CN107573503A - 一种靶向载药聚合物及其制备方法以及一种聚合物胶束载响应性前药体系及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向载药聚合物，具有式(I)所示结构。本发明提供的靶向载药聚合物带有靶向基团，可以靶向到肿瘤部位并富集，当响应性前药与靶向聚合物结合后可以增加在肿瘤部位的药物浓度；其次，响应性前药可以在肿瘤部位响应性释放出抗肿瘤药，通过改变酸酐的结构可以调控不同的酸度响应性，发生不同程度的断裂。再次，本发明通过提供的靶向的RGD‑聚乙二醇‑b‑聚(L‑赖氨酸)中各嵌段长度不同来调控纳米颗粒的粒径和载药率。
Description
技术领域
本发明属于高分子药物载体技术领域，具体涉及一种靶向载药聚合物及其制备方法以及一种聚合物胶束载响应性前药体系及其制备方法。
背景技术
肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一。临床上常用的癌症治疗手段有化学治疗、放射治疗和手术治疗等，其中，化学治疗是最常用和重要的治疗途径。但临床上所用的响应性抗肿瘤前药物在应用中有诸多的缺陷，如：水溶性剂稳定性差、药物毒副作用大，在治疗疾病的同时也杀死了人体的正常细胞。而药物传递系统和控制释放恰恰能够解决这些问题。药物控制释放是指将药物和适当载体按照一定的比例和形式制成制剂，在进入人体后控制药物在人体内部的作用部位、作用时间以及吸收和代谢的过程。和传统的直接用药方式相比较，药物控制释放的优点有：(1)可实现药物的主动或被动靶向传递，将药物直接作用与病变部位，降低了药物对正常人体细胞和组织的毒副作用；(2)可以对药物在人体内作用时间加以调节，适当延长药物作用的时间，尤其对需要长期用药的病人，可以减少频繁用药的痛苦；(3)由于药物载体的靶向作用，提高了药物的利用率，尤其对于比较昂贵的药物如响应性抗肿瘤前药物，具有很重要的意义。
常用的药物载体有无机材料纳米粒子、聚合物胶束、树枝状聚合物、脂质体以及聚合物纳米水凝胶等。传统的聚合物胶束是以两亲性分子在水溶液中形成疏水的内核和亲水的外壳的核壳结构，通过静电和疏水相互作用载抗肿瘤前药。其中靶向的聚合物胶束可以靶向到肿瘤部位，减少长循环过程中的泄露，降低药物的毒副作用。因此，靶向聚合物胶束是一种理想的药物载体。
其中，能对肿瘤组织微环境做出响应的环境敏感型的抗肿瘤前药具有良好的应用前景。环境敏感型的抗肿瘤前药能够有效的将药物带到病灶部位，在肿瘤组织特殊环境的刺激下，迅速的释放药物，以减少药物对正常组织的毒副作用，更好地发挥药效。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种靶向载药聚合物及其制备方法以及一种聚合物胶束载响应性前药体系及其制备方法，本发明提供的靶向载药聚合物带有靶向基团，可以靶向到肿瘤部位并富集，并且合成的响应性前药可以降低长循环过程中不必要的药物释放带来的细胞毒性，在肿瘤组织特殊环境的刺激下，迅速的释放药物，实现肿瘤部位酸度响应性释放。
本发明提供了一种靶向载药聚合物，具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，20≤y≤35。
本发明还提供了一种靶向载药聚合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐在有机溶剂中混合，进行反应，得到N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；
B)将所述N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)在强酸性溶液中进行脱保护，得到烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；
C)将所述烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)经过纯化后，在有机溶剂中与RGD反应，透析，冻干，得到靶向载药聚合物，所述靶向载药聚合物具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，20≤y≤35。
本发明还提供了一种聚合物胶束载响应性前药体系，由靶向载药聚合物与响应性抗肿瘤前药物制备而成，所述靶向载药聚合物具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，，20≤y≤35。
优选的，所述聚合物胶束载响应性前药体系的粒径为10～200nm。
优选的，所述响应性抗肿瘤前药物选自式(101)～式(105)所示的化合物中的一种或多种：
优选的，所述式(102)～式(105)所示的化合物按照如下方法进行制备：
在以三乙胺为引发剂存在的条件下，将阿霉素盐酸盐与酸酐R在有机溶剂中反应，得到阿霉素前药，所述酸酐R选自式(201)～式(214)所示的结构中的一种：
优选的，所述靶向载药聚合物与响应性抗肿瘤前药物的质量比为(0.5～0.05)：1。
本发明还提供了一种上述聚合物胶束载响应性前药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将靶向载药聚合物溶解于缓冲液中，得到第一溶液；
将响应性抗肿瘤前药物溶解于去离子水中，得到第二溶液；
将所述第二溶液与第一溶液混合，透析，冻干，得到聚合物胶束载响应性前药体系，
所述靶向载药聚合物，具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，，20≤y≤35。
优选的，所述缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液。
