CN104815335A - 一种水溶性聚谷氨酸-顺铂复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明是专利CN102499986A“一种大分子-顺铂复合物及其制备方法与应用”的继续，其发明内容及权利要求均适用于本发明。本发明涉及水溶性聚谷氨酸-顺铂复合物，并提供该复合物的制备方法及用途，属生物医药技术领域。本发明以生物发酵制得的γ-聚谷氨酸为原料，用小分子修饰剂与其侧链活性基团进行反应，制备γ-聚谷氨酸衍生物，再把顺铂与改造后的载体反应，制得既包含游离顺铂又包含结合顺铂的载药复合物。本发明水溶性聚谷氨酸-顺铂复合物的水溶性较现有顺铂复合物显著提高，顺铂利用率提高，除具有优于顺铂的抗癌效果外，其在体内毒性明显降低。

Description

一种水溶性聚谷氨酸-顺铂复合物及其制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及一种水溶性聚谷氨酸-顺铂复合物，并提供该复合物的制备方法、评价方法及其用于治疗肿瘤和癌症的应用，属于抗癌药物的制备领域。

背景技术：

顺铂[cis-dichlorodiammineplatinum(Ⅱ)，CDDP]为重金属络合物，临床上广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗，抗癌谱广。顺铂抗肿瘤的作用原理是：顺铂水解后的Pt²⁺可与DNA双链中的碱基交联形成稳定的复合物，从而造成DNA的损伤，影响DNA的复制、转录，进一步抑制细胞DNA的合成，导致细胞死亡或凋亡。在实际应用中，顺铂给药后往往会产生严重的毒副作用，使患者难以接受，且在达到治疗效果的同时，引起严重的肝肾毒性、骨髓抑制、神经毒性及严重的胃肠道反应等，从而大大限制了顺铂在临床上的应用。目前国内外上市的顺铂制剂有顺铂注射液和注射用顺铂冻干粉两种。上述两种制剂均不能解决顺铂给药后清除较快，毒副作用大的缺陷。其他剂型的顺铂制剂正处于研发中，包括顺铂脂质体、顺铂聚合物胶束等，这些制剂可实现缓慢释放顺铂且被动靶向于肿瘤组织的目的，但存在稳定性差、易于泄露等缺陷从而限制了其应用。

目前，以生物发酵制得的天然的γ-PGA作为药物载体所表现出的优良的生物相容性与生物可降解性引起了广泛的关注，曾有研究报道以聚谷氨酸为载体，连接难溶性药物紫杉醇，所制成的紫杉醇药物传递系统不但提高了紫杉醇的溶解性，降低了其单独给药的毒性，而且在治疗效果和延长生存期上有较明显的优势，目前该制剂已进入Ⅲ期临床阶段。但γ-PGA本身作为线性单氨基酸高分子聚合物，活性基团位点排列过于紧密，且活性基团较为单一，可修饰的药物较少。单独以此作为药用载体存在载药量低、可载药物种类少、载体用量大、载药后溶解性差等缺点。因此，开发新型的改性γ-聚谷氨酸载体，以降低药物接入的空间位阻，增加活性基团种类与数目是目前有待进一步解决的重要问题之一。

本发明提供了一种增加γ-聚谷氨酸活性基团数目及种类，减小空间位阻的方法。鉴于顺铂有上述的缺陷，本发明可增加顺铂的溶解性，降低顺铂单独给药的毒性，是一种活性好，毒性低的新型顺铂复合物制剂。

中国专利申请CN102499986A公开了一种大分子-顺铂复合物的制备方法，其制备及评价方法包括：

(1)将γ-聚谷氨酸溶于适量纯水中，以EDC·HCl与NHSS为酯化反应催化剂，柠檬酸为小分子修饰剂进行反应，之后将反应液透析以除去小分子杂质，冷冻干燥制备γ-聚谷氨酸衍生物；

