CN113368053B - 一种装载溶瘤肽的聚合物囊泡及其与囊泡免疫佐剂、pd-1单抗的联合用药 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种装载溶瘤肽的聚合物囊泡及其与免疫佐剂、抗体的联合药物与应用。将聚合物溶液与溶瘤肽溶液混合，然后透析，得到装载溶瘤肽的聚合物囊泡；将聚合物溶液与免疫佐剂溶液混合，然后透析，得到装载免疫佐剂的聚合物囊泡。本发明的联合药物系统给药方法能够有效靶向肿瘤处并重塑肿瘤微环境，在增加肿瘤浸润T细胞的同时降低发挥免疫抑制作用的Treg，从而显著地增加了IL‑6,TNF‑α和IFN‑γ的含量，并且增加了脾脏中的TCM和TEM含量，从而实现了强效而长期的免疫记忆。本发明的系统给药方法能够明显地拓宽溶瘤肽和CpG ODNs的使用窗口，为无法瘤内注射的肿瘤或是转移性浸润的肿瘤提供了一种新的治疗方案。

Description

一种装载溶瘤肽的聚合物囊泡及其与囊泡免疫佐剂、PD-1单 抗的联合用药
技术领域
本发明属于药物技术，具体涉及装载溶瘤肽LTX-315的聚合物囊泡与囊泡CpGODNs佐剂和PD-1抗体的联合系统递送用于黑色素瘤的免疫治疗。
背景技术
现代生物技术推动了多种多样的多肽药物的发展，其中很大一部分在抗癌药物方面有着出色的潜力。其中，宿主防御肽，或者又被称为阳离子抗菌肽（Cationicantimicrobial peptides, CAPs）能够通过破坏细胞膜以及线粒体膜从而展现出了高效的杀伤癌细胞的能力。有趣的是，LfcinB25和LfcinB6两种多肽在抗菌和抗癌方面展现出了比其亲本蛋白牛乳铁蛋白（BLF）更强的活性。同样来源于乳铁蛋白的LTX-315是一种溶瘤肽，在几个临床前模型中，通过瘤内注射LTX-315能够导致特异性的免疫反应和肿瘤消退，然而根据研究表明，在接受LTX-315治疗后，一些高恶性肿瘤会出现复发或转移，以及肿瘤中PD-L1的表达会出现上调，另外，LTX-315也仅限于瘤内给药，在血液中降解较快，不适用于一些无法通过瘤内给药或转移性的肿瘤。不仅如此，溶瘤肽的阳离子性和两亲性也给开发系统递送带来了巨大的挑战。
这些年来，免疫治疗已经成为了治疗癌症或延缓肿瘤进展的一种极为有效地方式，近年来有多种抗体，包括CTLA-4抗体、PD-1抗体和PD-L1抗体被用于治疗肺癌、黑色素瘤和肝癌并展现出了一定的疗效，然而总体的有效率仅约20~30%。值得注意的是，免疫佐剂CpG ODNs（CpG）用于增强免疫治疗效果，然而，CpG由于其进入细胞的能力较差，通常是在肿瘤内或肿瘤周围注射，限制了其在很多肿瘤中的应用。
发明内容
本发明设计了环肽cRGDfK功能化修饰的、具有不对称膜结构的聚合物囊泡（cRGD-CPs）作为溶瘤肽LTX-315（cRGD-CPs-L）的全身系统递送的高效稳定载体，同时结合囊泡CpG佐剂和PD-1抗体，显著增强了对小鼠恶性B16F10黑色素瘤的免疫治疗的效果。聚合物囊泡是为数不多的能够装载水溶性药物（包括小分子药物、siRNA和蛋白质）并且递送至肿瘤的载体系统之一。为了实现LTX-315和CpG ODNs的有效装载，cRGD-CPs的内壳分别被设计为带有负电荷的聚天冬氨酸和带有正电荷的精胺，通过系统注射cRGD-CPs-L能够有效诱导B16F10黑色素瘤的免疫原性死亡，并且通过与cRGD-CPs-CpG和PD-1抗体的联合，能够实现强免疫应答和长期免疫记忆保护作用，完全治愈率达到约30%。这种通过系统给药注射LTX-315和CpG ODNs的方法大大扩展了它们的应用范围，使其具备了治疗难以瘤内给药和转移性肿瘤的可能性。
本发明采用如下技术方案：
装载溶瘤肽的聚合物囊泡，其制备方法为，将聚合物溶液与溶瘤肽溶液混合，然后透析，得到装载溶瘤肽的聚合物囊泡；所述聚合物为非靶向两亲性聚合物或者所述聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物；所述非靶向两亲性聚合物包括亲水链段、疏水链段以及聚氨基酸链段，所述疏水链段的侧链为双硫键；所述靶向两亲性聚合物包括靶向分子、亲水链段、疏水链段，所述疏水链段的侧链为双硫键。聚合物为非靶向两亲性聚合物时，得到非靶向装载溶瘤肽的聚合物囊泡；聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物时，得到靶向装载溶瘤肽的聚合物囊泡。两亲性聚合物不含靶向分子则是非靶向两亲性聚合物，由亲水链段、疏水链段以及聚氨基酸链段组成；优选的，亲水链段的分子量为3000～10000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.1～7.0倍，聚氨基酸链段的分子量为亲水链段分子量的5%～35%。两亲性聚合物含靶向分子则是靶向两亲性聚合物，由靶向分子、亲水链段、疏水链段组成；优选的，亲水链段的分子量为3000～10000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.1～5.0倍。优选的，非靶向两亲性聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-PAsp、PEG-P(LA-DTC)-PAsp或者PEG-P(CL-DTC)-PAsp，靶向两亲性聚合物为cRGD-PEG-P(LA-DTC)、cRGD-PEG-P(CL-DTC)或者cRGD-PEG-P(TMC-DTC)。
装载免疫佐剂的聚合物囊泡，其制备方法为，将聚合物溶液与免疫佐剂溶液混合，然后透析，得到装载免疫佐剂的聚合物囊泡；所述聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物；所述非靶向两亲性聚合物包括亲水链段、疏水链段以及阳离子片段，所述疏水链段的侧链为双硫键；所述靶向两亲性聚合物包括靶向分子、亲水链段、疏水链段，所述疏水链段的侧链为双硫键。两亲性聚合物不含靶向分子则是非靶向两亲性聚合物，由亲水链段、疏水链段以及阳离子片段组成；优选的，亲水链段的分子量为3000～10000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.1～7.0倍，阳离子片段的分子量为亲水链段分子量的2%～40%。两亲性聚合物含靶向分子则是靶向两亲性聚合物，由靶向分子、亲水链段、疏水链段组成；优选的，亲水链段的分子量为3000～10000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.1～5.0倍。优选的，非靶向两亲性聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-Sp、PEG-P(LA-DTC)-Sp或者PEG-P(CL-DTC)-Sp，靶向两亲性聚合物为cRGD-PEG-P(LA-DTC)、cRGD-PEG-P(CL-DTC)或者cRGD-PEG-P(TMC-DTC)。
