CN106215191A - 一种脑胶质瘤靶向递药系统及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脑胶质瘤靶向递药系统及其制备方法和用途，其递药系统包括靶向分子、聚合物载体和药物，靶向分子为核酸适配体AS1411，聚合物载体为聚谷酰基谷氨酸PGG，药物为紫杉醇PTX；所述聚谷酰基谷氨酸PGG与紫杉醇PTX通过共价键结合为聚谷酰基谷氨酸‑紫杉醇共价键合物PGG‑PTX；核酸适配体AS1411通过其5’端修饰的伯氨基与PGG‑PTX表面的羧基共价连接成核酸适配体AS1411修饰的聚谷酰基谷氨酸‑紫杉醇共价键合物AS1411‑PGG‑PTX并具有下式结构。本发明可同时靶向脑胶质瘤组织以及新生血管内皮细胞，有效提高药物在肿瘤部位的蓄积，增加药物在肿瘤细胞内的浓度，增强药物的抗肿瘤治疗效果。本发明易在水中自组装成纳米粒，提高了紫杉醇化疗的精准性，有效降低紫杉醇临床应用的副作用。

Description

一种脑胶质瘤靶向递药系统及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种脑靶向递药系统，具体涉及一种核酸适配体AS1411修饰的脑胶质瘤靶向递药系统及其制备方法。本递药系统能够同时靶向脑胶质瘤组织以及新生血管内皮细胞，有效提高药物在肿瘤部位的蓄积，从而提高化疗效果。

背景技术

据世界卫生组织统计，全球脑部恶性肿瘤发病率为3.5/100,000，其中多形性神经胶质母细胞瘤Glioblastoma multiforme(GBM)是颅内最常见且死亡率最高的原发性恶性肿瘤之一，占脑部肿瘤发病率的40％左右，平均生存期只有14个月。临床上传统的治疗方法为手术切除，但因为脑肿瘤部位接近患者的中枢神经，手术难以完全清除而易导致肿瘤复发。进而，化疗成为脑胶质瘤诸多治疗环节中至关重要的一环，其成败直接影响病人的生活质量和预后。然而大多数有极好治疗前景的药物由于受血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的限制或缺乏靶向性等因素导致药物渗透能力及入胞效率较低，使得肿瘤细胞内的药物浓度过低，临床化疗效果并不理想。尤其相较于其他部位，脑部肿瘤的增强穿透与滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应较弱，以恶性胶质瘤U87MG为例，其平均孔径只有7～100nm，对脑部药物递送系统提出了更高的要求。近些年来，纳米递药系统凭借其自身在被动靶向方面的优势，更多地倾向于借助靶向分子与肿瘤细胞表面高表达的受体间的互动作用，来增强递药系统的主动靶向能力，从而进一步地增加药物在肿瘤的蓄积，提高化疗效果。

紫杉醇(Paclitaxel,PTX)作为临床广泛使用的天然广谱抗癌药物，在治疗包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑部和颈部肿瘤以及急性白血病等多种实体瘤方面具有显著作用。然而其极低的水溶性及严重的副作用限制了紫杉醇的临床应用，目前临床上使用的紫杉醇注射液以聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇作为混合溶剂，临床试验中除产生神经毒性、肾毒性、心脏毒性等不良反应外，紫杉醇注射液还存在稀释后不稳定等弊端。为此，近年来国内外的诸多研究者致力于紫杉醇新剂型的研究，包括紫杉醇乳剂、脂质体、聚合物胶束、纳米粒、环糊精包合物等剂型。聚合物胶束作为纳米医学发展的重要成果，通过化学、物理以及静电作用等多种方法包载药物，在提高药物的溶解性、稳定性和靶向性上表现出了明显的优势。目前韩国已有商品化的注射用紫杉醇胶束(Genexol-PM，Paclitaxel/L01CD01)，与传统紫杉醇制剂相比具有高效低毒的特点，且对紫杉醇耐药性的肿瘤有治疗效果。但是，该制剂仍存在着载药量低、辅料注射剂量大的缺点，导致系统毒副作用强，同时其疗效也有待于进一步提高。目前紫杉醇纳米递药系统在治疗脑肿瘤方面仍存在许多问题：由于血脑屏障的阻碍作用，使得98％的小分子药物和几乎所有的大分子药物难以进入中枢；并且药物入脑后呈现全脑分布，难以集中到病变部位，还可能造成对正常神经中枢的毒副作用。对于脑肿瘤的治疗，紫杉醇纳米递药系统在改善PTX水溶性的基础上，应侧重于血脑屏障、肿瘤组织靶向性的提高、稳定性的增加、生物利用度的提高、毒副反应的降低等方面。然而，目前还没有用于脑肿瘤临床治疗的紫杉醇靶向药物上市，因此，研发具有生物降解、定向传递、持续释放的药物载体，将会成为紫杉醇脑靶向纳米递药系统的研究热点。

