CN105001426B - 一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法 - Google Patents
一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法，该共聚物具有式I结构，其中，R1为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽脱巯基基团；R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种；R3选自苯基、R′‑CO‑、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′为苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基。本发明提供的聚氨基酸接枝共聚物的靶向方案具有更好的可控性和普适性，有利于推广到临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，尤其涉及一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法。
背景技术
纳米技术的飞速发展催生了纳米抗肿瘤药物的诞生。所谓纳米抗肿瘤药物，是指利用满足体内安全要求的纳米载体，将抗肿瘤药物担载其中而制备的全新剂型，其可解决目前很多正在使用的抗肿瘤药物存在的溶解性、稳定性和毒副作用等问题。由于上述方面的显著优势，在过去的二十几年里，已有大量的纳米抗肿瘤药物进入临床试验或通过审批进入市场，纳米药物越来越广泛地被公众所接受。
纳米抗肿瘤药物通常的制备方法是：利用生物可降解且生物相容性良好的高分子材料将小分子抗肿瘤药物装载在内部，从而形成粒径在一定范围的纳米粒形式的纳米药物。由于大部分的抗肿瘤药物是疏水性的，这一担载过程首先解决了药物的溶解性问题；其次，将药物装载在纳米粒内部可以有效避免药物过早与生理环境接触，提高药物的稳定性以及保证其活性形式；再次，通过合适的设计，可以使纳米粒保持较长的血液循环时间，延长药物的血液滞留，避免迅速的全身分布和系统毒性；而粒径在20nm～200nm的纳米粒可以躲避肾过滤和肝脾等网状内皮组织的清除作用，并可以利用肿瘤组织特有的“增强渗透和滞留”(EPR)效应，实现在肿瘤部位的被动靶向聚积。这些显而易见的优势，使得纳米抗肿瘤药物在肿瘤的诊断、检测和治疗等方面都展现出广阔的应用前景，也推动着人们对纳米抗肿瘤药物进行持续不断地研究。
为了进一步提升纳米抗肿瘤药物的作用效果并降低毒副作用，如何进一步增加纳米抗肿瘤药物在肿瘤部位的靶向富积成为当前研究的关键问题。在解决这方面问题上，应用高分子载体进行抗肿瘤药物传输具有天然优势：高分子载体表面可以方便地键合多种肿瘤靶向性配体，这些配体能够通过与肿瘤血管或细胞表面高表达受体的特异性结合，来增加纳米抗肿瘤药物在肿瘤部位的富积。这种靶向方法有别于完全依赖EPR效应的“被动靶向”策略，因此，也被称为“主动靶向”策略，这类方法也是目前很多公开文献和专利技术为提高纳米抗肿瘤药物肿瘤靶向性所采用的方法。
然而，到目前为止，还没有一种主动靶向纳米抗肿瘤药物成功通过临床试验进入市场。原因之一在于：目前的“主动靶向”的设计所针对的是肿瘤组织高表达的一些受体，在载体表面修饰的是针对这些受体的一些配体(如蛋白、核酸适配体或小分子等)。但是，对于不同类型的肿瘤，其表面受体的表达差异显著；即便是同一种肿瘤，其在不同的病人身上、甚至同一病人的不同阶段，表达量也是不一样的。这就使得当前的“主动靶向”的纳米抗肿瘤药物得到的治疗结果千差万别，很难得到普适性的推广。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法，本发明提供的聚氨基酸接枝共聚物的靶向方案具有更好的可控性和普适性，有利于推广到临床应用。
本发明提供一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物，具有式I结构：
式I中，R1为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽脱巯基基团；
R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种；
R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′为苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
a＞0，b＞0，c＞0，d≥0，10≤a+b+c+d≤1000；
10≤m≤500，10≤n≤500。
优选地，R1选自序列为CREKA的多肽脱巯基基团或序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽脱巯基基团。
优选地，R2选自油醇脱氢基团、α-生育酚脱氢基团、胆固醇脱氢基团，康普瑞丁脱氢基团、紫杉醇脱氢基团、喜树碱脱氢基团、阿霉素脱氢基团、顺铂水合物脱氢基团、Cy5.5荧光染料脱氢基团、Cy7荧光染料脱氢基团和IR830荧光染料脱氢基团中的一种或多种。
优选地，R3为C3～C8的直链烷基。
优选地，a≥5，b≥100，c≥1，100≤a+b+c+d≤800。
优选地，所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物具有式II或式III结构：
本发明还提供一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将聚氨基酸接枝聚乙二醇原料与靶向多肽在水中进行反应，得到具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物；
所述靶向多肽为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽；所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料具有式IV结构；所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物具有式I结构；
其中，R1为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽脱巯基基团；
R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种；
R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′选自苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
a＞0，b＞0，c＞0，d≥0，10≤a+b+c+d≤1000；
10≤m≤500，10≤n≤500。
优选地，所述反应的温度为10℃～50℃；所述反应的时间为10h～50h。
优选地，所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料按照以下方法制得：
