CN105902561A - 龙须菜多糖作为抗肿瘤化疗药增效剂的应用及抗肿瘤药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种龙须菜多糖的应用以及含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物，该应用为龙须菜多糖作为增效剂在抗肿瘤药物制备中的应用，该抗肿瘤药物包含有龙须菜多糖增效剂、抗肿瘤活性成分以及药学上可接受的辅料。本发明首次发现海藻龙须菜多糖与化疗药紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂等联合使用可以增加化疗药治疗肿瘤的效果。龙须菜多糖与化疗药联用对于多个不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制肿瘤增殖和活性的作用，包括肺癌、胃癌和宫颈癌等，龙须菜多糖对化疗药的增效作用呈剂量依赖性，且龙须菜多糖体外细胞实验中工作浓度未见毒性，具有药源丰富、安全无毒的特征，可开发为用于抗肿瘤化疗药增效剂的抗肿瘤药物或预防保健品，具有临床应用前景。

Description

龙须菜多糖作为抗肿瘤化疗药增效剂的应用及抗肿瘤药物

技术领域

本发明涉及一种海洋红藻龙须菜多糖的应用以及含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物，属于生物医药领域，尤其是海洋中药对肿瘤化疗药增效的技术领域。

背景技术

利用资源丰富的海藻研制低毒、高效的抗肿瘤药物是新型天然活性药物研究的热门领域。常见的肿瘤化疗药物治疗方法效果好但副作用较大。中药辅助西药治疗肿瘤在增强化疗药物疗效、提高机体免疫力、延长生存期、降低复发转移率及减轻副作用等方面有着积极的意义。刘骥等报道了姜黄素对化疗药丝裂霉素C抗胃癌细胞的作用具有增强效应。邓秀莲等发现米非司酮作为化疗增效剂作用于恶性滋养细胞肿瘤治疗中,能明显提高化疗效果,但对不良反应减弱作用不显著。孙超等以咖啡因作为增效剂,协同紫杉醇,可明显抑制骨肉瘤细胞的增殖并促进其凋亡。但目前常用的化疗药增效剂大多为化学合成物，具有毒副作用大、药效成分提取纯化制备过程复杂或成本较大等缺陷。

从研制创新药物角度出发，海洋药物的研究是开发以传统中药为来源的新型天然活性药物的热点及重要方向之一。目前国内外关于海藻抗肿瘤药物的报道日益增多，我国海域辽阔，海藻资源丰富，利用藻类生产抗肿瘤物质很有潜力。如果能将资源丰富的海藻开发为抗肿瘤药物，必将降低新药研制和开发的成本。龙须菜(Gracilariopsislemaneiformis)是红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科、江蓠属大型海藻，又名鹿角菜、海发菜、凤菜、线菜或江蓠等，主要分布于我国山东、辽宁、江苏、福建、海南等沿海地区。龙须菜性味甘、寒，主要入肝经，具有助消化、解积腻、清肠胃和止血降压、软坚化痰、清热利水、温经止痛的功效。作为海洋药物资源，龙须菜富含活性多糖、藻红蛋白和微量元素等，有着独特的生物学作用，已被用来辅助治疗多种疾病。龙须菜多糖为天然化合物，明显不同于常用细胞毒类抗肿瘤药物，且龙须菜多糖作为化疗药增效剂类的药物应用尚未见报道。由于海藻龙须菜多糖具有无毒高效、易于制备、药源丰富的特点，能够提高肿瘤病人生活质量，抵抗大剂量放化疗药物的副作用，因此可作为抗肿瘤化疗药的理想增效剂，并将在临床抗肿瘤治疗中发挥重要作用。

发明内容

为了进一步开拓海洋中药抗肿瘤活性物质的药用价值，本发明提供了一种红藻类植物龙须菜多糖的新用途，即龙须菜多糖作为抗肿瘤化疗药增效剂在抗肿瘤药物制备中的应用以及含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物。

本发明研究首次将龙须菜多糖与抗肿瘤化疗药紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂等联合应用，发现龙须菜可以明显增加化疗药治疗多个不同组织来源肿瘤的效果。

我国海域辽阔，如果能将资源丰富的龙须菜多糖开发为抗肿瘤化疗药增效剂的抗肿瘤药物或预防保健品，必将降低新药研制和开发的成本。鉴于龙须菜是一种容易获得具有临床应用前景的海洋藻类资源，为了充分利用这种藻类资源，本领域技术人员致力于进一步开拓其生物活性物质的用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种龙须菜多糖作为抗肿瘤化疗药增效剂在抗肿瘤药物制备中的应用，如肺癌、胃癌、宫颈癌和肝癌等。

