CN104069501B - 一种基于pamam的靶向给药载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于PAMAM的靶向给药载体，结构通式为：。该靶向给药载体的制备方法为将具有pH敏感性的PAMAM和亲水性的聚乙二醇通过还原敏感的二硫键相连，形成尺寸可控的还原和pH敏感的纳米给药载体。本发明的该载体不仅能显著降低高代数PAMAM所引起的细胞毒性和溶血毒性，同时还能减少网状内皮系统的摄取，延长血液中的滞留时间，从而有效的将药物输送至肿瘤组织。该载体在肿瘤细胞内高还原环境和低pH条件下，载体中的二硫键发生断裂，同时PAMAM的内核打开，使药物能够快速有效的释放，从而达到提高抗肿瘤药物的治疗效果和降低毒副作用的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向给药载体及其制备方法，具体涉及一种基于PAMAM的还原及pH敏感的靶向给药载体及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤已经成为继心血管疾病之后威胁人类健康最严重的疾病之一，化学治疗是当今临床治疗肿瘤的重要方法之一，小分子化疗药虽然在体外具有很强的抗肿瘤作用，但是经注射给药后，由于化疗药物缺乏肿瘤靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织也有很强的杀伤作用，以致毒副作用突出，病人难以坚持治疗。因此，提高药物在肿瘤部位的浓度、增强疗效，减少药物在正常组织器官中的分布并降低毒副作用，一直是肿瘤化疗基础研究和临床应用所追求的目标。为实现这一目标，基于生物材料的靶向药物递送系统近些年得到飞速发展。
聚酰胺-胺树枝状大分子 (PAMAM)是一类目前得到广泛应用的树枝状聚合物材料，在其作为靶向递药系统载体时体现出独特的优越性。首先，其结构内部的疏水空腔，可以物理包埋疏水性药物；其次，PAMAM表面有许多活性较强的氨基，一方面可以连接抗肿瘤药物，另一方面还可以连接能与机体中某些器官、组织发生特异性识别的靶向配基等。但由于高代数PAMAM会引起一定的细胞毒性和溶血毒性，所以通常在PAMAM表面对其进行PEG化的修饰，一方面可以减少其毒副作用，另一方面可进一步提高该载药系统的亲水性，从而延长药物在血液中的循环时间，有助于药物被动靶向于肿瘤组织, 从而提高药物治疗效果。
但值得我们注意的是，经PEG化修饰后的载体在一定程度上会降低药物的释放，刘丹等人曾报道DOX能快速的从PAMAM中释放出来，48 h的释放率能达到80%，而在经过PEG化修饰后PAMAM-PEG中的释放率仅为40%，这将大大降低药物的抗肿瘤效果。解决此问题的关键在于，既要保证PEG化后的聚合物能在血液循环中稳定，又要保证药物能在作用部位被快速的释放出来。因此，开发一种能在细胞内脱除PEG的药物递送系统就成了提高抗癌药物疗效的新方向。
因此，开发一种新型的基于PAMAM的还原和pH刺激响应性的药物递送系统，对于提高抗癌药物疗效、降低毒副作用仍是十分必要的。
发明内容
要解决的技术问题：本发明主要解决经PEG化修饰后的PAMAM-PEG载体释药缓慢的问题，提供一种基于PAMAM的还原及pH敏感的靶向给药载体及其制备方法，以此提高药物的抗肿瘤效果。
技术方案：为了达到上述目的，本发明公开了一种基于PAMAM的靶向给药载体，所述的基于PAMAM的靶向给药载体的结构通式为：
其中，PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的0 ~ 10.0代的聚酰胺-胺树状大分子，n为20 ~ 1000，m为1 ~ 4096。
其中，所述的基于PAMAM的靶向给药载体的结构通式中n优选为112。
其中，所述的基于PAMAM的靶向给药载体的结构通式中m优选为8、16或32。
其中，所述的基于PAMAM的靶向给药载体的结构通式中PAMAM优选为末端带有氨基，以乙二胺为核的4代的聚酰胺-胺树状大分子。
一种基于PAMAM的靶向给药载体的制备方法，制备方法包括下述步骤：
(1) 含二硫键的PAMAM-NH-SPDP中间体的合成
将PAMAM甲醇溶液与SPDP加入反应容器中，加入三乙胺，在30 oC下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；反应如下：