本发明中，制备装载溶瘤肽的聚合物囊泡时，静置下将聚合物溶液与溶瘤肽溶液混合，然后搅拌，再透析，得到装载溶瘤肽的聚合物囊泡；溶瘤肽的实际载药量为5wt.%～50wt.%，优选8wt.%～30 wt.%；所述聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物时，非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物的摩尔比为2～9∶1。制备装载免疫佐剂的聚合物囊泡时，免疫佐剂的实际载药量为5wt.%～50 wt.%，优选8wt.%～20 wt.%；所述聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物时，非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物的摩尔比为2～9∶1。
本发明中，聚合物溶液中的溶剂为有机溶剂；溶瘤肽溶液中的溶剂为缓冲液；免疫佐剂溶液中的溶剂为缓冲液。优选的，溶瘤肽为LTX-315；免疫佐剂为CpG。
本发明公开了一种联合药物，包括装载溶瘤肽的聚合物囊泡、装载免疫佐剂的聚合物囊泡，进一步的，还包括PD-1抗体。
本发明公开了上述装载溶瘤肽的聚合物囊泡和/或装载免疫佐剂的聚合物囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用；或者上述联合药物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，肿瘤为黑色素瘤。免疫治疗总体有效率偏低，结合其他的治疗方式是发展这些抗体药物免疫治疗的有效途径之一，与化疗药物联合应用能够进一步改善PD-1的治疗效果，瘤内注射LTX-315联合PD-1抗体能够提高其抗肿瘤效果。本发明的药物在杀伤癌症细胞后能够释放出潜在的危险相关模式分子（DAMPs）和肿瘤抗原，从而在造成大量癌细胞坏死的同时激起强烈的免疫反应，具有很大的免疫治疗应用前景；实验结果表明，在针对小鼠黑色素肿瘤时，联合给药能够引起肿瘤减小或完全消退。
附图说明
图1为cRGD-CPs-L和CPs-L的粒径分布（A）；囊泡在4℃下保存14天期间的粒径和载药量变化（B）； cRGD-CPs-L在10% FBS存在下37℃放置18 h的粒径分布（C）； cRGD-CPs-L在10 mM DTT中孵育19 h期间的粒径分布（D）。
图2为流式细胞仪测试了标记了Cy5的CPs-Cy5和cRGD-CPs-Cy5分别在（A）B16F10细胞和（B）MCF-7细胞中孵育1 h后被内吞的情况；MTT法测定（C）空囊泡孵育72 h后对B16F10细胞的毒性、（D）自由LTX-315和cRGD-CPs-L先孵育4 h，换新鲜培养基再孵育44 h后对L929细胞的毒性和（E）LTX-315、FBS预处理的LTX-315、CPs-L、cRGD-CPs-L和FBS预处理的cRGD-CPs-L孵育72 h后对B16F10细胞的毒性、（F）CPs-L、A6-CPs-L孵育72 h后对B16F10细胞的毒性。
图3为Cy5-CPs-L和Cy5-cRGD-CPs-L在Cy5浓度1 μg/mL时与B16F10细胞孵育4 h后的CLSM结果。标尺为20 μm。
图4为流式细胞仪测定的药物浓度7.9 μg/mL下LTX-315、CPs-L和cRGD-CPs-L（A）先孵育4 h，换新鲜培养基再孵育44 h后对B16F10的凋亡和（B）共同孵育12 h后对B16F10线粒体膜的破坏程度。
图5为PBS、LTX-315、CPs-L和cRGD-CPs-L在药物浓度7.9 μg/mL时与B16F10细胞孵育4 h后换新鲜培养基继续培养44 h的CLSM结果。标尺为20 μm。
图6为LTX-315、CPs-L和cRGD-CPs-L在药物浓度40 μg/mL时与B16F10细胞孵育24h 后（A）HMGB-1和（B）ATP的释放情况；（C）LTX-315、CPs-L和cRGD-CPs-L在药物浓度7.9 μg/mL时与B16F10细胞孵育12 h 后的CLSM结果。标尺为20 μm。
图7为CPs-L和cRGD-CPs-L在健康Balb/c小鼠体内的药代动力学曲线（50 mg LTX-315/kg，n=3）（A）； CPs-L和cRGD-CPs-L尾静脉给药8 h后LTX-315在主要器官和肿瘤中的富集情况（n=3）（B）。
图8为抗肿瘤实验的设计方案（A）；给药后荷B16F10小鼠的肿瘤体积（B）与生存曲线（C）；每组荷瘤小鼠分别的肿瘤体积（D）；#代表有至少1只小鼠死亡。
图9为 PBS、LTX-315、cRGD-CPs-L、cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG以及cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG和PD-1抗体治疗荷瘤小鼠13天后小鼠肿瘤切片的H&E、TUNEL和CD3抗体染色图。标尺为50 μm。
图10为PBS、LTX-315、cRGD-CPs-L、cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG以及cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG和PD-1抗体治疗荷瘤小鼠13天后小鼠心、肝、脾、肺、肾切片的H&E染色图。标尺为50 μm。
图11为 PBS、LTX-315、cRGD-CPs-L、cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG以及cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG和PD-1抗体治疗荷瘤小鼠第3天时血清中（A）IL-6的浓度；联合治疗后第3、8和13天时血清中分别的（B）IFN-γ和（C）TNF-α浓度。
图12为流式细胞仪对PBS、LTX-315、cRGD-CPs-L、cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG以及cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG和PD-1抗体治疗荷瘤小鼠第13天时体内免疫细胞的分析。（A）肿瘤中CTLs的占比；（B）肿瘤中Th的占比；（C）Th中Treg的占比；脾脏中（D）TEM的占比和（E）TCM的占比。
图13为cRGD-CPs-L、A6-CPs-L给药后荷B16F10小鼠的肿瘤相对体积。
具体实施方式
