CN109091452B - 一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备及应用 - Google Patents

一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备及应用，可有效解决抗肿瘤药物的制备问题；技术方案是，使用碳化二亚胺化学法将海藻酸钠骨架上接枝肽配体，超声条件下与阿霉素混合均匀，滴加FeCl3交联剂，其与海藻酸钠分子骨架上的—COOH共价交联形成纳米水凝胶，同时将阿霉素包载在纳米凝胶的空间网格结构内部，即得；本发明制备方法简单，节能环保，制备的抗肿瘤药物递送系统具有肿瘤触发式相转化能力，可实现肿瘤微环境响应释药；通过肿瘤微环境刺激实现粒径转化，实现肿瘤深部渗透；激活内源性H2O2→•OH转化，实现无O2参与的肿瘤化学动力学‑化疗联合治疗，为提高化疗药物肿瘤治疗效率提供新思路。

Description

一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的 制备及应用
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别是一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备及应用。
背景技术
目前纳米制剂的安全性和临床应用受到越来越多的关注。海藻酸钠（Alg）是从海带或海藻中提取的天然阴离子聚电解质多糖，由β-D-甘露糖醛酸（M）及其C-4差向异构体α-L-古洛糖醛酸（G）2种结构单元，以3种方式（MM段、GG段、MG段），通过（1→4）糖苷键连接而成。Alg 属于直链阴离子聚合物，其骨架上富含羧基， G单元上的 Na+可以与Fe3+等大多数金属阳离子（除镁外）发生离子交换反应，通过金属配位相互作用，G单元堆叠形成特征化的蛋形空间结构，从而形成水凝胶，即“蛋盒机制（Egg-Box）”。生物相容性好、成胶条件温和，无毒、功能多样和溶胶-凝胶转变特性使Alg成为可适应临床需求的理想药物载体。自2010年版中国药典首次收录为药用辅料后，已被广泛用于微球、纳米粒、微丸、骨架片、漂浮给药系统等众多药物递送系统的研究中。
多柔比星，又称阿霉素（Doxorubicin，DOX）与蒽环类抗生素作为一种最有效的抗肿瘤化疗药物，在临床上被广泛应用，可以抑制DNA和RNA的合成。但是，快速的血液清除速率和不可逆的心脏毒性严重限制了其在临床上的进一步发展和应用。为了克服这些障碍，已经开发了诸如脂质体的纳米载体作为药物递送系统（NDDS），阿霉素脂质体（如Doxil）已成功应用于临床。与游离药物相比，这些纳米制剂确实能够延长血液循环时间，增加肿瘤组织蓄积，降低毒副作用，但通过EPR效应进入肿瘤组织后，Doxil大量滞留于肿瘤组织外围，无法实现肿瘤深部渗透，最终造成药物在肿瘤组织中浓度分布不均一，治疗效率较低。因而，如何增强纳米制剂在肿瘤组织的渗透距离并同步实现肿瘤响应释药，是目前抗肿瘤纳米药物在递送过程中面临的主要挑战。
靶向药物递送既可以提高药物疗效，又可以减少药物对正常组织的副作用。体外具有良好靶向能力的配体，包括适配体、多肽和抗体，已被广泛用于药物或大分子物质递送。然而，由于肿瘤血管功能失调以及肿瘤本身的高间质压力，大多数靶向药物递送系统只能穿过3-5个细胞直径并且主要位于肿瘤血管周围。克服这些缺陷并增加药物对肿瘤实质的渗透是开发有效的肿瘤化疗的主要挑战。最佳解决方案是找到一种肿瘤区域中血管和细胞共享的受体和具有肿瘤靶向和穿透性质的相应配体。我们选择了一种新的CendR肽配体，Cys-Arg-Gly-Asp-Lys（CRGDK），其相应的受体为神经毡蛋白-1（Nrp-1），Nrp-1受体是一种跨膜受体糖蛋白，被肿瘤血管和各种各样的人类癌细胞过表达，在血管生成和血管通透性中起着重要作用。我们使用肿瘤穿透肽CRGDK作为特异性结合Nrp-1受体的靶配体，既可以实现靶向药物递送，又有利于增强药物递送系统对肿瘤组织深部的渗透性。
乏氧，低pH，高水平GSH和H2O2是肿瘤微环境的四大显著特征。当FeAlg纳米凝胶进入并蓄积于肿瘤后，高GSH, 低pH可激活递药系统发生相转变，粒径由大至小转化的同时伴随着荷载药物的释放。在肿瘤微环境高GSH和低pH的条件下，GSH等小分子还原物质通过扩散方式从FeAlg表层逐渐向中心扩散，处于FeAlg水凝胶外层的Fe3+首先被还原为Fe2+, Fe2+交联Alg的能力急剧降低，水凝胶发生固-液相变，使得包埋的物质快速释放。另外，在酸性条件下，被还原的Fe2+与Alg快速解离，导致水凝胶尺寸减小，小尺寸的纳米粒（<50nm）肿瘤组织扩散性强，有助于实现药物递送系统的深部肿瘤渗透。而且，Fe2+在酸性条件下可催化H2O2，通过芬顿反应高效产生具有治疗活性的·OH，用于肿瘤的局部高效治疗，由于该过程不需O2参与，因而ROS生成效率不受肿瘤乏氧限制，从而实现无O2参与的肿瘤化学动力学-化疗联合治疗，提高化疗药物肿瘤治疗效率。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备及应用，可有效解决现有抗肿瘤药物的制备问题。
本发明解决的技术方案是，一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统，使用碳化二亚胺化学法将海藻酸钠（Alg）骨架上接枝肽配体（CRGDK），超声条件下与阿霉素（DOX）混合均匀，以恒定的速率滴加FeCl3交联剂，其与海藻酸钠（Alg）分子骨架上的—COOH通过共价交联形成纳米水凝胶，同时将模型药物阿霉素（DOX）包载在纳米凝胶的空间网格结构内部，即得；
包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
利用Alg分子羧基和CRGDK分子中的氨基通过碳二亚胺化学法在Alg上接枝1%~10%CRGDK靶分子；
