KR101580251B1

KR101580251B1 - Tpp-pcl-tpp 고분자 및 상기 고분자를 이용한 미토콘드리아 표적 나노약물전달용 조성물

Info

Publication number: KR101580251B1
Application number: KR1020150052405A
Authority: KR
Inventors: 강한창; 이돈행; 허강무; 조동율; 지연희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 재단법인 유타 인하 디디에스 및 신의료기술개발 공동연구소
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2015-12-29

Abstract

본 발명은 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-TPP (TPCL) 고분자 및 상기 고분자를 이용한 미토콘드리아 표적 나노약물전달용 조성물에 관한 것으로서, 아령 모양의 합성된 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자는 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하였고, 자체로 암세포를 죽일 수 있는 항암약물의 역할을 할 수 있으며 또한 다양한 약물을 세포 내로 전달할 수 있는 전달체로의 역할도 할 수 있다.

Description

TPP-PCL-TPP 고분자 및 상기 고분자를 이용한 미토콘드리아 표적 나노약물전달용 조성물{TPP-PCL-TPP polymer and nano-drug delivery composition for targeting mitochondria using the same}

본 발명은 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-TPP (TPCL) 고분자 및 상기 고분자를 이용한 미토콘드리아 표적 나노약물전달용 조성물에 관한 것이다.

약물을 기관, 조직, 세포, 세포소기관과 같은 표적지에 효과적으로 더 많이 축적시키고, 반면 원하지 않는 비표적지에는 덜 가도록 하여 약효 증대와 부작용 감소를 얻을 수 있는 표적약물전달체의 개발은 지속적으로 성장하고 있다. 대부분의 표적약물전달체는 세포표적 전달체로 특정 세포의 세포막에 특이적으로 발현된 수용체나 항원 등을 인지 할 수 있는 리간드 또는 항체를 이용하고 있다. 그러나, 실제 약물의 작용기관은 세포 수준보다 세포내 소기관 수준이므로 세포질, 핵, 미토콘드리아 등의 세포내 소기관을 표적하여야만 표적약물전달체의 약효 증대와 부작용 감소의 가치를 극대화시킬 수 있다.

세포소기관 중 미토콘드리아는 신호전달, 세포분화, 세포자살, 세포성장, Ca²⁺의 농도조절, 활성산소종, ATP 생성 등과 같은 다양한 생리적인 기능의 항상성을 조절하는데 미토콘드리아가 이 기능들을 적절하게 수행하지 못하게 되면 퇴행성 뇌질환, 심장질환, 대사질환 등의 다양한 질병을 유발하게 된다. 미토콘드리아를 표적할 수 있는 기능을 포함하고 있는 물질로는 미토콘드리아-표적시그널 (mitochondria-targeting signal, MTS)과 친유성 양이온 (lipophilic cation)이 알려져 있다. 대부분의 MTS는 긴 아미노산 배열을 갖는 펩타이드로 그 예로는 다음과 같은 MLSCTSPLLRGACHNMGAAKALRLRWTVPPAVLIALGSGALYTTSGQTLYYKNSVQQTD, MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQ, MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ, MSATRMQLLSPRNVRLLSRGRSELFAGGSGGGPRVRSLISPPLSSSSPGRALSSVSATRRGLPKEKMTENGVSSRAKVLTIDT 등이 있으며, 미토콘드리아의 TOM/TIM complex를 이용해 미토콘드리아 내로 들어갈 수 있다. 이런 MTS 펩타이드를 이용해 포스포리파제 A 올소로그(phospholipase A ortholog; AoPlaA), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase), 종양 억제자 p53(tumor suppressor p53), 디하이드로포레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase) 등과 같은 다양한 치료 단백질을 전달할 수 있다. 또한 (사이클로헥실 알라닌-아르기닌)_n[(cyclohexyl alanine-arginine)_n](n=3-6)을 이용해 독소루비신과 같은 화학 항암제를 미토콘드리아로 표적시키기도 하였다. 그러나 일반적으로 펩타이드는 비싸고 면역반응을 유발시킬 수 있는 단점을 갖는다.

Na⁺와 같은 친수성 양이온은 물리적 방법 또는 화학적 방법의 도움 없이 미토콘드리아 막을 통과할 수 없다. 그러나, 친수성 양이온에 비해 상대적으로 소수성을 띠면서 양이온을 갖는 데쿠알리늄(dequalinium; DQA) 또는 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)은 미토콘드리아 막을 통과하여 미토콘드리아 내로 들어 갈 수 있다. 친수성과 소수성을 동시에 가지는 DQA는 아령구조를 가지고 있고 수상에서 자기조립 특성에 의해 70-700nm 정도의 크기의 입자를 형성한다. 이와 같은 DQA는 유전자 약물과 화학약물을 전달하는 능력을 가지고 있다. 미토콘드리아 표적기인 TPP 또한 비타민, Coenzyme Q10과 같은 다양한 화학약물과 화학적으로 결합하여 표적약물전달체로 개발되고 있다.

