CN113069530B - 萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素a在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素a在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及萘酰亚胺‑多胺衍生物联合环孢素A在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明通过将萘酰亚胺‑多胺衍生物与环孢素A联合使用，提供了一种萘酰亚胺‑多胺衍生物联合环孢素A在制备抗肿瘤药物中的应用。试验结果证明，同单药组相比，联合用药能够显著抑制肝癌细胞的体内转移并明显提高单药组的抗肿瘤活性。同时，同单药组相比，联合给药能够提高荷瘤小鼠的生存率。联合用药后能够显著降低二者剂量，且抗肿瘤效果显著提高，并且对正常肝细胞的毒性低于肝癌细胞。环孢素A和萘酰亚胺‑多胺衍生物6c联合用药可能成为肝癌患者治疗的新方法。

Description

萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抗肿瘤药物中的 应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肝癌(liver cancer)即肝脏恶性肿瘤，分为原发性肝癌和继发性肝癌。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症死亡的主要原因。肝癌可由慢性感染乙肝(HBV)、丙型肝炎(HCV)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)或酒精性脂肪肝炎(ASH)等疾病引起。大多数肝癌发现于长期炎性肝损害和肝硬化患者，通常确诊时已为中晚期。目前，针对肝癌的靶向治疗药物较少。因此，亟需探索新型有效的治疗策略。
环孢素A(Cyclosporine A，CsA)是由11个氨基酸构成的环状多肽，为钙调磷酸酶抑制剂家族中的一员。环孢素A(CsA)也是一种免疫抑制药物，主要作用于T淋巴细胞，常用于缓解器官移植后的排斥作用，包括肝脏、肾脏、心脏、等移植手术。此外，环孢素A还可用于治疗包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病等多种自身免疫性疾病。
萘酰亚胺类化合物具有荧光特性，可用于荧光增白剂，荧光染料，荧光化学传感器等。同时，萘酰亚胺类化合物具有包括抗肿瘤在内的广泛的生物学功能。因此，萘酰亚胺类化合物备受科研工作者和药物研发人员的青睐。萘酰亚胺衍生物涉及到的作用机制：(1)进入细胞核，同DNA相结合，抑制D拓扑异构酶的活性，抑制DNA的修复，从而引起DNA损伤；(2)定位于线粒体，诱导线粒体ROS的升高，进而抑制细胞生长和诱导细胞凋亡；(3)定位于溶酶体，调控溶酶体的相关功能，通过诱导自噬性凋亡抑制肿瘤的生长。但是，萘酰亚胺类化合物具有血液毒性、骨髓抑制性，这限制了这类化合物在临床上的应用。因此，需要寻找更为有效和安全的解决方案。
近年来，有少量文献报道显示环孢素A具有抗肿瘤活性。发明人在现有技术基础上，初步试验发现，在高浓度条件下，单用环孢素A和单用萘酰亚胺衍生物时均具有一定的抗肿瘤效果，但是毒副作用明显。虽然在低浓度条件下，单用环孢素A和单用萘酰亚胺-多胺衍生物时抗肿瘤效果不理想，但联合应用环孢素A和萘酰亚胺-多胺衍生物后可降低二者给药剂量，且能够明显提高其抗肿瘤效果，同时又对正常肝细胞的毒性较低。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，发明人经长期的实践探索，通过将萘酰亚胺-多胺衍生物与环孢素A(CsA)联合使用，提供了一种萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抗肿瘤药物中的应用。试验结果证明，将萘酰亚胺-多胺衍生物与环孢素A联合作用于人肝癌细胞和小鼠肝癌细胞，表现出较强的抑制肝癌的活性，且具有较好的协同抑制肿瘤的效果，环孢素A与萘酰亚胺-多胺衍生物联合用药对正常肝细胞没有毒性，表现出对肿瘤细胞的选择性抑制作用，因而具有较好的实际应用价值。
本发明的另一个目的是提供一种含有环孢素A的抗肿瘤药物组合物。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述萘酰亚胺-多胺衍生物为专利文献(CN 105669657 B)中实施例5化合物，亦为论文(Dai Fujun,Li Qian,Wang Yuxia,Ge Chaochao,Feng Chenyang,Xie Songqiang,HeHaoying,Xu Xiaojuan,Wang Chaojie.Design,Synthesis,and Biological Evaluationof Mitochondria-Targeted Flavone-Naphthalimide-Polyamine Conjugates withAntimetastatic Activity.[J].Journal of medicinal chemistry,2017,60(5).)中的化合物6c，为了便于说明，故以下称为化合物6c。
具体的，所述萘酰亚胺-多胺衍生物6c的结构式为：
Figure BDA0003000876180000021
具体的，所述肿瘤包括但不限于人结直肠癌、人肺腺癌、人肝癌、人食管癌、人胰腺癌、人前列腺癌、人乳腺癌、人胃癌、人子宫内膜癌、人膀胱癌、人皮肤癌或人血癌。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A在联合应用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A既可以混合后使用也可以单独分开使用。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A在联合应用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用或分多次连续添加使用。
