CN111420068B - 聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇‑树枝状聚赖氨酸/酸酐‑顺铂复合物，以聚乙二醇‑树枝状聚赖氨酸为载体，将顺铂通过酸酐作为间隔基连接在所述载体中聚赖氨酸嵌段的侧氨基上得到，该复合物实现了对药物的可控释放及细胞毒性的调节，可同时输送多种药物，提高了药物疗效，具备巨大的临床转化价值。本发明还提供了上述复合物的制备方法及其在抗肿瘤药物输送中的应用，本发明的制备方法步骤简单，适于工业化大量生产，在抗肿瘤药物的输送领域具备巨大的临床转化价值。

Description

聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于抗癌药物制备领域，具体涉及一种聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物作为抗肿瘤药物及其制备方法和应用。
背景技术
顺铂是临床上广泛应用的一种化疗药物，具有抗癌谱广、疗效好、与多种抗癌药物有协同作用等特点。虽然该药物在非小细胞肺癌、睾丸、卵巢、乳腺癌、头颈部肿瘤等多种实体瘤中有效，但顺铂的溶解性低、靶向性差、对正常器官组织也有巨大的毒副作用，尤其对肾脏结构和功能有重大影响。另外，一些癌细胞对顺铂具有一定的耐药性，严重限制了其临床给药剂量和疗效。
纳米药物传递系统的优势已广为人知，它不仅能延长药物在体循环中的半衰期，还能持续或环境敏感性地靶向释放药物以减小系统毒性。另外，负载了两种或多种药物的纳米载药体系还能产生协同效应，克服单一药物治疗时的细胞耐药性。
目前已有多种高分子-顺铂纳米药物正在进行临床实验或已经实现临床化，如顺铂的PEG脂质体药物LipoplatinTM已经通过临床试验成功上市，具有长循环和高肿瘤蓄积的特点，其阴离子脂质双分子层促进了药物跨越细胞膜，然后在细胞内脂肪酶的降解下实现了药物的有效释放。Mebiopharm公司公开了由转铁蛋白修饰的奥沙利铂脂质体MBP-426，通过与转铁蛋白受体连接，MBP-426可以有效介导药物优先与肿瘤细胞结合；在I期临床试验中MBP-426已经表现出有效的抗肿瘤活性，其II期临床试验正在进行。Kataoka课题组合成了一系列聚乙二醇-聚谷氨酸(PEG-b-pGlu)的高分子-顺铂络合物(NC-6004)，已成功进入对胰腺癌的三期临床试验，已完成对非小细胞肺癌和膀胱癌的临床二期试验，体现出了较好的治疗效果。
除了上述己进入临床试验阶段的顺铂脂质体之外，近年来药学科学家也在积极探索新型顺铂复合物脂质体，以解决顺铂毒性大、载药量低、释药困难等问题。如Zhou等将顺铂与十八烯酸的羧基聚合并包载于卵磷脂、十八油酸、胆固醇和mPEG—DSPE制备的空白脂质体，提高了顺铂的载药量和释放量；其在体外释放试验中，也表现出良好的药物持续释放效果。其原因是在药物释放后期，顺铂的氯离子与十八烯酸的羧基发生了交换反应，使得顺铂可以继续释放，目前这种顺铂脂质体仍处于临床前研究阶段。
综上所述，如何提供一种纳米药物传递系统以提高药物疗效及实现药物可控释放是目前研制抗肿瘤药物中亟待解决的重要问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于药物输送的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物，该复合物实现了对药物的可控释放及细胞毒性的调节，可同时输送多种药物，提高了药物疗效，具备巨大的临床转化价值。
本发明的另一目的还在于提供了上述聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物，以具有1～8代树枝状聚赖氨酸结构的二嵌段共聚物聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸为载体，将顺铂通过酸酐作为间隔基连接在所述载体中聚赖氨酸嵌段的侧氨基上得到；所述的二嵌段共聚物聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸中聚乙二醇嵌段的数均分子量为200～44000。
树枝状大分子是由重复增长反应合成而来的，高度支化且结构精确的分子，每一个重复循环反应增加一个支化层，叫做"代"。而本发明所述的载体为二嵌段共聚物聚乙二醇-m代树枝状聚赖氨酸(PEG-b-DPLL-Gm，1≤m≤8)，其中，利用含氨基的聚乙二醇(PEG-NH2)与赖氨酸可制得聚乙二醇-1代树枝状聚赖氨酸，继续通过发散法可依次制得聚乙二醇-2代、3代……m代树枝状聚赖氨酸。
本发明最终制得的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物为纳米囊泡结构，因此本发明也将该复合物简称为顺铂纳米囊泡。
作为优选，所述复合物以具有4代树枝状聚赖氨酸结构的二嵌段共聚物聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸为载体，所述载体的结构如下式(I)所示：
Figure BDA0002494201700000031
式(I)中，n为聚合度，5≤n≤1000。
利用上述载体连接得到的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的简化结构如下式(II)所示：
