CN107998081B - 囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种主动靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用，基于嵌段聚合物PEG‑P(TMC‑DTC)、PEG‑P(LA‑DTC)、PEG‑P(TMC‑DTC)‑PEI、PEG‑P(LA‑DTC)‑PEI、PEG‑P(TMC‑DTC)‑Sp或者PEG‑P(LA‑DTC)‑Sp及其以ANG为靶向分子的靶向聚合物的还原敏感可逆交联囊泡可以高效包载对脑胶质瘤细胞敏感的小分子化疗药物、蛋白药物以及基因药物。载药囊泡在体内可以高效的穿透血脑屏障进入肿瘤实质，进入肿瘤细胞后又可以快速的释放药物，诱导细胞凋亡。该体系具备很多优点，包括工艺简单，载体生物相容性好，显著提高药物在脑肿瘤部位富集，提高脑肿瘤细胞内的药物浓度。该体系可以高效的选择性的将药物递送到脑胶质瘤。

Description

囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
技术领域
本发明属于聚合物纳米药物技术领域，具体涉及一种可穿透血脑屏障并靶向脑肿瘤细胞的还原响应聚合物囊泡纳米药物的应用。
背景技术
脑胶质瘤是危害巨大的中枢神经系统疾病。因为中枢神经系统在人的生理活动中发挥重要作用，所以手术切除脑肿瘤，操作难度大，风险高，无法完全切除，易复发，放疗和化疗都会带来明显毒副作用，甚至直接危及生命，同时治疗效果也很差。随着新型纳米载药系统的发展，脑肿瘤的治疗也有了更好的选择。但是现有纳米载药系统包载药物的效率低，工艺复杂，过程中对蛋白药物和基因药物的的活性有破坏；同时还存在载药纳米系统体内循环不稳定、难以穿透血脑屏障，脑肿瘤细胞摄取低、细胞内药物浓度低等问题；导致纳米药物的药效不高，这些都极大的限制了纳米载药系统在脑肿瘤治疗中的应用。此外，即使是利用靶向载药系统进行脑肿瘤治疗，结果也常常不理想。例如，cRGD是经典的靶向肿瘤的多肽，利用它构建的靶向载药系统非常多，我们也曾在PEG-P(TMC-DTC)囊泡表面修饰cRGD，在多种肿瘤模型（肺癌肿瘤模型，黑色素瘤模型等）上取得明显的抑瘤效果。但是cRGD修饰的载药系统不能穿透血脑屏障进入脑肿瘤细胞，所以在脑肿瘤疾病治疗上效果很差；而具有双靶向效果的靶向分子修饰的载药脂质体取得的脑肿瘤治疗效果也很有限。所以高效的脑肿瘤纳米递药系统必须同时具备几个特点：一、载药系统可以高效包载药物且递送过程中不破坏药物活性；二、载药系统必须可同时选择性的靶向血脑屏障和脑胶质瘤细胞。
发明内容
本发明的目的是公开一种靶向还原响应囊泡纳米药物用于脑肿瘤治疗药物的制备，可以高效介导穿透血脑屏障并且进入脑肿瘤细胞，本发明用于脑肿瘤的纳米载药系统具备如下几个优点：纳米载药系统包载的药物高效低副作用，即包载的药物对脑肿瘤细胞毒性强，对正常器官和组织毒性低；聚合物纳米系统可以高效包载药物，并且纳米载药系统在血液循环时稳定，在脑肿瘤细胞中可以快速释放药物；纳米载药系统可以高效的穿透血脑屏障，并且被脑肿瘤细胞内吞，然后及时逃离内涵体，在细胞内快速释放药物。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用。
一种用于脑肿瘤治疗的药物体系，由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到。
一种脑肿瘤治疗试剂，由脑肿瘤治疗药物与分散介质混合得到；所述脑肿瘤治疗药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到。
本发明中，所述靶向还原响应囊泡纳米药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述靶向还原响应囊泡纳米药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由高聚物自组装后交联得到；所述高聚物为式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物的混合物；
Figure 367650DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ
Figure 199339DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅱ
其中，R1为靶向分子ANG；序列为Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly LysArg Asn Asn Phe Lys Thr Glu Glu Tyr Cys；
R2为以下结构式中的一种：
Figure 110795DEST_PATH_IMAGE003
、
Figure 143473DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 235319DEST_PATH_IMAGE005
R3为以下结构式中的一种：
Figure 277224DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure 698978DEST_PATH_IMAGE007
R4选自氢或者以下结构式中的一种：
Figure 840241DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 682033DEST_PATH_IMAGE009
所述式Ⅰ聚合物或者式Ⅱ聚合物中，PEG链段的分子量为3400-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～8倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～30%；PEI的分子量为PEG链段分子量的20%～60%。
本发明中，所述式Ⅰ聚合物或者式Ⅱ聚合物中，DTC与LA/TMC无规共聚形成疏水链段，xy分别表示疏水链段中DTC的重复单元数以及LA/TMC的重复单元数，中括号表示疏水部分为整体，其一端接有亲水PEG；亲水段1为PEG，其分子量为3400-8000Da，疏水段的总分子量为PEG分子量的2.5-8倍，疏水段中PDTC的分子量占整个疏水段总分子量的10%-30%；当聚合物末端为PEI时，其为亲水段2，其分子量为PEG分子量的20%-60%。