(2)用硝酸银将顺铂水化，之后与γ-聚谷氨酸衍生物进行配位结合，除去未完全反应的顺铂，从而冷冻干燥制备载药胶束。

(3)该载药胶束中顺铂的载药量为18％，有效结合率为65％。

上述制备方法及所得产物存在如下缺陷与问题：

(1)γ-聚谷氨酸衍生物的制备过程中所使用的催化剂之一为NHSS，其反应原理主要是使羧基与氨基进行酰胺化反应，而柠檬酸中的活性基团为羟基与羧基，催化剂选用NHSS时，γ-聚谷氨酸中小分子的接入率偏低。且NHSS价格较贵，生产成本较高，不适宜规模化生产。

(2)该载药胶束在制备的过程中应用硝酸银，生产成本较高，制备工艺过程中需要全程避光操作，对设备和环境要求较高。纯化后产物中有重金属银的残留，不同批次的载药胶束颜色不均一。

(3)该方法制备的γ-聚谷氨酸衍生物在接入顺铂时，由于小分子接入率低，顺铂的载入的空间位阻大，载药量低，载药后胶束体系难溶于水，通常需要升温以加速溶解。

(4)该方法在制备载药胶束时，将未反应的顺铂采用透析法去除，顺铂的接入率低，仅为65％。

(5)该方法在制备γ-聚谷氨酸衍生物与载药胶束过程中纯化步骤采用的是透析袋法，该方法不能完全去除未反应的小分子，且纯化时间较长，透析后溶液体积膨胀严重，较难冷冻干燥，难以规模化生产。

(6)该方法制备的载药胶束中顺铂均以配位键与载体相连，在体外细胞增殖实验中，对肿瘤细胞的抑制作用低于顺铂，顺铂的体内抗肿瘤活性优于所制备的载药胶束。

发明内容：

本发明是前述专利CN102499986A“一种大分子-顺铂复合物及其制备方法与应用”的继续，本发明包括但不局限于前述专利。

本发明的目的之一在于克服现有技术存在的上述缺点，提供一种小分子接枝率高的药物载体γ-聚谷氨酸衍生物。顺铂与其反应，通过化学结合与物理吸附的方式形成一种既包含结合顺铂又包含游离顺铂的聚谷氨酸-顺铂复合物，该复合物中顺铂总含量可控，提高了顺铂的利用率，降低了顺铂的毒副作用。

本发明目的之二在于提供一种简单可行、成本低廉、适用于规模化生产的新型载体聚合物——γ-聚谷氨酸衍生物的制备方法。

本发明目的之三在于提供一种成本低廉，药物利用率高，操作简单，水溶性好的聚谷氨酸-顺铂复合物的制备方法。

本发明中γ-聚谷氨酸衍生物的制备方法和CN102499986A所公开的衍生物制备方法基本类似。

本发明提供的生物合成聚氨基酸为γ-聚谷氨酸(γ-PGA)或其钠盐，其结构通式为：

其中，本发明中所用γ-聚谷氨酸是由生物发酵制得的γ-聚谷氨酸或其钠盐，分子量为10～50kDa。

本发明提供的小分子修饰剂为含两个以上羧基的酸或该酸的酯，主要包含L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、氨基丙二酸、丙三酸等。

本发明中γ-聚谷氨酸或其钠盐的侧链羧基既可以用含游离羟基的酸修饰，也可以用含游离氨基的酸修饰，修饰后小分子修饰剂与γ-聚谷氨酸之间通过共价键结合而成，形成酯键或酰胺键。

本发明提供的γ-聚谷氨酸衍生物制备方法包括：

(1)将γ-聚谷氨酸或其钠盐溶于反应溶剂中，在多肽缩合剂的作用下与小分子修饰剂进行反应，通过γ-聚谷氨酸侧链羧基或链端氨基与小分子修饰剂中游离羟基、氨基或羧基的酯化或酰胺化作用，将小分子修饰剂连接于γ-聚谷氨酸上；