作为优选方案，所述抗肿瘤化疗药物中的活性成分为紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂中的至少一种。

作为优选方案，所述活性成分为紫杉醇时，龙须菜多糖与紫杉醇的重量比为1:(50～100)。

作为优选方案，所述活性成分为氟尿嘧啶时，龙须菜多糖与氟尿嘧啶的重量比为1:(20～40)。

作为优选方案，所述活性成分为甲氨蝶呤时，龙须菜多糖与甲氨蝶呤的重量比为1:(10～20)。

作为优选方案，所述活性成分为顺铂时，龙须菜多糖与顺铂的重量比为1:(25～50)。

第二方面，本发明提供了一种含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物，其特征在于，包括龙须菜多糖增效剂、抗肿瘤活性成分以及药学上可接受的辅料。

作为优选方案，所述抗肿瘤活性成分为紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂中的至少一种，所述辅料为质谱级双蒸水。

作为优选方案，所述抗肿瘤活性成分的重量份数为10～100份、所述龙须菜多糖的重量份数为1份，所述质谱级双蒸水的重量份数为50～2000份。

本发明中的龙须菜多糖可采用三氯乙酸法(Trichloroacetic acid，TAC法)从红藻龙须菜中提取，再用DEAE-Sephadex A-25离子交换柱进行分步洗脱纯化、回收显著级分获得的纯多糖。主要成分为D-半乳糖和3,6-内醚半乳糖，其中D-半乳糖含量为27.36％，3,6-内醚半乳糖含量为29.38％。提取方法具体可参见：龙须菜多糖对肺癌细胞增殖能力及形态的影响.水产学报，2015,39(9):1405-1411。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明首次发现海藻龙须菜多糖与化疗药紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂等联合使用可以增加化疗药治疗肿瘤的效果。研究发现，龙须菜多糖与化疗药联用对于多个不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制肿瘤增殖和活性的作用，包括肺癌、胃癌和宫颈癌等，龙须菜多糖对化疗药的增效作用呈剂量依赖性，且龙须菜多糖体外细胞实验中工作浓度未见毒性，具有药源丰富、安全无毒的特征，可进一步开发为用于抗肿瘤化疗药增效剂的抗肿瘤药物或预防保健品，具有临床应用前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是本发明的实施例1的龙须菜多糖对三种肿瘤细胞的抑制增殖作用图；

图2是本发明的实施例2的龙须菜多糖对紫杉醇增效作用的体外药效学研究图；

图3是本发明的实施例3的龙须菜多糖对氟尿嘧啶增效作用的体外药效学研究图；

图4是本发明的实施例4的龙须菜多糖对甲氨蝶呤增效作用的体外药效学研究图；

图5是本发明的实施例5的龙须菜多糖对顺铂增效作用的体外药效学研究图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

龙须菜多糖对三种肿瘤细胞的抑制增殖作用

实验材料：龙须菜多糖是从红藻类植物龙须菜中提取并纯化得到的多糖。龙须菜为981品种，采自浙江温州。人肺癌细胞株A549、胃癌细胞株MKN45和宫颈癌细胞株Hela购自中科院细胞库，本室保存培养。

实验方法：将纯化干燥的龙须菜多糖加入ddH₂O配成1mg/mL母液，过滤除菌，分装，-20℃冻存备用。人肺癌细胞株A549、胃癌细胞株MKN45和宫颈癌细胞株Hela均为贴壁细胞，细胞复苏后分别以5×10⁶/L的接种密度种于新鲜的1640培养液(含有89v/v％的RPMI1640培养基，10v/v％的胎牛血清FBS，1v/v％的1U/mL的青-链霉素)中培养，置于37℃、饱和湿度、5v/v％CO₂培养箱中培养。每2天换液、传代1次。分别取对数生长期的A549、MKN45和Hela细胞，以0.25v/v％胰酶消化、计数，用含10v/v％胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，制成1×10⁴/mL细胞悬液，接种于3块96孔培养板内，每孔200μL，使每孔细胞密度为2×10³个，每组设4个平行复孔，并设不含细胞的空白组，培养24h，待细胞贴壁后，每孔加入含不同浓度龙须菜多糖(0、20、50、100g/mL)的200L培养基换液，其中0g/mL龙须菜多糖组为对照组。分别连续培养48h后，加入含10v/v％CCK-8的培养基200L换液，继续培养2.5h，采用自动酶标读数仪检测波长450nm的各孔吸光值A。按下列公式计算肿瘤细胞生长抑制率，分析待测药物对肿瘤细胞的增殖活力的影响。