将聚氨基酸、甲氧基聚乙二醇、马来酰亚胺基聚乙二醇和R2-H进行反应，得到式IV所示的聚氨基酸接枝聚乙二醇原料；
R2-H选自荧光染料、生物活性分子和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇中的一种或多种；所述聚氨基酸具有式1结构，所述甲氧基聚乙二醇具有式2结构，所述马来酰亚胺基聚乙二醇具有式3结构；
其中，R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′选自苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
10≤e≤1000；10≤m≤500；10≤n≤500。
优选地，所述靶向多肽选自序列为CREKA的多肽或序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽；
R2-H选自油醇、α-生育酚、胆固醇、康普瑞丁、紫杉醇、喜树碱、阿霉素、顺铂水合物、Cy5.5荧光染料、Cy7荧光染料和IR830荧光染料中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明提供的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物如式I所示，该共聚物以聚氨基酸为主链，侧链主要接枝聚乙二醇和末端修饰R1靶向多肽基团的聚乙二醇。所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物能够携带抗肿瘤药物，并且，由于R1多肽基团主要靶向于肿瘤部位自发的或外界刺激下产生的凝血反应，该共聚物对肿瘤自身或外界刺激产生的瘤内凝血反应有特殊的靶向作用，这样使得各种肿瘤都可以在人为控制的情况下产生大量的受体，从而能够大大增加药物在肿瘤部位的累积，增强药物治疗效果。不同于现有的主动靶向手段，本发明提供的这一靶向方案并不完全依赖于肿瘤自身的特点，使得该靶向方案具有更好的可控性和普适性。因此，以该共聚物作为载体制备的纳米抗肿瘤药物的可控性和普适性大大提高，这将大大增加将该肿瘤靶向性聚氨基酸接枝共聚物制备的纳米抗肿瘤药物推广到临床应用的成功几率。
此外，本发明提供的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物还包括R2修饰基团，进一步利于该共聚物的推广应用。
附图说明
图1为实施例2所得产物PLG-g-PEG的核磁共振氢谱图；
图2为实施例4所得产物CDDP/PLG-g-PEG-A15的动态光散射和透射电镜照片；
图3为实施例9测试的不同剂量DMXAA刺激C26肿瘤出血及凝血反应发生的肿瘤照片；
图4为实施例10测试的顺铂药物的组织分布结果；
图5为实施例11的肿瘤抑制实验中肿瘤体积曲线图；
图6为实施例11的肿瘤抑制实验中第14天时的肿瘤照片；
图7为实施例11的肿瘤抑制实验中第14天时的肿瘤重量；
图8为实施例11的肿瘤抑制实验中体重曲线图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物，具有式I结构：
式I中，R1为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽脱巯基基团；
R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种；
R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′为苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
a＞0，b＞0，c＞0，d≥0，10≤a+b+c+d≤1000；
10≤m≤500，10≤n≤500。
本发明提出了一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物，本发明创造性地对共聚物修饰了靶向于凝血反应的多肽基团，这种不完全依赖于肿瘤自身特征的靶向方式可控性和普适性更好，大大提高了应用该共聚物载体制备的纳米抗肿瘤药物的普适性。
本发明提供的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物具有式I结构，其主链为聚氨基酸，主链的两个端基分别为R3和R4。在本发明中，R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′选自苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；R3优选为C3～C8的直链烷基。在本发明的一个实施例中，R3为C6的直链烷基。而R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基，优选为乙酰基。在主链上，所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物接枝有侧链，侧链包括聚乙二醇。本发明式I中的L选自亚甲基(-CH2-)或亚乙基(-CH2CH2-)，优选为亚乙基。
在本发明式I中，R1为靶向多肽基团，修饰在马来酰亚胺聚乙二醇的末端。在本发明中，R1为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽脱巯基基团。所述外界刺激如热刺激和药物刺激等方式，其中，药物刺激下产生的凝血反应优选为注射血管阻断剂所造成的肿瘤部位的凝血反应，而所述血管阻断剂包括但不限于康普瑞丁磷酸二钠(CA4P)和DMXAA(ASA404)。在本发明的实施例中，R1优选自序列为CREKA的多肽脱巯基基团或序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽脱巯基基团，更优选为序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽脱巯基基团。
在本发明中，R1多肽基团主要靶向于肿瘤部位自发的或外界刺激下产生的凝血反应，这样使得各种肿瘤都可以在人为控制的情况下产生大量的受体，从而使得该靶向方案具有更好的可控性和普适性，这样将大大有利于将该肿瘤靶向聚氨基酸接枝共聚物推广到临床运用。
在本发明式I中，R2为接枝在聚氨基酸主链上的修饰基团，其不是必须存在的。在本发明中，R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种，优选自油醇脱氢基团、α-生育酚脱氢基团、胆固醇脱氢基团，康普瑞丁脱氢基团、紫杉醇脱氢基团、喜树碱脱氢基团、阿霉素脱氢基团、顺铂水合物脱氢基团、Cy5.5荧光染料脱氢基团、Cy7荧光染料脱氢基团和IR830荧光染料脱氢基团中的一种或多种。