(2)超滤浓缩除去小分子物质，冷冻干燥即得γ-聚谷氨酸衍生物。

本发明中γ-聚谷氨酸衍生物的制备过程中小分子修饰剂与γ-聚谷氨酸所用的反应溶剂是纯水；参与反应的多肽缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，小分子修饰剂与γ-聚谷氨酸(-COOH/-COONa)的摩尔比为0.5:1～5:1，优选比例为1:1；反应时间为6～24h，优选反应时间为18h；反应pH为6.5～8.0，优选为7.0～7.5；γ-聚谷氨酸衍生物的纯化方法既可用透析袋透析纯化，也可采用超滤浓缩纯化，优选超滤浓缩纯化法，这样制得载体分子量范围较集中，同时可节省纯化时间，且便于冷冻干燥。

本发明提供的聚合物-药物复合物的制备方法包括：

(1)将γ-聚谷氨酸衍生物溶于纯水；

(2)将顺铂加入到γ-聚谷氨酸衍生物溶液中，37℃至顺铂溶解，放置室温，调节pH至7.0～7.5；

(3)冷冻干燥即得载药复合物。

本发明中提供的顺铂接入方法为直接接入法，该方法简便可行、成本低廉，该反应中γ-聚谷氨酸衍生物与顺铂的质量比为1:1～5:1，优选3:1；反应时间为24～72h，优选48h；该反应的pH为6.5～8.0，优选为7.0～7.5；该反应的反应温度为25℃～37℃，优选为25℃；该反应需避光。

本发明提供的聚谷氨酸-顺铂复合物，同现有技术相比，本发明有如下优点与创新：

(1)本发明优选催化剂EDC·HCl/DMAP作为酯化反应催化剂，生产成本低廉，易于规模化生产，制得的γ-聚谷氨酸衍生物中小分子修饰剂的接入率增加；

(2)本发明采用顺铂直接加入法制备载药复合物，避免了硝酸银的使用，降低了生产成本，对设备要求低，避免了重金属银在产品中的残留；

(3)本发明在顺铂反应完毕后直接冻干，制得既有游离顺铂又有结合顺铂的复合物，且顺铂总含量可控，该方法使顺铂的利用率在99％以上，更合理有效地使用了资源，提高了经济效益；

(4)本发明由于催化剂的改进增加了小分子的接入率，使得顺铂接入后体系在水中易溶，成功制得了水溶性γ-聚谷氨酸-顺铂聚合物药物复合物；

(5)本发明在γ-聚谷氨酸衍生物的纯化过程中采用超滤法，该方法借用压力，可将未反应的小分子完全去除，且同时可将反应液浓缩，适合规模化生产的需要。

(6)本发明复合物中的游离顺铂可在短时间内迅速释放，达到较高的血药治疗浓度，之后结合的顺铂缓慢释放维持血药浓度平稳，实现了顺铂给药速释与缓释的结合，提高了治疗效果，减少了顺铂的给药次数，降低了毒性，具有潜在的临床应用价值。

(7)本发明的体外细胞增殖结果显示，本发明对肿瘤细胞的抑制效果由于顺铂，且γ-聚谷氨酸衍生物安全、无毒。体内药动结果显示，本发明可延长顺铂在体内的滞留时间，降低清除率，抗肿瘤实验结果显示，抗肿瘤活性优于顺铂，可明显延长荷瘤鼠的生存期，降低了顺铂给药的毒性。

以柠檬酸修饰后的γ-聚谷氨酸为例，制备得到γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物，该复合物水溶性在水中易溶，复合物中顺铂总含量约为25～28％，其中与载体结合顺铂含量约为16％，顺铂利用率在99％以上。释放介质为酸性时，72h顺铂的累计释放率达到64％。所制备的γ-聚谷氨酸-柠檬酸载体无毒，制得γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物体外对肿瘤细胞的抑制作用优于顺铂，体内滞留时间分布优于顺铂，顺铂清除率降低，体内抗肿瘤活性较顺铂好，且大大降低了顺铂单独给药的毒性。

