CN113350283A - 一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用，设计了基于PEG‑P(CL‑DTC)的PTX胶束，研究了其与载干扰素基因刺激蛋白（STING）通路激动剂环二核苷酸（CDN）的具有不对称膜结构的囊泡（CPs‑CDN）联用在治疗乳腺癌（TNBC）中的技术效果。本发明制备的PTX胶束方法简便、粒径小、载药量高，具有良好的稳定性及还原响应性，实验表明，在和CPs‑CDN联用后，可促进更多BMDC成熟，肿瘤和脾脏内的CD4⁺T和CD8⁺T细胞显著增多，而抑制性T_reg减少，使得肿瘤生长和肺转移受到明显抑制，小鼠生存期得以延长，体现了化疗免疫治疗的优势。

Description

一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米药物技术，具体涉及一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用。

背景技术

化疗后期很多病人会出现耐药、癌细胞转移、肿瘤复发等不良预后反应，对于高度转移性肿瘤，如孕激素受体、雌激素受体和人表皮生长受体都不表达的三阴性乳腺癌（TNBC）患者几乎是束手无策。最近兴起的免疫疗法在肿瘤治疗上显示了巨大潜力，尤其是基于PD-1单抗、PD-L1单抗、或CTLA-4单抗的免疫检查点疗法，通过唤醒或恢复免疫细胞对肿瘤的免疫学监控来实现肿瘤治疗。但是单一免疫疗法如PD-1/PD-L1单抗只对20%-25%的患者有效，而对棘手的TNBC病人的客观响应率（ORR）只有12％-19％，是因为TNBC肿瘤细胞突变率低、免疫微环境弱、肿瘤浸润淋巴细胞水平低。

发明内容

本发明公开了一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用，分别制备了偶联PHSCNK多肽（ATN1）、PhScNK 多肽（ATN2）或cRGD多肽的纳米药物ATN1-Ms-PTX、ATN2-Ms-PTX和cRGD-Ms-PTX；并且制备了基于PEG-P(TMC-DTC)-Sp的具有不对称膜结构的聚合物囊泡来装载、保护和递送环二核苷酸（CDN）ADU-S100（CPs-CDN）到APC，以更好地激活抗肿瘤免疫应答。实验结果表明，ATN2-Ms-PTX能高效靶向富集到小鼠肿瘤，增加了PTX在肿瘤细胞的浓度，其后顺序递送CPs-CDN激活了STING通路，明显延缓了小鼠肿瘤的生长、抑制了乳腺癌的肺转移，延长了小鼠的生存期。

本发明采用如下技术方案：

一种化疗免疫联合药物，由化疗药物胶束与囊泡纳米STING激动剂组成；所述化疗药物胶束的制备方法为，将小分子药物、两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；或者将小分子药物、两亲性聚合物、靶向两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；所述低聚乙二醇的分子量（M _n ）为200～600；所述囊泡纳米STING激动剂由聚合物囊泡装载STING激动剂组成。

上述技术方案中，静置下，将所述混合溶液打入缓冲溶液中，然后搅拌、静置、涡旋、吹打或者倒置；打入为现有技术，比如用注射器或者注射泵；搅拌的转速为100～1000rpm。混合溶液中，小分子药物的浓度为0.1至10 mg/mL，聚合物浓度为1～100 mg/mL；聚合物为两亲性聚合物，或者聚合物为两亲性聚合物和靶向两亲性聚合物的混合物。

上述技术方案中，混合溶液中含有靶向两亲性聚合物时，靶向两亲性聚合物的用量为两亲性聚合物重量的1～30%，优选2～10%。本发明中，两亲性聚合物不偶联靶向分子，靶向两亲性聚合物偶联靶向分子。

上述技术方案中，低聚乙二醇、缓冲溶液的体积比为1∶（5～40），优选1∶（10～30）。

本发明制备了PTX载药量高的胶束，且制备的小粒径胶束（20-40 nm）能够穿透至肿瘤深处。

本发明公开了上述囊泡纳米STING激动剂的制备方法，将STING激动剂溶液加入缓冲溶液中，再加入聚合物溶液，搅拌后透析，得到囊泡纳米STING激动剂。进一步的，STING激动剂溶液为STING激动剂水溶液；聚合物溶液为聚合物的DMF溶液；缓冲溶液为HEPES缓冲溶液。其中，STING激动剂溶液的浓度为1～30 mg/mL；聚合物溶液的浓度为1～100 mg/mL。

上述技术方案中，小分子药物为紫杉醇PTX；所述低聚乙二醇的分子量（M _n ）为200～600。两亲性聚合物的分子量为3000～15000，靶向两亲性聚合物的分子量为2000～15000。本发明聚合物的分子量为核磁测定的数均分子量（M _n ），单位为Da。

上述技术方案中，STING激动剂为环二核苷酸（CDN），包括环二单磷酸鸟苷（c-di-GMP）、环二单磷酸腺苷（c-di-AMP）、2`,3`环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸（2`,3`-cGMAP）、3`,3`环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸（3`,3`-cGMAP）及其取代衍生物，比如硫、氟、氮取代环二核苷酸衍生物。

上述技术方案中，两亲性聚合物为PEG-P(CL-DTC)、PEG-P(TMC-DTC)、PEG-P(LA-DTC)等；靶向两亲性聚合物为所述两亲性聚合物偶联靶向分子，优选的，靶向分子为多肽，比如PHSCNK多肽、PhScNK 多肽或cRGD多肽；两亲性聚合物中，PEG的分子量（M _n ）为1000～5000 Da。

上述技术方案中，制备囊泡纳米STING激动剂时，聚合物包括亲水链段、疏水链段以及阳离子片段；所述疏水链段的侧链为含双硫键的二硫戊环，其化学结构式如下：

R为亲水链段，比如聚乙二醇链段；T链段与侧链含双硫键的碳酸酯链段（DTC单体形成的单元）组成疏水链段，T为环酯单体或者环碳酸酯单体形成的单元，比如丙交酯、己内酯、三亚甲基碳酸酯；P为阳离子片段，比如聚乙烯亚胺（PEI）、精胺（SP）；y、z表示重复单元；

所述亲水链段的分子量为2000～9000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.1～8.0倍；侧链含双硫键的碳酸酯链段的分子量为T链段分子量的10%～35%；阳离子片段的分子量为亲水链段分子量的5%～30%；

比如所述聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-Sp。

本发明制备了PTX载药量高的胶束，且制备的小粒径胶束（20-40 nm）能够穿透至肿瘤深处，并且CPs-CDN激活STING通路、激活并招募APC的顺序给药策略，可以更强地激活免疫系统，产生更多促炎细胞因子，使肿瘤和脾脏内的CD4⁺、CD8⁺ T细胞比例显著增多、抑制性T_reg减少，更好地抑制小鼠TNBC的生长和肺转移的发生。本发明公开了上述化疗免疫联合药物在制备抗肿瘤药物中的应用，优选肿瘤为三阴性乳腺癌（TNBC）。

本发明首先设计制备了高效载PTX、双硫交联的胶束Ms-PTX以及三种TNBC主动靶向的胶束纳米药物，载药量高达23.1wt.%，粒径在30～38 nm之间，具有良好的稳定性、还原响应的药物释放性能。细胞层面和动物层面的实验证实，ATN2-Ms-PTX对4T1细胞的靶向内吞作用最强，IC₅₀值最低，在肿瘤的生物分布最高。此外，ATN2-Ms-PTX可诱导ICD、促进BMDC增值以及成熟、促进BMDM向M1型巨噬细胞极化，产生有利的免疫微环境。此外，为探索进一步加强靶向PTX胶束的免疫治疗效果，制备了载STING激动剂CDN的双硫交联的囊泡CPs-CDN，以激活APC的STING通路，诱导更强的免疫应答。ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN联合可促进BMDC的成熟，释放IFN-β和TNF-