如果本发明实施例利用该共聚物担载疏水性药物，R2-H可以为不含或至少含一个杂原子的C6～C30的醇，优选为油醇；即R2可以为不含或至少含一个杂原子的C6～C30的烷氧基或芳氧基，其具有疏水性，这样的目的是利于共聚物载体的自组装和担载药物的稳定性。在本发明的实施例中，R2-H本身也可以为具有生物活性的生物小分子及其衍生物，如R2-H可以为含有羟基的小分子抗肿瘤药物，其包括但不限于紫杉醇和喜树碱类药物；或者是能够与羧基发生络合的顺铂类药物，能够发生静电结合的阿霉素类药物；R2-H还可以是一些具有生物活性的小分子，如康普瑞丁，其本身能够刺激肿瘤部位发生凝血反应。在本发明的其他实施例中，R2-H也可以是荧光染料，即一些近红外荧光分子及其衍生物，如Cy5.5荧光染料、Cy7荧光染料或IR830荧光染料等，这样的目的是可将该共聚物载体用于肿瘤的检测或诊断。此外，R2-H不限于上面所述的一种分子，也可以是上面所述各种分子的混合物。
本发明提供的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物中各结构间为无规形式，式I中，a＞0，优选a≥5；b＞0，优选b≥100；c＞0，优选c≥1；d≥0；10≤a+b+c+d≤1000，优选100≤a+b+c+d≤800。作为优选，a≥5，b≥100，c≥1，100≤a+b+c+d≤800。在本发明的一个实施例中，a为5.6，b为125，c为1.4，d为0，a+b+c+d为132。在本发明的另一个实施例中，a为5.6，b为115，c为1.4，d为10，a+b+c+d为132。
在本发明式I中，m和n为聚合度；10≤m≤500，优选20≤m≤400；10≤n≤500，优选20≤n≤400。在本发明的一个实施例中，m和n均为113。
所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物优选具有式II或式III结构：
本发明还提供了一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将聚氨基酸接枝聚乙二醇原料与靶向多肽在水中进行反应，得到具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物；
所述靶向多肽为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽；所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料具有式IV结构；所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物具有式I结构；
其中，R1为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽脱巯基基团；
R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种；
R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′为苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
a＞0，b＞0，c＞0，d≥0，10≤a+b+c+d≤1000；
10≤m≤500，10≤n≤500。
本发明制备了一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物，该聚氨基酸接枝共聚物具有全新的肿瘤靶向方式，输送以该共聚物作为载体而制备的纳米抗肿瘤药物时，具有靶向于肿瘤部位自发的或外界刺激下产生的凝血反应的特征，从而将该共聚物担载的抗肿瘤药物输送到肿瘤部位。本发明应用该具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物进行的肿瘤靶向性药物输送，并不完全被动地依赖于肿瘤自身的特征，这不同于现有的“主动靶向”策略。因此，本发明有望建立起一个更为普适性的肿瘤检测、诊断和治疗的平台。
本发明实施例将聚氨基酸接枝聚乙二醇原料溶于水中，之后加入靶向多肽进行反应，得到式I所示的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物。
本发明采用式IV所示的聚氨基酸接枝聚乙二醇原料，式IV中的L、R2、R3和R4等与前文所述的内容一致，在此不再赘述。本发明对所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料的来源没有特殊限制，优选按照以下方法制得：将聚氨基酸、甲氧基聚乙二醇、马来酰亚胺基聚乙二醇和R2-H进行反应，得到式IV所示的聚氨基酸接枝聚乙二醇原料。
上述方法以聚氨基酸为原料，形成聚氨基酸接枝聚乙二醇原料的主链。所述聚氨基酸具有式1结构：
式1中，R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′选自苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；R3优选为C3～C8的直链烷基。在本发明的一个实施例中，R3为C6的直链烷基。而R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基，优选为乙酰基。L选自亚甲基或亚乙基，优选为亚乙基。式1中，10≤e≤1000，优选100≤e≤800，e更优选为130。在本发明的一个实施例中，所述聚氨基酸为聚L-谷氨酸，即L-谷氨酸均聚物(PLG)。在本发明的另一个实施例中，所述聚氨基酸为聚L-天冬氨酸。
上述方法对式1所示的聚氨基酸的来源没有特殊限制；在本发明的一个实施例中，所述聚L-谷氨酸的制备方法包括：将γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐(BLG-NCA)与正己胺和乙酸酐在有机溶剂中进行反应，得到中间产物，即聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)(PBLG)；将所述中间产物和溴化氢/冰醋酸溶液混合后进行反应，得到聚(L-谷氨酸)均聚物(PLG)。制备上述聚氨基酸时，所用的有机溶剂等条件为本领域技术人员所熟知的，本发明没有特殊限制。
上述方法可以将所述聚氨基酸与甲氧基聚乙二醇和马来酰亚胺基聚乙二醇在有机溶剂中进行反应，得到式IV所示的聚氨基酸接枝聚乙二醇原料，d为0。其中，所述甲氧基聚乙二醇具有式2结构：
式2中，n为聚合度；10≤n≤500，优选20≤n≤400。所述甲氧基聚乙二醇即为聚乙二醇单甲醚，本发明对其来源没有特殊限制。在本发明的一个实施例中，所述甲氧基聚乙二醇为5000Da的聚乙二醇单甲醚。
所述马来酰亚胺基聚乙二醇具有式3结构：
式3中，m为聚合度；10≤m≤500，优选20≤m≤400。本发明对所述马来酰亚胺聚乙二醇的来源等没有特殊限制；在本发明的一个实施例中，其分子量为5000Da。
上述方法还可以将所述聚氨基酸与甲氧基聚乙二醇、马来酰亚胺基聚乙二醇和R2-H在有机溶剂中进行反应，得到式IV所示的聚氨基酸接枝聚乙二醇原料，d＞0。其中，R2-H选自荧光染料、生物活性分子和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇中的一种或多种，优选自油醇、α-生育酚、胆固醇，康普瑞丁、紫杉醇、喜树碱、阿霉素、顺铂水合物、Cy5.5荧光染料、Cy7荧光染料和IR830荧光染料中的一种或多种。