紫杉醇高分子键合物，是通过将紫杉醇与水溶性聚合物以共价键结合成键合物，从而提高紫杉醇的水溶性。键合物前药通过水解等方式释放出PTX原药并发挥药效。该剂型可有效避免其他物理包裹型胶束的初期突释现象。多聚谷氨酸的生物可降解性及无毒性使其成为一种极具发展前景的药物载体，之前的工作已经成功地将临床Ⅲ期的聚谷氨酸-紫杉醇键合物PGA-PTX的骨架修饰一个谷氨酸(glutamic acid)得到聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇键合物PGG-PTX，极大地提高了紫杉醇的水溶性，且相较PGA-PTX降低了药物的细胞毒性，而且可以自组装形成纳米粒，其临界浓度仅为(～25μg/mL)。然而，高分子键合物PGG-PTX虽水溶性好，但其载药量并不能满足高载药量的临床需求，通过加大药量来增加药效的同时也会加重药物的系统毒副作用。因此，通过提高药物的肿瘤靶向性、增加药物在肿瘤组织的蓄积，减少药物在体内的非特异性分布，可大大提高药物的治疗效果，换言之，PGG-PTX可通过增加其肿瘤特异靶向性，来进一步提高治疗效果，具有极大的临床应用前景。

核酸适配体(aptamer)是一类能够特异性与靶物质结合的短寡核苷酸序列。它可作用于蛋白质、金属离子、小分子化合物、细胞膜表面受体等靶标。其结合能力与抗体相当，且具有比抗体免疫原性低、稳定性良好等优势，可结合各种药物及载体构建靶向递药系统用于肿瘤的靶向治疗。其中，核酸适配体AS1411，是一种鸟嘌呤G丰富的单链短DNA序列，其独特的“四倍体”结构可特异性识别并结合高表达于快速增殖细胞表面及胞浆的核仁蛋白(nucleolin)。包括脑胶质瘤在内的多种肿瘤细胞与新生血管内皮细胞膜表面均高表达该核仁蛋白。AS1411可与核仁蛋白识别并结合，随其进入胞浆，将药物一同带入胞内。

发明内容

本发明的目的在于将核酸适配体AS1411连接到聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物PGG-PTX上，构建靶向脑胶质瘤细胞及新生血管内皮细胞的双级-靶向递药系统，从而提高紫杉醇PTX在脑胶质瘤内的蓄积，增加肿瘤细胞内的药物浓度，进而增强脑胶质瘤的抑制效果。

本发明的另一目的是提供构建核酸适配体AS1411修饰的聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物AS1411-PGG-PTX该脑胶质瘤靶向递药系统的制备方法及用途。

本发明的目的是这样实现的：

一种脑胶质瘤靶向纳米递药系统，特点是该系统包括靶向分子、聚合物载体和药物，所述靶向分子为核酸适配体，聚合物载体为聚谷酰基谷氨酸PGG，药物为紫杉醇PTX；其中，核酸适配体为AS1411，其序列为5’-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3’；所述聚谷酰基谷氨酸PGG与紫杉醇PTX通过共价键结合为聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物PGG-PTX；核酸适配体AS1411通过其5’端修饰的伯氨基与PGG-PTX表面的羧基共价连接成核酸适配体AS1411修饰的聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物AS1411-PGG-PTX；AS1411-PGG-PTX在水中自组装形成纳米粒，粒径为30～40nm，粒径分散度为0.2～0.4；AS1411-PGG-PTX具有下式结构，其中x、y代表聚合度，x＝20～25、y＝200～250，R₁为PTX，R₂为AS1411；