Micro BCA试剂盒（Pierce，Thermo Scientific）、增强型ATP检测试剂盒（S0027，碧云天）、Annexin V-Alexa Fluor 647/PI凋亡试剂盒（BD Bioscience）、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（MedChemExpress）、小鼠高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA检测试剂盒（E-EL-M0676c，Elabscience、小鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒（CUSABIO）、小鼠干扰素-γ（IFN-γ）ELISA检测试剂盒（Invitrogen）、细胞坏死因子-α（TNF-α）ELISA检测试剂盒（Biolegend）、钙网蛋白（CRT）抗体（Ab2907，Abcam）、小鼠荧光标记抗体（Biolegend）CD4-APC、CD8a-FITC、CD25-PE、CD8a-PE-Cy7、CD44-FITC和CD62L-PE、山羊抗兔-Alexa Fluor633（Invitrogen）均购买后按说明书使用。高转移性小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）从中科院上海细胞库购买。
聚合物囊泡的粒径和粒径分布通过配有He/Ne激光光源（波长为633 nm）和173°背折射检测器的ZetaSizer Nano-ZS纳米粒度仪（Malvern Instruments）测定，温度为25℃。CpG浓度由超微量紫外-可见光分光光度计（NanoDropTM One, Thermo Scientific）测定。TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Leica）拍摄细胞CRT释放情况。流式细胞仪（FACSCalibur，BD sciences）用来研究细胞内吞、细胞凋亡、细胞线粒体膜电位以及体内免疫细胞的定性和定量。酶标仪（Thermo Multiskan FC）用来测定活细胞与MTT形成的紫色甲瓒在570 nm处的吸光度值。多功能酶标仪（Varioskan LUX，Thermo Scientific）用来进行蛋白浓度的Micro BCA检测和细胞因子的ELISA检测。
本发明所有数据均是以平均值呈现，组间差异性由Anova单因素方差分析评估， *p＜0.05视为具有显著性差异，**p＜0.01和***p＜0.001视为高显著性差异。
实施例一 LTX-315囊泡和CpG囊泡的制备和表征
嵌段聚合物cRGD-PEG-P(TMC-DTC)（M n=0.6-7.5-(14.8-2.1) kg mol-1）、A6-PEG-P(TMC-DTC)（M n=0.9-7.5-(14.8-2.1) kg mol-1）、PEG-P(TMC-DTC)-spermine（M n=5-(14.4-2.2)-0.2 kg mol-1）和PEG-P(TMC-DTC)-PAsp（M n=5-(14.1-2.2)-1.3 kg mol-1）根据现有技术合成，参见发明人之前公开的专利或者文献。聚天冬氨酸（KD10，98%）和LTX-315（KKWWKKWDipK-NH2，98%，上海强耀生物）、cRGD（Cyclo(RGDfK)，f是D-Phe, 98%，上海吉尔生化）、A6（序列：Ac-KPSSPPEEC-NH2，98%，上海吉尔生化)、CpG（CpG ODNs 1826，TCCATGACGTTCCTGACGTT，InvivoGen）、Cy5-NHS（Lumiprobe，USA）均购买后直接使用。
为了制备CPs-L，在37℃下将100 μL PEG-P(TMC-DTC)-PAsp的DMSO溶液分别打入溶有0.4 mg、0.8 mg和1.2 mg LTX-315的900 μL的HEPES溶液底部（5 mM， pH 6.8），之后在200 rpm下搅拌10 min，并在HEPES（5 mM，pH 7.4）中透析6 h（MWCO 14000 Da），每小时更换介质，得到理论载药量分别为10 wt.% 、20 wt.%和30 wt.%的CPs-L。为制备靶向LTX-315囊泡cRGD-CPs-L，在PEG-P(TMC-DTC)-PAsp中掺杂摩尔百分含量为20 mol.%的cRGD-PEG-P(TMC-DTC)作为起始的聚合物溶液，其余步骤同上。为了得到含有Cy5的cRGD-CPs-L-Cy5和CPs-L-Cy5用于测试，在聚合物溶液中添加2 mol.%的PEG-P(TMC-DTC)-Cy5聚合物并保证最终聚合物浓度为40 mg/mL，其余步骤同上。
为了研究cRGD-CPs-L的稳定性，囊泡在4℃下被保存在含有10% FBS的溶液中并在不同时间点检测其粒径和粒径分布。为了研究囊泡的还原环境响应性，囊泡溶液中在氮气保护下加入谷胱甘肽（GSH）溶液（10 mM），在37℃、200 rpm的摇床中放置，在不同时间点检测其粒径和粒径分布。纳米粒的粒径、粒径分布（PDI）和Zeta电位使用DLS测定。LTX-315的浓度使用紫外分光光度计检测在282 nm处的吸光度。并根据LTX-315在1-50 μg/mL范围内的标准曲线计算浓度，并根据现有公式载药量和载药效率。
为了得到装载CpG的靶向囊泡cRGD-CPs-CpG，聚合物cRGD-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-sp以摩尔比1∶4的比例在DMF中溶解为40 mg/mL的聚合物溶液，取100 μL在200rpm搅拌下打入溶有CpG（100 μg/mL）的900 μL HEPES溶液中（5 mM，pH 6.8），之后在200rpm下搅拌10 min，并在HEPES（5 mM，pH 7.4）中透析6 h（MWCO 14000 Da），每小时更换介质，得到理论载药量分别为10 wt.%的cRGD-CPs-CpG。DLE和DLC用NanoDropTM One进行测定。
制备cRGD-CPs-L需要PEG-P(TMC-DTC)-PAsp 和cRGD-PEG-P(TMC-DTC)以摩尔比4：1的比例在溶有LTX-315的HEPES（5 mM，pH 6.8）中进行自组装，并通过静电相互作用的原理装载LTX-315至囊泡内腔，根据现有常规方法进行表征。DLS和UV的测试结果表明，通过这种方法制备得到的cRGD-CPs-L具有小而均一的尺寸（图1 A）和高而稳定的药物载药量（表1），cRGD的加入并没有很大程度上影响囊泡的载药能力和尺寸大小，本发明选择了20 wt.%投料比得到的cRGD-CPs-L、CPs-L用于后续实验。cRGD-CPs-L具有良好的稳定性，即使是在4℃下放置14天，粒径基本不变，而稳定的载药量意味着放置时没有药物泄漏（图1 B），为了模拟体内循环时的环境，在37℃，10% FBS的条件下测试了cRGD-CPs-L的稳定性，DLS的结果表明（图1C），靶向囊泡在18 h的放置下粒径分布几乎没有变化，为囊泡能够在血液中稳定循环并保护LTX-315提供了佐证，为了验证稳定的囊泡到达肿瘤部位能够快速的响应并释放药物，模拟了肿瘤细胞内的高还原环境，在介质中添加了10 mM 的GSH。从DLS的结果（图1D）可以发现cRGD-CPs-L在10 mM GSH的还原条件下6 h会发生明显的溶胀，直至19 h囊泡结构几乎完全被破坏，与先前的稳定截然相反，说明囊泡在还原环境下能够快速解交联并释放药物。上述研究中的cryo-TEM和TEM测试证实了这种纳米粒的尺寸与DLS的结果相符合。综上，使得基于PEG-P(TMC-DTC)-PAsp的囊泡cRGD-CPs-L能够兼具能够在血液中稳定循环并在肿瘤处快速释放的特性，为后期的细胞动物实验提供依据。本发明制备了基于PEG-P(TMC-DTC)-spermine聚合物的囊泡cRGD-CPs-CpG。此方法制备的囊泡对于10 wt.%的CpG有接近100%的包封率，展现出了极高的包封能力并同时具有42±2 nm的小粒径、及窄的PDI0.1和趋近中性的Zeta电位（表1），为了后续的联合治疗提供了可能性，表1的CPs-L、cRGD-CPs-L和cRGD-CPs-CpG用于以下细胞、动物实验。