具体的，当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A的摩尔比为(0.25-4):1，添加处理时间为12-24h；当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A每次添加的摩尔比为(0.05-0.08):1，共连续添加5-12次。
优选的，当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A的摩尔比为0.5:1，添加处理时间为24h；当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A每次添加的摩尔比为0.08:1，共连续添加12次。
本发明还提供了萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抑制肝癌细胞增殖或促进其凋亡药物中的应用，所述肝癌细胞为HepG2或SMMC-7721。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5-20μM，环孢素A的浓度在5-20μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
优选的，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5μM、10μM、20μM，环孢素A的浓度在5μM、10μM、20μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
进一步优选的，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5μM，环孢素A的浓度在10μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
进一步的，本发明还提供了萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抑制肝癌鼠源转移模型肿瘤生长药物中的应用。
具体的，萘酰亚胺-多胺衍生物在用量为2mg/kg/天，且环孢素A用量为25mg/kg/天时能抑制肝癌鼠源转移模型肿瘤的转移。
具体的，所述鼠源采用的小鼠为Balb/c小鼠。
进一步的，本发明还提供了一种含有环孢素A的抗肿瘤药物组合物，包括萘酰亚胺-多胺衍生物或其盐，以及环孢素A或其衍生物。
具体的，所述含有环孢素A的抗肿瘤药物组合物中，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A的摩尔比为(0.25-4):1。
优选的，所述含有环孢素A的抗肿瘤药物组合物中，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A的摩尔比为0.25：1或4：1。
具体的，所述萘酰亚胺-多胺衍生物结构式为：
Figure BDA0003000876180000031
具体的，所述含有环孢素A的抗肿瘤药物组合物使用时，在室温条件下，将溶于生理盐水的化合物和溶于二甲基亚砜(DMSO)的环孢素A按照所述比例混合。
本发明还进一步提供了上述药物组合物的制剂，该制剂由所述药物组合物和药学上可接受的载体组成。
本发明中环孢素A和萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合应用的作用机制：
(1)通过上调蛋白cleaved PARP和Bax的表达水平以及降低蛋白PCNA和Bcl-2的表达水平，抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞发生凋亡。
(2)通过下调蛋白β-catenin、N-cadherin、Vimentin的表达水平和上调蛋白E-cadherin的表达水平，抑制肝癌细胞的迁移。
与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：
环孢素A和萘酰亚胺-多胺衍生物6c单独用药时有一定的抗肿瘤效果，但是低浓度或低剂量的环孢素A以及低浓度或低剂量萘酰亚胺-多胺衍生物6c的体外抗肿瘤效果不佳。联合用药后能够显著降低二者剂量，且抗肿瘤效果显著提高，并且对正常肝细胞的毒性低于肝癌细胞。动物实验显示，同单独用药相比，联合用药能够提高环孢素A和萘酰亚胺-多胺衍生物6c的体内抗肿瘤效果，并且没有明显的毒副作用。环孢素A和萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药可能成为肝癌患者治疗的新方法。
附图说明
图1为环孢素A(CsA)和萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG224小时后的联药指数；
图2为环孢素A(CsA)和萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞SMMC-7721 24小时后的联药指数；
图3为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG224小时后通过MTT实验检测细胞增殖抑制的结果；
图4为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG224小时后通过CCK-8实验检测细胞增殖抑制的结果；
图5为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞SMMC-7721 24小时后通过MTT实验检测细胞增殖抑制的结果；
图6为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞SMMC-7721 24小时后通过CCK-8实验检测细胞增殖抑制的结果；