一种上述脑胶质瘤靶向纳米递药系统的制备方法，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：活化PGG-PTX表面的羧基

取PGG-PTX溶于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液MES buffer中；其中2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液MES buffer的pH为6.0，浓度为0.1M，PGG-PTX的浓度为10μM；再依次加入过量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和过量的N-羟基丁二酰二胺NHS；其中EDC和NHS分别为200mM，25℃、400rpm条件下磁力搅拌0.5h；

步骤2：清洗活化后的PGG-PTX

将步骤1得到的溶液超滤，除去EDC和NHS；其中超滤管截留分子量为30000，离心力为2500g、5min/次；重复此步骤4次；

步骤3：核酸适配体AS1411变性-复性处理

将5’端伯氨基修饰的AS1411即5’-NH2-AS1411溶于无DNA/RNA酶的蒸馏水中；溶液85℃水浴10min后再冰浴10min；其中5’-NH2-AS1411的浓度为20μM；

步骤4：AS1411与PGG-PTX的连接

将步骤2得到的PGG-PTX溶液与步骤3得到的5’-NH2-AS1411溶液共孵育，25℃、400rpm条件下磁力搅拌6h；其中PGG-PTX与5’-NH2-AS1411的摩尔比为1:2；

步骤5：AS1411-PGG-PTX的纯化

将步骤4得到的溶液超滤，除去未连接的5’-NH2-AS1411；重复此步骤4次，所得溶液真空冷冻干燥，得到白色固体即为所述的递药系统AS1411-PGG-PTX；其中，超滤管截留分子量为50000，离心力为2500g、5min/次。

所述递药系统用于脑胶质瘤治疗药物的靶向递送。

本发明所述的PGG-PTX合成参考文献：

[1]Van S,Das SK,Wang X,Feng Z,Jin Y,Hou Z,et al.Synthesis,characterization,and biological evaluation of poly(L-gamma-glutamyl-glutamine)-paclitaxel nanoconjugate.International journal ofnanomedicine.2010；5:825-37。

本发明所述的5’-NH2-AS1411购于上海铂尚生物技术有限公司。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明AS1411修饰的聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物AS1411-PGG-PTX，即将高效靶向脑胶质瘤细胞及新生血管内皮细胞的核酸适配体AS1411连接在聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物表面，通过AS1411将药物PGG-PTX富集并带入脑胶质瘤细胞、增加药物PGG-PTX在脑胶质瘤细胞内的浓度，从而增强肿瘤细胞的抑制作用；同时AS1411也将药物PGG-PTX靶向肿瘤新生血管内皮细胞，抑制其生长，从而切断肿瘤内部血供，从另一方面达到抑制肿瘤生长的作用。

因此，AS1411-PGG-PTX脑胶质瘤靶向纳米递药系统的优势在于：(1)粒径小且稳定，体内循环时间长，更适合脑肿瘤靶向递药；(2)具有脑胶质瘤组织、新生血管双级靶向递药功能。可有效提高细胞对药物的摄取，增加药物在肿瘤细胞内的蓄积。

附图说明

图1为AS1411-PGG-PTX的合成路线图；

图2为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的粒径对比图；

图3为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的表面电势对比图；

图4为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的粒径分散度对比图；

图5为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的稳定性对比图；

图6为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的透射电镜表面形态对比图；

图7为U87MG细胞对AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的摄取荧光定性对比图；

图8为U87MG细胞对AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的摄取流式细胞荧光定性对比图；

图9为U87MG细胞对AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的摄取流式细胞荧光定量对比图；

图10为HUVEC细胞对AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的摄取荧光定性对比图；

图11为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的肿瘤球渗透性荧光定性对比图；

图12为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的肿瘤球渗透性荧光定量对比图；

图13为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的小动物体内荧光成像对比图；

图14为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的小动物脑部荧光成像对比图；

图15为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的小动物脑部荧光定量对比图；

图16为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的脑胶质瘤冰冻切片荧光分布对比图；

图17为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的动物生存曲线对比图；

图18为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的脑胶质瘤石蜡切片H&E染色对比图；

图19为AS1411-PGG-PTX与PGG-PTX的脑胶质瘤冰冻切片TUNEL染色对比图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面采用实施例来进一步阐明本发明，但本发明内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

