CN103933048B - 一种熊果酸衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种熊果酸衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。通过体外实验表明，本发明的熊果酸衍生物（US597）对肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移等具有显著的抑制作用；能有效调控细胞表面与肿瘤转移相关粘附因子的表达；且对人体正常细胞安全低毒。体内动物实验表明，其可有效减少小鼠B16-F10黑色素瘤的实验性肺转移，提示其具有较好的抗肿瘤转移作用。本发明的熊果酸衍生物可应用与肿瘤转移的预防药物中，开拓了熊果酸衍生物在肿瘤预防和治疗的新用途，为开发肿瘤转移的新生药物而预防恶性肿瘤的术后再转移提供了新的选择。

Description

一种熊果酸衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用

技术领域

本发明涉及预防恶性肿瘤术后转移的药物，具体地说是熊果酸及衍生物在预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。

背景技术

癌症（亦称恶性肿瘤）是当今威胁人类健康最严重的疾病之一，到目前为止尚无彻底治疗的办法。因而，寻求有效预防及治疗的肿瘤方法和药物一直是国内外的研究的热点。转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，目前尽管对肿瘤的化疗、放疗和手术治疗水平同过去相比均有很大的发展提高，但肿瘤术后复发转移仍是造成大部分癌症患者治疗失败和死亡的主要原因。

肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第5位。在我国每年约有11万人死于肝癌，发病人数约占全球肝癌病人数量的55%，是全球肝癌发病率最高的国家，死亡率居恶性肿瘤的第2位。肝癌治疗失败和死亡的主要原因是肝癌根治性切除术后的复发和转移，而肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附及随后的跨内皮迁移在癌症转移中起关键作用。

肿瘤转移是个复杂的多步骤过程,其中肿瘤细胞与血管内皮细胞的相互粘附和作用是肿瘤转移的关键步骤之一,它决定肿瘤转移的器官特异性。在肿瘤细胞同内皮细胞粘附过程中，细胞粘附因子（Integrin、SleX/A、VCAM-1、ICAM-1和E-selectin等）的表达与肿瘤转移密切相关。粘附分子对肿瘤细胞的粘附转移起着非常重要的调节作用，在肿瘤转移过程中，有多种粘附分子参与并介导肿瘤细胞与血管内皮细胞相互粘附。肿瘤细胞与内皮细胞粘附后，使血管内皮细胞收缩变圆，细胞连接间出现间隙．内皮层通透性增高，肿瘤细胞穿透血管壁，进入组织，形成转移。因此．通过药物干预肿瘤细胞与血管内膜的早期粘附作用有可能成为阻止肿瘤转移的有效途径之一；药物对细胞表面粘附分子表达的影响，可以作为判定预防和治疗肿瘤转移药物的标准之一。

目前临床上预防和治疗肿瘤术后复发转移的药物还是以传统的化疗药物为主，主要化疗药物有：5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂、阿霉素（ADM）、环磷酰胺（MMC）等，其疗效多在10%-20%之间。但是肿瘤细胞对大多数化疗药物敏感性差，且在长期的用药过程中易产生多药耐药性，从而导致化疗的敏感性差且毒副作用大，疗效不佳，目前尚缺乏一种安全有效的药物预防肿瘤术后复发转移。

熊果酸（Ursolicacid,UA）是一种五环三萜类化合物，其广泛分布于枇杷叶、熊果、山楂、白花蛇舌草等多种天然植物中，也是许多传统中药的主要活性成分之一，具有广泛的药理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等。近些年来，UA尤以其低毒高效的特点及多样化的抗癌作用机制日益受到人们重视，显示出较大的临床应用潜力和良好的应用前景。另一方面熊果酸具有较好的保肝抗炎功效，并可增强机体免疫功能。从而能够克服常规化疗药物毒性大、安全系数低的局限，在治疗的同时副作用小、毒性低。但是UA难溶于水，导致其制剂制备困难和体内生物利用低等问题，因此通过对UA的结构进行修饰，以提高难溶性UA的溶解度，从而进一步提高其抗癌活性，并有效改善其生物利用度，正日益成为科研工作者研究的热点和难点。