等细胞因子。在荷4T1乳腺癌小鼠中，先静脉注射ATN2-Ms-PTX、诱导ICD释放肿瘤抗原，8-24 h后再瘤内注射CPs-CDN激活STING通路、激活并招募APC的顺序给药策略，可以更强地激活免疫系统，产生更多促炎细胞因子，使肿瘤和脾脏内的CD4⁺、CD8⁺ T细胞比例显著增多、抑制性T_reg减少，更好地抑制小鼠TNBC的生长和肺转移的发生，显著延长小鼠生存期，体现了化疗联合免疫治疗的优势，为治疗高转移性肿瘤带来了希望。

附图说明

图1为Ms-PTX和ATN2-Ms-PTX胶束的制备和理化性质（载药量4.8 wt.%）。（A）胶束的制备过程示意图；（B）Ms-PTX和ATN2-Ms-PTX的粒径分布以及MS-PTX的TEM示意图；（C）载药量为23.1 wt.%的MS-PTX（I）及相同PTX浓度的PB溶液（II）照片；（D）胶束在室温存放3周、制备后再透析后室温放置1 h的粒径变化；（E）空Ms、ATN2-Ms和ncMs以及相同浓度的聚合物溶液（5 mg/mL）的紫外吸收谱图；（F）胶束中芘的荧光吸收谱中I₃₇₂/I₃₈₃（I₁/I₃）比值随浓度的变化；（G）Ms-PTX和ATN2-Ms-PTX浓度为20 μg/mL的粒径，以及ncMs-PTX浓度为1 mg/mL、50 μg/mL的粒径及其在室温下放置2天的粒径；

图2为Ms-PTX和ATN2-Ms-PTX在37 度10%FBS中孵育24 h后的粒径分布（A），在10mM DTT中孵育2 h后的粒径分布（B）；ATN2-Ms-PTX在模拟生理环境（PB，pH 7.4）和细胞内还原环境（含10 mM DTT 的PB）下PTX的累积释放（n = 3）（C）；

图3为MTT法（n = 5）测定含不同多肽密度的（A）cRGD-Ms-PTX、（B）ATN1-Ms-PTX和（C）ATN2-Ms-PTX对4T1细胞的毒性；（D）自由PTX先孵育4 h、换新鲜培养基再孵育44 h（4+44h）及共孵育48 h的细胞毒性；（E）空胶束Ms和ATN2-Ms共孵育48 h的细胞毒性；

图4为流式细胞仪（A）和CLSM（B&C）测试了标记Cy5的Ms-PTX、AT1-Ms-PTX、ATN2-Ms-PTX和cRGD-Ms-PTX被4T1细胞内吞（孵育4 h）的情况。（B）为Cy5半定量荧光强度。受体抑制实验用PhScNK多肽（ATN2）预先和4T1细胞孵育2 h再加Cy5/ATN2-Ms-PTX。Cy5聚合物浓度为2 μg/mL。标尺为25 μm；

图5为CPs-CDN的制备（A）以及1 mg/mL CPs-CDN在4℃放置3周和在含10%的FBS的PB中粒径变化（B）；

图6为BMDC的成熟（CD11c⁺CD86⁺CD80⁺）和培养基中细胞因子的浓度（n = 3）。自由CDN、ATN2-Ms-PTX、CPs-CDN及后两者联合和BMDC孵育24 h。（A）BMDC的代表性样品流式细胞仪伪色图（在CD11c⁺总BMDC圈门内）及其统计学分析（B）。培养基中（C）IFN-β、（D）TNF-α和（E）IL-6的浓度；

图7为Ms-PTX（i.v. 10 mg PTX/kg，i.t. 5 mg PTX/kg）及其给药后2 h联合CPs-CDN（i.t. 1 mg CDN/kg）治疗荷4T1小鼠（n = 3）的肿瘤体积（A）和相对体重（B）；

图8为ATN2-Ms-PTX胶束及其与CPs-CDN联合治疗荷4T1乳腺癌小鼠（7.5 mg PTX/kg，1 mg CDN/kg）的（A）抗肿瘤治疗方案；（B）肿瘤体积（#号代表肿瘤体积大于2000 mm³死亡或自然死亡）；（C）小鼠的生存曲线；（D）小鼠体重。n = 7；

图9为ATN2-Ms-PTX及其与CPs-CDN联合给药结束24 h后小鼠肿瘤的流式细胞仪分析（n = 4）。成熟DC（CD45⁺CD80⁺CD86⁺）（A）和M1M（CD11b⁺F4/80⁺CD206^-）（B）的比例。CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞代表性流式细胞图（C）。CD3⁺CD4⁺（D）和CD3⁺CD8⁺（E）T细胞比例。（D）Tregs（CD3⁺CD4⁺FoxP3⁺，CD45⁺圈门内）在CD4⁺ T中的含量，（E）CD8+ T/Tregs比例。（H）血清中细胞因子的浓度；

图10为ATN2-Ms-PTX及其与CPs-CDN联合给药结束24 h后小鼠脾脏的流式细胞仪分析。（A）CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ T细胞代表性流式细胞伪色图（在CD45⁺总免疫细胞圈门内）以及（B）CD3⁺CD4⁺ 和（C）CD3⁺CD8⁺ T细胞比例统计。n = 4；

图11为自由PTX、Ms-PTX、自由CDN、CPs-CDN、ATN2-Ms-PTX及其与CPs-CDN联合治疗后第22天小鼠的血常规（A）和血生化（B）分析（n = 3）；

图12为PBS、自由PTX、Ms-PTX、自由CDN、CPs-CDN、ATN2-Ms-PTX及其与CPs-CDN联合治疗荷瘤小鼠22天后小鼠心、肝、肾、脾切片的H&E染色图（40×，标尺为50 μm）。WP：白髓，RP：红髓；

图13为自由PTX、Ms-PTX、自由CDN、CPs-CDN、ATN2-Ms-PTX及其与CPs-CDN联合给药第22天小鼠的脾脏图片（A）和质量（B）。n = 3；

图14为荷瘤小鼠在给药22天后肺部离体成像（A）、荧光值半定量（B）和质量（C）。（D）肺H&E染色图。左图为10×，标尺为500 μm；右图为40×，标尺为50 μm。

具体实施方式

甲氧基聚乙二醇（MeO-PEG-OH，M _n = 2.0 kg/mol）、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺酯官能化的聚乙二醇（Mal/NHS-PEG-OH，M _n = 3.5 kg/mol）均购自北京键凯科技有限公司，经甲苯共沸蒸馏后使用。ε-己内酯（ε- CL, 99%，Alfa Aesar）经氢化钙干燥、减压蒸馏后使用。1,2-二硫戊环三亚甲基碳酸酯（DTC）由本实验室合成并提纯。磷酸二苯酯（DPP，> 99%，TCI）使用前真空干燥30分钟。环肽c(RGDfC)（cRGD）、Ac-PHSCNK-NH₂（ATN-1）和Ac-PhScNK-NH₂（ATN-2）的纯度都大于 98%，均购自上海强耀生物。高效液相色谱（HPLC）用试剂均从SigmaAldrich (USA) 购买得到。紫杉醇（PTX，> 99%，上海金和生物制药有限公司）、甲氧基低聚乙二醇（PEG 350，M _n = 350 g/mol，Sigma）、STING激动剂ADU-S100（> 99%，MCE）、谷胱甘肽（GSH，> 99%，Roche）和Cy5-NH₂（Lumiprobe）等试剂均是购买后直接使用。Micro BCA试剂盒（Pierce，Thermo Scientific）、增强型ATP检测试剂盒（S0027，碧云天）、小鼠高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）（E-EL-M0676c， Elabscience）、小鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒（JN-029562-S，上海研域）、小鼠干扰素-

、干扰素-

（IFN-

、IFN-

）和细胞坏死因子-（TNF-

）ELISA检测试剂盒（Invivogen）、钙网蛋白（CRT）抗体（Ab2907，Abcam）、以及小鼠荧光标记的各种抗体（Biolegend）CD45-PerCP/Cyanine5.5、CD80-APC、CD86-PE、CD11c-FITC、CD11b-FITC、CD206- Alexa Fluor 647、F4/80-PE、CD4-PE、CD8-FITC、FoxP3- Alexa Fluor647和山羊抗兔-Alexa Fluor 633等试剂盒和抗体均购买后按说明书使用。小鼠乳腺癌细胞株4T1是从中科院上海细胞库购买。

