CN102139037A - 重楼总皂苷在制备抗癌药辅助药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重楼总皂苷在制备抗癌药辅助药物的应用。试验研究结果证明：重楼总皂苷与化疗药物联合用药，可以增强化疗药物的疗效，降低化疗药物的剂量，起到了明显的杀伤肿瘤细胞的作用，并具有降低化疗药物毒性的作用，可以和化疗药物联合应用，因此重楼总皂苷可以制备成为抗癌药物的辅助药物。

Description

重楼总皂苷在制备抗癌药辅助药物的应用

技术领域

本发明涉及重楼总皂苷的用途。

背景技术

癌症是当今世界上死亡率最高的疾病之一。目前临床使用的抗癌药物虽然具有很好的杀死癌细胞的作用，但杀伤癌细胞的同时，对某些正常组织也有一定的损害，使化学治疗药物应用受到了限制，所以研究具有减毒增效作用，预防和治疗放化疗引起的副作用的抗癌辅助药物，是非常有意义的。

人们对重楼总皂苷及其药理活性进行了深入的研究，关于重楼总皂苷的抗肿瘤作用的文献报道越来越多。中国中药杂志，2008，33(16)：2057-2060公开了滇重楼皂苷对10种肿瘤细胞株的细胞毒谱及构效关系研究；王羽等在中国中药杂志，2007，32(14)∶1425-1428)发表了滇重楼的抗肿瘤活性成分研究；程志祥等对重楼总皂苷作用人肝癌细胞系HepG2的细胞毒性作用及蛋白组学进行了研究；石小枫等观察发现重楼总皂苷水溶液灌胃及腹腔注射均能明显抑制荷瘤小鼠瘤组织的生长，延长肿瘤的倍增时间，核酸同位素前体掺入实验表明，重楼总皂苷能干扰H₂₂瘤细胞形成DNA、RNA，同时还能干扰荷瘤小鼠脾组织DNA、RNA的生物合成。中国专利03135589.7、200610052223.8公开了重楼总皂苷的制备方法，2008100520922也公开了以重楼总皂苷为有效成分的药物制剂及其制备方法。

重楼中的皂苷类成分是抗肿瘤作用的有效成分，经体内外实验研究，具有明显的杀伤肿瘤细胞的作用，并对细胞免疫和体液免疫有增强作用，但目前重楼总皂苷作为抗癌辅助药物，用于降低化疗药物的剂量，减小化疗药物的毒副作用的研究较少。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种重楼总皂苷在制备抗癌药辅助药物的应用。

本发明的第二个目的是提供重楼总皂苷与药学可接受的辅料制成的制剂在制备抗癌药辅助药物的应用。

本发明的技术方案概述如下：

重楼总皂苷在制备抗癌药辅助药物的应用。

重楼总皂苷与药学可接受的辅料制成的制剂在制备抗癌药辅助药物的应用。

所述抗癌药为顺铂、环磷酰胺、氟尿嘧啶或丝裂霉素。

试验研究结果证明：重楼总皂苷与化疗药物联合用药，可以增强化疗药物的疗效，降低化疗药物的剂量，起到了明显的杀伤肿瘤细胞的作用，并具有降低化疗药物毒性的作用，可以和化疗药物联合应用，因此重楼总皂苷可以制备成为抗癌药物的辅助药物。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域的技术人员理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

将重楼粉碎至颗粒状，然后加入体积浓度为70％的乙醇水溶液，重楼与乙醇水溶液的加入比为1g∶4ml，加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液并浓缩至25℃相对密度为1.00；上述浓缩液加入50倍体积的体积浓度为10％的乙醇水溶液中并分散均匀，离心，上清液通过D101大孔吸附树脂柱进行吸附(干树脂重量∶重楼药材重量＝1∶4)，之后用体积浓度为10％的乙醇水溶液对树脂柱洗脱，再用体积浓度为70％的乙醇水溶液进行洗脱，收集70％的乙醇水溶液的洗脱液，浓缩、干燥、粉碎、过筛而得到粉末状重楼总皂苷。

实施例2

将重楼粉碎至颗粒状，然后加入体积浓度为60％的乙醇水溶液，重楼与乙醇水溶液的加入比为1g∶10ml，混合物加热回流提取2次，每次3小时，合并提取液并浓缩至25℃相对密度为0.92；上述浓缩液加入10倍体积的体积浓度为20％的乙醇水溶液中并分散均匀，离心，上清液通过D101大孔吸附树脂柱进行吸附(干树脂重量∶重楼药材重量＝1∶4)，之后用体积浓度为30％的乙醇水溶液对树脂柱洗脱，再用体积浓度为90％的乙醇水溶液进行洗脱，收集90％的乙醇水溶液洗脱液，浓缩、干燥、粉碎、过筛而得到粉末状重楼总皂苷。