上述技术方案中，所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述聚乙烯亚胺(PEI)为支化（bPEGI）或线性（LPEI），其化学结构式为以下结构式的一种：
Figure 527629DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure 944835DEST_PATH_IMAGE011
所述式Ⅰ聚合物或者式Ⅱ聚合物中，PEG链段的分子量为4000-8000Da；疏水段的总分子量为PEG链段分子量的2.8～6倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的11%～28%；PEI的分子量为PEG链段分子量的20%～50%。
上述技术方案中，所述式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物的摩尔比为（2～20）∶1；所述靶向还原响应囊泡纳米药物中，药物的质量百分数为1%～30%。
本发明中，以高聚物和药物为原料，通过pH梯度法或者溶剂置换法制备靶向还原响应囊泡纳米药物。
本发明还公开了上述靶向还原响应囊泡纳米药物在制备穿透血脑屏障药物中的应用，以及上述可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用，和上述高聚物物在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用。
本发明中，疏水链段里DTC的总分子量为整个疏水链段分子量的10%～30%；所述小分子药物包括阿霉素盐酸盐，大分子蛋白质药物包括皂草素（SAP）、颗粒酶B（GrB），基因药物包括siRNA、mRNA、DNA。
本发明中，所述靶向还原响应囊泡纳米药物中，药物的质量百分数为1%～30%。 cf本发明的聚合物可自组装形成囊泡，亲水内腔大可高效包载亲水小分子药物，即使载药量达到20wt.%, 载药囊泡依然保持稳定，无药物泄露。在聚合物链末端修饰PEI或者精胺（Spermine）后，通过静电相互作用和氢键作用可以大大提高囊泡包载亲水药物的效率，载药量达到15wt.%时，包封率依然超过80%。同时，上述囊泡在进入癌细胞后，细胞内的还原性物质GSH可以快速触发药物释放。此外，本发明的囊泡可以载药穿透血脑屏障进入癌细胞发挥作用。包括脑肿瘤的脑部疾病给药非常困难，不管是大分子药物（蛋白药物和基因药物）还是小分子化疗药物都很难入脑达到有效的治疗浓度。本发明为脑肿瘤的系统给药提供了一种有效方法，较传统纳米载药系统，本发明中的囊泡载药效率、体外稳定性和在肿瘤部位的富集以及药物释放速率都显著提高。
本发明设计的囊泡具有体外以及循环时交联稳定、整个递送过程中保持很高的药物活性、癌细胞内可解交联、同时靶向血脑屏障和脑肿瘤细胞和生物安全性好的特点。囊泡膜的外表面由聚乙二醇（PEG）组成，减少了循环过程中蛋白的吸附，包载大分子药物时，囊泡膜的内表面的较低分子量的PEI（680-4800Da）或精胺，可将大分子药物包载在囊泡内，交联的囊泡膜可保护药物不被降解防止药物泄露，并可延长药物的体内循环时间。囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC或者PLA，侧链的二硫戊环可提供还原敏感的可逆交联，囊泡膜内PEI或精胺除了用于复合药物如蛋白质、多肽和小分子药物，还能通过质子海绵效应逃逸内涵体，这样的设计不但支持生物药物在血液中的长循环，还可保证在细胞内逃离内涵体，快速解交联，释放药物到靶细胞。囊泡可以载药囊泡高效穿透血脑屏障并被脑胶质瘤细胞内吞。
本发明公开的靶向还原响应囊泡纳米药物的制备方法可举例包括以下步骤：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的末端羟基用羟基活化剂比如氯甲酸对硝基苯酯（NPC）活化，再与PEI或者精胺反应制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI、PEG-P(LA-DTC)-PEI、PEG-P(TMC-DTC)-Sp或者PEG-P(LA-DTC)-Sp；
（2）在PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的PEG端偶联靶向血脑屏障和脑胶质瘤细胞的靶向分子，得到靶向PEG-P(TMC- DTC)或者靶向PEG-P(LA-DTC)；
（3）以PEG-P(TMC-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药物；PEG-P(LA-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药物；或者以PEG-P(TMC-DTC)、靶向PEG-P(TMC-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药；或者以PEG-P(LA-DTC)、靶向PEG-P(LA-DTC)与药物为原料，通过pH梯度法制备抗肿瘤药物；以PEG-P(TMC-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；PEG-P(LA-DTC)-PEI与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；以PEG-P(TMC-DTC)-Sp与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；PEG-P(LA-DTC)-Sp与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(LA-DTC)与药物为原料，通过溶剂置换法制备抗肿瘤药物；以PEG-P(TMC-DTC)和靶向PEG-P(TMC-DTC)、药物为原料，或者以PEG-P(LA-DTC)和靶向PEG-P(LA-DTC)、药物为原料，或者PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)、药物为原料，或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(LA-DTC)、药物为原料，或者PEG-P(TMC-DTC)-Sp和靶向PEG-P(TMC-DTC)、药物为原料，或者以PEG-P(LA-DTC)-Sp和靶向PEG-P(LA-DTC)、药物为原料共混自组装、交联得到肿瘤主动靶向囊泡纳米药物，外壳为PEG，可穿透血脑屏障增加脑胶质瘤细胞的内吞；靶向分子为多肽ANG。