聚合物的核磁共振氢谱（¹H NMR）由400 MHz超导核磁共振谱仪（Unity Inova，安捷伦）或600 MHz 超导核磁共振谱仪（DirectDrive2，瓦里安）以氘代氯仿（CDCl₃）或氘代二甲亚砜（DMSO-d₆）为溶剂测定，化学位移以溶剂峰为参考标准。聚合物分子量以及分子量分布由Waters 1515凝胶渗透色谱仪（GPC）测定，以DMF为流动相（流速为0.8 mL/min），测试温度为40℃，以一系列单分散的线性聚甲基丙烯酸甲酯作为分子量标准品。聚合物胶束和囊泡的粒径和粒径分布通过配有He/Ne激光光源（波长为633 nm）和173^o背折射检测器的ZetaSizer Nano-ZS纳米粒度仪（Malvern Instruments）测定，温度为25 ºC。胶束样品的微观形貌由Tecnai G220透射电镜（TEM）在120 kV加速电压下测定，样品用1% 磷钨酸溶液染色。PTX的浓度由配有反相C18色谱柱（4.6×150 mm，5μm）的高效液相色谱仪（HPLC）测试，流动相为 0.1%三氟乙酸的水/乙腈（v/v =45/55），流速为 1 mL/min，检测温度为40℃，检测波长为 227 nm。TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Leica）用来研究胶束的细胞内吞行为。流式细胞仪（FACS Calibur, BD Biosciences）用来研究胶束内吞行为以及体内免疫细胞的定性和定量分析。酶标仪（Thermo Multiskan FC）用来测定活细胞与MTT形成的紫色甲瓒在570 nm处的吸光度值。多功能酶标仪（Varioskan LUX，Thermo Scientific）用来进行细胞因子的ELISA检测。

本发明设计制备了纳米剂型的PTX 和CDN免疫佐剂，将其联合在以小鼠4T1为模型的TNBC中进行化学免疫治疗。首先制备了靶向、基于PEG-P(CL-DTC)的双硫交联的PTX胶束纳米药物，提高PTX在肿瘤细胞里的浓度、提高疗效、降低毒副作用，分别制备了偶联PHSCNK、PhScNK 多肽或cRGD多肽的纳米药物ATN1-Ms-PTX、ATN2-Ms-PTX和cRGD-Ms-PTX。另一方面，CDN由于分子量小、易被降解、带负电水溶性强，难以进入抗原递呈细胞（APC）和内质网的STING蛋白结合激活STING通路，为了克服这些问题，本发明制备了基于PEG-P(TMC-DTC)-Sp的具有不对称膜结构的聚合物囊泡来装载、保护和递送STING激动剂环二核苷酸ADU-S100（CPs-CDN）到APC，以更好地激活抗肿瘤免疫应答。研究发现，化学免疫疗法中化药和免疫调节剂的递送顺序会影响总体疗效。本发明首先用靶向TNBC的PTX胶束高效输送PTX至肿瘤，杀死部分肿瘤细胞并诱导免疫原性细胞死亡（ICD），产生肿瘤相关抗原并被APC有效内吞，从而增加CTL的激活；然后瘤内注射CPs-CDN激活STING通路，并进一步活化肿瘤里包括DC在内的APC，增强其递呈抗原的能力，招募并激活T细胞产生抗肿瘤免疫应答。实验结果表明，ATN2-Ms-PTX能高效靶向富集到小鼠4T1肿瘤，增加了PTX在肿瘤细胞的浓度，其后顺序递送CPs-CDN激活了STING通路，显著延缓了小鼠肿瘤的生长、抑制了肺转移，延长了小鼠的生存期。

本发明的原料都是现有产品，具体操作方法以及测试方法为本领域常规方法。本发明所有数据均是以平均值呈现，组间差异性由ANOVA单因素方差分析评估，*p < 0.05视为具有显著性差异，将**p < 0.01和***p < 0.001视为高显著性差异。

制备例

PEG-P(CL-DTC) 嵌段共聚物的合成是以MeO-PEG-OH (M _n = 2.0 kg/mol) 为大分子引发剂、磷酸二苯酯（DPP）为催化剂引发DTC和CL的开环聚合而得。具体地，在惰性气体手套箱里，向25 mL密闭反应器中依次加入MeO-PEG-OH (800 mg, 0.4 mmol)、DPP (1.0 g，4mmol)、DTC (400 mg，2.1 mmol) 、CL (400 mg，3.5 mmol) 和无水DCM（3.2 mL），搅拌溶解后密封，移出手套箱，置于40 ºC 油浴中磁力搅拌反应48 h。反应结束后，加入冰醋酸终止反应，在30倍体积的冰乙醚中沉淀2次，抽滤、真空干燥24 h后得到PEG_2k-P(CL_1k-DTC_1k)，制备路线如下所示：

用分子量为5000 Da的MeO-PEG-OH为引发剂、DPP为催化剂，根据上述方法可控开环聚合CL和DTC得到PEG-P(CL-DTC)，核磁分子量为5k-4k-3k或者5k-4k-2k。

用上述相同方法：不加DTC合成了PEG-PCL；以Mal-PEG-OH或NHS-PEG-OH（M _n = 3.5kg/mol）替换MeO-PEG-OH (M _n = 2.0 kg/mol)作为引发剂合成了Mal-PEG-P(CL-DTC)或NHS-PEG-P(CL-DTC)。

ATN-PEG-P(CL-DTC) 通过PHSCNK或PhScNK多肽与NHS-PEG-P(CL-DTC)通过酰胺化反应得到。简言之，在氮气保护下，将NHS-PEG-P(CL-DTC)（132 mg，0.024 mmol）溶解在1 mL无水DMSO中，PHSCNK多肽或PhScNK多肽（20 mg，0.028 mmol）溶解在0.5 mL无水DMSO中。将聚合物溶液滴加至30℃的多肽溶液中，30 min滴加结束后再加入7 μL的三乙胺调节体系pH在8.0，密闭反应器后再30度反应48 h。将反应液装入透析袋（MWCO 3500 Da）在DMSO中透析4 h、DCM中透析2 h，然后在30倍体积的冰乙醚/无水乙醇（9/1，v/v）中沉淀2次，离心、真空干燥24 h后得到ATN-PEG-P(CL-DTC)。¹H NMR（600 MHz，DMSO-d ₆ ）测试得到谱图可进行聚合物结构和分子量分析，用Micro BCA蛋白试剂盒测试可计算多肽的官能化度，计算出PhScNK和PHSCNK的官能化度分别为71.2%和79.6%。反应如下：

cRGD-PEG-P(CL-DTC) 由c(RGDfC) 多肽的巯基和Mal-PEG-P(CL-DTC) 通过迈克尔加成反应制得，其步骤、聚合物的提纯和表征同上。反应如下：

上述聚合物及表征请参见申请人同日提交的发明名称为“一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用”的发明申请，本发明与其一致。

将PTX和PEG_2k-P(CL_1k-DTC_1k) 按照质量比（1/20）溶于PEG 350中，其中聚合物浓度保持1 mg/mL。常规超声5 min后，在37℃取100 μL的该混合溶液打入900 μL的PB溶液底部（pH 7.4，10 mM），过程中静置不搅拌。打入之后用移液枪贴液面吹打5次，即得到PTX载药胶束，为非靶向小胶束纳米药物，DLS测定其粒径为27.8nm，粒径分布（PDI）为0.18。在上述方法基础上：将聚合物更换为PEG_5k-P(CL_4k-DTC_3k)，同样方法得到的PTX载药胶束，DLS测定其粒径为55.1nm，粒径分布（PDI）为0.27。如果混液过程中常规搅拌（600 rpm），其余不变，得到的PTX载药胶束粒径达到168 nm，且存放1小时即出现药物析出。将PEG 350更换为DMF或者DMSO，同样方法得到的PTX载药胶束，粒径较小，但是稳定性差，常规环境下存放4小时后，出现大量沉淀，说明药物明显析出，较本发明存放20天以上无药物析出差得多。

