CN109172557B - Ppm-18通过激活细胞内活性氧诱导膀胱癌细胞凋亡的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了PPM‑18通过激活细胞内活性氧(ROS)诱导膀胱癌细胞凋亡的应用。PPM‑18显著抑制膀胱癌细胞活力；PPM‑18通过诱导膀胱癌细胞产生ROS，促进细胞凋亡；且PPM‑18能显著抑制人膀胱癌皮下瘤的生长和延长皮下瘤小鼠的生存周期。同时，PPM‑18对人正常肝细胞毒性作用很低。此外，PPM‑18可以通过化学合成，使用成本较低，综合考虑适合于作为治疗膀胱癌的新药物。

Description

PPM-18通过激活细胞内活性氧诱导膀胱癌细胞凋亡的应用

技术领域

本发明是关于PPM-18的新应用，具体地说，是关于PPM-18通过激活细胞内活性氧(ROS)诱导膀胱癌细胞凋亡的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

据有关资料报道，膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤第九位。近些年来，膀胱癌的发病率和致死率越来越高，已经成为严重影响和威胁人类健康与生存的恶性肿瘤之一。膀胱癌分为表浅性和浸润性两大分支，前者80％会出现局部复发，但转移率低于10％，后者有50％～80％会发生转移。

近年来，浸润性膀胱癌的治疗有很大的进展，目前对浸润性膀胱癌的治疗大多采用根治性全膀胱切除及尿流改造术，部分膀胱癌切除等。以手术为主、放疗和化疗为辅的方法都会对人体产生重大损伤，且术后有复发的危险，存在创伤较大、副作用明显和患者耐受性低等问题。

发明内容

本发明的一个目的在于开发一种安全有效的抗膀胱癌药物活性成分。

根据本发明的具体实施方案，本发明所提供的安全有效的抗膀胱癌药物活性成分为PPM-18。

PPM-18(2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌，2-benzamido-1,4-naphthoquinoe，又名NQN1)结构式如下：

PPM-18的中心结构是一个萘醌环，和许多VK化合物类似。据文献报道，PPM-18可以在体内体外抑制NF-κB的激活，通过这种作用，它抑制了脂多糖处理的巨噬细胞中iNOS(诱导型一氧化氮合成酶)的表达，从而抑制炎症和败血症的发生。同时，它也是HDAC(组蛋白去乙酰化酶)的抑制剂。此外，PPM-18能够通过扮演一个在线粒体呼吸链(电子传递链上)电子载体的角色而增强线粒体电子传递链上的电子传递，增强线粒体有氧呼吸(氧气消耗)，推动线粒体呼吸链的ATP合成，从而可以抑制斑马鱼和小鼠的癫痫。但是，据目前为止，没有文献报道过PPM-18对肿瘤的作用。

本案发明人通过体外体内实验验证PPM-18对膀胱癌的抑制作用。在体外实验中，通过对PPM-18进行抗膀胱癌细胞活性实验和细胞安全性实验研究发现，PPM-18的添加对于实验用膀胱癌细胞具有明显的活力抑制效果。PPM-18能通过激活细胞内ROS诱导膀胱癌细胞凋亡。在体内实验中，本案发明人通过建立小鼠皮下瘤模型来验证PPM-18在体内的抑制作用。通过小鼠皮下瘤模型实验发现，PPM-18具有明显抑制小鼠皮下瘤的生长作用；PPM-18可以延长皮下瘤小鼠的生存周期。PPM-18能诱导小鼠皮下膀胱癌细胞凋亡来达到抑制皮下瘤生长的作用。PPM-18可以在体内诱导ROS的产生。同时，瘤内注射PPM-18对皮下瘤小鼠体重变化在一定正常范围内波动，证明PPM-18具有一定的安全性。

从而，本发明提供了PPM-18在制备抑制膀胱癌细胞活力的制剂中的应用。

本发明还提供了PPM-18在制备诱导膀胱癌细胞凋亡的制剂中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，PPM-18是通过激活细胞内ROS诱导膀胱癌细胞凋亡。

本发明还提供了PPM-18在制备激活细胞内ROS的制剂中的应用。

本发明还提供了PPM-18在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了PPM-18在制备用于延长肿瘤患者生存期的药物中的应用。

