CN108992399B - 一种epr效应增强型联合用药体系的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法及应用，可有效解决抗肿瘤药物的制备问题，技术方案是采用生物相容性良好及易于凝胶化的药用辅料海藻酸钠为基材，Fe3+为交联剂兼门控开关，以羟氯喹和康普瑞汀为模型药物，同时康普瑞汀作为血管靶分子，构建一种纳米凝胶作为抗肿瘤递送系统；本发明制备工艺简单，稳定可靠，节能环保，制备的EPR效应增强型联合用药体系能够在肿瘤靶部位高效蓄积，实现长效控释作用；在肿瘤微环境刺激下实现粒径由大变小转化，实现肿瘤深部渗透；激活内源性H2O2→•OH转化，用于肿瘤的局部高效治疗，抗血管与抑制自噬联合用药可起到协同的显著治疗效果，为提高肿瘤治疗效率提供新策略。

Description

一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别是一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法及应用。
背景技术
与正常组织相比，由于肿瘤细胞的快速增殖，使得肿瘤组织内血管和淋巴管不完整，而导致纳米药物容易从血管内渗漏进入肿瘤组织，且难以从淋巴管回流，导致肿瘤具有增强的渗透和滞留效应 (enhanced permeability and retention effect，EPR效应)。EPR效应被誉为纳米药物递送的基石，然而EPR效应较弱，与正常器官相比，纳米药物只增加了20-30%的递送量。据报道，可以通过影响以下几个参数来改善EPR效应：（1）调节肿瘤血液流动（2）调节肿瘤脉管系统和基质（3）杀死癌细胞以降低其屏障功能。目前，肿瘤血管被证明是治疗癌症的潜在靶点，康普瑞汀（CA4）是最常用的一种小分子血管阻断剂，它对有异常结构特征和功能的肿瘤血管具有靶向抑制性，对正常血管作用较小，全身毒性较小且不易产生耐药性，但CA4具有水溶性较差，难以保持其有效构型，体内消除快等缺点，限制了其临床应用。因此，开发纳米制剂为改善CA4的临床应用缺陷提供了一种新的策略。
海藻酸钠（Alginate，Alg）是天然阴离子聚电解质多糖，由β-D-甘露糖醛酸（M）及其C-4差向异构体α-L-古洛糖醛酸（G）2种结构单元，通过（1→4）糖苷键连接而成，具有生物相容性和易于凝胶化，在生物医学科学和工程中被广泛应用。哺乳动物体内缺乏海藻酸降解酶，因此海藻酸基生物材料在体内存留时间较长，可提供较为长效的支架或载体。以海藻酸钠接枝CA4，制备Alg-CA4纳米颗粒可以解决CA4存在的问题，Alg 属于直链阴离子聚合物，其骨架上富含羧基，G单元上的 Na+可以与Fe3+等大多数金属阳离子（除镁外）发生离子交换反应，通过金属配位相互作用形成水凝胶。因此，利用铁（Ⅲ）作为交联剂，制备纳米凝胶（CA4-FeAlg），通过EPR效应在肿瘤部位累积，增加靶向性，可以提高抗肿瘤作用，但目前尚未有相关文献报道。
抗血管药物单独用药往往不能达到理想的效果，这大大影响了其实际应用。自噬是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解，以细胞内出现自噬体为特征的细胞自我消化过程。肿瘤形成后，在低氧、营养缺乏的情况下，细胞自噬为癌细胞提供更多的营养，起到促进肿瘤发展的功能。血管破坏剂治疗时切断肿瘤血管血氧供应从而诱发自噬，起到保护癌细胞，降低治疗效果的作用。效果稳定、毒副作用小的羟氯喹（HCQ）作为经典的自噬抑制剂在抗肿瘤研究中不断被推进更新，一些新的抗肿瘤机制也被不断发现。因此联合使用抗血管药物与自噬抑制剂，有协同抗肿瘤的效果。
乏氧，低pH，高水平GSH和H2O2是肿瘤微环境的四大显著特征。当CA4-FeAlg/HCQ纳米凝胶进入肿瘤部位后，CA4在肿瘤血管处释放提高EPR效应，纳米凝胶在肿瘤高效蓄积。在肿瘤微环境高GSH和低pH的条件下，GSH等小分子还原物质通过扩散方式从纳米凝胶表层逐渐向中心扩散，处于水凝胶外层的Fe3+首先被还原为Fe2+, Fe2+交联Alg的能力急剧降低，水凝胶发生固-液相变，使得包埋的物质HCQ快速释放。另外，在酸性条件下，被还原的Fe2+与Alg快速解离，导致水凝胶尺寸减小，小尺寸的纳米粒（<50nm）肿瘤组织扩散性强，有助于实现药物递送系统的深部肿瘤渗透。而且，Fe2+在酸性条件下可催化H2O2，通过芬顿反应高效产生具有治疗活性的·OH，用于肿瘤的局部高效治疗。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法及应用，可有效解决抗肿瘤药物的制备问题。
本发明解决的技术方案是，一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法及应用，采用生物相容性良好及易于凝胶化的药用辅料海藻酸钠（Alg）为基体材料，Fe3+为交联剂兼门控开关，以羟氯喹（HCQ）和康普瑞汀（CA4）为模型药物，同时康普瑞汀（CA4）作为血管靶分子，构建一种肿瘤靶部位高效蓄积、定点长效释药、粒径可变、协同治疗的纳米凝胶（CA4-FeAlg/HCQ）作为抗肿瘤递送系统；
具体制备方法为：
（1）血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）的合成：