实施例一 化疗-免疫联合药物

PTX胶束的制备

将PTX和PEG_2k-P(CL_1k-DTC_1k) 按照不同质量比（5/100、10/100、20/100、30/100）溶于PEG 350，其中聚合物浓度在50 mg/mL。常规超声5 min后，在37℃取100 mL的该混合液打入900 mL的PB溶液底部（pH 7.4，10 mM），过程中静置不搅拌。打入之后用移液枪贴液面吹打5次，即得到PTX载药量为4.8 wt.%～23.1 wt.%的胶束MS-PTX，为非靶向小胶束纳米药物。DLS测定其粒径及粒径分布（PDI），TEM测定胶束形貌。用含20 mM DTT的乙腈溶解MS-PTX（聚合物浓度为0.1 mg/mL），再用HPLC测试其中PTX浓度，计算载药量和载药效率。用DLS在不同时间点监测PTX胶束在25和37℃存放、稀释至低浓度（20 mg/mL）及在含10%FBS溶液中粒径和粒径分布的变化，见表1。

作为对照，用相同方法也制备了基于PEG-PCL的载PTX胶束（ncMS-PTX）。

现有技术多数文献中报道的PTX纳米载体载药量均较低。本发明利用少量PEG350来溶解聚合物PEG-P(CL-DTC)和PTX，将混合物加入到水相中（PEG350的最终体积含量10%），通过疏水作用聚合物形成核壳结构的胶束把PTX包裹在疏水核中，而核中DTC可快速自交联，能更稳定地把PTX固定在胶束核中，得到PTX胶束纳米药物MS-PTX（图1 A）。这里使用的PEG350无毒，获FDA批准使用。本发明通过该方法制备了载药量从4.8 wt.%到23.1 wt.%的胶束MS-PTX，粒径范围在30-38 nm，粒径分布0.13-0.17（表1）。例如，DLS测试结果表明，载4.8 wt.%的MS-PTX粒径为32.7 nm，PDI为0.16，TEM图显示出其具有较规则的实心小球的形状（图1B）。此外，即使是理论载药量达23.1 wt.%时，MS-PTX胶束依然保持澄清透明，粒径为38.1 nm，PDI为0.13（表1）。由于PTX的水溶性很低（水中溶解度为5.56mg/L），将相同量PTX用PEG350 溶解后直接加入到水中，PTX迅速析出，而载23.1 wt.% PTX的MS-PTX能保持澄清，说明PTX全装载在胶束里面（图1 C）。使用该方法制备胶束纳米药物过程简单、重现性好、胶束的稳定性好，在室温存放三周后胶束的粒径和粒径分布也基本不变（图1 D），没有沉淀；这比基于PEG-PDLLA聚合物制备的Genexol-PM稳定得多，Genexol-PM在2～4 h内粒径会增大并且产生很多晶状沉淀。本发明制备的MS-PTX比文献中报道的脂质体和多数纳米载体及Genexol-PM（PTX载药量10 wt.%）具有更高的载药量。

研究了制剂中的PEG350对MS-PTX载药量和稳定性的影响，将1 mL新制的载药量为4.8 wt.%的MS-PTX（1 mg/mL）的一半室温存储，另一半装入透析袋（MWCO 3500 Da）中，放入50 mL PB溶液（pH 7.4，10 mM）中透析3 h（每30分钟换一次缓冲液）。测定透析后粒径及PDI变化和PTX载药量的变化。结果发现，除去PEG350后胶束的PTX载药量稍微降低，但包封率保持在87%以上，说明该方法能把PTX紧密包在胶束里；但是透析后胶束粒径减小6-8 nm，PDI变大（表2），室温下放置1 h就逐渐出现浑浊和PTX析出，在200-1000 nm出现聚集体（图1D），这与没有除去PEG350样品的稳定形成鲜明对比。

研究了聚合物中DTC对形成的PTX胶束载药量和稳定性的影响，相同条件制备的基于PEG-PCL载PTX不交联胶束ncMS-PTX和载4.8 wt.% PTX的PEG-P(CL-DTC)（MS-PTX），一半室温存放、一半透析，测定两组各种透析前后粒径及PDI变化和PTX载药量的变化，研究比较了ncMs和Ms两种胶束的紫外吸收、临界胶束浓度（CMC）以及两种载药胶束的稳定性。纳米粒中DTC的二硫戊环的330 nm的紫外吸收值降低很多，说明发生硫硫交联反应得到交联纳米粒。而本胶束在制备中由于没有透析，PEG350仍然存在，是否在制备后也能在胶束核内形成交联是不可预知的。本发明首先测定了两种胶束和相同浓度的对应聚合物溶液（5 mg/mL）的紫外吸收，发现PEG-PCL聚合物溶液及其胶束ncMs无明显的吸收峰。而Ms中DTC在326 nm出现二硫戊环的紫外吸收峰，但是其强度低于对应的聚合物溶液中DTC的强度（图1 E），下降了40.7%。这结果说明Ms胶束中部分二硫戊环开环，形成核内自交联。其次，用芘为荧光染料来确定两种胶束的临界胶束浓度（CMC），发现ncMs的CMC为15.6 mg/mL，但Ms在聚合物浓度为1.2 mg/mL至 2.5 mg/mL范围内I₁/I₃没有发现明显的转变（图1 F），即没有CMC，胶束在稀释到CMC以下时也不会解离成单分子。在实验中也发现将MS-PTX胶束浓度稀释到20 mg/mL测DLS时，胶束仍然完整，粒径呈正态分布，而ncMS-PTX胶束稀释至50 mg/mL时测试就出现聚集现象，PDI也迅速变大（图1 G）。此外，ncMS-PTX在室温下放置2天后变得不稳定，出现PTX析出以及大分子聚集（图1 G）。这些实验结果都证实了本发明制备的MS-PTX胶束是双硫交联的，这有助于进一步稳定PTX。综上，本发明基于PEG-P(CL-DTC) 的胶束MS-PTX比基于T_g高得多的PEG-PDLLA的Genexol-PM还稳定得多。

载STING激动剂CDN的聚合物囊泡CPs-CDN的制备

PEG-P(TMC-DTC)-SP的合成可参见申请人已经公开的专利或者文章，具体制备方法为现有技术。使用聚乙二醇-聚（三亚甲基碳酸酯-二硫戊环三亚甲基碳酸酯）-精胺（PEG-P(TMC-DTC)-Sp，M _n = 5.0-(15-2)-0.2 kg/mol）、通过溶剂置换法制备载CDN聚合物囊泡，CDN选用ADU-S100。简要步骤如下：配制PEG-P(TMC-DTC)-Sp的DMF溶液（10 mg/mL）和CDN水溶液（不含核糖核酸酶的DEPC水，2 mg/mL）。将100 µL聚合物溶液加入900 µL含CDN的4℃的HEPES缓冲溶液（pH 6.8），CDN理论载药量为13.0 wt.%。200 rpm搅拌10分钟后形成载药囊泡，先用HEPES在4度透析2 h，再用pH 7.4的PB透析1 h得到CPs-CDN（1 mg/mL），研究表征见实施例五。CPs-CDN的粒径、PDI及稳定性等表征方法同PTX胶束。CDN的载药量（DLC）和载药效率（DLE）通过测定NanoDrop 2000在寡DNA模式下260 nm处的吸光度值、基于标准曲线计算得来。

DLC (wt.%) =（CDN质量/CDN和聚合物的总质量）×100

DLE (%) = （CDN质量/投入的CDN质量）×100

PTX胶束与载STING激动剂CDN的聚合物囊泡CPs-CDN组成化疗免疫联合药物。

此外，Ms-PTX在含10%FBS的PB缓冲液中（模拟体内血液环境）保持稳定，24 h粒径保持不变（图2 A）；然而在含10 mM DTT的PB溶液（模拟细胞质内还原环境）中其粒径在2 h时很快出现500-1000 nm的大颗粒，4 h时出现十几纳米的小颗粒（图2 B），这是由于疏水核中的二硫键在还原条件下逐渐解交联、胶束溶胀、在低聚合物浓度下会解离成单分子的缘故。这表明该胶束具有快速还原响应性能。

