CN105878253A - 科罗索酸的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种科罗索酸的医药用途。本发明的科罗索酸可用于制备防治肺癌的药物和保健品。

Description

科罗索酸的医药用途

技术领域

本发明涉及医药保健品领域，特别是涉及一种科罗索酸的医药用途。

背景技术

肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，在肿瘤组织中比例约在0.1-2％之间。CSC的概念于2001年提出，至今已在多种组织中得到证实，包括白血病、肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等。

肿瘤干细胞与成体干细胞相似，具有分化和自我复制能力。它与成体干细胞的分化和自我复制不同之处在于，肿瘤干细胞的自我复制能力是一种不受限的自我生长。

肿瘤干细胞能够不断地进行自我更新、分化，表现为具有很强的致瘤性，仅需少量肿瘤干细胞即可形成肿瘤，而一般肿瘤细胞需要大量细胞才能形成肿瘤。肿瘤干细胞形成肿瘤的能力是其他肿瘤细胞的百倍以上。这是肿瘤干细胞区别于普通肿瘤细胞的特点之一。

放化疗药物为临床肿瘤治疗的常用手段。但是传统放化疗治疗只能杀死肿瘤细胞，而对肿瘤干细胞则没有明显地抑制作用，并且在一定程度上还会富集肿瘤干细胞。这是导致患者在放化疗后，易出现肿瘤复发的主要原因。基于以上因素，抑制肿瘤干细胞增殖的药物研发才是肿瘤药物开发的重点和难点。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种科罗索酸的新的医药用途。

具体地说，本发明的第一方面是提供了科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备预防或治疗人肺支气管癌H1650的药物或保健品中的应用。

本发明的第二方面是提供了科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备预防或治疗人大细胞肺癌H460的药物或保健品中的应用。

本发明的第三方面是提供了科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备抑制肺癌肿瘤干细胞增殖的药物或保健品中的应用。

在一优选例中，所述肺癌肿瘤干细胞为非小细胞肺癌H1650肿瘤干细胞。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1是科罗索酸对非小细胞肺癌各种病理类型细胞增殖48小时的影响(图1a：人肺支气管癌细胞H1650；图1b：肺腺癌细胞SPC-A-1；图1c：肺腺癌A549；图1d：人大细胞肺癌H460)；

图2是科罗索酸对非小细胞肺癌H1650克隆形成的影响；

图3是科罗索酸对H1650肿瘤干细胞球体形成的影响；

图4是科罗索酸对非小细胞肺癌H1650中TGF/Smad信号通路核移位的影响。

具体实施方式

本发明人通过实验研究，意外地发现科罗索酸能够显著性地抑制非小细胞肺癌的增殖以及抑制非小细胞肺癌肿瘤干细胞的增殖。故而，该化合物可用于制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物或保健品。

如本领域的技术人员所知，本发明的科罗索酸(Corosolic acid)，又名2α-羟基熊果酸(2-alpha-hydroxyursolic acid)，其具有如下结构通式：

分子式：C₃₀H₄₈O₄，分子量：472.71

本发明还包括上述化合物的相应的所有药学上可以接受的盐、水合物或前药。这些盐可以由化合物中带正电荷的部分(例如，胺基)与具有相反电性的带负电荷(例如，三氟醋酸)形成；或者由化合物中带负电荷的部分(例如，羧基)与正电荷(例如，钠、钾、钙、镁)形成。化合物可以含有一个非芳香性的双键，具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。所有这些异构体都是可预期的。所述的“科罗索酸的前药”通常指一种物质，当用适当的方法施用后，可在受试者体内进行代谢或化学反应而转变成科罗索酸或其盐。

本发明的科罗索酸可通过本领域的常规方法从大花紫薇中提取获得，或者利用市售原料，通过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现有公知技术可以合成本发明的化合物。合成的化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。

合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCHPublishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3^rd Ed.,John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for OrganicSynthesis,John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis,John Wiley and Sons(1995)中都有公开。