比如上述制备方法，具体包括以下步骤：
步骤（1）为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羟基活化剂氯甲酸对硝基苯酯NPC溶于干燥的溶剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到活化的PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC) -NPC；将PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC)-NPC溶液滴加到PEI溶液中反应后，透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI；将PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(LA-DTC)-NPC溶液滴加到精胺溶液中反应后，透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-Sp或者PEG-P(LA-DTC)-Sp；步骤（2）为将得到聚合物Mal-PEG-P(TMC-DTC)或者Mal-PEG-P(LA-DTC)溶于带有靶向分子的有机溶剂如DMSO中反应得到靶向聚合物；步骤（3）为将原料溶液中加入缓冲溶液中，37摄氏度放置后在相同缓冲溶液中透析，室温孵育交联，得到抗肿瘤纳米药物。本发明可以在加或不加还原剂如二硫代苏糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）下室温交联得到可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
本发明首次公开了单靶向还原响应囊泡纳米药物在脑肿瘤治疗中的应用，不仅具有制备方法简单、优良的控制释放能力、载体生物相容好、在体内长循环、保护包载药物不被降解的优点，更主要可以高效的穿透血脑屏障进入脑胶质瘤细胞并及时逃离内涵体释放药物，所以该载药囊泡是脑肿瘤治疗的一个有力工具。
附图说明
图1是实例五囊泡纳米药物粒径分布图和透射电镜图（A）和其在高度稀释和10%FBS存在条件下的稳定性（B）、还原响应性表征(C)；
图2是实例七载SAP囊泡的体外释放(A)和囊泡中释放的SAP的圆二色谱图(B)；
图3是实例九囊泡穿透血脑屏障体外模型评价结果（A），实例十流式实验表征囊泡被细胞内吞结果（B），实例八载SAP囊泡的细胞毒性结果（C）；
图4是实例十囊泡纳米药物逃离U-87 MG细胞内涵体的共聚焦显微镜图
图5是实例十一囊泡纳米药物对胶质瘤细胞迁移能力影响评价；
图6 是实例十二用囊泡纳米药物治疗后，荷瘤鼠的肿瘤生物荧光图（A）囊泡在荷瘤鼠体内分布图（B）囊泡在荷瘤鼠脑的分布图（C）囊泡在荷瘤鼠脑的分布半定量结果(D)；
图7是实例十二囊泡穿透肿瘤组织血管的切片的共聚焦显微镜图；
图8是实例十三治疗后荷瘤鼠的肿瘤生物发光图（A）及其半定量（B），治疗中荷瘤鼠的体重变化（C）和荷瘤鼠的生存期（D）；
图9是实例十四ANG-PS-siPLK1囊泡的凝胶电泳图（A）和实例十六ANG-PS-siCy5囊泡穿透bEnd.3血管内皮细胞（B）；
图10 是实例十七中ANG-PS-siCy5囊泡在U-87 MG脑胶质瘤细胞内吞的流式细胞仪结果和共聚焦显微镜（CLSM）结果(B)；
图11为实例十八中ANG-PS-siPLK1囊泡处理的U-87 MG细胞的凋亡结果图；
图12是实施例十八中ANG-PS-siGL3囊泡处理的U-87 MG细胞的荧光素基因沉默结果图（A）和实施例十九中ANG-PS-siPLK1处理细胞的PLK1基因沉默（B）；
图13为实施例十九中ANG-PS-siPLK1囊泡对U-87 MG细胞的PLK1蛋白沉默；
图14为实施例二十中ANG-PS-siGL3囊泡引起荷U-87 MG-Luc原位脑胶质瘤小鼠体内的基因沉默活体荧光图（A）及定量（B）；
图15为是实施例二十一中ANG-PS-siCy5囊泡在荷U-87 MG-Luc原位脑胶质瘤小鼠体内的药代动力学（A）和活体成像结果（B）；
图16为实施例二十二尾静脉注射的ANG-PS-siPLK1囊泡治疗荷U-87 MG-Luc原位脑胶质瘤鼠的活体成像；
图17为实施例二十二尾静脉注射的ANG-PS-siPLK1囊泡治疗荷U-87 MG-Luc原位脑胶质瘤鼠的的活体成像的荧光定量（A）和小鼠生存曲线（B）。
具体实施方式
实施例一合成嵌段共聚物PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)和PEG5k-P(DTC2k- TMC15k)-bPEI1.8k
在氮气手套箱内，依次称取MeO-PEG-OH (M n =5.0 kg/mol, 0.50 g, 100 μmol),TMC (1.52 g, 14.55 mmol) 和DTC (0.23 g, 1.18 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0mL)中，搅拌加入催化剂磷酸二苯酯（DPP，DPP/OH 摩尔比为10/1)。密闭反应器密封好放置40℃油浴中磁力搅拌下反应2天；三乙胺终止，冰乙醚中沉淀两次，抽滤，真空干燥后得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)。
PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)的末端羟基氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与支化PEI（bPEI）的伯胺反应制得。具体的，PEG5k-P(DTC2k-TMC15k) (0.4 g, 羟基0.017 mmol)和NPC(50 mg, 0.09 mmol)溶于干燥的DCM中在0℃下反应24小时，然后在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-NPC。然后将产物溶于3 mL DCM后滴加到3 mL溶有bPEI (M n=1.8 kg/mol) (235 mg, 0.13mmol)的DCM中，30℃下反应24小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析(MWCO 7000) 48小时，接着在冰乙醚中沉淀两次、抽滤并室温真空干燥得到产物PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k。产率：93.4%。1H NMR (400 MHz, DTCl3)：PEG: δ 3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02, PEI: δ 2.56-2.98。通过积分可知，聚合物的分子量和设计的理论分子量吻合，且GPC测定分子量分布窄，均说明该反应活性可控。
Figure 647212DEST_PATH_IMAGE012
实施例二靶向共聚物的合成
靶向聚合物的合成有多种方式，取决于PEG的端功能化基团。ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)的合成分两步。第一步与实施例一中PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)的合成类似，但用Mal-PEG-OH(Mn=7.5 kg/mol)替代MeO-PEG-OH(M n =5.0 kg/mol)做引发剂，引发DTC和TMC的开环聚合得到Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)。然后在氮气下将ANG的DMSO溶液解按和后者摩尔比1.2：1滴加到Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)的DMSO溶液中，37度搅拌反应8小时后在DMSO透析24小时再用二次水透析12时，冷冻干燥得ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)，产率92%。通过核磁积分可知聚合物分子量为7.5-(2.0-14.7)kg/mol。核磁和BCA法得ANG接枝率为93%。
Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)再如同实施例一第二步一样，端羟基活化、与PEI反应得到Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k，后者再与多肽ANG-SH（为现有产品，序列为Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr Glu GluTyr Cys）室温下加成反应后得到靶向聚合物ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k。
实施例三合成嵌段聚合物PEG5k-P(TMC15k-DTC2k)-Sp
同实施例一法合成的PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-NPC溶于3 mL DCM后，滴加到3 mL溶有精胺(26 mg, 0.13mmol)的DCM中，30℃下反应48小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析(MWCO 7000) 48小时、冰乙醚沉淀两次、抽滤、真空干燥得到PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-Sp。产率：94.7%。核磁和TNBSA法表征Sp的接枝率为97%。表1列出了各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果，通过连接基团可以接上靶向分子ANG。
表1 各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果
Figure 589016DEST_PATH_IMAGE013
实施例四制备载阿霉素盐酸盐、以ANG为靶向分子的交联囊泡
将PEG5k-P(DTC2k-LA15k)和ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-LA15k)分别溶于DMF（10mg/mL）。按物质的量比4:1把100μL聚合物溶液滴入950μL匀速搅拌的柠檬酸缓冲溶液（5 mM，pH4.0）中，加入磷酸氢二钠饱和溶液将pH调至7.8，加入相应体积的阿霉素盐酸盐溶液（，5mg/mL）,继续搅拌10min，37度静置交联12h，用磷酸盐缓冲溶液（PB，10mM，pH 7.4）透析（MWCO7000）8h，每2h换一次缓冲溶液即得到载DOX•HCl的囊泡ANG-PS-DOX。将聚合物替换为PEG5k-P(DTC2k-LA15k)，采用同样的方法可得到无靶向的载DOX•HCl囊泡PS-DOX。表2显示载不同比例DOX•HCl（10%-20wt%）的交联囊泡粒径为91-103 nm，粒径分布为0.05-0.13；紫外测定DOX•HCl的包载效率为57.4%-62.8%。
表2 载DOX•HCl囊泡的表征结果
Figure 972724DEST_PATH_IMAGE014
实施例五制备载SAP的交联囊泡和以ANG为靶向分子的交联囊泡
将PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k和ANG-PEG7.5k-P(DTC2k- TMC15k分别溶于DMSO（10mg/mL）。按物质的量比4:1把100μL聚合物溶液注入950μL含不同浓度SAP的HEPES（5mM，pH 6.8）缓冲溶液中，37度静置，交联过夜。将得到溶液在PB中（10 Mm,pH 7.4）透析（MWCO 350,000）即得到载SAP的囊泡ANG-PS-SAP。将聚合物替换为PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k，采用同样的方法可得到无靶向的载SAP囊泡PS-SAP。靶向聚合物占总聚合物摩尔比分别为0、10%、20%、30%，对应囊泡表示为PS、ANG10-PS、ANG20-PS、ANG30-PS。表3显示载不同比例SAP（5%-10wt%）的交联囊泡粒径为68-88 nm，粒径分布0.08-0.15。BCA法测定SAP的包载效率为81.3%-92.5%。透射电子显微镜照片（图1A）也证实了囊泡的中空结构，大小与DLS结果相近，纳米药物在100倍稀释和含10% FBS溶液中保持良好的稳定性（图1B），在10 mM GSH环境下囊泡快速解交联粒径变大（图1C）。