将50~200mg海藻酸钠（Alg）加入4~8ml甲酰胺，在50~60℃、450~500rpm条件下磁力搅拌1.5-2.5h使其溶胀，再在室温、450~500rpm下磁力搅拌10~15h，得溶液A；将45~55mg康普瑞汀（CA4）、22~44mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），28~56µl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、25~50µl三乙胺，用3~5ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌25~35min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌20-30h，使康普瑞汀（CA4）通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入20-30 ml乙醚，在4℃下静置沉淀2~4h，4℃下10000~14000r离心25-35min，收集沉淀，将沉淀重溶到1.5-2.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析20-30 h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4），整个操作过程在避光条件下进行；
（2）纳米凝胶（CA4-FeAlg）的合成：
用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液和血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液；
在超声条件下，向1.0-2.0ml Alg-CA4溶液中以1ml/min的速度逐滴加入0.9~1.6ml交联剂FeCl3·6H2O溶液，室温条件下超声2.5~3.5h，4℃下10000~14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶（CA4-FeAlg），整个操作过程在避光条件下进行；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹（HCQ）溶液，取0.5~2mg纳米凝胶（CA4-FeAlg）加入到HCQ溶液中，室温下避光磁力搅拌70-80h，4℃下10000~14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离HCQ，收集沉淀产物，得CA4-FeAlg/HCQ协同治疗递药系统，即EPR效应增强型联合用药体系，4℃避光保存。
所述EPR效应增强型联合用药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述EPR效应增强型联合用药体系的粒径为80~120nm。
所述EPR效应增强型联合用药体系作为抗肿瘤药物为注射剂、冻干粉针或片剂。
本发明所述的EPR效应增强型联合用药体系，可用于肿瘤血管的靶向给药、肿瘤微环境响应型释药、实现肿瘤深部渗透、实现激活内源性H2O2→·OH转化、联合用药起到协同的显著治疗效果，为提高肿瘤治疗效率提供新思路。
该EPR效应增强型联合用药体系的粒径尺寸均一、分散性好；
本发明将Alg接枝到CA4合成血管靶向性纳米颗粒；Alg-CA4到达肿瘤部位释放小分子药物CA4，通过快速且有选择性的破坏已形成的肿瘤血管网，切断肿瘤血管血氧供应，诱发肿瘤细胞坏死。Alg-CA4在血液循环中稳定存在，解决了CA4水溶差及体内消除快的缺点，最终达到提高药物靶向性，提高药物生物利用度，增加药物稳定性，实现药物的长效控释效果，减少药物毒副作用的目的。
本发明利用Fe3+作为交联剂与门控开关形成水凝胶。水凝胶的网状空间结构具有高载药能力，可高效负载自噬抑制剂HCQ，构建EPR效应增强型联合用药抗肿瘤递药体系。递药系统经循环渗透进入肿瘤部位后，CA4的血管靶向性使其在肿瘤血管处先释放，从而增加血管通透性，提高EPR效应；纳米粒进入肿瘤组织后，在低pH、高GSH条件下Fe3+被还原为Fe2 +，水凝胶发生固-液相变，随后HCQ快速释放，达到抗血管和自噬抑制协同治疗肿瘤的作用。Fe2+与Alg快速解离，导致水凝胶尺寸减小，小尺寸的纳米粒（<50nm）肿瘤组织扩散性强，有助于实现药物递送系统的深部肿瘤渗透。另外，Fe2+在酸性条件下可催化H2O2通过芬顿反应高效产生具有治疗活性的·OH，用于肿瘤的局部高效治疗。
本发明制备工艺简单，稳定可靠，节能环保，制备的EPR效应增强型联合用药体系能够在肿瘤靶部位高效蓄积，实现长效控释作用；在肿瘤微环境刺激下实现粒径由大变小转化，实现肿瘤深部渗透；激活内源性H2O2→•OH转化，用于肿瘤的局部高效治疗。同时，抗血管与抑制自噬联合用药可起到协同的显著治疗效果，为提高肿瘤治疗效率提供新策略，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
实施例1
本发明一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法为：
（1）血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）的合成：