本发明的科罗索酸可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的科罗索酸及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1～99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的科罗索酸。“可药用载体”不会破坏本发明的科罗索酸的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。

所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

本发明的科罗索酸以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。

本发明的科罗索酸以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经肌肉或皮下、静脉、尿道、阴道等。

本发明的科罗索酸可以保健品的形式使用。所述保健品包括有效量的本发明的科罗索酸及其他保健品领域常规的添加剂，例如增溶和改善口昧的物质，如增加甜味的甜味剂；抗氧化的抗氧化剂；做成各种剂型所需的药学上允许的载体、赋形剂等。含有本发明的科罗索酸的保健品可以被制成各种形式，例如饮料、颗粒剂、片剂、胶囊等形式，以便于服用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例1科罗索酸对非小细胞肺癌增殖的抑制作用

选择4种非小细胞肺癌细胞株(肺细支气管肺泡癌H1650，人大细胞肺癌细胞H460，肺腺癌细胞SPC-A-1，人肺腺癌细胞A549)对科罗索酸的体外抗肿瘤活性进行测试，使用含10％胎牛血清的DMEM培养基(含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，37℃、5％CO₂条件下过夜培养，每周传代两次。采用MTT法检测科罗索酸对细胞增殖的影响。

实验方法(MTT法)：收集对数生长期细胞，用含0.05％EDTA的0.25％胰酶消化，重悬并计数。以每孔5×10³个细胞接种于96孔细胞培养板。培养24小时后吸取上清液，加入含不同浓度科罗索酸(μM/L)的培养液200μL继续培养48小时。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μL，置于细胞培养箱37℃继续培养4小时，弃去上清，每孔加入DMSO 150μL，室温混匀10分钟，用酶标仪在570nm下检测。利用Graphpad Prism5进行统计分析，分析细胞死亡率，计算IC₅₀。

实验结果表明，科罗索酸对非小细胞肺癌中各种病理亚型的细胞株增殖具有抑制作用，且呈剂量依赖性(如图1所示)。半数抑制浓度(IC₅₀)值详见表1。

表1科罗索酸对非小细胞肺癌细胞株的半数抑制浓度(μM/L)

	H1650	A549	SPC-A-1	H460
					科罗索酸	19.14	24.02	26.24	25.99

实施例2科罗索酸对非小细胞肺癌细胞平板克隆形成的影响

平板克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆(集落)。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖能力进行分析。此方法可用于有效评价药物的抑癌能力。

实验方法(克隆形成实验)：取处于指数生长期的肿瘤细胞，用含0.05％EDTA的0.25％胰酶消化，重悬并计数。利用细胞计数板调节细胞浓度为60个/ml，取5ml加入到60mm培养皿中，细胞均匀分布，铺满培养皿表面。细胞培养过夜后，弃去培养基，加入含不同浓度科罗索酸(μM/L)的培养基。一般培养10-12天，观察是否有克隆形成以及克隆大小。经过固定和吉姆萨染色，在显微镜下进行克隆计数。每团细胞数大于20个时作为一个克隆，即可计数。

实验结果表明，科罗索酸对非小细胞肺癌H1650细胞克隆形成具有抑制作用，且呈浓度依赖性，与MTT实验结果相一致(如图2所示)。

实施例3科罗索酸对非小细胞肺癌中肿瘤干细胞球体形成的影响

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是指一小群特定的肿瘤发生细胞，在特定的肿瘤组织中具有很强的自我更新和增殖分化能力。虽然数量很少，但是却具有很强的致瘤作用。这类细胞是肿瘤发生、进展、复发及转移的根源，也是肿瘤对放化疗耐受的根本原因。肿瘤干细胞与干细胞具有很多相似的特性，能够进行自我更新。但是由于肿瘤干细胞缺少干细胞的自我更新调控和定向分化能力，肿瘤干细胞能够不断地分裂形成肿瘤细胞，导致细胞数目不断增加，肿瘤组织不断变大。由于肿瘤干细胞由于具有自我更新、增殖的能力，能够在不贴壁、无血清的培养条件下成球，因此可通过肿瘤干细胞成球实验，评价药物的抑癌能力。

