CN108888774B - 一种雷公藤红素-树状大分子缀合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种雷公藤红素‑树状大分子缀合物及其制备方法与应用，涉及雷公藤红素。雷公藤红素‑树状大分子缀合物，由中心树枝状聚酰胺‑胺型树枝状有机高分子纳米载体、聚乙二醇、表面靶向配体和雷公藤红素组成。将PAMAM表面的氨基用丁二酸酐进行部分羧基化，透析冷冻干燥，得到PAMAM‑COOH衍生物，再用EDC/NHS活化后，进行聚乙二醇化修饰，透析得PAMAM‑PEG‑COOH衍生物，再用EDC/NHS活化后，与EpCAM靶向核酸适配体连接，超滤除去未反应的适配体后，得多功能化的PAMAM衍生物；用溶剂溶解雷公藤红素，EDC/NHS活化后将雷公藤红素共价络合在多功能化的PAMAM衍生物表面，透析即得缀合物。

Description

一种雷公藤红素-树状大分子缀合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及雷公藤红素，尤其是涉及一种雷公藤红素-树状大分子缀合物及其制备方法与应用。
背景技术
癌症已成为全世界范围内威胁人类健康的头号杀手，而结肠癌的发病率和死亡率则居于所有癌症的前五位。目前用于结肠癌的治疗方法除手术切除外，化疗仍是最主要的辅助治疗手段之一。然而，化学药物因到达肿瘤部位的含量有限，通常很难带来有效的治疗效果，且毒副作用强烈。有效性和安全性的缺乏大大限制了新型化学药物的审批进度和临床应用。
雷公藤红素(celastrol)，又名南蛇藤素、南蛇藤醇，属天然木栓烷型三萜类化合物。其化学名为：3-羟基-24-去甲-2-氧代-1(10)，3,5,7-邻苯二甲酸酯-29-油酸，分子式为C29H38O4,分子量为450.61，其结构式如下：
Figure BDA0001750832280000011
雷公藤红素作为一种醌甲基三萜类化合物，红色针状结晶，弱酸性，是独子藤及雷公藤药材中的主要有效成分之一。雷公藤红素具有多种药理活性，不仅能够抑制免疫反应和抵抗炎症，还具有抗肿瘤的活性。研究表明，雷公藤红素作为一种潜在的蛋白酶抑制剂，可以阻滞肿瘤细胞周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭，对白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、胶质瘤和乳腺癌等多种癌症都有显著的治疗效果(Jiang,et al.Oncotarget.2015；6(32):32790–32804；Pang,etal.Cancer Research 2010,70,1951-9)。
然而雷公藤红素在结构上属于三萜类化合物，有低溶解度、低生物利用度和毒性大等弊端，大大限制了雷公藤红素的应用和开发(Li,et al.Int J Nanomedicine.2012；7:1163–1173)。因此，开发一种改善溶解性、提高生物利用度和降低生物毒性的雷公藤红素制剂显得尤为重要。
纳米技术是20世纪80年代末诞生并崛起的高科技交叉学科，纳米材料由于其尺寸小，具备很多常规材料不具备的独特结构，使得它们同常规材料相比具有一些特殊的电子学、光学和磁学等性质。随着纳米技术的不断发展和各种新型材料的出现，一些功能化的纳米材料被用作药物传输载体显现出极大的优势。利用纳米技术可将纳米材料和药物一起制成纳米制剂，通过对纳米系统进行合理的修饰，药物能够有效地输送到靶标位置，减少了药物在正常组织中的分布，大大降低了药物的毒副作用。肿瘤组织因为快速生长，血管丰富且血管壁间隙宽，结构完整性较差，淋巴回流缺失，对大分子和纳米颗粒具有高通透性和滞留效应(EPR效应)，这种肿瘤的ERP效应使得纳米给药系统对肿瘤组织具有被动靶向性(LI,etal.ONCOLOGY REPORTS.2017,38:611-624,)。