미국등록특허 제8598145호(2013.12.03)

본 발명의 목적은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)이 공유결합된 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 TPCL 고분자가 수상에서 자기조립된 TPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 및 나노약물전달용 조성물을 제공하는데 있다.

이에, 상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)이 공유결합된, 화학식 1로 표시되는 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자를 제공한다.

<화학식 1>

n은 3 내지 50임.

또한, 본 발명은 상기 TPCL 고분자가 수상에서 자기조립된 TPCL 나노입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 TPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 TPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공한다.

도 1은 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자의 합성과정을 나타낸다.
도 2는 TPCL 고분자의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 TPCL 고분자의 UV/Visible 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 HeLa 세포에 대한 TPCL 나노입자의 항암특성 평가결과를 나타낸다.
도 5는 HepG2 세포에 대한 TPCL 나노입자의 항암특성 평가결과를 나타낸다.
도 6은 HeLa 세포를 이용한 Dox·HCl-TPCL 나노입자 항암특성 평가결과를 나타낸다.
도 7은 HeLa 세포를 이용한 Dox-TPCL 나노입자 항암특성 평가결과를 나타낸다.
도 8은 HepG2 세포를 이용한 Dox·HCl-TPCL 나노입자 항암특성 평가결과를 나타낸다.
도 9은 HepG2 세포를 이용한 Dox-TPCL 나노입자 항암특성 평가결과를 나타낸다.
도 10은 HeLa 세포, 핵 및 미토콘드리아 내로 유입된 약물봉입 TPCL 나노입자의 약물 형광세기를 나타낸다.
도 11은 HepG2 세포, 핵 및 미토콘드리아 내로 유입된 약물봉입 TPCL 나노입자의 약물 형광세기를 나타낸다.
도 12는 HeLa 세포 및 HepG2 세포에서 약물봉입 TPCL 나노입자가 나타내는 핵유입 대비 미토콘드리아유입 비를 이용한 미토콘드리아 선호도를 나타낸다.
도 13은 TPCL1/pDNA 나노복합체의 입자크기와 제타전위를 나타낸다.
도 14는 HepG2 세포를 이용한 TPCL1/pDNA 나노복합체의 유전자 발현효율 평가결과를 나타낸다.
도 15는 MCF7 세포를 이용한 TPCL1/pDNA 나노복합체의 유전자 발현효율 평가결과를 나타낸다.
도 16은 A549-GFP 세포를 이용한 TPCL1/siGFP 나노복합체의 유전자 간섭효율 평가결과를 나타낸다.

본 발명자들은 생체적합성과 생분해성 갖는다고 알려진 소수성 고분자인 폴리(입실론-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone), PCL)의 양 말단에 미토콘드리아 표적기인 TPP를 화학적으로 결합시켜 아령모양의 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자를 만들었다. 합성된 TPCL은 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하였고, 자체로 암세포를 죽일 수 있는 항암약물의 역할을 할 수 있으며 또한 다양한 약물을 세포 내로 전달할 수 있는 전달체로의 역할도 할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)이 공유결합된, 화학식 1로 표시되는 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자를 제공한다.

<화학식 1>

n은 3 내지 50임.

상기 TPCL 나노입자는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

1) TPCL 고분자를 클로로포름에 녹인 후, 이 용액을 회전증발농축기(rotary evaporator)를 이용해 용매를 제거하여 박막을 제조한다. 이 박막에 정제수를 첨가하여 섭씨 60도에서 초음파분산기(sonicator)로 1시간 동안 초음파처리를 한 후, 이 분산액을 100 nm 공극을 갖는 막이 장착된 압출기(extruder)에 넣어 생성된 나노입자의 크기를 균일화 한다. 본 발명에서는, 상기 박막수화법(film hydration, FH)으로 만들어진 나노입자를 TPCL1-FH 나노입자와 TPCL2-FH 나노입자로 명명했다.

2) TPCL 고분자를 DMSO에 녹여 30분간 교반한 후, 정제수를 첨가하고 10분간 더 교반한다. 이 분산액에 포함되어 있는 DMSO를 초여과방법(ultrafiltration)을 통해 제거하고 TPCL 나노입자를 얻었다. 본 발명에서는, 상기 공용매 분산법(co-solvent dispersion, CD)을 통해 만들어진 나노입자를 TPCL1-CD 나노입자와 TPCL2-CD 나노입자로 명명했다.

또한, 본 발명은 TPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 암은 간암 또는 자궁경부암이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 TPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 조성물은 미토콘드리아를 표적으로 할 수 있다.

