CN112891351B - 萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及萘酰亚胺‑多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明通过将萘酰亚胺‑多胺衍生物与米托蒽醌（MIT）联合使用，提供了一种萘酰亚胺‑多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用。试验结果证明，将萘酰亚胺‑多胺衍生物与米托蒽醌联合作用于人结直肠癌细胞和小鼠结直肠癌细胞，表现出较强的抑制结直肠癌的活性，表现出较好的协同抑制肿瘤的效果，因而具有较好的实际应用价值。萘酰亚胺‑多胺衍生物和米托蒽醌联合用药能够成为结直肠癌患者治疗的新方法。

Description

萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的 应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是胃肠道常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率位居肿瘤疾病中的第三位，也是威胁人类健康的最常见肿瘤。由于转移和复发等原因，结直肠癌预后差。目前，临床上针对结直肠癌主要是以手术治疗为主，放疗和化疗为辅助疗法。
米托蒽醌(Mitoxantrone，MIT)是一类合成的蒽醌类抗肿瘤药物，具有广泛的抗肿瘤效果，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、淋巴瘤和白血病等癌症中有不过的疗效。米托蒽醌(MIT)是阿霉素的类似物，其抗肿瘤活性等于或略高于阿霉素，由于无氨基糖骨架结构，不会产生自由基，而且具有抑制脂质氧化的作用，对心脏毒性小。米托蒽醌(MIT)能够与DNA相互作用，诱导单链和双链DNA的断裂以及通过抑制拓扑异构酶II阻断DNA的修复。米托蒽醌(MIT)能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。已有的报道显示，米托蒽醌(MIT)同其她抗肿瘤药物具有协同作用。
多胺(polyamine)是一类含有两个或更多个氨基的小分子化合物，天然的多胺包括腐胺、精胺、亚精胺。多胺是维持细胞生长和分化的必要物质，参与许多重要的细胞过程。在多种肿瘤中，多胺代谢异常，靶向多胺代谢已成为具有应用前景的肿瘤治疗方案。更为重要的是，抗肿瘤药物经过多胺修饰后，能够提高其抗肿瘤效果。
萘酰亚胺-多胺衍生物是一类萘酰亚胺类化合物经多胺修饰产生的多胺衍生物。萘酰亚胺-多胺衍生物涉及到的作用机制：(1)进入细胞核，同DNA相结合，抑制D拓扑异构酶的活性，抑制DNA的修复，从而引起DNA损伤；(2)定位于线粒体，诱导线粒体ROS的升高，进而抑制细胞生长和诱导细胞凋亡；(3)定位于溶酶体，调控溶酶体的相关功能，通过诱导自噬性凋亡抑制肿瘤的生长。
尽管萘酰亚胺-多胺衍生物具有一定的抗肿瘤效果，但是还没有一类多胺修饰的化合物应用于临床，这是由于此类化合物具有一定的骨髓毒性和神经毒性，限制了其应用。因此，需要寻找更为有效和安全的解决方案。目前，尚无萘酰亚胺-多胺衍生物与米托蒽醌(MIT)联合用药治疗肿瘤的报道。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，发明人经长期的实践探索，通过将萘酰亚胺-多胺衍生物与米托蒽醌(MIT)联合使用，提供了一种萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用。试验结果证明，将萘酰亚胺-多胺衍生物与米托蒽醌联合作用于人结直肠癌细胞和小鼠结直肠癌细胞，表现出较强的抑制结直肠癌的活性，表现出较好的协同抑制肿瘤的效果，因而具有较好的实际应用价值。
本发明的另一个目的是提供一种含有米托蒽醌的抗肿瘤药物组合物。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述萘酰亚胺-多胺衍生物为专利文献(CN 105669657 B)中实施例5化合物，亦为论文(Dai Fujun,Li Qian,Wang Yuxia,Ge Chaochao,Feng Chenyang,Xie Songqiang,HeHaoying,Xu Xiaojuan,Wang Chaojie.Design,Synthesis,and Biological Evaluationof Mitochondria-Targeted Flavone-Naphthalimide-Polyamine Conjugates withAntimetastatic Activity.[J].Journal of medicinal chemistry,2017,60(5).)中的化合物6c，为了便于说明，故以下称为化合物6c。
具体的，所述萘酰亚胺-多胺衍生物6c的结构式为：
Figure BDA0002929874010000021