实验方法(球体形成实验)：取指数生长期的肿瘤细胞，用含0.05％EDTA的0.25％胰酶消化，重悬并用PBS清洗2-3次，去除培养基中所含血清。细胞重新悬浮于DMEM培养基(含EGF 20ng/ml，bFGF₂ 20ng/ml,Vitamin B27,100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，进行培养。按照每孔1500个细胞的数量接种到未处理的6孔板中，第二天开始进行药物处理(μM/L)，共处理7-10天，根据球体形成的数量来评价药物对肿瘤干细胞球体形成的影响。实验结果表明，科罗索酸对非小细胞肺癌H1650中肿瘤干细胞球体形成具有抑制作用，且呈浓度依赖性，明确了科罗索酸对肺癌肿瘤干细胞增殖的抑制作用。

实验结果与肿瘤细胞中MTT实验、平板克隆形成实验结果相一致，表明科罗索酸是通过抑制肿瘤干细胞增殖来达到抗癌的作用(如图3所示)。

实施例4科罗索酸对非小细胞肺癌中TGF-β/Smad信号通路的影响

凡事有两面性，人有善恶同在。在癌症的发生发展中，也存在着这么一个亦正亦邪的细胞因子，那就是转化生长因子β(TGF-β)。TGF-β在肿瘤形成的早期发挥抑制作用，是通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡、抑制炎症因子来实现。相对于TGF-β的抑癌作用，TGF-β的促癌作用多发生在癌症形成过程的后期，主要表现：促进肿瘤生长、转移，促进肿瘤细胞的免疫逃逸，以及促进血管的生成，加剧肿瘤患者病程的发展，是导致肿瘤复发、转移的主要因素之一。在肿瘤干细胞研究中TGF-β能够调控肿瘤干细胞标记物CD133，具体表现在激活Smad3能够富集CD¹³³⁺亚群细胞。因此，在肿瘤后期有效抑制TGF-β/Smad信号通路的激活，将会有效抑制肿瘤的增殖、复发、转移。

在TGF-β/Smad信号通路中，活化的I型TGF-β受体催化Smad2/3磷酸化，继而Smad2/3与Smad4形成多聚体，进入细胞核并调节靶基因转录。且非小细胞肺癌中Ⅱ、Ⅲ期患者的TGF-β、Smad2/3水平也与肺癌的预后、转移有相关性。因此复合物Smad2/3/4是TGF-β信号下游关键的蛋白靶点。

实验方法：取指数生长期的肿瘤细胞，用含0.05％EDTA的0.25％胰酶消化，重悬并计数。将5×106个细胞接种100mm培养皿，培养过夜后，弃去培养基，加入含不同浓度科罗索酸(μM/L)的培养基。分别处理8、15、30分钟和1、2、4小时，采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天生物技术有限公司)提取蛋白，以BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)进行蛋白定量，进行蛋白质印迹检测(Western Blot)，上样量25μg。SDS-PAGE电泳后转移到NC膜，以5％脱脂奶粉封闭后，加入一抗(Smad2，Smad3，Smad4(1：1000)，Histone(1：2000)，CST公司)孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：2000，Santa Cruz)，孵育1小时，化学发光法检测蛋白水平变化。

实验结果表明，科罗索酸能够有效减低肿瘤细胞中Smad2/3/4蛋白复合体的核移位水平，进而达到抑制TGF-β/Smad信号通路的作用，干预肿瘤细胞的增殖调控，从而达到抗癌的目的(如图4所示)。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims (4)

1.科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备预防或治疗人肺支气管癌H1650的药物或保健品中的应用。

2.科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备预防或治疗人大细胞肺癌H460的药物或保健品中的应用。

3.科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备抑制肺癌肿瘤干细胞增殖的药物或保健品中的应用。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肺癌肿瘤干细胞为非小细胞肺癌H1650肿瘤干细胞。