附图说明：

图1为γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯核磁共振¹H-NMR图谱图。

图2为γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物中结合顺铂含量图。

图3为γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物于不同pH值释放介质中顺铂体外释放情况图。

图4为顺铂与γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物对A549和MCF-7肿瘤细胞的IC₅₀值图。

图5为顺铂与γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物在大鼠体内的血药浓度经时曲线图。

图6为顺铂和γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物的药动学参数图。

图7为S180荷瘤小鼠分别腹腔注射顺铂和γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物后相对肿瘤体积变化图。

图8为S180荷瘤小鼠分别腹腔注射顺铂和γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物后生存情况图。图9为S180荷瘤小鼠分别腹腔注射顺铂和γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物后体重变化图。

具体实施方式：

下面结合实施例，以γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物为例，但不限于此，对发明进行详细说明：

实施例1

γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯的合成及结构表征

取γ-聚谷氨酸约3.04g，精密称定，加入100mL水，搅拌30min使溶解，加入EDC·HCl3.84g，DMAP1.22g，冰浴搅拌60min。取无水柠檬酸3.84g，精密称定，加入到上述溶液中，搅拌使溶解。用NaOH溶液调节其pH至7.5左右，室温下反应18h。之后，将反应液置超滤仪(滤包分子量为10kDa)中，超滤浓缩至浓缩液呈无色透明，且滤出液pH呈中性。将浓缩液取出后冷冻干燥即得γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯。

结构表征取γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯干燥纯品适量，以D₂O为溶剂，测试温度为25℃，测试频率为300MHz，记录¹H-NMR图谱，结果见图1。

实施例2

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物的制备

取γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯适量，精密称定，加入至100mL水中溶解。取顺铂适量，精密称定，加入到上述反应液中，37℃水浴使顺铂充分溶解，用NaOH调节其pH至7.0～7.5，室温下避光反应48h，之后冷冻干燥即得γ-聚谷氨酸-顺铂聚合物药物复合物。

实施例3

γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯及γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物分子量的测定

GPC测定条件：流动相为pH4.0的0.2mol/L硫酸钠溶液(乙酸作为pH调节剂)；流速1mL·min^-1；柱温为35℃；进样量20μL；检测器：RID-10A；色谱柱型号：OHpak SB-806MHQ，300mm，Shodex。

采用不同分子量葡聚糖标准品做校正曲线，计算γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯及γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物分子量分别为9～12kDa与24～26kDa。

实施例4

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物中顺铂总含量及结合顺铂含量的测定

色谱条件：C18柱(HanbonSci.&Tech.Megres C18,4.6*300,5μ)；流动相：含150mmol·L^-1NaCl的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)；流速：0.65mL·min^-1；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

顺铂总含量取γ-PGA-CA-CDDP复合物适量，配成浓度为10mg·mL^-1的γ-PGA-CA-CDDP复合物储备液，取储备液1mL加入2mL 0.1mol·L^-1HCl溶液，于37℃恒温振荡箱中破坏12h，取出后加入2mL 0.1mol·L^-1NaOH溶液中和盐酸，用流动相定容至10mL即得供试品溶液。以顺铂为对照，按标准工作曲线法计算复合物中顺铂总含量。

结合顺铂含量取γ-PGA-CA-CDDP复合物16mg，精密称定，置于1mL容量瓶中，溶解并定容至刻度。取0.5mL于3k超滤管中，10000rpm/min离心10min，并用超纯水洗涤2～3次，取上层液体于10mL容量瓶中，加入HCl破坏，加入NaOH中和后定容，作为结合CDDP样品。以顺铂为对照，按标准工作曲线法计算复合物中结合顺铂含量。