将1g海藻酸钠溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）缓冲液中，得质量体积比（w/v）1%的Alg溶液；加入21.6~216mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和9.58~95.8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）活化，得反应液；将28.88~288.8mg CRGDK溶解在80~120μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌12~24h，将产物对双蒸水透析纯化1~2天，MWCO=3000~4000，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
通过一步交联法制备CRGDK -FeAlg/DOX递药系统；
将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成0.1~1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.01~0.8 mg/ml 的FeCl3交联剂溶液；
首先，将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg：DOX= 1 : 1~6的比例加入至0.5~5ml CRGDK-Alg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入3~30ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声1~6h，将产物转移至MWCO=12000~16000的透析袋，对双蒸水透析12~48h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
本发明所述方法制备的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的粒径为20-100nm。
本发明制备的一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明制备的一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统可用于肿瘤部位的靶向给药、肿瘤微环境响应型释药、实现肿瘤深部渗透、实现无O2参与的肿瘤化学动力学-化疗联合治疗，为提高化疗药物肿瘤治疗效率提供新思路。
本发明提供了基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统；本发明采用生物相容性良好的药用辅料Alg为基体材料，Fe3+为交联剂兼门控开关，CRGDK为靶分子，阿霉素（Doxorubicin，DOX）为模型药物，构建一种肿瘤可精确识别及触发的、粒径可变型智能门控纳米凝胶（RGD-FeAlg/DOX）作为药物递送系统。该递药系统具有以下优势：①具有肿瘤触发式相（固-液）转化能力，可实现肿瘤微环境响应释药；②该给药体系的空间交联结构具有高药物荷载能力，可实现药物在靶部位的缓释；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通过肿瘤微环境刺激实现粒径转化（由大变小），实现肿瘤深部渗透；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
具有主动靶向功能，实现定点药物释放；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
激活内源性H2O2→·OH转化，实现无O2参与的肿瘤化学动力学-化疗联合治疗。
本发明基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统，由生物相容性良好的Alg与Fe3+共价交联形成，荷载抗肿瘤药物DOX，CRGDK为靶分子，利用该体系在肿瘤微环境中的响应性相变和粒径减小功能，以及CRGDK的主动靶向能力，构建一种肿瘤可精确识别及触发的、粒径可变型智能门控药物递送系统。
本发明利用Alg与Fe3+共价交联形成纳米凝胶，水凝胶的空间交联结构具有高药物荷载能力，可以大大提升抗肿瘤药物DOX的载药量，当递药系统经循环渗透进入肿瘤部位后，在肿瘤微环境（低pH、高GSH）下，Fe3+被还原为Fe2+，水凝胶发生固-液相变，Fe2+与Alg快速解离，导致水凝胶尺寸减小，小尺寸的纳米粒（<50nm）肿瘤组织扩散性强，在实现包埋药物逐层缓慢释放的同时，有助于实现药物递送系统的深部肿瘤渗透。另外，Fe2+在酸性条件下可催化H2O2通过芬顿反应高效产生具有治疗活性的·OH，用于肿瘤的局部高效治疗，由于该过程不需O2参与，因而ROS生成效率不受肿瘤乏氧限制，有助于实现无O2参与的肿瘤化学动力学-化疗联合治疗。
本发明以CRGDK为靶分子，其相应的受体为神经毡蛋白-1（Nrp-1），Nrp-1受体是一种跨膜受体糖蛋白，被肿瘤血管和各种各样的人类癌细胞过表达，在血管生成和血管通透性中起着重要作用。我们使用肿瘤穿透肽CRGDK作为特异性结合Nrp-1受体的靶配体，一方面通过癌细胞靶向实现有效的药物递送，另一方面可以通过血管靶向实现递药系统的肿瘤组织深部渗透。
所述的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统，可以用于注射给药。注射给药优选注射剂、冻干粉针。
本发明制备方法简单，节能环保，制备的抗肿瘤药物递送系统具有肿瘤触发式相（固-液）转化能力，可实现肿瘤微环境响应释药；通过肿瘤微环境刺激实现粒径转化（由大变小），实现肿瘤深部渗透；激活内源性H2O2→•OH转化，实现无O2参与的肿瘤化学动力学-化疗联合治疗，为提高化疗药物肿瘤治疗效率提供新思路，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
实施例1
本发明一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统，具体包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