바람직하게는, 상기 약물은 항암제 또는 유전자 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신일 수 있고, 상기 유전자 약물은 플라스미드 DNA(plasmid DNA; pDNA) 또는 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 TPCL 자기조립 나노입자는 수상에서 자체적으로 항암나노약물로 응용가능하고, 수용성 화학약물 및 수불용성 화학약물을 담지할 수 있어 나노약물전달체로 응용가능하다. 친수성 항암제인 독소루비신 염화염 (doxorubicin HCl)을 봉입한 TPP-PCL-TPP(TPCL) 나노입자는 독소루비신 염화염보다 암세포 실험에서 약 10~20배 우수한 항암효과 (in vitro anti-tumor effect)을 나타냈으며, 봉입된 항암제를 단독 투여한 독소루비신 염화염 (doxorubicin HCl)에 비해 미토콘드리아에 더 많이 표적 축적되었다. 한편, TPP-PCL-TPP(TPCL) 나노입자의 양전하성 특징은 음전하성 유전자 약물인 plasmid DNA 또는 siRNA와 나노복합체를 형성하여 유전자 나노약물전달체로 응용가능하고, 유전자 전달효율이 높다고 알려진 분자량 25000 달톤을 가진 bPEI (branched polyethyleneimine) 기반의 유전자 나노약물체와 비교시, TPP-PCL-TPP(TPCL) 나노입자를 이용한 luciferase pDNA를 전달한 TPCL1/pDNA 나노약물전달체는 간암세포 (HepG2)와 유방암 세포 (MCF7)에서 비슷한 유전자 발현효율을 나타냈고, 녹색형광단백질 (green fluorescent protein, GFP)이 발현된 폐암세포(A549-GFP)에 GFP siRNA를 전달한 TPCL1/siRNA 나노약물전달체는 2배 이상 우수한 유전자 간섭효율을 나타냈다.

본 발명에 따른 항암용 조성물 또는 약물 전달용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항암용 조성물 또는 약물 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 고분자 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 “약물”은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, (1) 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, (2) 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, (3) 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> TPP - PCL - TPP ( TPCL ) 고분자의 합성 및 분석

도 1에 나타낸 바와 같이, TPCL 고분자는 폴리(입실론-카프로락톤) (PCL)의 양 말단에 있는 수산화기(OH)와 미토콘드리아 표적기인 TPP를 포함하는 4-카르복시부틸트리페닐포스포늄 브로마이드(4-Carboxybutyltriphenylphosphonium bromide; carboxybutyl TPP·Br)의 카르복실기(COOH)를 화학적으로 결합시켜 얻었다. 예로, 분자량 1250 달톤 또는 2000 달톤인 폴리카플로락톤디올(PCL-diol) 0.2g을 2mL의 클로로포름(chloroform)에 녹이고, PCL-diol의 수산화기 몰 수의 3배에 해당하는 carboxybutyl TPP·Br, 4-(디메틸아미노)피리딘[4-(dimethylamino)pyridine; DMAP], 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC]를 따로 미량의 트리에틸아민(triethylamine, TEA)과 함께 8mL의 클로로포름에 녹인다. carboxybutyl TPP·Br를 포함하는 용액을 2시간 동안 교반해 카르복실기를 활성화시키고, 이 용액에 미리 준비된 PCL-diol 용액을 첨가하여 추가적으로 48시간 더 교반시킨다. 분자량 1.25kDa인 PCL(PCL₁ _.25 _kDa)을 포함하는 고분자 반응용액은 에테르(ether)에 침전시키고, 분자량 2kDa인 PCL(PCL_2kDa)을 포함하는 고분자 반응용액은 노르말 헥산(n-hexane)에 침전시켰다. 침전된 물질을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 같은 부피의 정제수를 첨가하여 투석을 통해 고분자를 정제하였고, 얻어진 고분자용액을 동결건조하여 TPP-PCL_1.25kDa-TPP(TPCL1) 고분자와 TPP-PCL_2kDa-TPP(TPCL2) 고분자를 얻었다. 얻어진 고분자는 도 2의 ¹H-NMR 분광 스펙트럼과 도 3의 UV-visible 분광 스펙트럼을 통해 TPCL1은 PCL 1몰당 TPP가 1.75몰, TPCL2는 PCL 1몰당 TPP가 2몰 붙어 있다고 확인되었다.

< 실시예 2> TPCL 나노입자의 제조, 물리화학적 특성 및 항암 효과

1mg의 TPCL 고분자를 1mL의 클로로포름에 녹인 후, 이 용액을 회전증발농축기(rotary evaporator)를 이용해 용매를 제거하여 박막을 제조한다. 이 박막에 2mL의 정제수를 첨가하여 섭씨 60도에서 초음파분산기(sonicator)로 1시간 동안 초음파처리를 한 후, 이 분산액을 100 nm 공극을 갖는 막이 장착된 압출기(extruder)에 넣어 생성된 나노입자의 크기를 균일화 한다. 이 박막수화법(film hydration, FH)으로 만들어진 나노입자를 TPCL1-FH 나노입자와 TPCL2-FH 나노입자로 명명했다. 제조된 TPCL1-FH 나노입자는 약 23 ± 23nm의 크기와 37 ± 17mV의 제타전위를 가졌고, TPCL2-FH 나노입자는 약 52 ± 32nm의 크기와 41 ± 17mV의 제타전위를 가졌다.

