CN110124057A - 一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体 - Google Patents

一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体，及在制备抗肿瘤药物中的应用，其中谷氨酰胺修饰的β‑环糊精可以与化疗药物形成包合物，通过靶向肿瘤中异常高表达的谷氨酰胺转运体ASCT2将化疗药物转运进入肿瘤细胞，谷氨酰胺修饰的环糊精或者谷氨酰胺修饰的β‑环糊精与阿霉素或紫杉醇形成的包合物能够靶向谷氨酰胺转运体ASCT2，并被该转运体识别、转运进入肿瘤细胞，进而杀伤肿瘤细胞；由于荷瘤机体中，肿瘤是最大的谷氨酰胺摄取器官，而肝、肾、肺、肌肉等均为谷氨酰胺分泌器官，因此通过靶向谷氨酰胺转运体能够很好的降低化疗药物对肝、肾、肺等主要器官的毒副作用。

Description

一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域，尤其是涉及一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物。
背景技术
癌症是危害公众健康的重大问题。尽管近年来出现了免疫疗法、抗血管生成制剂等新的技术，基于细胞毒类药物的化疗依然是癌症治疗的基石地位。但是，化疗对正常器官的毒副作用仍然是限制其临床疗效的主要因素。谷氨酰胺是胞浆中含量最丰富的氨基酸，在细胞内参与能量产生、生物大分子合成、氧化还原等生物过程。依赖于外源性的谷氨酰胺，是大多数肿瘤细胞代谢的共同特点。因此，大多数肿瘤细胞都会高表达谷氨酰胺转运体ASCT2，例如肺癌、乳腺癌、结直肠癌等，并且ASCT2的表达与病人的预后密切相关。在正常机体中，肺、肌肉组织、脂肪组织是主要的谷氨酰胺分泌器官，小肠和肾是主要的消耗器官；当肿瘤发生时，肿瘤成为了谷氨酰胺最大的消耗器官，肺和肌肉分泌谷氨酰胺增多，肝和肾也转变成谷氨酰胺的分泌器官。基于纳米材料载体靶向运输化疗药到肿瘤部位一直是研究的热点，然而根据最新统计，只有0.7％(中位数)的药物进入了肿瘤。此外，纳米载体安全性难以评估、不稳定、批次间差异大等因素都限制了纳米载体用于药物开发的可能性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体。
本发明采用的技术方案是：一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物，包含谷氨酰胺修饰的环糊精。
优选地，环糊精为β-环糊精。
优选地，谷氨酰胺与β-环糊精的修饰比例为1:1～7:1；
优选地，谷氨酰胺与β-环糊精的修饰比例为1:1。
一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物包合物，由谷氨酰胺修饰的环糊精与细胞毒类化疗药物形成；
优选地，谷氨酰胺修饰的环糊精与细胞毒类化疗药物摩尔比为1:1。
优选地，细胞毒类化疗药物为阿霉素或紫杉醇。
一种谷氨酰胺修饰环糊精的制备方法，在钠氢条件下用溴乙酸叔丁酯取代β-环糊精α羟基的氢，然后用三氟乙酸脱去溴乙酸叔丁酯上的叔丁基形成游离羧基，最后在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的作用下将游离出的羧基与L-谷氨酰胺的氨基联结成酰胺键制成谷氨酰胺修饰的β-环糊精。
谷氨酰胺修饰的环糊精在抗肿瘤药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包含但不限于乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、淋巴瘤、结直肠癌、宫颈癌、膀胱癌、胆管癌、食管癌、头颈鳞癌、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌、胸腺癌或子宫内膜瘤。
谷氨酰胺转运体ASCT2作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，谷氨酰胺修饰的药物载体或药物特异性通过谷氨酰胺转运体ASCT2靶点转运进入肿瘤细胞；
优选地，谷氨酰胺修饰的药物载体或药物为谷氨酰胺修饰的环糊精。
优选地，通过抑制或阻断谷氨酰胺转运体ASCT2杀伤肿瘤细胞。
本发明具有的优点和积极效果是：
1谷氨酰胺修饰的环糊精或者谷氨酰胺修饰的β-环糊精与阿霉素或紫杉醇形成的包合物能够靶向谷氨酰胺转运体ASCT2，并被该转运体识别、转运进入肿瘤细胞，进而杀伤肿瘤细胞；
2由于谷氨酰胺是非必需氨基酸，谷氨酰胺转运体ASCT2在正常细胞表面不表达或处于失活状态，因此该包合物不能被正常细胞摄取，从而避免阿霉素或紫杉醇对正常细胞的毒性；
3用谷氨酰胺修饰β-环糊精并与化疗药形成包合物，能够有效的利用肿瘤对谷氨酰胺的依赖性将化疗药带入肿瘤细胞，而避免肝、肾、肺等主要器官对化疗药的摄取，进而降低化疗药的毒副作用为化疗药带来更好的临床疗效。