此外，由于肿瘤细胞表面往往过表达一些与肿瘤细胞增值生长密切相关的受体，为了加强靶向作用，可以设计合成具有主动靶向作用的纳米载体，通过靶向分子与细胞表面表达的受体进行特异性的结合，使药物能够准确地递送到肿瘤部位，增加肿瘤局部的药物有效浓度，增强抗肿瘤作用(Tao，etal.Theranostics.2016；6(4):470–484)。目前有很多改善雷公藤红素生物利用度的纳米制剂，如雷公藤红素柔性脂质体(CN107149593A)，雷公藤红素纳米混悬剂(CN106309364A)，雷公藤红素免疫纳米粒(CN104800164A)等，但这些制剂往往不具备特异性靶向肿瘤细胞并延长在体循环时间的能力。因此，研发能实现肿瘤靶向传递的高效特异雷公藤红素纳米制剂显得尤为重要。
聚酰胺-胺型树枝状大分子(Polyamidoamine,PAMAMdendrimers)是近年来合成并迅速发展的一类新型高分子聚合物，相比较线性的聚合物，其结构固定完整，由中心向外对称发散并高度分支，有着良好的几何对称性。除此之外，树状大分子的化学结构、分子尺寸、分子质量及分布、形状都是可控的。PAMAMdendrimers内部的疏水性空腔，可为难溶性药物及无机染料、探针提供负载场所。此外，PAMAM dendrimers末端表面具有丰富的反应官能团，可经糖基、聚乙二醇、靶向配体等改性得到不同用途的树状大分子衍生物。而PAMAMdendirmers的粒径大小、电泳性质和其他一些拟生态性质与球状蛋白质非常相似，又被称为“人工蛋白”。因此，PAMAM dendrimers具备良好的尺寸效应(1-10nm)、显著的多价络合效应及协同效应、优良的生物相容性和生物安全性，在生物医药领域发挥着重要作用(Wang,et al.Chemical Society Reviews.2015,44,4023-71)。
上皮细胞粘附因子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)又称为CD326，TACSTDl，C017-lA，GA733-2和KSA等，属单次跨膜I型糖蛋白，分子质量为30～40kD，在各种类型的肿瘤组织中高水平表达，早在1979年就被认为是人类结肠癌的主要表面抗原，后被相继认为是人类上皮组织及人类上皮癌的表面标志物，现在也被认为是腺癌及其它类型癌症的标志物。生理情况下EpCAM不同程度地表达于除鳞状上皮之外所有的正常上皮中，且多位于细胞间紧密连接。在结缔组织及造血系统来源的细胞、脑组织和血管内皮细胞中缺乏明显的EpCAM的表达。病理情况下EpCAM几乎表达于所有的腺癌中，包括结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤。此外，EpCAM在癌症发展进程如黏附、侵袭、转移中，表达含量也会上调。因此，EpCAM常作为癌症早期诊断、治疗、预后、转移预防的重要靶标。为此，针对EpCAM的靶向抗体及核酸适配体在癌症诊治中扮演着重要角色(Xiang,et al.Theranostics.2015；5(10):1083–1097；Xie,etal.AdvFunct Mater.2015,25,1304-1313)。
发明内容
本发明的目的在于针对雷公藤红素在癌症治疗应用中的难溶性、毒副作用大等弊端，提供一种雷公藤红素-树状大分子缀合物及其制备方法与应用，从而拓宽功能化修饰的聚酰胺-胺型树状大分子(PAMAM dendrimers)在药物靶向传递及癌症精准治疗中的应用研究，为生物标记物丰富、靶标明确的癌症治疗提供药物制剂设计新策略。
所述雷公藤红素-树状大分子缀合物，由中心树枝状聚酰胺-胺型树枝状有机高分子(PAMAM dendrimers)纳米载体、聚乙二醇、表面靶向配体和雷公藤红素组成，所述中心树枝状聚酰胺-胺型树枝状有机高分子(PAMAM dendrimers)纳米载体、聚乙二醇、表面靶向配体之间通过酰胺共价键连接，但雷公藤红素与树状有机高分子纳米载体间的共价键包括酰胺键、酰腙键、酯键等中的一种；所述表面靶向配体包括抗体/适配体。
所述聚乙二醇为功能化的聚乙二醇。
所述雷公藤红素为抗癌药物雷公藤红素。