根据本发明的具体实施方案，所述肿瘤为膀胱癌。

根据本发明的具体实施方案，可以在细胞水平或个体水平治疗肿瘤。

综合而言，本发明的研究表明，在细胞水平上PPM-18对于膀胱癌细胞具有明显强烈细胞活力抑制作用。进一步地，PPM-18是通过在肿瘤细胞内产生大量的ROS而诱导膀胱癌细胞凋亡，因此是非常有前景的肿瘤治疗新药。另一方面，细胞安全性实验表明，PPM-18在一定浓度范围内没有毒性。同时，PPM-18在体内的小鼠皮下膀胱癌模型中表现出明显的抑制皮下瘤生长的作用，进一步地，PPM-18是通过使皮下膀胱癌细胞凋亡来达到对皮下瘤生长抑制作用。另一方面，相对于对照组小鼠，给予PPM-18处理的小鼠表现出更好的活跃性，因而进一步延长了给药组小鼠的生存周期。可推知PPM-18在临床治疗中或许也能达到治疗癌症并延长癌症病人生存周期的效果。此外，PPM-18可以是化学合成的，使用成本较低，综合考虑适合应用于抗膀胱癌药物的制备。

附图说明

图1为PPM-18和VK2对膀胱癌EJ的细胞活力抑制效应对比图。

图2A与图2B是实施例1中PPM-18抗膀胱癌活性MTT检测结果图。其中，图2A是EJ细胞在不同PPM-18剂量下、不同处理时间下的细胞活力图；图2B是T24细胞在不同PPM-18剂量下、不同处理时间下的细胞活力图。

图3A和图3B是实施例1中PPM-18诱导膀胱癌细胞凋亡分析结果图。其中，图3A是PPM-18诱导膀胱癌T24细胞凋亡的流式分析图。在图3A中，图左上是T24细胞在未加药处理条件下21h培养细胞凋亡散点图；图右上是T24细胞在10μM PPM-18剂量21h培养细胞凋亡散点图；图左下是T24细胞在15μM PPM-18剂量21h培养细胞凋亡散点图；图右下是T24细胞在20μM PPM-18剂量21h培养细胞凋亡散点图。图3B是PPM-18诱导膀胱癌细胞凋亡westernblot的分析结果图。在图3B中，膀胱癌细胞在不同浓度PPM-18处理下，凋亡相关蛋白cleaved caspas-3的表达情况(β-actin作为内参)。

图4A与图4B是实施例1中T24细胞在不同PPM-18剂量下、不同时间处理后，细胞内ROS的变化；图4A，不同PPM-18剂量；图4B，不同处理时间。

图5是实施例1中T24细胞在20μM PPM-18剂量下，通过NAC清除细胞内ROS后，膀胱癌细胞流式细胞仪凋亡分析结果图。

图6A和图6B是实施例2中L02细胞在不同PPM-18剂量下、不同处理时间下的细胞活力图和流式检测细胞凋亡图。图6A，L02细胞活力图；图6B，流式检测细胞凋亡图。

图7A和图7B显示PPM-18抑制膀胱癌细胞T24、EJ的细胞活力和克隆形成、而对人正常细胞L02无明显细胞活力抑制效应的实验结果。其中，图7A显示PPM-18抑制T24、EJ的细胞活力，对L02无明显抑制效应。图7B显示PPM-18抑制EJ细胞的克隆形成能力。

图8A、图8B和图8C显示了PPM-18诱导膀胱癌细胞T24凋亡、对人正常肝细胞L02无明显凋亡效果的实验结果。其中，图8A，流式检测PPM-18对T24细胞的凋亡；图8B，westernbolt检测凋亡相关蛋白的表达；图8C，流式检测PPM-18对L02细胞的凋亡。

图9A和图9B显示PPM-18通过产生细胞内ROS诱导膀胱癌细胞凋亡实验结果。其中，图9A，PPM-18诱导膀胱癌细胞EJ ROS的产生；图9B，PPM-18通过产生ROS来诱导膀胱癌细胞T24凋亡。

图10A和图10B显示PPM-18在体内抑制膀胱癌EJ细胞生长实验结果。其中，图10A，BALB/c雌性裸鼠各组给药浓度的皮下瘤瘤子大小比较。图10B，PPM-18处理0-32天内，皮下瘤的生长情况。

图11显示PPM-18延长了BALB/c皮下瘤裸鼠的生存周期的实验结果。

图12A和图12B显示PPM-18在体内诱导膀胱癌EJ细胞的凋亡实验结果。其中，图12A，通过免疫组织化学检测切割的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3的表达水平。图12B，通过TUNEL实验评估肿瘤组织的凋亡状态(实验中出现蓝色：DAPI；绿色：反映凋亡水平，绿色点越多，代表凋亡水平越高)。

图13显示本发明实施例9中PPM-18在体内诱导ROS的产生的实验结果。

图14显示PPM-18对BALB/c皮下瘤裸鼠体重变化的影响的实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例中所用的PPM-18为化学合成的药物，母液(DMSO溶解)保存在-80℃中，其水溶液现配现用，且注意避光。