图7为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人正常肝细胞QSG-7701 24小时后通过MTT实验检测细胞增殖抑制的结果；
图8为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人正常肝细胞HL-7702 24小时后通过MTT实验检测细胞增殖抑制的结果；
图9为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG2后的克隆形成结果；
图10为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞SMMC-7721后的克隆形成结果；
图11为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG2后的细胞凋亡结果；
图12为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG2后的caspase 3活性检测结果；
图13为10μM环孢素A(CsA)与5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG2后凋亡相关蛋白的免疫印迹结果；
图14为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG2后的划痕迁移实验结果；
图15为环孢素A(CsA)与萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG2后的Boyden小室迁移实验结果；
图16为2μM环孢素A(CsA)与5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c联合用药作用于人肝癌细胞HepG2后迁移相关蛋白的免疫印迹结果；
图17为联合用药对小鼠肝癌细胞H22体内转移作用的结果；
图18为联合用药后小鼠体重变化曲线；
图19为联合用药后小鼠心脏指数和肾脏指数的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
本发明中所用到的环孢素A(CsA)购买于MedChemExpress(MCE)公司。
本发明主要提供萘酰亚胺-多胺衍生物6c与环孢素A联合用药的应用方式，其中，采用生理盐水制备萘酰亚胺-多胺衍生物6c储备液和二甲基亚砜(DMSO)制备环孢素A(CsA)储备液。
本发明所述萘酰亚胺-多胺衍生物6c按照论文Dai Fujun,Li Qian,Wang Yuxia,Ge Chaochao,Feng Chenyang,Xie Songqiang,He Haoying,Xu Xiaojuan,WangChaojie.Design,Synthesis,and Biological Evaluation of Mitochondria-TargetedFlavone-Naphthalimide-Polyamine Conjugates with Antimetastatic Activity.[J].Journal of medicinal chemistry,2017,60(5).中的方法获得，其结构式为：
Figure BDA0003000876180000061
实施例选用的癌细胞株包括：人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、QSG-7701、HL-7702、小鼠肝癌细胞H22。
实施例1：萘酰亚胺-多胺衍生物6c和环孢素A(CsA)联合使用的体外生物活性评价
试验一：
分别取对数生长期的人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721，采用胰蛋白酶消化癌细胞，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，以密度为8×103cells/孔的接种量接种于96孔板中，贴壁生长24小时后，分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c、环孢素A(CsA)单独用药，以及二者联合用药。单独用药终浓度为CsA(5μM)、CsA(10μM)、CsA(20μM)、6c(5μM)、6c(10μM)、6c(20μM)；联合用药终浓度为6c(5μM)+CsA(5μM)、6c(5μM)+CsA(10μM)、6c(5μM)+CsA(20μM)、6c(10μM)+CsA(5μM)、6c(10μM)+CsA(10μM)、6c(10μM)+CsA(20μM)、6c(20μM)+CsA(5μM)、6c(20μM)+CsA(10μM)、6c(20μM)+CsA(20μM)。药物处理24小时后，每孔加入50μL的MTT溶液孵育4小时，弃除孔内液体，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶液，置于摇床上轻轻摇动10分钟，使96孔板中的紫色结晶物充分溶解。然后，采用多功能酶标仪测量570nm下各孔的吸光值(OD570)，并计算细胞存活率；其中存活率(％)＝(OD570实验组/OD570对照组)×100％。根据联合用药后的细胞存活率变化计算联合用药指数(combination index，CI)。
结果分别如图1(HepG2)、图2(SMMC-7721)所示，本试验为利用单独用药作为对照组来计算联合用药指数(CI)，故图中显示均为联合用药的结果，统计结果显示，联合用药在抑制人肝癌细胞HepG2的增殖(图1所示)和人肝癌细胞SMMC-7721的增殖(图2所示)方面具有较好的协同效果。
试验二：