实施例二

装载PTX的靶向胶束是由两亲性嵌段聚合物PEG_2k-P(CL_1k-DTC_1k)和偶联靶向分子的聚合物Ta-PEG-P(CL-DTC)（Ta为多肽cRGD、ATN1或ATN2）在水相中自组装而成。在PEG-P(CL-DTC) 中分别混合重量百分含量为2.5%、5%、7.5%、10%或20%的ATN1-PEG-P(CL-DTC)、ATN2-PEG-P(CL-DTC)或cRGD-PEG-P(CL-DTC) 作为起始的聚合物溶液，然后和PTX溶液混合，其余步骤同实施例一，得到不同多肽表面密度的胶束ATN1-MS-PTX、ATN2-MS-PTX和cRGD-MS-PTX，为靶向小胶束纳米药物。

PEG-(CL-DTC)和不同比例的偶联cRGD、PHSCNK或PhScNK的靶向聚合物混合后，制备靶向胶束，采用实施例一相同方法、保持PTX载药量为4.8 wt.%，分别制备了三个系列具有不同靶向分子密度的胶束cRGD-MS-PTX、ATN1-MS-PTX和ATN2-MS-PTX。DLS测试结果表明，在表面多肽不超过5%时，随着多肽的增加，胶束粒径基本不变，在31到35 nm之间，PDI保持在0.2左右（表3）。此外，以PTX载药量为4.8 wt.%、多肽密度为5%的 ATN2-MS-PTX为例，研究了其中PEG350及DTC对胶束稳定性、FBS稳定性，以及冷冻/冻干复溶对粒径的影响，发现结果与非靶向MS-PTX相同。研究了PTX胶束在模拟细胞中还原响应环境的药物释放行为，分别用含或不含10 mM DTT的PB溶液（含0.1%吐温80）作为释放介质，以ATN2-MS-PTX为例研究了在不同时间点释放到介质中的PTX的累积量。发现浓度为0.5 mg/mL的胶束在10 mM DTT中能够快速释放PTX，24 h的释放PTX累积量达79.4%；而在不含DTT环境中PTX 24 h仅泄漏17.0%（图2C），结果表明胶束结构因为DTC交联而保持相对稳定、药物始终释放缓慢；而在还原条件下，双硫键断裂生成的巯基有一定的亲水性，胶束在较稀浓度下很难维持胶束结构，药物快速释放，呈现出明显的还原响应性药物控释行为。

采用同样的步骤，由两亲性嵌段聚合物PEG_2k-P(CL_1k-DTC_1k)和偶联靶向分子的聚合物Ta-PEG_2k-P(CL_1k-DTC_1k)（重量百分含量为5%）在水相中自组装而成装载PTX的靶向胶束；Ta为多肽cRGD、ATN1或ATN2对应的粒径分别为27 nm、29 nm 和28nm。

本发明制备了PTX载药量高的胶束，且制备的小粒径胶束（20～40 nm），能够有效穿透至肿瘤深处，尤其是本发明载药过程中无药物析出，静置三周也无药物泄露，采用的小分子量PGE无需去除。

实施例三 MTT实验评估PTX胶束的细胞毒性

具体测试方法为现有方法，可以参见申请人同日提交的发明名称为“一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用”的发明申请，本发明与其一致。细胞选用小鼠高转移性三阴乳腺癌细胞株4T1，PTX浓度范围为0.002至5 μg/mL。本发明以鼠源三阴乳腺癌4Tl细胞为研究对象，用MTT法研究了不同靶向分子密度的三种胶束的细胞毒性。结果表明，MS-PTX对4T1的毒性具有浓度依赖性，IC₅₀为0.6 μg/mL，明显低于PTX（IC₅₀为1.12 μg/mL），偶联靶向分子的胶束均表现了比MS-PTX更高的毒性（图3）。三种胶束对4T1的毒性不尽相同，整体来看，ATN2-MS-PTX比cRGD-MS-PTX毒性略高，远高于ATN1-MS-PTX；5%cRGD-MS-PTX、20%ATN1-MS-PTX、5%ATN2-MS-PTX在各组中相对其他多肽密度胶束具有最低的IC₅₀值，分别为0.27、0.46、0.21 μg/mL（表4），其中5%ATN2-MS-PTX的IC₅₀值最低，甚至低于自由PTX与4T1细胞共孵育48h的IC₅₀值（0.55 μg/mL）。

进一步考察了5%ATN2-MS-PTX与4T1细胞共孵育24 h和48 h的细胞毒性（IC₅₀值分别为0.54 和0.020 μg/mL），发现该IC₅₀值均比无靶胶束（分别为1.19和0.064μg/mL）的低2-3倍。此外，空胶束Ms和ATN2-Ms在浓度1 mg/mL时共孵育48 h对4T1细胞均没有显示出毒性，这说明该方法制备的纳米载体具有良好的生物相容性。

实施例四 PTX胶束的细胞内吞行为研究

用流式细胞术FACS和CLSM来考察4T1细胞对PTX胶束的摄取，通过NHS-PEG-P(CL-DTC)与Cy5-NH₂的酰胺化反应得到Cy5标记的PEG-P(CL-DTC)，并将其按照1% 掺杂到原聚合物中得到Cy5标记的胶束。具体测试方法为现有方法，可以参见申请人同日提交的发明名称为“一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用”的发明申请，本发明与其一致。用水合法制备即得到Cy5标记的胶束，不同靶向密度均选用表4中的最佳靶向密度。M _n = 5.0-(15-2)-0.2 kg/mol）

FACS测试结果显示（图4 A），和Cy5/cRGD-MS-PTX、Cy5/ATN2-MS-PTX孵育4 h后的4T1细胞的荧光强度是对照无靶Cy5/MS-PTX组细胞的2.1倍和2倍，而Cy5/ATN1-MS-PTX与无靶组相比只有1.2倍。通过CLSM观察到，4T1细胞经含Cy5胶束孵育4 h后，各靶向胶束的荧光强度均高于无靶组，其中Cy5/ATN2-MS-PTX组最高，与PBS 和Cy5/cRGD-MS-PTX组都存在显著性差异（图4 B，*p），且Cy5/ATN2-MS-PTX组Cy5荧光出现在每个细胞的细胞质中。而Cy5/cRGD-MS-PTX和Cy5/ATN1-MS-PTX组中均有部分细胞的细胞质中没有Cy5荧光（图4 C）。

实施例五 载STING激动剂的聚合物囊泡CPs-CDN的表征

由于STING蛋白一般驻留在APC中，所以要激活STING通路，其激动剂如环二核苷酸（CDNs）必须递送到APC内。但CDN分子量小、带负电荷、亲水性强，进入胞质能力差，易降解，导致其生物利用率不高，效果大打折扣。为了将CDN有效递送至APC胞质中激活STING通路，本发明设计基于DTC的还原敏感、双硫交联的聚合物囊泡来实现这一目标，利用聚合物PEG-P(TMC-DTC)-Sp形成的具有不对称膜结构的聚合物囊泡（CPs）来递送CDN。为了验证该CPs是否能稳定装载分子量小的CDN并递送到APC中，选用目前临床II期试验中的ADU-S100为模型CDN展开研究。采取溶剂置换法制备装载CDN的囊泡CPs-CDN（图5 A），CDN的装载效率用NanoDrop 2000测定。实验结果表明，在CDN理论载药量为16.7 wt.%时，其包封率和载药量分别能达86.4%和14.4 wt.%（表5）。考虑到CDN的小分子量和强亲水性，这样高的载药量还是令人意想不到的，CPs-CDN的粒径为55.3-56.8 nm，PDI为0.12-0.18，具有良好的胶体稳定性，在4度冰箱中能储存3周且在含有10%胎牛血清（FBS）中能保持粒径不变（图5B）。