将50mg海藻酸钠（Alg）加入4ml甲酰胺，在50℃、450rpm条件下磁力搅拌2.5h使其溶胀，再在室温、450rpm下磁力搅拌15h，得溶液A；将45mg康普瑞汀（CA4）、22mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），28µl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、25µl三乙胺，用3ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌25min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌20h，使康普瑞汀通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入20ml乙醚，在4℃下静置沉淀2h，4℃下10000r离心35min，收集沉淀，将沉淀重溶到1.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析20h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4），整个操作过程在避光条件下进行；
（2）纳米凝胶（CA4-FeAlg）的合成：
用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液和血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液；在超声条件下，向1.0ml Alg-CA4溶液中以1ml/min的速度逐滴加入0.9ml交联剂FeCl3·6H2O溶液，室温条件下超声2.5h，4℃下10000r离心35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶（CA4-FeAlg），整个操作过程在避光条件下进行；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹（HCQ）溶液，取0.5mg 纳米凝胶（CA4-FeAlg）加入到HCQ溶液中，室温下避光磁力搅拌70h，4℃下10000r离心35min，弃去上清液以除去游离HCQ，收集沉淀产物，得CA4-FeAlg/HCQ协同治疗递药系统，即EPR效应增强型联合用药体系。
实施例2
本发明一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法为：
（1）血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）的合成：
将50mg海藻酸钠（Alg）加入4ml甲酰胺，在55℃、480rpm条件下磁力搅拌2h使其溶胀，再在室温、480rpm下磁力搅拌12h，得溶液A；将50mg康普瑞汀（CA4）、44mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），56µl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、50µl三乙胺，用4ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌30min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌24h，使康普瑞汀（CA4）通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入25ml乙醚，在4℃下静置沉淀3，4℃下12000r离心30min，收集沉淀，将沉淀重溶到2ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析24 h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4），整个操作过程在避光条件下进行；
（2）纳米凝胶（CA4-FeAlg）的合成：
用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液和血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液；在超声条件下，向1.5ml Alg-CA4溶液中以1ml/min的速度逐滴加入1.6ml交联剂FeCl3·6H2O溶液，室温条件下超声3h，4℃下12000r离心30min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶（CA4-FeAlg），整个操作过程在避光条件下进行；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹（HCQ）溶液，取1mg 纳米凝胶（CA4-FeAlg）加入到HCQ溶液中，室温下避光磁力搅拌72h，4℃下12000r离心30min，弃去上清液以除去游离HCQ，收集沉淀产物，得CA4-FeAlg/HCQ协同治疗递药系统，即EPR效应增强型联合用药体系。
实施例3
本发明一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法为：