其中，PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的0 ~ 10.0代的聚酰胺-胺树状大分子；
(2) PAMAM-SS-PEG的合成
向PAMAM-NH-SPDP中间体中加入HS-(CH2CH2O)n-OCH3，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中，在水中透析两天，冷冻干燥三天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-PEG，避光保存；反应如下：
其中n为20 ~ 1000，m为1 ~ 4096。
其中，所述的制备方法中制备得到的靶向给药载体PAMAM-SS-PEG中n优选为112。
其中，所述的制备方法中制备得到的靶向给药载体PAMAM-SS-PEG中m优选为8、16或32。
其中，所述的制备方法中透析袋的分子量优选为8000 ~14000。
其中，所述的制备方法中制备得到的靶向给药载体PAMAM-SS-PEG中PAMAM优选为末端带有氨基，以乙二胺为核的4代的聚酰胺-胺树状大分子。
通过在PAMAM和PEG之间引入还原敏感的二硫键，形成PAMAM-SS-PEG聚合物，该聚合物能在血液循环中保持稳定，而一旦到达肿瘤细胞内，还原敏感的二硫键能在细胞内高浓度的谷胱甘肽（GSH）的刺激下发生断裂，从而快速的释放其包载的药物，发挥其抗肿瘤作用。
有益效果：
本发明的一种基于PAMAM的靶向给药载体是通过二硫键将PAMAM与PEG连接起来，此种连接方式不仅可以降低由PAMAM引起的细胞毒性和溶血毒性等问题，而且可进一步提高该载药系统的亲水性，减少被RES系统的摄取，从而延长药物在血液中的循环时间，有助于药物通过EPR效应被动靶向于肿瘤组织，从而提高药物治疗效果。此种可剪切的聚合物能在血液循环时二硫键不发生断裂，药物缓慢释放，而当被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内高浓度的GSH（10-20 mM）刺激下，二硫键发生断裂，从而快速的释放被包载的药物，达到治疗肿瘤的目的。除此此外，PAMAM本身还具有pH敏感性，即在肿瘤组织低pH的条件下，PAMAM的构象会发生变化，其外部的树枝状支链会打开，这将进一步加快药物的释放速度及增加释放量，从而达到还原及pH双重释药的目的。
附图说明
图1为PAMAM、HS-(CH2CH2O)112- CH2OCH3、PAMAM-SS-PEG32的1H-NMR图谱。
图2为PAMAM、HS-(CH2CH2O)112-CH2OCH3、PAMAM-SS-PEG32的IR图谱。
图3为PAMAM-SS-PEG32的体外稳定性实验结果。
图4 为PAMAM-SS-PEG/DOX体外释放图。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子：末端带有氨基，以乙二胺为核，0 ~ 10.0代(购自Sigma-Aldrich)；3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）购自圣克鲁斯生物技术上海有限公司；HS-(CH2CH2O)n-OCH3购自上海炎怡生物有限公司；三乙胺、甲醇等购自国药集团化学试剂有限公司；水为双蒸水。
用Unity Inova 400 M超导核磁共振谱仪（1H-NMR）对PAMAM-SS-PEG进行结构确证；用ProStar LC240 红外光谱仪（IR）对PAMAM-SS-PEG进行表征；用Nicomp TM380 ZLS粒径/电位分析仪对PAMAM-SS-PEG进行电位和粒径表征。
PAMAM-SS-PEG聚合物的1H-NMR和IR表征
以D2O为溶剂，将不同比例的聚合物进行1H-NMR分析，通过PEG与PAMAM特征峰的积分比值可以计算出PEG连接的个数。同时将不同比例的聚合物分别与溴化钾粉末混合，研磨至均匀分散，压制成厚度约为1 mm的透明薄片，用红外仪进行FTIR分析。
实施例1