将1g海藻酸钠溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）缓冲液中，得质量体积比（w/v）1%的Alg溶液；加入21.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和9.58mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）活化，得反应液；将28.88mg CRGDK溶解在80μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌12h，将产物对双蒸水透析纯化1天，MWCO=4000，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成0.1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.01 mg/ml 的FeCl3交联剂溶液；
首先，将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg：DOX= 1 : 1的比例加入至0.5ml CRGDK-Alg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入3ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声1~6h，将产物转移至MWCO=12000的透析袋，对双蒸水透析48h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
实施例2
本发明一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统，具体包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
将1g海藻酸钠溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）缓冲液中，得质量体积比（w/v）1%的Alg溶液；加入108.56mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和47.93mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）活化，得反应液；将144.4mg CRGDK溶解在100μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌18h，将产物对双蒸水透析纯化2天，MWCO=3500，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成0.1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.08 mg/ml 的FeCl3交联剂溶液；
首先，将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg：DOX= 1 : 3的比例加入至1.5ml CRGDK-Alg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入9ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声3h，将产物转移至MWCO=14000的透析袋，对双蒸水透析36h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
实施例3
本发明一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统，具体包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
将1g海藻酸钠溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）缓冲液中，得质量体积比（w/v）1%的Alg溶液；加入216mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和95.8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）活化，得反应液；将288.8mg CRGDK溶解在120μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌24h，将产物对双蒸水透析纯化2天，MWCO=3000，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.8 mg/ml 的FeCl3交联剂溶液；
首先，将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg：DOX=1：6的比例加入至5mlCRGDK-Alg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入30ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声6h，将产物转移至MWCO=16000的透析袋，对双蒸水透析12h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
本发明经多次反复实验，均取得了一致的结果，相关实验资料如下：
实验1
实施例2所述方法制备的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统，经显微观察，结果显示，所制得的纳米凝胶粒径均一，平均粒径在100~200nm范围，电位为-11.6mv。
实验2：CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的体外释药考察
将CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶置于透析袋内（MWCO=3500Da）中，浸入不同pH值和GSH浓度的磷酸盐PBS缓冲液中（pH 7.4，不含GSH：模拟正常体液；pH6.5，20uM GSH：模拟肿瘤组织；pH5.5，10mM GSH：模拟肿瘤细胞），100r/min, 37℃条件下震荡，每隔一定时间取出部分释放介质，采用UV法测定不同时间点DOX吸光度，计算其浓度，累积释药百分率并绘制释放曲线。