表1 不同载药量的CPs-L、cRGD-CPs-L和cRGD-CPs-CpG的粒径、载药量和Zeta电位
拓展实施例一
更换上述投料比、搅拌方式以及透析溶液的pH，其余不变，得到CPs-L的表征见表2。
表2不同条件下载药囊泡CPs-L的粒径及其分布
根据上述制备方法，以投料比10wt%为例，改变PEG-P(TMC-DTC)-PAsp的分子量、选择多种CpG药物，比如CpG ODN 1826、CpG ODN2395、CpG ODN 2006等，其余不变，得到CPs-L、cRGD-CPs-CpG的表征见表3。
表3 不同CPs-L、cRGD-CPs-CpG的粒径、载药量
将实施例一的cRGD-PEG-P(TMC-DTC)更换为A6-PEG-P(TMC-DTC)，其他一样，得到A6-CPs-L。
实施例二 细胞毒性试验（MTT）、流式细胞仪试验
细胞为小鼠高转移性黑色素瘤细胞株B16F10。B16F10细胞用DMEM培养基（Gibco）在37℃、5%的CO2培养，培养基中添加10%血清、1% L-谷氨酰胺、青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100 g/mL）。将B16F10细胞铺于96孔板（3 × 103个/孔，80 μL），24小时后细胞回合率达到60%左右，加入20 Μl PBS，cRGD-CPs-L，CPs-L，LTX-315和与50% FBS预孵育4 h的LTX-315，LTX-315浓度范围为0.1到100 μg/mL。孵育72 h后，每孔加入10 mL MTT溶液（5 mg/mL）孵育4 h，弃掉上清液，加入150 μL DMSO溶解活细胞和MTT作用生成的紫色甲瓒晶体。溶解后用酶标仪测定各孔在570 nm的紫外吸收。加入PBS的细胞作为对照组，细胞的存活率为各孔吸光度与对照组吸光度的比值。每个实验平行5次（n=5），最终呈现的结果为平均值±SD。对B16F10细胞的半数抑制浓度（IC50）通过非线性回归计算得到。
在空纳米粒cRGD-CPs对B16F10细胞的毒性实验中，囊泡浓度设置为0.5至5 mg/mL，其余步骤与上述相同。cRGD-CPs-L与自由药LTX-315对小鼠成纤维细胞L929的毒性实验中，选用RPMI 1640作为培养基，铺板的细胞数为5×103个/孔，孵育时间为48 h，其余步骤与上述相同。
为了测定B16F10对细胞的摄取情况，将B16F10细胞铺于6孔板中（3×105个/孔），24小时后分别加入PBS，CPs-Cy5和cRGD-CPs-Cy5（1.0 μg Cy5 equiv./mL）。孵育1小时后，细胞用胰酶消化，用培养基终止，1000 rpm离心3 min并用PBS清洗2次，最终分散至500 μLPBS中用于FACS测试。
为了测定药物处理后B16F10的凋亡情况，B16F10细胞铺于6孔板中（1×105个/孔），24小时后分别加入PBS，LTX-315，CPs-L和cRGD-CPs-L（7.9 μg/mL LTX-315）。孵育4小时后弃去培养基，加入2 mL新鲜培养基继续培养44 h。细胞用无EDTA的胰酶消化，用培养基终止，1000 rpm离心3 min并用PBS清洗2次，最终分散至100 μL binding buffer中（1×106个/mL），用凋亡试剂盒中提供的Annexin V-Alexa Fluor 647/碘化丙啶（PI）避光染色15min后，用400 μL binding buffer终止并用于FACS测试。
为了测定药物对B16F10细胞线粒体膜的影响能力，B16F10细胞铺于6孔板中（3×105个/孔），24小时后分别加入PBS，LTX-315，CPs-L和cRGD-CPs-L（7.9 μg/mL LTX-315）。孵育12小时后用线粒体膜电位试剂盒（JC-1）根据说明书进行染色操作，最终用于FACS测试。药物处理后完整的线粒体（Q2），受损的线粒体（Q3）分别与PBS组的Q2和Q3进行比较。
为了拍摄细胞摄取情况，B16F10细胞铺于放有小圆片的24孔板中（3×104个/孔），24小时后分别加入Cy5-CPs-L和Cy5-cRGD-CPs-L（1 μg/mL Cy5）。孵育4小时后，细胞用PBS清洗2次后用4% 多聚甲醛溶液固定15 min，用DAPI染色5 min，每步处理后用PBS清洗3次，最后用甘油封片，通过CLSM观察拍摄。
为了拍摄细胞凋亡情况，B16F10细胞铺于放有小圆片的24孔板中（3×104个/孔），24小时后分别加入LTX-315，CPs-L和Cy5-cRGD-CPs-L（7.9 μg/mL LTX-315）。孵育4小时后弃去培养基，加入1 mL新鲜培养基继续培养44 h。细胞用PBS清洗2次后用4% 多聚甲醛溶液固定15 min，用Annexin V-Alexa Fluor 647，PI染色15分钟，再用DAPI染色5 min，每步处理后用PBS清洗3次，最后用甘油封片，通过CLSM观察拍摄。
B16F10生长速度快，转移性高，新生血管丰富。通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜研究了cRGD对于促进细胞内吞囊泡能力的研究。结果表明，在B16F10细胞中，带有靶向分子的cRGD-CPs-Cy5囊泡孵育1 h后细胞的荧光强度是对照无靶CPs-Cy5组细胞的2.2倍（图2A）。CLSM的结果同样证实了cRGD能够显著地增强细胞摄取囊泡的能力（图3）。与此同时，在MCF-7细胞中，cRGD-CPs-Cy5与CPs-Cy5两组的细胞荧光却几无差别（图2 B）。
以上实验初步证明了cRGD能够一定程度提高B16F10细胞对囊泡的摄取能力，为了保证后期体内实验时囊泡不会对小鼠造成明显毒性，研究了cRGD-CPs对B16F10细胞和cRGD-CPs-L对正常小鼠成纤维细胞L929的毒性。MTT的结果表明，没有载药的囊泡cRGD-CPs在0.5 μg/mL到5 mg/mL的浓度范围中都对细胞没有明显的毒性（图2 C），同时相比在10 μg/mL浓度下就能够对正常细胞造成明显高毒性的LTX-315相比，经过囊泡包裹的cRGD-CPs-L对L929细胞在极高的浓度（100 μg/mL）下也保持着较低（＜20%）的毒性（图2 D）。这些结果不仅表明cRGD-CPs本身对细胞几乎没有毒性，也说明能够有效地保护LTX-315不提前泄露从而导致对正常细胞产生毒性，说明对于LTX-315，cRGD-CPs是一个及其优良的载体，具有良好的生物相容性。
