CN102499986A - 一种大分子-顺铂复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大分子-顺铂复合物及其制备方法与应用，本发明以聚氨基酸为原料，通过降解或纯化得到分子量合适的聚氨基酸载体，先用修饰剂小分子酸与其侧链活性基团进行反应，对其结构进行修饰，再把顺铂巧妙地连接到该聚合物上制备得载药复合物，并对该载药复合物的性质进行了研究，结果表明其性质明显优于现有报道，所制得复合物体内毒性低且无溶血性。

Description

一种大分子-顺铂复合物及其制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及一种大分子-顺铂复合物，并提供该复合物的制备方法与应用，属于抗癌药物的制备领域。

背景技术：

癌症己成为人类第二大致死病因，大量的人力、物力和财力已被投入到抗癌药物的开发上。目前世界上的抗癌药物己经超过上百种，在这些抗癌药主要有顺铂、紫杉醇、阿霉素和喜树碱等。这些用于临床治疗的大多数抗肿瘤药物对组织都具有很高的毒副作用、且溶解度低、难以给药，副作用多等缺陷，因此在临床使用上有很大的局限性。

顺铂[cis-dichlorodiammineplatinum(II)，CDDP]为重金属络合物，在临床上广泛用于多种恶性肿瘤的治疗，是治疗癌症的首选药物之一，属周期非特异性抗癌药，抗癌谱广。顺铂杀伤肿瘤细胞的作用原理是：与DNA交联连接形成相当稳定的复合物锁住DNA，造成DNA的损伤，破坏DNA的复制、转录，从而抑制DNA和RNA的合成。但因其溶解度低、无靶向性、在体内很快会和蛋白结合而失效，且铂半衰期很长，体内毒性大，尤其具有肾毒性、神经毒性、骨髓抑制和严重的胃肠道反应，因此在临床应用上仍受到很大限制。

为解决上述缺陷，有研究将其载于高分子载体上，使得顺铂可以靶向性输送到肿瘤组织(即被动靶向)，目前，国外报道的几种载体有微球体、纳米微粒、脂质体和微型胶囊等，它们均极大地提高了药物的生物利用率，有效地降低药物的毒副作用，但其仍存在稳定性差，药物无明显缓释性等缺点。

聚氨基酸是一种水溶性，生物降解，不含毒性的生物高分子。目前，聚氨基酸在医药领域中的应用较多，因其具有良好的生物亲和性和生物降解性，作为药物载体，可实现药物的缓释性、靶向性，提高药物水溶性，降低药物毒副作用，从而可以提高药物的疗效、扩大药物的使用范围。叶海峰等(Haifeng Ye，Li Jin，Rongzhang Hu，et al.Poly(γ，L-glutamic acid)-cisplatin conjugate effectively inhibitshuman breast tumor xenografted in nude mice[J].Biomaterials，2006，27(35)：5958-5965.)以γ-聚谷氨酸作为载体连接顺铂，制备得聚谷氨酸-顺铂复合物；李文娟等(李文娟，冯震，薛晓敏，等。γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及其生物活性[J]中国医药生物技术，2010，5(2)：98-104.)以γ-聚谷氨酸天冬氨酸作为载体连接顺铂，制备得γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物，两者均得到较好的结果，顺铂的水溶性和毒性得到大大改善，但前者仅以小分子γ-聚谷氨酸作为载体，制备得的复合物载药量仅为9～12％，存在载药量低、载体用量大和释放率低的缺点，后者虽然有所改进，但复合物的载药量和顺铂的有效结合率仍较低，其顺铂有效结合率仅为30％。

发明内容：

本发明的目的之一在于提供一种由聚氨基酸经小分子酸修饰后作为载体与顺铂通过离子键结合形成一种大分子-顺铂复合物，这样改善顺铂水溶性，降低其毒性的同时也增大了复合物的载药量和顺铂的有效结合率，并且改善了复合物中顺铂的释放行为。