Figure BDA0002494201700000041
式(II)中，R1和R2源自酸酐，～为重复单元；n为聚合度，5≤n≤1000。
所述的酸酐选自丁二酸酐、甲基丁二酸酐、2，2-二甲基丁二酸酐、2，2，3，3-四甲基丁二酸酐、环己基丁二酸酐、7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,3-二羧酸酐、马来酸酐、甲基马来酸酐、2,3-二甲基马来酸酐、2-乙基-3-甲基马来酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、顺式乌头酸酐、3-甲基顺式乌头酸酐中的任意一种。
本发明还公开了上述聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，包括：利用载体中聚赖氨酸嵌段的侧氨基与酸酐中的羧基进行酰胺反应，然后再与顺铂在水中自组装后制得。
上述聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一：在室温条件下，将聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸(PEG-DPLL-Gm)与酸酐在水中搅拌反应至羧基反应完全，再将得到的溶液依次经过透析、过滤、冷冻干燥得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐(PEG-DPLL-Gm/amide)；
步骤二：将聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐和顺铂溶于水中自组装得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物(PEG-DPLL-Gm/amide-CDDP)。
优选地，所述步骤一的反应过程中利用氢氧化钠溶液调节pH至8～9。在优选的pH值范围内反应最完全，pH值过高或过低均很难反应。
所述步骤一中载体的氨基与酸酐投料的摩尔比为1：1～20，优选为1：10。
所述步骤一中将反应得到的溶液放入透析袋中，先用磷酸氢二钠溶液透析14～18h，再用氢氧化钠溶液透析6～10h；或/和，
所述透析的截留分子量为3500KDa。
所述步骤二中顺铂与聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐中羧基的摩尔比为1：1～5，优选为1～1；所述羧基浓度为4～6mmol/ml，优选为5mmol/ml。
本发明还公开了上述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物在抗肿瘤药物输送中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在常温常压下即可制备得到结构准确、分散性小的顺铂纳米囊泡，步骤简单，适于工业化大量生产。
(2)本发明通过载体聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸与不同酸酐的螯合，实现了对顺铂药物释放可调和细胞毒性调节。
(3)本发明的顺铂纳米囊泡因其独特的结构可同时携带亲水性和疏水性药物，而该纳米载药体系可通过负载多种药物产生协同效应，克服单一药物治疗时的细胞耐药性，提高了疗效。
(4)本发明利用聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐包载顺铂药物可以提高药物分子的溶解性和稳定性，增加药物在血液中的循环时间，借助于肿瘤的“增强渗透和滞留效应”显著提高药物在病灶部位的富集能力，减少其在正常器官组织中的分布，从而增强药物疗效、减少毒副作用。
(5)本发明的抑瘤实验结果显示，在相同剂量的铂含量下，纳米复合物的毒性明显低于顺铂，且治疗效果优于顺铂。
附图说明
图1为本发明中聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的合成路线；
图2为本发明聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的透射电子显微镜(TEM)图；
图3为实施例1中制备的PEG-DPLL-G4/SA的核磁图；
图4为实施例2中制备的PEG-DPLL-G4/MSA的核磁图；
图5为实施例3中制备的PEG-DPLL-G4/DMS的核磁图；
图6为实施例4中制备的PEG-DPLL-G4/TM的核磁图；
图7为实施例7中制备的PEG-DPLL-G4/MSA-Pt、PEG-DPLL-G4/DMS-Pt和PEG-DPLL-G4/TM-Pt的粒径图；
图8为实施例7中制备的PEG-DPLL-G4/MSA-Pt、PEG-DPLL-G4/DMS-Pt和PEG-DPLL-G4/TM-Pt中10h(a)及24h(b)顺铂释放速率图；
图9为荷瘤裸鼠注射顺铂和PEG-DPLL-G4/MSA后肿瘤体积(a)和体重(b)变化图。
具体实施方式
下面提供一些具体的实施例，但本发明不受这些案例的限制。下列实施例中所用的原料聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸(PEG-DPLL-G4，Mw＝6920)参考文献中所述的方法制得，具体的合成路线如下：