表3 载SAP囊泡的表征结果
Figure 369070DEST_PATH_IMAGE015
aSAP载药量由BCA法测定；b 粒径于室温，PB缓冲液(pH 7.4, 10 mM) 中测定
实施例六制备载GrB的交联囊泡和以ANG为靶向分子的交联囊泡
PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-Sp和ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) 制备囊泡装载颗粒酶B（GrB）同实施例六，得到载GrB的囊泡ANG-RCCP-GrB和无靶向的载GrB囊泡RCCP-GrB（表4）。DLS显示载GrB（1%）的交联囊泡粒径为68nm，粒径分布很窄（PDI=0.12）。
表4 载GrB囊泡的表征结果
Figure 616250DEST_PATH_IMAGE016
a BCA法测定SAP载药量；b室温PB (pH 7.4, 10 mM) 中测定；c室温PB中测定
实施例七 SAP的体外释放实验
实施例五制备的囊泡中SAP的体外释放实验在37℃恒温摇床中震荡（200 rpm）进行，每组各有三个平行样。PS-SAP和ANG-PS-SAP分别在两种环境下释放，第一种，载SAP的交联囊泡在加入10 mM GSH模拟细胞内还原环境PB(10 mM, pH 7.4)中；第二组，载SAP的交联囊泡在PB (10 mM, pH 7.4)中；载药交联囊泡的SAP浓度为0.1 mg/mL，取0.5 mL 放入透析袋（MWCO: 350000）中，每个试管中加入相应的透析溶剂25 mL，预定时间间隔取5.0 mL透析袋外介质，同时向试管中补加5.0 m相应介质再用二次水透析（MWCO 3500），然后冻干再用BCA法测试SAP的浓度。图2A可看出，加入模拟细胞内还原环境的GSH后，SAP释放明显快于没加GSH的组，说明载药交联囊泡在10 mM的GSH的存在下能快速的释放药物，并且释放出的SAP二级结构完整保持了高的蛋白活性(图2B)。
实施例八 MTT法评价空囊泡和载药囊泡对U-87 MG的细胞毒性
用MTT实验来评估实施例五制备的载SAP囊泡的抗癌活性（图3C），自由 SAP在药物浓度达到100 nM时，细胞存活率依然高于90%，而PS-SAP明显提高了蛋白药物的细胞毒性，细胞存活率下降至70%，而ANG-PS-SAP对LRP-1过表达的U-87 MG 细胞具有更强的细胞毒性，其IC50值只有30.2 nM。上述结果表明修饰靶向分子ANG可以近一步提高载药囊泡的细胞内吞效率，提高药物的细胞毒性。同时，靶向和非靶向的空载体却都显示出很好的生物相容性。
实施例九交联囊泡穿透血脑屏障体外模型评价
用BBB的体外模型来研究Cy5标记的载药囊泡穿透血脑屏障的效率。首先将bEnd.3细胞 (1 × 105细胞/孔) 铺于24孔板的上室内，下室加入800 μL DMEM培养基孵育48小时后，通过跨内皮电阻（TEER）仪（World Precision Instruments）测量bEnd.3单层的紧密度。其次，将培养液更换为无FBS 的DMEM，当bEnd.3细胞单层TEER值超过200 Ω.cm2时，50 μLHEPES的不同ANG密度的囊泡加入transwell上室，37 ℃、50 rpm的摇床中孵育24小时收集下室或上室培养基，并用等体积的新鲜培养基代替。每收集一次都对TEER进行监测。随后通过荧光分光光度计（Thermo Scientific）测量外流比率。结果表明，ANG20-PS-Cy5显示出最高的穿透效率（12.7%），比非靶向组PS-Cy5（5.4%）有了进一步的提高，也优于其他靶向密度的囊泡（ANG10-PS-Cy5（7.4%）和ANG30-PS-Cy5（11.7%）（图3A）。竞争结合实验显示用ANG(0.1 mg/mL)预先孵育细胞0.5h后再加ANG20-PS-Cy5的组穿透效率降至6.8%，说明本发明的囊泡可以有效载药穿透血脑屏障。
实施例十囊泡被细胞内吞和在细胞内蛋白释放行为
用流式实验和内涵体逃逸实验来研究Cy5标记的囊泡细胞内吞和细胞内蛋白的释放行为。图3B显示囊泡ANG10-PS-Cy5、ANG20-PS-Cy5和ANG30-PS-Cy5组在U-87 MG细胞的内吞量分别是无靶向组的1.2、2.0和2.1倍；竞争结合实验同样证明了本发明的囊泡被U-87MG内吞。同样，类似的受体与配体结合的饱和效应也被观察到（ANG20-PS-Cy5（2.0倍）和ANG30-PS-Cy5（2.1倍）。用共聚焦显微镜追踪了模型蛋白FITC-CC在细胞内的位置。结果显示随着孵育时间的延长，细胞内FITC-CC的荧光强度显著增强；表明囊泡高效的将FITC-CC导入胶质瘤细胞，并快速的逃离内涵体，释放进入细胞质(图4)。
实施例十一 ANG-PS-SAP和PS-SAP对胶质瘤细胞迁移能力的影响
脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭是引起脑肿瘤快速恶化的重要原因，图5显示PBS组的细胞单层的划痕在48 h后几乎完全汇合，用无靶向载药囊泡PS-SAP孵育的组有一定的抑制迁移和侵袭的作用，只可观察到细胞少量的迁移。相比之下，用ANG-PS-SAP预先孵育的组细胞形态皱缩，划痕清晰，中间几乎无明显的迁移细胞。这表明ANG-PS-SAP对脑胶质瘤细胞的迁移有更明显的抑制作用。
实施例十二交联囊泡在荷原位脑胶质瘤小鼠体内生物分布和在体内穿透肿瘤区域脑微血管能力的考察
所有动物实验操作均在苏州大学动物中心及动物保护及使用委员会批准下进行。活体成像系统用来考察不同靶向密度的囊泡在肿瘤部位富集能力的差异。肿瘤细胞的生物荧光显示了肿瘤的位置和相对大小（图6A），图6B是尾静脉注射不同ANG靶向分子密度的载荧光分子DiR的囊泡PS、ANG10-PS、ANG20-PS和ANG30-PS在24h后囊泡在小鼠体内的分布情况。可以明显发现囊泡富集在脑的肿瘤部位。将荷瘤鼠的脑取出后发现，囊泡选择性的富集在脑肿瘤部位，这与活体观察到的结果一致（图6C）。脑肿瘤部位的荧光强度定量分析发现，ANG20-PS显示出最好的富集效果，分别是ANG10-PS和ANG30-PS的1.5倍和1.2 倍。穿透肿瘤区域脑微血管能力研究发现，载荧光分子的无靶向囊泡PS在脑肿瘤部位富集很少。靶向囊泡ANG-PS 穿透肿瘤与正常组织边界的血管进入肿瘤实质（图7）。这与BBB体外模型的结果是一致的，证明本发明的囊泡可以高效穿过血脑屏障富集在肿瘤实质。