在上述方法中，聚乙二醇原料(包括甲氧基和马来酰亚胺基的聚乙二醇)与聚氨基酸的投料质量比优选为0.5/1～4/1；R2-H与聚氨基酸的投料质量比优选为0/1～2/1。其中，甲氧基聚乙二醇与马来酰亚胺基聚乙二醇的投料质量比优选为0.001/1～9/1。所述反应可在缩合促进剂存在下进行，所述缩合促进剂优选为N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
本发明对所述反应的条件等没有特殊限制，如所用的有机溶剂可为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；所述反应可在振荡的条件下进行，反应温度优选为0℃～40℃；反应时间优选为20小时～80小时，更优选为24小时～72小时。所述反应结束后，本发明优选经过过滤，所得滤液用乙醚沉降，得到的沉淀用N,N-二甲基甲酰胺复溶，再用去离子水透析，冻干后得到产物聚氨基酸接枝聚乙二醇原料。
本发明实施例取式IV所示的聚氨基酸接枝聚乙二醇原料溶于水，加入靶向多肽，在一定温度下振荡反应，得到最终产物具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物。
在本发明中，所述靶向多肽为靶向肿瘤组织自发的或外界刺激下产生的凝血反应的多肽，优选自序列为CREKA的多肽或序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽。在本发明中，靶向多肽基团R1与马来酰亚胺基的摩尔比优选为1/1～1.5/1。
在本发明中，R1通过巯基与马来酰亚胺基在水中进行的加成反应，修饰在聚乙二醇末端。所述反应的时间优选为10小时～50小时，更优选为12小时～42小时。所述反应的温度优选控制在10℃～50℃，更优选为20℃～40℃。反应结束后，本发明优选采用透析的方式提纯，以除掉未反应的含R1的靶向多肽。所得最终产物为式I所示的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物，冻干或液态保存。
本发明在共聚物载体上修饰了靶向基团R1，由于R1多肽基团主要靶向于肿瘤部位自发的或外界刺激下产生的凝血反应，使得该共聚物对肿瘤自身或外界刺激产生的瘤内凝血反应有特殊的靶向作用，可控性和普适性更好，这将大大有利于将该肿瘤靶向聚氨基酸接枝共聚物推广到临床运用。
本发明的主要目的是：采用上述共聚物载体制备具有肿瘤靶向性的纳米抗肿瘤药物。应用上述技术方案，使得本发明制备的聚氨基酸接枝共聚物能够用于各种小分子抗肿瘤药物的靶向输送，以及肿瘤的检测和诊断。不难理解的是，采用所述聚氨基酸接枝共聚物制备的纳米抗肿瘤药物同样具备前面所述的纳米抗肿瘤药物的各种优点，同时，所采用的主链聚氨基酸材料和侧链修饰材料在各种临床前试验中被大量采用，安全可降解，有利于快速审批通过。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法进行具体地描述。
实施例1 聚L-谷氨酸(PLG)的制备
将36.8g(140.0mmol)的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体(BLG-NCA)溶于270mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌溶解后加入1.0mL(1.0mmol/L DMF溶液)的正己胺(n-HA)，密封，在温度为25℃的条件下，搅拌反应72h。之后，在上述反应体系中加入2.0g(20.0mmol)的乙酸酐，继续反应6h。反应结束后，将得到的反应液沉降到2.0L的乙醚中，依次经过滤和乙醚洗涤，在室温下真空干燥24h，得到中间产物聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)(PBLG)。
将10.0g上述制备的聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)用100mL二氯乙酸溶解，在搅拌的条件下，加入30mL质量含量为33％的溴化氢/冰醋酸溶液，在温度为30℃的条件下搅拌反应1h。之后，将得到的反应液沉降到1.0L的乙醚中，离心，所得沉淀用DMF复溶，再用去离子水透析，经冻干，得到聚(L-谷氨酸)均聚物(PLG)。
用氘代水对所制备的聚(L-谷氨酸)均聚物进行核磁共振分析，结果表明，化学位移4.43ppm为主链上次甲基的信号峰，化学位移2.21ppm为侧基上与羰基相连的亚甲基的信号峰，化学位移1.91ppm和1.71ppm为侧基上与主链相连的亚甲基的信号峰。所述聚氨基酸具有式1结构，L为亚乙基(-CH2CH2-)。根据核磁计算，所得聚(L-谷氨酸)的聚合度为130，综合产率为81.2％。
实施例2 聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)的制备
向干燥的反应瓶中，加入1.7g(13.2mmol谷氨酸单元)的聚(L-谷氨酸)(实施例1制备)、2.8g(63.6mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)和0.7g(15.9mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)，再加入150mL的DMF溶解。之后，加入178mg(1.4mmol)的N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和196mg(1.6mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在温度为25℃的条件下密封反应，48小时后，将得到的反应液用1.0L的乙醚沉降，所得固体用DMF复溶，再用去离子水透析3天，经冻干，得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料。
以氘代水为溶剂，对上述聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料进行核磁共振分析，图谱如图1所示，图1为实施例2所得产物PLG-g-PEG的核磁共振氢谱图。图1中的峰位置包括：δ6.61ppm(d,-CH＝CH-CO-),4.25ppm(t,-CH<),3.63ppm(t,-CH2CH2O-),3.31ppm(s,-OCH3),2.18ppm(m,-CH2COOH),1.96and1.83ppm(m,>CHCH2-),1.10–1.02ppm(m,-CH2CH2-),0.78ppm(t,-CH2-CH3)。结果表明，所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料具有式IV结构。
实施例3 具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)的制备
取实施例2制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料80.0mg溶于15.0mL水，之后，加入4.8mg(3.0μmol)靶向多肽(多肽序列为GNQEQVSPLTLLKXC，简写为A15)，在温度为37℃的条件下振荡反应24h。将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)。