5mg의 TPCL 고분자를 0.25mL의 DMSO에 녹여 30분간 교반한 후, 7.5mL의 정제수를 첨가하고 10분간 더 교반한다. 이 분산액에 포함되어 있는 DMSO를 초여과방법(ultrafiltration)을 통해 제거하고 TPCL 나노입자를 얻었다. 이와 같은 공용매 분산법(co-solvent dispersion, CD)을 통해 만들어진 나노입자를 TPCL1-CD 나노입자와 TPCL2-CD 나노입자로 명명했다. 제조된 TPCL1-CD 나노입자는 약 3.6 ± 3.9nm의 크기와 45 ± 13mV의 제타전위를 가졌고, TPCL2-CD 나노입자는 약 4.7 ± 4.9nm의 크기와 41 ± 10mV의 제타전위를 가졌다.

박막수화법과 공용매 분산법으로 각각 준비된 TPCL-FH 나노입자와 TPCL-CD 나노입자의 항암효과는 5000개의 자궁경부암세포(HeLa) 또는 간암세포(HepG2)를 96-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, 암세포를 다양한 농도의 TPCL 나노입자에 48시간 동안 노출시켜 암세포의 생존능(cell viability)을 MTT 방법을 이용하여 평가했다. 또한, 나노입자의 항암효과를 TPP 유도체인 methoxymethyl TPP·Cl 및 carboxybutyl TPP·Br과 비교하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, HeLa 세포에서는 50% 생존능을 보이는 농도인 IC50가 실험이 진행된 농도범위 내에서 carboxybutyl TPP·Br에서는 관찰되지 않았지만 methoxymethyl TPP·Cl은 약 0.22 mg/mL에서 나타났다. TPCL1-FH 나노입자와 TPCL2-FH 나노입자의 IC50는 각각 30μg/mL과 12μg/mL, TPCL1-CD 나노입자와 TPCL2-CD 나노입자의 IC50는 각각 42μg/mL과 24μg/mL로 관찰되었고, 이들의 항암효과는 methoxymethyl TPP·Cl의 항암효과에 비해 각각 7.3배, 18.3배, 5.2배, 9.2배 더 우수했다. 도 5의 HepG2 세포에 대한 TPCL 나노입자의 항암효과 평가에서는 carboxybutyl TPP·Br의 IC50는 평가된 농도 범위 내에서 관찰되지 않았고, methoxymethyl TPP·Cl의 IC50는 약 0.19 mg/mL이었다. TPCL1-FH 나노입자와 TPCL2-FH 나노입자의 IC50는 각각 51μg/mL과 13μg/mL, TPCL1-CD 나노입자와 TPCL2-CD 나노입자의 IC50는 각각 58μg/mL과 39μg/mL로 관찰되었고, 이들의 항암효과는 methoxymethyl TPP·Cl의 항암효과에 비해 각각 3.7배, 14.6배, 3.3배, 4.9배 더 우수했다.

< 실시예 3> 독소루비신 염화염(Dox·HCl)이 봉입된 TPCL 나노입자의 제조 및 물리화학적 특성

박막수화법(FH)과 공용매 분산법(CD)을 이용해 각각 TPCL-FH 나노입자와 TPCL-CD 나노입자를 제조한 후, 독소루비신 염화염(Dox·HCl)을 황산암모늄(ammonium sulfate) 농도 차이를 이용해 TPCL 나노입자 내부에 봉입시켰다.

TPCL-FH 나노입자에 약물봉입을 하는 경우, 4mg의 TPCL 고분자를 1mL의 클로로포름에 녹인 후, 이 용액을 회전증발농축기(rotary evaporator)를 이용해 용매를 제거하여 박막을 제조한다. 이 박막에 8mL의 200 mM 황산암모늄(ammonium sulfate) 수용액을 첨가하여 섭씨 60도에서 초음파분산기(sonicator)로 3시간 동안 초음파처리를 한 후, 이 분산액을 100 nm 공극을 갖는 막이 장착된 압출기(extruder)에 넣어 생성된 나노입자의 크기를 균일화한다. 만들어진 나노입자 수용액을 12시간동안 투석하여 나노입자의 외상에 존재하는 황산암모늄(ammonium sulfate)을 제거한다. TPCL-FH 나노입자 분산액에 5mg/mL의 Dox·HCl을 0.2mL 넣고 섭씨 60도에서 12시간동안 교반시키면서 Dox·HCl이 나노입자 내부에 봉입되도록 한다. 봉입되지 않은 약물은 투석을 통해 제거한 후, Dox·HCl-TPCL1-FH 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-FH 나노입자를 얻었다. 제조된 Dox·HCl-TPCL1-FH 나노입자는 약 18 ± 10nm의 크기와 21 ± 3mV의 제타전위를 가졌고, Dox·HCl-TPCL2-FH 나노입자는 약 43 ± 26nm의 크기와 19 ± 2mV의 제타전위를 가졌다. 또한, 약물의 목표 무게함량을 20wt%으로 해서 Dox·HCl을 TPCL-FH 나노입자 내부에 봉입했을 때, Dox·HCl-TPCL1-FH 나노입자의 실제 무게함량은 4.9 ± 3wt%, 약물 봉입효율은 20 ± 11%이었고, Dox·HCl-TPCL2-FH 나노입자의 실제 무게함량은 3.8 ± 1.4wt%, 약물 봉입효율은 16 ± 6%이었다.

