CN111920813A - 6-乙氧基血根碱在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开6‑乙氧基血根碱在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物医药技术领域。尤其涉及6‑乙氧基血根碱在制备用于治疗食管癌的药物中的应用，6‑乙氧基血根碱，中文名称为：14‑乙氧基‑13,14‑二氢血根碱；英文名：6‑Ethoxysanguinarine；分子式：C₂₂H₁₉NO₅；分子量:377.396；CAS号：28342‑31‑6，本申请通过实验证实6‑乙氧基血根碱用于人食管鳞癌细胞KYSE150细胞和KYSE450细胞时，能够起到抑制食管鳞癌细胞增殖的作用，且6‑乙氧基血根碱能够抑制食管鳞癌细胞增殖的适宜浓度为0.1μM‑1μM。

Description

6-乙氧基血根碱在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及6-乙氧基血根碱在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

食管癌是较常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的所有恶性肿瘤中排名第六位，是一种较为常见的致命性癌症，我国食管癌患病人数和死亡人数的总和约占全球的50%。根据病理类型，食管癌又可分为食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma，EAC）和食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）以及未分化癌症。中国是食管癌的高发国家，在食管癌的病理组织学分类中，食管鳞癌患者占食管癌患者总量的90%以上，目前食管癌的治疗方案大概分为：手术切除、放射治疗和化学治疗等，但是这些方法往往具有治愈率低、副作用大等弊端。由于缺乏有效的治疗方法，导致食管癌患者的五年生存率不到20%，是威胁人类健康的一道难题。因此，从天然化合物中寻找高效、低毒且可用于食管癌化学治疗的药物是非常重要的。

食管癌已经成为一种威胁全人类的疾病，由于对食管癌认识的不断加深，食管癌的治疗方案及治疗药物也在不断地优化。对于开发新药物和减少药物毒副作用，从植物中提取分离化合物是一个很好的思路。从传统草药和植物中提取的某些化合物显示出预防和治疗肿瘤的潜力，一些植物生物碱已经在临床治疗癌症上起到了非常显著的效果，对于植物生物碱这一类化合物的研究探索还在不断进行中，期望从癌症的预防、癌症的治疗方面发挥作用。

人类使用植物作为药物可以追溯到几千年前，植物来源的生物碱是天然产物，在化学、生物学和医学中起着不可或缺的作用。很大一部分生物碱化合物在细胞水平和动物模型上已经显现出抑制肿瘤生长的效果，此外随着分析技术的不断发展可以发现更多的化合物，为肿瘤防治确定新的药物。6-乙氧基血根碱在抑制食管癌增殖方面目前无报道，也无相关的专利申请。

发明内容

本发明目的在于提供一种6-乙氧基血根碱在制备抗肿瘤药物中的应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

6-乙氧基血根碱在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌的药物。6-乙氧基血根碱，中文名称为：14-乙氧基-13,14-二氢血根碱；英文名：6-Ethoxysanguinarine ；分子式：C₂₂H₁₉NO₅；分子量:377.396 ；CAS号：28342-31-6。

6-乙氧基血根碱在浓度为0.1-1 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150以及KYSE450细胞的增殖、克隆形成的数量及大小。

本发明发现人源性食管鳞癌移植瘤小鼠在6-乙氧基血根碱作用后可以起到预防食管癌复发的效果，本发明中，在小鼠体内治疗浓度为0.5mg/kg/天-2mg/kg/天。

本发明中利用6-乙氧基血根碱在食管癌的预防及治疗中的作用，显著提高了食管癌的预防及治疗效果。实验发现：6-乙氧基血根碱在治疗食管癌上有显著效果。

本发明通过细胞增殖实验，首次验证了14-乙氧基-13,14-二氢血根碱在食管鳞癌细胞系(KYSE150,KYSE450)生长中的抑制效果，可为临床研究预防和治疗肿瘤的药物提供新的思路和依据。

附图说明

图1中：A为6-乙氧基血根碱结构式；B、C为6-乙氧基血根碱在食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450中的毒性作用；

