CN113559275B - 一种一锅法制备高分子/康普瑞汀a4/blz945纳米键合药的方法 - Google Patents

一种一锅法制备高分子/康普瑞汀a4/blz945纳米键合药的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药（CB‑PLG‑NPs）的方法。该方法包括如下步骤：S1：将向聚（L‑谷氨酸）溶液中加入缚酸剂和活化试剂进行活化，然后与聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液混合，加入催化剂反应；S2：向S1的反应体系中加入活化试剂活化，然后加入康普瑞汀A4/BLZ945反应，纯化，即得所述高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药；本发明提供的方法通过对反应试剂的调控及条件优化，成功实现一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药，简单易行，步骤极少，尤其减少了纯化步骤，明显地缩短了制备时间，大幅降低了物料的消耗，非常适合批量生产，有利于实现产业化；且键合效率高。

Description

一种一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药的 方法
技术领域
本发明属于高分子抗肿瘤药物合成领域，具体涉及一种一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药（CB-PLG-NPs）的方法。
背景技术
康普瑞汀A4（CA4）和BLZ945共载高分子键合药物在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。CA4是一种血管阻断剂，它可以选择性破坏肿瘤血管，通过“饿死”肿瘤抑制肿瘤的生长，而BLZ945是一种集落刺激因子1受体(CSF-1R)抑制剂，它通过调控肿瘤相关巨噬细胞的表型而发挥巨噬细胞的抗肿瘤功能，CA4和BLZ945具有协同抗肿瘤效果。使用聚（L-谷氨酸）接枝聚乙二醇单甲醚将CA4和BLZ945键合在一起，形成纳米药物，可以使CA4和BLZ945在肿瘤血管处富集，使它们更加容易到达其靶标，从而显著提高抗肿瘤疗效。
一锅法（one-pot reaction）是一种非常具有前景的有机合成方法。一锅法是指反应中的多步反应可以从相对简单易得的原料出发，中间不经过分离提纯，连续反应得到目标产物。这样的反应由于减少了一些有关于中间产物的提纯步骤和试剂消耗，因此，有效降低了经济成本，明显缩短了生产时间，同时也有利于环境保护。
但目前康普瑞汀A4（CA4）和BLZ945共载高分子键合药物主要还采用两步法来进行制备。例如有研究（WANG Yue, SHEN Na, WEI Qi, et al. Co-Bonded CombretastatinVascular Disrupting Agents and BLZ945 Polymeric Nanodrug for SynergisticCancer Therapy [J]. Journal of Functional Polymers, 2020, 33（6）: 1-10.）公开了一种康普瑞汀A4（CA4）和BLZ945共载高分子键合药物的制备方法，但其并非一锅法，步骤多，中间产物的分离提纯消耗了大量的对环境有害的化学试剂，反应周期也较长。
如开发一种一锅法制备康普瑞汀A4（CA4）和BLZ945共载高分子键合药物的方法，无疑可减少反应步骤、减少反应时间，减少反应所使用的溶剂的种类及用量，达到经济环保的效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中制备康普瑞汀A4（CA4）和BLZ945共载高分子键合药物并非一锅法的缺陷或不足，提供一种一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药的方法。本发明提供的方法通过对反应试剂的调控及条件优化，成功实现一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药（CB-PLG-NPs），简单易行，步骤极少，尤其减少了纯化步骤，明显地缩短了制备时间，大幅降低了物料的消耗，非常适合批量生产，有利于实现产业化；且键合效率高，接近100%。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药的方法，包括如下步骤：
S1：将聚（L-谷氨酸）溶解于有机溶剂中得聚（L-谷氨酸）溶液，备用；将聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶解于有机溶剂得聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液，备用；向聚（L-谷氨酸）溶液中加入缚酸剂和活化试剂进行活化，然后与聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液混合，加入催化剂反应；