实施例十三载SAP 交联囊泡对荷原位脑胶质瘤小鼠的治疗
原位荷脑胶质瘤鼠被用来评估载SAP囊泡的体内抗肿瘤效果，肿瘤的生物荧光被用来检测肿瘤的大小。原位脑胶质瘤模型的建立：将U-87 MG-Luc细胞（1×107细胞悬浮于50 μL的0.9％NaCl中）注射到载体裸鼠BALB/c裸鼠的侧腹。当其肿瘤体积增长至约300 mm3时，将载体小鼠处死以收获皮下肿瘤。然后将约2 mg切碎的脑肿瘤组织用专门制作的螺旋桨植入到每只麻醉动物的左侧纹状体（前颅侧2 mm，深3 mm）中（使用24＃套管针腹膜内注射戊巴比妥钠，剂量80 mg/kg）。由IVIS Lumina系统观察肿瘤生长情况，在成像前10-15分钟，腹腔注射100 μL荧光素酶(150 mg/kg)为底物。约两周后开始实验。图8显示连续给药后，无靶向组PS-SAP有一定的肿瘤抑制作用，ANG-PS-SAP的肿瘤抑制效果更好。肿瘤荧光强度的定量分析（图8B）结果显示ANG-PS-SAP和PS-SAP组的抑瘤率分别是 84.1%和43.4%。随着脑胶质瘤的恶化，到接种后第22天，PBS组小鼠的体重下降了25%，并且有小鼠死亡。PS-SAP组显示出一定的抗肿瘤效果，体重有下降，在接种后第23天出现动物死亡。而ANG-PS-SAP组直到32天也只有不到15%的体重下降（图8C）。中位生存期分别为22 天 (PBS)、29 天(PS-SAP) 和 43 days (ANG-PS-SAP) （图8D）。TUNEL染色进一步表征了抗肿瘤效果：PS-SAP 组引起了脑胶质瘤细胞的部分凋亡，ANG-PS-SAP组的脑肿瘤切片中大量凋亡细胞。
实施例十四制备装载各种siRNA的囊泡和靶向囊泡
通过溶剂交换法复合装载各种siRNA，包括特异性的siPLK1、荧光标记的siRNA（Cy5-siRNA）和非特异性siRNA(siScramble)。100 μL溶于DMSO的聚合物 PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k或者和特定比例的靶向聚合物ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) ；或是PEG5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8k或者和特定比例的ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k)-bPEI1.8混合好(5.0 mg/mL)，再加与siRNA缓冲溶液(1 mg/mL)混合孵育10 min，再缓慢打入900 μL的HEPES (5 mM, pH 6.8)，室温下放置2 h、摇床25 ℃、100 rpm交联过夜，在HEPES中透析得到各种载siRNA的囊泡。DLS结果显示粒径为100-160 nm，载10 wt.% siRNA的ANG-PS粒径为117 nm，粒径分布为0.17。表5为ANG-PS-siScramble、PS-siPLK1和ANG-PS-siPLK1的粒径与包载效率。
表5 ANG-PS-siRNA的粒径与包载效率
Figure 668520DEST_PATH_IMAGE017
实施例十五 ANG-PS-siPLK1的凝胶电泳分析
琼脂糖胶中分别加入20 μL的ANG-PS-siScramble，PS-siPLK1和ANG-PS-siPLK1，自由siRNA，以及用10 mM GSH处理过夜后的ANG-PS-siScramble，PS-siPLK1和ANG-PS-siPLK1，在TBE电泳缓冲液中跑胶(100 V, 30 min)后，由Molecular Imager FX(Bio-Rad,Hercules，Ex/Em: 532/605 nm)拍照凝胶图片，通过Quantity One 软件(Bio-Rad)分析，见图9A，琼脂糖凝胶阻留法表明，ANG-PS可以完全、紧实包裹siRNA，证明ANG-PS-siRNA稳定性优异。在10 mM GSH存在下过夜孵育，囊泡的解交联，大部分siRNA释放出来。
实施例十六 ANG-PS-siCy5（siCy5: Cy5-siRNA）穿透血脑屏障实验
如实施例十建立体外BBB模型。当bEnd.3细胞单层TEER值超过200 Ω.cm2时，50 μL HEPES的载Cy5-siRNA的囊泡（ANG-PS-siCy5或PS-siCy5）加入上室。然后37 ℃、50 rpm的摇床中孵育6、12或24小时。图9B表明ANG-PS-siRNA具有显著的BBB穿透能力。
实施例十七 ANG-PS-siCy5流式细胞仪及共聚焦显微镜(CLSM)实验
ANG-PS-siCy5和PS-siCy5被脑胶质瘤细胞U-87 MG的内吞及释放行为通过流式细胞仪及CLSM检测。图10A显示PS-siCy5能进入细胞，但ANG-PS-siCy5孵育细胞荧光强度明显强于PS-siCy5；图10B的CLSM图显示ANG-PS-siCy5能有效逃离内涵/溶酶体。
实施例十八 ANG-PS细胞毒性实验及NG-PS-siGL3体外荧光素表达
MTT实验表明ANG-PS空囊泡在浓度高达0.5 mg/mL时也没有毒性（细胞存活率>85%），佐证了本发明的囊泡优异的生物相容性。用流式细胞仪的膜联蛋白V-FITC（Annexin-V）和碘化丙啶（PI）双染的细胞凋亡实验中，ANG-PS-siPLK1或PS-siPLK1(siPLK1 浓度为200 nM和400 nM）37℃孵育4 h后，换新鲜培养基再孵育44小时。图11表明，在200 nM 和400nM时，PS-siPLK1能诱导U-87 MG细胞的晚期凋亡为6.4%和8.2%，ANG-PS-siPLK1诱导的晚期凋亡分别为8.0%和12.5%。