以5%ATN2-Ms-PTX、CPs-CDN（CDN理论载药量为13.0 wt.%）组成化疗免疫联合药物，进行细胞、动物实验。

实施例六PTX胶束、CPs-CDN及其联合激活BMDC的研究

BMDC（1×10⁶个/孔）在12孔板中培养24 h后加入PBS、PTX、Ms-PTX、ATN2-Ms-PTX、CDNs和CPs-CDN孵育24 h，联合组是先加ATN2-Ms-PTX孵育8 h后再加CPs-CDN共孵育16 h，最终PTX浓度为5 µg/mL，CDN浓度为0.2 µg/mL（n = 3）。孵育结束后离心（1500 rpm，5min），分离出上层培养基，收集细胞后用荧光标记的CD11c、CD80和CD86抗体按说明书来染细胞，最后用FACS测试各组中总CD11c⁺ BMDC的量和CD11c⁺CD80⁺CD86⁺成熟BMDC的含量。分离的培养基用ELISA试剂盒测定IFN-β、TNF-α和IL-6浓度。

STING激动剂CDN进入DC等APC中与内质网上的STING蛋白结合，诱导I型干扰素（IFN-β）等细胞因子的产生，从而激活相关免疫细胞的成熟递呈抗原给T细胞，招募更多的免疫细胞进入肿瘤区域；但是不可预知CPs-CDN中CDN由于装在囊泡里面是否还能实现这样的功能，本发明检测了CPs-CDN及自由CDN和BMDC孵育16 h后CD11c⁺的DC细胞以及CD11c⁺CD86⁺CD80⁺的成熟BMDC的比例。此外，结合ATN2-Ms-PTX可诱导ICD，产生一系列肿瘤抗原，并能使BMDC增殖与成熟。因此，用ATN2-Ms-PTX处理使BMDC增殖，之后再联用CPs-CDN也能增加CDN进入DC的量，会增强STING通路的激活，从而增加BMDC的成熟量；另一方面，ATN2-Ms-PTX诱导的TAA能更有效地被这些激活的APC呈递给T细胞，从而招募更多的T细胞。检测了两者与BMDC孵育后其表达CD11c⁺的BMDC的量以及成熟BMDC比例的变化，来研究联合是否对BMDC的增殖、成熟有更强劲的提升。FACS测试结果表明，相比于PBS组，CDN制剂和联合组都能在促进总CD11c⁺的BMDC含量，而CPs-CDN组中成熟 BMDC（81.7%）远高于自由CDN组（66.9%）（***p）（图6 A&B），表明CPs的装载不但没有影响CDN的细胞内释放和功能，反而具有更高的刺激BMDC成熟的能力。此外，联用ATN2-Ms-PTX能进一步增加BMDC成熟，CD11c⁺CD80⁺CD86⁺的BMDC高达90.2%，比单用任何一种要显著高（*p/***p）。此外，也测定了BMDC培养基中IFN-β、TNF-

和IL-6的浓度。细胞因子的增多表明BMDC成熟，抗原呈递能力增强，可极强地激活T细胞，其中IFN-β是CDN与STING结合后产生的标志性细胞因子，对肿瘤引发T细胞启动具有关键作用。结果显示，三个CDN制剂组诱导的IFN-β是PBS和ATN2-Ms-PTX组的两个数量级以上，体现了CDN的强烈激活STING通路的功能。先用ATN2-Ms-PTX再用CPs-CDN的联合组处理细胞，分泌的IFN-β、TNF-

和IL-6的浓度显著高于CPs-CDN组和ATN2-Ms-PTX组（*p/***p）和自由CDN组（**p/***p）（图6 C、D&E）。这些结果表明，CPs-CDN提升了CDN对DC激活的功能，和ATN2-Ms-PTX联用能更显著促进BMDC的增殖和激活、激活STING通路、诱导IFN-β等细胞因子，更有效促进BMDC成熟并递呈抗原给T细胞。

实施例七 PTX胶束联合CPs-CDN用于小鼠TNBC的化学免疫治疗

采用荷4T1皮下瘤的Balb/c小鼠作为小鼠三阴乳腺癌模型，初步考察Ms-PTX的药效、给药方式以及和CPs-CDN联用对肿瘤抑制的影响，在15只荷瘤小鼠的肿瘤体积为200-250 mm³时开始给药，给药当天为第0天。共分5组，每组3只小鼠，每2天给药、共3次。组1：Ms-PTX尾静脉（i.v. 10 mg PTX/kg，200 µL）；组2：Ms-PTX瘤内注射（i.t. 5 mg PTX/kg，50 µL）；组3：Ms-PTX尾静脉（i.v. 10 mg PTX/kg，200 µL）给药2h后瘤内注射CPs-CDN（1 mgCDN/kg）；组4：Ms-PTX瘤内注射（i.t. 5 mg PTX/kg，50 µL）给药2h后瘤内注射CPs-CDN（1mg CDN/kg）；组5：PBS。每2天监测肿瘤体积和小鼠体重，肿瘤体积通过公式V = 0.5×L×W²来计算（L、W分别为肿瘤最宽和最窄处的长度）。小鼠相对体重是测量时体重占第0天时体重的百分比（M/M₀）。发现无论是静脉或瘤内注射Ms-PTX，肿瘤体积持续增加，和PBS组生长曲线相似，这和起始肿瘤体积过大、该肿瘤的恶性程度和侵袭性很高有关。而联合CPs-CDN给药时，两种方式均比单给Ms-PTX有显著的肿瘤抑制作用，其中Ms-PTX i.v. + CPs-CDNi.t. 组肿瘤抑制最显著（**p/***p），前10天肿瘤体积没有增长，10天后开始缓慢增长（图7A）。相比之下，Ms-PTX i.t. + CPs-CDN i.t. 组肿瘤一直有缓慢的增长。这和Ms-PTX瘤内注射PTX浓度过高，杀死肿瘤细胞的同时也杀死免疫细胞有关，导致再给CPs-CDN也不能被很多APC内吞，整体STING激活程度差，产生的免疫应答较弱。而Ms-PTX尾静脉注射后，短时间富集至肿瘤的Ms-PTX相比要少、PTX浓度低，对免疫细胞无毒，却可诱导肿瘤细胞ICD、使DC增殖；在给CPs-CDN后就能在大量DC中激起强免疫应答。但是，Ms-PTX i.v. + CPs-CDNi.t. 组小鼠体重在给药期间有下降，而后又恢复（图7 B）。

系统研究PTX胶束以及其联合CPs-CDN的化学免疫治疗。在接种4T1（3×10⁵/只）的荷瘤小鼠的肿瘤体积在50-100 mm³（接种后第6天）开始给药，给药当天为第0天。小鼠随机分9组，每组7只，每两天给药，共4次；给药剂量为7.5 mg PTX/kg和/或1 mg CDN/kg。九组分别为：PBS、自由PTX（i.v.）、Ms-PTX（i.v.）、ATN2-Ms-PTX（i.v.）、自由CDN（i.v.）、CPs-CDN（i.t.）、三个ATN2-Ms-PTX（i.v.）+ CPs-CDN（i.t.）联合组，分别是ATN2-Ms-PTX（i.v.）给药2 h、8 h或24 h后再给CPs-CDN（i.t.）。实验过程中每2天监测小鼠体重、肿瘤体积和小鼠状态。小鼠死亡或肿瘤体积大于2000 mm³判定死亡，绘制生存曲线。给荷瘤（肿瘤体积约50mm³）小鼠每2天尾静脉注射肿瘤靶向的ATN2-Ms-PTX，并把药量降低到7.5 mg/kg，共给药4次；在每次ATN2-Ms-PTX给药之后再瘤内注射CPs-CDN（1 mg/kg），研究该方案对小鼠肿瘤尺寸、体重和生存期的影响，当肿瘤体积大于2000 mm³时，判定小鼠死亡（#号表示）。系统比较该方案与单给ATN2-Ms-PTX、Ms-PTX、自由CDN或CPs-CDN的抗肿瘤效果。此外，还研究了ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN之间的给药间隔时间（2、8或24 h）对抗肿瘤效果的影响（图8 A）。