（1）血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）的合成：
将120mg海藻酸钠（Alg）加入6ml甲酰胺，在55℃、470rpm条件下磁力搅拌2h使其溶胀，再在室温、470rpm下磁力搅拌13h，得溶液A；将50mg康普瑞汀（CA4）、30mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），40µl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、35µl三乙胺，用4ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌30min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌25h，使康普瑞汀（CA4）通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入25ml乙醚，在4℃下静置沉淀3h，4℃下13000r离心28min，收集沉淀，将沉淀重溶到1.5-2.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析20-30 h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4），整个操作过程在避光条件下进行；
（2）纳米凝胶（CA4-FeAlg）的合成：
用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液和血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液；在超声条件下，向1.0-2.0mlAlg-CA4溶液中以1ml/min的速度逐滴加入0.9~1.6ml交联剂FeCl3·6H2O溶液，室温条件下超声2.5~3.5h，4℃下10000~14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶（CA4-FeAlg），整个操作过程在避光条件下进行；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹（HCQ）溶液，取0.5~2mg纳米凝胶（CA4-FeAlg）加入到HCQ溶液中，室温下避光磁力搅拌70-80h，4℃下10000~14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离HCQ，收集沉淀产物，得CA4-FeAlg/HCQ协同治疗递药系统，即EPR效应增强型联合用药体系。
实施例4
本发明一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法为：
（1）血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）的合成：
将200mg海藻酸钠（Alg）加入4~8ml甲酰胺，在60℃、500rpm条件下磁力搅拌2.5h使其溶胀，再在室温、500rpm下磁力搅拌15h，得溶液A；将55mg康普瑞汀（CA4）、44mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），56µl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、50µl三乙胺，用5ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌35min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌30h，使康普瑞汀（CA4）通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入30 ml乙醚，在4℃下静置沉淀4h，4℃下14000r离心35min，收集沉淀，将沉淀重溶到2.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析30 h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4），整个操作过程在避光条件下进行；
（2）纳米凝胶（CA4-FeAlg）的合成：
用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液和血管靶向性纳米颗粒（Alg-CA4）溶液；在超声条件下，向2.0ml Alg-CA4溶液中以1ml/min的速度逐滴加入1.6ml交联剂FeCl3·6H2O溶液，室温条件下超声3.5h，4℃下14000r离心35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶（CA4-FeAlg），整个操作过程在避光条件下进行；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹（HCQ）溶液，取2mg 纳米凝胶（CA4-FeAlg）加入到HCQ溶液中，室温下避光磁力搅拌70-80h，4℃下14000r离心35min，弃去上清液以除去游离HCQ，收集沉淀产物，得CA4-FeAlg/HCQ协同治疗递药系统，即EPR效应增强型联合用药体系。
