CN116270617B - Arp2/3复合物抑制剂CK-666和多西他赛组合用于癌症治疗的制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种Arp2/3复合物抑制剂CK‑666联合多西他赛在制备抗肿瘤产品中的应用及其产品，将CK‑666与多西他赛药物组合，可提高多西他赛的药物敏感性和稳定性，提高HDRA有效率。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物组合技术领域，具体涉及一种Arp2/3复合物抑制剂CK-666联合多西他赛在制备抗肿瘤产品中的应用及其产品。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的一些理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前尿路上皮癌(UC)的治疗药物较多，但是由于肿瘤的异质性，目前适应药物有较高的不稳定性，因此临床经常出现试药的情况，导致患者承受药物副作用和经济负担。因此寻找一种药物组合提高治疗肿瘤的有效性和稳定性，对肿瘤治疗和医生选择药物提供了极大的便利。
多西他赛(Docetaxel，DTX)又名多西紫杉醇，多烯紫杉醇，分子式为C43H53NO14，分子量为807.88。作用与紫杉醇(PTX)相同，为M期周期特异性药物，促进小管聚合成稳定的微管并抑制其聚解，从而使小管的数量显著减少，并可破坏微管网状结构。推荐剂量是每三周静脉内施用一次，其中剂量范围是75～100mg/m2体表面积。对晚期乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌有较好的疗效。对头颈部癌、胰腺癌、小细胞肺癌、胃癌、黑色素瘤、软组织肉瘤也有一定的疗效。同时也是尿路上皮癌的二线治疗药物。
多西他赛在多种肿瘤治疗中发挥重要的作用，但是由于个体差异和肿瘤的异质性，多西他赛单药在治疗中也出现差异性，有些患者效果较好，有些患者无效果，有些患者不仅没有效果反而增加了药物副作用。对疗效显著的乳腺癌，非小细胞肺癌和卵巢癌，有效率仅为30％以上。
因此多种肿瘤中也出现了一些药物组合增强多西他赛的疗效，尽管如此，效果仍然存在很大的差异，因此亟需一种稳定的药物组合能够显著的提高多西他赛的药物敏感性和稳定性，对于多西他赛的应用将会获得极大的推广。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种可提高多西他赛的药物敏感性和稳定性的药物组合物或联合用药及其应用。本发明中，将CK-666与多西他赛药物组合，能够显著提升多西他赛的抗肿瘤疗效，提高3D-HDRA有效率。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在本发明的第一个方面，提供一种CK-666联合多西他赛在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明中，所述CK-666是一种细胞渗透性的与肌动蛋白相关的蛋白质Arp2/3复合物的抑制剂，它结合Arp2/3复合物，稳定复合物的非活性状态，阻止Arp2和Arp3亚单位移动进入激活的丝状构象。目前该药物还未有报道在抗肿瘤中的应用，也没有联合多西他赛的应用报道。分子量为296.34，分子式为C18H17FN2O，CAS号为442633-00-3。
在本发明中，所述肿瘤包括但不仅仅限于尿路上皮癌、食管鳞癌、咽鳞癌、卵巢癌或乳腺癌。所述尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一种多源性的恶性肿瘤，包括肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌以及尿道癌，是最常见的泌尿系统肿瘤。
在本发明的一个或多个实施方式中，联合应用时，工作液中CK-666与多西他赛的浓度配比为1:0.1～1000。
优选的，工作液中CK-666与多西他赛的浓度配比为1:0.1～100。
进一步优选的，工作液中CK-666与多西他赛的浓度配比为1:1.24。
在本发明的一个或多个实施方式中，联合应用时，工作液中CK-666的浓度小于等于200μM。
优选的，联合应用时，工作液中CK-666的浓度为100μM。
在本发明的一个或多个实施方式中，联合应用时，对于多西他赛的浓度参考临床范围。
优选的，工作液中多西他赛的浓度范围为0.1～900μg/ml。
进一步优选的，工作液中多西他赛的浓度为100μg/ml。
在本发明的第二个方面，提供一种提高多西他赛药物敏感性、抑制肿瘤细胞活性的药物组合物，该药物组合物是以CK-666和多西他赛为主要活性成分。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述CK-666与多西他赛的浓度配比为1:0.1～1000。