实施例3

将重楼粉碎至颗粒状，然后加入体积浓度为80％的乙醇水溶液，重楼与乙醇水溶液的加入比为1g∶8ml，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液并浓缩至25℃相对密度为0.97；上述浓缩液加入30倍体积的水中并分散均匀，离心，上清液通过D101大孔吸附树脂柱进行吸附(干树脂重量∶重楼药材重量＝1∶4)，之后用水对树脂柱洗脱，再用体积浓度为80％的乙醇水溶液进行洗脱，收集80％的乙醇水溶液洗脱液，浓缩、干燥、粉碎、过筛而得到粉末状重楼总皂苷。

实施例4

本实验以人肺腺癌细胞株A549为试验对象，应用四氮甲唑蓝(MTT)实验和流式细胞仪等技术，研究重楼总皂苷协同顺铂对肿瘤细胞的生长、增殖的抑制作用，说明重楼皂苷与低剂量化疗药联合应用抗肿瘤具有减毒增效的作用。

1、重楼总皂苷(实施例1制备)对肿瘤细胞的周期阻滞作用及与化疗药物联合应用对肿瘤细胞的杀伤作用。

1.1细胞培养

将人肺腺癌细胞株A549常规培养于含10％小牛血清RPM1-1640完全培养基中，置CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养，培养细胞至生长对数期。

1.2抗肿瘤活性测定

MTT法检测细胞抑制率：将2×10⁵个/ml细胞接种于96孔培养板内，分为4个组。

重楼总皂苷单独用药组：向孔中分别加入不同浓度的重楼总皂苷水溶液(20、50、100、150μg/ml)。

重楼总皂苷与顺铂联合用药组：每孔加入不同浓度重楼总皂苷水溶液(20、50、100、150mg/ml)和3μg/ml顺铂水溶液；

顺铂单独用药组：3μg/ml顺铂水溶液；

另设对照组：0.1％二甲基亚砜。

每组做8个复孔，常规培养48h，加入MTT 20μl/孔(5mg/ml)3h，测定前弃上清而后按照上述分组加入各自的溶液100μl/孔，置旋涡振荡器5min，溶解后用全自动酶标仪测定每孔光密度(A值)，计算细胞生长抑制率，实验重复6次。以重楼总皂苷浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制细胞增殖抑制曲线，并测定药物半数抑制浓度(IC₅₀)。细胞生长抑制率(％)＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％，并由此得到IC₅₀药物半数抑制率，IC₅₀＝细胞生长抑制率为50％的药物浓度。

1.3流式细胞仪检测细胞凋亡

常规培养A549细胞48h，加入MTT 20μl/孔(5mg/ml)3h，弃上清后按照1.2中分组加入各自的溶液100μl/孔(或者写按照1.2方法处理细胞)，在药物作用细胞72h后收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗2次，加入70％(V/V)冷乙醇，4℃固定24h以上，随后清洗细胞加入碘化丙啶(PI)染液，孵育30min，进行DNA染色，采用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率。统计学方法：采用t检验做组间显著性分析。

2结果

2.1单独用重楼总皂苷对肺癌细胞的抑制作用：

对照组细胞呈正常的对数生长，而不同浓度的重楼总皂苷对肺癌细胞的生长均有明显抑制作用，其作用强度呈现对浓度的依赖关系。

2.2重楼总皂苷与顺铂协同抗肿瘤作用：

重楼总皂苷与顺铂联合用药优于重楼总皂苷和顺铂单独使用。

重楼总皂苷的IC₅₀值由单独应用时的950μg/ml下降到重楼总皂苷和顺铂(3μg/ml)联合应用时的650μg/ml，杀伤率提高了1.46倍。顺铂的单独应用的IC₅₀值由7.0μg/ml，降低为联合应用时的3.2μg/ml，杀伤率提高2.2倍。结果显示联合应用有明显抑制肿瘤细胞生长增殖作用，增强了对肿瘤细胞的细胞毒活性。

2.3重楼总皂苷对细胞周期的影响：

不同浓度的重楼总皂苷诱导肺癌细胞24h后收集样品，流式细胞仪检测结果显示细胞周期发生了明显的变化，主要表现为G₁期细胞数增多，S期细胞减少。将肿瘤细胞阻滞于G₁期，从而抑制肿瘤细胞的生长、增殖，见表1。