专利CN101161670B和CN101830961B公布了具有抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物胺和熊果酸酯等，这些UA衍生物相对UA母体本身，虽对肿瘤细胞抗癌活性有一定的提高，但未涉及对正常细胞毒性及其在抗肿瘤转移方面的研究；本课题组在前期申请的专利201110373561.2中公布了一种具有抗肿瘤活性的UA衍生物N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基乙二胺（简称US597，见式I）。该化合物可明显改善UA的溶解度，化合物理化性质稳定；此外跟UA对比，其对不同种类肿瘤细胞均具有更显著的增殖抑制作用，且对正常细胞毒性较低，提示其具有安全、高效和低毒的特点，可望将其应用于肿瘤转移的早期预防和治疗中。鉴于此，本发明以UA衍生物简称US597为研究对象，探讨其在预防和治疗肿瘤转移方面的应用。发明者合成的UA衍生物US597其主要优势在于：1)US597可进一步改善UA的溶解度，在理化性质和成药性方面具有更好的优点；2）US597对各种肿瘤细胞的抗癌活性明显优于UA母体，且对肿瘤细胞具有较好的选择性，对正常细胞安全低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤转移候选药物。因此，发明者将UA衍生物US597应用于预防和治疗肿瘤转移药物研究，并通过体内外实验探讨US597预防和治疗肿瘤转移的作用及机制。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术的缺陷，提供了熊果酸及衍生物在预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种熊果酸衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用，

所述的熊果酸衍生物如式I所示，简称US597：

上述应用中，肿瘤包括但不限于肝癌、黑色素瘤。

上述应用中，熊果酸衍生物US597在预防肿瘤转移药物中的含量大于等于50%。

上述应用中，熊果酸衍生物US597在预防肿瘤转移药物中的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、膏剂、片剂、缓释剂、滴丸剂、胶囊。

本发明的有益效果：

(1).熊果酸衍生物US597对肿瘤细胞的抑制作用有较好的选择性，对正常细胞安全低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤转移药。

(2).熊果酸衍生物US597能抑制肿瘤细胞对细胞外基质及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的粘附。

(3).熊果酸衍生物US597能抑制肿瘤细胞的运动迁移能力。

(4).熊果酸衍生物US597能下调HUVEC细胞表面肿瘤转移相关粘附分子（ICAM-1、VCAM-1、E-selectin）的表达。

(5).熊果酸衍生物US597能抑制肿瘤细胞表面Integrinβ1的表达。

(6).熊果酸衍生物US597能防治小鼠B16-F10黑色素瘤发生肺部转移。

附图说明

图1熊果酸及衍生物US597对肝癌细胞HepG2增殖抑制及正常肝细胞LO2毒性的作用。

图2熊果酸及衍生物US597干预肝癌细胞HepG2与FN胶粘附能力的影响。

图3熊果酸及衍生物US597对肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞的粘附作用。

图4熊果酸及衍生物US597对肝癌细胞HepG2迁移能力的影响。

图5A和图5B熊果酸及衍生物US597对肝癌细胞HepG2表面粘附因子Integrinβ1表达的影响。

图6熊果酸及衍生物US597抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的实验性肺转移。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1熊果酸及衍生物对肝癌细胞HepG2的增殖抑制及对正常肝细胞LO2毒性的研究

将处于对数生长期肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞LO2消化后，细胞密度调整为1×10⁵个/mL，接种于96孔板，每孔100μl，置37℃,5%CO₂培养箱中培养24h；移去旧的培养基，加入受试药物（熊果酸及衍生物）用培养基将受试药物存储液稀释，设定不同的浓度，每孔100μl，另设空白对照组，每组设5个复孔。药物作用24h后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清无酚红1640培养基100μl，再加入0.5mg／mlMTT的溶液100μl，继续孵育4h后，终止培养；小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入100μlDSMO，振荡10min，于570nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值（OD值），计算细胞成活率（%）=（用药组平均OD值/空白对照组平均OD值）×100%。用GraphPadPrism软件进行数据处理，结果见下图1。

实验结果表明US597对肝癌细胞HepG2具有显著的抑制增殖作用，且具有剂量依懒性，而UA本身效果不明显；低浓度的（0.2-5μM）UA和US597对肝癌细胞HepG2作用24h后的具有一定的增殖抑制作用，其抑制率为2.87%—27.32%；该浓度范围的LO2细胞的存活率均大于85%，对正常肝细胞LO2毒性较小。而随着UA及US597浓度的升高，化合物对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用及对正常肝细胞LO2的毒性均显著的增强。在0.2-5μM浓度范围内，UA衍生物US597的抗癌活性明显高于UA母体本身，且US597兼具安全低毒的特点，因此熊果酸衍生物US597可作为预防和治疗肿瘤转移的药物开发利用。同时，选取该浓度范围的US597进行后续的体外粘附、转移等实验研究，可排除因药物抑制肿瘤的增殖作用引起实验结果产生的干扰。