附图说明
图1实施例1中ASCT2在多种肿瘤和正常组织中的表达量；
图2实施例2中谷氨酰胺-环糊精合成路线图；
图3实施例2中谷氨酰胺-环糊精1H-NMR谱图；
图4实施例2中谷氨酰胺-环糊精质谱图；
图5实施例3中阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物荧光光谱图；
图6实施例3中阿霉素和谷氨酰胺-环糊精的比例与592nm波长处荧光强度的关系；
图7实施例4中谷氨酰胺-环糊精与ASCT2结合作用力；
图8实施例4中谷氨酰胺-环糊精诱导ASCT2闭合状态；
图9实施例5中乳腺癌细胞和正常乳腺细胞对阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物的摄取流式图；
图10实施例6中GPNA对乳腺癌细胞摄取阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物的影响；
图11实施例7中阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物对乳腺癌细胞及正常乳腺细胞增殖的影响；
图12实施例8中阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物诱导肺癌细胞凋亡；
图13实施例9中紫杉醇-谷氨酰胺-环糊精包合物对乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌细胞周期的影响；
图14实施例10中治疗后乳腺癌肿瘤大小直观图；
图15实施例10中肿瘤重量统计图；
图16实施例10中肿瘤生长曲线；
图17实施例10中阿霉素-谷氨酰胺-环糊精治疗对小鼠体重的影响；
图18实施例10中阿霉素-谷氨酰胺-环糊精对小鼠血清CK、LDH的影响；
图19实施例10中小鼠主要器官HE染色图；
GLN谷氨酰胺
GLN-CD谷氨酰胺-环糊精
Ctrl对照组
DOX阿霉素
DOX@CD阿霉素-环糊精包合物
DOX@GLN-CD阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物
PTX@GLN-CD紫杉醇-谷氨酰胺-环糊精包合物
5-1 Ctrl，5-2 DOX@CD，5-3 DOX@GLN-CD，5-4 DOX；
6-1 Ctrl，6-2 GPNA 3mM，6-3 GPNA 1mM，6-4 GPNA 0.3mM，6-5 GPNA 0mM。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
基于细胞毒类药物的化疗方法依然是癌症治疗的基石，而化疗对正常器官的毒副作用仍然是限制其临床疗效的主要因素，这种毒副作用主要是由于肿瘤细胞和正常细胞对化疗药物的无选择摄取导致的。通过药物载体将化疗药靶点递送至肿瘤细胞，是克服化疗药毒副作用的有效技术手段。依赖于外源性谷氨酰胺是大多数肿瘤细胞代谢的共同特点，谷氨酰胺转运体ASCT2也在多种肿瘤组织中异常高表达，ASCT2可以作为抗肿瘤药物的一个新靶点，在荷瘤机体中，肿瘤是谷氨酰胺最大的消耗器官，肝、肾、肺、肌肉等均是谷氨酰胺分泌器官。谷氨酰胺修饰的药物载体或药物可以特异性通过谷氨酰胺转运体ASCT2转运进入肿瘤细胞，谷氨酰胺修饰的药物载体或药物为谷氨酰胺修饰的环糊精，可以通过抑制或阻断谷氨酰胺转运体ASCT2杀伤肿瘤细胞。谷氨酰胺修饰的β-环糊精与阿霉素或紫杉醇形成的包合物，由于谷氨酰胺是非必需氨基酸，谷氨酰胺转运体ASCT2在正常细胞表面不表达或处于失活状态，因此该包合物不能被正常细胞摄取，从而避免阿霉素或紫杉醇对正常细胞的毒性；因此，用谷氨酰胺修饰β-环糊精并与化疗药形成包合物，能够有效的利用肿瘤对谷氨酰胺的依赖性将化疗药带入肿瘤细胞，而避免肝、肾、肺等主要器官对化疗药的摄取，进而降低化疗药的毒副作用；由于荷瘤机体中肝、肾、肺等主要器官不摄取谷氨酰胺，因此该包合物也不能被肝、肾、肺等器官摄取，从而降低阿霉素或紫杉醇的毒副作用。
在钠氢条件下用溴乙酸叔丁酯取代β-环糊精α羟基的氢，然后用三氟乙酸脱去溴乙酸叔丁酯上的叔丁基形成游离羧基，最后在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的作用下将游离出的羧基与L-谷氨酰胺的氨基联结成酰胺键制成谷氨酰胺修饰的β-环糊精。谷氨酰胺与β-环糊精的修饰比例为1:1～7:1，当其修饰比例为1:1时，其联合效果最佳。将谷氨酰胺修饰的β-环糊精按照摩尔比为1：1的比例与阿霉素或紫杉醇制成包合物，能够用于制备治疗乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、淋巴瘤、结直肠癌、宫颈癌、膀胱癌、胆管癌、食管癌、头颈鳞癌、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌、胸腺癌或子宫内膜瘤的抗肿瘤药物。