将10mg PAMAM（4代）溶于1.5 mL甲醇溶液中，分别加入1.75mg的SPDP及10 μL三乙胺，在30 ℃下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例分别为1:8。向PAMAM-NH-SPDP中加入28 mg的HS-(CH2CH2O)112-CH2OCH3，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-P EG8，避光保存；生成PAMAM-SS-P EG8产物中，PAMAM与PEG的摩尔比例为1:8。
实施例2
将10mg 的PAMAM（4代）溶于1.5mL甲醇溶液中，加入3.5mg的SPDP及10 μL三乙胺，在30℃下避光搅拌5h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例为1:16。向PAMAM-NH-SPDP中加入56mg的HS-(CH2CH2O)112-CH2OCH3，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-PEG16，避光保存；生成的PAMAM-SS-PEG16产物中，PAMAM与PEG的摩尔比例分别为1:16。
实施例3
将10mg的PAMAM（4代）溶于1.5 mL甲醇溶液中，加入7mg的SPDP及10 μL三乙胺，在30 ℃下避光搅拌5h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例为1:32。向PAMAM-NH-SPDP中加入112mg的HS-(CH2CH2O)112-CH2OCH3，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-PEG32，避光保存；生成的PAMAM-SS-PEG32产物中，PAMAM与PEG的摩尔比例为1:32。
对实施例3合成的产物进行核磁分析，结果如图1所示，PAMAM-SS-PEG32的特征质子峰归属如下:其中 δ = 2.25，2.45，2.65，3.05-3.15 ppm 为PAMAM上的特征质子峰；δ =3.23 ppm (s，OCH3)，δ = 3.4 ~3.6 ppm (m，CH2CH2O) 为HS-(CH2CH2O)112-CH2OCH3上特征质子峰；从产物的核磁氢谱中可以发现同时具有PAMAM和HS-(CH2CH2O)112-CH2OCH3的特征质子峰，证明PEG共价结合到PAMAM表面。此外根据文献计算PEG的连接个数，HS-(CH2CH2O)112-CH2OCH3的H的个数为455个，而PAMAM在δ 2.84处H的个数为248个，由公式PEG/PAMAM =，可以计算出PEG的连接个数。
对实施例3合成的产物进行红外分析，结果如图2所示，PAMAM-SS-PEG32产物在1400-1000 cm-1出现了特征峰群，同时PAMAM的伯胺基特征峰基本消失，在3437.27 cm-1出现了酰胺键的特征吸收峰，说明PEG通过二硫键成功的与PAMAM表面的伯胺基发生了反应，生成了PEG化的PAMAM-SS-PEG32。
实施例4
将10mg的PAMAM（0代）溶于1.5mL甲醇溶液中，分别加入6.05mg的SPDP及10 μL三乙胺，在30 ℃下避光搅拌5h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例分别为1:1。向PAMAM-NH-SPDP中加入18.5mg的HS-(CH2CH2O)20-CH2OCH3，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-PEG1，避光保存；生成的PAMAM-SS-PEG1产物中，PAMAM与PEG的摩尔比例为1:1。
实施例5
将10mg 的PAMAM（10代）溶于1.5mL甲醇溶液中，分别加入13.69mg的SPDP及10 μL三乙胺，在30 ℃下避光搅拌5h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例分别为1:4096。向PAMAM-NH-SPDP中加入1932mg的HS-(CH2CH2O)1000-CH2OCH3，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-PEG4096，避光保存；生成的PAMAM-SS-PEG4096产物中，PAMAM与PEG的摩尔比例为1:4096。