S2：向S1的反应体系中加入活化试剂活化，然后加入康普瑞汀A4和BLZ945反应，纯化，即得所述高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药；
其中，S1、S2中所述活化试剂为2,4,6-三氯苯甲酰氯溶液；S1、S2中所述缚酸剂为三乙胺；
S1中，缚酸剂与有机溶剂的总和的质量体积比为(9~17):1 mg/mL。
文献（WANG Yue, SHEN Na, WEI Qi, et al. Co-Bonded CombretastatinVascular Disrupting Agents and BLZ945 Polymeric Nanodrug for SynergisticCancer Therapy [J]. Journal of Functional Polymers, 2020, 33（6）: 1-10.）中向聚（L-谷氨酸）（PLG）和聚乙二醇单甲醚（m-PEG）的混合溶液中加入活化试剂N,N′-二异丙基碳二亚胺（DIC）和催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP）反应，经分离纯化得到PLG-g-mPEG；然后将PLG-g-mPEG溶解加入活化试剂2,4,6-三氯苯甲酰氯和缚酸剂三乙胺，活化后再加入CA4和BLZ945，及DMAP反应，经分离提纯得到键合药物。
本发明的发明人尝试对上述方法进行调整来得到一种可行的一锅法。研究发现，活化试剂N,N′-二异丙基碳二亚胺（DIC）有较好的活化作用，使得PLG和m-PEG的接枝反应在催化剂的作用下较好进行，进而生成PLG-g-mPEG，但其会残留在PLG-g-mPEG上，进而影响后续CA4和BLZ945与PLG-g-mPEG的键合，并且DIC是一种剧毒物质，仅适合研究阶段使用，后续为了产业化发展，必须将其去掉，故需分离纯化中间产物PLG-g-mPEG。如简单将活化试剂DIC替换为2,4,6-三氯苯甲酰氯，由于2,4,6-三氯苯甲酰氯是一种非常活泼的物质，极易分解或者发生副反应，反应过程中出现成胶现象，无法进行mPEG的接枝反应及后续的操作。
经反复研究发现，以2,4,6-三氯苯甲酰氯活化试剂，并加入缚酸剂三乙胺，同时调控三乙胺、有机溶剂之间的用量关系，可实现一锅法制备，该方法简单易行，步骤极少，尤其减少了纯化步骤，明显地缩短了制备时间，大幅降低了物料的消耗，非常适合批量生产，有利于实现产业化；并且大大提高了制备PLG-g-mPEG的键合效率（S1步骤），可实现近100%键合。
具体地，（1）在缚酸剂三乙胺及其它条件的配合下，可增强2,4,6-三氯苯甲酰氯的活化作用，进而促使PLG和mPEG的有效键合，键合效果接近100%；
（2）缚酸剂三乙胺、有机溶剂的用量关系非常关键。
有机溶剂对反应速率有较大的影响，如有机溶剂的用量过多，会影响反应速率；另外，聚谷氨酸是酸性的高分子，三乙胺是碱性物质，酸碱中和会产生不溶于有机溶剂的中间产物，如有机溶剂的用量太少，导致反应物大量析出，成胶，不溶于有机溶剂。
三乙胺的添加量过大，酸碱中和会产生大量不溶于有机溶剂的中间产物，容易成胶；添加量过小，载药率低。
通过对三乙胺和有机溶剂之间的用量关系的调控，可促使PLG和mPEG的高效键合，键合效率接近100%；且得到的键合药为纳米级，具有较好的应用前景。
优选地，S1所述聚（L-谷氨酸）溶液中聚（L-谷氨酸）的质量浓度为20~40 mg/mL。
在该条件下可实现聚（L-谷氨酸）的充分溶解，且S1步骤反应速度快。
更为优选地，S1所述聚（L-谷氨酸）溶液中聚（L-谷氨酸）的质量浓度比为20:1 mg/mL。在该条件下可进一步节省溶剂。
优选地，S1中所述聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液中聚乙二醇单甲醚及其衍生物的质量浓度为50~120 mg/mL。
更为优选地，S1中所述聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液中聚乙二醇单甲醚及其衍生物的质量浓度为100 mg/mL。
本领域常规的有机溶剂均可用于本发明中。
优选地，所述有机溶剂为 N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或两种。
更为优选地，所述有机溶剂为 N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述2,4,6-三氯苯甲酰氯溶液的质量浓度为5~20 mg/mL。
2,4,6-三氯苯甲酰氯溶液一般利用N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂溶解得到，可通过商购得到。