Figure BDA0002494201700000071
具体制备方法包括：以分子量为5000的PEG-NH2为中心，以叔丁氧羰基为保护基团、六氟苯酚活化的赖氨酸((Boc)2Lys-COOH)为重复单元，通过发散法制得含有16个氨基的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸(PEG-DPLL-G4)。本发明中聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的合成路线如图1所示，其透射电子显微镜(TEM)图如图2所示。
实施例1：聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸-酸酐的制备
以氨基与酸酐的摩尔比为1：10投料，将聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸(poly(ethylene glycol)-dendritic poly(lysine)，PEG-DPLL-G4，Mw＝6920)100mg溶于去离子水中，加适量磷酸氢二钠；分批加入232mg丁二酸酐(Succinic Anhydride，SA,Mw＝100)，搅拌并用氢氧化钠溶液调节pH至8.5左右，酸酐全部投入后反应至溶液澄清，继续室温搅拌反应30min。反应结束后，将反应液放入3500KDa透析袋中，用磷酸氢二钠溶液(pH＝8.5)透析16h，再用氢氧化钠溶液(pH＝8.5)透析8h。透析后的液体用0.45μm的水系滤头过滤，冷冻干燥，即可得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸-酸酐的白色粉末，记为PEG-DPLL-G4/SA，其核磁图谱如图3所示。
实施例2：
制备工艺与实施例1基本相同，区别仅在于将丁二酸酐替换为甲基丁二酸酐(Methylsuccinic Anhydride，MSA，Mw＝114)，得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸-酸酐的白色粉末，记为PEG-DPLL-G4/MSA，其核磁图谱如图4所示。
实施例3：
制备工艺与实施例1基本相同，区别仅在于，将丁二酸酐替换为2,2-二甲基丁二酸酐(2,2-Dimethylsuccinic Anhydride，DMS，Mw＝128)，得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸-酸酐的白色粉末，记为PEG-DPLL-G4/DMS，其核磁图谱如图5所示。
实施例4：
制备工艺与实施例1基本相同，区别仅在于，将丁二酸酐替换为四甲基丁二酸酐(TM，Mw＝156)，得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸-酸酐的白色粉末，记为PEG-DPLL-G4/TM，其核磁图谱如图6所示。
实施例5：
制备工艺与实施例1基本相同，区别仅在于，将丁二酸酐替换为环己基丁二酸酐(Cyclohexylsuccinic Anhydride，CY，Mw＝154)，得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸-酸酐的白色粉末，记为PEG-DPLL-G4/CY。
实施例6：聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备
以羧基与顺铂摩尔比为1：1投料，将30mg PEG-DPLL-G4/SA溶于11.2ml去离子水中(CCOOH＝5mmol/L)，用1M氢氧化钠溶液将pH调至8.5，加入16.07mg顺铂，37℃摇床振荡反应72h，反应结束后0.45μm的水系滤头过滤，即得纳米囊泡，记为PEG-DPLL-G4/SA-Pt。
实施例7：
制备工艺与实施例6基本相同，区别仅在于，将PEG-DPLL-G4/SA依次替换为PEG-DPLL-G4/MSA、PEG-DPLL-G4/DMS、PEG-DPLL-G4/CY、PEG-DPLL-G4/TM，即得纳米囊泡，分别记为PEG-DPLL-G4/MSA-Pt、PEG-DPLL-G4/DMS-Pt、PEG-DPLL-G4/TM、PEG-DPLL-G4/CY-Pt。
制得的PEG-DPLL-G4/MSA-Pt、PEG-DPLL-G4/DMS-Pt和PEG-DPLL-G4/TM-Pt的粒径图如图7所示，可知纳米囊泡粒径均在15nm左右。
性能测试：
(1)聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的顺铂释放实验
取1ml实施例6～7制备得到的顺铂样品于透析袋中，分别在50ml pH7.5，pH 5.0的PBS缓冲液中进行顺铂释放实验，过10h，24h后透析袋外取样，用ICP-MS测定缓冲液中Pt含量，并计算Pt释放速率。
从图8可以看出，PEG-DPLL-G4/MSA-Pt的释放速率最快，PEG-DPLL-G4/TM-Pt的释放速率最慢，PEG-DPLL-G4/MSA-Pt，PEG-DPLL-G4/DMS-Pt，PEG-DPLL-G4/TM-Pt的释放速率依此递减。这就表明接有不同酸酐的纳米颗粒有不同的释放速率，我们可通过控制酸酐的类型来控制药物释放速率。