所述表面靶向配体，通常指针对EpCAM的靶向抗体或核酸适配体；但不局限于EpCAM，也可为MUC1、HER2等公认的肿瘤表面标志物。
所述一种雷公藤红素-树状大分子缀合物的制备方法包括以下步骤：
1)将PAMAM表面的氨基用丁二酸酐进行部分羧基化，透析冷冻干燥，得到PAMAM-COOH衍生物；
2)将PAMAM-COOH衍生物用EDC/NHS活化后，用功能化的聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)修饰，透析冷冻干燥，得到PAMAM-PEG-COOH衍生物；
3)将步骤2)中得到的PAMAM-PEG-COOH衍生物，用EDC/NHS活化后，进一步与EpCAM靶向核酸适配体连接，超滤除去未反应的适配体后，冷冻干燥制备得到多功能化的PAMAM衍生物；
4)用溶剂溶解雷公藤红素，进行EDC/NHS活化后；将活化后的雷公藤红素共价络合在步骤3)所得到的多功能化的PAMAM衍生物表面，透析除去多余的雷公藤红素及溶剂，而得到雷公藤红素-树状大分子缀合物；或
用溶剂溶解雷公藤红素，将EDC/NHS活化后的雷公藤红素先共价络合在步骤2)所得到的PAMAM-PEG-COOH衍生物表面，透析除去未反应的雷公藤红素后，用EDC/NHS活化，进行EpCAM抗体的功能化修饰，而得到雷公藤红素-树状大分子缀合物。
在步骤1)中，所述PAMAM的代数可为3～6代；PAMAM︰丁二酸酐的质量比可为2.25︰1。
在步骤2)中，所述PAMAM-COOH︰EDC︰NHS︰NH2-PEG-COOH的质量比可为1︰(1～2)︰(0.2～1)︰9。
在步骤3)中，所述PAMAM-PEG-COOH︰EDC︰NHS︰EpCAM的摩尔比可为1︰(10～50)︰(2.5～12.5)︰4。
在步骤4)中，雷公藤红素︰EDC︰NHS︰PAMAM-PEG-EpCAM的质量比为50︰180︰25︰166；所述溶剂可选自甲醇和水的混合液，所述甲醇与水的体积比可为5︰3。
在步骤1)和4)中，所述透析袋截留分子量可为3.5KD；步骤2)中所述透析袋截留分子量可为14KD；步骤3)所述超滤管的截留分子量可为30KD；在步骤4)中，所述雷公藤红素︰EDC︰NHS︰PAMAM-PEG-COOH聚合物的质量比为＝2︰4.22︰0.5︰20。
所述雷公藤红素-树状大分子缀合物可在治疗结肠癌、肝癌、乳腺癌等EpCAM表面膜蛋白丰富的癌症治疗中应用。
本发明的作用原理如下：
第一，采用PAMAM树状高分子作为雷公藤红素的传递载体，利用PAMAM水中良好的单分散性，解决雷公藤红素水溶性差的问题，并进一步改变雷公藤红素的使用剂型。
第二，由于该PAMAM进行过PEG化的修饰，大大延长了雷公藤红素在体内的循环时间和对肿瘤组织的穿透能力；相比于游离小分子药物的快速代谢，可减少给药剂量提高患者服药的依从性。
第三，由于PAMAM具有纳米级的尺寸，可使纳米药物利用肿瘤组织的EPR效应靶向到肿瘤组织中，提高雷公藤红素对肿瘤组织的靶向性；
第四，PAMAM通过靶向EpCAM的核酸适配体/抗体的修饰，能够携带雷公藤红素主动靶向到肿瘤细胞，进一步提高雷公藤红素对肿瘤细胞的选择性，减少毒副作用；
第五，该雷公藤红素-树状大分子纳米药物能够通过肿瘤细胞的受体-配体介导的内吞作用被摄取进入细胞，这种进入细胞的方式的效率要远远大于小分子裸药渗透进入细胞的效率，从而使雷公藤红素纳米药物能够迅速在细胞内达到较高的药物浓度，发挥更好的抗肿瘤效果。
本发明的有益效果是：
本发明可大大解决雷公藤红素水溶性差、生物利用度低的问题，为雷公藤红素临床使用提供新剂型。
本发明可有效解决雷公藤红素在癌症治疗中的脱靶效应，提高肿瘤治疗的选择性和特异性，为肿瘤靶向治疗提供新方案。
本发明因采取了聚乙二醇和核酸适配体修饰，可有效解决在体肿瘤组织药物的定点输送及胞内药物穿透的问题，为高效的化学药物治疗提供策略。
本发明因缀合物有多步骤的功能化修饰，大大降低了雷公藤红素使用的肝肾毒性，提高了在体应用的安全性。
本发明所述雷公藤红素-树状大分子缀合物的最终粒径小于100nm，不会形成给药栓塞，可适用于患者的静脉注射或者腹腔给药，从而为雷公藤红素药物使用提供多种可能。