所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物具有式II结构：
实施例4 具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物担载顺铂纳米药物(CDDP/PLG-g-PEG-A15)的制备
取实施例2制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料80.0mg溶于15.0mL水，并将pH值调至7.5左右，之后加入23.0mg(76.7μmol)的顺铂(CDDP)，避光于37℃振荡反应72h。之后，将得到的反应液用去离子水透析24h，得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物担载顺铂纳米药物。
向上述体系中加入4.8mg(3.0μmol)的靶向多肽(多肽序列为GNQEQVSPLTLLKXC，简写为A15)，在温度为37℃的条件下振荡反应24h。将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物担载顺铂纳米药物(CDDP/PLG-g-PEG-A15)。
采用动态光散射法(DLS)测定所制得的纳米药物的水合粒径，其结果为63.5±12.0nm；采用透射电子显微镜(TEM)测定所制得的纳米药物干燥后的粒径，结果参见图2，图2为实施例4所得产物CDDP/PLG-g-PEG-A15的动态光散射和透射电镜照片。根据图2，所制得的纳米药物干燥后的粒径为42.7±5.1nm。
采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定所制得的纳米药物中顺铂的载药量，结果为15.3wt.％。采用X射线光电子能谱(XPS)测试所制得的纳米药物，证明了表面靶向多肽的存在。
实施例5 具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/紫杉醇共聚物(PTX/PLG-g-PEG-A15)的制备
向干燥的反应瓶中，加入1.7g(13.2mmol谷氨酸单元)的聚(L-谷氨酸)(实施例1制备)、2.8g(63.6mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)、0.7g(15.9mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)和853.9mg(1.0mmol)的紫杉醇(PTX)，再加入150mL的DMF溶解。之后，加入431mg(3.4mmol)的N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和440mg(3.6mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在温度为25℃的条件下密封反应，48小时后，将得到的反应液用1.0L的乙醚沉降，所得固体用DMF复溶，再用去离子水透析3天，经冻干，得到式IV所示的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/紫杉醇原料。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/紫杉醇原料90.0mg溶于15.0mL水，之后加入4.8mg(3.0μmol)靶向多肽(多肽序列为GNQEQVSPLTLLKXC，简写为A15)，在温度为37℃的条件下振荡反应24h。将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/紫杉醇共聚物(PTX/PLG-g-PEG-A15)，其为式III所示的具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物：
实施例6 具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁共聚物(CA4/PLG-g-PEG-A15)的制备
向干燥的反应瓶中，加入1.7g(13.2mmol谷氨酸单元)的聚(L-谷氨酸)(实施例1制备)、2.8g(63.6mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)、0.7g(15.9mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)和286.3mg(1.0mmol)康普瑞丁，再加入150mL的DMF溶解。之后，加入431mg(3.4mmol)的N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和440mg(3.6mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在温度为25℃的条件下密封反应，48小时后，将得到的反应液用1.0L的乙醚沉降，所得固体用DMF复溶，再用去离子水透析3天，经冻干，得到式IV所示的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁原料。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁原料90.0mg溶于15.0mL水，之后加入4.8mg(3.0μmol)靶向多肽(多肽序列为GNQEQVSPLTLLKXC，简写为A15)，在温度为37℃的条件下振荡反应24h。将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁共聚物(CA4/PLG-g-PEG-A15)。
实施例7 具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/IR830共聚物(IR830/PLG-g-PEG-A15)的制备
取实施例2制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料250.0mg，溶于5.0mL DMF，之后加入11.4mg(60.0μmol)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和3.6mg(30.0μmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应1h后，再加入20.0mg(25.0μmol)的IR830-B-NH2，在温度为0℃的条件下搅拌反应24h，将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/IR830原料。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/IR830原料90.0mg溶于15.0mL水，之后加入4.8mg(3.0μmol)靶向多肽(多肽序列为GNQEQVSPLTLLKXC，简写为A15)，在温度为37℃的条件下振荡反应24h。将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到具有肿瘤靶向性的L-谷氨酸接枝聚乙二醇/IR830共聚物(IR830/PLG-g-PEG-A15)。
