CN108976342B - 四价顺铂类前药与生物还原性药物联用的用途 - Google Patents

四价顺铂类前药与生物还原性药物联用的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种四价顺铂类前药与生物还原性药物联用的用途；该四价顺铂类前药的结构式如(Ⅰ)所示，其中，m为0‑1000、n为1‑1000，I为1～1000；本发明的四价顺铂类前药装载生物还原性药物替拉扎明，在肿瘤细胞微环境下降解释放顺铂抗癌药，且可以诱导癌细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)的酶家族高表达，提高癌细胞的耗氧率，进一步提高生物还原性药物替拉扎明的药效，协同治疗以提高整个癌症治疗的疗效；
Figure DDA0001648256220000011

Description

四价顺铂类前药与生物还原性药物联用的用途
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，特别涉及铂类聚合物协同治疗的应用领域，具体涉及一种四价顺铂类前药与生物还原性药物联用的用途。
背景技术
在临床上，铂类药物，包括顺铂、卡铂、奥沙利铂等，是一类具有抗癌活性的金属配合物，由B.Rosenborg等人在1965年首次发现可以抑制肿瘤细胞生长后,就广泛应用于癌症化学治疗,在化疗药物中占有重要的位置。铂类药物具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用等特点,在治疗肺癌、食道癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、胃癌等方面作为一线药物,特别是睾丸癌早期治愈率达100％、卵巢癌早期治愈率达80％以上。然而，顺铂等抗癌药作为传统的小分子药物，其系统毒性和短的循环时间等问题又不容忽视。
另一方面，由于细胞快速增殖和异常血管形成导致的严重缺氧，被认为是实体瘤的标志。乏氧的存在常常起到了抵抗常规癌症治疗的重要作用，如放疗，化疗和光动力治疗(Cell 2007,129,465-472)。因此，生物还原性药物被认为是一种肿瘤治疗方法。然而，单独使用生物还原性药物用于抗肿瘤，通常对于具有充足氧气的细胞效果不佳。
除了抗肿瘤效果以外，铂类药物还有诱导肿瘤细胞产生活性氧的能力。铂类药物可激活肿瘤细胞中称为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOXs)的酶家族(J.Neurosci.2010,30,3933-3946)，可穿过质膜将电子传送。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种四价顺铂类前药与生物还原性药物联用的用途。本发明发现该铂类药物不仅作为药物用于肿瘤治疗，而且还可以作为诱导NADPH氧化酶高表达导致氧气消耗的媒介，诱导生物还原性药物替拉扎明毒性产生，从而协同肿瘤治疗。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种四价顺铂类复合物，所述复合物由四价顺铂类前药装载生物还原性药物制备而得；所述四价顺铂类前药的结构式如(Ⅰ)所示：
Figure GDA0002088937880000021
其中，m为0-1000，n为1～1000，I为1～1000。优选m为1-1000，n为1～1000，I为1～1000。
优选的，将1～10mg生物还原性药物溶解在1～10mL浓度为1～10mg/mL的所述四价顺铂类前药中，避光搅拌1～24小时，透析，即完成四价顺铂类前药装载生物还原性药物。
优选的，用于装载生物还原性药物的四价顺铂类前药的尺寸范围在10～1000nm。
优选的，所述生物还原性药物为替拉扎明。
第二方面，本发明涉及一种四价顺铂类前药用于装载生物还原性药物的用途，所述铂类前药结构式如(Ⅰ)所示，其中，m为0-1000，n为1～1000，I为1～1000。
该铂类前药(也表示为：铂基Pt(IV)前药)，其在肿瘤还原微环境下降解，且还原得到二价铂类化疗药，用于治疗肿瘤。