本发明目的之二在于提供一种简单易行，安全有效的新型载体聚合物——聚氨基酸衍生物的制备方法。

本发明目的之三在于提供一种成本低廉，操作简单的大分子-顺铂复合物的制备方法。

本发明目的之四在于提供该大分子-顺铂复合物在抗肿瘤领域的应用。

因此，本发明提供一种大分子-顺铂复合物，其特征是，所述复合物由聚氨基酸用小分子修饰剂修饰得到聚氨基酸衍生物，再通过离子键与顺铂结合而得到，

其中所述的聚氨基酸包含但不局限于γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、ε-聚赖氨酸(ε-PL)、聚天冬氨酸(PASP)和聚精氨酸(PAA)，优选γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和ε-聚赖氨酸(ε-PL)，其结构通式分别为：

其中，γ-PGA与ε-PL分子量为5～60KDa。

其中所述的小分子修饰剂为含两个以上羧基的酸或该酸的酯，主要包含L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、氨基丙二酸、丙三酸等，以最常见为例，其结构式可以表示如下，但不限于此，其中n＝0、1、2、3。

γ-PGA的侧链羧基既可以用含游离羟基的酸修饰，也可以用含游离氨基的酸修饰，而ε-PL的侧链氨基因其需与游离羧基反应，因此，上述含三个以上游离羧基的修饰剂均可用来修饰ε-PL。

本发明中提供的经小分子修饰剂修饰后聚氨基酸的典型结构式表示如下，以α-羟基多酸修饰γ-PGA和多酸修饰ε-PL为例，但不限于此，其中m＝0、1、2、3。

本发明提供的大分子-顺铂复合物由修饰后的聚氨基酸衍生物与顺铂通过离子键结合而成，其中顺铂与聚氨基酸衍生物的结合方式有多种，以柠檬酸修饰后的γ-PGA与顺铂结合为例，其复合物的结构可表示如下，但不限于此。

本发明提供的聚氨基酸衍生物制备方法包括：

(1)将聚氨基酸溶于反应溶剂中，在多肽缩合剂的作用下与小分子修饰剂进行反应，通过聚氨基酸侧链羧基或氨基与小分子修饰剂中游离羟基、氨基或羧基的酯化或酰胺化作用，将小分子修饰剂连接于聚氨基酸上；

(2)透析除去小分子物质，冷冻干燥得修饰的聚氨基酸衍生物。

本发明中小分子修饰剂与聚氨基酸的反应溶剂可以是惰性有机溶剂，如DMSO，DMF或环己烷，也可以是纯水，优选纯水做反应溶剂；参与反应的多肽缩合剂可以是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，二环己基碳化二亚胺(DCC)，N，N′-羰基二咪唑(CDI)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)，1-羟基-苯并-三氮唑(HOBT)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，优选为EDCI与NHSS组合参与反应；小分子修饰剂与聚氨基酸(-COOH或-NH₂)的摩尔比为0.5∶1～5∶1，优选比例为1∶1；反应时间为6h～24h，优选反应时间为24h；反应pH为7.0～9.0，优选为7.5～8.5。

本发明提供的大分子-顺铂复合物的制备方法包括：

(1)将顺铂与硝酸银在纯水中反应，对顺铂进行充分水化；

(2)将顺铂与硝酸银的反应液离心取上清，得水化后的顺铂；

(3)将聚氨基酸衍生物溶于水化后的顺铂溶液中，调节pH至7.0～9.0，通过离子键将顺铂连于聚氨基酸衍生物上；

(4)透析除去未反应的顺铂，冷冻干燥即得复合物。

本发明中提供的顺铂水化反应，有利于顺铂与聚氨基酸衍生物的结合。该水化反应中，顺铂与硝酸银的摩尔比例为1∶2；反应时间为12～36h，优选24h；该反应需避光。

本发明中顺铂与聚氨基酸衍生物的结合方式是离子键结合，顺铂与聚氨基酸衍生物的摩尔比为1∶1～5∶1，优选为5∶1；该反应的pH为7.0～9.0，优选为7.5～8.0；该反应的反应温度为25℃～37℃，优选为25℃；该反应的反应时间为24～48h，优选为24h。

本发明中提供的载药复合物的纯化方法既可以采用透析袋透析纯化，也可以采用离心浓缩管纯化，优选离心浓缩管，这样可节省反应时间，便于冷冻干燥。

本发明还提供了大分子-顺铂复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是大分子-顺铂复合物在制备抗人类卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、前列腺癌和膀胱癌药物中的应用。