具体的，所述肿瘤包括但不限于人结直肠癌、人肺腺癌、人肝癌、人食管癌、人胰腺癌、人前列腺癌、人乳腺癌、人胃癌、人子宫内膜癌、人膀胱癌、人皮肤癌或人血癌。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌在联合应用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌既可以混合后使用也可以单独分开使用。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌在联合应用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用或分多次连续添加使用。
具体的，当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和多胺衍生物的摩尔比为：(1-1.5):1；当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌每次添加的摩尔比为(5-8):1，共连续添加7-14次。
优选的，当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和多胺衍生物的摩尔比为1.5:1；当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌每次添加的摩尔比为7.5:1，共连续添加14次。
本发明还提供了萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抑制结肠癌细胞增殖或促进其凋亡药物中的应用，所述结肠癌细胞为HCT116或HT-29或CT-26细胞。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5-7.5μM，米托蒽醌的浓度在4-5μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
优选的，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5或7.5μM，米托蒽醌的浓度在5μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
进一步的，本发明还提供了萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抑制结肠癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物在用量为3mg/kg/天且米托蒽醌0.4mg/kg/天时能抑制结肠癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。
进一步的，本发明还提供了一种含有米托蒽醌的抗肿瘤药物组合物，包括萘酰亚胺-多胺衍生物或其盐，以及米托蒽醌或其盐。
具体的，所述含有米托蒽醌的抗肿瘤药物组合物中，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌的摩尔比为(1-1.5)：1。
优选的，所述含有米托蒽醌的抗肿瘤药物组合物中，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌的摩尔比为1：1或1.5：1。
具体的，所述萘酰亚胺-多胺衍生物结构式为：
Figure BDA0002929874010000031
具体的，所述含有米托蒽醌的抗肿瘤药物组合物使用时，在室温条件下，将溶于生理盐水的化合物和米托蒽醌按照所述比例混合。
本发明还进一步提供了上述药物组合物的制剂，该制剂由所述药物组合物和药学上可接受的载体组成。
本发明通过将萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合作用于治疗结直肠癌中，以达到更好的结直肠癌治疗效果的目的。本发明所述组合的联合用药的实现机理是：萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合可以抑制结直肠癌细胞增殖，诱导结直肠癌细胞凋亡和自噬，能够上调结直肠癌细胞HCT116中cleaved caspase 3、cleaved PARP，p53、LC3II和p21的表达。
活性氧(ROS)清除剂能够逆转萘酰亚胺-多胺衍生物6c抑制结直肠癌细胞的作用。在该应用中，为了达到更好的效果，萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)最好同时给予。在细胞水平上，较低浓度的萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联用后，抑制结直肠癌细胞的增殖，诱导结直肠癌细胞发生凋亡，上调LC3II蛋白的表达。自噬抑制剂3-MA和ROS清除剂能够部分逆转联合用药对结直肠癌的抑制效果。在动物水平上，联合用药相比于萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌(MIT)，能显著抑制结直肠癌在体内的生长，并可以延长荷瘤小鼠的生存率。
与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：
萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌(MIT)单独用药时具有一定的抑制结直肠癌效果，但是萘酰亚胺-多胺衍生物6c单独用药对荷瘤小鼠的生命延长没有意义。联合应用后能降低萘酰亚胺-多胺衍生物6c的给药剂量，且同单独用药相比，抗肿瘤效果显著提高并可以延长荷瘤小鼠的生存率。萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌(MIT)联合用药能够成为结直肠癌患者治疗的新方法。
附图说明
图1为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HCT116 48小时后细胞增殖抑制的结果；
图2为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HT-29 48小时后细胞增殖抑制的结果；
图3为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于小鼠结直肠癌细胞CT-26 48小时后细胞增殖抑制的结果；
图4为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HCT116后的细胞克隆形成结果；
图5为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HT-29后的细胞克隆形成结果；
图6为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于小鼠结直肠癌细胞CT-26后的细胞克隆形成结果；
图7为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HCT116后的细胞中凋亡和自噬蛋白的western blot结果；
图8为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HCT116后的细胞中MIT荧光强度结果；
图9为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HT-29后的细胞中MIT荧光强度结果；
图10为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于小鼠结直肠癌细胞CT-26后的细胞中MIT荧光强度结果；
图11为萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌(MIT)联合用药作用于人结直肠癌细胞HCT116、HT-29和小鼠结直肠癌细胞CT-26后的细胞中6c荧光强度结果；
图12为经3-MA预处理后联合用药对人结直肠癌细胞HCT116增殖抑制的结果；
图13为经3-MA预处理后联合用药对小鼠结直肠癌细胞CT-26增殖抑制的结果；
图14为经NAC预处理后联合用药对人结直肠癌细胞HCT116增殖抑制的结果；
图15为经NAC预处理后联合用药对小鼠结直肠癌细胞CT-26增殖抑制的结果；
图16为经3-MA预处理后联合用药作用于人结直肠癌细胞HCT116后细胞中凋亡和自噬蛋白的western blot结果；
图17为经NAC预处理后联合用药作用于人结直肠癌细胞HCT116后细胞中凋亡和自噬蛋白的western blot结果；
图18为联合用药对结直肠癌体内生长作用的结果；
图19为联合用药后肿瘤内自噬蛋白的western blot结果；
图20为联合用药后肿瘤内凋亡蛋白的免疫组化结果；
图21为联合用药后小鼠脏器的H&E染色结果；
图22为联合用药后荷瘤小鼠的生存率结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
本发明中所用米托蒽醌购买于Sigma-Aldrich公司。
本发明主要提供萘酰亚胺-多胺衍生物6c与米托蒽醌联合用药的应用方式，其中，采用生理盐水制备萘酰亚胺-多胺衍生物6c储备液和米托蒽醌储备液。
体外试验中萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌的浓度比为5μM：5μM或5μM：7.5μM。
体内试验中萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌的给药剂量为3mg/kg/day：0.4mg/kg/day。
本发明所述萘酰亚胺-多胺衍生物6c按照论文Dai Fujun,Li Qian,Wang Yuxia,Ge Chaochao,Feng Chenyang,Xie Songqiang,He Haoying,Xu Xiaojuan,WangChaojie.Design,Synthesis,and Biological Evaluation of Mitochondria-TargetedFlavone-Naphthalimide-Polyamine Conjugates with Antimetastatic Activity.[J].Journal of medicinal chemistry,2017,60(5).中的方法获得，其结构式为：