该铂基Pt(IV)前药还可诱导癌细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)的酶家族高表达，提高癌细胞的耗氧率。
优选的，所述生物还原性药物为替拉扎明。
优选的，将1～10mg生物还原性药物溶解在1～10mL浓度为1～10mg/mL的所述四价顺铂类前药中，避光搅拌1～24小时，透析，即完成四价顺铂类前药装载生物还原性药物。
优选的，用于装载生物还原性药物的四价顺铂类前药的尺寸范围在10～1000nm。
优选的，四价顺铂类前药装载生物还原性药物用于诱导癌细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)的酶家族高表达。
优选的，四价顺铂类前药装载生物还原性药物用于提高癌细胞的耗氧率。
优选的，四价顺铂类前药装载生物还原性药物用于提高生物还原性药物的药效。从而用于协同治疗。
优选的，所述的四价顺铂类前药是通过包括如下步骤的方法制备而得：
S1、以偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰为引发剂，在二硫酯类或三硫酯类链转移剂和溶剂的存在下，四价顺铂类单体前药与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸(酰)胆碱经过三次冷冻-抽气-解冻过程，在30～80℃下反应0.5～72小时；
制备四价顺铂类前药的单体的结构式如式(II)所示：
Figure GDA0002088937880000031
S2、反应完毕后，冰浴淬灭反应，然后用冷乙醚沉淀，即得所述四价顺铂类单体前药。
优选的，步骤S1中，所述四价顺铂类单体前药与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸(酰)胆碱的摩尔比为1：1～20；所述二硫酯类或三硫酯类链转移剂与四价顺铂类单体前药的摩尔比为1：10～100；所述引发剂与二硫酯类或三硫酯类链转移剂的摩尔比为1：1～10。
优选的，所述四价顺铂类单体前药为顺式-二氯二胺二甲基二乙酰胺基甲基丙烯酸甲酯铂(IV)。所述顺式-二氯二胺二甲基二乙酰胺基甲基丙烯酸甲酯铂(IV)和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比为1：1～20。所述三硫酯类链转移剂为2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-异丁酸；2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-异丁酸与顺式-二氯二胺二甲基二乙酰胺基甲基丙烯酸甲酯铂(IV)的摩尔比为1：10～100。引发剂选用偶氮二异丁腈；偶氮二异丁腈与2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-异丁酸的摩尔比为1：1～10。
优选的，步骤S1中，所述溶剂为体积比为1：1～10的二甲基亚砜与甲醇的混合溶剂；所述混合溶剂的用量为每克四价顺铂类单体前药对应混合溶剂5～100mL。优选的，二甲基亚砜(DMSO)/甲醇混合溶剂的用量为10mL/g。
优选的，反应温度为65～75℃。
第三方面，本发明涉及一种本发明所述的四价顺铂类复合物(即四价顺铂类前药装载生物还原性药物)在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。
优选的，所述生物还原性药物为替拉扎明。
综上，本发明合理设计一种新型铂类(IV)复合物多功能药物，能够导致NOX相关的乏氧和生物还原前药(tirapazamine，TPZ)释放。
详细地说，本发明合成了一种基于铂类(IV)配合物的前体药物单体(PPM)，其含有对称的轴向双氨基甲酸乙酯甲基丙烯酸酯配体。为了通过增强的渗透性和保留(EPR)效应有效地将药物递送到肿瘤部位，具有高水平的生物相容性并且抵抗蛋白质吸附的两性离子分子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)单体为用于与PPM共聚合成超支化聚合物。