计算公式：细胞生长和增殖活力(％)＝[A450(加药)－A450(空白)]/[A450(对照)－A450(空白)]×100％；细胞生长抑制率＝1－细胞生长和增殖活力(％)

结果：从图1可知，随着作用浓度的增加，龙须菜多糖对三种肿瘤细胞抑制生长和增值效果也有所增加，但在20g/mL以内，作用均不明显(P>0.05)。而当作用浓度为50时，胃腺癌MKN45、肺癌A549和宫颈癌Hela细胞的生长和增殖能力分别是59.16％、51.29％和69.96％(P<0.05)。作用浓度为100g/mL时，对A549、MKN45和Hela细胞的增殖能力46.27％、43.77％和50.67％(P<0.01)。

可见，各实验组与对照组抑制增殖效果相比，龙须菜多糖对肿瘤细胞的生长和增殖能力有抑制作用，且随着浓度的增大，细胞增殖活力越小，抑制作用增大越明显。龙须菜多糖对肿瘤细胞生长和增殖抑制的作用效果呈现出明显的浓度依赖性。

实施例2

龙须菜多糖对紫杉醇抗肿瘤增效作用的药效学研究

实验材料：龙须菜多糖为采用本发明提供的提取分离方法得到的龙须菜多糖成品，同实施例1。紫杉醇注射液(商品名：紫素，英文名称：Paclitaxel Injection)北京协和药厂(批准文号：国药准字H10980069)，规格为5mL:30mg。常规培养于含10％的胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中的人肺癌细胞株A549、胃癌细胞株MKN45和宫颈癌细胞株Hela。

实验方法：本实施例将龙须菜多糖与用于治疗多种实体瘤的一线用药紫杉醇联合使用，作用于人肺癌细胞株A549、胃癌细胞株MKN45和宫颈癌细胞株Hela。龙须菜多糖作用浓度参照实施例1中的浓度选择50和100g/mL，作用48小时。将纯化干燥的龙须菜多糖加入ddH₂O配成1mg/mL母液，过滤除菌，分装，-20℃冻存备用。紫杉醇注射液按药品说明书配置。将A549、MKN45和Hela细胞以5×10⁶/L的接种密度种于新鲜的RMPI1640培养液(含有89v/v％的RPMI1640培养基，10v/v％的胎牛血清FBS，1v/v％的1U/mL的青-链霉素)中培养，置于37℃、饱和湿度、5v/v％CO₂培养箱中培养。每2～3天换液或传代1次。实验采用培养的对数生长期的细胞，以0.25％Trypsin-EDTA胰酶消化、PBS洗涤、细胞计数仪计数，用含10v/v％胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，调整成细胞密度为1×10⁴/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔200μL，使每孔细胞密度为2×10³个，每组设4个平行复孔。同时设4个孔中只加10v/v％FBS的RMPI 11640培养液，不含细胞的空白组，用于调零。将铺有细胞的96孔板置于37℃、5v/v％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中过夜培养，待细胞贴壁后，以换液形式每孔加入待检药物(紫杉醇或者紫杉醇和龙须菜多糖的200L培养基，并设阴性对照孔。继续48小时后，按照CCK8试剂盒说明书，在每孔以换液形式加入含10％CCK-8的培养基200L，继续培养2.5h，自动酶标读数仪检测波长450nm的各孔吸光值A。待测药物对肿瘤细胞的增殖活力的影响的分析方法及肿瘤细胞生长抑制率计算公式及数据分析方法同实施例1。结果如表1和图2所示：

表1 肿瘤细胞生长抑制率(％)(n＝6)

注：与紫杉醇组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05

上述结果表明，单独使用化疗药紫杉醇时，1g/mL紫杉醇对三种肿瘤细胞生长和增殖均有一定的抑制作用而将紫杉醇与龙须菜多糖联合使用时，其抑瘤效果明显增强且大于单独使用紫杉醇的抑瘤效果(P<0.01或P<0.05)，其中对肺癌的抑瘤效果最为显著(P<0.01)。随着龙须菜多糖用量增加，增效作用增强，呈现剂量依赖性。这说明龙须菜多糖增加了紫杉醇的抑瘤效果，对紫杉醇起到了一种增效剂的作用。