与现有技术相比，本发明提供了一种靶向载药聚合物，具有式(I)所示结构。本发明提供的靶向载药聚合物带有靶向基团，可以靶向到肿瘤部位并富集，当响应性前药与靶向聚合物结合后可以增加在肿瘤部位的药物浓度；其次，响应性前药可以在肿瘤部位响应性释放出抗肿瘤药，通过改变酸酐的结构可以调控不同的酸度响应性，发生不同程度的断裂。再次，本发明通过提供的靶向的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)中各嵌段长度不同来调控纳米颗粒的粒径和载药率。
附图说明
图1为实施例4和实施例5制备的产物的核磁谱图；
图2为实施例6～8得到的产物的核磁谱图；
图3为DOX-丁二酸酐的质谱谱图；
图4为DOX-顺丁烯二酸酐的质谱图；
图5为DOX-2,3-二甲基马来酸酐的质谱图；
图6为实施例9、10、11所制备的聚合物胶束载响应性前药体系的药物释放曲线；
图7为实施例9、10、11所制备的载药体系的细胞毒性试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向载药聚合物，具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，，20≤y≤35。
具有式(I)所示结构的靶向载药聚合物为RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)，通过调节嵌段的长度可以调控纳米颗粒的粒径和载药率。优选的，75≤x≤100，25≤y≤30。
本发明提供的靶向载药聚合物带有靶向基团，可以靶向到肿瘤部位并富集，当载有响应性前药时，可以增加肿瘤部位的药物浓度。
本发明还提供了一种靶向载药聚合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐在有机溶剂中混合，进行反应，得到N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；
B)将所述N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)在强酸性溶液中进行脱保护，得到烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；
C)将所述烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)经过纯化后，在有机溶剂中与RGD反应，透析，冻干，得到靶向载药聚合物，所述靶向载药聚合物具有式(I)所示结构：
其中68≤x≤113，，20≤y≤35。
本发明首先将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚(即端氨基化的aPEG)与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐在有机溶剂中混合，进行反应，得到N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)。
其中，所述端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚的来源为市售，也可为自制的，本发明优选按照以下方法进行制备：
S1)将烯丙基聚氧乙烯醚与甲苯共沸除水后，除去甲苯，再加入第一有机溶剂、三乙胺与甲基磺酰氯混合，进行反应，得到甲基磺酸烯丙基聚氧乙烯醚酯；
S2)将所述甲基磺酸烯丙基聚氧乙烯醚酯与氯化铵在氨水中混合，进行氨解反应，得到端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚。
将烯丙基聚氧乙烯醚与甲苯共沸除水后，继续除去甲苯。其中，所述烯丙基聚氧乙烯醚的数均分子量为3000。
接着，加入第一有机溶剂、三乙胺与甲基磺酰氯混合，进行反应，得到甲基磺酸烯丙基聚氧乙烯醚酯。其中，所述第一有机溶剂用于溶解烯丙基聚氧乙烯醚，优选为二氯甲烷；所述烯丙基聚氧乙烯醚的质量与第一有机溶剂的体积比优选为1g：(1～20)ml，更优选为1g：(3～18)ml，再优选为1g：(5～15)ml；所述三乙胺与烯丙基聚氧乙烯醚的摩尔比优选为(1～10)：1，更优选为(3～8)：1，再优选为(4～7)：1；所述甲基磺酰氯与烯丙基聚氧乙烯醚的摩尔比优选为(2～20)：1，更优选为(5～18)：1，再优选为(8～14)：1；所述三乙胺与甲基磺酰氯的摩尔比优选为(1～10)：(10～30)，更优选为(3～8)：(18～26)，再优选为(4～7)：(15～24)。
加入第一有机溶剂、三乙胺与甲基磺酰氯混合，进行反应，所述反应优选先在-10℃～10℃、无水的条件下进行，更优选为-8℃～8℃，再优选为-5℃～5℃；所述反应的时间优选为0.5～4h，更优选为1～3.5h，再优选为1.5～2.5h；然后升温至12℃～40℃，更优选为15℃～35℃，再优选为15℃～28℃，在搅拌的条件下继续进行反应，时间优选为10～72h，更优选为15～60h，再优选为20～48h。
反应完成之后，优选将反应液过滤，滤液浓缩后，用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后得到甲基磺酸烯丙基聚氧乙烯醚酯，所述干燥优选在10℃～40℃的条件下进行真空干燥，更优选为15℃～38℃，再优选为20℃～30℃；所述干燥的时间优选为15～35h，更优选为18～30h，再优选为22～28h。
将所述甲基磺酸烯丙基聚氧乙烯醚酯与氯化铵在氨水中混合，其中，所述甲基磺酸烯丙基聚氧乙烯醚酯的质量、氯化铵的质量与氨水的体积比优选为1g：(0.2～3.5)g：(30～70)ml，更优选为1g：(0.5～3)g：(35～55)ml，再优选为1g：(1～1.8)g：(40～50)ml。