siRNA使用萤火虫荧光素酶报告基因siRNA(siGL3)。荧光素酶基因稳定表达的脑胶质瘤细胞(U-87 MG-Luc)悬浮在含10% FBS的DMEM培养基中植于96孔板(5 × 103细胞/孔)培养24 h。接着换上90 μL新鲜培养基并加入10 μL ANG-PS-siRNA或PS-siRNA(200 nM和400 nM 的siRNA)和对照组ANG-PS-siScramble孵育48 h后，裂解细胞，其中的荧光素强度由基于荧光酶标仪(Mithras LB 940)的荧光素酶检测系统(Promega)测定。以HEPES组别为标准(100%)得到相对的荧光素酶活性（n = 4）。图12A结果显示，ANG-PS-siScramble没有导致荧光素酶表达量的降低，而无靶向PS-siGL3呈现出较低的基因沉默效率。荧光素酶表达量被ANG-PS-siGL3显著下调：ANG-PS-siGL3在siRNA浓度为200 nM和400 nM时，分别抑制44%及59%荧光素酶的表达。
实施例十九 qRT-PCR定量ANG-PS-siPLK1的体外基因沉默能力
按实施例十四制备装载治疗性基因siRNA(siPLK1)的囊泡ANG-PS-siPLK1。用实时荧光定量基因扩增荧光检测系统(qRT-PCR)研究ANG-PS-siPLK1内源性基因沉默活性实验，类似球激酶(PLK1)作为靶向基因。U-87 MG细胞悬浮于含有10% FBS的DMEM培养基中铺于6孔板(3×105 个细胞/孔)培养24 h后，分别加入100 µL ANG-PS-siPLK1、ANG-PS-siScramble和PS-siPLK1 (最终siRNA浓度为200 nM和400 nM)孵育48 h。细胞经PBS清洗并收集RNA，反转并由qPCR测试得到。GAPDH作为内参基因确定PLK1 mRNA量。mRNA表达水平由相对Ct方法(2−ΔΔCt)计算得到（n = 4）。图12B可见，ANG-PS-siPLK1组的PLK1 mRNA量与PS-siPLK1和ANG-PS-siScramble相比显著降低，证明其靶向性及序列特异性基因沉默能力。另外，在蛋白水平上进一步验证了ANG-PS-siPLK1在U-87 MG细胞中序列特异性沉默PLK1蛋白的能力（图13）。本发明的ANG-PS 包载siGL3或siPLK1囊泡能有效包裹siRNA，有效被细胞内吞，通过PEI质子海绵效应逃离内涵体，细胞质还原环境下快速释放siRNA，高效沉默相应基因。
实施例二十ANG-PS-siGL3的体内基因沉默
如实施例十四建立U-87 MG-Luc原位脑胶质瘤肿瘤。约两周后开始实验，分别尾静脉注射200 μL HEPES的ANG-PS-siGL3 和ANG-PS-siScramble (20 μg siRNA/鼠)。图14A为原位脑胶质瘤裸鼠的脑部荧光在ANG-PS-siGL3给药前后的变化图片。图14B为脑部生物荧光的定量分析，注射ANG-PS-siGL3的24及48 h后，脑部生物荧光强度分别降低57%及71%，证明ANG-PS-siGL3诱导脑组织荧光素酶基因有效表达，没有观察到ANG-PS-siScramble小鼠脑部荧光强度的变化，证实特异序列能致使生物荧光基因沉默。
实施例二十一 ANG-PS-siCy5药代动力学及体内活体成像
ANG-PS-siCy5在体内的药代动力学在BALB/c小白鼠体内研究。经尾静脉注射200μL HEPES的ANG-PS-siCy5、PS-siCy5和游离Cy5-siRNA (20 μg Cy5-siRNA/鼠)。在预定时间，眼眶取血(约50 μL血液)，立即离心取20μL血浆（3000 rpm，5 min），加入700 μL的含40mM DTT的DMSO溶液在37℃过夜萃取其中的Cy5。离心(14.8 krpm, 30 min)后，上清液中Cy5的含量由荧光测得。图15A表明，ANG-PS-siCy5和PS-siCy5比游离Cy5-siRNA具有更长的血液循环时间，长于文献中报道的阳离子复合物siRNA。ANG-PS-siCy5、PS-siCy5和Cy5-siRNA的消除半衰期分别为4.32、4.04和0.36小时。
荷原位脑胶质瘤U-87 MG-Luc裸鼠随机分为两组，分别尾静脉注射200 μL HEPES的ANG-PS-siCy5 和PS-siCy5 (20 μg Cy5-siRNA/鼠)。在2、4、8、12和24小时，小鼠通过异氟烷麻醉、近红外荧光成像系统(Lumina, IVIS II)获取荧光图（Ex.633 nm，Em.670 nm）。在图片获取过程中，由小动物麻醉机麻醉小鼠。通过Lumina II软件拍摄并分析图片。图15B为肿瘤部位Cy5-siRNA荧光图，显示ANG-PS-siCy5组小鼠在注射2 h后，观察到肿瘤部位Cy5-siRNA荧光很强；PS-siCy5在肿瘤部位积累量显著减少。结果表明主动靶向在肿瘤高富集及久持续上发挥重要作用。
实施例二十二荷U-87 MG-Luc原位脑肿瘤裸鼠的治疗实验
如实施例十四建立原位U-87MG-Luc胶质瘤模型。接种时定位第0天，约10 d后肿瘤荧光强度达到106时开始治疗。小鼠称重并随机分为4组(每组8只)：ANG-PS-siPLK1、PS-siPLK1、ANG-PS-siScramble和PBS。小鼠经尾静脉每两天注射一次，剂量为60 µg siRNA/鼠。小鼠的相对体重以它们初始体重为标准。第20天治疗终止，每组任意取一只小鼠处死，取出主要器官清洗。之后，浸泡在4%的福尔马林并包埋于石蜡中，由H&E染色并由正置显微镜拍照(Olympus BX41)。除此以外，40天内观察各组的生存曲线(每组7只)。图16为通过荧光成像跟踪肿瘤生长情况图，结果表明，和PBS组相比，PS-siPLK1能部分抑制肿瘤增长，而ANG-PS-siPLK1显著抑制肿瘤增长。ANG-PS-siScrambl和PBS组小鼠情况类似，肿瘤快速增长。脑部荧光定量分析显示了ANG-PS-siPLK1的高效肿瘤抑制能力要显著强于无靶向组PS-siPLK1(图17A)；ANG-PS-siPLK1组小鼠体重几乎无变化，而PS-siPLK1，ANG-PS-siScramble及PBS组小鼠体重有所降低。生存曲线显示ANG-PS-siPLK1组小鼠生存期明显延长。ANG-PS-siPLK1、PS-siPLK1、 ANG-PS-siScramble和PBS组小鼠生存中值分别为39.0、27.0、24.0及22.0天(图17B)。肿瘤的H&E染色组织学分析表明，ANG-PS-siPLK1比其他组引发更大量及大面积肿瘤细胞凋亡，但对主要器官伤害很小。结果表明ANG-PS-siPLK1能安全高效、靶向递送siRNA至荷原位脑肿瘤小鼠。