实施例3

龙须菜多糖对氟尿嘧啶抗肿瘤增效作用的药效学研究

实验材料：除用氟尿嘧啶注射液代替紫杉醇外，其他材料同实施例2，所用的氟尿嘧啶注射液(英文名称：Fluorouracil Injection)购自亚宝药业集团股份有限公司(批准文号：国药准字H20057995)，规格为10mL:0.25g。

实验内容：除所加入的待检药物为氟尿嘧啶或氟尿嘧啶和龙须菜多糖外，其他同实施例2。实验结果如表2和图3所示：

表2 肿瘤细胞生长抑制率(％)(n＝6)

注：与氟尿嘧啶组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05

上述结果表明，单独使用化疗药氟尿嘧啶时，2.5g/mL氟尿嘧啶对三种肿瘤细胞生长和增殖均有一定的抑制作用而将氟尿嘧啶与龙须菜多糖联合使用时，其抑瘤效果明显增强且大于单独使用氟尿嘧啶的抑瘤效果(P<0.01或P<0.05)，其中对肺癌的抑瘤效果最为显著(P<0.01)。随着龙须菜多糖用量增加，增效作用增强，呈现剂量依赖性。这说明龙须菜多糖增加了氟尿嘧啶的抑瘤效果，对氟尿嘧啶起到了一种增效剂的作用。

实施例4

龙须菜多糖对甲氨蝶呤抗肿瘤增效作用的药效学研究

实验材料：除用甲氨蝶呤注射液代替紫杉醇外，其他材料同实施例2，所用的甲氨蝶呤注射液(进口药品：澳大利亚Pfizer(Perth)Pty Limited，英文名称：Methotrexate Injection)，购自康德乐大药房(批准文号：国药准字H20090207)，规格为20mL:0.5g。

实验内容：除所加入的待检药物为甲氨蝶呤或者甲氨蝶呤和龙须菜多糖外，其他同实施例2。实验结果如表3和图4所示：

表3 肿瘤细胞生长抑制率(％)(n＝6)

注：与甲氨蝶呤组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05

上述结果表明，单独使用化疗药甲氨蝶呤时，5g/mL甲氨蝶呤对三种肿瘤细胞生长和增殖均有一定的抑制作用而将甲氨蝶呤与龙须菜多糖联合使用时，其抑瘤效果明显增强且大于单独使用甲氨蝶呤的抑瘤效果(P<0.01或P<0.05)，其中对肺癌的抑瘤效果最为显著(P<0.01)。随着龙须菜多糖用量增加，增效作用增强，呈现剂量依赖性。这说明龙须菜多糖增加了甲氨蝶呤的抑瘤效果，对甲氨蝶呤起到了一种增效剂的作用。

实施例5

龙须菜多糖对顺铂抗肿瘤增效作用的药效学研究

实施例1中，单独使用龙须菜多糖作用于胃癌MKN45、肺癌A549和宫颈癌Hela细胞均表现出一定的抗肿瘤作用。本实施例将龙须菜多糖与用于治疗多种实体瘤的一线用药顺铂(齐鲁制药，规格：20mg，国药准字H37021358)联合使用，作用于MKN45、A549和Hela细胞。龙须菜多糖给药方法和作用浓度、肿瘤细胞培养方法、细胞增殖能力检测方法、细胞活力计算公式及数据分析方法同实施例2。结果如表4和图5所示：

表4 肿瘤细胞生长抑制率(％)(n＝6)

注：与顺铂组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05

上述结果表明，单独使用化疗药顺铂时，2g/mL顺铂对三种肿瘤细胞生长和增殖均有一定的抑制作用而将顺铂与龙须菜多糖联合使用时，其抑瘤效果明显增强且大于单独使用顺铂的抑瘤效果(P<0.01或P<0.05)，其中对肺癌的抑瘤效果最为显著(P<0.01)。随着龙须菜多糖用量增加，增效作用增强，呈现剂量依赖性。这说明龙须菜多糖增加了顺铂的抑瘤效果，对顺铂起到了一种增效剂的作用。