S1中活化的时间和温度可根据现有的控制条件调整得到，可实现有效活化即可。如活化不充分，PLG和mPEG的接枝反应无法完全进行，会存在游离的mPEG。
优选地，S1中所述活化的温度为-20~30℃，活化的时间为10~60 min；进一步优选为25℃，15~45 min，最优选为20 min。
S1中反应的时间和温度可根据现有的控制条件调整得到，可保证PLG和mPEG的接枝反应进行完全即可。
优选地，S1中所述反应的温度为5~60℃，反应的时间为3~6 h；进一步优选为25℃，3 h。
本领域常规的催化剂均可而用于本发明中。
优选地，S1中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
优选地，S1中所述催化剂与聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4的总和的摩尔比不低于0.1:1。
更为优选地，S1中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，所述4-二甲氨基吡啶与聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4的总和的摩尔比不低于1.5:1 ，例如(1.5~4.0):1。
研究表明，催化剂与待键合原料（聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4）的摩尔比不低于0.1:1（一般为0.2~0.5:1）时就可实现较好的催化效果。一般情况下，催化剂只能加快反应速率，并不能提升反应的程度，常规键合反应下BLZ945和康普瑞汀A4的键合效率为80%左右。而本发明的发明人研究发现，在本发明的一锅法体系中，当显著增大催化剂4-二甲氨基吡啶的用量时（例如大于1.5:1），不仅可提高反应速率，还可促进键合效率的提升，特别是BLZ945的键合。当催化剂-二甲氨基吡啶的用量不低于2:1时，键合效率（S2步骤）接近100%。
进一步优选地，所述4-二甲氨基吡啶与聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4的总和的摩尔比为(2.0~4.0):1
优选地，S1中所述活化试剂与聚乙二醇单甲醚及其衍生物的摩尔比值为1.5~4.0。
优选地，所述缚酸剂与聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4的总和的摩尔比为(2~2.5):1。
聚乙二醇单甲醚及其衍生物的接枝可赋予纳米键合药较好的长循环性能。聚乙二醇单甲醚及其衍生物的用量可根据实际需要选取，以达到所需的长循环性能即可。
优选地，S1中所述聚（L-谷氨酸）和聚乙二醇单甲醚及其衍生物的质量比为1:(1~3)。
S2中药物康普瑞汀A4和BLZ945的接枝顺序没有特别要求，无论同时键合两种药物或者先键合一种药物，再键合另一种药物，并不会产生影响。。
S2中活化的时间和温度可根据现有的控制条件调整得到，可实现有效活化即可。
优选地，S2中所述活化的温度为-20~30℃，活化的时间为10~60 min；进一步优选为25℃，15~45 min，最优选为20 min。
S2中反应的时间和温度可根据现有的控制条件调整得到，可保证PLG-g-mPEG和BLZ945和康普瑞汀A4的键合反应进行完全即可。
S2中所述反应的温度为5~60℃，反应的时间为5~18 h；进一步优选为60℃，12 h。
优选地，S2中活化试剂与康普瑞汀A4和BLZ945的总和的摩尔比为(1.5~4.0):1。
优选地，聚（L-谷氨酸）和康普瑞汀A4的质量比为1:(0.002~0.7)。
优选地，聚（L-谷氨酸）和BLZ945的质量比为1:( 0.002~0.7)。
优选地，S2中康普瑞汀A4和BLZ945的质量比为1:(0.05~20)。
通过调整康普瑞汀A4和BLZ945的配比关系，可使两种药物发挥协同作用，以进一步提高药效。
优选地，所述聚（L-谷氨酸）的结构式为：
Figure 749355DEST_PATH_IMAGE001
其中，R1为C2~C10的直链烷基、C3~C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′为C2~C10的直链烷基、C3~C10的支链烷基或苯基；
R2为H原子、C2~C10的直链酰基或C3~C10的支链酰基基团；
R3为H原子或阳离子；
L独立的选自-CH2-CH2-；
n=a+b+c+d，a，b，c，d为聚合度，10≤a+b+c+d≤5000。
优选地，所述聚乙二醇单甲醚及其衍生物的结构式为：
Figure 135337DEST_PATH_IMAGE002
其中，R4为H原子、C1~C20的烷基或取代的C1~C20的烷基。
m为聚合度，40≤m≤250.