聚谷酰基谷氨酸PGG的制备：

1)将聚谷氨酸钠cPGA-Na(分子量35000,10g)，谷氨酸叔丁基丁酯盐酸盐H-Glu(otBu)₂·HCl(38.3g,0.148mol)，1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl(37.0g,0.193mol)，1-羟基苯并三氮唑HOBt(10.6g,0.074mol)，溶解于500mL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，25℃、700rpm磁力搅拌24h，通氩气保护。将反应后的溶液缓慢倒入3L去离子水中，有白色沉淀析出，过滤，用去离子水250mL洗涤3次，冷冻干燥15h得到白色固体。

2)将1)步骤得到的产物(60g)转移至1L圆底烧瓶，加入480mL的三氟乙酸TFA，25℃、700rpm磁力搅拌4h。40℃条件下真空旋转蒸发除去TFA，得到黄色油状物，重复此步骤2次后，加入800mL去离子水，700rpm磁力搅拌30min直至完全溶解。加入去离子水将溶液稀释至4L，再转入透析袋(截留分子量10000)透析24h，期间每4小时更换全部去离子水。检测透析袋外溶液电阻率＜0.05ms/cm时，收集透析袋内部溶液，0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥得到白色固体为聚谷酰胺谷氨酸PGG。

实施例2

聚谷酰基谷氨酸PGG-PTX的制备：

聚谷酰胺谷氨酸PGG(10g)，加入500mL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，25℃、700rpm磁力搅拌30min直至完全溶解，再加入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl(9.4g,0.049mol)和4-二甲基吡啶(2.6g)，继续搅拌15min。将紫杉醇PTX(5.4g)加入反应瓶，25℃、700rpm磁力搅拌26～28h，反应完全后，冰浴环境中将反应液缓慢倒入1.5L盐酸水溶液(0.2M)中，析出白色沉淀，5000rpm离心10min，所得白色沉淀溶于1.5L碳酸氢钠(0.5M)水溶液中，再转入透析袋(截留分子量10000)透析24h，期间每4小时更换全部去离子水。检测透析袋外溶液电阻率＜0.05ms/cm时，收集透析袋内部溶液，0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥得到白色固体为聚谷酰胺谷氨酸-紫杉醇共价键合物PGG-PTX。

得到的聚谷酰胺谷氨酸-紫杉醇共价键合物PGG-PTX经紫外分光光度法测得PTX载药量为20％，分子量为80k Da，水中最大溶解量为60mg/mL。

实施例3

核酸适配体AS1411修饰的聚谷酰胺谷氨酸-紫杉醇共价键合物AS1411-PGG-PTX的制备：

1)取8mg(10nmol)的聚谷酰胺谷氨酸-紫杉醇共价键合物PGG-PTX溶于1mL的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液MES buffer(pH 6.0,0.1M)，其中PGG-PTX的浓度为10μM。再依次加入200mM的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和200mM的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，25℃、400rpm磁力搅拌30min，活化PGG-PTX表面的羧基，混合液由透明澄清变为白色浑浊。

2)将1)步骤得到的溶液转移至4mL超滤管(截留分子量:30000)，用无DNA/RNA酶的蒸馏水DNase/RNase free water清洗，除去EDC/NHS，其中DNase/RNase free water用量4mL/次，离心力为2500g，5min/次，重复此步骤4次。

3)将5’-NH2-AS1411溶于1mL的DNase/RNase free water中，其中5’-NH2-AS1411浓度为20μM。之后溶液先在85℃下孵育10min，再转入冰浴孵育10min；其中5’-NH2-AS1411由上海铂尚生物技术公司合成(5OD/20nmol)。