图2中：A、B为6-乙氧基血根碱在不同浓度作用下食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖曲线；

图3中：A为6-乙氧基血根碱作用后食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450克隆形成图片， B为克隆数量的统计结果；

图4中：A为人源性食管鳞癌移植瘤小鼠模型经6-乙氧基血根碱处理40天后，小鼠处死后肿瘤的对比结果图片；B 为人源性食管鳞癌移植瘤小鼠模型经6-乙氧基血根碱处理40天后，小鼠处死后肿瘤称量统计结果；C为人源性食管鳞癌移植瘤小鼠模型经6-乙氧基血根碱处理40天后，小鼠处死后肿瘤体积统计结果；

图1、图2、图3、图4中*p <0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用试验

材料与方法

1.材料

1.1食管癌细胞系

实验所用的人食管鳞癌细胞系KYSE150与KYSE450来源于郑州大学医学科学院病理学与病理生理学系，KYSE150用含有10%胎牛血清（FBS）、0.1%青霉素、0.1%链霉素的RPMI1640培养基培养；KYSE450用含有10%胎牛血清（FBS)、0.1%青霉素、0.1%链霉素的DMEM培养基培养。上述细胞均培养在37℃，含5%二氧化碳的无菌环境中。

1.2 试剂

青霉素 华北制药股份有限公司

链霉素 山东鲁抗医药股份有限公司

RPMI-1640 培养基 以色列 Biological Industries 公司

DMEM 培养基 以色列 Biological Industries 公司

0.25%胰酶 上海碧云天生物科技有限公司

无血清细胞冻存液 苏州新赛美生物科技有限公司

DAPI 北京索莱宝科技有限公司

琼脂粉 美国 B&D 公司

PBS 粉末 北京索莱宝科技有限公司

BME 粉末 美国 SIGMA-ALDRICH

L-谷氨酰胺 北京索莱宝科技有限公司

NaHCO₃ 天津市凯通化学试剂有限公司

多聚甲醛粉 天津市光复精细化工研究所

胎牛血清 美国 BI 公司

6-乙氧基血根碱 上海鼎瑞化工有限公司

0.4％戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）；

生理盐水500ml 瓶（辰欣药业股份有限公司）；

1.3仪器与器材：

1.5ml 离心管 美国 Axygen 公司

15ml 离心管 美国 Corning 公司

96 孔细胞培养板 无锡耐思生物科技有限公司

10 cm 细胞培养皿 无锡耐思生物科技有限公司

15 cm 细胞培养皿 美国 Thermo Fisher Scientific 公司

一次性移液管 广州洁特生物过滤股份有限公司

In Cell Analyzer 6000 美国 GE 公司

移液器 美国 Gilson 公司

干燥 CO₂ 培养箱 上海一恒科学仪器有限公司

高速低温离心机 德国 Eppendorf 公司

真空抽吸泵 海门市其林贝尔仪器制造有限公司

倒置显微镜 德国 Carl Zeiss Jena 公司

雪花制冰机 日本 SANYO 公司

Mili-Q 纯水仪 美国 Millipore 公司

Thermo超净工作台；

眼科剪，手术镊，手术刀，溶药针，注射器；

1.4实验动物

在SPF级动物房中，根据SPF级动物管理相关规定，对重度联合免疫缺陷（Severecombined immunodeficiency, SCID）小鼠进行管理，实验动物饲养于郑州大学癌症化学预防河南省协同创新中心的动物设施内，小鼠垫料每周更换三次，将小鼠生长环境的温度保持在20-25℃范围内，以及湿度保持在40-70%范围内。人工设置光照周期为白天12 h，黑夜12 h，昼夜更替。保证小鼠饲料和饮用水充足。（注：给小鼠使用的笼盒、垫料、饮用水等均需经过高压蒸汽灭菌处理。）