本发明经多次反复实验均取得了一致的结果，相关实验资料如下：
实验1
按照实施例2所述方法制备的EPR效应增强型联合用药体系，粒径均一，平均粒径在100nm左右，电位为-21.9mv。
实验2CA4-FeAlg/HCQ协同治疗递药系统的体外释药考察
将纳米凝胶（CA4-FeAlg）分别置于透析袋内（MWCO=3500Da）中，浸入不同pH值和GSH浓度的磷酸盐PBS缓冲液中（pH 7.4，不含GSH；pH5.5，不含GSH；pH7.4，5mM GSH；pH5.5，5mM GSH），100r/min, 37℃条件下震荡，每隔一定时间取出部分释放介质，采用UV法测定不同时间点CA4吸光度，计算其浓度，累积释药百分率并绘制释放曲线。以上述步骤，考察CA4-FeAlg/HCQ纳米凝胶中HCQ的体外释药。
结果表明纳米凝胶释药具有明显的pH和GSH浓度敏感性①CA4释药速度为：pH7.4，5mM GSH>pH7.4，不含GSH >pH5.5，5mM GSH >pH5.5，不含GSH ②HCQ释药速度为：pH5.5，5mMGSH>pH7.4，5mM GSH >pH5.5，不含GSH > pH7.4，不含GSH。
实验3CA4-FeAlg/HCQ转化A549肿瘤细胞H2O2生成•OH的情况
设置空白细胞组，FeAlg，CA4-FeAlg及CA4-FeAlg/HCQ组，与细胞共培养一定时间后，使用•OH 测定试剂盒（Hydroxyl Detection Kit ™）通过酶标仪定量测定细胞内•OH的量。
结果表明，CA4-FeAlg/HCQ可以有效诱导A549肿瘤细胞生成•OH。
实验4CA4-FeAlg/HCQ的体外抑制自噬考察
接种A549肿瘤细胞，设置FeAlg，Alg-CA4，HCQ，CA4-FeAlg及CA4-FeAlg/HCQ组，与细胞共培养一定时间后，通过自噬检测试剂盒以及透射电镜观察细胞自噬情况。
结果表明，CA4-FeAlg/HCQ能够有效的抑制A549肿瘤细胞自噬的发生。
实验5递药系统在体外三维肿瘤模型中的渗透分布研究
在预先涂布有低熔点琼脂糖的96孔板中接种A549非小细胞肺癌细胞，待肿瘤球体形成后，分别加入等浓度Alg-CA4， FeAlg，CA4-FeAlg，HCQ，CA4-FeAlg/HCQ及无粒径变化特征的SiO2/DOX对照。共孵育一定时间后用冷PBS冲洗球体三次并用4%多聚甲醛固定，利用DOX自身荧光通过激光共聚焦显微镜观察递药系统在三维肿瘤模型中的渗透及分布情况。
结果表明，与HCQ、Alg-CA4组相比，其他组均能实现在体外三维肿瘤模型中的渗透距离，CA4-FeAlg/HCQ组渗透效果最好。
实验6CA4-FeAlg/HCQ的抗肿瘤活性测定
体外抗肿瘤活性（以非小细胞肺癌A549为研究对象）：时间效应：用CA4-FeAlg/HCQ对细胞进行一次处理，在不同时间点考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用（SRB法或其它方法测定）；剂量效应：用不同剂量CA4-FeAlg/HCQ处理细胞，考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用（SRB法或其它方法测定）。
以上实验均设不同实验组：Alg-CA4、FeAlg、 CA4-FeAlg、 HCQ、 CA4-FeAlg/HCQ。结果表明CA4-FeAlg/HCQ对细胞的抑制作用具有明显的时间依赖性及浓度依赖性，且与其他组相比，CA4-FeAlg/HCQ能显著抑制A549肿瘤细胞的增殖。
体内抗肿瘤活性：将A549细胞接种到裸鼠胁腹的皮下, 隔天监测肿瘤的生长情况，并记录裸鼠的一般状况。当肿瘤体积达到100-300 mm3时，将动物随机分组并开始处理（静脉注射）：①生理盐水组；②Alg-CA4组；③FeAlg组；④CA4-FeAlg；⑤HCQ；⑥CA4-FeAlg/HCQ，给药期间连续监测肿瘤体积直到动物处死为止。到第七周时，处死所有小鼠，取出肿瘤, 称重。按照相对肿瘤增殖 率T/C评价效果。
试验结果表明相比于其他组，CA4-FeAlg/HCQ在体内取得了显著的抑瘤效应，相对肿瘤增殖率最小。
本发明相对于现有技术具有如下的优点和有益效果：
（1）该体系能够靶向肿瘤血管同时升高血管通透性，通过增强EPR效应实现肿瘤靶部位高效蓄积；
（2）该体系的空间交联结构具有高药物荷载能力，可实现药物在靶部位的长效缓释；
（3）通过肿瘤微环境刺激实现粒径转化（由大变小），实现肿瘤深部渗透；
（4）激活内源性H2O2→·OH转化，用于肿瘤的局部高效治疗；
（5）抗血管与抑制自噬联合用药起到协同的显著治疗效果。

Claims (8)

1.一种EPR效应增强型联合用药体系的制备方法，其特征在于，采用海藻酸钠为基体材料，Fe3+为交联剂兼门控开关，以羟氯喹和康普瑞汀为模型药物，同时康普瑞汀作为血管靶分子，构建纳米凝胶作为抗肿瘤递送系统；
具体包括以下步骤：
（1）血管靶向性纳米颗粒的合成：