4)将2)步骤与3)步骤得到的溶液共孵育，25℃、400rpm磁力搅拌6h，混合液由白色浑浊变为透明澄清。

5.将4)步骤所得混合液转移至4mL超滤管超滤(截留分子量:50000)，用DNase/RNase free water清洗，除去未结合的AS1411，其中DNase/RNase free water用量4mL/次，离心力为2500g，5min/次，重复此步骤4次，最后收集超滤管内的溶液即为AS1411-PGG-PTX。将AS1411-PGG-PTX溶液冷冻干燥得到白色固体即为AS1411-PGG-PTX递药系统。超滤管下收集的溶液为未结合的AS1411，并用于接枝率的测定。

6)AS1411接枝效率测定：根据Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(invitrogen:P11496)方法定量未结合的AS1411，再由公式：接枝效率＝(总量_AS1411-未结合_AS1411)/总量_AS1411×100％算得AS1411的接枝效率。本实验的AS1411接枝率为89.9％。

AS1411-PGG-PTX的合成路线图，如图1所示。其中x、y代表聚合度，x＝20～25、y＝200～250，R₁为PTX，R₂为AS1411。

实施例4

AS1411-PGG-PTX的粒径、电位测定

配制AS1411-PGG-PTX溶液1mg/mL，震荡混匀5min后，用马尔文激光粒度测定仪测定其粒径大小及粒径分布。配制AS1411-PGG-PTX溶液1mg/mL，震荡混匀5min后，用马尔文激光粒度测定仪测定电位大小。如图2所示，测得A组PGG-PTX粒径为60～70nm，B组AS1411-PGG-PTX粒径为30～40nm；如图3所示，A组PGG-PTX表面电势为-40～-50nm，B组AS1411-PGG-PTX表面电势为-10mV；如图4所示，A组PGG-PTX粒径分布PDI为0.4～0.5，B组AS1411-PGG-PTX粒径分布PDI为0.2～0.3。综合图2、图3、图4可知，AS1411-PGG-PTX的粒径较小于PGG-PTX，且AS1411-PGG-PTX的表面电势高于PGG-PTX。因此，AS1411-PGG-PTX较小的粒径更适合脑肿瘤的治疗，AS1411-PGG-PTX较高的表面电势也更利于肿瘤细胞的摄取。

实施例5

AS1411-PGG-PTX的稳定性测定

配制AS1411-PGG-PTX溶液1mg/mL，按照实施例4的方法分别测定其一周内的粒径大小及表面电势情况。如图5所示，A-1和B-1分别代表PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX一周内的粒径变化情况，A-2和B-2分别代表PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX组一周内的表面电势变化情况。由图可看出AS1411-PGG-PTX的粒径及表面电势一周内变化幅度比PGG-PTX小，即相较于PGG-PTX，AS1411-PGG-PTX具有更好的稳定性。

实施例6

AS1411-PGG-PTX的表面形态鉴定

配制AS1411-PGG-PTX溶液1mg/mL，稀释10倍，震荡混匀5min，采用2％磷钨酸染色后，用透射电镜观察其表面形态。如图6所示，A组PGG-PTX与B组AS1411-PGG-PTX的表面均圆整；AS1411-PGG-PTX的粒径较小于PGG-PTX，且AS1411-PGG-PTX的粒径较PGG-PTX更均一。

实施例7

AS1411-PGG-PTX的体外靶向性---U87MG细胞摄取定性实验

取10mg的PGG-PTX及AS1411-PGG-PTX溶于4mL蒸馏水中，加入溶有10μg DiO的甲醇，室温孵育30min，加6mL蒸馏水分散，40℃真空旋转蒸发除去甲醇，浓缩至5mL即得到载DiO的PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX。