为了能进一步证明cRGD-CPs-L的细胞毒性，进行了对B16F10的MTT实验。结果表明，cRGD-CPs-L在孵育72 h的条件下能够对B16F10细胞产生极高的细胞毒性，IC50为7.9 μg/mL（图2 E），与自由的LTX-315接近，同样的实验下，A6-CPs-L的IC50为11.1 μg/mL（图2F）。LTX-315本身的毒性有很大一部分来源于自身的强正电荷对细胞膜造成的直接的溶瘤效果，常规认为包裹后会降低药物对细胞的毒性，而MTT的结果说明LTX-315经过包裹后并依然对细胞保持着明显毒性，证明了cRGD-CPs-L用于治疗肿瘤的可行性。不仅如此，靶向组的IC50比无靶向的CPs-L低了一倍，证明了cRGD-CPs-L能够借助高效的内吞从而明显提高对B16F10细胞的毒性。值得注意的是，与50% FBS预孵育过的自由LTX-315对细胞毒性明显降低，在高浓度100 μg/mL时都不能有效地杀伤细胞，说明自由药在血清中的稳定性极差，会明显降低药效。而与之相反的是，与血清预孵育的cRGD-CPs-L对细胞的毒性与未处理组相比几乎相同，说明囊泡能够有效保护包裹的LTX-315而不明显影响毒性，从而实现LTX-315经血液循环后到达肿瘤发挥作用的可能性。
由于LTX-315被包裹后很可能改变了杀死细胞的主要途径，通过流式细胞术和CLSM对细胞死亡的方式进行了验证。从结果可以发现，自由LTX-315在7.9 μg/mL的浓度下对B16F10细胞进行了一定程度的杀伤，其中有26.6%的细胞产生了不同程度死亡，其中有72.2%的细胞发生了坏死，这说明自由LTX-315确实主要通过溶膜作用直接让B16F10细胞坏死（图4 A）。而与之不同的是，无论是cRGD-CPs-L还是CPs-L，细胞死亡的途径主要是凋亡，分别有61.7%和14.6%的细胞处于晚期凋亡的状态，这不仅说明药物被包裹后改变了杀伤细胞的途径，也证明cRGD靶向分子对B16F10有着增强细胞毒性的作用。自由LTX-315处理后的非健康细胞有26.6%，而cRGD-CPs-L处理后的非健康细胞高达67.0%，主要的原因是被自由LTX-315处理的细胞有一部分已经由于溶膜作用裂解为碎片，无法被流式细胞仪捕获。于此同时，CLSM图像的结果也证明了在cRGD-CPs-L处理过的细胞中发现了大量FITC阳性代表的早期凋亡和PI阳性的晚期凋亡，且信号强度远高于CPs-L组和自由LTX-315组（图5）。于此同时，在自由LTX-315处理的细胞样本中发现了明显的破裂的细胞膜碎片，而在纳米粒组中没有发现类似的情况。上述结果说明与CPs-L相比，cRGD-CPs-L能够显著增强导致细胞凋亡的能力（图2A，图3）。
LTX-315由于自身带有很强的正电，被cRGD-CPs-L递送至细胞内后，很容易倾向于对带有负电的细胞器发生作用。而细胞内的细胞器中，以线粒体带有的负电最强，且线粒体的异常很容易导致细胞发生凋亡，且线粒体的异常通常表现为线粒体膜电位的改变。用流式细胞术对药物处理后细胞的线粒体进行了测试，使用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒对线粒体进行标记，JC-1是一种具有两种形态的荧光探针，当线粒体膜完整即电位较高时，JC-1在基质中汇聚成聚合物，产生红色荧光；而当线粒体膜收到影响，电位下降后，JC-1无法在基质中汇聚从而以单体的形式发出绿色荧光，而两者的比值可以用来表示线粒体膜电位的下降程度，也可作为细胞凋亡的检测指标。流式细胞术的检测结果中可以发现（图4 B），被LTX-315和cRGD-CPs-L处理过的细胞均发生了明显的线粒体膜电位下降，且显著高于CPs-L和PBS，这说明LTX-315经递送进入细胞后，确实倾向于与线粒体发生作用，从而导致细胞凋亡。以上结果表明，LTX-315在经过囊泡包裹后，仍然能保持对B16F10细胞明显的毒性，并且对于正常组织没有明显毒性，进一步证明cRGD-CPs-L具备了系统给药的可能性。
实施例三 细胞释放危险相关模式分子（DAMPs）实验
B16F10细胞铺于6孔板中（3×105个/孔），24小时后分别加入PBS，LTX-315，CPs-L和cRGD-CPs-L（40 μg/mL LTX-315）。孵育24小时后，收集培养基，细胞用PBS清洗2次后用4%多聚甲醛溶液固定15 min，用含有0.1% 吐温20的PBS封闭30分钟，然后加入CRT抗体染色1h，加入Alexa Fluor-633二抗孵育30 min，用DAPI染色5 min，每步处理后用PBS清洗3次，最后用甘油封片，通过CLSM观察拍摄。收集的培养基用超滤离心浓缩（50 KDa，1000 ×g）20分钟，按照说明书用HMGB-1 ELISA试剂盒和ATP荧光试剂盒测定浓度。
之前的研究确认了cRGD-CPs-L对B16F10的细胞毒性及杀伤机理，但囊泡包裹的LTX-315是否能像自由药一样产生足够的ICD反应无法预期，本发明研究了释放DAMPs以激起免疫反应。首先用ELISA法测试了药物处理后的B16F10细胞培养基中释放的HMGB-1和ATP浓度，结果中可以看到（图6 A&B），cRGD-CPs-L组释放的HMGB-1和ATP都与LTX-315组释放的量相当，且显著高于PBS组，表明靶向囊泡药物cRGD-CPs-L也能够与LTX-315一样，使细胞释放足够量的DAMPs。值得注意的是，cRGD-CPs-L组的ATP释放量显著高于CPs-L组，意味着cRGD起到了有利效果。
随后又用CLSM来观察细胞释放经历ICD的经典标志物——钙网蛋白（CRT）的程度。从CLSM拍摄的图片中可以看出，cRGD-CPs-L和LTX-315处理后的细胞能够观察到明显且大量的CRT信号（图6 C），且几乎每个细胞表面都有较强的荧光，明显强于CPs-L组的信号，而PBS处理的细胞则几乎没有CRT信号，这与DAMPs释放量的结果相符。图4 A已经证明了LTX-315能够导致明显的细胞坏死，而细胞坏死通常伴有DAMPs的释放和随后的抗肿瘤免疫反应。而cRGD-CPs-L虽然主要导致细胞的凋亡，却依然能够释放DAMPs，这说明 cRGD-CPs-L能够有效诱导细胞ICD并且释放大量DAMPs，这为后期动物的免疫治疗提供了依据。
动物模型：所有动物实验及操作均获得苏州大学实验动物中心和苏州大学的动物护理和使用委员会的批准。为了建立B16F10黑色素移植瘤模型，6周龄雌性C57BL/6小鼠脱毛后在右后腿上部皮下注射1×105个细胞（50 μL，含30% 基质胶）。当肿瘤体积到达50-100mm3时分组进行治疗实验，当肿瘤体积到达150-200 mm3时分组进行生物分布实验。肿瘤体积根据以下公式进行计算：体积=长×宽2×0.5。分组时每组动物具有相似的体重和肿瘤大小。
实施例四 药代动力学和生物分布实验
为了分析囊泡的药代动力学，通过尾静脉将CPs-L和cRGD-CPs-L（50 mg LTX-315/kg）注入健康Balb/c小鼠体内（n=3），在预定时间点，用肝素化毛细采血管从小鼠内眦静脉丛取血70 μL，5000 rpm离心20 min，取20 μL血清加入0.1 mL 1% 的曲拉通并超声，再加入200 μL含20 mM DTT的DMSO，在37℃、200 rpm的摇床中过夜萃取LTX-315。随后离心后取上清，用紫外分光光度计测试。LTX-315浓度对时间作图得药代动力学曲线，并用Excel和Origin8软件拟合得到半衰期（t1/2β）和曲线下面积（AUC）。