实施例8 具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁/IR830共聚物(IR830/CA4/PLG-g-PEG-A15)的制备
取实施例6制备的中间产物聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁原料260.0mg，溶于5.0mL DMF，之后加入11.4mg(60.0μmol)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和3.6mg(30.0μmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应1h，再加入20.0mg(25.0μmol)的IR830-B-NH2，在温度为0℃的条件下搅拌反应24h，将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁/IR830原料。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁/IR830原料90.0mg溶于15.0mL水，之后加入4.8mg(3.0μmol)靶向多肽(多肽序列为GNQEQVSPLTLLKXC，简写为A15)，在温度为37℃的条件下振荡反应24h。将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到具有肿瘤靶向性的L-谷氨酸接枝聚乙二醇/康普瑞丁/IR830共聚物(IR830/PLG-g-PEG-A15)。
实施例9 DMXAA刺激肿瘤出血及凝血反应发生
取Balb/C小鼠(5～6周，雌性，体重约为20g)12只，分别于右侧腋下种植C26鼠源结肠癌细胞2.0×106/只。待肿瘤体积长至300mm3左右时，将小鼠均分为6组，分别尾静脉注射0，10.0，12.5，15.0，17.5，20.0mg/kg的DMXAA。4h后，处死小鼠，将肿瘤剥离出来，拍照，观察出血及凝血发生情况，结果如图3所示，图3为实施例9测试的不同剂量DMXAA刺激C26肿瘤出血及凝血反应发生的肿瘤照片。从图3可以看到，在注射12.5mg/kg及以上的剂量时，DMXAA能够触发C26肿瘤大量出血发生，这些大量的凝血位点可以作为肿瘤内的靶向位点。
实施例10 应用具有肿瘤靶向性聚氨基酸接枝共聚物担载顺铂药物的肿瘤靶向性测试
取Balb/C小鼠(5～6周，雌性，体重约为20g)12只，分别于右侧腋下种植C26鼠源结肠癌细胞2.0×106/只。待肿瘤体积长至300mm3左右时，将小鼠均分为3组，分别尾静脉注射顺铂、实施例4制备的CDDP/PLG-g-PEG-A15顺铂纳米药物、DMXAA+CDDP/PLG-g-PEG-A15顺铂纳米药物。给药剂量为：4.0mg顺铂/kg体重，15.0mg DMXAA/kg体重。24h后，处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾脏、肿瘤等脏器，进行硝酸消化处理，采样ICP-MS测定Pt浓度，所得3组样品在不同脏器内的药物浓度如图4所示，图4为实施例10测试的顺铂药物的组织分布结果。图4中，A15-NPs代表实施例4制备的具有肿瘤靶向性的聚(L-谷氨酸)接枝聚乙二醇共聚物担载顺铂纳米粒(CDDP/PLG-g-PEG-A15)。
从图4可以看出，虽然纳米药物本身有一定的肿瘤靶向性(EPR被动靶向作用)，但是肿瘤部位的药物浓度增加并不多(3倍左右)；而借助于DMXAA造成的瘤内凝血位点，所制备的具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物担载顺铂纳米药物(CDDP/PLG-g-PEG-A15)能够提高肿瘤内的药物浓度达到7.5倍，而在其他脏器则基本没有什么影响，这一结果显示了该具有肿瘤靶向作用的聚氨基酸接枝共聚物在肿瘤靶向性药物输送方面的出色表现。
实施例11 应用具有肿瘤靶向性聚氨基酸接枝共聚物担载顺铂药物抑制体内肿瘤的实验
取Balb/C小鼠(5～6周，体重20g左右)30只，分别于右侧腋下种植2.0×106C26细胞，待肿瘤长至50mm3时，均分为5组(生理盐水组，顺铂组，CDDP/PLG-g-PEG-A15顺铂纳米药物组，DMXAA组，DMXAA+CDDP/PLG-g-PEG-A15顺铂纳米药物组)，记为第0天，之后分别于第1,3,8天给药3次。给药剂量为：4.0mg顺铂/kg体重，15.0mg DMXAA/kg体重。每周量瘤三次，记录小鼠体重，直至第14天结束观察。肿瘤体积、肿瘤照片和小鼠体重图分别如图5～8所示，图5为实施例11的肿瘤抑制实验中肿瘤体积曲线图，图6为实施例11的肿瘤抑制实验中第14天时的肿瘤照片，图7为实施例11的肿瘤抑制实验中第14天时的肿瘤重量，图8为实施例11的肿瘤抑制实验中体重曲线图。图6和图7中，横坐标1,2,3,4,5依次代表生理盐水组，顺铂组，CDDP/PLG-g-PEG-A15组，DMXAA组，DMXAA+CDDP/PLG-g-PEG-A15组；图5和图8中，图例1,2,3,4,5依次代表生理盐水组，顺铂组，CDDP/PLG-g-PEG-A15组，DMXAA组，DMXAA+CDDP/PLG-g-PEG-A15组。
从以上附图可见，到结束观察时，DMXAA+CDDP/PLG-g-PEG-A15顺铂纳米药物组取得了95.9％的出色肿瘤抑制率，而顺铂组、CDDP/PLG-g-PEG-A15顺铂纳米药物组、DMXAA组的肿瘤抑制率分别为79.6％，57.9％和72.9％。值得注意的是，DMXAA+CDDP/PLG-g-PEG-A15顺铂纳米药物组在取得这样肿瘤抑制效果的同时，并没有造成明显的系统毒性(体重无明显变化)。这一结果表明，所应用的具有肿瘤靶向作用的聚氨基酸接枝共聚物作为抗肿瘤药物的载体，能够在外界刺激下将抗肿瘤药物高效输送到肿瘤部位，大大增强肿瘤治疗的效果，并且，该治疗方式安全，无明显机体毒性发生。
实施例12 应用具有肿瘤靶向性聚氨基酸接枝共聚物担载紫杉醇药物的肿瘤靶向性测试
取Balb/C裸鼠(5～6周，雌性，体重约为20g)12只，分别于右侧腋下种植MCF-7人源乳腺癌细胞2.0×106/只。待肿瘤体积长至200mm3左右时，将小鼠均分为3组，分别尾静脉注射紫杉醇、实施例5制备的PTX/PLG-g-PEG-A15紫杉醇纳米药物、CA4P+PTX/PLG-g-PEG-A15紫杉醇纳米药物。给药剂量为：5.0mg紫杉醇/kg体重，50.0mg CA4P/kg体重。24h后，处死小鼠，收集肿瘤，匀浆，进行水解处理，采用HPLC测定紫杉醇浓度，得到3组样品在肿瘤内的药物浓度。
结果显示，紫杉醇药物的浓度为85.5ng/mL，紫杉醇纳米药物对应的瘤内紫杉醇浓度为170.2ng/mL，而CA4P造成的凝血靶向发生时得到的瘤内紫杉醇浓度达到470.0ng/mL，这一结果同样显示了该具有肿瘤靶向作用的聚氨基酸接枝共聚物在肿瘤靶向性药物输送方面的出色表现。