本发明在前期试验中，对比了PPM-18和VK2对膀胱癌EJ的细胞活力抑制效应。在相同培养条件下，同时用100μM的VK2和100μM PPM-18对膀胱癌EJ进行药物处理来检测细胞活力。试验结果参见图1所示。数据显示，相较于对照组(Control)，VK2和PPM-18对膀胱癌细胞都具有抑制效果，但是PPM-18效果更显著。所以说明，PPM-18是一个具有前景的治疗膀胱癌的药物。

实施例1、PPM-18抗膀胱癌活性实验

PPM-18抗膀胱癌活性实验主要包括以下步骤：

(1-1)将实验用膀胱癌细胞进行体外培养；

(1-2)采用不同浓度的PPM-18或PPM-18处理不同时间处理步骤(1-1)中培养的细胞；

(1-3)统计经不同浓度的PPM-18或PPM-18处理不同时间的膀胱癌细胞活力，凋亡，ROS指标的检测；

(1-4)根据步骤(1-3)的结果，绘制PPM-18的抗膀胱癌活性检测结果图。

具体操作如下步骤：

(1-1)将膀胱癌细胞系EJ和T24用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％。

(1-2)将步骤(1-1)中培养的细胞，分别加入如1μM，5μM,10μM，15μM，20μM的PPM-18于细胞培养液中，并设计空白对照(untreated)，处理设定小时后进行细胞活力检测。

(1-3)统计经不同浓度的PPM-18或PPM-18处理不同时间的膀胱癌细胞等指标的检测，具体实施如下：

采用MTT检测试剂检测细胞活力：

PPM-18处理2h，12h，24h后，每孔加入20μL的MTT细胞活力检测试剂，37℃避光孵育1-2h，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

采用流式细胞仪检测细胞凋亡率：

将步骤(1-2)中培养的细胞经PBS洗涤、胰酶消化制成细胞悬液，将其细胞悬液移入15ml离心管中，转速1500rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次，采用华联科的凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡的检测，其具体过程为用双蒸水稀释bindingbuffer，取500μL 1x binding buffer重悬细胞，每管加入5μL Annexin V-FITC和10μL的PI；轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟；在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测Annexin V-FITC和通过PE检测通道检测PI。

采用western blot检测细胞凋亡：

将步骤(1-2)中培养的细胞进行以下五个步骤处理：

第一步：提取样品蛋白。去除含药物培养液后加1ml PBS冲洗一遍；然后加入含有磷酸酶抑制剂的裂解液，在冰上裂解30min；12000rpm，离心20min，收集上清；进行蛋白浓度测定；加入蛋白上样缓冲液，100℃，煮沸5min，进行蛋白变性。

第二步：电泳。配置10％或12％的分离胶，5％的浓缩胶；根据蛋白浓度，决定上样体积；跑电泳，初始电压50V，跑30min，之后调成电压80V，跑2h；根据目标蛋白分子量，进行切胶操作。

第三步：转膜。将切下的胶置于转膜板上，按照三明治模型加上海绵、滤纸和PVDF膜。设置电流300mA，转膜1h。

第四步：封闭和孵抗。将含有目的蛋白的PVDF膜放置于脱脂牛奶中室温摇床封闭3h；一抗(1:2000稀释)4℃摇床过夜；二抗(1：10000稀释)，室温摇床避光孵育3h；TBST洗涤3次，每次30min。

第五步：显影。

采用流式细胞仪检测细胞内ROS的含量：

将步骤(1-2)中培养的细胞其细胞悬液移入15ml离心管中，转速1500rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次，采用普利莱活性氧检测试剂检测细胞内ROS的水平。其具体过程为：将DCFH-DA活性氧检测试剂按照1:5000的稀释比用PBS稀释，每个离心管中加入含有DCFH-DA探针的PBS稀释液500μL；37℃，避光孵育1h，期间注意混匀；用PBS洗涤一次，然后每管加入500μL的PBS重悬；流式上机检测。

结果：

由图2A与图2B可知，MTT检测结果说明在细胞水平上能够说明PPM-18对于膀胱癌细胞具有明显强烈细胞活力抑制作用。

由图3A与图3B可知，PPM-18可以诱导膀胱癌T24细胞凋亡。图3A的每个子图中，从左上开始第一象限代表细胞收集过程中机械性损伤的细胞；第二象限代表晚期凋亡细胞；第三象限代表正常的活细胞；第四象限代表早期凋亡细胞。右上图、左下图和右下图中第二象限内的散点明显多于左上图，而且随着PPM-18浓度的增大，第二象限内的散点也明显增多，说明对于T24细胞，PPM-18具有明显的促进细胞凋亡的作用。图3B表明在不同浓度PPM-18处理下，15μM，20μM的caspase-3的切割片段的表达量明显较对照组(0μM)上调，说明，PPM-18能够通过激活内源性细胞凋亡方式诱导膀胱癌细胞死亡。综上所述，PPM-18在细胞水平上表现出明显的抗膀胱癌作用，可推知或许在个体水平上也能达到治疗癌症的效果。