分别取对数生长期的人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和正常人肝细胞QSG-7701、HL-7702，采用胰蛋白酶消化细胞，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，以密度为8×103cells/孔的接种量接种于96孔板中，贴壁生长24小时后，分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c、环孢素A(CsA)单独用药，以及二者联合用药；单独用药终浓度为环孢素A(CsA)10μM、萘酰亚胺-多胺衍生物6c 5μM；联合用药终浓度为10μM环孢素A(CsA)+5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c。药物处理24小时后，每孔加入50μL的MTT溶液孵育4小时，弃除孔内液体，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶液，置于摇床上轻轻摇动10分钟，使96孔板中的紫色结晶物充分溶解。然后，采用多功能酶标仪测量570nm下各孔的吸光值(OD570)，并计算细胞存活率；其中存活率(％)＝(OD570实验组/OD570对照组)×100％。
结果分别如图3(HepG2)、图5(SMMC-7721)、图7(QSG-7701)、图8(HL-7702)所示，统计结果显示，同单药处理组相比，联合用药能够显著抑制人肝癌细胞HepG2的增殖(图3所示)、人肝癌细胞SMMC-7721的增殖(图5所示)，但是对正常人肝细胞QSG-7701、HL-7702的增殖没有抑制效果。这些实验结果表明，联合用药能够选择性地抑制肝癌细胞的增殖，对正常肝细胞没有明显的杀伤作用。
试验三：
分别取对数生长期的肝癌细胞HepG2、SMMC-7721，采用胰蛋白酶消化细胞，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，完全培养基混悬，血细胞计数板计数细胞数目，以密度为8×103cells/孔的接种量接种于96孔板中，贴壁生长24小时，分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c、环孢素A(CsA)单独用药，以及二者联合用药；单独用药终浓度为环孢素A(CsA)10μM、萘酰亚胺-多胺衍生物6c 5μM；联合用药终浓度为10μM环孢素A(CsA)+5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c。药物处理24小时后，每孔加入10μL CKK-8溶液，培养箱孵育1-4小时，采用多功能酶标仪测量450nm下各孔的吸光值(OD450)，并计算细胞存活率。
结果分别如图4(HepG2)、图6(SMMC-7721)所示，统计结果显示，在CCK-8实验中，同单药处理组相比，联合用药能够显著抑制人肝癌细胞HepG2的增殖(图4所示)、人肝癌细胞SMMC-7721的增殖(图6所示)。
试验四：
分别取呈对数生长期的人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721，采用胰蛋白酶消化细胞，以转速1000r/min离心5分钟，按1000细胞/孔的密度将细胞接种于6孔板中，贴壁生长24小时后，更换新鲜的培养基。继续培养14天后，分别加入萘酰亚胺-多胺衍生物6c、环孢素A(CsA)单独用药，以及二者联合用药；单独用药终浓度为环孢素A(CsA)10μM、萘酰亚胺-多胺衍生物6c 5μM；联合用药终浓度为10μM环孢素A(CsA)+5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c。药物处理24小时后，弃去上清液，PBS清洗，采用4％(质量体积比，下同)多聚甲醛溶液室温固定，结晶紫染色，蒸馏水清洗至上清液无色为止，室温风干，凝胶成像仪拍照成像，统计细胞克隆数目。
结果分别如图9(HepG2)、图10(SMMC-7721)所示，统计结果显示，同单药处理组相比，联合用药能够显著抑制人肝癌细胞HepG2的克隆形成(图9所示)、人肝癌细胞SMMC-7721的克隆形成(图10所示)。
试验五：
取对数生长期的人肝癌细胞HepG2，采用胰蛋白酶消化细胞，以转速1000r/min离心5分钟，血细胞计数板计数，按每孔3×105个细胞接种于6孔板中，贴壁生长24小时，加入10μM环孢素A(CsA)、5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c以及10μM环孢素A(CsA)+5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c。药物处理24小时后，收集细胞。采用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞并转移至1.5mL EP管中，以转速1500r/min离心8分钟，弃去上清液。分别采用Annexin V/PI、caspase 3活性检测试剂盒染色，以及Western blot检测，检测方法参考文献(Dai Fujun,Li Qian,Wang Yuxia,Ge Chaochao,Feng Chenyang,Xie Songqiang,He Haoying,XuXiaojuan,Wang Chaojie.Design,Synthesis,and Biological Evaluation ofMitochondria-Targeted Flavone-Naphthalimide-Polyamine Conjugates withAntimetastatic Activity.[J].Journal of medicinal chemistry,2017,60(5).)和文献(Qing-Bo Lu,Qiong Du,Hui-Ping Wang,Zi-Han Tang,Yuan-Ben Wang,Hai-JianSun.Salusin-βmediates tubular cell apoptosis in acute kidney injury:Involvement of the PKC/ROS signaling pathway[J].Redox Biology,2020Feb；30:101411.)中的方法。