更为优选地，所述聚乙二醇单甲醚及其衍生物为聚乙二醇单甲醚（R4为H原子）。
优选地，所述高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药具有式（I）所示结构：
Figure 882451DEST_PATH_IMAGE003
其中，R1为C2~C10的直链烷基、C3~C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′为C2~C10的直链烷基、C3~C10的支链烷基或苯基；
R2为H原子、C2~C10的直链酰基或C3~C10的支链酰基基团；
R3为H原子或阳离子；
R4为H原子、C1~C20的烷基或取代的C1~C20的烷基；
L独立的选自-CH2-CH2-；
m为聚合度，40≤m≤250；a，b，c，d为聚合度，10≤a+b+c+d≤5000。
所述高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药即为聚（L-谷氨酸）接枝聚乙二醇单甲醚及其衍生物/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的方法通过对反应试剂的调控及条件优化，成功实现一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药，简单易行，步骤极少，尤其减少了纯化步骤，明显地缩短了制备时间，大幅降低了物料的消耗，非常适合批量生产，有利于实现产业化；且键合效率高。
附图说明
图1为实施例1制备的CB-PLG-NPs的核磁共振谱图；
图2为实施例2和3制备的mPEG-PLG的水相溶胶凝胶色谱谱图；
图3为CB-NPs解离后的高效液相色谱谱图；
图4为CB-NPs在水中溶解后粒径DLS体积径谱图；
图5为CB-NPs未解离的高效液相色谱谱图；
图6为CB-PLG-NPs小鼠抑瘤实验肿瘤体积随时间变化曲线图；
图7为CB-PLG-NPs小鼠抑瘤实验体重变化随时间变化曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1 一锅法制备CB-PLG-NPs
本实施例提供一种一锅法制备CB-PLG-NPs的方法，具体过程如下：
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0 g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和77.18 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应三小时。
（2）再加入259.3 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物，即聚（L-谷氨酸）接枝聚乙二醇单甲醚/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药，记为CB-PLG-NPs。
以氘代水/氘代DMSO/氘代氢氧化钠为溶剂对所述固体产物进行核磁共振测试，见图1，可见明显的CA4（δ 6.52ppm，δ 6.38ppm，δ 6.21ppm）和BLZ945(δ 8.28ppm，δ 7.91ppm，δ 7.33ppm)的特征峰，因此表明CA4和BLZ945被成功键合到高分子上。
实施例2 制备mPEG-PLG
本实施例提供一种制备mPEG-PLG（PLG-g-mPEG）的方法，具体过程如下：
在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和77.18 mg N-羟基琥珀酰亚胺（DMAP）。三小时后用甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物mPEG-PLG。
实施例3 制备mPEG-PLG
本实施例提供一种制备mPEG-PLG的方法，具体过程如下：
在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和77.18 mg N-羟基琥珀酰亚胺（DMAP）。六小时后用甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物mPEG-PLG。
实施例4 检验游离mPEG
本实施例对实施例2和3制备的mPEG-PLG是否有游离mPEG进行检测，具体过程如下：
将116.04 g NaHPO4·12H2O、11.86 g NaH2PO4·2H2O和17 g NaNO3溶解于2 L超纯水中作为流动相，取6 mg mPEG-PLG（实施例2和3制备得到）和6 mg碳酸氢钠溶解在3 mL流动相中，用水相溶胶凝胶色谱（GPC）进行测试，如图2所示，观察到实施例2和实施例3中mPEG-PLG没有游离mPEG（游离mPEG位于23分钟），可知，反应三小时就可实现mPEG的近100%键合。
实施例5 一锅法制备CB-PLG-NPs
本实施例提供一种一锅法制备CB-PLG-NPs的方法，具体过程如下：