实施例2熊果酸及衍生物抑制肝癌细胞HepG2对细胞外基质的粘附检测

将保存于-20°C的纤粘蛋白FN（fibronectin）静置于37℃水浴至完全融解，用无血清培养液，配置成为浓度为10μg／ml的FN工作液。使用100μL/孔FN工作液完全覆盖于96孔板，室温放置过夜，轻轻吸去液体。取对数生长期HepG2细胞，制成单细胞悬液,细胞浓度为5×10⁵/ml，与不同浓度的药物（0、0.2、1、5μM）混合，接种于FN包被的96孔板中。37℃,5%CO₂孵育2h后，PBS轻洗3遍，控干后加入MTT的培养液10μl，继续孵育4h，弃上清，加入100μlDMSO，溶解后使用酶联检测仪检测570nm处的OD值。粘附抑制率（%）=（1-用药组平均OD值/空白对照组平均OD值）×100%。结果显示US597能明显抑制人肝癌细胞HepG2对FN胶的粘附能力，抑制率为5.48%-31.63%，具有剂量依赖性；而UA仅5μM组的抑制效果(12.60%)与对照组比较存在显著性差异（p<0.05），见图2。

实施例3熊果酸及衍生物抑制肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞的粘附实验

人脐静脉内皮细胞分离自正常妊辰分娩的脐带静脉，并按照Jaffe,E.A.;Nachman,R.L.;Becker,C.G.;Minick,C.R.Cultureofhumanendothelialcellsderivedfromumbilicalveins:Identificationbymorphologicandimmunologiccriteria.Clin.Inest.1973,52,2745-2756.中所示进行培养。将处于对数期的HUVEC细胞消化后接种于24孔板，待上述24孔板的内皮细胞长满孔板时，用PBS清洗两三次，然后加入含有内皮刺激因子IL-1β，浓度为1ng/L的培养基，在37℃,5%CO₂的条件下孵育4h。4h后取出孔板，用PBS清洗两三次后，取对数生长期HepG2细胞，荧光标记后制成4×10⁵/ml^-1单细胞悬液，并加入不同浓度USS597的RPM-1640培养液，药物终浓度分别为：0、0.2、1、5μM，每孔500μl。37℃、5%CO2孵育2h后，PBS轻洗3遍，控干后加入无血清培养液500μl。然后在荧光显微镜下进行拍照，随机拍取10个视眼后并记录每个视眼的细胞数，计算不同浓度的熊果酸及其衍生物对内皮细胞粘附抑制率。粘附率（%）=（用药组平均细胞数/空白对照组平均细胞数）×100%。

由表1,图3可知，与对照组比较，0.2-5μM的US597对肝癌HepG2细胞与HUVEC细胞的粘附的抑制率分别为8.82%，18.46%（p<0.05）、44.39%（p<0.01），存在显著性差异。而0.2-5μM的UA对肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞粘附的抑制作用不明显；5μM的UA对肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞粘附的抑制率仅为15.27%（p<0.05）。

实施例4细胞致伤愈合实验检测熊果酸及衍生物对人肝癌细胞HepG2迁移的影响。

选取对数生长期的HepG2细胞，经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为2×105/ml，以2ml/孔接种于6孔板中，置于37℃,5%CO2的培养箱中培养12h，细胞单层铺满孔板时；划“一”字形划痕，PBS轻洗3遍，分别加入UA（5μM）和US597（0、0.2、1、5μM）并拍照，培养24h后，同一部位再次拍照，测定迁移距离。实验重复三次计算细胞迁移率[细胞迁移率=(用药组0h平均距离—用药组24h平均距离)/(对照组0h平均距离—对照组24h平均距离）×100%]。

UA和US597对肝癌细胞HepG2作用24h后的迁移抑制率检测，结果表明：与对照组相比，5μM的UA对肝癌细胞的迁移抑制率为20.35%（p<0.05），对肝癌细胞HepG2的迁移抑制作用不明显。不同浓度的US597对肝癌细胞HepG2的迁移抑制作用具有剂量依赖性，随着US597浓度的增加，HepG2细胞的迁移率显著降低；5μM的US597对肝癌HepG2细胞作用24h后，细胞的迁移抑制率高达59.05%（p<0.01）。见表2、图4。

实施例5熊果酸及衍生物对HUVEC细胞表面粘附分子（ICAM-1、VCAM-1、E-selectin）的表达抑制分析；

利用流式细胞术检测HUVEC细胞表面粘附分子表达。具体步骤如下：

对选取对数生长期的HUVEC细胞，经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为1.5×10⁵/ml，以2ml/孔接种于6孔板中，置于37℃,5%CO₂的培养箱中培养24h；然后加入1ng/L内皮刺激因子IL-1β，孵育4h；配制所需浓度的UA（5μM）和US597(0.2、1、5μM)，吸弃旧培养基，于每孔2.0ml含药培养基加入到孔板内，设置空白对照组，培养箱内继续孵育24h。