优选的，所述CK-666与多西他赛的浓度配比为1:0.1～100。
进一步优选的，所述CK-666与多西他赛的浓度配比为1:1.24。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述CK-666的浓度小于等于200μM。
优选的，所述CK-666的浓度为100μM。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述多西他赛的浓度范围为0.1～900μg/ml。
优选的，所述多西他赛的浓度为100μg/ml。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料为药物制剂中的常规辅料，为本领域技术人员认为可行的常规辅料均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
在本发明的第三个方面，提供一种提高多西他赛药物敏感性、抑制肿瘤细胞活性的联合用药物，所述联合用药物是分别或同时给药的CK-666和多西他赛。
在本发明的一个或多个实施方式中，联合用药时，联合用药时，工作液中CK-666与多西他赛的浓度配比为1:0.1～1000。
优选的，工作液中CK-666与多西他赛的浓度配比为1:0.1～100。
进一步优选的，工作液中CK-666与多西他赛的浓度配比为1:1.24。
在本发明的一个或多个实施方式中，联合用药时，工作液中CK-666的浓度小于等于200μM。
优选的，联合用药时，工作液中CK-666的浓度为100μM。
在本发明的一个或多个实施方式中，联合用药时，对于多西他赛的浓度参考临床范围。
优选的，工作液中多西他赛的浓度范围为0.1～900μg/ml。
进一步优选的，工作液中多西他赛的浓度为100μg/ml。
与本发明人知晓的相关技术相比，本发明其中的一个技术方案具有如下有益效果：
经过试验验证，将CK-666与多西他赛药物组合，具有比多西他赛单独用药更强的抗肿瘤活性，提高HDRA有效率，提高多西他赛的药物敏感性。在尿路上皮癌、食管鳞癌、咽鳞癌、卵巢癌或乳腺癌等癌症中的药物治疗中具有广阔的应用前景。
经过试验验证，原有多西他赛浓度的基础上增加CK-666终浓度为100μM，可以显著提升多西他赛单药的药效。并且相比其它的药物效果也有所提高，整体排名靠前，并且药效比较稳定。
附图说明
构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是不同细胞的生存率。左列图示CK-666不同浓度对肿瘤细胞的杀伤作用，其中横线标注在100μM时CK-666对不同肿瘤细胞系的杀伤效率。右列图示不同浓度多西他赛和不同浓度多西他赛联合CK-666(100μM)对不同肿瘤细胞系的杀伤效果分析。***P<0.001,**P<0.05。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1、处理对象：
尿路上皮癌患者手术离体新鲜组织。尿路上皮癌(UC)包含：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌以及尿道癌，是最常见的泌尿系统肿瘤。
2、处理领域：
药物组合药效评估：采用临床针对尿路上皮癌采用三维肿瘤组织培养药敏检测(3D-HDRA苏泰械备20190058，20090139，20190143)技术对临床治疗常用药物单药或组合对离体新鲜组织进行药敏检测。在这个检测的同时加入CK-666单药，CK-666联合多西他赛，共同评价多西他赛单药，CK-666单药和CK-666联合多西他赛的抗肿瘤效果和稳定性。
概念：三维肿瘤组织培养药敏检测(3D-HDRA)：将手术切除或活检获取的活性肿瘤组织块经体外培养后，进行药物敏感性检测的独特体内样体外肿瘤活组织器官模型。直接从手术或活检组织检查获得的多种人类肿瘤可以在三维组织培养中长时间生存并且仍然保持其许多体内特性，包括三维生长、维持组织和结构、致癌转化的相关变化、差异化功能，致瘤性，异质性等，使得培养的肿瘤成为实际癌症患者的代表，支持癌症生物学的基础研究以及临床相关测试。3D-HDRA组织培养药敏检测、MTT终点检测的高体内外药物反应相关性。常见化疗药、靶向药、免疫药均可检测。各癌种中：3D-HDRA可评价率接近100％，测试成功率高，方法学稳定，技术成熟，临床一致性超过80％，体外3D-HDRA药敏反应结果与真实临床评价效果符合率高，可反应临床实际，具备应用价值。本实施例采用3D-HDRA技术，该技术目前比较成熟，已经应用到临床，对于药物的评价准确度很高。
3、药物：CK-666，购自AbMole公司，目录号M6611，溶剂DMSO购自Sigma公司。
细胞实验用多西他赛(Docetaxel多西紫杉醇)，购自AbMole公司，目录号M1940。
HDRA检测相关试剂和配套药物(含多西他赛)：均购自苏州安泰康公司。