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和77.18 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应三小时；
（2）再加入518.6 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
实施例6 一锅法制备CB-PLG-NPs
本实施例提供一种一锅法制备CB-PLG-NPs的方法，具体过程如下：
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和77.18 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应六小时；
（2）再加入259.3 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
实施例7 一锅法制备CB-PLG-NPs
本实施例提供一种一锅法制备CB-PLG-NPs的方法，具体过程如下：
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0 g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和77.18 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应三小时；
（2）再加入259.3 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应5 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
实施例8 一锅法制备CB-PLG-NPs
本实施例提供一种一锅法制备CB-PLG-NPs的方法，具体过程如下：
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0 g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和463.08 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应三小时；
（2）再加入259.3 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
实施例9 一锅法制备CB-PLG-NPs
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0 g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和231.5 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应三小时；
（2）再加入518.59 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
实施例10 一锅法制备CB-PLG-NPs
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在25 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入255.7 mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0 g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和308.71 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应三小时；
（2）再加入518.6 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
实施例11 CB-PLG-NPs载药量检测、粒径检测及游离CA4/BLZ945小分子检测
1. CB-PLG-NPs载药量检测
与实施例1相比，实施例5步骤（2）中加入了更大量的2,4,6-三氯苯甲酰氯，实施例6中步骤（1）的反应时间更长；实施例7中步骤（2）的反应时间更长；实施例8、9和10中步骤（1）加入了不同量的DMAP；实施例1、5~10中BLZ945和CA4的理论载药量均为10%，载药量通过如下过程计算得到：载药量（%）=（水解后得到药物质量mg）/（称量的CBP样品质量mg）*100%。
本实施例对实施例1、5~10制备的CB-PLG-NPs的载药量进行检测，具体过程如下：
将4.00 g的氢氧化钠溶解于1 L超纯水中作为解离液。将4 mg CB-PLG-NPs（实施例1、5~10制备）溶解于2 mL解离液中，超声1小时并解离3小时。解离后再加入2 mL乙腈，混匀作为待测样。
