％) |
| 1∶4 | 75 | 13 |
| 1∶2 | 57 | 18 |
| 1∶1 | 62 | 42 |
实施例6.将人血清白蛋白(HSA)用去离子水溶解，配制成10mg/mL的白蛋白溶液。然后将分子量为62kDa的葡聚糖加入到白蛋白溶液中，葡聚糖与白蛋白的摩尔投料比为 1∶2。待溶液混合均匀以后调节其pH值到7.10，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重，然后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中(容器内相对湿度为79％)，在60℃下进行Maillard反应48小时以后得到白蛋白-葡聚糖共价复合物。
将得到的人血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，加入壳聚糖醋酸溶液，壳聚糖与白蛋白的质量比为1∶10，白蛋白的终浓度为5mg/mL。调节溶液pH至5.6，在80℃加热1小时制备壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子。然后将纳米粒子溶液与盐酸阿霉素溶液混合，控制白蛋白与阿霉素的质量比为1∶1，混合后白蛋白和阿霉素的终浓度分别为4mg/mL。搅拌过夜后，用NaOH调节溶液的pH值到7.4并继续搅拌24小时，即可得到包埋阿霉素的纳米粒子。用人血清白蛋白制备的阿霉素纳米粒子，其阿霉素的包埋效率为58％，包埋量为40％。
实施例7.用透析的方法将阿霉素纳米粒子溶液中的自由阿霉素除去。取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1∶4稀释(细胞浓度约为1～2×107个/mL)，每只小鼠右腋皮下接种0.2mL，随机分组，每组10只，设空白对照组，阿霉素原料(3mg/kg)组，阿霉素原料(5mg/kg)组，阿霉素纳米粒子(阿霉素3mg/kg)组，阿霉素纳米粒子(阿霉素5mg/kg)组，阿霉素纳米粒子(阿霉素8mg/kg)组。
接种后第3日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重给药，共给药5次。接种后第10日称体重后脱臼处死小鼠，解剖取瘤块，称瘤重，计算各组平均瘤重。实体瘤的疗效评价以瘤重抑制百分率(inhibition rate，IR)表示，将给药组的平均瘤重与对照组的平均瘤重按下列公式计算抑瘤率：
抑瘤率IR(％)＝(1-WT/WC)×100％
其中WT为给药组的平均瘤重，WC为生理盐水对照组的平均瘤重。按公式计算求出肿瘤抑制率并进行t检验。经统计学检验P＜0.05为有效。
表6.阿霉素纳米粒子对荷H22瘤小鼠瘤重抑制的结果。
| 组别 | 动物数目 (始/终) | 平均体重 (始/终) | 瘤重(g) | 抑瘤率％ |
| 空白对照 | 10/10 | 19.9g/25.2g | 3.17±0.58 | - |
| 阿霉素原料 (3mg/kg) | 10/10 | 20.1g/20.9g | 1.78±0.43▲ | 43.85％ |
| 阿霉素原料 (5mg/kg) | 10/10 | 19.7g/15.9g | 0.86±0.22▲▲ | 72.87％ |
| 阿霉素纳米粒子 (阿霉素3mg/kg) | 10/10 | 20.0g/23.9g | 2.28±0.25* | 28.08％ |
| 阿霉素纳米粒子 (阿霉素5mg/kg) | 10/10 | 20.1g/23.1g | 2.11±0.5* | 33.44％ |
| 阿霉素纳米粒子 (阿霉素8mg/kg) | 10/10 | 19.9g/21.9g | 1.69±0.29** | 46.69％ |
与空白对照组比较▲P＜0.01，▲▲P＜0.001，*P＜0.01，**P＜0.001，***P＜0.001。
表6的结果表明，和阿霉素原料组相比，阿霉素纳米粒子组在更高的给药剂量下，小鼠的体重不仅没有降低还有所增加，证明了阿霉素纳米粒子有较小的毒副作用并且有一定的肿瘤抑制效果。
实施例8.用透析的方法将阿霉素纳米粒子溶液中的自由阿霉素除去。取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1∶3(生理盐水∶H22细胞液)稀释，每只小鼠腹腔接种0.2mL，随机分组，每组10只，设空白对照1组，空白对照2组，阿霉素原料(5mg/kg)组，阿霉素纳米粒子(阿霉素12mg/kg)组。