TPCL-CD 나노입자에 약물봉입을 하는 경우, 4mg의 TPCL 고분자를 0.2mL의 DMSO에 녹여 30분간 교반하고, 7.5mL의 200 mM 황산암모늄(ammonium sulfate) 수용액을 추가한 후, 12시간동안 더 교반한다. 투석을 이용해 TPCL-CD 나노입자로부터 DMSO와 외상에 존재하는 황산암모늄(ammonium sulfate)을 제거한다. TPCL-CD 나노입자 분산액에 5mg/mL의 Dox·HCl을 0.2mL 넣고 섭씨 60도에서 12시간동안 교반시키면서 Dox·HCl이 나노입자 내부에 봉입되도록 한다. 봉입되지 않은 약물은 투석을 통해 제거한 후, Dox·HCl-TPCL1-CD 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-CD 나노입자를 얻었다. 제조된 Dox·HCl-TPCL1-CD 나노입자는 약 61 ± 17nm의 크기와 26 ± 2mV의 제타전위를 가졌고, Dox·HCl-TPCL2-CD 나노입자는 약 31 ± 23nm의 크기와 29 ± 10mV의 제타전위를 가졌다. 또한, 약물의 목표 무게함량을 20wt%으로 해서 Dox·HCl을 TPCL-CD 나노입자 내부에 봉입했을 때, Dox·HCl-TPCL1-CD 나노입자의 실제 무게함량은 3.5 ± 0.6wt%, 약물 봉입효율은 15 ± 3%이었고, Dox·HCl-TPCL2-CD 나노입자의 실제 무게함량은 4.5 ± 3wt%, 약물 봉입효율은 19 ± 11%이었다.

< 실시예 4> 독소루비신( Dox )이 봉입된 TPCL 나노입자의 제조 및 물리화학적 특성

독소루비신 염화염(doxorubicin hydrochloride, Dox·HCl)을 DMSO에 녹인 후, 트리에틸아민(triethylamine, TEA)을 Dox·HCl의 몰 수의 2배만큼 넣고 12시간 이상 교반하여, 염화수소가 제거된 독소루비신(doxorubicin, Dox)을 준비한다. DMSO에 녹여진 독소루비신(Dox)을 TPCL 용매에 첨가한 후, 박막수화법(FH)과 공용매 분산법(CD)을 이용해 제조되는 TPCL 나노입자 내부에 봉입시켰다.

TPCL-FH 나노입자에 약물봉입을 하는 경우, 4mg의 TPCL 고분자를 1mL의 클로로포름에 녹인 TPCL 고분자 용액에 20mg/mL 농도로 준비된 독소루비신(doxorubicin, Dox)의 0.05mL을 첨가한다. 이 고분자-약물 용액을 회전증발농축기(rotary evaporator)를 이용해 용매를 제거하여 박막을 제조한다. 이 박막에 10mL의 정제수을 첨가하여 섭씨 60도에서 초음파분산기(sonicator)로 3시간 동안 초음파처리를 한 후, 이 분산액을 0.45μm 공극을 갖는 주사기용 필터를 이용해 큰 입자를 제거했다. 봉입되지 않은 약물은 투석을 통해 제거한 후, Dox-TPCL1-FH 나노입자와 Dox-TPCL2-FH 나노입자를 얻었다. 제조된 Dox-TPCL1-FH 나노입자는 약 76 ± 61nm의 크기와 41 ± 8mV의 제타전위를 가졌고, Dox-TPCL2-FH 나노입자는 약 45 ± 12nm의 크기와 35 ± 13mV의 제타전위를 가졌다. 또한, 약물의 목표 무게함량을 20wt%으로 해서 Dox를 TPCL-FH 나노입자 내부에 봉입했을 때, Dox-TPCL1-FH 나노입자의 실제 무게함량은 1.8 ± 1wt%, 약물 봉입효율은 7.6 ± 5%이었고, Dox-TPCL2-FH 나노입자의 실제 무게함량은 3.6 ± 1wt%, 약물 봉입효율은 15 ± 4%이었다.