表1重楼总皂苷对肺癌细胞周期的影响

注：*为P＜0.01

本实验采用不同浓度的重楼总皂苷作用人肺腺癌细胞株A549后，细胞的生长、增殖受到明显的抑制。流式细胞仪检测，发现细胞被阻滞G₁期，S期细胞明显减少。细胞周期在肿瘤的生长调控中具有重要的作用。细胞周期的调节主要发生在2个重要阶段：G₁～S期和G₂～M期细胞周期内有2个检测点：1个是G₁期检测点，另1个是G₂期检测点。重楼总皂苷对肿瘤细胞G₁期的阻滞作用为重楼总皂苷协同化疗药物抗肿瘤的研究提供了实验依据。

实施例5

1材料与方法

1.1实验资料

11.1实验药物重楼总皂苷(实施例1制备)用适量土温80溶解并加水至所需浓度，实验小鼠设计剂量为0.05mg/g/d。5-氟尿嘧啶。

1.1.2实验小鼠昆明小鼠，6.7周龄，体重18-25克，雌雄各半。

11.3动物瘤种腹水型S-180肉瘤小鼠，购自中国医学科学院药物研究所。

1.2实验方法

1.2.1小鼠实体瘤模型的建立将腹水型S180肉瘤小鼠传代至抽出乳白色腹水，抽取腹水，以含适量肝素的生理盐水按5：1的比例稀释腹水；用1ml针管取0.2毫升稀释后腹水，用4号针头接种于小鼠右前肢腋下，每次接种前均轻轻摇匀接种液。

1.2.2动物分组及给药方法昆明小鼠48只，雌雄各半。动物入室后，常规饲养3天，小鼠随机接种S180肉瘤瘤株。24h后，随机分为四组，为对照组、化疗组(5-氟尿嘧啶组)、中药组(重楼总皂苷)、中药化疗组(5-氟尿嘧啶+重楼总皂苷)，各组12只。对照组灌服饮用水0.5ml，每天一次；化疗组腹腔注射5-氟尿嘧啶60mg/kg；中药组灌服中药重楼总皂苷0.05mg/g/d (液体量为0.5ml)，每天一次；中药化疗组第一天注射5-氟尿嘧啶60mg/kg，仅此一次，同时灌服中药重楼总皂苷0.05mg/g/d(液体量为0.5ml)，每天一次。实验时间12天，实验重复3次，分别为试验一、试验二、试验三。

1.2.3检测

实验12天后，处死小鼠，剥取肿瘤，分析天平称取瘤重，依据瘤重得出抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重-用药组瘤重)/对照组瘤重×100％.

1.3统计学处理

数据采用统计软件SPSS12.0进行分析，样本均数的比较采用t检验。

2结果

试验结果表明，中药重楼总皂苷与化疗药5-氟尿嘧啶合用能明显增强疗效，如表2所示，中药化疗组3次试验的平均瘤重较化疗组、中药组均明显减轻(P＜0.01或P＜0.05)。平均抑瘤率中药化疗组最高，中药化疗组、中药组、化疗组对S180肉瘤小鼠平均抑瘤率依次为：69.11％、44.58％、58.48％。

表2中药化疗组与其他组对S180肉瘤小鼠的抑瘤率及瘤重影响情况(X±SD)

注：三次试验平均瘤重中药组、化疗组与中药化疗组比较^▲▲P＜0.01或^▲P＜0.05

实验例6

1、实验方法同实施例5，建立小鼠体内移植性肿瘤模型，昆明小鼠48只，雌雄各半，动物入室后，常规饲养3天，小鼠随机接种S180肉瘤瘤株。24h后，随机分为四组，各组12只，为化疗组(丝裂霉素组)、中药组(重楼总皂苷组)、中药化疗组(丝裂霉素+重楼总皂苷组)和对照组。对照组灌服饮用水0.5ml/d。化疗组腹腔注射丝裂霉素50mg/kg；中药组灌服中药重楼总皂苷0.05mg/g/d(液体量为0.5ml)，每天一次；中药化疗组注射丝裂霉素50mg/kg/d，仅此一次，同时灌服中药重楼总皂苷0.05mg/g/d(液体量为0.5ml)，每天一次。实验12天后，处死小鼠，剥取肿瘤，分析天平称取瘤重，依据瘤重得出抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重-用药组瘤重)/对照组瘤重×100％。统计学处理：数据采用统计软件SPSS12.0进行分析，样本均数的比较采用t检验。

2结果：试验结果表明，中药重楼总皂苷与丝裂霉素合用能明显增强疗效，如表3所示，中药化疗组3次试验的平均瘤重较化疗组、中药组均明显减轻，平均抑瘤率中药化疗组最高，中药化疗组、中药组、化疗组对S180肉瘤小鼠平均抑瘤率依次为：67.52％、44.44％、54.54％。

表3中药化疗组与其他组对S180肉瘤小鼠的抑瘤率及瘤重影响情况(X±SD)