结果显示，4T1肿瘤的恶性程度极高，PBS组肿瘤快速增长（图8 B），到第20天肿瘤体积均大于2000 mm³，中位生存期为18天。自由PTX组在给药期间肿瘤缓慢生长，停药后开始快速生长。而ATN2-Ms-PTX、Ms-PTX、自由CDN、CPs-CDN与联合给药各组均能显著抑制肿瘤的生长，10天内肿瘤基本不长，但10-12天开始肿瘤都开始缓慢生长，其中联合组的肿瘤生长最慢。比较第22天肿瘤体积可知，Ms-PTX可能由于小粒径而使其EPR效应显著，比PTX能更有效抑制肿瘤生长（*p）。而ATN2-Ms-PTX则能比PTX和Ms-PTX更进一步限制肿瘤生长（***p）（图8 B），延长小鼠的生存时间，体现了靶向抗肿瘤疗效。此外，瘤内给CDN或CPs-CDN也能减缓肿瘤生长速度，CDN减缓程度与MS-PTX相似，CPs-CDN和ATN2-Ms-PTX类似，但CPs-CDN与自由CDN相比优势更显著（**p），再次表明囊泡能更高效地递送CDN，提高其生物利用率和激活STING通道的能力（图8 B）。

令人兴奋的是，ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN联用的抑瘤效果比单药组都更强，且二者间隔8或24 h比间隔2 h的疗效更佳（ATN2-Ms-PTX+CPs-CDN（2或8或24 h）vs ATN2-Ms-PTX，p = 0.1656（ns）或p = 0.0042（**）或0.0068（**）；ATN2-Ms-PTX+CPs-CDN（2或8或24 h）vsCPs-CDN，p = 0.2872（ns）或p = 0.0099（**）或0.0158（*））。联合组间隔2、8、24h组的小鼠中位生存期分别30、32、33天（PBS组为18天）（图8 C）。联合给药间隔2 h效果差些，可能是由于间隔太短，PTX释放量不多和/或诱导ICD及促使DC增殖的程度还不足，导致APC的抗原递呈作用弱。研究发现，在“癌症-免疫周期”的循环中，不仅需要TAA的释放，同时需要APC的加工和递呈，激活T细胞，募集更多T细胞至肿瘤，从而识别杀伤肿瘤，每一环节都很重要。循环过程某一项被抑制或不足，都将使抗肿瘤免疫无法达到最佳状态。此外，小鼠在治疗期间体重变化很小，尾静脉给7.5 mg PTX/kg和/或瘤内给1 mg/kg的CPs-CDN都没有对小鼠产生毒副作用（图8 D）。

实施例八 ATN2-Ms-PTX及其与CPs-CDN联合对荷瘤小鼠免疫系统的调节

同实施例七描述，荷瘤小鼠随机分7组，每组7只。七组分别为：PBS（i.v.）、自由PTX（i.v.）、Ms-PTX（i.v.）、ATN-Ms-PTX（i.v.）、自由CDN（i.v.）、CPs-CDN（i.t.）、ATN-Ms-PTX（i.v.）+ CPs-CDN（i.t.）（间隔8 h），按照7.5 mg PTX/kg和/或1 mg CDN/kg给药4次，每2天一次。最后一次给药后24 h每组处死4只小鼠，取小鼠全血分离血清测定IFN-β、IFN-

、IL-6和TNF-

的含量。取脾脏和肿瘤，研磨成单细胞悬液，裂红后计数。对脾脏，每个样品6×10⁶个细胞进行T细胞染色。对肿瘤，每个样品分为4份，每份6×10⁶个细胞，进行DC、巨噬细胞、T细胞染色，通过FACS测试分析。免疫细胞相应的荧光标记的抗体为：DC：anti-CD11c-FITC、anti-CD80-APC、anti-CD86-PE；巨噬细胞：anti-CD11b-FITC、anti- F4/80-PE、anti-CD206- Alexa Fluor 647；T细胞：anti-CD3-APC、anti-CD4-PE、anti-CD8-FITC；Tregs：anti-CD3-FITC、anti-CD4-PE、anti-Foxp3- Alexa Fluor 647。

肿瘤免疫微环境（TME）是由恶性细胞、免疫细胞、血管、细胞外基质和信号分子组成的环境，可单独发挥作用，也可共同影响免疫疗法的敏感性。上文已证明，ATN2-Ms-PTX、CPs-CDN联合药物可进入肿瘤细胞诱导ICD、释放肿瘤相关抗原，产生有利的免疫微环境，进入APC激活STING通道使DC成熟，两者联合在细胞层面已经展现出了优异的免疫效果。这里将分析ATN2-Ms-PTX、CPs-CDN及其联合按图8方案给药24 h后小鼠TME以及脾脏中T细胞的影响。首先分析了TME中CD80⁺CD86⁺ 成熟DC和CD206^-的M1M的含量，图9 A显示，PTX胶束成熟DC比例都要比PBS高，CDN胶束更高些，CPs-CDN组成熟DC 为52.5%高于自由CDN（48.7%）；而联合组成熟DC（62.9%），显著高于分别单药组（*p）。前面细胞实验中，PTX可使巨噬细胞从M2M转化为M1M。在TME中，ATN2-Ms-PTX、CPs-CDN及联合给药均能促进了M2M极化为M1M（图9B）。

T细胞是人体攻击和杀灭肿瘤的免疫细胞，参与抗肿瘤免疫的T细胞亚群分为两类：CD8⁺细胞毒性T细胞（CTL）和CD4⁺辅助性T细胞（T_h细胞），而T_h又可产生淋巴因子增强CTL功能，激活巨噬细胞、DC或其他APC，产生肿瘤坏死因子发挥溶瘤作用。见图9 C-E，结果显示，ATN2-Ms-PTX+CPs-CDN联合组的CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞比ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN都显著提升（CD4⁺ T：***p和**p；CD8⁺ T：*p）。另外，T_h中的调节性T细胞（T_reg）是减弱T细胞活性、使TME免疫抑制的T细胞的主要类型。分析了T_regs在CD4⁺ T中的占比及CD8⁺ T/T_reg，结果表明（图9F&G），CPs-CDN能急剧降低T_reg比例，与联合组相当。此外，CPs-CDN组的CD8⁺ T/T_reg显著高于自由组CDN（***p）。文献报道，STING激活程度越大，CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫力越强，也正因为CPs-CDN高效的CDN利用率，使其单独使用也能有效激活抗肿瘤免疫。联合组能强效激发T细胞的杀伤能力，其CD8⁺ T/T_reg进一步增强，是ATN2-Ms-PTX的14倍（***p）、CPs-CDN的3.4倍（*p）。ELISA测试结果表明，ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN联用组的促炎细胞因子IFN-

、IFN-γ、TNF-α和IL-6含量均增加（图9 H），这些结果充分证实了其能诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。

脾脏是人体最重要的免疫器官，含有丰富的免疫细胞，拥有全身25%的淋巴细胞。脾脏对T淋巴细胞的免疫调节作用是抗肿瘤免疫的一个重要环节。接着，分析了ATN2-Ms-PTX及其与CPs-CDN联合给药后小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞占CD45⁺总免疫细胞的比例。图10显示，各组药物给药后第8天小鼠脾中的CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞的变化趋势和肿瘤中的一致，联合组占二者比分别高达18.7%和6.3%，分别是单制剂ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN组的1.3/1.4倍（CD4+：**p/*p）和2.1/1.5倍（CD8+ ***p/*p）。因此，联合组有效促进了脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用，增加了CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞的比例，有效增强抗肿瘤免疫应答。

实施例九 ATN2-Ms-PTX与CPs-CDN联合对荷瘤小鼠的毒性研究

随着4T1乳腺癌病情的发展，小鼠的血液系统以及器官会受到一定影响；而长期用药也会给小鼠带来全身累计毒性。为了研究本发明设计使用的PTX胶束和CDN囊泡制剂及其联合对荷瘤小鼠的全身累计影响或毒副作用的改善，按图8方案给药第22天，每组牺牲3只小鼠，取全血进行血常规检测、分离血清进行血生化检测，并解剖取主要脏器观察并切片，用H&E染色进行组织学分析。