本发明因PAMAM表面PEG化的修饰，不仅能增加载体的生物相容性，而且可以提高雷公藤红素在生物体内的循环时间，从而减少给药剂量和次数，提高患者服药的依从性。
本发明不仅适用于所有EpCAM靶标的癌症诊治，也为其它类似标志物的癌症治疗提供纳米制剂设计新思路。
本发明原料便宜，方法简单，易于操作，过程可控，有雷公藤红素新剂型进行产业化实施的良好前景。
为了克服现有技术的不足，本发明所述雷公藤红素-树状大分子缀合物经靶向EpCAM配体和聚乙二醇的功能化修饰，既解决了雷公藤红素水溶性差的问题，又利用肿瘤组织的EPR效应使得纳米药物被动靶向到肿瘤组织，同时利用EpCAM适配体/抗体与肿瘤膜蛋白EpCAM的特异性结合使纳米药物主动靶向输送并穿透到肿瘤细胞内部，从而提高抗肿瘤活性，减少毒副作用。此外，PEG的修饰能够延长纳米药物在体的循环时间，解决了小分子药物代谢快的问题，大大提高了患者给药的依从性。检索国内外相关文献和专利结果表明，一种雷公藤红素-树状大分子缀合物及其制备方法与应用尚未见报道。
附图说明
图1为雷公藤红素-树状大分子缀合物的1H-NHR谱图。
图2为雷公藤红素及雷公藤红素-树状大分子缀合物的水溶性对比图。
图3为雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物的扫描电镜图。
图4为雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物的水合粒径及电势分布图。
图5为树状大分子功能化修饰前后及雷公藤红素-树状大分子缀合物的紫外吸收图谱。在图5中，曲线a为G5-p-EpCAM，曲线b为Celastrol，曲线c为Celastrol-G5，曲线d为EpCAM。
图6为EpCAM适配体修饰的树状大分子衍生物体外靶向结合癌细胞的荧光图。
图7为雷公藤红素及雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物不同浓度下体外作用24h杀伤癌细胞SW620的效果图。
图8为雷公藤红素及雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物不同浓度下体外作用24h正常细胞AD293的效果图。
图9为雷公藤红素及雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物作用24h诱导癌细胞SW620和正常细胞AD293凋亡的流式图。
图10为雷公藤红素及雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物体内抑瘤效果分析(肿瘤大小测定)。
图11为雷公藤红素及雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物体内抑瘤效果分析(称重结果)。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例，在本发明权利要求所阐明的范围，可进行各种改变或同等替换。
实施例1：靶向EpCAM适配体修饰的雷公藤红素-第五代树状大分子缀合物的制备
(1)取20ml第五代PAMAM(G5-NH2)(5mg/ml)甲醇溶液，旋转去除甲醇后，完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入44.4mg丁二酸酐避光过夜常温搅拌反应24h，反应结束后用分子量3500的透析袋置于ddH2O中透析两天，然后冷冻干燥，得到G5-COOH聚合物。
(2)称取4.5mgG5-COOH聚合物溶于磷酸盐缓冲液(PBS,pH6.8)中，加入4.8mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，室温避光搅拌15min后，再加入1.4mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温继续搅拌45min，然后加入40.5mgNH2-PEG-COOH,室温避光过夜搅拌，反应结束后，用分子量14000的透析袋置于ddH2O中透析，透析过程中，用薄层色谱法(TLC)来监控产物是否透析完全。透析完全后，收集透析袋内的液体,冷冻干燥得到G5-PEG的聚合物。