试验发现，制得的阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物能够特异性被三阴乳腺癌细胞系摄取而不被正常乳腺细胞摄取，在流式细胞技术测定内吞实验中，阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物可以被三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549摄取，而不被正常乳腺细胞MCF10A摄取；在MTT法测定细胞增殖实验中，0.1～10μM的阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物能够显著降低三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549的增殖，且抑制率接近游离阿霉素，但是对正常乳腺细胞MCF10A的增殖无明显影响。同样的，阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物进入乳腺癌细胞的能力可被ASCT2抑制剂L-谷氨酰基-4-硝基苯胺拮抗，在流式细胞技术测定内吞实验中，MDA-MB-231和BT549摄取阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物的量随着L-谷氨酰基-4-硝基苯胺的浓度升高而减小，进一步说明阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物是通过谷氨酰胺转运体ASCT2进入乳腺癌细胞。阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物还能够特异性诱导肺癌细胞凋亡而不引起正常支气管细胞凋亡，在流式细胞技术测定细胞凋亡实验中，1～5μM的阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物能够特异性诱导肺癌细胞A549和H1299凋亡，但不诱导正常支气管上皮细胞BEAS-2B凋亡。
与阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物相同，制得的紫杉醇-谷氨酰胺-环糊精包合物能够特异性抑制乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌细胞，细胞周期的G2/M阻滞是紫杉醇作用于细胞的主要现象，在流式细胞技术测定细胞周期实验中，0.1～10μM的紫杉醇-谷氨酰胺-环糊精包合物能够特异性诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231、宫颈癌细胞Hela、胆管癌细胞TFK-1、结直肠癌细胞HCT116和肺癌细胞A549细胞周期的G2/M阻滞。
阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物具有与游离阿霉素接近或更优的肿瘤抑制效果，但屏蔽游离阿霉素对正常器官的毒性作用。在裸鼠乳腺癌异体移植瘤模型中，阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物能够显著抑制肿瘤生长且效果优于同等剂量的游离阿霉素；治疗过程中，阿霉素表现出较强的心脏、肝脏、肾脏、脾脏毒性，而同等剂量的阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物并未表现出明显的脏器毒性。说明阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物既可以抑制肿瘤生长，又能屏蔽阿霉素对主要脏器的毒副作用。
下面通过具体实施例进一步说明本方案在抗肿瘤药物中的效果，下述实施例中主要试剂及材料来源如下：
MDA-MB-231、BT549、MCF10A、A549、H1299、BEAS-2B、Hela、TFK-1、HCT116细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；DMEM/High glucose(1X)培养基、胎牛血清购自Thermo Scientific(货号分别为SH30022.01B和SV30087.02)；培养皿、离心管等均购自美国Corning公司；阿霉素、紫杉醇购自大连美仑生物技术有限公司；MTT购自SIGMA；β-环糊精、谷氨酰胺购自北京百灵威科技有限公司；BALB/C-nu裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2012-0001)；荧光分光光度计型号为RF-5301PC(Shimadzu,Japan)；流式细胞仪(BD Biosciences,USA)。