将U87MG细胞以2×10⁴cell/mL的密度接种于24孔细胞培养板，37℃、5％CO₂、饱和湿度下，用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％S/P)培养细胞24h后换去培养液，每孔加入1mL载DiO的PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX(50μg/mL)(PTX浓度为10μg/mL)继续培养0.5h，之后除去药物，用PBS清洗细胞，4％多聚甲醛固定15min后PBS再清洗细胞，最后用DAPI染细胞核5min并用PBS清洗。通过激光共聚焦显微镜观察细胞对药物的摄取情况。如图7所示，L组为蓝色荧光(DAPI)通道，G组为绿色荧光(DiO)通道，M组为蓝色荧光(DAPI)通道与绿色荧光(DiO)通道的叠加；C组为未加药的U87MG细胞空白对照组，A组为PGG-PTX给药组，B组为AS1411-PGG-PTX给药组；由图可看出AS1411-PGG-PTX组荧光强度明显高于PGG-PTX组，表明U87MG细胞对AS1411-PGG-PTX的摄取明显高于PGG-PTX。说明AS1411-PGG-PTX具有体外靶向U87MG细胞的能力。

实施例8

AS1411-PGG-PTX的体外靶向性----U87MG细胞摄取定量实验

将U87MG细胞以2×10⁴cell/mL的密度接种于24孔细胞培养板，37℃、5％CO2、饱和湿度下，用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％S/P)培养细胞24h后换去培养液，每孔加入1mL载DiO的PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX(50μg/mL)(PTX浓度为10μg/mL)继续培养0.5h，之后除去药物，用PBS清洗细胞，胰蛋白酶-EDTA(0.25％)消化细胞后离心(1000rpm)4min，PBS重悬细胞后，用流式细胞仪检测细胞摄取情况。如图8所示，流式细胞仪测得B组的AS1411-PGG-PTX荧光强度明显高于A组的PGG-PTX，且A/B组荧光强度均远远高于C组未加药的空白对照。如图9，流式细胞仪荧光定量结果显示B组AS1411-PGG-PTX荧光强度是A组PGG-PTX的3倍，且A/B组荧光强度均远远高于C组未加药的空白对照。即U87MG细胞对AS1411-PGG-PTX的摄取量是PGG-PTX的3倍。表明AS1411-PGG-PTX具有体外靶向U87MG细胞的能力。图9中****代表配对T检验P＜0.0001，表明两组具有显著性差异。

实施例9

AS1411-PGG-PTX的体外靶向性----HUVEC细胞摄取定性实验

将HUVEC细胞以2×10⁴cell/mL的密度接种于24孔细胞培养板，37℃、5％CO2、饱和湿度下，用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％S/P)培养细胞24h后换去培养液，每孔加入1mL载DiO的PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX(50μg/mL)(PTX浓度为10μg/mL)继续培养0.5h，之后除去药物，用PBS清洗细胞，4％多聚甲醛固定15min后PBS再清洗细胞，最后用DAPI染细胞核5min并用PBS清洗。通过激光共聚焦显微镜观察细胞对药物的摄取情况。如图10所示，L组为蓝色荧光(DAPI)通道，G组为绿色荧光(DiO)通道，M组为蓝色荧光(DAPI)通道与绿色荧光(DiO)通道的叠加；C组为未加药的HUVEC细胞空白对照组，A组为PGG-PTX给药组，B组为AS1411-PGG-PTX给药组。由图可看出AS1411-PGG-PTX组荧光强度明显高于PGG-PTX组，表明HUVEC细胞对AS1411-PGG-PTX的摄取明显高于PGG-PTX。说明AS1411-PGG-PTX也具有体外靶向HUVEC细胞的能力。