实施例6

龙须菜多糖用作顺铂增效剂在制备抗肿瘤药物中的应用

实验材料：龙须菜多糖和顺铂注射剂同实施例5。体内药效学实验对象为昆明种H22雄性荷瘤小鼠(体重17-21g)。

实验分组：模型复制后第二天，将腹水瘤小鼠随机分为5组，分别为：①生理盐水组(阴性对照组)；②顺铂10mg/kg组(阳性对照组)；③顺铂10mg/kg+龙须菜多糖25mg/kg(小剂量组)；④顺铂10mg/kg+龙须菜多糖50mg/kg(中剂量组)；⑤顺铂10mg/kg+龙须菜多糖100mg/kg(大剂量组)。

实验方法：将H22荷瘤小鼠适应性饲养3天后，无菌抽取腹水型H22肝癌传代小鼠腹水，用生理盐水稀释调整细胞密度为5x10⁶/ml的细胞悬液。无菌接种于小鼠腹腔，每只注射0.2ml。第二天随机分组后，生理盐水组通过腹腔注射给予0.2ml生理盐水注射液，每3天1次，共3次，灌胃给予生理盐水，0.3ml/只/天，连续9天后停药；顺铂10mg/kg组按10mg/kg体重，通过腹腔注射给予顺铂注射液，每3天1次，共3次，每天灌胃给予龙须菜多糖溶液，0.3ml/只/天，使其终浓度分别达到25、50、100mg/kg，每天连续灌胃给药9天后停药。末次给药后，每天记录各组小鼠死亡只数。数据统计时间结点为第70天，对于70天后依然存活的小鼠按生存70天计算。分析各组H22肝癌腹水瘤小鼠平均存活天数及生命延长率，结果见表5。各组生存天数采用时间比较的假设检验(log-rank检验)。分析各组生命延长率的计算公式如下：

生命延长率＝(T-C)/C X 100，其中T为实验给药组平均存活天数，C为阴性对照组平均存活天数。

表5 不同处理组H22肝癌腹水瘤小鼠平均存活天数和生命延长率分析

注：*表示与生理盐水组相比，P<0.01；#表示与顺铂10mg/kg组相比，P<0.05

上述平均存活天数分析结果表明，与顺铂10mg/kg组相比，顺铂10mg/kg+龙须菜多糖50mg/kg和顺铂10mg/kg+龙须菜多糖100mg/kg组H22肝癌腹水瘤小鼠的平均生存天数显著延长。生命延长率分析结果显示，顺铂10mg/kg组H22肝癌腹水瘤小鼠相对于生理盐水组小鼠的生命延长率为64.72％，顺铂10mg/kg+龙须菜多糖100mg/kg组相对于生理盐水组小鼠的生命延长率达97.48％；与单纯顺铂10mg/kg组小鼠相比，顺铂10mg/kg+龙须菜多糖100mg/kg组H22肝癌腹水瘤小鼠生命延长率达59.27％。表明龙须菜多糖100mg/kg与顺铂10mg/kg联合应用相对于顺铂10mg/kg对于H22肝癌腹水瘤小鼠生命率有明显的延长作用，有显著性差异和疗效优势，具有临床应用价值。

海藻龙须菜多糖与化疗药紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂等联合使用可以增加化疗药治疗肿瘤的效果。其协同增效机制可能是龙须菜多糖抑制了肿瘤细胞某些基因的修复,并逆转了肿瘤细胞对于紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂等化疗药的耐药性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.龙须菜多糖作为抗肿瘤化疗药增效剂在抗肿瘤药物制备中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤化疗药物中的活性成分为紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂中的至少一种。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述活性成分为紫杉醇时，龙须菜多糖与紫杉醇的重量比为1:(50～100)。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述活性成分为氟尿嘧啶时，龙须菜多糖与氟尿嘧啶的重量比为1:(20～40)。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述活性成分为甲氨蝶呤时，龙须菜多糖与甲氨蝶呤的重量比为1:(10～20)。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述活性成分为顺铂时，龙须菜多糖与顺铂的重量比为1:(25～50)。

7.一种含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物，其特征在于，包括龙须菜多糖增效剂、抗肿瘤活性成分以及药学上可接受的辅料。

8.如权利要求7所述的含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤活性成分的重量份数为10～100份、所述龙须菜多糖的重量份数为1份，所述质谱级双蒸水的重量份数为50～2000份。

9.如权利要求7或8所述的含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤活性成分为紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂中的至少一种，所述辅料为质谱级双蒸水。