结果见图2，即结果显示，γ-PGA-CA-CDDP复合物中顺铂总含量约为25～28％，其中结合顺铂含量约为16％，顺铂利用率高，复合物制备成本较低。

实施例5

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物在不同pH值释放介质中释放情况

取γ-PGA-CA-CDDP复合物适量，精密称定溶于5mL水中，配成CDDP浓度为1mg/mL的溶液。将溶液转移至截留分子量3500Da的透析袋中，两端用棉线扎紧防止漏液，置于50mL棕色广口瓶中，分别对25mL释放介质透析，置于37℃恒温水浴振荡器中，转速为100rpm/min。分别于1,2,3,4,5,6,8,10,12,24,36,48,60,72h取释放外液1mL，同时补加1mL释放介质。样品置于进样小瓶中冻存。临用前取出解冻，取100μL释放外液，用石墨炉原子分光光度法进行测定，记录吸光度A，并计算顺铂累积释放量。释放介质选取含150mmol/LNaCl的PBS(pH5.0,pH 6.5,pH 7.4)溶液。

图3为γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物于不同pH值释放介质中顺铂体外释放情况。结果显示：顺铂在不同释放介质中前12h存在突释现象，之后释放缓慢，72h在pH5.0,pH 6.5,pH 7.4释放介质中的累计释放率分别为64％，51％，41％。

实施例6

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物体外细胞毒性考察

取对数生长的肿瘤细胞(人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7)悬液，接种于96孔板上，每孔0.1mL(4*10³个细胞)(培养基含10％血清)。于37℃，95％湿度，5％CO₂培养箱中孵育24h。待细胞贴壁生长后，分别加入CDDP、γ-PGA-CA-CDDP复合物的新鲜培养基溶液。分别设定不同浓度的空白对照组和阳性实验组，每组设5个平行孔，其中药物浓度分别设为0、20、40、60、80、100mg·L^-1(阳性实验组药物浓度按CDDP计)，继续于细胞培养箱中培养24h，48h。之后每孔加入20μL浓度为5mg·mL^-1的MTT溶液，继续培养4h。吸去培养液，加入150μL DMSO，置于摇床中10min轻轻地混匀，于酶标仪波长490nm处读出每孔的OD值。并按下式计算实验组抑制率。用SPSS软件计算IC₅₀值。抑制率计算公式如下：

图4为顺铂与γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物对肿瘤细胞的IC₅₀值。结果显示，以γ-PGA-CA作为载体，与顺铂结合后，仍保留了其对肿瘤细胞的抑制作用。相同条件下γ-PGA-CA-CDDP复合物对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用更强。对肺癌细胞A549而言，较长时间后仍可达到相同的抑制效果，48h抑制率达75％，所制备的γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯载体安全无毒。

实施例7

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物大鼠体内药动学实验

取Wistar大鼠16只(雌雄各半)，体重为220±20g，随机分为4组，每组3只。给药前12h禁食，自由饮水。临用前用5％葡萄糖注射液稀释各样品冻干粉至适宜浓度(按CDDP计，3mg·mL^-1)，以尾静脉单剂量给药，给药剂量为10mg/kg(以CDDP计)。分别于给药后15min，30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，每只大鼠眼球采集血样约0.6mL，置1.5mL已肝素化的EP离心管中，8000r/min离心15min，取上层血浆，采用石墨炉原子分光光度法进行测定，计算大鼠血浆中铂浓度。

图5是顺铂与γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物在大鼠体内的血药浓度经时曲线，图6为顺铂和γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物的药动学参数。结果表明，游离CDDP与γ-PGA-CA-CDDP复合物在大鼠血浆中的药动学参数有显著性差异(P<0.05)。γ-PGA-CA-CDDP复合物的Cmax高于CDDP，为CDDP的3倍，AUC_0→t和AUC_0→inf均为CDDP的7倍，CL和Vss值明显低于CDDP，分别为顺铂的0.14倍和0.15倍，MRT高于顺铂。上述结果表明，γ-聚谷氨酸-柠檬酸酯与顺铂结合后能够延长顺铂在体内的滞留时间，降低了顺铂的清除率，达到了长循环的效果，明显提高了顺铂的生物利用度。