实施例10

AS1411-PGG-PTX的体外3D肿瘤球渗透性实验

将U87MG细胞以1×10⁵cell/mL的密度接种于2％低熔点琼脂糖预处理过的48孔细胞培养板，37℃、5％CO2、饱和湿度下，用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％S/P)培养细胞，7天之后形成肿瘤球，加入载DiO的PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX(100μg/mL)(PTX浓度为20μg/mL)继续培养6h，之后除去药物，用PBS清洗细胞，4％多聚甲醛固定15min后PBS再清洗细胞。通过激光共聚焦显微镜观察肿瘤球对药物的摄取情况，并测量药物渗入肿瘤球的深度。如图11所示，B组AS1411-PGG-PTX荧光强度明显高于A组PGG-PTX，表明U87MG细胞肿瘤球对AS1411-PGG-PTX的摄取明显高于PGG-PTX；图12显示B组AS1411-PGG-PTX的荧光深度是A组PGG-PTX的2.5倍，即AS1411-PGG-PTX的渗透深度是PGG-PTX的2.5倍。说明AS1411-PGG-PTX具有脑胶质瘤靶向性以及良好的肿瘤球渗透能力。图12中****代表配对T检验P＜0.0001，表明两组具有显著性差异。

实施例11

AS1411-PGG-PTX的体内靶向性---小动物荧光成像实验

U87MG原位脑胶质瘤荷瘤鼠，接种20天后，尾静脉注射200μL载DiR的PGG-PTX或AS1411-PGG-PTX(DiR为10μg)，每组4只。12h、24h、48h分别由小动物活体成像仪分析其DiR荧光信号。6h、12h、24h、48h每组取出3只动物处死后用PBS心脏灌流，脑组织匀浆并用酶标仪定量其DiR荧光信号。24h各组取1只动物处死后PBS心脏灌流，取出脑组织后由小动物活体成像仪分析其DiR荧光信号。如图13所示，12h、24h、48h均显示小鼠脑部B组AS1411-PGG-PTX荧光信号高于A组PGG-PTX；图14所示的24h脑组织荧光成像亦显示B组AS1411-PGG-PTX荧光信号明显高于A组PGG-PTX组；图15中的6h、12h、24h、48h脑组织匀浆荧光定量结果也显示B组AS1411-PGG-PTX荧光含量均高于A组PGG-PTX，且24h时，AS1411-PGG-PTX组信号是PGG-PTX组的1.5倍。综上表明AS1411-PGG-PTX具有良好的体内脑胶质瘤靶向性。图15中***代表配对T检验P＜0.001，表明两组具有显著性差异。

实施例12

AS1411-PGG-PTX的体内靶向性---脑组织冰冻切片荧光分布实验

U87MG原位脑胶质瘤荷瘤鼠，接种20天后，尾静脉注射200μL载DiO的PGG-PTX或AS1411-PGG-PTX(DiO为10μg)，每组3只。4h后处死动物并用PBS心脏灌流，取出的脑组织用4％多聚甲醛固定48h，然后15％、30％的蔗糖溶液依次脱水处理48h，最后OCT包埋，完成冰冻切片(切片厚度为10μm)。用DAPI染核5min，PBS清洗后用激光共聚焦显微镜观察脑切片中胶质瘤内载绿色荧光DiO的药物PGG-PTX和AS1411-PGG-PTX的分布情况。如图16所示，给药4h后，B组AS1411-PGG-PTX的小鼠瘤内荧光信号明显高于A组PGG-PTX，且A/B组荧光信号均明显高于C组未给药的肿瘤空白对照组，表明AS1411-PGG-PTX具有良好的脑胶质瘤靶向性。

实施例13

AS1411-PGG-PTX的药效学---平均生存时间监测实验

U87MG原位脑胶质瘤荷瘤鼠，随机分成4组(saline、PGG-PTX、AS1411-PGG-PTX组)，每组8只，分别于接种后第3、6、9、12天，尾静脉给药100μL(PTX药物剂量：每公斤动物体重给10mg的PTX)。记录各组动物的生存时间并绘制生存曲线。如图17所示，B组AS1411-PGG-PTX治疗组、A组PGG-PTX治疗组、T组Toxal治疗组相较C组未加药组均延长了荷瘤小鼠的平均生存时间，其中AS1411-PGG-PTX治疗组具有最长的生存期，表明AS1411-PGG-PTX相较PGG-PTX具有更好的脑胶质瘤治疗效果。