实施例1：谷氨酰胺转运体ASCT2在各肿瘤中的表达量。
ASCT2在各肿瘤中的表达量通过从公共数据库GEPIA查询获取，搜索条件“SLC1A5”(ASCT2基因名)，每种肿瘤样本量如表1所示，ASCT2在各肿瘤中表达情况如图1所示，在膀胱上皮癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、淋巴瘤、结直肠癌、宫颈癌、膀胱癌、胆管癌、食管癌、头颈鳞癌、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜瘤、肉瘤等肿瘤中，ASCT2在肿瘤组织中的表达量均远高于正常组织。
表1
实施例2：谷氨酰胺-环糊精的合成。
一种谷氨酰胺修饰环糊精的制备方法，在钠氢条件下用溴乙酸叔丁酯取代β-环糊精α羟基的氢，然后用三氟乙酸脱去溴乙酸叔丁酯上的叔丁基形成游离羧基，最后在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的作用下将游离出的羧基与L-谷氨酰胺的氨基联结成酰胺键制成谷氨酰胺修饰的β-环糊精，谷氨酰胺与β-环糊精的修饰比例为1:1～7:1，均能够实现本方案的药物作用，现以修饰比例为1:1为例详细描述合成方法如下。
具体操作步骤：
1)氮气保护下向β-环糊精(β-CD)(11.3g，0.01mol)的DMF(150mL)中室温加入钠氢(4g，0.1mol)和溴乙酸叔丁酯(19.5g，0.1mol)，升温至80℃搅拌过夜。0℃下向反应液中加入水(50mL)，旋干溶剂得到粗品，加入50mL甲醇搅拌过夜。过滤，滤饼烘干得到化合物2(15g)。
2)向化合物2(10g,8mmol)的水(200mL)中室温加入TFA(30mL)，反应液30℃搅拌过夜。将反应液用油泵旋干，再用用乙醇带水得到化合物3(10g)。
3)将化合物3(2.4g，2mmol)溶于30mL去离子水中，加入EDCI.HCl(1.2g，6mmol)，35℃下搅拌2小时。将L-谷氨酰胺(1.2g，8mmol)分批加入反应液，然后继续搅拌72小时。将反应液旋干得到粗品，用甲醇重结晶除去多余的EDCI.HCl，加少量的水溶解粗品，过阳离子离子交换树脂柱(流动相为去离子水)，合并流动相冻干得到终产物谷氨酰胺-环糊精(GLN-CD)(1g)。
具体合成路线如图2所示，产物经1H-NMR分析结构正确，质谱峰为1320.4，与计算的负离子模式下m/z峰1320.43一致，如图3-4所示，说明化合物GLN-CD被成功合成。
实施例3：谷氨酰胺-环糊精与阿霉素形成包合物。
取100mg GLN-CD(75.7μmol)在40℃条件下溶于6mL超纯水，分别将37.8，50.5，75.7和151.4μmol的阿霉素(DOX)溶于0.6mL DMSO，然后在搅拌条件下分别逐滴滴加到GLN-CD溶液中，40℃继续搅拌8小时。用80mL无水乙醇沉淀并洗涤3次，收集沉淀真空干燥获得阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物(DOX@GLN-CD)。阿霉素进入环糊精内腔后荧光强度增强，因此阿霉素的包合效率通过荧光光谱进行分析，各包合物测试浓度为9.2×10-4mol/L，激发波长495nm。
如图5-6所示，随着DOX:GLN-CD比例增大，荧光逐渐增强，说明DOX与GLN-CD成功形成了包合物；将峰592nm处的荧光值与投料比作图，发现1:1之后荧光强度进入平台期，说明DOX与GLN-CD形成包合物的最适比例为1:1。
实施例4：分子动力学模拟谷氨酰胺-环糊精与ASCT2的结合。
首先用SWISS-MODEL根据同源蛋白EAAT1的晶体结构构建ASCT2的3D结构并定位谷氨酰胺(GLN)的结合位点，分别将GLN和GLN-CD放入谷氨酰胺结合位点，通过Desmond软件进行分子动力学模拟。结果显示，谷氨酰胺修饰到β-环糊精上并未影响谷氨酰胺与ASCT2的结合，主要的结合氨基酸Ile431、Thr438、Asp464、Thr468在两者中具有一致性，如图7所示。ASCT2对谷氨酰胺的转运是变构转运，因此监测了动力学模拟过程中ASCT2构象的变化，如图8所示，GLN和GLN-CD均能诱导ASCT2的构象由开合状态变为闭合状态，说明GLN-CD可以像谷氨酰胺一样通过ASCT2的变构转运进入细胞。
实施例5：流式细胞术测定乳腺癌细胞和正常乳腺细胞对阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物的摄取。
取对数生长期的MDA-MB-231、BT549、MCF10A细胞，以8×105个/3mL铺于6cm皿中，12h后分别加2.76μM的DOX、DOX@CD(阿霉素的环糊精包合物)和DOX@GLN-CD处理24小时，等量的生理盐水用作对照。收集细胞，PBS洗2次，然后用流式细胞仪进行分析。每个样本收集20000个细胞。