图4A与图4B显示T24细胞在不同PPM-18剂量下、不同时间处理后，细胞内ROS含量变化。可以看出，PPM-18通过在肿瘤细胞内产生大量的ROS而诱导膀胱癌细胞凋亡，因此是非常有前景的肿瘤治疗新药。

图5显示T24细胞在20μM PPM-18剂量下，通过加入NAC清除细胞内ROS后，流式细胞仪分析凋亡结果。在加入NAC后，细胞的凋亡率相比仅加入20μM PPM-18，其凋亡率明显下降，表明PPM-18通过激活细胞内ROS诱导膀胱癌细胞凋亡。

实施例2、PPM-18细胞安全性实验

PPM-18细胞安全性实验主要包括以下步骤：

(2-1)将实验用的正常人肝细胞进行体外培养；

(2-2)用不同浓度的PPM-18处理步骤(2-1)中培养的细胞；

(2-3)统计经不同浓度PPM-18处理的细胞的活力、凋亡指标的检测；

(2-4)根据步骤(2-3)的结果，绘制PPM-18的细胞安全性检测结果图。

具体操作如下步骤：

(2-1)将正常人肝细胞用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％。

(2-2)向步骤(2-1)中培养的细胞，分别加入如1μM，5μM,10μM，15μM，20μM的PPM-18于细胞培养液中，并设计空白对照(untreated)，处理设定小时后进行细胞活力检测。

(2-3)统计经不同浓度PPM-18处理的细胞的活力、凋亡指标的检测，具体实施如下：

采用MTT检测试剂检测细胞活力：

培养2h，12h，24h后，每孔加入20μL的MTT细胞活力检测试剂，37℃避光孵育1-2h，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果；

采用流式细胞仪检测细胞凋亡率：

将步骤(2-2)中培养的细胞其细胞悬液加入15ml离心管中，转速1500rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次，采用华联科的凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡的检测，其具体过程为用双蒸水稀释binding buffer，取500μL1x binding buffer重悬细胞，每管加入5μL Annexin V-FITC和10μL的PI；轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟；在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测Annexin V-FITC和通过PE检测通道检测PI。

结果参见图6A和图6B所示，显示L02细胞在不同PPM-18剂量下、不同处理时间下的细胞活力和流式检测细胞凋亡情况。由图可知，PPM-18对L02细胞活力和凋亡水平几乎没有影响。据此，可以说明PPM-18在一定浓度范围内的安全性是没有问题的。可推论在个体水平上安全性是比较高的。

实施例3、PPM-18可以抑制膀胱癌细胞活力和克隆的形成，而对正常细胞无明显活力抑制作用

本实施例中，PPM-18抑制膀胱癌细胞活力实验主要包括以下步骤：

(3-1)细胞培养：将实验用膀胱癌细胞和人正常肝细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；

(3-2)种96孔板：将膀胱癌细胞系EJ和T24用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％(一般培养24h)；

(3-3)加药处理：培养24h后，轻轻吸取掉旧培养液，用不同浓度PPM-18(0μM，1μM，5μM，10μM，15μM，20μM)分别处理培养的细胞，加药处理时间24h；

(3-4)MTT检测：培养24h后，每孔加入20μL的MTT检测试剂，37℃避光孵育1-2h，然后选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据记录结果，绘制PPM-18的细胞活力检测结果图。

PPM-18抑制膀胱癌细胞克隆形成实验主要包括以下实验步骤：

(3-a)细胞培养：将实验用膀胱癌细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；

(3-b)收集细胞：将培养瓶中生长到对数生长期的膀胱癌细胞(细胞数约为5*10⁶)，PBS润洗，加入胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化2分钟，然后加入含胎牛血清的MEM培养基终止消化作用，并转移到15ml离心管中，于1500rpm，离心5min；

(3-c)稀释种板：离心结束，弃掉上清液，留下细胞沉淀，并加入1ml新鲜的MEM培养液，轻柔吹打混匀，同时，取2只1.5ml的EP管，分别加入1ml新鲜的MEM培养液。取15ml离心管中的细胞悬液100μL加入到其中的一只1.5mlEP管中，轻轻吹打混匀，然后从中取出100μL加入到另一只1.5mlEP管中，再次轻轻吹打混匀。然后从第二只1.5mlEP管中取出100μL加入到装有12ml新鲜MEM培养液的15ml离心管中，混匀后种12孔板，每孔1ml。以这种方式稀释种板，12孔板中每孔约200-500个细胞；

(3-d)加药处理：待12孔板中的细胞贴壁培养3-4天后，吸取掉旧培养液，加入浓度梯度的PPM-18(0μM、10μM、15μM、20μM)，刺激1h，然后吸取掉含药物培养基，加入不含药物的新鲜MEM培养液继续培养4-5天；