药物浓度范围：多西他赛终浓度为100μg/mL；CK-666的终浓度为100μM；总体积为200μL。
4、仪器：
检测仪器：BioTek多功能酶标仪Synergy LX。
5、测试方法：MTT比色法，选择630nm波长，在BioTek多功能酶标仪Synergy LX仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
1)检测方法采用安泰康HDRA检测标准操作规程具体如下：
第1天操作
(1)组织前处理：拿到组织样本进行清洗，并将上述清洗过的组织于清洗液中快速切块，切成大小约1mm3的均匀立体小块。并用清洗液进行清洗4次。
(2)组织活性染色：洗涤后的组织块全部转移至已提前加入4.5mL培养液的60mm培养皿内；再加入0.5mL四唑化合物溶液，轻轻摇晃均匀，置于CO2培养箱孵育20min-2h。待组织块颜色变为紫色。
(3)组织脱色：去除未染色、染色较浅或染色不均匀的组织，仅保留染色均匀且较深的组织块。组织块移至新的含15mL培养液的100mm培养皿中，轻轻摇晃均匀，置于CO2培养箱过夜培养。
第2天操作
(4)组织接种：选择从96孔板的第二行第二列进行接种，每孔加入培养基180μL。对照组及每种药物做1组平行对照。脱色完成的组织块根据大小、重量挑选分组，每孔接种2块，确保每孔总质量一致。
(5)组织药物作用：每孔加入待测药物(1mg/mL，10×)20μL，对照组加入PBS缓冲液20μL，每个孔均补充培养基180μL(每孔终体积为200μL)，单用或联用时：多西他赛终浓度为100μg/mL；CK-666的终浓度为100μM；其他药物浓度的选择参考临床应用时优选浓度。接种孔外侧孔加入PBS缓冲液，防止过度蒸发。置于CO2培养箱孵育72h。
第5天操作
(6)葡萄糖代谢检测：接种孔每孔取上清20μL至96孔PCR板底部，加入80μL邻甲苯胺溶液，盖好盖子，沸水中水浴7.5min，将液体转至新的96孔板，酶标仪630nm检测吸光值。
(7)MTT活性检测：接种孔每孔加入20μL琥珀酸脱氢酶样本释放剂，培养箱中孵育1.5-2h，待组织颜色变深，弃上清，每孔加入DMSO 150μL，培养箱中孵育30min，待组织褪色，取上清至新的96孔板，酶标仪测定540nm吸光值。
(8)结果计算
结果处理光盘打开数据处理.xls文件，将代谢检测吸光值以及活性检测吸光值依次填入即可生成葡萄糖消耗率和活性抑制率的结果以及相应图表。
2)CCK8方法检测细胞耐药实验
采用各种癌细胞系如：膀胱癌细胞T24，乳腺癌细胞MDA-MB-231，食管鳞癌细胞KYSE-30，卵巢癌细胞SKOV3。
(1)分别种板96孔板，每孔5000细胞，分别采用CK-666单药梯度浓度，多西他赛单药梯度浓度，CK-666 100μM联合多西他赛梯度浓度处理细胞24小时。
注：药物浓度CK-666 0，25，50，100，150，200μM。多西他赛：0，2.5，5，10，15，25μM。联合浓度：单药CK-666 100μM分别联合多西他赛0，2.5，5，10，15，25μM。
(2)弃上清，每孔加入100μL 1×CCK8孵育处理1小时。
(3)酶标仪测定450nm吸光值，计算相对生存情况。
6、结果
药物敏感性判定以细胞活性抑制率为主，葡萄糖消耗率为辅，选取细胞活性抑制率高且葡萄糖消耗率低的药物。活性抑制率数值越大敏感性越高。如表1所示，CK-666联合多西他赛可显著增强多西他赛的药物敏感性，且显著优于单用CK-666或多西他赛。
如图1所示，CK-666联合多西他赛能显著增强对食管鳞癌细胞KYSE-30、膀胱癌细胞T24(UC的一种)、咽鳞癌细胞FaDu、卵巢癌细胞SKOV3、乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤作用，其中，2.5μM～25μM多西他赛联合CK-666组对肿瘤细胞的杀伤作用均显著优于单纯多西他赛组。
表1细胞活性抑制率和葡萄糖代谢抑制率数据
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种 CK-666 和多西他赛的组合在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是，所述肿瘤为膀胱癌、食管鳞癌、咽鳞癌、卵巢癌或乳腺癌；所述CK-666的浓度为100 μM，多西他赛的浓度为2.5~25μM。
2.一种提高多西他赛药物敏感性、抑制肿瘤细胞活性的药物组合物，其特征是，该药物组合物的活性成分为CK-666和多西他赛；所述CK-666的浓度为100 μM，多西他赛的浓度为2.5~25μM。
3.如权利要求2所述的提高多西他赛药物敏感性、抑制肿瘤细胞活性的药物组合物，其特征是，所述肿瘤为膀胱癌、食管鳞癌、咽鳞癌、卵巢癌或乳腺癌。
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