囊泡药物能否通过血液循环到达肿瘤部位并产生富集，对于抗肿瘤效果有着至关重要的作用。此前证明的囊泡药物对于肿瘤细胞的杀伤能力如果没有长效的血液循环与较高的肿瘤富集能力，将无法在动物层面发挥较好的作用。因此，本发明研究了其药代动力学和生物分布。结果表明，cRGD-CPs-L和CPs-L在血液中有着相似的药代动力学行为，消除相半衰期（t1/2β）分别为1.91 h和2.28 h（图7 A），而LTX-315在血液中会快速降解，几乎无法检测其药代动力学行为。
为了测定LTX-315在不同器官中的富集，通过尾静脉注射通过尾静脉将CPs-L和cRGD-CPs-L（50 mg LTX-315/kg）注入荷瘤小鼠体内（n=3），8 h后颈椎脱臼处死动物，立即解剖取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，用PBS清洗擦干并称重。各组织剪下约0.1 g，剪碎后分别加入0.5 mL 1% 的曲拉通，用匀质机（IKA T25， 18000 rpm， 10 min）研磨成匀浆，加入0.7 mL含有20 mM DTT的乙腈萃取24 h。随后将乙腈挥发干并分别加入0.3 mL DMSO溶解LTX-315，离心后取上清用UV测试。LTX-315在各器官中的标准曲线绘制是将一系列已知浓度的LTX-315混入各个器官，并完全按照上述方法处理后测UV，绘制以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标的标准曲线。LTX-315的浓度最终被定量并表现为%ID/g（百分之注射剂量/克组织）。
进一步研究了囊泡药物在小鼠主要器官和肿瘤中的富集能力。选择尾静脉给药8h后研究药物在体内的分布，结果表明，尾静脉给药8 h后，药物在肿瘤中依然有较多的富集，cRGD-CPs-L组在肿瘤处有4.8% ID/g的富集量，显著高于CPs-L组的2.5% ID/g，达到了近一倍的提升（图7 B）。这证明了在小鼠体内，cRGD也能够很好的发挥作用并靶向至肿瘤部位。而前期的实验也证明了即使囊泡在正常组织中富集，也不会对正常细胞产生明显的毒性。综合以上实验结果，cRGD-CPs-L表现出了对B16F10的良好的靶向性和细胞毒性，这为动物实验提供了有力的依据。
为了加强两亲性溶瘤肽LTX-315在抗癌免疫治疗上的潜力，本发明设计制备了能够高效装载带有正电荷LTX-315的具有不对称膜结构，内腔带有负电荷，并且具有靶向的囊泡cRGD-CPs-L，还制备了能够通过尾静脉注射递送CpG免疫佐剂至肿瘤处的cRGD-CPs-CpG。这两种纳米药物的联合治疗中，LTX-315囊泡能够快速抵达肿瘤处高效杀伤肿瘤细胞，并同时释放出多种DAMPs和肿瘤相关抗原，诱导有利的免疫微环境，而后一步到达的CpG囊泡能够促进肿瘤处抗原呈递细胞的成熟和抗原递呈，更好的激活并募集CTLs杀伤肿瘤细胞，而PD-1抗体的加入能够加强CTLs对肿瘤细胞的杀伤能力，三种药物在一条途径上的不同位置为提高免疫治疗效果发挥着不同的作用。
实施例五 LTX-315囊泡联合CpG囊泡和PD-1抗体的抗肿瘤活性实验
PD-1单抗（InVivoMab anti-mouse PD-1 (CD279)，Bioxcell）购买后直接使用。
荷B16F10黑色素瘤小鼠被随机分为8组，每组7只（n=7）：PBS，LTX-315瘤内注射（i.t.），cRGD-CPs-L（i.t.），cRGD-CPs-L尾静脉注射（i.v.），cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG（i.v.）, cRGD-CPs-L（i.v.）联合PD-1抗体腹腔注射（i.p.）, CPs-L（i.v.）联合PD-1抗体（i.p.）和cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG （i.p.）并联合PD-1抗体（i.p.）（LTX-315: 50 mg/kg, CpG: 0.5 mg/kg, αPD-1: 10 mg/kg）。从给药开始设为第0天，所有LTX-315囊泡在每天上午给药一次（尾静脉给药体积为200 μL，瘤内给药体积为50 μL），持续三天，CpG囊泡（尾静脉给药体积为100 μL）和PD-1抗体（腹腔给药体积为 100 μL）在每天下午给药一次，持续三天。每2天检测体重和肿瘤体积，并在第13天每组随机取1只小鼠解剖，取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤用组织固定液固定，随后用石蜡包埋并切片，用苏木精和伊红（H&E），TUNEL和CD3抗体染色，显微镜观察并分析。剩余每组6只小鼠（n=6）继续观察生存期，小鼠死亡、体重下降超过15% 或肿瘤体积大于2000 mm3判定死亡，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。
为了验证cRGD-CPs-L应用于免疫治疗的效果，选用荷B16F10皮下瘤的C57BL/6小鼠作为小鼠黑色素瘤模型，研究了囊泡药物联合CpG免疫佐剂和PD-1抗体对肿瘤的抑制作用。在开始给药前6天，给每只小鼠皮下注射了B16F10细胞进行建模，确定了50 mg LTX-315/kg，0.5 mg CpG/kg以及10 mg anti-PD-1/kg的给药剂量，连续三天每天给药一次。在每天上午尾静脉注射cRGD-CPs-L，下午尾静脉注射cRGD-CPs-CpG以及腹腔注射PD-1以达到更好治疗效果的目的。为了检测药物的治疗效果，在给药后第3、8、13天时检测了小鼠血液中的免疫因子和脾脏、肿瘤中的免疫细胞，并对小鼠肿瘤尺寸和生存期进行了持续的检测，在肿瘤体积大于2000 mm3时判定死亡（图8 A）。
结果显示，由于B16F10的极高恶性程度，PBS组肿瘤体积迅速增长，到第10天时肿瘤平均体积已超过2000 mm3，中位生存期11天（图8 B&C）。而瘤内给药的自由LTX-315组在给药三次完成时，肿瘤生长位置出现明显黑色坏死，肿瘤体积无法测量。但是在第5天时，可以发现有2只小鼠的肿瘤在给药区域附近重新开始生长（图8 D），并在第10天时所有小鼠均有明显复发并且在16天开始出现死亡，复发的肿瘤生长速度与PBS接近，中位生存期延长至20天。CPs-L与PD-1抗体联用组、cRGD-CPs-L的尾静脉给药和瘤内给药组，均有一定程度抑制肿瘤生长速度的能力（图8 B&C），但是停药后肿瘤又迅速增长，中位生存期从11天延长至16天，但不如自由LTX-315组的20天。这可能是由于相较自由LTX-315而言，包裹后囊泡药物在杀伤肿瘤细胞时较为温和，导致无法完全抑制恶性程度很高的B16F10黑色素瘤，且由于杀死细胞的数量和速度较低，无法仅靠此激起明显的免疫反应，PD-1抗体也无法发挥明显作用。这证明被囊泡装载递送的LTX-315依然保持着一定程度的抗肿瘤能力，但是仅靠单药无法达到较好的治疗效果。cRGD-CPs-L联用PD-1抗体组无论是在肿瘤生长速度抑制还是中位生存期的延长方面均已优于自由LTX-315（图8 B&C），MST延长至23天，明显优于cRGD-CPs-L单用组。而cRGD-CPs-L联用cRGD-CPs-CpG组相比联用PD-1抗体组，中位生存期也仅达到26天，这可能是由于肿瘤被LTX-315杀伤后导致PD-L1抗体的上调，导致最后激活的CTLs表面的PD-1被PD-L1结合而无法进一步杀伤癌症细胞。然而这一现象在三药联用组中被极大改善，肿瘤体积直到15天时依然被有效抑制，中位生存期也极大地提升至37天。其中第12天时观察到有2只小鼠肿瘤完全消退，第20天时我们重新在这两只小鼠的皮下注射了1×105个B16F10细胞，未见到复发，并且一直存活至100天（图8 B、C&D）。这一结果验证了本发明的联合用药起到预料不到的技术效果：在cRGD-CPs-L初步杀死癌症细胞并释放TAA和DAMPs后，cRGD-CPs-CpG增强肿瘤部位的APC并将随后激活的CTLs表面的PD-1结合封闭，从而达到出色的免疫治疗效果。