用乙腈：水=4:1（体积比）作流动相，高效液相色谱检测实施例1、5~10制备的CB-PLG-NPs的待测样中BLZ945和CA4的载药量，结果如图3和表1所示，结果显示一定范围内改变实验条件的均有可能获得纳米键合药；且从实施例1、8~10可知，当催化剂DMAP的用量较小（实施例5中DMAP与聚乙二醇单甲醚+BLZ945+康普瑞汀A4的摩尔比为0.5:1）时，BLZ945和CA4的键合效率为70~85%；增大催化剂DMAP的用量（实施例9中DMAP与聚乙二醇单甲醚+BLZ945+康普瑞汀A4的摩尔比为1.5:1），BLZ945和CA4的键合效率保持为90~100%；而当催化剂DMAP的用量显著增大时（实施例10，DMAP与聚乙二醇单甲醚+BLZ945+康普瑞汀A4的摩尔比为2:1，键合效率增大，键合效果接近100%。
表1 实施例1、5~10制备的CB-PLG-NPs的载药量及键合效率检测结果
Figure 480923DEST_PATH_IMAGE004
2. CB-PLG-NPs粒径检测
将CB-PLG-NPs样品溶解在纯水中（1 mg/mL），用动态光散射仪（DLS）检测其粒径（体积径），如图4，其大小基本为20~50 nm左右，随载药量有一定变化，但变化不大。
3. 游离CA4/BLZ945小分子检测
本实施例对实施例6~8制备的CB-PLG-NPs是否有游离CA4/BLZ945小分子进行检测，具体过程如下：
用乙腈：水=4:1（体积比）作流动相，利用高效液相色谱检测实施例6~8中CB-PLG-NPs是否含有游离CA4/BLZ945小分子。如图5，实施例6~8中CB-PLG-NPs未观测到游离小分子。
实施例12 不同缚酸剂及溶剂用量下制备CB-PLG-NPs
（1）在干燥惰性气体的条件下，将0.5 g 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在N mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入M mg三乙胺。搅拌5分钟后，加入97.56 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的1.0 g聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和308.71 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），反应三小时；
（2）再加入518.6 mg 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将187.5 mg CA4和187.5 mg BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12 h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
表2为缚酸剂三乙胺和DMF的用量。
表2 缚酸剂三乙胺和DMF的用量
Figure 560874DEST_PATH_IMAGE006
实施例11-2是合成比较好的例子，键合效率接近100%，与之相比，实施例11-1减少了三乙胺的量，导致缚酸剂不够，因此溶液呈酸性，不利于合成反应的进行；碱性条件虽然有利于反应的进行，但是大量增加三乙胺时，如实施例11-3，会导致谷氨酸与三乙胺形成溶解性很差的盐，这种盐不易容于有机溶剂，因此析出成胶，整体变成固体，无法搅拌，无法进一步实验，导致实验失败。
实施例11-4减少了溶剂的体积，反应物原料浓度增大，有利于反应的进行，但是浓度太大，使谷氨酸和三乙胺的产物析出；但是增大溶剂的体积，如实施例11-5，虽然溶液现像正常，但是反应物浓度明显降低，因此其反应速率降低，至12小时时，可能反应尚未完成，呈现结果即是键和效率的降低，但是常规的其它增加反应速度的手段，如升高温度等，或者延长反应时间等，均不适用于本实验，因为本发明使用了催化剂2,4,6-三氯苯甲酰氯在提高温度，或者接触水，或者长时间反应条件下，均会分解，并极有可能产生未知的副反应产物，因此通过其他方法增加反应速度的手段均不适用于本发明，所以维持较高的反应浓度，不仅仅是出于环保和节约的理念，也是为了得到更高键合效率的CBPs的一个重要条件。
实施例13~22 一锅法制备CB-PLG-NPs
本实施例提供一系列一锅法制备CB-PLG-NPs的方法，具体过程如下：
（1）在干燥惰性气体的条件下，将一定质量的 聚（L-谷氨酸）(聚合度n=160)，充分溶解在8.3 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌条件下维持温度在25℃加入一定质量的三乙胺。搅拌5分钟后，加入一定质量的2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟。再加入用5 mL无水DMF溶解的一定质量的聚乙二醇单甲醚（mPEG，5000Da）和一定质量的 N-羟基琥珀酰亚胺（DMAP），反应三小时；
（2）再加入一定质量的 2,4,6-三氯苯甲酰氯，搅拌20分钟后将一定质量的 CA4和一定质量的 BLZ945加入反应溶液中，升温至60℃反应12 h。反应后加入甲基叔丁基醚沉降，再用DMF复溶，反复沉降三次，用离心机离心得到固体，再用纯净水透析12h，换水6次以上，冷冻干燥后直接得到固体产物CB-PLG-NPs。