铂类(IV)配合物聚合成纳米凝胶后，克服了小分子铂类药物不可避免的弊端，如副作用严重，水溶性不足，细胞摄取效率低，非特异性递送等。重要的是，肿瘤中缺氧微环境(部分由NOX诱导的氧耗尽引起)激活了TPZ的细胞毒性，TPZ从附近的大分子中去除氢原子以诱导细胞凋亡。除了上调NOXs的表达，药物，即来自多种药物的还原产物，也作为一种化疗药物将缺氧激活的前药(生物还原性药物)联合用于协同癌症治疗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明反应条件简单，合成出具有长循环的四价铂类聚合物，产品的收率高(收率≥99％)、铂含量稳定；同时后处理简单，适宜于工业化上产。
2、本发明的四价铂类前药装载生物还原性药物替拉扎明，在肿瘤细胞微环境下降解释放顺铂抗癌药，且可以诱导癌细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)的酶家族高表达，提高癌细胞的耗氧率，进一步提高生物还原性药物替拉扎明的药效，协同治疗以提高整个癌症治疗的疗效。
3、四价铂类前药具有长循环的功能，可以在肿瘤中富集，提高药物的效果，且只有在肿瘤细胞中的还原微环境中才能释放出高毒性二价铂类药物，显示系统毒性低，并且尺寸单一稳定。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的四价铂类前药的合成流程示意图；
图2为本发明的四价铂类前药的1H NMR谱图；
图3为实施例2制备的四价铂类前药纳米凝胶透射电镜图；
图4为实施例3制备的顺铂长循环纳米凝胶的体外释放曲线；其中，A为Pt的释放曲线；B为TPZ的释放曲线；
图5为实施例1制备的四价铂类前药诱导NADPH氧化酶表达的凝胶电泳图；
图6为实施例2制备的四价铂类前药对于A549肺癌细胞以及NOX1 siRNA转染后或者NOX1抑制剂二苯基碘化铵(DPI)预处理的A549肺癌细胞的氧气消耗率作用对比曲线图；
图7为实施例3制备的四价铂类前药装载乏氧药物替拉扎明和替拉扎明单药体外细胞毒性试验数据对比曲线图；
图8为实施例3中制备的四价铂类前药装载生物还原性药物替拉扎明与替拉扎明单药进行动物水平的药代动力学的对比曲线图；
图9为实施例3中制备的四价铂类前药装载生物还原性药物替拉扎明与替拉扎明单药进行动物水平肿瘤治疗效果的对比曲线图；
图10为实施例3中制备的四价铂类前药装载生物还原性药物替拉扎明与替拉扎明单药进行动物水平肿瘤治疗效果的对比图；其中，1、7、21分别指的是治疗天数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
超支化型铂类前药的合成。取168mg顺式-二氯二胺二甲基二乙酰胺基甲基丙烯酸甲酯铂(IV)和283.2mg加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱到50mL的茄型反应瓶，然后依次加入9.1mg的RAFT链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-异丁酸和1mg引发剂偶氮二异丁腈，随后加入10mL的无水二甲基亚砜/无水甲醇混合溶剂，通氮气保护后，开启搅拌，随后经过三次冻-抽气-解冻过程，避光反应时间20小时，反应温度60～70℃。反应完毕后，降到室温，吸取反应产物滴入200mL的冷乙醚中，出现沉淀并静置2小时，随后离心收集沉淀物，烘干后得到淡黄色固体。
实施例2
水凝胶型四价铂类前药的合成。取26.88mg顺式-二氯二胺二甲基二乙酰胺基甲基丙烯酸甲酯铂(IV)和283.2mg加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱到50mL的茄型反应瓶，然后依次加入9.1mg的RAFT链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-异丁酸和1mg引发剂偶氮二异丁腈，随后加入10mL的无水二甲基亚砜/无水甲醇混合溶剂，通氮气保护后，开启搅拌，随后经过三次冷冻-抽气-解冻过程，避光反应时间20小时，反应温度60～70℃。反应完毕后，降到室温，吸取反应产物滴入200mL的冷乙醚中，出现沉淀并静置2小时，随后离心收集沉淀物，烘干后得到淡黄色固体。
本实施例1或2所示化合物的合成路线，如图1所示；式V所示的化合物1H NMR如图2所示，测试溶剂为DMSO，分别对各个吸收峰进行归属，并在谱图中标明。