PAMAM-SS-PEG聚合物的体外稳定性实验
向实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5的PAMAM-SS-PEG聚合物溶液中分别加入10 μM和10 mM的GSH，并放入转速为120 rpm，温度为37℃的恒温摇床中，每隔一段时间取样，通过DLS测其Zeta电位和粒径的变化。
实施例1的二硫键在GSH = 10 µM的条件下不发生断裂，而在GSH = 10 mM的条件下，30 min内发生完全断裂；二硫键断裂后，PAMAM的正电荷暴露出来，Zeta电位增大至15mV，粒径减小至7.8 nm；
实施例2的二硫键在GSH = 10 µM的条件下不发生断裂，而在GSH = 10 mM的条件下，30 min内发生完全断裂；二硫键断裂后，PAMAM的正电荷暴露出来，Zeta电位增大至 12mV，粒径减小至 10.7 nm；
实施例3的二硫键在GSH = 10 µM的条件下不发生断裂，而在GSH = 10 mM的条件下，30 min内发生完全断裂；二硫键断裂后，PAMAM的正电荷暴露出来，Zeta电位增大至 9mV，粒径减小至 12.5 nm；
实施例4的二硫键在GSH = 10 µM的条件下不发生断裂，而在GSH = 10 mM的条件下，在30 min内即发生完全断裂；二硫键断裂后，PAMAM的正电荷暴露出来，Zeta电位增大至6 mV，粒径减小至1.5 nm；
实施例5的二硫键在GSH = 10 µM的条件下不发生断裂，而在GSH = 10 mM的条件下，在30 min内即发生完全断裂；二硫键断裂后，PAMAM的正电荷暴露出来，Zeta电位增大至86 mV，粒径减小至25 nm。
PAMAM-SS-PEG/DOX复合物体外释放考察
取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5的PAMAM-S-S-PEG聚合物10mg溶于2ml蒸馏水中。同时取2mg的DOX•HCl溶于300µL的甲醇中，加入15µL三乙胺中和盐酸，使DOX游离出来。然后将DOX溶液与2ml聚合物水溶液混合，搅拌过夜，除去甲醇。将PAMAM-SS-PEG/DOX复合物在3000 rpm/min的条件下离心15min，除去未被包封的DOX，即得实施例1至实施例5的PAMAM-SS-PEG/DOX复合物。
我们通过四种释放条件来考察，分别为：(1)含有10μM GSH的PBS缓冲液 (0.1M,pH7.4)；(2) 含有10 mM GSH的PBS缓冲液(0.1 M, pH 7.4)；(3)含有10μM GSH的醋酸缓冲液 (0.1 M, pH 5.0)；(4) 含有10mM GSH的醋酸缓冲液(0.1 M, pH 5.0)。
具体操作为：称取实施例1的PAMAM-SS-PEG/DOX复合物 30 mg溶于8 ml pH =7.4, GSH = 10 µM的缓冲液中；将实施例1随即转入4个透析袋（MW = 3500）中，每个透析袋里加入2 ml复合物溶液，透析袋两端采用包装线系紧。然后将透析袋放入50 ml的锥形瓶中，每个锥形瓶中加入20 ml相应的四种缓冲溶液。将锥形瓶放入摇床中，在37 oC、100 rpm条件下孵育，于固定的时间点（0.5、1、2、4、6、8、12、24 h）取样1 ml，并补充1 ml新鲜缓冲液，采用荧光分光光度计(FLS920, 激发波长为480 nm)测定外液中DOX的浓度，并计算累计释放百分数。实施例2至实施例5操作方法同实施例1。
从图4A可以看出，实施例3的PAMAM-SS-PEG/DOX复合物在GSH = 10 mM的条件比在GSH = 10μM条件下释放快，主要原因是由于二硫键在高浓度GSH的刺激下会发生断裂，使原本覆盖在PAMAM表面的PEG外壳脱落，从而减小了DOX从PAMAM内核转移至外面释放介质中的阻力，进而加快药物的释放；从图4B中可以看出，实施例1至3的PAMAM-SS-PEG/DOX复合物在pH = 5.0的条件下比pH = 7.4条件下释放快，这主要是因为PAMAM在酸性条件下其构象会发生改变，其内核会打开，从而有助于药物的快速释放。除此之外，我们从图4C中可以看出，实施例3的PAMAM-SS-PEG/DOX复合物在同时具有高浓度GSH和酸性环境的介质中(GSH = 10mM，pH = 5.0)，药物的释放率明显高于其单一在高GSH条件或者酸性条件下的药物释放率，其原因主要是由于在这种条件下，不仅PAMAM外表面连接的PEG能够脱落，而且其表面的树状分支也会打开，这样就大大降低了DOX释放时的阻力，从而明显提高了药物的释放，有助于增加药物的抗肿瘤效果。