在避光下，将50～200mg海藻酸钠加入4～8ml甲酰胺，在50～60℃、450～500rpm条件下磁力搅拌1.5-2.5h使其溶胀，再在室温、450～500rpm下磁力搅拌10～15h，得溶液A；将45～55mg康普瑞汀、22～44mg 4-二甲氨基吡啶，28～56μl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、25～50μl三乙胺，用3～5ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌25～35min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌20-30h，使康普瑞汀通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入20-30ml乙醚，在4℃下静置沉淀2～4h，4℃下10000～14000r离心25-35min，收集沉淀，将沉淀重溶到1.5-2.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析20-30h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒；
（2）纳米凝胶的合成：
在避光下，用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁溶液和血管靶向性纳米颗粒溶液；在超声条件下，向1.0-2.0ml血管靶向性纳米颗粒溶液中以1ml/min的速度逐滴加入0.9～1.6ml交联剂氯化铁溶液，室温条件下超声2.5～3.5h，4℃下10000～14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解定容到20ml，得羟氯喹溶液，取0.5～2mg纳米凝胶加入到羟氯喹溶液中，室温下避光磁力搅拌70-80h，4℃下10000～14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离羟氯喹，收集沉淀产物，得EPR效应增强型联合用药体系，4℃避光保存。
2.根据权利要求1所述的EPR效应增强型联合用药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）血管靶向性纳米颗粒的合成：
在避光下，将50mg海藻酸钠加入4ml甲酰胺，在50℃、450rpm条件下磁力搅拌2.5h使其溶胀，再在室温、450rpm下磁力搅拌15h，得溶液A；将45mg康普瑞汀、22mg 4-二甲氨基吡啶，28μl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、25μl三乙胺，用3ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌25min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌20h，使康普瑞汀通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入20ml乙醚，在4℃下静置沉淀2h，4℃下10000r离心35min，收集沉淀，将沉淀重溶到1.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析20h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒；
（2）纳米凝胶的合成：
在避光下，用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁溶液和血管靶向性纳米颗粒溶液；在超声条件下，向1.0ml血管靶向性纳米颗粒溶液中以1ml/min的速度逐滴加入0.9ml交联剂氯化铁溶液，室温条件下超声2.5h，4℃下10000r离心35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹溶液，取0.5mg纳米凝胶加入到羟氯喹溶液中，室温下避光磁力搅拌70h，4℃下10000r离心35min，弃去上清液以除去游离羟氯喹，收集沉淀产物，得EPR效应增强型联合用药体系。
3.根据权利要求1所述的EPR效应增强型联合用药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）血管靶向性纳米颗粒的合成：
在避光下，将50mg海藻酸钠加入4ml甲酰胺，在55℃、480rpm条件下磁力搅拌2h使其溶胀，再在室温、480rpm下磁力搅拌12h，得溶液A；将50mg康普瑞汀、44mg 4-二甲氨基吡啶，56μl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、50μl三乙胺，用4ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌30min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌24h，使康普瑞汀通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入25ml乙醚，在4℃下静置沉淀3，4℃下12000r离心30min，收集沉淀，将沉淀重溶到2ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析24h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒；
（2）纳米凝胶的合成：