(3-e)克隆形成：待形成肉眼可见的细胞克隆后，终止培养。吸取掉板中的旧培养液，每孔加入1mlPBS润洗一遍，然后加入无水甲醇固定10分钟，用PBS洗涤三次，再加入结晶紫染色30分钟，并于30分钟后，PBS润洗3-4遍，然后将板子避光干燥，并拍照和计算每组克隆形成数。

实验结果请参见图7A和图7B。结果说明：在前期实验中，比较了PPM-18和VK2对膀胱癌细胞EJ的活力抑制作用，发现100μM PPM-18的作用效果较100μM VK2更显著，接下来筛选PPM-18对膀胱癌细胞的作用浓度，并计算了IC₅₀。如图7A所示，选取了0μM、1μM、5μM、10μM、15μM、20μM，这6个浓度，分别加药处理24h，发现PPM-18呈现浓度梯度依赖的方式抑制膀胱癌细胞活力，并通过计算IC₅₀，得出PPM-18对T24的IC₅₀作用浓度为13.17μM，对EJ的IC₅₀作用浓度为12.21μM，而对人正常肝细胞无明显细胞活力抑制效果，其IC50必定大于20μM。通过MTT实验，得出PPM-18能够有效抑制膀胱癌细胞的活力，而对人正常肝细胞无明显抑制作用。MTT实验可以短期快速验证药物对细胞的作用，接下来用细胞克隆实验来进一步验证PPM-18在长期增殖中对膀胱癌的作用效果。如图7B所示，随着PPM-18浓度梯度的上升，其对克隆形成呈现梯度抑制效果，进一步验证了PPM-18可以抑制集落的形成，且这个效果是呈现浓度依赖性的。

实施例4、PPM-18可以诱导膀胱癌细胞凋亡，而对正常细胞无明显凋亡效果

本实施例中，用流式检测PPM-18诱导细胞凋亡，主要包括以下实验步骤：

(4-1)细胞培养：将培养瓶中的细胞在37℃、5％的CO2的细胞培养箱中培养至细胞处于对数生长期；

(4-2)细胞种板：将处于对数生长期的细胞加入PBS润洗、胰酶消化后，加入12ml的新鲜的培养液轻轻吹打混匀，种12孔板，每孔1ml细胞悬液，上下左右来回晃动5次，置于细胞培养箱中培养48h，培养24h时换液一次；

(4-3)加药处理：48h后，细胞处于90％-100％的丰度，然后加PPM-18处理(PPM-18的浓度为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM)24h；

(4-4)收集细胞：24h后，将12孔板种的细胞收集于15ml离心管中，转速1500rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次；

(4-5)加入凋亡检测试剂：采用华联科的凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡的检测，其具体过程为用双蒸水稀释binding buffer，取500μL 1x binding buffer重悬细胞，每管加入5μL Annexin V-FITC和10μL的PI；轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟；

(4-6)流式机检测凋亡：在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测Annexin V-FITC和通过PE检测通道检测PI。

采用western blot检测细胞凋亡包括以下步骤：

(4-a)细胞培养：将培养瓶中的细胞在37℃、5％的CO2的细胞培养箱中培养至细胞处于对数生长期；

(4-b)细胞种板：将处于对数生长期的细胞加入PBS润洗、胰酶消化后，加入12ml的新鲜的培养液轻轻吹打混匀，种6孔板，每孔2ml细胞悬液，上下左右来回晃动5次，置于细胞培养箱中培养48h，培养24h时换液一次；

(4-c)加药处理：48h后，细胞处于90％-100％的丰度，然后加PPM-18处理(PPM-18的浓度为0μM、15μM、20μM)24h；

(4-d)提取样品蛋白：去除含药物培养液后加1mlPBS冲洗一遍；然后加入含有磷酸酶抑制剂的裂解液，在冰上裂解30min；12000rpm，离心20min，收集上清；进行蛋白浓度测定；加入蛋白上样缓冲液，100℃，煮沸5min，进行蛋白变性；

(4-e)电泳：配置10％的分离胶，5％的浓缩胶；根据蛋白浓度，决定上样体积；跑电泳，初始电压50V，跑30min，之后调成电压80V，跑2h；根据目标蛋白分子量，进行切胶操作；

(4-f)转膜：将切下的胶置于转膜板上，按照三明治模型加上海绵、滤纸和PVDF膜。设置电流300mA，转膜1h；

(4-g)封闭和孵抗：将含有目的蛋白的PVDF膜放置于脱脂牛奶中室温摇床封闭3h；一抗(1:2000稀释)4℃摇床过夜；二抗(1：10000稀释)，室温摇床避光孵育3h；TBST洗涤3次，每次30min；