实施例13 应用具有肿瘤靶向性聚氨基酸接枝共聚物担载紫杉醇药物抑制体内肿瘤的实验
取Balb/C裸鼠(5～6周，体重20g左右)30只，分别于右侧腋下种植2.0×106MCF-7人源乳腺癌细胞，待肿瘤长至50mm3时，均分为5组(生理盐水组，紫杉醇组，PTX/PLG-g-PEG-A15紫杉醇纳米药物组(实施例5制备)，CA4P组，CA4P+PTX/PLG-g-PEG-A15纳米药物组)，记为第0天。之后分别于第1,3,8天给药3次。给药剂量为：5.0mg紫杉醇/kg体重，50.0mg CA4P/kg体重。每周量瘤三次，记录小鼠体重，直至第24天结束观察。
结果显示，CA4P+PTX/PLG-g-PEG-A15紫杉醇纳米药物组取得了87.5％的肿瘤抑制率，而紫杉醇组、PTX/PLG-g-PEG-A15紫杉醇纳米药物组、CA4P组的肿瘤抑制率分别为49.6％，57.9％和54.7％。
实施例14
按照实施例2的方法，制备得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)；不同之处在于，加入1.75g(39.7mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)和1.75g(39.7mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料，按照实施例3的方法，制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)；不同之处在于，加入12mg(7.5μmol)靶向多肽。
实施例15
按照实施例2的方法，制备得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)；不同之处在于，加入0.7g(15.9mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)和2.8g(63.6mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料，按照实施例3的方法，制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)；不同之处在于，加入19.2mg(12.0μmol)靶向多肽。
实施例16
按照实施例2的方法，制备得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)；不同之处在于，加入1.4g(31.8mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)和0.35g(8.0mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)；加入89.0mg(0.7mmol)的N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和98.0mg(0.8mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料，按照实施例3的方法，制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)；不同之处在于，加入2.4mg(1.5μmol)靶向多肽。
实施例17
按照实施例2的方法，制备得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)；不同之处在于，加入0.7g(15.9mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)和0.18g(4.0mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)；之后加入44.5mg(0.35mmol)的N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和49.0mg(0.4mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料，按照实施例3的方法，制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)；不同之处在于，加入1.2mg(0.75μmol)靶向多肽。
实施例18
按照实施例2的方法，制备得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)；不同之处在于，加入5.6g(127.2mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)和1.4g(31.8mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)；加入356mg(2.8mmol)的N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和392mg(3.2mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
取上述制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料，按照实施例3的方法，制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)；不同之处在于，加入9.6mg(6.0μmol)靶向多肽。
实施例19
按照实施例1的方法，制备得到聚L-谷氨酸；不同之处在于，以正辛胺(n-OA)替代正己胺(n-HA)作为引发剂，正辛胺同样配成1.0mmol/L DMF溶液，加入1.0mL。
取上述制备的聚L-谷氨酸，按照实施例2的方法，制备得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)；进一步，按照实施例3的方法制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)。
实施例20
按照实施例1的方法，制备得到聚L-谷氨酸；不同之处在于，以胆固醇甲酰氯替代乙酸酐，胆固醇甲酰氯的用量为9.0g(20.0mmol)。
取上述制备的聚L-谷氨酸，按照实施例2的方法，制备得到聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料(PLG-g-PEG)；进一步，按照实施例3的方法制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-A15)。
实施例21
将34.8g(140.0mmol)的γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐单体(BLA-NCA)溶于270mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌溶解后加入1.0mL(1.0mmol/L DMF溶液)的正己胺(n-HA)，密封，在温度为25℃的条件下，搅拌反应72h。之后，在上述反应体系中加入2.0g(20.0mmol)的乙酸酐，继续反应6h。反应结束后，将得到的反应液沉降到2.0L的乙醚中，依次经过滤和乙醚洗涤，在室温下真空干燥24h，得到中间产物聚(γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯)(PBLA)。