TPCL-CD 나노입자에 약물봉입을 하는 경우, 4mg의 TPCL 고분자를 0.2mL의 DMSO에 녹여 30분간 교반하고, 20mg/mL 농도로 준비된 독소루비신(doxorubicin, Dox)의 0.05mL 넣고 4시간동안 더 교반한다. 7.5mL의 정제수를 추가하고 10분간 더 교반한 후, 분산액을 초여과방법(ultrafiltration)을 통해서 DMSO와 나노입자에 봉입되지 않은 Dox를 제거하고 Dox-TPCL1-CD 나노입자와 Dox-TPCL2-CD 나노입자를 얻었다. 제조된 Dox-TPCL1-CD 나노입자는 약 23 ± 12nm의 크기와 51 ± 13mV의 제타전위를 가졌고, Dox-TPCL2-CD 나노입자는 약 7 ± 7nm의 크기와 71 ± 17mV의 제타전위를 가졌다. 또한, 약물의 목표 무게함량을 20wt%으로 해서 Dox을 TPCL-FH 나노입자 내부에 봉입했을 때, Dox-TPCL1-CD 나노입자의 실제 무게함량은 9.5 ± 0.3wt%, 약물 봉입효율은 42 ± 1%이었고, Dox-TPCL2-CD 나노입자의 실제 무게함량은 8.9 ± 0.8wt%, 약물 봉입효율은 39 ± 4%이었다.

< 실시예 5> 약물이 봉입된 TPCL 나노입자의 항암 효과

<실시예 3> 및 <실시예 4>로부터 준비된 Dox·HCl 또는 Dox가 봉입된 TPCL 나노입자의 항암효과는 5000개의 자궁경부암세포(HeLa) 또는 간암세포(HepG2)를 96-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, 암세포를 Dox·HCl 또는 Dox가 봉입된 TPCL 나노입자에 48시간동안 노출시켜 다양한 약물농도에서 암세포의 생존능(cell viability)을 MTT방법을 이용하여 평가했다. 또한, Dox·HCl 또는 Dox가 봉입된 TPCL 나노입자의 항암효과를 Dox·HCl 또는 Dox의 항암효과와 비교하였다.

도 6의 결과에서 보이는 바와 같이, HeLa 세포에 대한 Dox·HCl의 IC50는 약 1.3μg/mL이었다. Dox·HCl이 봉입된 나노입자의 경우, Dox·HCl-TPCL1-FH 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-FH 나노입자의 IC50가 0.07μg/mL 미만이었고, Dox·HCl-TPCL1-CD 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-CD 나노입자의 IC50는 각각 0.3μg/mL와 0.1μg/mL이었다. 이 결과는 Dox·HCl-TPCL1-FH 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-FH 나노입자는 Dox·HCl보다 약 18.6배 더 우수한 항암효과를 보이는 것을 의미하고, Dox·HCl-TPCL1-CD 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-CD 나노입자는 Dox·HCl보다 각각 4.3배, 13배 더 우수한 항암효과를 보인다. 또한, 도 7에 의하면, HeLa 세포에 대한 Dox의 IC50는 약 4.4μg/mL이었다. Dox가 봉입된 나노입자의 경우, Dox-TPCL1-FH 나노입자와 Dox-TPCL2-FH 나노입자의 IC50가 각각 3.2μg/mL와 0.6μg/mL이었고, Dox-TPCL1-CD 나노입자와 Dox-TPCL2-CD 나노입자의 IC50는 각각 1.4μg/mL와 1.0μg/mL이었다. Dox-TPCL1-FH 나노입자의 항암효과는 Dox와 유사했고, Dox-TPCL2-FH 나노입자의 항암효과는 Dox보다 약 7.3배 더 우수했다. Dox-TPCL1-CD 나노입자와 Dox-TPCL2-CD 나노입자는 Dox보다 각각 3.1배, 4.4배 우수한 항암효과를 나타냈다.

HepG2세포에 대한 도 8의 결과는 Dox·HCl의 IC50는 약 0.6μg/mL이었다. Dox·HCl이 봉입된 나노입자의 경우, Dox·HCl-TPCL1-FH 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-FH 나노입자의 IC50가 각각 0.08μg/mL, 0.08μg/mL이었고, Dox·HCl-TPCL1-CD 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-CD 나노입자의 IC50는 각각 0.6μg/mL와 0.3μg/mL이었다. 이 결과는 Dox·HCl-TPCL1-FH 나노입자와 Dox·HCl-TPCL2-FH 나노입자는 Dox·HCl보다 약 7.5배 더 우수한 항암효과를 보이는 것을 의미하고, Dox·HCl-TPCL1-CD 나노입자의 항암효과는 Dox·HCl과 유사했고, Dox·HCl-TPCL2-CD 나노입자의 항암효과는 Dox·HCl보다 약 2배 더 우수했다. 또한, 도 9의 결과와 같이 Dox의 IC50는 약 2.3μg/mL이었다. Dox가 봉입된 나노입자의 경우, Dox-TPCL1-FH 나노입자와 Dox-TPCL2-FH 나노입자의 IC50가 각각 3.2μg/mL와 1.1μg/mL이었고, Dox-TPCL1-CD 나노입자와 Dox-TPCL2-CD 나노입자의 IC50는 각각 1.7μg/mL와 0.9μg/mL이었다. 이는 Dox-TPCL1-FH 나노입자의 항암효과는 Dox보다 약 1.4배 낮고, Dox-TPCL2-FH 나노입자의 항암효과는 Dox보다 약 2.1배 더 우수했다. Dox-TPCL1-CD 나노입자와 Dox-TPCL2-CD 나노입자는 Dox보다 각각 1.4배, 2.6배 우수한 항암효과를 나타냈다.