在氨水中，甲基磺酸烯丙基聚氧乙烯醚酯与氯化铵进行氨解反应；所述氨解反应的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，再优选为20℃～30℃；所述氨解反应的时间优选为40～100h，更优选为50～85h，再优选为60～75h。
氨解反应完成后，优选将反应液用二氯甲烷萃取，然后用氯化钠水溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后，得到端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚。所述干燥优选在10℃～40℃的条件下进行真空干燥，更优选为15℃～35℃，再优选为20℃～30℃；所述干燥的时间优选为15～35h，更优选为18～30h，再优选为20～28h。
在本发明中，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐优选按照以下步骤进行制备：
将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐。
所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1：(0.1～1.2)，更优选为1：(0.3～1)，再优选为1：(0.5～0.8)；所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸优选先用第二有机溶剂进行溶解，然后再与双(三氯甲基)碳酸酯混合进行缩合反应，所述第二有机溶剂优选为四氢呋喃；所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，再优选为20℃～30℃；所述缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，再优选为40℃～60℃；所述缩合反应的时间优选为0.1～5h，更优选为0.15～3h，再优选为0.2～2h。
缩合反应之后，优选用石油醚进行沉降，然后将沉降物分离，洗涤、重结晶、干燥后，得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐。
将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐在有机溶剂中混合，进行反应，得到N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)。具体为：
将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚溶于第三有机溶剂中，得到端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚溶液；
将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶于第四有机溶液中，得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶液；
将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚溶液与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶液混合，进行反应，得到N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)。
按照本发明，所述端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚优选先与无水甲苯共沸除水后，再溶于第三有机溶剂中。所述端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚的质量与无水甲苯的体积比优选为1g：(10～50)ml，更优选为1g：(15～45)ml，再优选为1g：(25～35)ml；所述共沸的温度优选为110℃～150℃，更优选为115℃～140℃，再优选为125℃～135℃；所述共沸的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，再优选为1.8～2.2h；所述第三有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺与三氯甲烷中的一种或多种，更优选为N,N-二甲基甲酰胺；所述第四有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺与三氯甲烷中的一种或多种，更优选为N,N-二甲基甲酰胺。
将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚溶液与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶液优选在保护气氛的条件下混合，进行反应。所述保护气氛为本领域技术人员熟知的保护气氛即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氮气；所述端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的摩尔比优选为1：(5～120)，更优选为1：(10～100)，再优选为1：(15～90)；所述反应的温度优选为15℃～45℃，更优选为20℃～40℃，再优选为25℃～35℃；所述反应的时间优选为20～80h，更优选为24～72h，再优选为30～70h。