1.5实验方法

1.5.1细胞毒性实验

将复苏后的KYSE150，KYSE450细胞培养至第3-5代，用于做实验。根据预实验结果估算，按照每孔加100 μl KYSE150（每孔1.0×10⁴个细胞）或KYSE450（每孔8×10³个细胞），根据细胞悬液密度，用完全培养基计算并配制出所需的细胞悬液，混匀备用。将细胞接种在96孔板中，每个药物浓度设置6个复孔。于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养。16-18 h后，将6-乙氧基血根碱用DMSO溶解，与培养基混匀，使用终浓度为0、1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM的6-乙氧基血根碱分别处理24，48小时。每隔24 h更换一次含药培养基。将标记为24 h的板拿出，倒掉旧培养基，再加入1×PBS清洗两次，每孔加入100 μl 4%的多聚甲醛固定30 min，然后再用1×PBS清洗两次。再将DAPI溶液用1×PBS稀释成1 μg/ml 的浓度，每孔加入100 μlDAPI溶液，放入37℃培养箱培养20 min，然后用1×PBS清洗两次，每孔加入100 μl 1×PBS保存。DAPI染色时要注意避光。再将96孔板放入高内涵细胞成像分析系统中，对板中细胞进行拍照和计数。计数完成后，求细胞平均数和标准差，绘制成折线图。以横坐标为加药培养时间，纵坐标为细胞数量，绘制折线图，如图1B、1C所示。

1.5.2细胞增殖实验研宄

将实验细胞抽掉旧培养基，再加入1×PBS清洗两次，再滴加1 ml 0.25%胰蛋白酶，在培养箱中消化3 min，直到在显微镜下观察到细胞不贴壁后，用完全培养基终止消化，然后离心1000 rpm、3 min，倒掉上清液，再加入完全培养基，混合均匀。根据预实验结果预估，KYSE150（每孔4.0×10³个细胞）或KYSE450（每孔3×10³个细胞）的密度，用完全培养基与细胞悬液按比例配制成所需的细胞悬液，混匀备用。将细胞接种于96孔板中，100 μl/孔，设置6个复孔，再在周围的每个孔中加入100 μl 1×PBS缓冲液，起到保持湿度的作用，防止培养基蒸发。待到16-18 h后细胞贴壁，分别用终浓度为0，0.1μM，0.25μM，0.5μM，1 μM的含6-乙氧基血根碱培养基对接种的细胞分别处理24，48，72，96小时。对每个药物浓度设置6个复孔，每孔加入100 μl含药培养基，每隔24 h更换一次含药培养基。96孔板于37℃，5% CO₂恒温培养箱中培养。细胞接种16-18 h后，将0 h的板取出并用4%多聚甲醛固定30 min，再用稀释后的DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）在37℃培养箱环境下染色20 min，然后用1×PBS清洗两次，并加入每孔100 μl 1×PBS，4℃保存。用高内涵细胞成像分析系统对板中细胞进行拍照和计数。将五个时间点的细胞分别计数，X轴表示各个时间点，Y轴表示是细胞数量，在Graph pad软件上绘制生长曲线图，并做统计学分析。结果详见图2。

1.5.3软琼脂克隆形成实验

从培养箱中取出KYSE150和KYSE450细胞，消化3 min，各加入3 ml培养基终止消化，离心1000 rpm，3 min，弃上清液，再分别加入10 ml FBS-BME（配制方法如下表1）重悬，使用血球计数板得出细胞重悬液的浓度，再用FBS-BME溶液配制浓度为2.4×10⁴个/ml的细胞悬液。用浓度为0μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、1 μM的含6-乙氧基血根碱培养基处理KYSE150和KYSE450细胞，取15 ml离心管，分别加入1.2 ml细胞悬液，再按照化合物浓度标记分别加入3.6 μl化合物，最后加入2.4 ml下层胶（配制方法如下表2），注意防止下层胶凝固，充分混匀，继续放在46℃水浴中，防止凝固，关闭超净工作台的风机，在每种细胞中每个浓度的三个复孔中依次铺开，1 ml/孔，完全铺好后晾置2 h后放入细胞培养箱中。观察该化合物对细胞克隆形成的大小及数量的抑制作用。用高内涵细胞成像系统拍下克隆的图片，并且统计数量。结果详见图3。