注：三次试验平均瘤重中药组、化疗组与中药化疗组比较^▲▲P＜0.01或^▲P＜0.05

实验例7

1、重楼总皂苷(实施例1制备)的增效试验

实验分组：

溶剂对照组：给予1％羧甲基纤维素钠；

阳性药的小剂量对照组：给予环磷酰胺5mg/kg；

阳性药小+药物小剂量组：给予环磷酰胺5mg/kg+重楼总皂苷50mg/kg；

阳性药小+药物大剂量组：给予环磷酰胺5mg/kg+重楼总皂苷100mg/kg；

阳性药的大剂量对照组：给予环磷酰胺10mg/kg；

阳性药大+药物小剂量组：给予环磷酰胺10mg/kg+重楼总皂苷50mg/kg；

阳性药大+药物大剂量组：给予环磷酰胺10mg/kg+重楼总皂苷100mg/kg

与实施例5小鼠实体瘤模型的建立一致，用小鼠肝癌H₂₂建立小鼠体内移植性肿瘤模型。末次给药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，取瘤并称重，比较单纯应用环磷酰胺5mg及10mg治疗同与重楼总皂苷50mg及100mg分别合用治疗各组之间抑瘤率差异，观察重楼总皂苷的增效作用。

重楼总皂苷的增效作用结果：重楼总皂苷对环磷酰胺治疗小鼠肝癌H₂₂的增效作用结果表明，环磷酰胺5mg/kg剂量组平均抑瘤率为20.72％，而加用重楼总皂苷50mg/kg及100mg/kg实验组平均抑瘤率分别为32.39％及50.62％，提高抑瘤率11.67～30.35％。环磷酰胺10mg/kg剂量组平均抑瘤率为35.63％，而加用重楼总皂苷50mg/kg及100mg/kg实验组平均抑瘤率分别为57.73％及65.70％，提高抑瘤率22.10～30.07％，结果见表4。

表4重楼总皂苷对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H₂₂生长的增效作用

以上结果显示，环磷酰胺10mg剂量组为治疗H₂₂的有效剂量，重楼总皂苷分别与其联合应用可以提高抑瘤率，增强治疗效果。而且重楼总皂苷与环磷酰胺联合用药优于环磷酰胺单纯用药，增效作用明显。

2、重楼总皂苷的减毒试验

实验分组：

溶剂对照组：给予1％羧甲基纤维素钠；

阳性药的小剂量对照组：给予环磷酰胺10mg/kg；

阳性药小+药物小剂量组：给予环磷酰胺10mg/kg+总皂苷50mg/kg；

阳性药小+药物大剂量组：给予环磷酰胺10mg/kg+总皂苷100mg/kg；

阳性药的大剂量对照组：给予环磷酰胺20mg/kg；

阳性药大+药物小剂量组：给予环磷酰胺20mg/kg+总皂苷50mg/kg；

阳性药大+药物大剂量组：给予环磷酰胺20mg/kg+总皂苷100mg/kg

上述各组药物均灌胃(i.g)给药，容量0.2ml/10g，连续给药10天。与实施例5小鼠实体瘤模型的建立一致，用小鼠肝癌H₂₂建立小鼠体内移植性肿瘤模型。末次给药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，取瘤并称重，比较单纯应用环磷酰胺10mg及20mg治疗同与重楼总皂苷50mg及100mg分别合用治疗各组之间各组动物体重差异，计算脏器指数，按常规方法计数外周血白细胞数，观察重楼总皂苷的减毒作用。

重楼总皂苷对环磷酰胺治疗小鼠肺癌H₂₂的减毒作用结果：结果表明，环磷酰胺10mg/kg剂量组和20mg/kg剂量组在抑瘤的同时可见体重、免疫器官及白细胞均明显下降(P＜0.01或0.001)，有些小鼠在停药前就已经死亡。重楼总皂苷与环磷酰胺合用可以对此起保护作用，对抗环磷酰胺所致的体重、白细胞下降及免疫器官萎缩，提高小鼠胸腺及脾脏重量，降低荷瘤小鼠死亡率，减轻环磷酰胺毒性，见表4。

表5重楼总皂苷对环磷酰胺抑制肝癌H₂₂荷瘤小鼠生长的减毒作用

注：与溶剂对照比较*P＜0.05与环磷酰胺相应剂量组比较*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001

用实施例4-实施例7的方法对实施例2和实施例3的重楼总皂苷进行实验也具有相似的作用。

Claims (3)

1.重楼总皂苷在制备抗癌药辅助药物的应用。

2.重楼总皂苷与药学可接受的辅料制成的制剂在制备抗癌药辅助药物的应用。

3.根据权利要求1或2所述的药物的应用，其特征是所述抗癌药为顺铂、环磷酰胺、氟尿嘧啶或丝裂霉素。