用透射电子显微镜法测定实施例2中铂类前药的粒径和粒径分布。
图3是实施例2制备的铂类前药纳米凝胶透射电镜图；从测定结果可知，铂类前药的平均粒径为123nm。
实施例3
本实施例涉及一种铂类前药装载乏氧药物替拉扎明的制备方法，包括以下具体步骤：
将1～10mg替拉扎明药物溶解在1～10mL浓度为1～10mg/mL的铂类前药，避光搅拌1-24小时，透析，装载的替拉扎明含量通过使用紫外/可见分光亮度计测试在500nm处的吸收而得。
图4是实施例3制备的顺铂长循环纳米凝胶的体外释放曲线。体外释放测定方法：精密移取新鲜制备的经过纯化的顺铂脂质体2mL于透析袋中(30KD)。放入20mL释放介质中，分别于0、1、2、4、8、10、18、30、42、50h取样1mL，同时补充新鲜介质1mL，ICP-AES的测试用于测试Pt含量，使用紫外/可见分光亮度计测试500nm处的波长用于测试TPZ含量，计算累计释放百分率，所有的测试进行三次。
试验结果表明：铂类前药体外具有氧化还原可控释放及缓释效果。
图5是实施例1制备的四价铂类前药诱导NADPH氧化酶表达的凝胶电泳图。测试方法：将A549肺癌细胞用胰酶消化稀释后接种到培养皿中，每孔接种细胞3×106个，过夜培养待细胞贴壁后，将0-100μM的铂类前药加入到培养皿中，依次共培养0、6、12、24、48小时，随后按照说明书使用TRIzol(Invitrogen)抽提总RNA，单链cDNA使用反转录PCR技术进行合成。随后，10μL的PCR产物通过凝胶电泳方式分离，并且在UV下观察。可以观察到NADPH氧化酶中的NOX1型及其辅酶NOXO1会出现高表达，并且随着时间推移表达逐渐减弱，说明A549肺癌细胞对于前药的影响是时间依赖性，并且有利于提高NADPH氧化酶的高表达。
图6是实施例2制备的铂类前药对于A549肺癌细胞以及NOX1 siRNA转染后或者NOX1抑制剂二苯基碘化铵(DPI)预处理的A549肺癌细胞的氧气消耗率作用。测试方法：对于使用NOX1siRNA转染的方式，A549细胞在24孔板上培养，随后瞬时转染带有100nM NOX1的X-tremeGENE siRNA转染试剂盒(Roche Applied Science)，并且依照说明书进行转染。对于DPI预处理的细胞，预先加入10μM的DPI与A549肺癌细胞共培养。随后上述三种A549肺癌细胞加入20μM的四价铂类聚合物，12小时以后，更换培养基，并且使用液体石蜡用于隔离培养基与外界空气。随后测试使用的是Clark氧气电极(DOG-3082溶氧仪)温度保持在37℃。测试的氧气浓度在10mL的RPMI1640的培养基作为背景。相对的氧气消耗速率通过氧气值的变量对比初始氧气值得到。实验结果表明：A549肺癌细胞与四价铂类前药共培养后，氧气消耗率提高，而被NOX1 siRNA转染或被DPI抑制后的A549肺癌细胞氧气消耗率降低，进一步说明四价铂类前药可以实现提高NADPH氧化酶的高表达从而提高氧气消耗率。
实施例4
本实施例3制得的四价铂类聚合物装载生物还原性药物替拉扎明用于癌细胞的抗恶性肿瘤实验。
图7是实施例3制备的四价铂类聚合物装载乏氧药物替拉扎明和替拉扎明单药体外细胞毒性试验数据曲线。测定方法：将A549肺癌细胞用胰酶消化稀释后接种到96孔板，每孔接种细胞8000个，过夜培养待细胞贴壁后，将不同浓度的脂质体依次加到96孔板上，每孔10μL，终浓度为100、50、10、2、1、0.1mg/L，每个浓度设为5个复孔，每块板设一组正常对照组(加入10μL纯净水，不含四价铂类聚合物)和空白凋零孔(只加培养液，不含细胞和药物)，在培养箱内培养48h。采用厌氧产气带(Mitsubishi Gas Chemical Co.Inc.,Japan)提供细胞培养环境从1％的氧气浓度模拟乏氧肿瘤微环境。之后弃去上清液，然后每孔加MTT溶液20μL继续孵育4h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，再每孔加100μL溶解液，振荡使结晶物充分溶解，最后进行比色。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。细胞生长抑制率＝(1-A实验/A对照)*100％。实验结果表明：相比被NOX1 siRNA转染后的A549肺癌细胞，未被干扰的A549肺癌细胞被四价铂类聚合物装载乏氧药物替拉扎明处理过后，细胞活性明显降低；而作为对比，在乏氧情况下细胞的活性比正常氧气情况下显著降低；上述结果说明四价铂类聚合物装载乏氧药物替拉扎明可以显著提高细胞毒性。