实施例六 治疗后小鼠体内细胞因子和免疫细胞分析
荷B16F10黑色素瘤小鼠根据5.2.8中方法治疗（n=3）。在第3，8和13天时，从内眦静脉丛取血约200μL并离心取得约50μL血清，按照IL-6 ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒和IFN-γ ELISA试剂盒说明书的要求进行测试。第13天时，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取脾和肿瘤，加入含有1% FBS的PBS并研磨，通过细胞滤膜过滤得到单细胞悬液。离心收集细胞，加入ACK裂解液裂红并计数，每个样品取6×106个细胞进行染色并通过FACS测试分析。细胞与对应标记抗体：细胞毒性T细胞（CTLs）：anti-CD4-APC、anti-CD8a-FITC；辅助T细胞（Th）：anti-CD4-APC、anti-CD8a-FITC；调节T细胞（Treg）：anti-CD4-APC、anti-CD8a-FITC、anti-CD25-PE；中央记忆T细胞（TCM）：anti-CD8a-FITC、anti-CD44-FITC、anti-CD62L-PE；效应记忆T细胞（TEM）：anti-CD8a-FITC、anti-CD44-FITC、anti-CD62L-PE。
在第12天从PBS、LTX-315、cRGD-CPs-L、cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG以及cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG和PD-1抗体5组小鼠中每组随机挑选一直小鼠解剖并将主要脏器和肿瘤进行切片，进行了H&E染色，其中肿瘤的切片额外进行了TUNEL和CD3抗体的染色并拍摄。结果显示，PBS，LTX-315和cRGD-CPs-L三组在H&E、TUNEL和CD3抗体染色中并未发现明显的坏死、炎症、凋亡或是T细胞的痕迹（图9），与相对较差的治疗效果相符合。其中，LTX-315组虽然在治疗初期有肉眼可见的肿瘤坏死，然而到第12天时，已均为复发生长的肿瘤，切片未能看到与PBS组有明显差异。而cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG组的切片中，H&E图片能观察到一定的坏死情况，TUNEL图片中存在一些绿色凋亡细胞的信号，CD3抗体染色的图片中也能看到一部分T细胞的痕迹，这说明cRGD-CPs-L联合cRGD-CPs-CpG的治疗已经能够激起一定程度的免疫反应并对肿瘤进行杀伤。令人兴奋的是三药联用组的结果，可以看到H&E图片中能观察到极多肿瘤坏死的部分，且肿瘤结构不致密，TUNEL中也出现了大片肿瘤细胞凋亡的绿色信号，CD3抗体染色图片中有很多T细胞浸润在肿瘤组织中间，这证明三药联用能够有效地激起免疫反应并且有效杀死肿瘤细胞。而在主要器官额的H&E染色切片中所有组别均没有表现出对脏器的明显毒性（图10）。这些结果表明了三药联用的方案能够有效抑制肿瘤生长并且激起较强的免疫反应，并且产生记忆T细胞进一步保护小鼠不被B16F10侵袭，且使用的聚合物在进入小鼠体内后没有引起明显的毒副作用，体现了优越的生物相容性。
上述的结果已经证明三药联用能够有效治疗小鼠B16F10黑色素瘤，进一步分析了在治疗过程中，给药对于小鼠体内的免疫环境起到的作用。白介素-6（IL-6）是一种癌症相关炎症因子，主要由活化的T细胞分泌；γ干扰素（IFN-γ）是一种主要由Th1细胞分泌的细胞因子，能够促进细胞免疫应答；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，主要由巨噬细胞和T细胞产生。检测这三种具有代表性的免疫相关细胞因子能够直观的反应体内免疫反应激活的程度。
首先研究了给药后第3天小鼠血清中IL-6含量以及给药后第3、8和13天时血清中IFN-γ和TNF-α的变化。从结果中可以发现，检测的4组给药组在第3天时，均能够使小鼠血清中的IL-6、IFN-γ和TNF-α明显升高，且三药联用组显著比cRGD-CPs-L和cRGD-CPs-CpG两药联用组更高（图11）。而现有的一些研究表明，单用CpG或是PD-1抗体均不能明显提高这些细胞因子的表达水平，这说明了三药联用对于有效激起体内免疫反应或是至关重要的。不仅如此，三药联用组血清中的IFN-γ和TNF-α水平在第8和第13天时仍维持着较高的水平（图11 B&C），相比LTX-315组，在给药初期同样能激起明显的免疫作用，但随时间增加很快降低，在第13天时已经和PBS没有差别，这意味着三药联用能够持续并高效地引起体内T细胞的激活并发挥作用。
小鼠体内的细胞因子可以从侧面反应体内免疫系统被激活的程度，而T细胞更是直接参与杀死肿瘤的免疫细胞。起到抗肿瘤作用的T细胞主要分为CD4+的辅助性T细胞（Th）和CD8+的细胞毒性T细胞（CTL），其中CTL直接攻击肿瘤细胞并杀死，而Th主要产生细胞因子增强CTL并且激活更多的APC参与免疫反应。然而Th中还有一种调节性T细胞（Treg），会减弱T细胞活性，发生免疫抑制。
用流式细胞术直接检测了经药物治疗13天后，小鼠肿瘤内的T细胞的含量。结果中可以发现，经过cRGD-CPs-L治疗的小鼠肿瘤内的CTLs（CD4-CD8+）含量显著高于PBS组（图12A），证明cRGD-CPs-L能够激活一定的免疫反应。而随着联用的cRGD-CPs-CpG加入后，肿瘤内CTLs的含量进一步提升，说明CpG的联用确实能够增强APC发挥的作用，在肿瘤处募集激活更多的CTLs。值得注意的是，现有研究表明单独的PD-1抗体治疗B16F10肿瘤并不能增加CTLs在肿瘤处的浸润，但三药联用组的肿瘤内CTLs占比显著高于两药联用组。这是由于包括DC细胞在内的APC细胞的抗原的交叉递呈对于CD8+ T细胞的激活有着至关重要的作用。CpG虽然能够激活DC细胞的TLR9并且增强其抗原交叉递呈的能力，但是CpG需要被DC通过受体介导内吞才能发挥激活TLR9的作用。与自由CpG相比，cRGD-CPs-CpG具有双硫交联的囊泡膜结构，因此能够更有效地进入DC细胞并引起更强的TLR9激活效果。与此同时，现有研究表明CD8α+ DC细胞的交叉递呈不仅需要吞噬正在死亡的细胞，并且需要在吞噬细胞前就被CpG激活，才能有效地实现抗原交叉递呈。在本发明三药联用组中，cRGD-CPs-L能够有效地诱导大量肿瘤细胞凋亡，并提供有效的肿瘤抗原，并且与cRGD-CPs-CpG的结合使用能够有效的使DC细胞实现抗原交叉递呈，募集并激活更多的CTLs。而随着PD-1抗体的加入，CTLs能够更高效的杀死肿瘤细胞，使肿瘤释放出更多的TAA，从而激活募集更多的APC，并使T细胞成熟，正向反馈之下使得肿瘤处的CTLs进一步增加，从而实现更强的免疫治疗效果。