本发明提供的大分子-顺铂复合物，其优点在于：在经微生物发酵制得的γ-聚谷氨酸或ε-聚赖氨酸的基础上，通过其侧链活性羧基或氨基与小分子修饰剂中的游离羟基、氨基或羧基发生酯化或酰胺化作用，制得聚氨基酸衍生物，丰富了载体中可以与顺铂结合的有效羧基个数，减小了顺铂与载体结合的空间位阻，减少了载体的药量，增大了顺铂的有效结合率和复合物的载药量，并且改善了药物的释放行为。以柠檬酸修饰后的γ-聚谷氨酸为例，制备得到γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物，该复合物中顺铂的有效结合率达65％，并且48h时顺铂的累计释放率达到50％。

附图说明：

图1为本发明中降解制得的γ-PGA紫外扫描图，其最大特征吸收峰为215nm，与文献报道的γ-PGA在212nm处有最大吸收峰相似。

图2为本发明中降解制得的γ-PGA利用Nexus 670傅立叶红外光谱仪测定的红外扫描图。

图3为本发明中降解制得的γ-PGA利用AVANCE 500MHZ核磁共振仪测定的¹HNMR扫描图。

图4为本发明所制备的γ-PGA-CA利用AVANCE 500MHZ核磁共振仪测定的¹HNMR扫描图。

图5为γ-PGA-CDDP、γ-PGA-ASP-CDDP和γ-PGA-CA-CDDP复合物有效结合率比较图。

图6为γ-PGA-CA-CDDP复合物中CDDP的体外释放曲线图。

图7为从体重变化角度考察γ-PGA-CA-CDDP复合物在正常小鼠体内毒性实验图。

图8为从存活率角度考察γ-PGA-CA-CDDP复合物在正常小鼠体内毒性实验图。

图9为γ-PGA、γ-PGA-CA和γ-PGA-CA-CDDP的溶血性实验方法图。

图10为γ-PGA、γ-PGA-CA和γ-PGA-CA-CDDP的溶血性实验结果图。

具体实施方式：

下面结合实施例，以γ-PGA-CA-CDDP复合物为例，但不限于此，对发明进行详细说明：

实施例1

γ-聚谷氨酸的制备及结构表征

(1)降解条件

称取γ-聚谷氨酸适量，加蒸馏水溶解制得2％溶液，用浓盐酸直接调节pH至2～3，在121℃、0.1MPa条件下反应20min后，冰浴冷却，用1mol/L NaOH调节pH至7～8，终止反应，透析纯化，冷冻干燥得小分子γ-聚谷氨酸。

(2)结构表征

紫外扫描光谱分析取γ-聚谷氨酸干燥纯品适量，加蒸馏水溶解，于200～400nm范围内扫描，结果见图1。

红外图谱分析取γ-聚谷氨酸干燥纯品适量，与少量KBr研磨压片制样，室温下，于4000～500cm-1范围内扫描，分辨率2cm-1，结果见图2。

核磁共振分析取γ-聚谷氨酸干燥纯品适量，溶于D₂O中，进行核磁共振H谱(¹H NMR)检测，结果见图3。

实施例2

γ-聚谷氨酸-柠檬酸聚合物的合成及结构表征

精密称取小分子γ-聚谷氨酸129mg，加水10ml使溶解，冰浴搅拌一段时间，加EDCI 384mg，NHSS 60mg，继续冰浴搅拌一段时间，取柠檬酸210mg溶于适量蒸馏水中，调节pH至中性，缓慢滴加至上述反应液中，搅拌均匀，调节pH至7.5～8.0，室温下搅拌过夜，对去离子水透析24h，之后冷冻干燥即得聚合物。

结构表征取γ-聚谷氨酸-柠檬酸聚合物干燥纯品适量，溶于D₂O中，进行核磁共振氢谱(¹HNMR)检测，结果见图4。

实施例3

γ-聚谷氨酸柠檬酸-顺铂复合物的制备

γ-聚谷氨酸柠檬酸-顺铂复合物的制备精密称取顺铂60mg，硝酸银68mg加水100ml使溶解，室温避光反应24h，离心，取上清液经0.45μm滤膜过滤，收集滤液置于250ml三颈瓶中，加当量的上述聚合物，搅拌使溶解，调节pH至7.5～8.0，室温反应48h，对去离子水透析24h，之后冷冻干燥即得载药复合物。