(2)聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物体外细胞毒性实验
用实施例6～7分别制备的顺铂纳米颗粒分别在人宫颈癌Hela细胞以及人肺癌A549细胞中进行48小时细胞毒性实验，Pt浓度梯度为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml，最后测量得到顺铂纳米颗粒分别在pH＝7.4与pH＝5.0条件下的细胞毒性实验的IC50结果如下表1所示。
表1
Figure BDA0002494201700000101
由上表1可知，PEG-DPLL-G4/amide-Pt纳米囊泡在pH＝5.0时的半致死量IC50小于pH＝7.4时的IC50，表明在低pH环境中纳米囊泡有更强的细胞毒性。与游离的顺铂相比，pH＝7.4时顺铂纳米囊泡的细胞毒性较弱，但在pH＝5.0时与顺铂的毒性相接近。
(3)聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的抗肿瘤活性
将A549接种于BALB/c小鼠皮下，建立肺癌肿瘤模型。待肿瘤长至100mm3左右时，将24只小鼠随机分成4组，分别用PBS、顺铂及PEG-DPLL-G4/MSA尾静脉给药。给药剂量为：Pt含量4mg/kg，每两天给一次共5次，并记录肿瘤大小及小鼠体重。
图9为荷瘤小鼠肿瘤体积变化及小鼠体重变化图。结果显示聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的治疗效果略优于顺铂，且大大降低了顺铂的毒副作用，提高了小鼠的存活率。

Claims (8)

1.一种聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，其特征在于：
所述复合物以具有1～8代树枝状聚赖氨酸结构的二嵌段共聚物聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸为载体，将顺铂通过酸酐作为间隔基连接在所述载体中聚赖氨酸嵌段的侧氨基上得到；所述二嵌段共聚物聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸中聚乙二醇嵌段的数均分子量为200～44000；
所述复合物的制备方法包括：
步骤一：在室温条件下，将载体与酸酐在水中搅拌反应至羧基反应完全，再将得到的溶液依次经过透析、过滤、冷冻干燥得到聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐；
步骤二：将聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐和顺铂溶于水中自组装得到所述聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，其特征在于：
所述复合物以具有4代树枝状聚赖氨酸结构的二嵌段共聚物聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸为载体，所述载体结构如下式(I)所示：
Figure FDA0003091261060000021
式(I)中，n为聚合度，5≤n≤1000。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，其特征在于：
所述的酸酐选自丁二酸酐、甲基丁二酸酐、2，2-二甲基丁二酸酐、2，2，3，3-四甲基丁二酸酐、环己基丁二酸酐、7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,3-二羧酸酐、马来酸酐、甲基马来酸酐、2,3-二甲基马来酸酐、2-乙基-3-甲基马来酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、顺式乌头酸酐、3-甲基顺式乌头酸酐中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤一的反应过程中利用氢氧化钠溶液调节pH至8～9。
5.根据权利要求1所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤一载体中的氨基与酸酐投料的摩尔比为1：1～20。
6.根据权利要求1所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤一中将反应得到的溶液放入透析袋中，先用磷酸氢二钠溶液透析14～18h，再用氢氧化钠溶液透析6～10h；或/和，
所述透析膜的截留分子量为3500KDa。
7.根据权利要求1所述的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤二中顺铂与聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐中羧基的摩尔比为1：1～5；所述羧基浓度为4～6mmol/ml。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的制备方法制备的聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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