(4-h)显影。

图8A、图8B和图8C显示了PPM-18诱导膀胱癌细胞T24凋亡、对人正常肝细胞L02无明显凋亡效果的实验结果。

结果说明：PPM-18可以抑制膀胱癌细胞的活力。接下来本实施例验证是否PPM-18可以诱导膀胱癌细胞凋亡。如图8A所示，通过流式检测，确实PPM-18诱导了膀胱癌细胞凋亡，在20μM的PPM-18浓度下，其凋亡率达到了47％，此时对照组凋亡率为15％左右，凋亡率上调了3倍左右。且通过western检测凋亡相关蛋白的表达，如图8B所示，凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax均上调，而caspase-3、PARP均有所下调，证明了PPM-18诱导凋亡是依赖caspase-3的，虽然Bcl-2的表达水平似乎无明显变化。

本实施例中，接下来用人正常肝细胞系L02来进一步验证PPM-18对正常细胞有没有凋亡效果。同样地，通过流式检测，本发明发现在5μM、10μM、15μM的PPM-18浓度下，PPM-18对人正常肝细胞无明显凋亡效应，但是在20μM的高浓度下，PPM-18对L02有些许凋亡效应，但是相较于PPM-18对膀胱癌细胞T24的作用来说，其对L02的凋亡效应微乎其微(图8C)。这也从侧面验证了20μM的PPM-18可以抑制L02的细胞活力，但是其抑制作用很弱。通过细胞活力实验和凋亡实验，进一步验证了PPM-18对膀胱癌细胞的抑制作用是很强的，对正常细胞的作用很弱，这为PPM-18对膀胱癌的治疗作用奠定了基础。

实施例5、PPM-18通过产生细胞内ROS来诱导膀胱癌细胞凋亡

本实施例中，PPM-18诱导膀胱癌细胞产生ROS包括以下几个步骤：

(5-1)细胞培养：将培养瓶中的细胞在37℃、5％的CO2的细胞培养箱中培养至细胞处于对数生长期；

(5-2)细胞种板：将处于对数生长期的细胞加入PBS润洗、胰酶消化后，加入12ml的新鲜的培养液轻轻吹打混匀，种6孔板，每孔2ml细胞悬液，上下左右来回晃动5次，置于细胞培养箱中培养48h，培养24h时换液一次；

(5-3)加药处理：48h后，细胞处于90％-100％的丰度，然后加PPM-18和NAC(清除细胞内ROS)处理(各分组分别为对照组、6mM NAC处理组、15μM PPM-18组、15μM PPM-18+6mMNAC组和ROS阳性对照组，即ROSup组)24h；

(5-4)收集细胞：24h后，将6孔板中的细胞收集于15ml离心管中，转速1500rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次；

(5-5)加入ROS探针DCFH-DA：北京普利莱的活性氧检测试剂盒(母液浓度为10mM)，按照1：5000的稀释比用PBS稀释DCFH-DA，然后每管加入500μL的含稀释后的DCFH-DA探针，放入细胞培养箱中孵育30分钟，期间每隔10分钟混匀一次；

(5-6)流式分析仪检测ROS水平：将培养箱中孵育后的样本用PBS洗涤两遍，然后每管再加入500μL的PBS重悬，上流式分析仪检测ROS水平。

PPM-18通过产生细胞内ROS来诱导膀胱癌细胞凋亡包括以下步骤：

(5-a)细胞培养：将培养瓶中的细胞在37℃、5％的CO2的细胞培养箱中培养至细胞处于对数生长期；

(5-b)细胞种板：将处于对数生长期的细胞加入PBS润洗、胰酶消化后，加入12ml的新鲜的培养液轻轻吹打混匀，种6孔板，每孔2ml细胞悬液，上下左右来回晃动5次，置于细胞培养箱中培养48h，培养24h时换液一次；

(5-c)加药处理：48h后，细胞处于90％-100％的丰度，然后加20μM PPM-18和6mM的NAC处理(Control组、6mM NAC组、20μM PPM-18组、20μM PPM-18+6mM NAC组)24h；

(5-d)收集细胞：24h后，将6孔板中的细胞收集于15ml离心管中，转速1500rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次；

(5-e)加入凋亡检测试剂：采用华联科的凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡的检测，其具体过程为用双蒸水稀释binding buffer，取500μL 1x binding buffer重悬细胞，每管加入5μL Annexin V-FITC和10μL的PI；轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟；

(5-f)流式机检测凋亡：在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测Annexin V-FITC和通过PE检测通道检测PI。

本实施例中检测了细胞内ROS的水平。图9A和图9B显示本实施例中PPM-18通过产生细胞内ROS诱导膀胱癌细胞凋亡实验结果。如图9A所示，当加入15μM浓度的PPM-18时，ROS的水平相较于对照组呈现上升趋势，证明了PPM-18确实可以诱导膀胱癌细胞EJ ROS的产生。相较于对照组，15μM PPM-18处理组ROS的水平是对照组的6倍。