尽管cRGD-CPs-L组和cRGD-CPs-L联用cRGD-CPs-CpG组能够增加肿瘤部位的CTLs数量，但是Th（CD4+CD8-）数量却几乎没有增加（图12 B），相反的是，三药联用组的Th细胞显著的增多。而Th细胞能够起到促进CTL成熟的作用，并且激活更多的APC来到肿瘤处发挥作用，这也是三药联用组治疗效果显著优于其他组的重要原因之一。三药联用组显著增加的Th比例之中，起到免疫抑制效果的Treg（CD4+CD25+）比例反而远低于其余各组（图12 C），进一步提供了三药联用组治疗效果优秀的证据。
脾脏是人体重要的免疫器官之一，而起到免疫记忆效果的记忆T细胞大量储存在脾脏处。记忆T细胞主要分为效应记忆T细胞（TEM，CD4-CD8+CD62L-CD44+）和中央记忆T细胞（TCM，CD4-CD8+CD62L+CD44+），其主要区别是TEM接到了保护记忆性，能够快速执行效应功能，TCM几乎没有效应功能，却能够稳定地增殖并在抗原刺激下分化为效应细胞。检测了两种重要的记忆性T细胞在脾脏的含量，结果表明，第13天时，三药联用组的TEM显著高于其余各组（图12 D），而TCM则是三药联用组和cRGD-CPs-L联用cRGD-CPs-CpG组均显著高于其他组（图12 E），这说明cRGD-CPs-L联用cRGD-CPs-CpG组能够诱导一定的免疫反应产生，并且已经使机体产生中央记忆T细胞，然而没有PD-1的参与，一开始激活的CTLs可能无法有效的杀伤肿瘤细胞并进一步产生更多的TAA与DAMPs，也就无法继续激活免疫反应的产生，这于之前实验中验证的持续时间较短的免疫效果相符合。而三药联用组则能够持续的杀伤肿瘤细胞并产生TAA，完成抗原-APC-CTL的闭环，并且降低了Treg导致的免疫抑制，从而诱导持续而有效的免疫效果，并产生最优的治疗效果。
实施例七 cRGD-CPs-L、A6-CPs-L的抗肿瘤活性实验
荷B16F10黑色素瘤小鼠被随机分为3组，每组3只（n=3）：PBS， cRGD-CPs-L尾静脉注射（i.v.），A6-CPs-L尾静脉注射（i.v.），LTX-315: 50 mg/kg。从给药开始设为第0天，所有LTX-315囊泡在每天上午给药一次（尾静脉给药体积为200 μL），持续三天。每2天检测体重和肿瘤体积，常规方法计算肿瘤相对体积，见图13，可以看出cRGD-CPs-L与A6-CPs-L相比，抑瘤效果具有显著差异。
小结：
本发明首先制备了cRGD靶向的装载有溶瘤肽LTX-315的囊泡cRGD-CPs-L，实际载药量达到18.3 wt.%，粒径在45-61 nm之间，具有出色的稳定性和还原响应性。在细胞层面验证了cRGD-CPs-L不光能够靶向并高效杀伤B16F10细胞，同时能够保证被囊泡装载的LTX-315不被血清影响而降低药效，并且能够有效诱导ICD并使细胞释放DAMPs以及相关炎症因子。在动物层面上首先验证了cRGD-CPs-L能够在体内长循环并最终靶向到B16F10实体瘤中富集，随即在治疗中证实通过尾静脉注射cRGD-CPs-L联合CpG免疫佐剂和腹腔注射PD-1抗体，能够在小鼠体内诱导对恶性B16F10黑色素瘤的强效而长期的免疫治疗，7只受治疗小鼠中更有2只被完全治愈并且对B16F10细胞产生了抵抗能力。这种系统给药方法能够有效靶向B16F10肿瘤处并重塑肿瘤微环境，在增加肿瘤浸润T细胞的同时降低发挥免疫抑制作用的Treg，从而显著地增加了受治疗小鼠体内IL-6, TNF-α和IFN-γ的含量，并且增加了脾脏中的TCM和TEM含量，从而实现了强效而长期的免疫记忆。本发明的系统给药方法能够明显地拓宽溶瘤肽和CpG ODNs的使用窗口，为无法瘤内注射的肿瘤或是转移性浸润的肿瘤提供了一种新的治疗方案。

Claims (4)

1.一种装载溶瘤肽的聚合物囊泡，其特征在于，所述装载溶瘤肽的聚合物囊泡的制备方法为，将聚合物溶液与溶瘤肽溶液混合，然后透析，得到装载溶瘤肽的聚合物囊泡；所述聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物；所述非靶向两亲性聚合物包括亲水链段、疏水链段以及聚氨基酸链段，所述疏水链段的侧链为双硫键；所述靶向两亲性聚合物包括靶向分子、亲水链段、疏水链段，所述疏水链段的侧链为双硫键；非靶向两亲性聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-PAsp、PEG-P(LA-DTC)-PAsp或者PEG-P(CL-DTC)-PAsp，靶向两亲性聚合物为cRGD-PEG-P(LA-DTC)、cRGD-PEG-P(CL-DTC)或者cRGD-PEG-P(TMC-DTC)。
2.权利要求1所述装载溶瘤肽的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，将聚合物溶液与溶瘤肽溶液混合，然后透析，得到装载溶瘤肽的聚合物囊泡；所述聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物时，非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物的摩尔比为2～9∶1。
3.一种联合药物，其特征在于，包括权利要求1所述装载溶瘤肽的聚合物囊泡、装载免疫佐剂的聚合物囊泡、PD-1抗体；所述装载免疫佐剂的聚合物囊泡的制备方法为，将聚合物溶液与免疫佐剂溶液混合，然后透析，得到装载免疫佐剂的聚合物囊泡；所述聚合物为非靶向两亲性聚合物与靶向两亲性聚合物；所述非靶向两亲性聚合物包括亲水链段、疏水链段以及阳离子片段，所述疏水链段的侧链为双硫键；所述靶向两亲性聚合物包括靶向分子、亲水链段、疏水链段，所述疏水链段的侧链为双硫键；非靶向两亲性聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-Sp、PEG-P(LA-DTC)-Sp或者PEG-P(CL-DTC)-Sp，靶向两亲性聚合物为cRGD-PEG-P(LA-DTC)、cRGD-PEG-P(CL-DTC)或者cRGD-PEG-P(TMC-DTC)。
4.权利要求3所述联合药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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