将10.0g上述制备的聚(γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯)用100mL二氯乙酸溶解，在搅拌的条件下，加入30mL质量含量为33％的溴化氢/冰醋酸溶液，在温度为30℃的条件下搅拌反应1h。之后，将得到的反应液沉降到1.0L的乙醚中，离心，所得沉淀用DMF复溶，再用去离子水透析，经冻干，得到聚(L-天冬氨酸)均聚物(PLA)。
向干燥的反应瓶中，加入1.5g(13.2mmol天冬氨酸单元)的聚(L-天冬氨酸)、2.8g(63.6mmol乙二醇单元)的聚乙二醇单甲醚(5000Da)和0.7g(15.9mmol乙二醇单元)的马来酰亚胺基聚乙二醇(5000Da)，再加入150mL的DMF溶解。之后，加入178mg(1.4mmol)的N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和196mg(1.6mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在温度为25℃的条件下密封反应，48小时后，将得到的反应液用1.0L的乙醚沉降，所得固体用DMF复溶，再用去离子水透析3天，经冻干，得到聚L-天冬氨酸接枝聚乙二醇原料。
进一步，按照实施例3的方法制备得到具有肿瘤靶向性的聚L-天冬氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLA-g-PEG-A15)。
实施例22
取实施例2制备的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇原料80.0mg溶于15.0mL水，之后，加入2.0mg(3.0μmol)靶向多肽(CREKA)，在温度为37℃的条件下振荡反应24h。将得到的反应液用去离子水透析，经冻干，得到具有肿瘤靶向性的聚L-谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLG-g-PEG-CREKA)。
Claims (9)
1.一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物，具有式I结构：
式I中，R1选自序列为CREKA的多肽脱巯基基团或序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽脱巯基基团；
R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种；
R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′为苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
a＞0，b＞0，c＞0，d≥0，10≤a+b+c+d≤1000；
10≤m≤500，10≤n≤500。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，R2选自油醇脱氢基团、α-生育酚脱氢基团、胆固醇脱氢基团、康普瑞丁脱氢基团、紫杉醇脱氢基团、喜树碱脱氢基团、阿霉素脱氢基团、顺铂水合物脱氢基团、Cy5.5荧光染料脱氢基团、Cy7荧光染料脱氢基团和IR830荧光染料脱氢基团中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，R3为C3～C8的直链烷基。
4.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，a≥5，b≥100，c≥1，100≤a+b+c+d≤800。
5.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物具有式II或式III结构：
6.一种具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将聚氨基酸接枝聚乙二醇原料与靶向多肽在水中进行反应，得到具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物；
所述靶向多肽选自序列为CREKA的多肽或序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽；所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料具有式IV结构；所述具有肿瘤靶向性的聚氨基酸接枝共聚物具有式I结构；
其中，R1选自序列为CREKA的多肽脱巯基基团或序列为GNQEQVSPLTLLKXC的多肽脱巯基基团；
R2选自荧光染料脱氢基团、生物活性分子脱氢基团和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇脱氢基团中的一种或多种；
R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′为苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
a＞0，b＞0，c＞0，d≥0，10≤a+b+c+d≤1000；
10≤m≤500，10≤n≤500。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为10℃～50℃；所述反应的时间为10h～50h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚氨基酸接枝聚乙二醇原料按照以下方法制得：
将聚氨基酸、甲氧基聚乙二醇、马来酰亚胺基聚乙二醇和R2-H进行反应，得到式IV所示的聚氨基酸接枝聚乙二醇原料；
R2-H选自荧光染料、生物活性分子和不含杂原子或至少含一个杂原子的C6～C30的醇中的一种或多种；所述聚氨基酸具有式1结构，所述甲氧基聚乙二醇具有式2结构，所述马来酰亚胺基聚乙二醇具有式3结构；
其中，R3选自苯基、R′-CO-、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基，R′为苯基、C2～C10的直链烷基或C3～C10的支链烷基；
R4选自乙酰基、丙酰基或胆固醇酰基；L选自亚甲基或亚乙基；
10≤e≤1000；10≤m≤500；10≤n≤500。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，R2-H选自油醇、α-生育酚、胆固醇、康普瑞丁、紫杉醇、喜树碱、阿霉素、顺铂水合物、Cy5.5荧光染料、Cy7荧光染料和IR830荧光染料中的一种或多种。
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