在避光下，用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁溶液和血管靶向性纳米颗粒溶液；在超声条件下，向1.5ml血管靶向性纳米颗粒溶液中以1ml/min的速度逐滴加入1.6ml交联剂氯化铁溶液，室温条件下超声3h，4℃下12000r离心30min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹溶液，取1mg纳米凝胶加入到羟氯喹溶液中，室温下避光磁力搅拌72h，4℃下12000r离心30min，弃去上清液以除去游离羟氯喹，收集沉淀产物，得EPR效应增强型联合用药体系。
4.根据权利要求1所述的EPR效应增强型联合用药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）血管靶向性纳米颗粒的合成：
在避光下，将120mg海藻酸钠加入6ml甲酰胺，在55℃、470rpm条件下磁力搅拌2h使其溶胀，再在室温、470rpm下磁力搅拌13h，得溶液A；将50mg康普瑞汀、30mg 4-二甲氨基吡啶，40μl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、35μl三乙胺，用4ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌30min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌25h，使康普瑞汀通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入25ml乙醚，在4℃下静置沉淀3h，4℃下13000r离心28min，收集沉淀，将沉淀重溶到1.5-2.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析20-30h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒；
（2）纳米凝胶的合成：
在避光下，用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁溶液和血管靶向性纳米颗粒溶液；在超声条件下，向1.0-2.0ml血管靶向性纳米颗粒溶液中以1ml/min的速度逐滴加入0.9～1.6ml交联剂氯化铁溶液，室温条件下超声2.5～3.5h，4℃下10000～14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹溶液，取0.5～2mg纳米凝胶加入到羟氯喹溶液中，室温下避光磁力搅拌70-80h，4℃下10000～14000r离心25-35min，弃去上清液以除去游离羟氯喹，收集沉淀产物，得EPR效应增强型联合用药体系。
5.根据权利要求1所述的EPR效应增强型联合用药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）血管靶向性纳米颗粒的合成：
在避光下，将200mg海藻酸钠加入8ml甲酰胺，在60℃、500rpm条件下磁力搅拌2.5h使其溶胀，再在室温、500rpm下磁力搅拌15h，得溶液A；将55mg康普瑞汀、44mg 4-二甲氨基吡啶，56μl 2,4,6-三氯苯甲酰氯、50μl三乙胺，用5ml甲酰胺溶解，室温磁力搅拌35min混合均匀，得溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温下磁力搅拌30h，使康普瑞汀通过Yamaguchi反应接枝到海藻酸钠上，得到产物；向产物中加入30ml乙醚，在4℃下静置沉淀4h，4℃下14000r离心35min，收集沉淀，将沉淀重溶到2.5ml甲酰胺中，转入MWCO=3500的透析袋，以超纯水透析30h，冻干即得血管靶向性纳米颗粒，整个操作过程在避光条件下进行；
（2）纳米凝胶的合成：
用双蒸水分别配制浓度为0.8mg/ml的氯化铁溶液、浓度为0.1mg/ml的血管靶向性纳米颗粒溶液，分别超声10min使溶液分散均匀，得氯化铁溶液和血管靶向性纳米颗粒溶液；在超声条件下，向2.0ml血管靶向性纳米颗粒溶液中以1ml/min的速度逐滴加入1.6ml交联剂氯化铁溶液，室温条件下超声3.5h，4℃下14000r离心35min，弃去上清液以除去游离铁离子，收集沉淀，冻干即得纳米凝胶，整个操作过程在避光条件下进行；
（3）制备EPR效应增强型联合用药体系：
取2mg硫酸羟氯喹用超纯水溶解后定容到20ml，得羟氯喹溶液，取2mg纳米凝胶加入到羟氯喹溶液中，室温下避光磁力搅拌80h，4℃下14000r离心35min，弃去上清液以除去游离羟氯喹，收集沉淀产物，得EPR效应增强型联合用药体系。
6.根据权利要求1或2-5任一项所述的EPR效应增强型联合用药体系的制备方法，其特征在于，所述的EPR效应增强型联合用药体系的粒径为80～120nm。
7.权利要求1或2-5任一项所述方法制备的EPR效应增强型联合用药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.权利要求1或2-5任一项所述方法制备的EPR效应增强型联合用药体系在制备抗肿瘤药物注射剂或片剂中的应用。
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