(3)称取22.1mg的G5-PEG聚合物，溶于磷酸盐缓冲液(PBS,pH6.8)中，加入5.7mgEDC，室温避光搅拌15min后，加入1.4mgNHS,继续避光搅拌45min后，用截留分子量为3KDa的超滤管超滤除去过量的EDC和NHS，超滤结束后，用Binding Buffer稀释，加入26.1ulEpCAM或EpCAM-CY3适配体(10umol/L),室温避光过夜搅拌，反应结束后，用截留分子量30KDa的超滤管超滤，除去未反应的EpCAM或EpCAM-CY3，超滤结束后，冷冻干燥，得到G5-PEG-EpCAM或G5-PEG-EpCAM-CY3聚合物。
(4)称取2.5mg雷公藤红素，溶于甲醇︰水＝5︰3(v︰v)的混合溶液中，加入9mgEDC,室温避光搅拌15min后，再加入1.25mgNHS，室温避光搅拌45min，然后加入8.3mgG5-PEG-EpCAM或G5-PEG-EpCAM-CY3,放于4℃层析柜中避光过夜搅拌，反应结束后，用分子量3500的透析袋置于4℃ddH20中透析，除去未反应的雷公藤红素，冷冻干燥得到靶向EpCAM配体修饰的雷公藤红素-树状大分子纳米缀合物。
将制备得到的雷公藤红素-树状大分子缀合物进行1H NMR谱(图1)分析可知，该缀合物在δ3.42～3.68处出现PEG的特征峰，在δ1.08～2.69，δ7.97～8.11处出现雷公藤红素的特征峰，表明雷公藤红素-树状大分子缀合物的成功制备。而对比雷公藤红素经过功能化的纳米载体修饰前后的水溶性差异，由图2可发现，雷公藤红素本身水溶性很差，很难进行静脉注射应用。而制备成雷公藤红素-树状大分子缀合物后，其在水中的溶解性和分散性都很好，从而得到大大改善。
通过扫描电镜表征，图3可观察到所制备得到的雷公藤红素-树状大分子纳米缀合物有近球形的外貌，颗粒直径在39.23±1.57nm，小于200nm,有利于携带雷公藤红素进行体内循环和胞内穿透。
雷公藤红素-树状大分子缀合物的表面电势是体内循环和胞内穿透的重要参考。经动态光散射仪测试，图4表明，第五代树状大分子因表面有大量的氨基基团，故电势维持在18.075±1.58mV，但当经过逐步的PEG和靶向适配体EpCAM修饰，其表面电势有明显的降低，最终变为-3.49±0.45mV，呈现由正到负的逆转。
采用紫外分光光度法分析，由图5可知，雷公藤红素可共价连接在功能化树状大分子表面，并在427nm左右出现雷公藤红素的特征峰，尽管由于溶剂原因，缀合物的吸收峰出现部分红移(439nm)，但相对于其它物质的吸收峰而言，还是有明显的区分。
实施例2：靶向EpCAM抗体修饰的雷公藤红素-第五代树状大分子缀合物的制备
(1)取60ml第五代PAMAM(G5-NH2)(5mg/ml)甲醇溶液于旋转蒸发仪上去除甲醇，然后完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入133.2mg丁二酸酐避光过夜常温搅拌，反应结束后用分子量3500的透析袋置于ddH2O中透析两天，然后冷冻干燥，得到G5-COOH聚合物。
(2)称取3mg G5-COOH聚合物溶于pH6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入14.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，室温避光搅拌15min后，再加入4.2mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温继续搅拌45min，然后加入121.5mg NH2-PEG-COOH,室温避光过夜搅拌，反应结束后，用分子量14000的透析袋置于ddH2O中透析，透析过程中，用薄层色谱法(TLC)来监控产物是否透析完全。透析完全后，收集透析袋内的液体冷冻干燥，得到G5-PEG聚合物。