端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐反应完成之后，将反应产物N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)进行纯化，具体方法如下：
用减压抽干的方法除去有机溶剂，用氯仿溶解得到的固体，然后用乙醚沉降，过滤、洗涤、真空干燥后得到N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)。
将N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)在强酸性溶液中进行脱保护，其中，所述强酸性溶液优选为溴化氢的乙酸溶液，所述溴化氢与乙酸的体积比优选为(0.5～5)：1，更优选为2：1；本发明中优选将N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)溶于有机酸性溶剂中，然后再与强酸性溶液混合进行脱保护，所述有机酸性溶剂优选为三氟乙酸和/或二氯乙酸，更优选为三氟乙酸；所述脱保护的时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h，再优选为1h。
脱保护完成之后，将产物烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)进行纯化，具体方法为：
将脱保护后的产物倒入乙醚中，抽滤，将得到的固体用水溶解，进行透析，冻干后得到烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；所述透析优选用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析三天，每隔4h换一次透析液。
接着，将所述烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)与RGD混合进行反应，本发明优选将烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)和RGD溶解于第四有机溶剂中，进行反应；所述烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)与RGD的摩尔比优选为1：(1.2～1)。
按照本发明，所述烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)与RGD混合进行反应后，透析、冻干，得到靶向的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)；所述透析优选用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析三天，每隔4h换一次透析液。
一种聚合物胶束载响应性前药体系，由靶向载药聚合物与响应性抗肿瘤前药物制备而成，所述靶向载药聚合物具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，，20≤y≤35。
在溶液中式(I)所示的靶向的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)与响应性抗肿瘤前药物通过静电和疏水相互作用得到聚合物胶束载响应性前药体系，具有肿瘤组织靶向与肿瘤细胞内微环境响应性。
首先，本发明将响应性前药与靶向聚合物结合，使其可以靶向到肿瘤部位，在肿瘤部位富集，增加在肿瘤部位的药物浓度；其次，响应性前药可以在肿瘤部位响应性释放出抗肿瘤药，通过改变酸酐的结构可以调控不同的酸度响应性，发生不同程度的断裂,达到控制释放的作用；再次，本发明通过提供的靶向的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)中各嵌段长度不同来调控纳米颗粒的粒径和载药率。
在本发明中，所述响应性抗肿瘤前药物选自式(101)～式(105)所示的化合物中的一种或多种：
所述式(102)～式(105)所示的化合物按照如下方法进行制备：
在以三乙胺为引发剂存在的条件下，将阿霉素盐酸盐与酸酐R在有机溶剂中反应，得到阿霉素前药，所述酸酐R选自式(201)～式(214)所示的结构中的一种：
在以三乙胺为引发剂存在的条件下，将阿霉素盐酸盐与酸酐R在第五有机溶剂中反应，得到反应液；
其中，所述第五有机溶剂用于溶解阿霉素、酸酐R，优选为DMF；所述阿霉素质量与第一有机溶剂的体积比优选为1g：(10～100)ml，更优选为1g：(20～80)ml，再优选为1g：(40～60)ml；所述三乙胺与酸酐R的摩尔比优选为(1～1.5)：1，更优选为(1.1～1.4)：1，再优选为1.2：1；
用第六有机溶剂溶解所述反应液，再用酸性饱和氯化钠水溶液洗数次，中性饱和氯化钠溶液洗数次，干燥剂干燥，过滤，抽干，得到阿霉素前药。
所述靶向载药聚合物与响应性抗肿瘤前药物的质量比为(0.05～0.5)：1，优选为(0.1～0.4)：1，更优选为(0.2～0.3)：1。
按照本发明，所述聚合物胶束载响应性前药体系的粒径优选为10～200nm。
本发明还提供了一种上述聚合物胶束载响应性前药体系的制备方法，包括以下步骤：
将靶向载药聚合物溶解于缓冲液中，得到第一溶液；
将响应性抗肿瘤前药物溶解于去离子水中，得到第二溶液；
将所述第二溶液与第一溶液混合，透析，冻干，得到聚合物胶束载响应性前药体系，
所述靶向载药聚合物，具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，，20≤y≤35。