各原料的添加量如表3，其中实施例20~22为平行试验。
表3 实施例13~22中各原料的添加量
Figure 586599DEST_PATH_IMAGE008
实施例23 CB-PLG-NPs载药量检测
本实施例对实施例13~22制备的CB-PLG-NPs的载药量进行检测，具体过程如下：
将4.00 g的氢氧化钠溶解于1 L超纯水中作为解离液。将4 mg CB-PLG-NPs（实施例13~22制备）溶解于2 mL解离液中，超声1小时并解离3小时。解离后再加入2 mL乙腈，混匀作为待测样。
用乙腈：水=4:1（体积比）作流动相，利用高效液相色谱检测实施例11~20制备的CB-PLG-NPs的待测样中BLZ945和CA4的载药量，结果如表4所示。
表4 实施例13~22制备的CB-PLG-NPs中BLZ945和CA4的载药量
Figure 322474DEST_PATH_IMAGE009
从表4可知，通过实施例13~19可知，调整投料比例可以获得担载不同比例药物的CB-PLG-NPs，通过实施例20~22可知，平行反应所得担载结果误差不超过1%。
实施例24~25和对比例1~2一锅法制备CB-PLG-NPs、 CP或BP
本实施例和对比例提供一系列一锅法制备CB-PLG-NPs、 CP或BP的方法，其过程与实施例13~22的一致，各原料的添加量如表5。
表5 实施例24~25和对比例1~2中各原料的添加量
Figure DEST_PATH_IMAGE011
其中，对比例1中仅键合CA4，记为CP，对比例2仅键合BLZ945，记为BP。
实施例26 CB-PLG-NPs载药量检测
本实施例对实施例24~25和对比例1~2制备的产物（CB-PLG-NPs、 CP或BP）的载药量进行检测，具体过程如下：
将4.00 g的氢氧化钠溶解于1 L超纯水中作为解离液。将4 mg CB-PLG-NPs（实施例24~25和对比例1~2制备）溶解于2 mL解离液中，超声1小时并解离3小时。解离后再加入2mL乙腈，混匀作为待测样。
用乙腈：水=4:1（体积比）作流动相，利用高效液相色谱检测实施例24~25和对比例1~2制备的产物的待测样中BLZ945和CA4的载药量，结果如表6所示。
表6 实施例24~25和对比例1~2制备的产物中BLZ945和CA4的载药量
Figure 990216DEST_PATH_IMAGE012
从表6可知，实施例24和25为两组不同比例的CB-PLG-NPs，对比例1单独担载CA4，对比例2单独担载了BLZ945，可分别与实施例24和25 做对比，因此实施例24~25及对比例1~2制备的纳米键合药可以准备进行动物实验。
对比例3
（1）将PLG（0.413 g，0.02 mmol）和mPEG5k-OH（1.239 g，0.248 mmol）溶解在25 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，然后将三乙胺（74 mg, 0.74 mmol）2,4,6-三氯苯甲酰氯（181 mg,，0.74 mmol）和DMAP（10 mg，0.82 mmol）加入到反应体系中。
（2）再依次加入2,4,6-三氯苯甲酰氯（ 639 mg,2.61 mmol）和三乙胺（2.49 mg,2.49 mmol），反应20 min 后将溶于30 mL 无水DMF 中的CA4（240 mg, 0.75 mmol）、BLZ945（ 225 mg, 0.57 mmol）和DMAP（ 192 mg, 1.59 mmol）加入到上述反应体系中，在60 ℃ 条件下反应4 h。反应结束后用过量无水乙醚对反应混合物进行沉降。沉降产物在DMF 中复溶，用蒸馏水（MWCO = 3 500）透析72 h，冷冻干燥后得到最终产物CB-NPs。
上述反应步骤是按照研究（WANG Yue, SHEN Na, WEI Qi, et al. Co-BondedCombretastatin Vascular Disrupting Agents and BLZ945 Polymeric Nanodrug forSynergistic Cancer Therapy [J]. Journal of Functional Polymers, 2020, 33（6）:1-10.）的方法，将其活化试剂DIC改为2,4,6-三氯苯甲酰氯，但是配比和步骤，完全没有改变的情况下，重复实验，反应过程中成胶，没有得到成功的反应产物，因此简单将其研究中的DIC替换成2,4,6-三氯苯甲酰氯是不行的。
应用实施例1 CB-PLG-NPs抑瘤实验
将健康的BALb/c（雌鼠，6-8周）于右腹部皮下接种H22肝癌细胞悬液，当小鼠肿瘤平均体积达到200mm3时，将小鼠按肿瘤体积平均分成6组，每组6只小鼠。小鼠尾静脉给药一次，给药方案如表7所示。
表7 各组小鼠的给药方案
Figure DEST_PATH_IMAGE013
每两天测量小鼠肿瘤体积，称量小鼠体重，来评价治疗效果和全身毒性，肿瘤体积的计算公式如下：