实施例二十三载DOX、ANG为靶向分子的囊泡治疗荷原位脑胶质瘤小鼠
如实施例四制备的载DOX•HCl、基于PEG5k-P(DTC2k-LA15k)和ANG-PEG7.5k-P(DTC2k-LA15k)的ANG20-PS-DOX尾静脉给药。PBS组接种后第18天开始有小鼠死亡；PS-DOX有一定的抑制作用，但体重下降明显，第28天出现小鼠死亡。里葆多组动物毒性明显，21天开始有死亡。ANG20-PS-DOX组显示出更好的抑瘤效果：50天开始有小鼠死亡。中位生存期分别为20天(PBS)、24天(里葆多，6 mg DOX/kg)、28天(PS-DOX，10mg DOX/kg)和50天(ANG-PS-DOX，10 mg DOX/kg)。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial)
<400> 1
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Cys
20

Claims (9)

1.靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述靶向还原响应囊泡纳米药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由高聚物自组装后交联得到；所述高聚物为式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物的混合物；
Figure 929867DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ
Figure 565117DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅱ
其中R1为靶向分子ANG；
R2为以下结构式中的一种：
Figure 16958DEST_PATH_IMAGE003
、
Figure 146588DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 882331DEST_PATH_IMAGE005
R3为以下结构式中的一种：
Figure 173635DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure 175089DEST_PATH_IMAGE007
R4选自氢或者以下结构式中的一种：
Figure 92099DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 433081DEST_PATH_IMAGE009
所述式Ⅰ聚合物或者式Ⅱ聚合物中，PEG链段的分子量为3400-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～8倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～30%；PEI的分子量为PEG链段分子量的20%～60%；
所述式Ⅰ聚合物、式Ⅱ聚合物的摩尔比为（2～20）∶1；所述靶向还原响应囊泡纳米药物中，药物的质量百分数为1%～30%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述PEI的化学结构式为以下结构式的一种：
Figure 895287DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure 633304DEST_PATH_IMAGE011
所述式Ⅰ聚合物或者式Ⅱ聚合物中，PEG链段的分子量为4000-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8～6倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的11%～28%；PEI的分子量为PEG链段分子量的20%～50%。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以高聚物和药物为原料，通过pH梯度法或者溶剂置换法制备主动靶向还原响应聚合物囊泡纳米药物。
4.靶向还原响应囊泡纳米药物在制备穿透血脑屏障药物中的应用，其特征在于，所述靶向还原响应聚合物囊泡纳米药物为权利要求1所述靶向还原响应囊泡纳米药物。
5.可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡为权利要求1所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
6.高聚物在制备穿透血脑屏障药物或者脑肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述高聚物为权利要求1所述高聚物。
7.一种用于脑肿瘤治疗的药物体系，由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由权利要求1所述高聚物自组装后交联得到。
8.根据权利要求7所述一种用于脑肿瘤治疗的药物体系，其特征在于，所述用于脑肿瘤治疗的药物体系中，药物的质量百分数为1%～30%。
9.一种脑肿瘤治疗纳米药物，由脑肿瘤治疗药物与分散介质混合得到；所述脑肿瘤治疗药物由可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载药物得到；所述药物为小分子药物、大分子蛋白质药物或基因药物；所述可逆交联生物可降解聚合物囊泡由权利要求1所述高聚物自组装后交联得到。
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Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(e-caprolactone) nanoparticles as dual-targeting drug delivery system for brain glioma;Hongliang Xin等;《Biomaterials》;20110321;第32卷(第18期);参见摘要，第3.6节和第3.7节 *

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