Figure BDA0002929874010000061
实施例选用的癌细胞株包括：人结直肠癌细胞HCT116、人结直肠癌细胞HT-29、小鼠结直肠癌细胞CT-26。
实施例1：萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌联合使用的体外生物活性评价
试验一：
分别取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116、HT-29或小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，按每孔4000个细胞接种于96孔板中，使其贴壁生长24小时。萘酰亚胺-多胺衍生物6c的终浓度为5μM和7.5μM，米托蒽醌(MIT)的终浓度为5μM。继续孵育培养48小时。待指定时间后，每孔加入50μL的MTT溶液(2.5mg/mL，PBS缓冲液)，孵育4小时后去除96孔板中的液体，并加入100μL二甲基亚砜溶液，置于摇床上轻轻摇动10分钟，以使96孔板中的紫色结晶物充分溶解。然后，用多功能酶标仪测量570nm下各孔的吸光值，并计算细胞增殖抑制率；其中抑制率(％)＝(OD570对照组-OD570实验组/OD570对照组)×100％。
结果分别如图1(HCT116)、图2(HT-29)、图3(CT-26)所示，统计结果显示，同对照组和单药处理组相比，联合用药能够显著抑制人结直肠癌细胞HCT116的增殖(图1所示)、人结直肠癌细胞HT-29的增殖(图2所示)以及小鼠结直肠癌细胞CT-26的增殖(图3所示)。
试验二：
分别取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116、HT-29或小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，按每孔800细胞接种于6孔板中，使其贴壁生长24小时。继续培养10天，每隔两天更换一次培养基。从第11天开始，分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c(7.5μM)、米托蒽醌(5μM)和同样浓度条件下的二者联合用药，继续孵育培养72小时。待指定时间后，加入4％的多聚甲醛进行固定；固定30分钟后，加入结晶紫孵育10分钟，去除6孔板中的液体，并加入PBS洗去未结合的结晶紫。待6孔板中水分挥发后，使用倒置显微镜进行拍照。
结果分别如图4(HCT116)、图5(HT-29)、图6(CT-26)所示，统计结果显示，同对照组和单药处理组相比，联合用药能够显著抑制人结直肠癌细胞HCT116的克隆形成能力(图4所示)、人结直肠癌细胞HT-29的克隆形成能力(图5所示)以及小鼠结直肠癌细胞CT-26的克隆形成能力(图6所示)。
试验三：
取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，按每皿8×105个细胞接种于6cm培养皿中，使其贴壁生长24小时。分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c(7.5μM)、米托蒽醌(5μM)和同样浓度条件下的二者联合用药，继续孵育培养24小时。24小时后收集上清，贴壁细胞继续使用胰蛋白酶消化液消化细胞，并收集到对应的10mL EP管中，以转速1500r/min离心8分钟。弃去上清液，使用4℃预冷的PBS清洗细胞并转移至1.5mL EP管中，以转速1500r/min离心8分钟，弃去上清液，每个样品加入300μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强裂解液混匀，每隔10分钟振荡器震荡一次。30分钟后，4℃12000r/min，离心30分钟。取上清250μL置于新1.5mLEP管中，BCA蛋白定量试剂盒参照说明书配置，96孔板每孔200μL BCA蛋白定量液，再加入每孔2μL蛋白上清液，37℃孵育1小时后多功能酶标仪进行检测，计算蛋白浓度。Western blot检测相关蛋白的表达变化，以β-actin作为内参。
结果如图7所示，同对照组和单药处理组相比，联合用药能够显著诱导PARP1发生切割和上调cleaved caspase3、p53、p21、BAK、LC3Ⅱ等蛋白的表达。以上实验进一步说明，在结直肠癌细胞中，联合用药能够诱导细胞发生凋亡和自噬。
试验四：
分别取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116、HT-29或小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，按每孔4000个细胞接种于96孔板中，使其贴壁生长24小时。分别加入米托蒽醌(5μM)和同样浓度条件下萘酰亚胺-多胺衍生物6c(7.5μM)与米托蒽醌(5μM)二者联合用药，继续孵育培养6小时。去除培养基，用PBS洗三遍，采用高内涵成像系统拍照和采集荧光强度值，并进行统计分析。