实施例4中PAMAM-SS-PEG1/DOX复合物在GSH = 10 mM的条件比在GSH = 10 μM条件下释放快，释放率从20%提高至43%；而且复合物在pH = 5.0的条件下比pH = 7.4条件下释放快，释放率从20%提高至53%。除此之外，复合物在同时具有高浓度GSH和酸性环境的介质中(GSH = 10 mM , pH = 5.0)，药物的释放率达到67%，明显高于其单一在高GSH条件或者酸性条件下的药物释放率。
实施例5中PAMAM-SS-PEG4096/DOX复合物在GSH = 10 mM的条件比在GSH = 10 μM条件下释放快，释放率从30%提高至53%；而且复合物在pH = 5.0的条件下比pH = 7.4条件下释放快，释放率从30%提高至63%。除此之外，复合物在同时具有高浓度GSH和酸性环境的介质中(GSH = 10 mM , pH = 5.0)，药物的释放率达到87%，明显高于其单一在高GSH条件或者酸性条件下的药物释放率。
PAMAM-SS-PEG/DOX复合物体外抗肿瘤实验
为了考察实施例1、2、3、4、5中PAMAM-SS-PEG/DOX复合物的体外抗肿瘤作用，取处于对数生长期的B16细胞，分别以1× 104个/孔接种于96孔板，在37℃培养24h后，分别加入实施例1至5的PAMAM-SS-PEG/DOX复合物，继续培养48 h后，吸去含药培养液，每孔加入0.1mL含0.5 mg/mL MTT的无血清培养液，于37℃继续孵育4 h，吸去含有MTT的培养液，每孔加入0.1mL DMSO，待溶解均匀后用酶标仪测定吸光度值(λ=570nm)，并计算细胞活力抑制50%时的浓度(IC50)。同时采用同样的试验方法进行单独DOX和PAMAM-PEG/DOX的体外抗肿瘤实验。再用同样的方法考察实施例1至实施例5中PAMAM-SS-PEG/DOX复合物、单独DOX、PAMAM-PEG32 /DOX对A549细胞的毒性，孵育时间为48 h。
实施例1至实施例5、单独DOX、PAMAM-PEG32/DOX复合物对B16细胞和A549细胞的IC50值如下。
| 实施例 | B16细胞IC50值（μg/ml） | A549细胞IC50值（μg/ml） |
| 实施例1 | 3.40 ± 0.14 | 5.78 ± 0.21 |
| 实施例2 | 2.38 ± 0.08 | 3.98 ± 0.19 |
| 实施例3 | 0.28 ± 0.06 | 1.16 ± 0.04 |
| 实施例4 | 1.40 ± 0.24 | 4.78 ± 0.41 |
| 实施例5 | 3.62 ± 0.34 | 6.78 ± 0.41 |
| PAMAM-PEG32/DOX | 4.80 ± 0.03 | 7.74 ± 0.13 |
| DOX | 0.25 ± 0.11 | 0.89 ± 0.02 |
从上表可以看出，各复合物对B16细胞和A549细胞都有一定抗肿瘤作用，而且其抗肿瘤效果都优于不带二硫键的对照组PAMAM-PEG32/DOX复合物，尤其是实施例3中复合物对B16细胞的抗肿瘤作用更明显，基本与DOX的作用相当，说明二硫键的断裂有助于药物的释放，从而增加复合物的抗肿瘤作用。另外值得注意的是，该复合物的抗肿瘤作用具有明显的靶向性，在正常的血液循环时，其药物释放缓慢，而在达到肿瘤细胞后，在还原和pH条件刺激下，药物能迅速释放，从而发挥明显的抗肿瘤作用，并且能明显降低药物的毒副作用。
当然上述实施例只是为说明本发明的技术构思及特点所作的例举而非穷举，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种基于PAMAM的靶向给药载体，其特征在于所述的基于PAMAM的靶向给药载体的结构通式为：
其中，PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的4代的聚酰胺-胺树状大分子，n为112，m为32。
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