结果如图9所示，在MDA-MB-231和BT549乳腺癌细胞中，DOX@GLN-CD包合物的细胞内吞接近但稍弱于游离阿霉素，可能是因为游离阿霉素主要是自由扩散所致；但是在MCF10A正常细胞中，游离阿霉素的细胞内吞仍然很强，而DOX@GLN-CD包合物却不能被内吞。说明DOX@GLN-CD包合物可以进入乳腺癌肿瘤细胞，但不能进入正常细胞。
实施例6：ASCT2抑制剂拮抗乳腺癌细胞对阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物的摄取。
L-谷氨酰基-4-硝基苯胺(GPNA)是公认的ASCT2竞争性拮抗剂，半数抑制浓度约为0.85mM。取对数生长期的MDA-MB-231和BT549细胞，以8×105个/3mL铺于6cm皿中，12h后分别加2.76μM DOX@GLN-CD和0、0.3、1、3mM的GPNA共同处理24小时，等量的生理盐水用作对照。收集细胞，PBS洗2次，然后用流式细胞仪进行分析。每个样本收集20000个细胞。
实验结果如图10所示，随着GPNA浓度的增加，MDA-MB-231和BT549细胞对DOX@GLN-CD包合物的摄取逐渐减少，说明GPNA与DOX@GLN-CD是竞争关系，进一步说明DOX@GLN-CD是通过ASCT2转运进入细胞。
实施例7：阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物对乳腺癌细胞及正常乳腺细胞增殖的影响。
通过MTT实验检测DOX@GLN-CD人乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549及正常乳腺细胞MCF10A的毒性作用。
1)取对数生长期的MDA-MB-231、BT549、MCF10A细胞，以4×103/0.2ml种于96孔板中，培养12h后每孔加DOX、DOX@CD、DOX@GLN-CD 20μl，药物终浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、6、9μM，继续培养48h。
2)用无菌PBS配制5mg/mL的MTT溶液，用0.22μM膜过滤，然后用培养基稀释至1mg/mL。弃去96孔板中的培养基，加入100μL 1mg/mL的MTT工作液，继续培养4h。
3)弃去MTT工作液，每孔加入150μL DMSO，置于水平摇床震荡10min，用酶标仪检测在波长562nm处的吸光度。
实验结果如图11所示，游离阿霉素对三种细胞增殖的抑制无选择性，DOX@GLN-CD包合物仅对乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549的增殖有显著抑制，且抑制能力接近游离阿霉素，但是对正常细胞MCF10A无明显抑制。实验说明，DOX@GLN-CD包合物能够特异性抑制乳腺癌细胞增殖。
实施例8：阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物诱导肺癌细胞凋亡。
药物诱导的细胞凋亡通过流式细胞术进行检测。取对数生长期的肺癌细胞A549、H1299和支气管上皮细胞BEAS-2B，以1.5×106个/3mL铺于6cm皿中，12h后分别加3.68μMDOX、DOX@CD、DOX@GLN-CD处理24小时。每组收集细胞1×106个，PBS洗2次，然后用AnnexinV-APC凋亡试剂盒(AO2001-11A，三箭生物，天津)进行染色，凋亡的细胞同时被Annexin V-APC和7-AAD标记，用流式细胞仪进行分析。
实验结果如图12所示，游离阿霉素能够无选择性诱导三种细胞的凋亡，但是DOX@GLN-CD包合物仅诱导肺癌细胞A549和H1299的凋亡，而不诱导支气管上皮细胞BEAS-2B的凋亡，说明DOX@GLN-CD包合物能够特异性诱导肺癌细胞凋亡。
实施例9：紫杉醇-谷氨酰胺-环糊精包合物(PTX@GLN-CD)对乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌细胞周期的影响。
诱导细胞周期G2/M阻滞是紫杉醇作用于细胞的主要表现，药物诱导的细胞周期变化通过流式细胞术进行进行分析。
取乳腺癌细胞MDA-MB-231、宫颈癌细胞Hela、胆管癌细胞TFK-1、结直肠癌细胞HCT116、肺癌细胞A549接种于6cm皿中，分别加1μM PTX@GLN-CD处理24小时。收集细胞，70％乙醇4℃固定过夜，PI/RNase(BD Pharmingen,Sparks,MD,USA)避光孵育15min，流式上机检测，每个样本收集20000个细胞进行分析，用ModFit LT 3.2软件分析细胞周期的分布。
实验结果如图13所示，紫杉醇-谷氨酰胺-环糊精包合物能够将乳腺癌细胞MDA-MB-231、宫颈癌细胞Hela、胆管癌细胞TFK-1、结直肠癌细胞HCT116、肺癌细胞A549细胞周期阻滞在G2/M期，显著抑制这些肿瘤细胞的增殖。