具体的，采用Annexin V/PI染色时，步骤为在离心后的细胞中加入300μL缓冲液、3μL Annexin V和4μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)，室温染色20分钟，通过流式细胞仪检测细胞凋亡比例。结果如图11所示，统计结果显示，同单药处理组相比，联合用药能够显著诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡。
采用caspase 3活性检测试剂盒染色时，步骤为将离心后的细胞用caspase 3活性检测试剂盒进行染色15分钟，PBS清洗，通过流式细胞仪检测荧光变化情况。结果如图12所示，统计结果显示，同单药处理组相比，联合用药能够显著上调人肝癌细胞HepG2中caspase3的活性，进一步说明联合用药能够诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡。
Western blot检测时，每个样品加入含蛋白酶抑制剂(200mM AEBSF,30μMAprotinin,13mM Bestatin,1.4mM E64 and 1mM Leupeptin in DMSO，添加量为蛋白样品体积的百分之一)和磷酸酶抑制剂(1.25mM(-)-p-bromotetramisole oxalate,250μMCantharidin and 250nM Microcystin-LR in DMSO，添加量为蛋白样品体积的五十分之一)的强裂解液进行裂解，每隔10分钟震荡一次，以转速12000r/min离心30分钟，取上清置于新1.5mL EP管中，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达，以β-actin作为内参。结果如图13所示，同单药处理组相比，联合用药能够上调Bax、cleaved PARP-1的表达以及下调PCNA和Bcl-2的表达。这些结果进一步证实了联合用药能够诱导肝癌细胞发生凋亡。
试验六：
取对数生长期的人肝癌细胞HepG2，无血清培养基饥饿8小时，采用胰蛋白酶消化细胞，以转速1000r/min离心5分钟，将细胞接种于6孔板中，贴壁生长24小时，再进行无血清培养基饥饿8小时，划痕，加入2μM环孢素A(CsA)、5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c以及2μM环孢素A(CsA)+5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c。药物处理24小时后，采用4％多聚甲醛溶液固定20分钟，结晶紫染色，蒸馏水清洗干净。采用显微镜拍照并统计细胞数目。
结果如图14所示，统计结果显示，同单药处理组相比，联合用药能够显著抑制人肝癌细胞HepG2发生迁移。
试验七：
取对数生长期的人肝癌细胞HepG2，无血清培养基饥饿8小时，采用胰蛋白酶消化细胞，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，重悬细胞。按照论文Dai Fujun,Li Qian,WangYuxia,Ge Chaochao,Feng Chenyang,Xie Songqiang,He Haoying,Xu Xiaojuan,WangChaojie.Design,Synthesis,and Biological Evaluation of Mitochondria-TargetedFlavone-Naphthalimide-Polyamine Conjugates with Antimetastatic Activity.[J].Journal of medicinal chemistry,2017,60(5).中的方法，在Boyden小室(Costar品牌，8.0μm pore size)上层加入含细胞和药物的无血清培养基，每个小室细胞数目为9×104细胞。小室下层加入含有药物(无细胞)的完全培养基。药物浓度分别为：2μM环孢素A(CsA)、5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c、2μM环孢素A(CsA)+5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c。继续培养24小时，采用4％多聚甲醛溶液固定20分钟，结晶紫染色，蒸馏水清洗干净，棉签擦洗干净小室内侧膜。采用显微镜拍照并统计细胞数目。
结果如图15所示，统计结果进一步证实，同单药处理组相比，联合用药能够显著抑制人肝癌细胞HepG2发生迁移。
试验八：
取对数生长期的人肝癌细胞HepG2，采用胰蛋白酶消化细胞，以转速1000r/min离心5分钟，将细胞接种于细胞培养皿中，贴壁生长24小时，加入2μM环孢素A(CsA)、5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c以及2μM环孢素A(CsA)+5μM萘酰亚胺-多胺衍生物6c。药物处理24小时后，收集细胞。采用预冷的磷酸盐缓冲液清洗细胞并转移至1.5mL EP管中，以转速1500r/min离心8分钟，弃去上清液，每个样品加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强裂解液进行裂解，每隔10分钟震荡一次。以转速12000r/min离心30分钟。取上清置于新1.5mL EP管中，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。通过Western blot检测迁移相关蛋白的表达，以β-actin作为内参。
结果如图16所示，同单药处理组相比，联合用药能够上调E-cadherin的表达以及下调Vimentin、β-catenin和N-cadherin的表达。这些结果进一步证实了联合用药能够抑制肝癌细胞发生迁移。
实施例2：萘酰亚胺-多胺衍生物6c和环孢素A(CsA)联合使用的体内生物活性评价
试验九：