< 실시예 6> 약물이 봉입된 TPCL 나노입자의 세포 소기관 표적능

<실시예 3> 및 <실시예 4>로부터 준비된 Dox·HCl 또는 Dox가 봉입된 TPCL 나노입자의 세포유입(cellular uptake), 핵유입(nuclear uptake), 미토콘드리아유입(mitochondrial uptake)을 봉입되지 않은 약물 자체 Dox·HCl 또는 Dox의 세포유입, 핵유입, 미토콘드리아유입과 비교했다. 세포유입 실험을 위해 500,000개의 자궁경부암세포(HeLa) 또는 간암세포(HepG2)를 6-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, 암세포를 Dox·HCl 또는 Dox가 봉입된 TPCL 나노입자에 4시간 동안 노출시킨 후, 인산완충액으로 세포를 씻어낸다. 유세포분석기를 이용해 세포 내에 존재하는 Dox·HCl 또는 Dox의 형광을 평가했다. 핵유입 실험을 위해서는 500,000개의 자궁경부암세포(HeLa) 또는 간암세포(HepG2)를 6-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, 암세포를 Dox·HCl 또는 Dox가 봉입된 TPCL 나노입자에 4시간 동안 노출시킨 후, 인산완충액으로 세포를 씻어낸다. 세포를 Nuclei PURE isolation kit을 이용해 핵만을 분리해 낸 후, 유세포분석기를 이용해 핵 내에 존재하는 Dox·HCl 또는 Dox의 형광을 평가했다. 미토콘드리아유입 실험을 위해서는 500,000개의 자궁경부암세포(HeLa) 또는 간암세포(HepG2)를 6-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, 암세포를 Dox·HCl 또는 Dox가 봉입된 TPCL 나노입자에 4시간 동안 노출시킨 후, 인산완충액으로 세포를 씻어낸다. 세포를 mitochondria isolation kit을 이용해 미토콘드리아만을 분리해 낸 후, 유세포분석기를 이용해 미토콘드리아 내에 존재하는 Dox·HCl 또는 Dox의 형광을 평가했다. 이 때, 사용된 약물의 농도는 5μg/mL이었다.

도 10처럼, HeLa 세포에서 Dox의 세포유입량보다 Dox·HCl의 세포유입량은 약 3배 많았고 대부분의 Dox-봉입 TPCL 나노입자는 1.4~1.9배 낮았다. Dox·HCl-TPCL-CD 나노입자는 Dox·HCl의 세포유입량에 비해 2배 낮은 세포유입량을 보였지만, Dox·HCl-TPCL-FH 나노입자는 비슷하거나 약 1.3배 높은 세포유입량을 보였다. 또한, 핵유입량의 경우, 세포유입량과 유사한 경향을 보였다. 그러나, 미토콘드리아유입량은 Dox와 Dox·HCl가 유사했고, Dox-봉입 TPCL 나노입자는 Dox보다 약 1.3~1.8배 많은 미토콘드리아유입을 보였다. Dox·HCl-봉입 TPCL 나노입자도 Dox·HCl보다 약 2.4~3.8배 많은 미토콘드리아유입량을 보였다.

도 11처럼, HepG2 세포에서 Dox의 세포유입량보다 Dox·HCl의 세포유입량은 약 2.1배 많았고 대부분의 Dox-봉입 TPCL 나노입자는 1.3~1.6배 낮았다. Dox·HCl-TPCL 나노입자는 Dox·HCl의 세포유입량에 비해 비슷하거나 약 1.5배 높은 세포유입량을 보였다. 또한, 핵유입량의 경우, 세포유입량과 유사한 경향을 보였다. 그러나, Dox의 미토콘드리아유입량은 Dox·HCl의 미토콘드리아유입량의 약 68% 수준이었고, Dox-TPCL1-FH 나노입자를 제외하고 다른 Dox-봉입 TPCL 나노입자의 미토콘드리아유입량은 Dox와 비슷했다. 또한, Dox·HCl-봉입 TPCL 나노입자도 Dox·HCl보다 약 1.5~2.2배 많은 미토콘드리아유입량을 보였다.

핵유입에 대한 미토콘드리아유입을 계산하여 나노입자의 미토콘드리아 선호도를 계산하면, 도 12처럼 소수성 약물인 Dox는 친수성 약물인 Dox·HCl보다 HeLa 세포에서 약 2.5배, HepG2 세포에서 약 2배 높은 미토콘드리아 선호도를 보였다. Dox에 비해서도 Dox-봉입 TPCL 나노입자는 HeLa 세포에서 약 1.6~2.9배, HepG2 세포에서 약 0.9~1.4배 높은 미토콘드리아 선호도를 보였다. Dox·HCl와 비교하면, Dox·HCl-봉입 TPCL 나노입자는 HeLa 세포에서 약 2~5.3배, HepG2 세포에서 약 1.4~1.7배 높은 미토콘드리아 선호도를 보였다.