肿瘤体积（V）=a×b2/2
a和b分别为实体瘤块的长径和短径。
如图6所示，A组B组显示出很好的肿瘤抑制，其中A组与空白组相比肿瘤抑制率为82.6%，与C组差异性显著（0.01<P<0.05），与D组差异性极显著（P<0.01），与空白组差异性极显著（P<0.01）。B组与空白组相比肿瘤抑制率为67.6%，与E组差异性显著（0.01<P<0.05），与空白组差异性显著（0.01<P<0.05）。以上实验结果表明共载的CB-PLG-NPs纳米药物能够很好的抑制肿瘤，并且可以通过精确调控BLZ945/CA4的比例来使两种药物发挥协同作用，以达到明显提高药效的目的。
如图7示不同组的小鼠体重变化不具有显著性差异，且均在正常体重范围内。体重变化结果表明CB-PLG-NPs纳米药物没有明显的全身毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种一锅法制备高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将聚（L-谷氨酸）溶解于有机溶剂中得聚（L-谷氨酸）溶液，备用；将聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶解于有机溶剂得聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液，备用；向聚（L-谷氨酸）溶液中加入缚酸剂和活化试剂进行活化，然后与聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液混合，加入催化剂反应；
S2：向S1的反应体系中加入活化试剂活化，然后加入康普瑞汀A4和BLZ945，反应，纯化，即得所述高分子/康普瑞汀A4/BLZ945纳米键合药；
其中，S1、S2中所述活化试剂为2,4,6-三氯苯甲酰氯溶液；S1、S2中所述缚酸剂为三乙胺；S1中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶；
S1中，缚酸剂与溶解聚（L-谷氨酸）的有机溶剂的质量体积比为(9~17):1 mg/mL；
S1所述聚（L-谷氨酸）溶液中聚（L-谷氨酸）的质量浓度为20~40 mg/mL。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述聚乙二醇单甲醚及其衍生物溶液中聚乙二醇单甲醚及其衍生物的质量浓度为50~120 mg/mL。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述活化的温度为-20~30℃，活化的时间为10~60 min；S1中所述反应的温度为5~60℃，反应的时间为3~6 h。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述催化剂与聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4的总和的摩尔比不低于0.1:1。
6.根据权利要求1~5任一所述方法，其特征在于，S1中所述4-二甲氨基吡啶与聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4的总和的摩尔比不低于1.5:1。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缚酸剂与聚乙二醇单甲醚及其衍生物、BLZ945和康普瑞汀A4的总和的摩尔比为(2~2.5):1。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述聚（L-谷氨酸）和聚乙二醇单甲醚及其衍生物的质量比为1:(1~3)。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述活化试剂与聚乙二醇单甲醚及其衍生物的摩尔比为(1.5~4.0):1。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S2中所述活化的温度为-20~30℃，活化的时间为10~60 min；S2中所述反应的温度为5~60℃，反应的时间为5~18 h。
11.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S2中活化试剂与康普瑞汀A4和BLZ945的总和的摩尔比为(1.5~4.0):1。
12.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述聚（L-谷氨酸）和康普瑞汀A4的质量比为1:(0.002~0.7)；所述聚（L-谷氨酸）和BLZ945的质量比为1:( 0.002~0.7)。
13.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S2中康普瑞汀A4和BLZ945的质量比为1:(0.05~20)。
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