实施例4

γ-聚谷氨酸柠檬酸-顺铂复合物中顺铂结合率的测定

配制1mg/ml的顺铂溶液作为母液，以该母液分别配制浓度为3、6、9、12、15、18ug/ml的标准液，取各浓度下的标液各0.25ml溶于2.25ml双蒸水中，与2.5ml邻苯二胺(OPDA)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液(1.2mg/ml)混合，经沸水浴反应10分钟后，立即在705nm处测其紫外吸收值，复合物中顺铂的量由标准工作曲线法标定，顺铂的有效结合率结果见图5。

结合率＝(结合上的顺铂质量/投入反应的顺铂总质量)*100％

图5比较了γ-PGA-CDDP、γ-PGA-ASP-CDDP和γ-PGA-CA-CDDP复合物中顺铂的有效结合率，即如果显示γ-PGA-CA-CDDP复合物中顺铂的结合率远远高于另外两种复合物，顺铂的利用率高，复合物成本较低。

实施例5

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物体外释放研究

将γ-聚谷氨酸柠檬酸-顺铂复合物溶液(顺铂浓度为1mg/ml)放入透析袋中，加5倍量的PBS缓冲液(pH7.4)混合，于37℃恒温振荡箱中放置。分别于不同时间段(1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，24，36，48，60，72，84h)取1ml样品保存备用，同时再加入1ml新PBS溶液，用HPLC检测其中释放出来的游离顺铂的量，并计算其累计释放率，结果见图6。

色谱条件：流动相：纯水；流速：0.65ml/min；检测波长：210nm；进样量：20μl；色谱柱型号：C-185μ(250×4.6mm)。

图6表示的是γ-PGA-CA-CDDP复合物于PBS缓冲液中CDDP的体外释放行为。结果显示：顺铂于前8h存在突释现象，之后释放较平缓，48h的累积释放率已达50％左右，

实施例6

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物在正常小鼠体内的毒性实验

将正常小鼠按体重分为9组：PBS对照组、游离CDDP组*4个剂量及γ-PGA-CA-CDDP复合物组*4个剂量，每组5只。腹腔注射，单次给药，剂距为0.6，游离CDDP组及γ-PGA-CA-CDDP复合物组各组的注射剂量分别为6.48mg/kg、10.8mg/kg、18mg/kg、30mg/kg(以CDDP计量)，每只小鼠的给药体积为0.5ml，每天记录小鼠的存活和体重变化情况，结果见图7和图8。

图7是从体重变化角度考察γ-PGA-CA-CDDP复合物在正常小鼠体内的毒性。结果显示：同等剂量下的复合物组小鼠体重基本呈上升趋势，类似于PBS对照组，而顺铂组的小鼠则均出现体重下降，并有死亡现象。图8是从存活率角度考察γ-PGA-CA-CDDP复合物在正常小鼠体内的毒性，结果显示：观察期内，复合物组和PBS对照组均未出现死亡情况，而顺铂组中10.8mg/kg组第九天死亡一只；18.0mg/kg组第四天死亡两只，第五天死亡一只；30.0mg/kg组第三天全部死亡。结果表明，γ-PGA-CA-CDDP复合物对小鼠的毒性较低。

实施例7

γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂复合物溶血性实验

(1)2％红细胞混悬液的制备

取健康家兔血液，放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，以除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％氯化钠溶液约10倍量，摇匀，每分钟1000～1500转离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不再显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液制成2％的混悬液，供试验用。

(2)实验方法

取洁净试管8只，进行编号，1-5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管，8号管为供试品对照管。按图9所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液、蒸馏水和供试品溶液，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。3小时后，从恒温箱中取出，离心取上清于541nm处测定各上清液的吸光值，并计算溶血率。取γ-聚谷氨酸、γ-聚谷氨酸-柠檬酸和γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂分别为供试品，进行平行操作，结果见图10。