实施例10：阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物体内抑制肿瘤生长及器官毒性评估。
取24只BALB/c nude裸鼠，5-6周龄，在每只小鼠右侧第二对乳房脂肪垫原位接种1.5×106个MDA-MB-231细胞，使其成瘤，制备裸鼠原位乳腺癌模型。成瘤7天后随机分成4组，分别给药生理盐水、DOX、DOX@CD和DOX@GLN-CD，给药方式为尾静脉注射，给药剂量为5mg/kg(按DOX剂量计)，给药频率为每4天1次连续6次。每4天记录1次小鼠体重，并测量肿瘤长径和短径，按公式1/2×长径×短径2计算肿瘤体积。第30天，小鼠全部处死，收集全血3000rpm离心15min获取血清，用试剂盒测定肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)(货号分别为BC1145和BC0680索莱宝生物科技，北京)的含量；肿瘤拍照并称重；心脏、肝脏、肾脏、脾脏用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，然后进行HE染色。
肿瘤大小和重量如图14-16所示，DOX@GLN-CD能够显著抑制肿瘤生长，且效果优于游离阿霉素，可能是良好的靶向能力将更多的阿霉素递送到了肿瘤部位。血清中CK和LDH含量是评估心脏毒性的重要指标，如图17-18所示，游离阿霉素给药组，血清中CK和LDH含量升高了约3倍，小鼠体重明显下降，均为阿霉素的毒副作用的表现；而DOX@GLN-CD给药组，血清中CK和LDH含量无显著升高，且小鼠体重无明显下降，说明DOX@GLN-CD屏蔽了阿霉素的毒副作用。进一步HE染色结果显示，如图19所示，阿霉素对心肌和肝、肾、脾等主要器官均有明显损伤，而该损伤未见于DOX@GLN-CD给药组。该实验总体说明，阿霉素-谷氨酰胺-环糊精包合物能够在体内显著抑制肿瘤生长，同时屏蔽阿霉素对心脏、肝、肾、脾等主要器官的毒性作用。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体，其特征在于：包含谷氨酰胺修饰的环糊精。
2.根据权利要求1所述的包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体，其特征在于：所述环糊精为β-环糊精。
3.根据权利要求2所述的包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物或药物载体，其特征在于：谷氨酰胺与β-环糊精的修饰比例为1:1～7:1；
优选地，谷氨酰胺与β-环糊精的修饰比例为1:1。
4.一种包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物包合物，其特征在于：谷氨酰胺修饰的环糊精作为药物载体与细胞毒类化疗药物形成；
优选地，谷氨酰胺修饰的环糊精与细胞毒类化疗药物摩尔比为1:0.5-2；
优选地，谷氨酰胺修饰的环糊精与细胞毒类化疗药物摩尔比为1:1。
5.根据权利要求4所述的包含谷氨酰胺修饰的环糊精的抗肿瘤药物包合物，其特征在于：所述细胞毒类化疗药物为阿霉素或紫杉醇。
6.一种谷氨酰胺修饰环糊精的制备方法，其特征在于：在钠氢条件下用溴乙酸叔丁酯取代β-环糊精α羟基的氢，然后用三氟乙酸脱去溴乙酸叔丁酯上的叔丁基形成游离羧基，最后在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的作用下将游离出的羧基与L-谷氨酰胺的氨基联结成酰胺键制成谷氨酰胺修饰的β-环糊精。
7.权利要求1-6中任一所述的谷氨酰胺修饰的环糊精在制备抗肿瘤药物中的应用；优选地，所述肿瘤包含但不限于乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、淋巴瘤、结直肠癌、宫颈癌、膀胱癌、胆管癌、食管癌、头颈鳞癌、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌、胸腺癌或子宫内膜瘤。
8.谷氨酰胺转运体ASCT2作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：谷氨酰胺修饰的药物载体或药物特异性通过谷氨酰胺转运体ASCT2靶点转运进入肿瘤细胞，所述谷氨酰胺修饰的药物载体或药物为谷氨酰胺修饰的环糊精。
9.根据权利要求8所述的谷氨酰胺转运体ASCT2作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：通过抑制或阻断谷氨酰胺转运体ASCT2杀伤肿瘤细胞。
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