结果分别如图8(HCT116)、图9(HT-29)、图10(CT-26)所示，统计结果显示，同对照组和单药处理组相比，联合用药能够显著增强米托蒽醌(MIT)在人结直肠癌细胞HCT116中的聚集(图8所示)、在人结直肠癌细胞HT-29中的聚集(图9所示)以及在小鼠结直肠癌细胞CT-26中的聚集(图10所示)。
试验五：
取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116、HT-29和小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，接种于96孔板中，使其贴壁生长24小时。分别加萘酰亚胺-多胺衍生物6c(7.5μM)和同样浓度条件下萘酰亚胺-多胺衍生物6c(7.5μM)与米托蒽醌(5μM)二者联合用药，继续孵育培养6小时。去除培养基，用PBS洗三遍，采用高内涵成像系统拍照和采集荧光强度值，并进行统计分析。
统计结果如图11所示，同对照组和单药处理组相比，联合用药能够对萘酰亚胺-多胺衍生物6c在结直肠癌细胞中的聚集没有影响。
上述实验表明，联合用药能够显著抑制结直肠癌细胞的体外生长，且同单药组对比，联合用药抑制结直肠癌生长的活性明显增强。联合用药抑制结直肠癌生长活性的增强是依赖化合物6c提高米托蒽醌在细胞内的累积实现的。
实施例2：萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌联合使用的体外作用机制
试验六：
分别取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116或小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，接种于96孔板中，使其贴壁生长24小时。加入细胞自噬抑制剂3-MA预处理1小时后，同时加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c、米托蒽醌(MIT)及其联合用药，萘酰亚胺-多胺衍生物6c的终浓度为5μM和7.5μM，米托蒽醌(MIT)的的终浓度为5μM。继续孵育培养24小时。待指定时间后，每孔加入50μL的MTT溶液(2.5mg/mL，PBS缓冲液)，孵育4小时后去除96孔板中的液体，并加入100μL二甲基亚砜溶液，置于摇床上轻轻摇动10分钟，以使96孔板中的紫色结晶物充分溶解。然后，用多功能酶标仪测量570nm下各孔的吸光值，并计算细胞增殖抑制率；其中抑制率(％)＝(OD570对照组-OD570实验组/OD570对照组)×100％。
统计结果如图12、13所示显示，同未进行预处理组相比，3-MA预处理能够降低联合用药对人结直肠细胞HCT116(如图12)和小鼠结直肠细胞CT-26(如图13)的增殖抑制能力。以上实验说明，联合用药可以通过诱导自噬抑制细胞的生长。
试验七：
分别取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116或小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/mim离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，按每孔4000个细胞接种于96孔板中，使其贴壁生长24小时。加入ROS清除剂NAC(终浓度为10mM)预处理1小时后，同时加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c、米托蒽醌(MIT)及其联合用药，萘酰亚胺-多胺衍生物6c的终浓度为5μM和7.5μM，米托蒽醌(MIT)的的终浓度为5μM。继续孵育培养24小时。待指定时间后，每孔加入50μL的MTT溶液(2.5mg/mL，PBS缓冲液)，孵育4小时后去除96孔板中的液体，并加入100μL二甲基亚砜溶液，置于摇床上轻轻摇动10分钟，以使96孔板中的紫色结晶物充分溶解。然后，用多功能酶标仪测量570nm下各孔的吸光值，并计算细胞增殖抑制率；其中抑制率(％)＝(OD570对照组-OD570实验组/OD570对照组)×100％。
统计结果如图14、15所示显示，同未进行预处理组相比，NAC预处理能够降低联合用药对人结直肠细胞HCT116(如图14)和小鼠结直肠细胞CT-26(如图15)的增殖抑制能力，以上实验说明，联合用药依赖活性氧(ROS)抑制细胞的生长。
试验八：
取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116，以转速1000r/mim离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，按每皿8×105个细胞接种于6cm培养皿中，使其贴壁生长24小时。加入自噬抑制剂3-MA(终浓度为2mM)预处理1小时后，分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c(7.5μM)、米托蒽醌(5μM)和同样浓度条件下的二者联合用药，继续孵育培养24小时。24小时后收集上清，贴壁细胞继续使用胰蛋白酶消化液消化细胞，并收集到对应的10mL EP管中，以转速1500r/min离心8分钟。弃去上清液，使用4℃预冷的PBS清洗细胞并转移至1.5mL EP管中，以转速1500r/min离心8min，弃去上清液，每个样品加入300μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强裂解液混匀，每隔10分钟振荡器震荡一次。30min后，4℃12000r/min离心30分钟。取上清250μL置于新1.5mL EP管中，BCA蛋白定量试剂盒参照说明书配置，96孔板每孔200μL BCA蛋白定量液，再加入每孔2μL蛋白上清液，37℃孵育1小时后多功能酶标仪进行检测，计算蛋白浓度。Western blot检测相关蛋白的表达变化，以β-actin作为内参。