表1配制10% FBS-BME（40 ml）：

表2配下层胶（200 ml）：

1.5.4人源性食管鳞癌移植瘤小鼠模型的建立

选取一例未接受放疗或化疗的病人的新鲜肿瘤组织（编号：EG20，分期T2N0M0Ⅱ，中分化鳞癌，患者来源于河南省肿瘤医院)，剥离肿瘤后的90 min内，将肿瘤浸入无血清的1640培养基中，待接种前，用含有2%青霉素和链霉素的1×PBS冲洗，置于冰上，随后用0.4%的戊巴比妥钠麻醉小鼠，再将肿瘤组织切成10-15 mm³的小块，种植于小鼠颈背部皮下，固定时间测量小鼠肿瘤体积，当肿瘤体积达到1000 mm³时即可处死小鼠并取出肿瘤组织。以同样的方式传代至新的SCID小鼠皮下（第2代）。若移植瘤稳定传至3代以后，则食管癌移植瘤模型建立成功。

准备手术镊子和剪刀，洗净烘干，高压蒸汽灭菌后备用。首先取一只荷瘤的小鼠，且荷瘤为EG20（编号：EG20，分期T2N0M0Ⅱ，中分化鳞癌，患者来源于河南省肿瘤医院)，评估小鼠和小鼠负荷的肿瘤状况是否良好，再将小鼠脱臼处死，用剪子剪开小鼠背部表皮，剥离出背部的瘤组织，用生理盐水洗净肿瘤组织上粘带的毛皮。在生理盐水中，将肿瘤组织用灭菌的手术剪剪成均匀的若干份，每份大约重0.10-0.12 g。随后取出SCID小鼠，注射0.2 ml0.4%的戊巴比妥钠溶液，使小鼠麻醉。在已经进入麻醉状态的小鼠背部注射1 ml抗生素溶液，再用剪刀在小鼠背部剪开一个小口，用镊子将已经分切好的肿瘤组织塞入小鼠皮下，封闭小鼠伤口，再将小鼠轻轻地放在保温毯上，等小鼠清醒后，将小鼠放置于笼盒中，给予充足的饲料和饮用水，并及时观察小鼠的肿瘤生长情况。

动物分组：等到小鼠的情况恢复良好时，将这些小鼠随机分组，按照每组8只的数量，一共分为三组，分别标为对照组、低剂量组和高剂量组。称取小鼠的体重以及测量小鼠的荷瘤体积，记录下来。瘤体积的计算统一按照公式：V=LD×(SD)²/2计算，其中，V代表肿瘤的体积，SD代表肿瘤的较短直径，LD代表肿瘤的较长直径。

腹腔注射化合物溶液：每天在同一时间给三组小鼠腹腔注射给药，根据小鼠体重计算化合物的用量，给予对照组的小鼠注射生理盐水，低剂量组的小鼠注射0.5 mg/kg 的6-乙氧基血根碱，高剂量组注射2 mg/kg的6-乙氧基血根碱（注：6-乙氧基血根碱使用DMSO和生理盐水溶解）。另外，每周测量两次小鼠体重以及每周测量一次肿瘤体积。

剥离肿瘤：在腹腔注射给药28天后，对照组中肿瘤的平均体积大小约为1000 mm³时，考虑取出肿瘤。先将三组小鼠从动物房中取出，注射0.2 ml 的0.4% 戊巴比妥钠，使小鼠麻醉。采用小鼠眼眶取血法，采取小鼠的血液于EP管中，并且分离出血清，保存备用。再处死小鼠，用剪刀和镊子剥离小鼠瘤组织，每组按照大小依次排列，并拍照。依次分组测量肿瘤重量，记录数据。然后将肿瘤组织一分为二，一块冰冻，另一块浸泡在中性甲醛中，保存备用。同时将小鼠的心、肝、脾、肺、肾分别剥离，分为两份，一份冰冻保存，另一份浸泡在甲醛中，依次放入已标记的EP管中。