此外，还将实施例3中制备得到铂基(IV)前药装载生物还原性药物替拉扎明与替拉扎明单药进行动物水平的药代动力学的对比，分别尾静脉注射4mg/kg TPZ/小鼠体重当量的药物，每隔一定时间进行取血，通过高效液相色谱手段测得血样中替拉扎明的含量，最终得到两种药物的药代动力学曲线，如图8所示。从图8可以观察到：该铂基(IV)前药装载生物还原性药物替拉扎明具有在体内长循环的作用，循环半衰期达到12小时左右，而单药替拉扎明的循环时间就很短，在半小时内就被清除，说明把光化疗药物修饰成高分子的结果有利于体内长循环。
最后，还将实施例3中制备得到的四价铂类聚合物装载生物还原性药物替拉扎明与顺铂单药和替拉扎明单药进行动物水平肿瘤治疗效果的对比，首先，预先在小鼠后腿右上部种上非小型细胞肺癌A549细胞系肿瘤，等瘤体积达到50mm3，把小鼠分为5组，依次为生理盐水，替拉扎明，替拉扎明+顺铂，四价铂类聚合物，和四价铂类聚合物装载生物还原性药物替拉扎明，分别尾静脉注射2mg/kg替拉扎明/小鼠体重当量的药物，每2天一次，总共5次，治疗21天，对小鼠肿瘤体积每两天称量一次并且拍照，结果如图9和图10所示，四价铂类聚合物装载生物还原性药物替拉扎明具有优秀的抗肿瘤效果，有些小鼠的肿瘤最终消失，说明利用四价铂类聚合物释放得到的顺铂并且提高NADPH氧化酶诱导氧气消耗提高替拉扎明药效在治疗恶性肿瘤中具有潜在的应用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种四价顺铂类复合物，其特征在于，所述复合物由四价顺铂类前药装载生物还原性药物制备而得；所述四价顺铂类前药的结构式如(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002268172810000011
其中，m为1～1000，n为1～1000，I为1～1000。
2.一种四价顺铂类前药用于装载生物还原性药物的用途，所述四价顺铂类前药的结构式如(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002268172810000012
其中，m为1～1000，n为1～1000，I为1～1000。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述生物还原性药物为替拉扎明。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，将1～10mg生物还原性药物溶解在1～10mL浓度为1～10mg/mL的所述四价顺铂类前药中，避光搅拌1～24小时，透析，即完成四价顺铂类前药装载生物还原性药物。
5.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，用于装载生物还原性药物的四价顺铂类前药的尺寸范围在10～1000nm。
6.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，四价顺铂类前药装载生物还原性药物用于诱导癌细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的酶家族高表达。
7.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，四价顺铂类前药装载生物还原性药物用于提高癌细胞的耗氧率。
8.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，四价顺铂类前药装载生物还原性药物用于提高生物还原性药物的药效。
9.一种如权利要求1所述的四价顺铂类复合物在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述生物还原性药物为替拉扎明。
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