接下来验证ROS是否是PPM-18诱导膀胱癌细胞凋亡的因素。本实施例使用了ROS的清除剂NAC(清除细胞内总ROS)，通过流式检测，如图9B所示，发现当加入PPM-18和NAC共处理时，可以大大降低PPM-18所诱导的癌细胞凋亡。

综上所述，PPM-18可以通过使细胞内产生ROS，来诱导膀胱癌细胞凋亡。

实施例6、PPM-18抑制BALB/c雌性裸鼠膀胱皮下瘤的生长

本实施例中，PPM-18抑制小鼠膀胱皮下瘤生长实验主要包括以下步骤：

(6-1)将实验用膀胱癌EJ细胞进行体外培养；

(6-2)收集人膀胱癌EJ细胞：待体外培养的EJ细胞长到对数生长期，弃掉上层培养基，加入PBS润洗，弃掉PBS，加入胰酶并放入细胞培养箱消化3分钟，然后加新鲜的MEM终止消化，轻微吹打混匀，将细胞悬液转移入15ml离心管，1000rpm，离心5分钟，弃掉上清液，加入PBS重悬细胞；

(6-3)BALB/c裸鼠皮下接种膀胱癌EJ细胞：选取6只4-6周龄，体重约为18-20g，健康状况良好的雌性BALB/c裸鼠。每只裸鼠右侧皮下接种10⁷个数量的人膀胱癌EJ细胞的PBS悬液；

(6-4)人膀胱癌细胞裸鼠皮下瘤的形成：将接种了人膀胱癌EJ细胞的裸鼠放置在华中科技大学同济医学院的SPF级别的动物实验中心饲养，2-3周后，皮下瘤生长至可给药的大小(约100-200mm³)；

(6-5)BALB/c裸鼠分组：将形成皮下瘤的裸鼠随机分成两组。分别为对照组、5.0mg/kg、各5只。并做上记号以区分各组小鼠；

(6-6)PPM-18给药处理：采取瘤內注射的给药方式，每天给药。对照组给含DMSO的PBS溶液120μL，给药组5.0mg/kg每只裸鼠给对应溶度药物120μL；

(6-7)数据采集：每两到三天测一次瘤子长和宽(皮下瘤体积＝长×宽×宽×0.5)；

(6-8)待小鼠死后，剥离瘤子并拍照。观察瘤子大小变化；

(6-9)计算裸鼠的皮下瘤体积，生成皮下瘤体积生长曲线图。

本实施例中，为了进一步研究PPM-18在体内的抑制作用，构建了BALB/c裸鼠的皮下瘤模型。持续每天瘤內注射PBS或者PPM-18，如图10B所示，在给药的32天内，对照组小鼠的膀胱皮下瘤呈现持续增长的趋势，在32天时，其皮下瘤体积是初始体积的16倍。但是5mg/kg PPM-18的给药组小鼠皮下瘤体积呈现生长平缓，在32天时，其皮下瘤体积约是初始体积的3倍，很明显，给药组小鼠的皮下瘤体积远远小于对照组。并且如图10A所示，将各给药浓度的小鼠皮下瘤剥离，可以更直观的看到给药组小鼠的瘤子明显小于对照组，说明PPM-18可以有效抑制皮下瘤的生长。

综上所述，PPM-18可以在体内抑制人膀胱癌EJ细胞的生长。

实施例7、PPM-18可以延长BALB/c皮下瘤裸鼠的生存周期

PPM-18可以延长BALB/c皮下瘤裸鼠的生存周期实验主要包括以下步骤：

(7-1)前面步骤如实施例6的步骤(6-1)至(6-6)；

(7-2)记录BALB/c皮下瘤裸鼠的死亡日期：在观察期限内，记录对照组、5mg/kg、10mg/kg组BALB/c裸鼠的死亡日期；

(7-3)统计每组BALB/c裸鼠的生存天数，生成生存曲线图；

本实施例中，验证是否PPM-18可以延长皮下瘤裸鼠的生存周期。持续观察47天(最后一只观察小鼠于给药后的第47天死亡)，如图11所示，发现对照组中有两只小鼠在瘤內注射PBS后的第16天死亡、继而陆续在第17天、18天分别有一只小鼠死亡，其中有一只对照组小鼠在第40天死亡，其平均存活天数21.4天。然而5mg/kg的给药组小鼠其中一只在给药后的第25天死亡，然后陆续在给药后的第32天、45天(两只给药组死亡)、47天死亡，其平均存活天数38.8天，相较于对照组，大大延长了皮下瘤小鼠的生存周期。