血常规结果显示（图11 A），荷瘤小鼠血液（PBS组）中白细胞（WBC）数大量增多，是正常Balb/c小鼠的91倍（**p），与文献报道一致。其中的中性粒细胞数（Neut）（*p）和淋巴细胞数（Lymph）（**p）升高最显著，这是由于肿瘤的生长和转移，以及出现了一些炎症导致的。红细胞数（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）、红细胞压积（HCT）较正常小鼠有所下降，这主要是由于荷瘤小鼠出现贫血。此外，PBS组小鼠血液中的血小板数（PLT）、血小板压积（PCT）和平均血小板浓度（MPV）均有增加，这将增加血栓发生的概率。有研究表明，血小板有助于肿瘤细胞的存活和转移，因此血小板的增加也促使了4T1乳腺癌发生转移。和PBS组小鼠相比，自由PTX或自由CDN组治疗小鼠的血常规指标基本无缓解，ATN2-Ms-PTX或CPs-CDN单制剂治疗的小鼠血常规指标均有所缓解；而ATN2-Ms-PTX与CPs-CDN联合给药的小鼠血液中的WBC总量以及WBC中的Neut和Lymph、RBC、HGB、HCT、PLT、PCT和MPV均接近健康小鼠，进一步说明联合治疗对肿瘤的抑制效果明显、减少了肿瘤转移、避免小鼠发生贫血以及形成血栓。血生化检测表明，主要肝（碱性磷酸酶ALP、谷氨酰基转移酶GGT、天门冬氨酸氨基转移酶AST、丙氨酸氨基转移酶ALT）、肾（肌酐CRE、尿素URE）功能的各项指标与正常Balb/c小鼠的无显著性差异（图11 B）。

荷瘤小鼠主要脏器的H&E染色切片（图12）显示，各组小鼠心、肝、肾没有出现明显的组织损伤。但PBS组、CDN和CPs-CDN组小鼠心脏有少许炎症，而PTX制剂各组和联合组小鼠心脏正常；除ATN2-Ms-PTX与CPs-CDN联合组，其他组小鼠肝脏均有轻微炎症发生。此外，PBS组小鼠脾脏显著增大、质量增加（图13），Yong等人也发现荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠有脾肿大现象。治疗组小鼠脾脏的质量和肿瘤大小呈现正相关，即肿瘤越小，脾越小。其中联合组脾最小（约0.15 g，和健康小鼠接近），和ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN单制剂组相比具有显著性差异（***p和*p）。从脾的H&E染色（图12）可以看到，PBS组白髓明显减少，红髓变多，这是4T1小鼠病程发展的标志之一。治疗组尤其是联合组具有丰富的白髓，说明阻止了乳腺癌病程的发展。以上结果说明，尾静脉给7.5 mg PTX/kg及瘤内注射1 mg CDN/kg及其联合给药，每2天给药、共4次的方式对小鼠没有明显毒性。

实施例十 ATN2-Ms-PTX与CPs-CDN联合抑制4T1乳腺癌的肺转移

在给药第22天，给小鼠腹腔注射荧光素钾盐，10分钟内处死每组剩余的3只小鼠，取全血进行血常规分析、分离出血清进行血生化分析。此外，解剖小鼠，取和心、肝、脾、肺、肾等器官，用组织固定液固定、切片、石蜡封切。切片用苏木精和伊红（H&E）染色，显微镜观察切片进行组织学分析和肺转移判断。由于TNBC具有高浸润性及高转移性，本发明也研究了PTX胶束和CDN囊泡及ATN2-Ms-PTX与CPs-CDN联合对荷4T1-luc乳腺癌肺转移的抑制。同图8方案给药后22天，解剖取肺部、称重以及离体成像、切片H&E染色做组织学分析。肺部成像及荧光定量结果显示（图14 A&B），PBS和自由PTX组小鼠发生了严重的肺转移，自由CDN和Ms-PTX组肺部荧光有显著下降（***p），而ATN2-Ms-PTX、CPs-CDN及联合联合能更有效抑制肺转移，分别为PBS组的22.8、19.3和107.7倍（***p）。其中ATN2-Ms-PTX较Ms-PTX也具有明显的肺转移抑制（*p），说明了ATN2能精准靶向到4T1上。ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN联合组小鼠肺部几乎检测不到荧光信号（ 8.9×10⁵ p/s）；该组肺的质量最小，约0.10 g，和健康小鼠接近；而其他组肺转移瘤越多，质量也大（图14 C），证明了ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN联合治疗能最有效抑制4T1的肺转移。此外，肺部H&E染色图片显示，PBS组和自由PTX小鼠肺部存在大量肿瘤细胞和炎症细胞的浸润，几乎没有肺泡结构；Ms-PTX组有所改善，ATN2-Ms-PTX相比没有明显的肿瘤细胞群，但也存在肿瘤细胞和炎症细胞的浸润，肺泡结构也不明显。CPs-CDN组比自由CDN组能看到大片的肺泡结构，肿瘤浸润少，但也存在炎症。形成鲜明对比的是，ATN2-Ms-PTX和CPs-CDN联合组肺部切片看不到肿瘤细胞和炎症细胞，生理结构和正常小鼠无异，肺泡多且都有明显的中空结构（图14 D），结果和生物发光图吻合。结果证明本发明化疗与免疫药物相结合不仅能有效抑制原发性TNBC肿瘤，也能显著抑制其肺转移，尤其是，联合组显著延长了小鼠的中位生存期（33天）。

Claims (10)

1.一种化疗免疫联合药物，由化疗药物胶束与囊泡纳米STING激动剂组成，其特征在于，所述化疗药物胶束的制备方法为，将小分子药物、两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；或者将小分子药物、两亲性聚合物、靶向两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；所述低聚乙二醇的分子量为200～600；所述囊泡纳米STING激动剂由聚合物囊泡装载STING激动剂组成。

2.根据权利要求1所述化疗免疫联合药物，其特征在于，小分子药物包括紫杉醇；所述低聚乙二醇的分子量为200～600；STING激动剂为环二核苷酸。

3.根据权利要求1所述化疗免疫联合药物，其特征在于，两亲性聚合物为PEG-P(CL-DTC)、PEG-P(TMC-DTC)、PEG-P(LA-DTC)中的一种或几种；靶向两亲性聚合物为所述两亲性聚合物偶联靶向分子；聚合物囊泡中，聚合物包括亲水链段、疏水链段以及阳离子片段，所述疏水链段的侧链为含双硫键的二硫戊环。

4.权利要求1所述化疗免疫联合药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1所述化疗免疫联合药物的制备方法，其特征在于，将小分子药物、两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；或者将小分子药物、两亲性聚合物、靶向两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；将STING激动剂溶液加入缓冲溶液中，再加入聚合物溶液，搅拌后透析，得到囊泡纳米STING激动剂；由化疗药物胶束与囊泡纳米STING激动剂组成化疗免疫联合药物。

6.根据权利要求5所述化疗免疫联合药物的制备方法，其特征在于，将小分子药物、两亲性聚合物、靶向两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液中，靶向两亲性聚合物的用量为聚合物总重量的1～30%。

7.根据权利要求5所述化疗免疫联合药物的制备方法，其特征在于，制备囊泡纳米STING激动剂时，所述聚合物的化学结构式如下：

R为亲水链段；T链段与侧链含二硫戊环的碳酸酯链段组成疏水链段；T为环酯单体或者环碳酸酯单体形成的单元；P为阳离子片段；y、z表示重复单元。

8.根据权利要求7所述化疗免疫联合药物的制备方法，其特征在于，所述阳离子片段为聚乙烯亚胺或者精胺。

9.权利要求1所述化疗药物胶束与囊泡纳米STING激动剂在制备化疗免疫联合药物中的应用。

10.PTX与STING激动剂在制备化疗免疫联合药物中的应用。

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