结果如图16所示，同对照组和联合用药组相比，3-MA预处理能够显著降低联合用药所诱导PARP1切割和cleaved caspase3、BAK等蛋白的表达。这些实验进一步说明，在结直肠癌细胞中联合用药通过自噬诱导细胞发生凋亡。
试验九：
取呈对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116，以转速1000r/mim离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，按每皿8×105个细胞接种于6cm培养皿中，使其贴壁生长24小时。加入ROS清除剂NAC预处理1小时后，分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c(7.5μM)、米托蒽醌(5μM)和同样浓度条件下的二者联合用药，继续孵育培养24小时。24小时后收集上清，贴壁细胞继续使用胰蛋白酶消化液消化细胞，并收集到对应的10mLEP管中，以转速1500r/min离心8分钟。弃去上清液，使用4℃预冷的PBS清洗细胞并转移至1.5mL EP管中，以转速1500r/min离心8分钟，弃去上清液，每个样品加入300μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强裂解液混匀，每隔10分钟振荡器震荡一次。30分钟后，4℃12000r/min离心30分钟。取上清250μL置于新1.5mL EP管中，BCA蛋白定量试剂盒参照说明书配置，96孔板每孔200μL BCA蛋白定量液，再加入每孔2μL蛋白上清液，37℃孵育1小时后多功能酶标仪进行检测，计算蛋白浓度。Western blot检测相关蛋白的表达变化，以β-actin作为内参。
结果如图17所示，同对照组和联合用药组相比，NAC预处理能够显著降低联合用药所诱导PARP1切割和cleaved caspase3、BAK、LC3Ⅱ等蛋白的表达。这些实验进一步说明，在结直肠癌细胞中联合用药通过活性氧诱导细胞发生自噬和凋亡。
上述实验表明，细胞自噬抑制剂3-MA和活性氧清除剂NAC能够逆转联合用药抑制结直肠癌细胞的活性，这证实了联合用药是依赖自噬和活性氧发挥抑制结直肠癌作用。
实施例3：萘酰亚胺-多胺衍生物6c和米托蒽醌联合使用的体内生物活性评价
试验十：
取呈对数生长期的小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，预冷PBS洗三遍。每只小鼠(小鼠为6周龄，体重为25g左右)腋下接种CT-26细胞，细胞数目为5×105。荷瘤小鼠分为四组，分别为对照组、萘酰亚胺-多胺衍生物6c(3mg/kg/day)组、米托蒽醌(MIT，0.4mg/kg/day)组及联合用药组(6c 3mg/kg/day+MIT 0.4mg/kg/day)。连续给药14天，实验结束后，剥离肿瘤，拍照，统计肿瘤的重量并进行分析。
结果如图18所示，同对照组相比，萘酰亚胺-多胺衍生物6c组的肿瘤抑制率为42.3％，米托蒽醌(MIT)组的肿瘤抑制率为45.2％，联合用药组的肿瘤抑制率为69.1％。这些结果表明，联合用药能够提升单独用药的抗肿瘤活性。
从以上对照组、萘酰亚胺-多胺衍生物6c(3mg/kg/day)组、米托蒽醌(MIT，0.4mg/kg/day)组及联合用药组中取肿瘤组织，通过western blot实验检测ATG7和LC3蛋白的表达(参考文献Yundong He,Shihong Peng,Jinhua Wang,Huang Chen,Xiaonan Cong,AngChen,Meichun Hu,Min Qin,Haigang Wu,Shuman Gao,Liguo Wang,Xin Wang,ZhengfangYi,and Mingyao Liu.Ailanthone targets p23 to overcome MDV3100resistance incastration-resistant prostate cancer,[J].Nature Communication.2016；7:13122.中的方法)；
结果如图19所示。western blot实验结果显示，联合用药能够提高肿瘤组织内ATG7和LC3Ⅱ的表达，证明联合用药可以体内诱导肿瘤细胞发生自噬。