(3)称取2mg雷公藤红素溶解于甲醇︰水＝5︰3(v︰v)的混合溶液中，加入EDC4.22mg，室温避光搅拌15min，再加入NHS 0.5mg，继续室温避光搅拌45min，反应结束后，用乙酸乙酯和水萃取有机相，将得到的有机相于旋转蒸发仪上旋干，得到雷公藤红素-NHS活性酯。将所得到的活性酯同样溶解于甲醇︰水＝5︰3(v︰v)的混合溶液中，加入20mgG5-PEG聚合物，置于4℃层析柜中，避光过夜反应。反应结束后，用分子量3500的透析袋置于ddH2O中透析，直至透析外液中没有游离的雷公藤红素为止，然后冷冻干燥得到雷公藤红素-树状大分子偶联物。
(4)将上述所得的雷公藤红素-树状大分子偶联物完全溶解于PBS(pH6.8)中，加入5.12mgEDC，室温避光搅拌15min，后加入1.2mgNHS，继续室温避光搅拌45min，然后加入6ulEpCAM antibody/EpCAM-PE antibody(1mg/ml)，避光过夜反应，然后用分子量25000的透析袋在ddH2O进行透析，透析24h后，冷冻干燥，得到靶向EpCAM抗体修饰的雷公藤红素-树状大分子缀合物。
实施例3：靶向EpCAM适配体/抗体修饰的雷公藤红素-第六代树状大分子缀合物的制备(1)取20ml第六代PAMAM(G6-NH2)(5mg/ml)甲醇溶液于旋转蒸发仪上去除甲醇，然后完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入44mg丁二酸酐避光过夜常温搅拌，反应结束后用分子量3500的透析袋置于ddH2O中透析两天，然后冷冻干燥，得到G6-COOH聚合物。其它步骤同上(2)、(3)、(4)。
实施例4：雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物对结肠癌细胞的特异性结合分析
选取人结肠癌SW620细胞和人胚肾AD293细胞分别作为体外EpCAM高表达和低表达的细胞系。将SW620和AD293细胞分别以每孔(2～10)×103/孔的密度接种于含有盖玻片的24孔板内，于细胞培养箱培养24h后，去除旧培养基，加入含有5％FBS的Binding Buffer封闭30min后，分别加入浓度为240ug/ml的G5-PEG-EpCAM-CY3孵育2h。用PBS洗涤含药的培养基后，分别按比例加入线粒体(green)和细胞膜探针(deep red)孵育30min,吸弃染料，用1％的多聚甲醛于4℃固定过夜，DAPI(1ug/ml)染色10min。最后，封片，于激光共聚焦显微镜下观察、拍摄细胞图片。
激光共聚焦显微镜(图6)分析可看到，靶向配体修饰的雷公藤红素-树状大分子纳米缀合物可在2h内靶向结合结肠癌SW620细胞，而对AD293细胞几乎无结合，这可从细胞表面叠加的粉白色荧光观察到，从而证实了靶向EpCAM配体修饰的树状大分子衍生物的选择性和特异性。
实施例5：雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物对结肠癌细胞增殖的选择性抑制
将SW620或AD293细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中培养24h，分别加入0.5uM,1uM,1.5uM,2uM,2.5uM浓度梯度的雷公藤红素-G5-PEG-EpCAM纳米药物培养箱中孵育7h、24h。将游离雷公藤红素和同等质量的G5-PEG-EpCAMr用作阳性对照，不加任何药物的作为阴性对照。吸弃含药培养基后，每孔加入100ul新鲜培养液，同时加入20ulMTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO2(相对湿度90％)培养箱中培养4h后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150ulDMSO，避光振荡10min使结晶物充分溶解。最终于酶标仪490nm处测定各孔的吸收度(A)，按照以下公式计算：细胞存活率％＝(试验组平均A值-溶剂对照组A值)/(阴性对照组平均A值-溶剂对照组A值)×100％。