图10分别比较了γ-聚谷氨酸、γ-聚谷氨酸-柠檬酸和γ-聚谷氨酸-柠檬酸-顺铂三种物质的溶血性，结果显示，这三种物质均无溶血性。

Claims (10)

1.一种大分子-顺铂复合物，其特征是，所述复合物由聚氨基酸用小分子修饰剂修饰得到聚氨基酸衍生物，再通过离子键与顺铂结合而得到，其中聚氨基酸包含但不局限于γ-聚谷氨酸、ε-聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚精氨酸，其中小分子修饰剂为含两个以上羧基的酸或该酸的酯，包含L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、氨基丙二酸、丙三酸；所述复合物的分子量为40～70KDa。

2.如权利要求1中所述的复合物，其特征是顺铂与修饰后的聚氨基酸有多种结合方式，可以是成环结合，也可以是开环结合，其结合主要是通过顺铂中的氯离子与聚氨基酸衍生物的活性羧基反应来实现的。

3.如权利要求1中所述的复合物，其特征是选自以下复合物：

γ-聚谷氨酸柠檬酸-顺铂复合物；

γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物；

γ-聚谷氨酸氨基丙二酸顺铂复合物；

ε-聚赖氨酸柠檬酸顺铂复合物；

ε-聚赖氨酸丙三酸顺铂复合物；

聚天冬氨酸柠檬酸-顺铂复合物；

聚天冬氨酸谷氨酸顺铂复合物；

聚天冬氨酸氨基丙二酸顺铂复合物；

聚精氨酸柠檬酸顺铂复合物；

聚精氨酸丙三酸顺铂复合物。

4.权利要求1的复合物的制备方法，其特征是其中聚氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：

(1)将聚氨基酸溶于反应溶剂中，在多肽缩合剂的作用下与小分子修饰剂进行反应，通过聚氨基酸侧链羧基或氨基与小分子修饰剂中游离羟基、氨基或羧基的酯化或酰胺化作用，将小分子修饰剂连接于聚氨基酸上；

(2)透析除去小分子物质，冷冻干燥得聚氨基酸衍生物。

5.如权利要求4中所述的制备方法，其特征是步骤(1)的反应溶剂可以是惰性有机溶剂，如DMSO，DMF或环己烷，也可以是纯水，优选纯水做反应溶剂；参与反应的多肽缩合剂可以是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，二环己基碳化二亚胺(DCC)，N，N′-羰基二咪唑(CDI)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)，1-羟基-苯并-三氮唑(HOBT)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，优选为EDCI与NHSS组合参与反应；小分子修饰剂与聚氨基酸(-COOH或-NH2)的摩尔比为0.5∶1～5∶1，优选比例为1∶1；反应时间为6h～24h，优选反应时间为24h；反应pH为7.0～9.0，优选为7.5～8.5。

6.权利要求1中所述复合物的制备方法，该方法包括：

(1)将顺铂与硝酸银在纯水中反应，对顺铂进行充分水化；

(2)将顺铂与硝酸银的反应液离心取上清，得水化后的顺铂；

(3)将聚氨基酸衍生物溶于水化后的顺铂溶液中，调节pH至7.0～9.0，通过离子键将顺铂连于聚氨基酸衍生物上；

(4)透析除去未反应的顺铂，冷冻干燥即得。

7.如权利要求6中所述复合物的制备方法，其特征是该方法中步骤(1)提供的顺铂水化反应，顺铂与硝酸银的摩尔比例为1∶2；反应时间为12～36h，优选24h；该反应需避光。

8.如权利要求6中所述复合物的制备方法，其特征是所述步骤(3)中顺铂与聚氨基酸衍生物的结合方式是离子键结合，顺铂与载体聚合物的摩尔比为1∶1～5∶1，优选为5∶1；该反应的pH为7.0～9.0，优选为7.5～8.0；该反应的反应温度为25℃～37℃，优选为25℃；该反应的反应时间为24～48h，优选为24h。

9.如权利要求6中所述复合物的制备方法，其特征是所述步骤(4)中提供的复合物的纯化方法既可以采用透析袋透析纯化，也可以采用离心浓缩管纯化。

10.权利要求1中所述的复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

Images