腹腔抽取小鼠(Balb/c小鼠)肝癌细胞H22，以转速1000r/min离心5分钟，弃上清，采用预冷生理盐水洗至无血液残留为止，一般为三遍。每只小鼠(小鼠为6周龄，体重为20g左右)尾静脉接种H22细胞，细胞数目为2×106。荷瘤小鼠分为四组，分别为空白对照组、萘酰亚胺-多胺衍生物6c(2mg/kg/day)组、环孢素A(CsA，25mg/kg/day)组及联合用药组(6c2mg/kg/day+CsA 25mg/kg/day)。萘酰亚胺-多胺衍生物6c通过尾静脉注射方式给药，环孢素A(CsA)通过灌胃方式给药，连续给药12天。实验结束后，按照论文Lei Gao,ChaochaoGe,Senzhen Wang,Xiaojuan Xu,Yongli Feng,Xinna Li,Chaojie Wang,Yuxia Wang,Fujun Dai,Songqiang Xie.The Role of p53-Mediated Signaling in the TherapeuticResponse of Colorectal Cancer to 9F,a Spermine-Modified Naphthalene DiimideDerivative Cancers(Basel).2020Feb 25；12(3):528.中的方法，剥离肺组织，统计肺结节数目并进行分析。结果如图17所示，统计结果显示，同单药处理组相比，联合用药能够抑制肝癌细胞在小鼠体内的转移。
动物实验过程中，每天记录每只小鼠体重变化并绘制体重变化曲线，结果如图18所示，统计结果显示，同单药处理组和对照组相比，联合用药能够对小鼠的体重没有明显的影响。
动物实验结束后，剥离心脏和肾脏组织，称量每只小鼠的心脏和肾脏重量，统计脏器指数，结果如图19所示，单独用药和联合用药对组织没有明显的影响。
以上实验数据表明，同单药组相比，联合用药能够显著抑制肝癌细胞的体内外活性并明显提高单药组的抗肿瘤活性。同时，联合用药对正常肝细胞的生长没有明显的抑制作用；体内实验中联合用药对小鼠的体重以及其它的脏器指数均无明显影响。体内外实验均表明，联合用药可以选择性抑制肝癌的活性且没有毒副作用。机制方面，实验数据表明联合用药能够通过上调蛋白cleaved PARP和Bax的表达水平以及降低蛋白PCNA和Bcl-2的表达水平，抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞发生凋亡，并且还能够通过下调蛋白β-catenin、N-cadherin、Vimentin的表达水平和上调蛋白E-cadherin的表达水平，抑制肝癌细胞的迁移。
上述实施例为本发明实施方式的举例说明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，
萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A在联合应用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用或分多次连续添加使用；
当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用时，所述应用为萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抑制肝癌细胞增殖或促进其凋亡药物中的应用，肝癌细胞为HepG2或SMMC-7721，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A的摩尔比为（0.25-4）:1，添加处理时间为12-24 h；
当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5-20μM，环孢素A的浓度在5-20μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小；
当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A分多次连续添加使用时，所述应用为萘酰亚胺-多胺衍生物联合环孢素A在制备抑制肝癌鼠源转移模型肿瘤生长药物中的应用，肝癌细胞为小鼠肝癌细胞H22，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A每次添加的摩尔比为（0.05-0.08）:1，共连续添加5-12次；
当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物在用量为2 mg/kg/天，且环孢素A用量为25 mg/kg/天时能抑制肝癌鼠源转移模型肿瘤的转移；所述鼠源为Balb/c小鼠；
所述萘酰亚胺-多胺衍生物结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A的摩尔比为0.5:1，添加处理时间为24 h；当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A分多次连续添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A每次添加的摩尔比为0.08:1，共连续添加12次。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A一次性添加使用时，萘酰亚胺-多胺衍生物在浓度为5 μM、10 μM或20 μM，环孢素A的浓度在5 μM、10 μM或20 μM时能够抑制癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。
4.一种含有环孢素A的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括萘酰亚胺-多胺衍生物，以及环孢素A，萘酰亚胺-多胺衍生物和环孢素A的摩尔比为（0.25-4）:1；
所述萘酰亚胺-多胺衍生物结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
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