所述缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液，更优选为pH值为5～8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，再优选为pH值为7～7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
将式(I)所示的靶向的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)溶解于缓冲液中，得到第一溶液；其中所述溶解的温度优选为4℃～20℃，更优选为4℃～8℃，再优选为4℃；所述溶解的时间优选为8～24h，更优选为8～16h，再优选为8h。
将响应性抗肿瘤前药物溶解于去离子水中，得到第二溶液；其中所述溶解的温度优选为4℃～20℃，更优选为4℃～8℃，再优选为4℃；所述溶解的时间优选为8～24h，更优选为8～16h，再优选为8h。
所述式(I)所示的靶向的RGD-的聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)与响应性抗肿瘤前药物的质量比为(0.5～0.05)：1。
将所述第二溶液与第一溶液混合，优选将第二溶液加入第一溶液中进行混合，所述混合的时间优选为8～24h，更优选为8～16h，再优选为8h，然后透析、冻干，得到聚合物胶束载响应性前药体系，所述透析的温度优选为4℃～20℃，更优选为4℃～8℃，再优选为4℃；所述透析的时间优选为4～12h，更优选为4～8h，再优选为8h。
本发明提供的聚合物胶束载响应性前药体系具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解得到的产物为氨基酸和聚乙二醇，可通过肾脏排出体外，对人体无害；并且本发明制备方法操作简单，原料简单易得，反应条件温和。
本发明提供的靶向载药聚合物带有靶向基团，可以靶向到肿瘤部位并富集，当响应性前药与靶向聚合物结合后可以增加在肿瘤部位的药物浓度；其次，响应性前药可以在肿瘤部位响应性释放出抗肿瘤药，通过改变酸酐的结构可以调控不同的酸度响应性，发生不同程度的断裂。再次，本发明通过提供的靶向的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)中各嵌段长度不同来调控纳米颗粒的粒径和载药率。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的靶向载药聚合物及其制备方法以及一种聚合物胶束载响应性前药体系及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
称取15g数均分子量为3000(0.005mol)的烯丙基聚氧乙烯醚，放入干燥的带支口的反应瓶中，分别加入100ml甲苯共沸除水，然后将得到的固体物分别溶于100ml无水二氯甲烷中，冷却至0℃，分别加入2.53g(0.025mol)、三乙胺，然后分别滴加11.46g甲基磺酰氯。甲基磺酰氯滴加结束后0℃反应2h，恢复至25℃，在搅拌下继续反应24h，反应结束后过滤除去生成的沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤，洗涤，25℃下真空干燥24h，得到甲基磺酸聚乙二醇酯。
称取8g所得到的甲基磺酸聚乙二醇酯，另外分别称取8g氯化铵，溶解于80ml氨水中，室温搅拌3天。反应结束后，加入过量的氯化钠只饱和,用500ml二氯甲烷萃取，用5％氯化钠溶液洗涤3次，转移到锥形瓶中，用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，40℃旋转蒸发浓缩至100ml，将浓缩液倒入1000ml的无水乙醚中，抽滤得到固体，用真空干燥器干燥，得到端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚。
实施例2
将1molN-苄氧羰基-L-赖氨酸与0.6mol双(三氯甲基)碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐。
实施例3
称取实施例1制备的0.3g数均分子量为3000的端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚，加入到除水除氧的反应瓶中，加入30ml无水甲苯，在油浴中加热到125℃，共沸2h，除去甲苯，再用油泵抽去残留甲苯，加入20mlN,N-二甲基甲酰胺，待固体溶解后，分别称取1.71g N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气气氛下，将所得实施例2制备的N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶液与实施例1制备的端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚，溶液混合，室温搅拌3天进行聚合反应，聚合反应结束后，用减压抽干的方法除去得到反应液中的N,N-二甲基甲酰胺，用氯仿溶解得到的固体，然后用乙醚进行沉降，对得到的沉降物进行抽滤、洗涤、真空干燥，得到烯丙基聚氧乙烯醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)。
实施例4