MTT增殖实验(图7和8)表明，雷公藤红素及雷公藤红素-树状大分子缀合物可浓度依赖性地导致SW620癌细胞的死亡，24h缀合物对SW620细胞的IC50值为1.446uM。而雷公藤红素本身也可导致人胚肾正常细胞AD293的死亡，且随着浓度增大，毒副作用增强，雷公藤红素24h对AD293细胞的IC50值为1.189uM。但在功能化树状大分子载体的携带作用下，雷公藤红素可选择性地增强抑制肿瘤细胞SW620的生长、增殖的能力，24h的IC50值从2.278uM降到1.446uM，而对AD293细胞的毒副作用减弱,从1.189uM增到1.909uM。而功能化的树状物载体随着浓度变化几乎对细胞无作用，展现其良好的细胞安全性。上述结果较好地证实了雷公藤红素-树状大分子缀合物对肿瘤细胞的靶向有效性。
实施例6：雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物选择性诱导结肠癌细胞凋亡的分析
将SW620或AD293细胞以每孔50×104个接种于6孔板中，贴壁生长24h后，每种细胞分别加入1、2、4uM的雷公藤红素、雷公藤红素-G5-PEG-EpCAM、G5-PEG-EpCAM含药培养基，同时设置空白培养基为阴性对照组，于37℃、5％CO2的培养箱共孵育24h后，收集上液及细胞。每孔分别加入500ulAnnexin V-FITC/PI混合液，室温避光染色15min后,于流式细胞仪上分析雷公藤红素-树状大分子纳米药物对两种细胞的凋亡诱导情况。
流式凋亡(图9)分析，雷公藤红素-树状大分子缀合物仍旧保留修饰前雷公藤红素的促进癌细胞SW620凋亡的效应，24h在2uM的剂量下，诱导SW620凋亡率达到20％左右，展现了缀合物良好的抗癌效果。而对比雷公藤红素，缀合物诱导细胞凋亡的状态有所不同。雷公藤红素更多的是促使肿瘤细胞处于晚期凋亡或坏死状态；而缀合物则更多地诱导肿瘤细胞到早期凋亡状态。此外，缀合物可相对减轻雷公藤红素对人正常AD293细胞的毒性，细胞凋亡率从54％降为19％，展现其良好的癌细胞靶向性和细胞安全性。
实施例7：雷公藤红素-树状大分子纳米药物缀合物体内抑瘤效果分析
首先皮下接种结肠癌SW620，每只裸鼠接种0.2ml上述细胞悬液(细胞浓度为107/ml)，当裸鼠移植瘤体积达到1000mm3时，选择无出血、坏死、感染的裸鼠进行实验，将裸鼠随机分配为对照组(生理盐水组)，给药组(0.4mg/kg celastrol,0.4mg/kg celastrol-G5-PEG-EpCAM,G5-PEG-EpCAM)，每个组4只裸鼠，在第1,4,7,10,13和16天分别尾静脉给药，并隔天监测肿瘤的大小和体重，观察抑瘤效果。
通过测定肿瘤大小发现(图10)，间隔2天给药，连续18天后，相对于生理盐水组，给药组可不同程度抑制裸鼠的肿瘤生长。而相对于游离雷公藤红素组，雷公藤红素-树状大分子缀合物组的裸鼠肿瘤体积下降了4倍，可见，在同等剂量的雷公藤红素下，雷公藤红素-树状大分子缀合物可展现出更好的肿瘤生长抑制能力。称重结果(图11)也显示，给药组的裸鼠肿瘤相对于生理盐水组，肿瘤瘤重增值减少，其中雷公藤红素-树状大分子缀合物肿瘤增重最少(0.5g)。可见，而肿瘤大小的变化与肿瘤生长抑制的趋势是一致的，从而证实了在低剂量下雷公藤红素(0.4mg/kg)，缀合物也可展现出比游离雷公藤红素更强的体内抑瘤效果。

Claims (4)

1.一种雷公藤红素-树状大分子缀合物，其特征在于由中心树枝状聚酰胺-胺型树枝状有机高分子纳米载体、聚乙二醇、表面靶向配体和雷公藤红素组成，所述中心树枝状聚酰胺-胺型树枝状有机高分子纳米载体、聚乙二醇、表面靶向配体之间通过酰胺共价键连接，所述表面靶向配体包括抗体/适配体；所述聚乙二醇为功能化的聚乙二醇；所述雷公藤红素为抗癌药物雷公藤红素；