实施例8

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物在骨肉瘤S180肿瘤模型中的抗肿瘤活性

将正常SPF小鼠接种鼠源S180传代细胞以建立小鼠S180肿瘤模型，待肿瘤体积长至约为80～100mm³时，取荷瘤小鼠60只，体重约为18～22g，随机分为3组：生理盐水阴性对照组，顺铂(4mg·kg^-1)阳性对照组，γ-PGA-CA-CDDP复合物(4mg·kg^-1)组，每组15只。腹腔注射给药，给药容量为0.2mL/20g，每2天给药一次。

在试验过程中，从分组、给药开始，每2天称重一次，同时记录并观察荷瘤小鼠死亡情况，并用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，并比较各组间肿瘤生长曲线差异。

图7、图8、图9分别为荷瘤小鼠相对肿瘤体积变化、生存情况、体重变化图。结果显示，当给药剂量为4mg/kg时，γ-PGA-CA-CDDP复合物的抑瘤效果明显优于顺铂注射液组，γ-PGA-CA-CDDP复合物组中部分荷瘤鼠的肿瘤基本消失，小鼠体重有所增加，大大降低了顺铂给药的毒副作用，延长了荷瘤小鼠的平均存活时间。

Claims (10)

1.一种水溶性聚谷氨酸-顺铂复合物，其特征是以γ-聚谷氨酸衍生物为载体，主要通过配位键与顺铂结合而得的复合物，该复合物中既包含与载体相结合的顺铂，也包含部分游离顺铂。

2.如权利要求1中所述的复合物，其特征是所用由生物发酵而得的γ-聚谷氨酸或其钠盐的分子量为10～50kDa。

3.如权利要求1中所述的复合物，其特征是复合物的分子量为10～30kDa。

4.如权利要求1中所述的复合物，其特征是用于修饰γ-聚谷氨酸的小分子修饰剂为含两个以上羧基的酸，包含但不局限于柠檬酸等。

5.如权利要求1中所述的复合物为一种易溶于水的大分子顺铂复合物。

6.γ-聚谷氨酸衍生物的制备方法，该方法制备过程为：

(1)将γ-聚谷氨酸或其钠盐溶于反应溶剂中，在多肽缩合剂的作用下与小分子修饰剂进行反应，通过γ-聚谷氨酸侧链羧基或链端氨基与小分子修饰剂中游离羟基、氨基或羧基的酯化或酰胺化作用，将小分子修饰剂连接于γ-聚谷氨酸上；

(2)超滤浓缩除去小分子物质，冷冻干燥即得γ-聚谷氨酸衍生物。

7.如权利要求6中所述的γ-聚谷氨酸衍生物的制备方法，其特征是该方法中所用的反应溶剂是纯水；参与反应的多肽缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)，小分子修饰剂与γ-聚谷氨酸(-COOH/-COONa)的摩尔比为0.5:1～5:1，优选比例为1:1；反应时间为6～24h，优选反应时间为18h；反应pH为6.5～8.0，优选为7.0～7.5；γ-聚谷氨酸衍生物的纯化方法既可用透析袋透析纯化，也可采用超滤浓缩纯化，优选超滤浓缩纯化法，这样制得载体分子量范围较集中，同时可节省纯化时间，且便于冷冻干燥。

8.权利要求1中所述水溶性载药复合物的制备方法，该方法制备过程为：

(1)将γ-聚谷氨酸衍生物溶于纯水；

(2)将顺铂加入到γ-聚谷氨酸衍生物溶液中，37℃至顺铂溶解，放置室温，调节pH至7.0～7.5，搅拌反应；

(3)冷冻干燥即得水溶性顺铂复合物。

9.如权利要求8中所述载药复合物的制备方法，其特征是该方法中步骤(2)中γ-聚谷氨酸衍生物与顺铂的质量比为1:1～5:1，优选3:1；反应时间为24～72h，优选48h；该反应的pH为6.5～8.0，优选为7.0～7.5；该反应的反应温度为25℃～37℃，优选为25℃；该反应需避光。

10.如权利要求8中所述的载药复合物，其中顺铂与羧基的络合方式有两种，包括：(a)顺铂与一个羧基配位结合；(b)顺铂与两个羧基配位结合。