称取3g实施例3制备的烯丙基聚氧乙烯醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)于圆底烧瓶中，其中，再加入30mL三氟乙酸使其完全溶解，再加入9mL三氟乙酸的溴化氢(33％)溶液，防止暴沸，搅拌一小时。脱保护完成之后，优选倒入乙醚中，抽滤，将得到的固体用水溶解，进行透析，冻干后得到烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；所述透析袋优选用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析三天，每隔4h换一次透析液。得到烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)。对所述烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)进行核磁分析，结果见图1，图1为实施例4和实施例5制备的产物的核磁谱图。图1中，1为烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)核磁谱图，2为RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)的核磁谱图。
实施例5
称取0.5g实施例4制备的双键聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)与0.04g RGD于干燥的安瓶中，加入20mLDMF使其充分溶解。用液氮冻住，用油泵抽半个小时。与水浴中使其融化，再用液氮冻住，用泵抽半个小时，重复三次。75℃反应24小时。乙醚沉降两次，将产物溶于水，透析，冻干。得到RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)。对所述RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)进行核磁分析，结果见图1，图1为实施例4和实施例5制备的产物的核磁谱图。图1中，1为烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)核磁谱图，2为RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)的核磁谱图。
实施例6
称取100mg盐酸阿霉素、20mg丁二酸酐于干燥的安瓶中，在加入6mL DMF使其完全溶解，再加入24μLTEA反应24h。乙酸乙酯萃取反应液，依次用pH＝2～3的饱和氯化钠溶液和pH＝7.4饱和氯化钠溶液洗涤。保留有机相，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，真空抽干溶剂得到DOX-丁二酸酐。对所述DOX-丁二酸酐进行核磁分析，结果见图2，图2为实施例6～8得到的产物的核磁谱图。对所述DOX-丁二酸酐进行质谱分析，结果见图3，图3为DOX-丁二酸酐的质谱谱图。
实施例7
称取100mg盐酸阿霉素、20mg顺丁烯二酸酐酸酐于干燥的安瓶中，在加入6mLDMF使其完全溶解，再加入24μLTEA反应24h。乙酸乙酯萃取反应液，依次用pH＝2～3的饱和氯化钠溶液和pH＝7.4饱和氯化钠溶液洗涤。保留有机相，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，真空抽干溶剂得到DOX-顺丁烯二酸酐。对所述DOX-顺丁烯二酸酐进行核磁分析，结果见图2，图2为实施例6～8得到的产物的核磁谱图。对所述DOX-顺丁烯二酸酐进行质谱分析，结果见图4，图4为DOX-顺丁烯二酸酐的质谱图。
实施例8
称取100mg盐酸阿霉素、25mg 2,3-二甲基马来酸酐于干燥的安瓶中，在加入6mLDMF使其完全溶解，再加入24μLTEA反应24h。乙酸乙酯萃取反应液，依次用pH＝2～3的饱和氯化钠溶液和pH＝7.4饱和氯化钠溶液洗涤。保留有机相，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，真空抽干溶剂得到DOX-2,3-二甲基马来酸酐。对所述DOX-2,3-二甲基马来酸酐进行核磁分析，结果见图2，图2为实施例6～8得到的产物的核磁谱图。对所述DOX-2,3-二甲基马来酸酐进行质谱分析，结果见图5，图5为DOX-2,3-二甲基马来酸酐的质谱图。
实施例9
称取10mg实施例4中制备的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)溶解于pH值为7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液中，在4℃下搅拌溶解，得到溶液一；将2.5mg实施例6制备的DOX-丁二酸酐溶解于去离子水中，搅拌溶解，得到溶液二；将溶液二加入到溶液一中，得到溶液三，在4℃下搅拌8h，透析8h，4℃冻干，得到聚合物胶束载响应性前药体系。
实施例10
称取10mg实施例4中制备的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)溶解于pH值为7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液中，在4℃下搅拌溶解，得到溶液一；将2.5mg实施例7制备的DOX-顺丁烯二酸酐溶解于去离子水中，搅拌溶解，得到溶液二；将溶液二加入到溶液一中，得到溶液三，在4℃下搅拌8h，透析8h，4℃冻干，得到聚合物胶束载响应性前药体系。
实施例11
称取10mg实施例4中制备的RGD-聚乙二醇-b-聚(L-赖氨酸)溶解于pH值为7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液中，在4℃下搅拌溶解，得到溶液一；将2.5mg实施例8制备的DOX-2,3-二甲基马来酸酐溶解于去离子水中，搅拌溶解，得到溶液二；将溶液二加入到溶液一中，得到溶液三，在4℃下搅拌8h，透析8h，4℃冻干，得到聚合物胶束载响应性前药体系。