< 실시예 7> TPCL 고분자/유전자 나노복합체의 제조, 물리화학적 특성 및 유전자 발현효과

TPCL1 고분자/유전자 나노복합체를 만들기 위해 TPCL 고분자 수용액(1mg/mL)과 pDNA 수용액(1mg/mL)을 각각 준비한 후, 양전하/음전하 비(Cation/Anion (+/-) ratio, C/A ratio)에 맞춰 두 용액을 섞어 TPCL1/pDNA 나노복합체를 제조했다. C/A 0.3에서 C/A 3.5 조건에서 제조된 TPCL1/pDNA 나노복합체의 입자크기는 도 13과 같이 50~120nm였고, 제타전위는 -44~45mV사이였다.

준비된 TPCL1/pDNA 복합체를 유전자 발현효율이 높다고 알려진 분자량 25 kDa의 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, bPEI_25kDa)을 이용해 준비한 bPEI_25kDa/pDNA 복합체와 비교하여 TPCL1의 유전자 발현효율능력을 평가했다. 이 트랜스펙션(transfection)실험을 위해 500,000개의 간암세포(HepG2) 또는 유방암세포(MCF7)를 6-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양하였다. 세포를 트랜스펙션 (transfection) 1시간 전에 트랜스펙션 배지로 갈아 준 후, 준비된 TPCL1/pDNA 복합체 또는 bPEI_25kDa/pDNA 복합체 용액을 세포에 트랜스펙션하였다. 4시간 동안 배양 후 원래 혈청이 있는 세포배지로 갈아 준 후 44시간 동안 더 배양 후 유전자 발현효율을 평가하였다.

도 14에서 보는 바와 같이, HepG2 세포에서 bPEI_25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율보다 TPCL1/pDNA 복합체의 유전자 발현효율은 C/A 0.5에서 약 17배, C/A 1.0에서 약 1.5배 낮았으나, C/A 1.25에서 유사했고, C/A 1.5와 C/A 2.0에서는 약 2배 더 높았다. 유사하게 MCF7 세포에서도 bPEI_25kDa/pDNA 복합체의 유전자 발현효율에 보다 TPCL1/pDNA 복합체의 유전자 발현효율은 C/A 0.6에서 약 444배, C/A 0.7에서 약 10배, C/A 0.8에서 약 3배 낮았으나, C/A 0.9와 C/A 1.0에서는 유사했다 (도 15). 특히, HepG2 세포에서 C/A가 증가함에 따라 TPCL1/pDNA 복합체의 세포유입, 핵유입, 미토콘드리아유입량은 증가하였고, C/A 1.0이상에서 핵유입보다 미토콘드리아유입을 약 3~3.5배 선호했다.

< 실시예 8> TPCL 고분자/간섭 RNA 나노복합체의 유전자 간섭효과

TPLC1과 GFP의 간섭 RNA인 siGFP의 나노복합체를 제조한 후, TPCL1/siGFP 나노복합체의 GFP 발현 감소를 평가했다. 이 실험을 위해 100,000개의 A549-GFP 세포를 12-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양하였다. 세포에 복합체를 처리하기 1시간 전에 트랜스펙션 배지로 갈아 준 후, 준비된 TPCL1/siGFP 복합체 용액을 세포에 트랜스펙션하였다. 4시간 동안 배양 후 원래 혈청이 있는 세포배지로 갈아 준 후 44시간 동안 더 배양 후 유세포분석기를 이용하여 유전자 간섭효율을 평가하였다.

도 16와 같이 bPEI_25kDa/siGFP복합체는 siGFP가 25nM일 때 유전자 간섭이 약 0%, 50nM일 때 약 8%이었다. 그러나, TPCL1/siGFP 복합체의 경우, siGFP가 25nM일 때 C/A 0.6, 0.8, 및 1.0 에서 준비된 나노입자는 유전자 간섭이 각 약 6%, 13%, 및 20%이었고, siGFP가 50nM일 때 C/A 0.6, 0.8, 및 1.0 에서 준비된 나노입자는 유전자 간섭이 각 약 22%, 33%, 및 42%이었다.

Claims

폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)이 공유결합된, 화학식 1로 표시되는 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자.
<화학식 1>

n은 3 내지 50임.
제1항의 TPCL 고분자가 수상에서 자기조립된 TPCL 나노입자.
제2항의 TPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 암은 간암 또는 자궁경부암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제2항의 TPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 약물은 항암제 또는 유전자 약물인 것을 특징으로 하는 나노약물전달용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신인 것을 특징으로 하는 나노약물전달용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유전자 약물은 플라스미드 DNA(plasmid DNA; pDNA) 또는 siRNA인 것을 특징으로 하는 나노약물전달용 조성물.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미토콘드리아를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 나노약물전달용 조성물.