接种后第5日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重给药，共给药5次。试验期间逐日记录动物死亡的情况。分别记录对照组和给药组动物的平均生存时间，按照下列公式计算生命延长率：
生命延长率(％)＝(给药组平均存活天数/对照组平均存活天数-1)×100％
表7.除去自由阿霉素后的阿霉素纳米粒子溶液治疗荷H22瘤小鼠的生命延长效果。
| 组别 | 平均存活天数 | 生命延长率％ |
| 空白对照1 | 10.4±2.17 | |
| 空白对照2 | 10.3±1.77 | |
| 阿霉素原料(5mg/kg) | 11.2±1.69* | 8.74％ |
| 阿霉素纳米粒子(阿霉素12 mg/kg) | 14.8±4.02** | 43.69％ |
与空白对照组比较*P＞0.05，**P＜0.01
表7的结果表明，阿霉素原料(5mg/kg)由于毒性太大，使小鼠体重迅速下降导致其死亡，而阿霉素纳米粒子(阿霉素12mg/kg)组明显提高了小鼠的存活时间，证明了阿霉素纳米粒子能有效地降低阿霉素的毒副作用和提高阿霉素疗效。
实施例9.使用未除去自由阿霉素的纳米粒子溶液(其中含25％自由阿霉素和75％包埋在纳米粒子内部的阿霉素)进行小鼠实验。取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1∶3(生理盐水∶H22细胞液)稀释，每只小鼠腹腔接种0.2mL，随机分组，每组10只，设空白对照1组，空白对照2组，阿霉素原料(5mg/kg)组，阿霉素纳米粒子(阿霉素8mg/kg)组。
接种后第5日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重给药，共给药5次。试验期间逐日记录动物死亡的情况。分别记录对照组和给药组动物的平均生存时间，按照下列公式计算生命延长率：
生命延长率(％)＝(给药组平均存活天数/对照组平均存活天数-1)×100％
表8.含25％自由阿霉素的纳米粒子溶液治疗荷H22瘤小鼠的生命延长效果。
| 组别 | 平均存活天数 | 生命延长率％ |
| 空白对照1 | 14.7±1.6 | |
| 空白对照2 | 14.3±0.8 | |
| 阿霉素原料(5mg/kg) | 13.7±1.4* | - |
| 阿霉素纳米粒子(阿霉素8 mg/kg) | 21.3±1.6** | 46.8％ |
与空白对照组比较*P＞0.05，**P＜0.01
表8的结果表明，阿霉素原料(5mg/kg)由于毒性太大，其小鼠的存活时间反而低于空白对照组，由于阿霉素纳米粒子溶液中含有自由阿霉素，在治疗初期自由阿霉素快速释放抑制肿瘤的生长，而被包埋在纳米粒子内部的阿霉素的缓释作用使得病灶继续得到治疗。表8的数据再次证明了阿霉素纳米粒子能有效地降低阿霉素的毒副作用和提高阿霉素疗效。
Claims (4)
1.一种具有双多糖外壳的白蛋白-阿霉素纳米制剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
将壳聚糖与白蛋白-葡聚糖共价复合物混合，壳聚糖的分子量在20～500kDa之间，壳聚糖与白蛋白的质量比在0.05～5之间；调节pH到4.5～6.5范围内，使壳聚糖与白蛋白形成静电复合物；然后将上述溶液加热至60℃～100℃，维持1～1000分钟，使白蛋白变性并发生分子间交联，形成以白蛋白为核，葡聚糖和壳聚糖为壳的稳定的纳米粒子溶液；再在酸性条件下混合上述纳米粒子溶液和盐酸阿霉素溶液，壳聚糖/葡聚糖-白蛋白纳米粒子溶液中，白蛋白的最终浓度为0.1～50mg/mL，阿霉素与白蛋白的质量比为10∶1～1∶10之间；将混合溶液的pH调到6.2～8.2范围内，利用白蛋白与阿霉素之间的静电和疏水作用，通过扩散的方法将阿霉素包埋在纳米粒子的内部，即得到以白蛋白和阿霉素为核，壳聚糖和葡聚糖为壳的纳米粒子水溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的白蛋白-葡聚糖共价复合物由Maillard反应制备而获得。
3.一种如权利要求1所述方法制备获得的具有双多糖外壳的白蛋白-阿霉素纳米制剂。
4.一种如权利要求3所述的具有双多糖外壳的白蛋白-阿霉素纳米制剂在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。
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