实施例8、PPM-18体内诱导人膀胱癌EJ细胞凋亡

本实施例为PPM-18体内诱导人膀胱癌EJ细胞凋亡实验。实验方法包括：

(8-1)前面步骤如实施例6的步骤(6-1)至(6-6)；

(8-2)取皮下瘤：将BALB/c裸鼠皮下瘤用手术器械将瘤体剥离，然后于4％的多聚甲醛中固定，并置于4℃冰箱保存；

(8-3)凋亡的检测：将在4％的多聚甲醛中固定的皮下瘤由武汉谷歌生物进行cleaved caspase-3免疫组化和TUNEL指标的检测。

本发明中发现PPM-18能够显著抑制BALB/c裸鼠膀胱皮下瘤的生长，且到32天左右，5mg/kg给药浓度的瘤子体积远远小于对照组。而在前期细胞实验中，发现PPM-18可以诱导人膀胱癌细胞T24凋亡。为了进一步验证PPM-18能否在体内诱导膀胱癌细胞凋亡。本发明中将经过PBS处理和PPM-18给药处理的裸鼠皮下瘤剥离，经过4％多聚甲醛固定、石蜡包埋做成切片，进行TUNEL荧光染色、cleaved caspase-3免疫组化检测，来评估皮下瘤组织的凋亡水平。

图12A和图12B显示了本实施例的PPM-18在体内诱导膀胱癌EJ细胞的凋亡的实验结果。图12A是检测皮下瘤中cleaved caspase-3的表达水平，相较于对照组，5mg/kg PPM-18的给药组小鼠皮下瘤caspase-3的切割片段随之上调，证明PPM-18确实诱导膀胱皮下瘤的凋亡。图12B显示通过TUNEL实验评估肿瘤组织的凋亡状态。实验过程中出现蓝色：DAPI；绿色：反映凋亡水平，绿色点越多，代表凋亡水平越高。且根据图12B显示，5mg/kg PPM-18的给药组小鼠皮下瘤TUNEL的阳性水平要高于对照组，也证明了PPM-18可以在体内诱导膀胱癌EJ细胞的凋亡。

实施例9、PPM-18可以诱导体内ROS的产生

本实施例为PPM-18可以诱导体内ROS的产生的实验。实验方法包括：

(9-1)前面步骤如实施例6的步骤(6-1)至(6-6)；

(9-2)取皮下瘤：将BALB/c裸鼠皮下瘤用手术器械将瘤体剥离，立即存放于-80℃冷冻保存；

(9-3)组织中ROS的检测：将在-80℃冷冻保存的瘤体交于武汉谷歌生物进行组织中ROS的检测。

本实施例中，在体内实验中验证了PPM-18也可以诱导ROS的产生。实验中出现蓝色：DAPI，红色：ROS，红色越多，代表ROS的水平越高。如图13所示，5mg/kg PPM-18处理组，ROS的含量较对照组有上调的趋势，这和体外的实验结果是一致的。证明了PPM-18可以在体内诱导ROS的产生。

实施例10、PPM-18的药物安全性

本实施例的PPM-18的药物安全性实验主要包括以下步骤：

(10-1)前面步骤如实施例6的步骤(6-1)至(6-6)；

(10-2)体重数据采集：在给药过程中，每隔两到三天，称量各组小鼠的体重；

(10-3)计算每组BALB/c裸鼠的平均体重，生成体重变化曲线图。

给药过程中监测小鼠的体重变化，可以体现药物的安全性。所以在整个实验过程中，对各组小鼠的体重变化进行了统计，如图14所示，发现给药组的小鼠体重在整个给药过程中没有发生太大的波动，基本维持在一个比较稳定的水平，说明PPM-18具有一定的安全性。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.PPM-18在制备抑制膀胱癌细胞活力和/或诱导膀胱癌细胞凋亡而对人正常肝细胞无明显抑制作用的制剂中的应用，其中，PPM-18为2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，PPM-18通过诱导膀胱癌细胞产生ROS诱导细胞凋亡。

3.PPM-18在制备激活细胞内ROS来治疗膀胱癌而对人正常肝细胞无明显抑制作用的制剂中的应用，其中，PPM-18为2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌。

4.PPM-18在制备用于治疗肿瘤膀胱癌的药物中的应用，其中，PPM-18为2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌，其中，所述肿瘤为膀胱癌。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述治疗肿瘤为在细胞水平或个体水平治疗。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述细胞为人膀胱癌细胞。

7.PPM-18在制备用于延长肿瘤患者生存期的药物中的应用，其中，PPM-18为2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌，其中，所述肿瘤患者为膀胱癌患者。

8.根据权利要求1~7任一项所述的应用，其中，PPM-18具有如下结构：

。

9.根据权利要求1~7任一项所述的应用，其中，PPM-18为化学合成的。

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