统计数据并分析：将实验数据进行做图并统计分析。结果如图4所示。

1.6实验结果

本发明选取了食管癌细胞系，因此首先对食管癌细胞系进行细胞毒性实验，结果见图1B，C。由图1B，C可知，在1 µM时细胞毒性作用开始明显加强，随着浓度的加大，细胞存活率几乎下降为零。以上结果说明6-乙氧基血根碱能显著杀伤食管鳞癌细胞。

6-乙氧基血根碱对食管鳞癌细胞具有抑制作用结果见图2。结果表明：6-乙氧基血根碱在浓度范围为：0.1μM-1 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖，且在浓度为1 μM时，对食管鳞癌细胞的增殖抑制作用显著。

图3为6-乙氧基血根碱抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。用浓度为0、0.1、0.25、0.5、1 μM的6-乙氧基血根碱处理KYSE150和KYSE450细胞，观察该化合物对细胞克隆形成的大小及数量的抑制作用。用高内涵细胞成像系统拍下克隆的图片，并且统计数量。图3A图片结果表明，与对照组相比，用6-乙氧基血根碱处理的KYSE150和KYSE450细胞，随着化合物浓度的增加克隆大小逐渐减小，克隆数量也逐渐减少。进一步，对细胞克隆数目进行统计学分析，结果如图3B所示， 浓度为0.25、0.5、1 μM的6-乙氧基血根碱能明显地抑制KYSE150和KYSE450细胞的克隆形成数量，并且差异具有统计学意义。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图4为6-乙氧基血根碱在人源性食管鳞癌移植瘤小鼠模型上对肿瘤的治疗效果。将6-乙氧基血根碱溶解后腹腔注射到人源性食管鳞癌移植瘤小鼠上，再随机将小鼠分为三组，对照组，低剂量组和高剂量组，每小组8只，分别给药0、0.5、2 mg/kg，定期量取小鼠肿瘤体积，药物作用一直持续到对照组肿瘤大小约为1000 mm³时，将小鼠杀死排列整齐，取出肿瘤和内脏，将肿瘤组织按照分组排列好，并且拍照（图A），图片表明，6-乙氧基血根碱处理的小鼠的肿瘤生长受到较强地抑制。称取剥落的肿瘤的重量，（图4B），以及肿瘤的大小（图4C），结果表明，6-乙氧基血根碱处理组的肿瘤重量及大小均明显地减少。

综上，将6-乙氧基血根碱处理食管鳞癌细胞上进行细胞表型实验，在正常食管上皮细胞上测试毒性实验，结果表明对正常食管上皮细胞的毒性作用较小，并且发现6-乙氧基血根碱在浓度为1μM时，能够显著抑制KYSE150与KYSE450细胞的生长，说明6-乙氧基血根碱具有研究价值。此外，还通过软琼脂克隆形成实验发现6-乙氧基血根碱能够显著抑制KYSE150与KYSE450细胞的锚定非依赖性生长能力。

为了验证6-乙氧基血根碱在体内的效果，用人食管鳞癌的肿瘤组织来构建小鼠PDX模型，测评6-乙氧基血根碱在体内抑制食管鳞癌增殖的效果。将PDX模型进行分组，分为对照组、低剂量组（0.5 mg/kg）、高剂量组（2 mg/kg）三组。对小鼠进行腹腔注射，在给药期间定期测量肿瘤体积和小鼠的体重。当对照组肿瘤体积达1000 mm³时，处死小鼠，剥离瘤组织并且称重。结果显示，6-乙氧基血根碱在小鼠体内可以有效地抑制肿瘤组织的生长。因此，6-乙氧基血根碱在浓度0.5 mg/kg/天-2 mg/kg/天时能抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤的生长。

本申请为食管癌等肿瘤的临床研究预防和治疗以及预后及其他肿瘤药物提供帮助。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。

Claims (6)

1.6-乙氧基血根碱在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，6-乙氧基血根碱在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，6-乙氧基血根碱在浓度为0.1μM~1μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，6-乙氧基血根碱在制备抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤生长药物的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，6-乙氧基血根碱在浓度0.5 mg/kg/天-2mg/kg/天时能抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤的生长。

Images