实施例12
在pH值为7.4、6.8和5.5环境下，分别将实施例9、10、11得到的载药体系进行药物释放测试，结果参见图6，图6为实施例9、10、11所制备的聚合物胶束载响应性前药体系的药物释放曲线。图6中，A为pH5.5条件下聚合物胶束载响应性前药体系的药物释放曲线；B为pH6.8条件下聚合物胶束载响应性前药体系的药物释放曲线；C为pH7.4条件下聚合物胶束载响应性前药体系的药物释放曲线。在图6的A图、B图和C图中，1为cRGD-PEG-PLL/DOX-丁二酸，2为aPEG-PLL/DOX-丁二酸，3为cRGD-PEG-PLL/DOX-2,3-二甲基马来酸，4为a PEG-PLL/DOX-2,3-二甲基马来酸，5为cRGD-PEG-PLL/DOX-四氢苯酐，6为aPEG-PLL/DOX-四氢苯酐。
由图6可知，本发明提供的载响应性前药体系进入细胞后，在cRGD存在的条件下靶向到肿瘤细胞，在肿瘤部位富集，接着在肿瘤细胞内较低的pH条件下，不同阿霉素衍生物中的酯键发生不同程度断裂，从而快速释放药物，达到逐级响应的智能释放药物的效果，实现抑制肿瘤的目的。
将实施例9、10、11得到的载药体系对HpG2细胞(购买于中科院细胞库)进行细胞毒性试验，具体方法为：将HpG2细胞均匀种在96孔板中，每孔细胞数7000，分别用pH＝6.8，pH＝7.4的培养基培养，体积为200μL。然后，将阿霉素浓度依次为10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.1562mg·mL-1的阿霉素溶液和载药阿霉素溶液加入到pH＝6.5，pH＝7.4培养基的孔板中，有一组不经过任何处理作为对照组，再次培养48小时。最后吸去培养基，用含有噻唑蓝的溶液处理，分别测试在490纳米处的吸收值。其中，细胞存活率使用以下公式计算，即载药组紫外吸收值与空白组紫外吸收值之比×100：
结果参见图7，图7为实施例9、10、11所制备的载药体系的细胞毒性试验结果。图7中，A为pH6.8条件下载药体系的细胞毒性试验结果，B为pH7.4条件下载药体系的细胞毒性试验结果。在图6的A图和B图中，1为cRGD-PEG-PLL/DOX-丁二酸，2为aPEG-PLL/DOX-丁二酸，3为cRGD-PEG-PLL/DOX-2,3-二甲基马来酸，4为a PEG-PLL/DOX-2,3-二甲基马来酸，5为cRGD-PEG-PLL/DOX-四氢苯酐，6为aPEG-PLL/DOX-四氢苯酐。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种靶向载药聚合物，其特征在于，具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，20≤y≤35。
2.一种靶向载药聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将端氨基化的烯丙基聚氧乙烯醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐在有机溶剂中混合，进行反应，得到N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；
B)将所述N-苄氧羰基保护的烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)在强酸性溶液中进行脱保护，得到烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)；
C)将所述烯丙基聚氧乙烯醚-b-聚(L-赖氨酸)经过纯化后，在有机溶剂中与RGD反应，透析，冻干，得到靶向载药聚合物，所述靶向载药聚合物具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，20≤y≤35。
3.一种聚合物胶束载响应性前药体系，其特征在于，由靶向载药聚合物与响应性抗肿瘤前药物制备而成，所述靶向载药聚合物具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，20≤y≤35。
4.根据权利要求3所述的聚合物胶束载响应性前药体系，其特征在于，所述聚合物胶束载响应性前药体系的粒径为10～200nm。
5.根据权利要求3所述的聚合物胶束载响应性前药体系，其特征在于，所述响应性抗肿瘤前药物选自式(101)～式(105)所示的化合物中的一种或多种：
6.根据权利要求5所述的聚合物胶束载响应性前药体系，其特征在于，所述式(102)～式(105)所示的化合物按照如下方法进行制备：
在以三乙胺为引发剂存在的条件下，将阿霉素盐酸盐与酸酐R在有机溶剂中反应，得到阿霉素前药，所述酸酐R选自式(201)～式(214)所示的结构中的一种：
7.根据权利要求3所述的聚合物胶束载响应性前药体系，其特征在于，所述靶向载药聚合物与响应性抗肿瘤前药物的质量比为(0.5～0.05)：1。
8.一种如权利要求3～7任意一项所述的聚合物胶束载响应性前药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将靶向载药聚合物溶解于缓冲液中，得到第一溶液；
将响应性抗肿瘤前药物溶解于去离子水中，得到第二溶液；
将所述第二溶液与第一溶液混合，透析，冻干，得到聚合物胶束载响应性前药体系，
所述靶向载药聚合物，具有式(I)所示结构：
其中，68≤x≤113，20≤y≤35。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液。
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