结果表明该制剂释药具有明显的pH和GSH浓度敏感性，释药速度为：pH5.5，10mMGSH >pH6.5，20uM GSH> pH7.4，不含GSH。其中，pH5.5，10mM GSH条件下，72h累积释药百分量为88%，pH6.5，20uM GSH条件下为35%，pH7.4条件下仅为5%，说明该制剂在正常体液循环中释药极少 ，而在肿瘤部位定点释药。
实验3：FeAlg纳米凝胶的粒径及形态变化考察
将FeAlg纳米凝胶置于以下介质中（pH6.5，20uM GSH；pH5.5，10mM GSH）72h，通过透射电镜观察递药系统粒径及形态变化。结果表明，在pH5.5，10mM GSH条件下，纳米凝胶的粒径由30nm左右转变为10nm左右，该粒径变化可有效促进纳米凝胶的深部肿瘤渗透。
实验4：FeAlg纳米凝胶转化MDA-MB-231肿瘤细胞H2O2生成•OH的情况；
设置空白细胞组，FeAlg，CRADK-FeAlg及CRGDK-FeAlg组，与细胞共培养一定时间后，使用•OH 测定试剂盒（Hydroxyl Detection Kit ™）通过流式细胞仪定量测定细胞内•OH的量。
结果表明，CRGDK-FeAlg组诱导羟自由基生成能力为135U/ml，而空白对照组仅为16U/ml，表明该制剂可以有效诱导MDA-MB-231肿瘤细胞生成•OH。
实验5：递药系统在体外三维肿瘤模型中的渗透分布研究；
与传统的二维培养系统相比，体外的三维细胞培养系统能够更准确模仿癌组织的微环境，因而采用三维肿瘤模型考察递药系统的深部渗透性质。在预先涂布有低熔点琼脂糖的96孔板中接种MDA-MB-21乳腺癌细胞，待肿瘤球体形成后，分别加入等浓度FeAlg/DOX，CRGDK-FeAlg/DOX，CRADK-FeAlg/DOX，游离DOX及无粒径变化特征的SiO2/DOX对照。共孵育一定时间后用冷PBS冲洗球体三次并用4%多聚甲醛固定，利用DOX自身荧光通过激光共聚焦显微镜观察递药系统在三维肿瘤模型中的渗透及分布情况。
结果表明，CRGDK-FeAlg/DOX组在体外三维肿瘤模型中的渗透距离约为1mm，而游离DOX仅为0.2mm，表明CRGDK-FeAlg/DOX组具有优异的肿瘤深部渗透功能。
实验6：CRGDK-FeAlg/DOX的抗肿瘤活性测定
体外抗肿瘤活性（以人乳腺癌细胞株MDA-MB-231为研究对象）：时间效应：用CRGDK-FeAlg/DOX对细胞进行一次处理，在不同时间点考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用（SRB法或其它方法测定）；剂量效应：用不同剂量CRGDK-FeAlg/DOX处理细胞，考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用（SRB法或其它方法测定）。
以上实验均设不同实验组：DOX、FeAlg、FeAlg/DOX、CRGDK-FeAlg、CRGDK-FeAlg/DOX、CRADK-FeAlg、CRGDK-FeAlg/DOX。结果表明CRGDK-FeAlg/DOX对细胞的抑制作用具有明显的时间依赖性及浓度依赖性。当DOX浓度为0.5μg/ml时，CRGDK-FeAlg/DOX组24h抑制率为79.2%，而DOX组仅为25.7%，表明制剂组能显著抑制MDA-MB-231肿瘤细胞的增殖。
体内抗肿瘤活性：将MDA-MB-231细胞接种到裸鼠胁腹的皮下, 隔天监测肿瘤的生长情况，并记录裸鼠的一般状况。当肿瘤体积达到100-300 mm3时，将动物随机分组并开始处理（静脉注射）：①DOX；②FeAlg；③FeAlg /DOX；④CRGDK-FeAlg；⑤CRGDK-FeAlg/DOX
Figure DEST_PATH_IMAGE004
CRADK-FeAlg；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
CRADK-FeAlg/DOX。同时设生理盐水对照组和阳性对照组。给药期间连续测定肿瘤体积直到动物处死为止。到第七周时，处死所有小鼠，取出肿瘤, 称重。按照相对肿瘤增殖率T/C评价效果。
试验结果表明，CRGDK-FeAlg/DOX组的抑瘤率是DOX对照组的5.7倍，表明该纳米系统在体内取得了显著的抗肿瘤效果。
试验结果表明，本发明相对于现有技术具有如下的优点和有益效果：
（1）具有肿瘤触发式相（固-液）转化能力，可实现肿瘤微环境响应释药；
（2）通过肿瘤微环境刺激实现粒径转化（由大变小），实现肿瘤深部渗透；
（3）具有主动靶向功能，实现定点药物释放；
（4）激活内源性H2O2→·OH转化，实现无O2参与的肿瘤化学动力学-化疗联合治疗。
以上特点表明，本发明方法简单，易操作，材料丰富，成本低，使用效果好，节能环保，开拓了肿瘤治疗药物的新用途，经济和社会效益巨大。

Claims (6)

1.一种基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备方法，其特征在于，用碳化二亚胺化学法将Alg骨架上接枝CRGDK，超声条件下与DOX混合均匀，以恒定的速率滴加FeCl3交联剂，再与Alg分子骨架上的—COOH通过共价交联形成纳米水凝胶，同时将模型药物DOX包载在纳米凝胶的空间网格结构内部；
具体包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
利用Alg分子羧基和CRGDK分子中的氨基通过碳二亚胺化学法在Alg上接枝1%～10%CRGDK靶分子；
将1g Alg溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的MES缓冲液中，得质量体积比1%的Alg溶液；加入21.6～216mg Sulfo-NHS和9.58～95.8mg EDC活化，得反应液；将28.88～288.8mg CRGDK溶解在80～120μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌12～24h，将产物用双蒸水透析纯化1～2天，MWCO=3000～4000，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
通过一步交联法制备CRGDK-FeAlg/DOX递药系统；具体是将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成0.1～1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.01～0.8mg/ml的FeCl3交联剂溶液；