实施例14

AS1411-PGG-PTX的药效学---脑胶质瘤病理切片实验

U87MG原位脑胶质瘤荷瘤鼠，随机分成4组(saline、PGG-PTX、AS1411-PGG-PTX四组)，每组6只，分别于接种后第3、6、9、12天，尾静脉给药100μL(PTX药物剂量：每公斤动物体重给10mg的PTX)。

第15天，处死动物并用PBS心脏灌流，取出的脑组织用4％多聚甲醛固定48h，每组中3只为一组，分别做石蜡切片和冰冻切片处理，用于H&E染色和TUNEL分析。如图18为脑胶质瘤切片H&E染色，相较于C组未加药组，T组Toxal治疗组、A组PGG-PTX治疗组、B组AS1411-PGG-PTX治疗组均出现细胞凋亡(细胞凋亡表现为细胞核破碎)，其中AS1411-PGG-PTX治疗组肿瘤组织细胞凋亡比例显著高于PGG-PTX组和Toxal组；图19为脑胶质瘤冰冻切片TUNEL染色，相较于C组未加药组，T组Toxal治疗组、A组PGG-PTX治疗组、B组AS1411-PGG-PTX治疗组均出现细胞凋亡(细胞凋亡表现为荧光信号，图19中的荧光已用箭头标明)，其中AS1411-PGG-PTX治疗组荧光信号显著高于PGG-PTX组。综合图18/19，可得出AS1411-PGG-PTX相较PGG-PTX能更有效诱导肿瘤组织细胞凋亡。综上表明AS1411-PGG-PTX具有更好的治疗效果。

Claims (3)

1.一种脑胶质瘤靶向纳米递药系统，其特征在于该系统包括靶向分子、聚合物载体和药物，所述靶向分子为核酸适配体，聚合物载体为聚谷酰基谷氨酸PGG，药物为紫杉醇PTX；其中，核酸适配体为AS1411，其序列为5’-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3’；所述聚谷酰基谷氨酸PGG与紫杉醇PTX通过共价键结合为聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物PGG-PTX；核酸适配体AS1411通过其5’端修饰的伯氨基与PGG-PTX表面的羧基共价连接成核酸适配体AS1411修饰的聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物AS1411-PGG-PTX；AS1411-PGG-PTX在水中自组装形成纳米粒，粒径为30～40nm，粒径分散度为0.2～0.4；所述AS1411-PGG-PTX具有下式结构，其中x、y代表聚合度，x＝20～25、y＝200～250，R₁为PTX，R₂为AS1411；

2.一种权利要求1所述脑胶质瘤靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：活化PGG-PTX表面的羧基

取PGG-PTX溶于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液MES buffer中；其中2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液MES buffer的pH为6.0，浓度为0.1M，PGG-PTX的浓度为10μM；再依次加入过量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和过量的N-羟基丁二酰二胺NHS；其中EDC和NHS分别为200mM，25℃、400rpm条件下磁力搅拌0.5h；

步骤2：清洗活化后的PGG-PTX

将步骤1得到的溶液超滤，除去EDC和NHS；其中超滤管截留分子量为30000，离心力为2500g、5min/次；重复此步骤4次；

步骤3：核酸适配体AS1411变性-复性处理

将5’端伯氨基修饰的AS1411即5’-NH2-AS1411溶于无DNA/RNA酶的蒸馏水中；溶液85℃水浴10min后再冰浴10min；其中5’-NH2-AS1411的浓度为20μM；

步骤4：AS1411与PGG-PTX的连接

将步骤2得到的PGG-PTX溶液与步骤3得到的5’-NH2-AS1411溶液共孵育，25℃、400rpm条件下磁力搅拌6h；其中PGG-PTX与5’-NH2-AS1411的摩尔比为1:2；

步骤5：AS1411-PGG-PTX的纯化

将步骤4得到的溶液超滤，除去未连接的5’-NH2-AS1411；重复此步骤4次，所得溶液真空冷冻干燥，得到白色固体即为所述的递药系统AS1411-PGG-PTX；其中，超滤管截留分子量为50000，离心力为2500g、5min/次。

3.一种权利要求1所述递药系统的用途，其特征在于该递药系统用于脑胶质瘤治疗药物的靶向递送。