从以上对照组、萘酰亚胺-多胺衍生物6c(3mg/kg/day)组、米托蒽醌(MIT，0.4mg/kg/day)组及联合用药组取肿瘤组织，通过免疫组化检测cleaved caspase 3、Ki67和BAK在肿瘤组织中的表达情况(参考文献Fujun Dai,Yihua Chen,Li Huang,Jinhua Wang,TaoZhang,Jingjie Li,Weiguang Tong,Mingyao Liu,Zhengfang Yi.[J].Journal ofCellular and Molecular Medicine,2015 Feb；19(2):383-95.中的方法)。
结果如图20所示。免疫组化结果显示，在联合用药组的肿瘤组织内cleavedcaspase 3和BAK明显上调，Ki67的表达明显下调，以此表明联合用药可以体内诱导肿瘤组织发生凋亡。
从以上对照组、萘酰亚胺-多胺衍生物6c(3mg/kg/day)组、米托蒽醌(MIT，0.4mg/kg/day)组及联合用药组取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等组织，通过苏木精-伊红染色法(H&E)检测药物对组织的影响。
结果如图21所示。H&E染色结果显示，单独用药和联合用药对组织形态没有明显的影响。
试验十一：
取呈对数生长期的小鼠结直肠癌细胞CT-26，以转速1000r/min离心5min，弃上清，预冷PBS洗三遍。通过尾静脉将CT-26细胞接种到小鼠(小鼠为6周龄，体重为25g左右)体内，细胞数目为1×105，从而构建肺转移模型。荷瘤小鼠分为四组，分别为对照组、萘酰亚胺-多胺衍生物6c(3mg/kg/day)组、米托蒽醌(MIT，0.4mg/kg/day)组及联合用药组(6c 3mg/kg/day+MIT 0.4mg/kg/day)，连续给药14天。之后每天观察小鼠的状态，统计小鼠的死亡情况并对小鼠的生存率进行分析。
结果如图22所示，同单药组相比，联合给药能够延长荷瘤小鼠的生存时间。
以上实验数据表明，同单药组相比，联合用药能够显著抑制结直肠癌细胞的体内生长并明显提高单药组的抗肿瘤活性。同时，同单药组相比，联合给药能够提高荷瘤小鼠的生存率。机制方面，实验数据表明联合用药能够通过诱导自噬导致细胞发生凋亡，这种现象是依赖产生活性氧实现的。
上述实施例为本发明实施方式的举例说明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，
萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌在联合应用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用或分多次连续添加使用；
当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用时，所述应用为萘酰亚胺-多胺衍生物联合米托蒽醌在制备抑制结肠癌细胞增殖或促进其凋亡药物中的应用，结肠癌细胞为HT-29细胞，萘酰亚胺-多胺衍生物和多胺衍生物的摩尔比为：(1-1.5):1；
当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌分多次连续添加使用时，所述应用为萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌在制备抑制结肠癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用，结肠癌细胞为CT-26细胞，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌每次添加的摩尔比为(5-8):1，共连续添加7-14次；
所述萘酰亚胺-多胺衍生物结构式为：
Figure FDA0003373489370000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和多胺衍生物的摩尔比为1.5:1；当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌每次添加的摩尔比为7.5:1，共连续添加14次。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5-7.5μM，米托蒽醌的浓度在4-5μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5或7.5μM，米托蒽醌的浓度在5μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物在用量为3mg/kg/天且米托蒽醌0.4mg/kg/天时能抑制结肠癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌分多次连续添加使用时，所述结肠癌人源化移植瘤模型为荷瘤小鼠模型。
7.一种含有米托蒽醌的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括萘酰亚胺-多胺衍生物，以及米托蒽醌，萘酰亚胺-多胺衍生物和米托蒽醌的摩尔比为(1-1.5)：1；
所述萘酰亚胺-多胺衍生物结构式为：
Figure FDA0003373489370000021
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