将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg︰DOX=1︰1～6的比例加入至0.5～5mlCRGDK-Alg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入3～30ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声1～6h，将产物转移至MWCO=12000～16000的透析袋，对双蒸水透析12～48h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
2.根据权利要求1所述的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
将1g Alg溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的MES缓冲液中，得质量体积比1%的Alg溶液；加入21.6mg Sulfo-NHS和9.58mg EDC活化，得反应液；将28.88mg CRGDK溶解在80μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌12h，将产物用双蒸水透析纯化1天，MWCO=4000，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成0.1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.01mg/ml的FeCl3交联剂溶液；
首先，将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg︰DOX= 1︰1的比例加入至0.5mlCRGDK-Alg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入3ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声1～6h，将产物转移至MWCO=12000的透析袋，对双蒸水透析48h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
3.根据权利要求1所述的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
将1g Alg溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的MES缓冲液中，得质量体积比1%的Alg溶液；加入108.56mg Sulfo-NHS和47.93mg EDC活化，得反应液；将144.4mg CRGDK溶解在100μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌18h，将产物用双蒸水透析纯化2天，MWCO=3500，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成0.1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.08mg/ml的FeCl3交联剂溶液；
首先，将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg︰DOX= 1︰3的比例加入至1.5mlCRGDK-Alg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入9ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声3h，将产物转移至MWCO=14000的透析袋，对双蒸水透析36h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
4.根据权利要求1所述的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）CRGDK-Alg偶联物的合成：
将1g Alg溶于质量浓度0.1M pH6.5的含有0.3M NaCl的MES缓冲液中，得质量体积比1%的Alg溶液；加入216mg Sulfo-NHS和95.8mg EDC活化，得反应液；将288.8mg CRGDK溶解在120μL MES缓冲液中，加入到上述反应液中，室温下搅拌24h，将产物用双蒸水透析纯化2天，MWCO=3000，冻干，即得CRGDK-Alg偶联物；
（2）CRGDK-FeAlg/DOX递药系统的制备：
将DOX加入双蒸水配制成10mg/ml的DOX溶液；将步骤（1）制备的CRGDK-Alg偶联物加入双蒸水配制成1mg/ml的CRGDK-Alg溶液；将FeCl3加入双蒸水配制成0.8mg/ml的FeCl3交联剂溶液；
首先，将质量浓度10mg/ml的DOX溶液以质量比Alg︰DOX=1︰6的比例加入至5mlCRGDKAlg溶液中，超声30min使二者混合均匀，得混合液；然后在超声条件下，向上述混合液中逐滴加入30ml FeCl3交联剂溶液，室温条件下超声6h，将产物转移至MWCO=16000的透析袋，对双蒸水透析12h除去游离药物，冷冻干燥得CRGDK-FeAlg/DOX纳米凝胶，即基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统。
5.根据权利要求1或2-4任一项所述的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的制备方法，其特征在于，所述的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统的粒径为20-100nm。
6.权利要求1或2-5任一项所述方法制备的基于海藻酸钠的粒径可变门控型抗肿瘤药物递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
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