所述一种雷公藤红素-树状大分子缀合物的制备方法包括以下步骤：
1)将PAMAM表面的氨基用丁二酸酐进行部分羧基化，透析冷冻干燥，得到PAMAM-COOH衍生物；所述PAMAM的代数为3～6代；PAMAM︰丁二酸酐的质量比为2.25︰1；
2)将PAMAM-COOH衍生物用EDC/NHS活化后，用功能化的聚乙二醇NH2-PEG-COOH修饰，透析冷冻干燥，得到PAMAM-PEG-COOH衍生物；所述PAMAM-COOH︰EDC︰NHS︰NH2-PEG-COOH的质量比为1︰(1～2)︰(0.2～1)︰9；
3)将步骤2)中得到的PAMAM-PEG-COOH衍生物，用EDC/NHS活化后，进一步与EpCAM靶向核酸适配体连接，超滤除去未反应的适配体后，冷冻干燥制备得到多功能化的PAMAM衍生物；所述PAMAM-PEG-COOH︰EDC︰NHS︰EpCAM的摩尔比为1︰(10～50)︰(2.5～12.5)︰4；
4)用溶剂溶解雷公藤红素，进行EDC/NHS活化后；将活化后的雷公藤红素共价络合在步骤3)所得到的多功能化的PAMAM衍生物表面，透析除去多余的雷公藤红素及溶剂，而得到雷公藤红素-树状大分子缀合物；或
用溶剂溶解雷公藤红素，将EDC/NHS活化后的雷公藤红素先共价络合在步骤2)所得到的PAMAM-PEG-COOH衍生物表面，透析除去未反应的雷公藤红素后，用EDC/NHS活化，进行EpCAM抗体的功能化修饰，而得到雷公藤红素-树状大分子缀合物；
雷公藤红素︰EDC︰NHS︰PAMAM-PEG-EpCAM的质量比为50︰180︰25︰166；所述溶剂选自甲醇和水的混合液，所述甲醇与水的体积比为5︰3。
2.如权利要求1所述一种雷公藤红素-树状大分子缀合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将PAMAM表面的氨基用丁二酸酐进行部分羧基化，透析冷冻干燥，得到PAMAM-COOH衍生物；所述PAMAM的代数为3～6代；PAMAM︰丁二酸酐的质量比为2.25︰1；
2)将PAMAM-COOH衍生物用EDC/NHS活化后，用功能化的聚乙二醇NH2-PEG-COOH修饰，透析冷冻干燥，得到PAMAM-PEG-COOH衍生物；所述PAMAM-COOH︰EDC︰NHS︰NH2-PEG-COOH的质量比为1︰(1～2)︰(0.2～1)︰9；
3)将步骤2)中得到的PAMAM-PEG-COOH衍生物，用EDC/NHS活化后，进一步与EpCAM靶向核酸适配体连接，超滤除去未反应的适配体后，冷冻干燥制备得到多功能化的PAMAM衍生物；所述PAMAM-PEG-COOH︰EDC︰NHS︰EpCAM的摩尔比为1︰(10～50)︰(2.5～12.5)︰4；
4)用溶剂溶解雷公藤红素，进行EDC/NHS活化后；将活化后的雷公藤红素共价络合在步骤3)所得到的多功能化的PAMAM衍生物表面，透析除去多余的雷公藤红素及溶剂，而得到雷公藤红素-树状大分子缀合物；
雷公藤红素︰EDC︰NHS︰PAMAM-PEG-EpCAM的质量比为50︰180︰25︰166；所述溶剂选自甲醇和水的混合液，所述甲醇与水的体积比为5︰3；
用溶剂溶解雷公藤红素，将EDC/NHS活化后的雷公藤红素先共价络合在步骤2)所得到的PAMAM-PEG-COOH衍生物表面，透析除去未反应的雷公藤红素后，用EDC/NHS活化，进行EpCAM抗体的功能化修饰，而得到雷公藤红素-树状大分子缀合物；
所述雷公藤红素︰EDC︰NHS︰PAMAM-PEG-COOH聚合物的质量比为＝2︰4.22︰0.5︰20。
3.如权利要求2所述一种雷公藤红素-树状大分子缀合物的制备方法，其特征在于在步骤1)和4)中，所述透析袋截留分子量为3.5KD；步骤2)中所述透析袋截留分子量为14KD；步骤3)所述超滤管的截留分子量为30KD。
4.如权利要求1所述雷公藤红素-树状大分子缀合物在制备治疗结肠癌、肝癌、乳腺癌EpCAM表面膜蛋白丰富的癌症药物中的应用。
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