24h后消化收集细胞悬液，1000g离心5min，小心吸除上清，加入约1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞；加药组加入CD54-PE(ICAM-1)、CD106-PE(VCAM-1)、CD62E-APC(E-selectin)，对照组加入相应的同型对照，4℃孵育30min后，流式细胞仪相应激发波长处检测HUVEC细胞表面粘附分子（ICAM-1、VCAM-1、E-selectin）的表达情况。每个样品测定1万个细胞，利用软件分析细胞的平均荧光强度。

如表3所示，HUVEC经IL-1β刺激后，明显增加细胞表面ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达。不同浓度的US597与HUVEC预孵24h后，对IL-1β诱导HUVEC表面ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达均有一定的抑制作用，且存在显著的差异性。US597对经IL-1β诱导的ICAM-1、E-selectin的表达具有剂量依赖性地抑制作用。5μM的US597与HUVEC预孵24h后，ICAM-1、E-selectin表达量下调至29.50%（p<0.01）、57.53%（p<0.01）。而5μM的UA与HUVEC预孵24h后，对IL-1β诱导HUVEC表面ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达量分别为82.48%（p<0.05）、94.32%、87.33%（p<0.05）。与US597相比较，UA对HUVEC表面粘附分子的表达无明显的抑制作用。

实施例6熊果酸及衍生物抑制人肝癌细胞HepG2表面粘附因子Integrinβ1表达作用

选取对数生长期的HepG2细胞，经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为1.5×10⁵/ml，以2ml/孔接种于6孔板中，置于37℃,5%CO₂的培养箱中培养24h；配制所需浓度的UA（5μM）和US597(0.2、1、5μM)，吸弃旧培养基，于每孔2.0ml含药培养基加入到孔板内，设置空白对照组，培养箱内继续孵育24h。

24h后消化收集细胞悬液，1000g离心5min，小心吸除上清，加入约1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞；加药组加入CD29-PE(Integrinβ1)，对照组加入相应的同型对照，4℃孵育30min后，流式细胞仪相应激发波长处检测HepG2细胞表面粘附因子Integrinβ1表达的情况。每个样品测定1万个细胞，利用软件分析细胞的平均荧光强度。

流式细胞仪检测显示，人肝癌HepG2细胞表面整合素β1具有高表达性，阳性率为89.6%。与对照组相比，不同浓度US597（0.2-5μM）作用于肝癌HepG2细胞24h后，HepG2细胞表面Integrinβ1的表达量均有下降，且呈剂量依赖性。5μM的US597作用24h后，HepG2细胞表面Integrinβ1的表达量仅为64.16%(P＜0.01)；而相同浓度UA作用24小时后，HepG2细胞表面Integrinβ1的表达量仍为88.61%(P＜0.05)。5μM的US597对HepG2细胞表面Integrinβ1表达的抑制作用是UA的3倍多。如图5A、B所示。

实施例7检测熊果酸及衍生物对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞人工肺转移瘤形成的抑制作用

取对数生长期B16-F10细胞，PBS缓冲液调整细胞浓度至1×10⁶个ml^-1。C57／BL6小鼠尾静脉注射，每只0.2ml。随机分为生理盐水组、实验组共5组，每组8只。对照组给予生理盐水，US597分为低中高三个剂量组，给药剂量为10mg·kg^-1、20mg·kg^-1、40mg·kg^-1，UA（40mg·kg^-1）组。肿瘤接种后次日采用灌胃方式给药，每只一次给药0.2ml，每天1次，连续给药21d。于给药结束后次日脱颈椎处死小鼠，取肺，福尔马林固定液固定，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶数，并将动物肺组织进行石蜡切片，按下式计算抑制率。抑制率=(1-给药组平均转移瘤灶数／生理盐水组平均转移瘤灶数)×100。

经C57／BL6小鼠尾静脉注射B16-F10细胞建立人工肺转移模型，体内实验发现，不同剂量的US597给药后，与生理盐水组比较，可以不同程度的抑制肺转移灶的形成；高剂量US597（40mg·kg^-1）用药组对B16-F10细胞的肺转移抑制率高达60.24%（P＜0.01＝；而同剂量组的UA用药组，抑制率仅为14.46%（P＜0.05＝，对B16-F10细胞的肺转移无明显的抑制作用。HE染色镜下观察发现，生理盐水组肺转移瘤组织呈巢状或片块，多位于血管周围处，呈多发散状分布，面积较大；US597用药组中肺转移瘤组织亦呈巢状或片块，但随着US597剂量的增加，肺转移瘤灶数显著减少，瘤块面积缩小；而UA用药组（40mg·kg^-1）的肺转移瘤灶数和瘤块面积均为减小。见表4、图6。

Claims (1)

1.一种熊果酸衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用；所述的熊果酸衍生物如式I所示：

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