CN103919850A - 一种药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的组合物包括有效量的丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖，以及药学上可接受的载体，丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为0.5-1.5：0.5-1.5：1-3优选比例为1：1：2。本发明的重要之处是发现了所述的药物组合物具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡、显著抑制肿瘤细胞增殖和对人体正常细胞安全、低毒的作用特性。因此，该药物组合物具有制备诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖的抗肿瘤药物的应用前景。

Description

一种药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体的，本发明涉及一种药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 

背景技术

自20世纪70年代以来，我国恶性肿瘤的发病率和死亡率一直呈上升趋势，据中国抗癌协会统计，2005年我国癌症新发病例220万，死亡160万，患癌病人310万，预计2020年新发病例将达300万。美国癌症协会的统计资料显示，2002年全球有670万死于癌症，预计这一数字将在2030年上升到1310万，全球目前肿瘤患病人数估计超过4000万。由于非特异毒性、缺乏肿瘤选择性以及肿瘤的多药耐药性等，大多数抗肿瘤药物并不像预期那样有效，其对正常组织的毒副作用更是困扰药物治疗的主要问题。因此，寻求对肿瘤细胞有特异选择性的高效抗癌药物意义重大。 

细胞凋亡是普遍存在于多细胞生物体内的一种自发、主动的细胞死亡过程，是生物体维持细胞数量相对稳定的固有机制。这一机制若有障碍或发生异常，就有可能引发肿瘤或其他病变。目前大多数人认为，肿瘤是一种细胞凋亡过少而增殖过多的疾病，若能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，则能有效地抑制肿瘤的进程，比直接杀伤肿瘤的细胞毒性化疗药物治疗有明显优越性。细胞毒性药物在杀伤肿瘤细胞的同时也伤害正常细胞，其毒副作用使临床应用和疗效受到很大影响。故寻求高效低毒的肿瘤细胞凋亡诱导剂是肿瘤治疗的研究热点，基于细胞凋亡机制的抗肿瘤药物的研究是近年来发现新型抗肿瘤药物的重要策略。 

我国的中医药资源是一个宝库，为新型抗肿瘤药物提供了丰富的物质基础，从中药中发现抗肿瘤有效药物具有独特的优势和广宽的前景。根据辨证论治，审证求因的立法原则，活血化瘀、扶正培本法作为中医肿瘤治疗基本大法被广泛运用于临床，而作为活血化瘀代表药的丹参和补气药之首的人参自然倍受青睐为临床常用。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科鼠尾草属植物,主要化学成分有脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物两类。丹参在改善循环系统功能等方面已有深入的研究和广泛的应用，而其抗肿瘤作用，尤其水溶性成分鲜有报导。人参(Panax ginseng C.A.Mey)为五加科多年生草本植物,主要活性成分为人参皂苷和人参多糖。研究表明,它在癌症的预防和治疗方面具有较强的活性。我们前期研究中，通过对活血益气类方药的筛选、多组分和复杂作用特点研究，发现了丹参与人参组分配伍，与传统丹参－人参药对配伍比 较，具有疗效优越、组分成分清楚的特点，对肿瘤细胞具广泛的生物学作用；在与部分临床一线抗肿瘤药物的比较研究中，发现丹参与人参组分配伍在安全有效和肿瘤细胞特异选择性方面具有优势。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，具体涉及有效量的丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖，以及药学上可接受的载体在制备抗肿瘤药物中的应用。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 

一种药物组合物，所述的组合物包括丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖，以及药学上可接受的载体，制备成剂型，其中丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为0.5-1.5：2-4：0.5-1.5：1-3。 

上述药物组合物，丹参总黄酮、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为1：3：1：2。 

上述药物组合物，丹参总酚酸含量大于80％、人参总皂苷含量大于80％、人参总多糖含量大于60％。 

上述药物组合物，剂型为口服液、颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、滴丸剂、注射剂以及纳米制剂、靶向制剂。 

上述药物组合物在制备抑制肿瘤生长，和/或诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用。 

上述药物组合物在制备抑制肿瘤生长，和/或诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用，所述的肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌或乳腺癌。 

有益效果： 

1)上述药物组合物能诱导肿瘤细胞凋亡，并且具有协同作用，与单独某种组分相比有显著性差异。 

2)上述药物组合物对肿瘤细胞的抑制作用有较好的选择性。 

3)上述药物组合物对人体正常细胞安全、低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤药。 

附图说明

图1：组合物对L-O2和SMMC-7721细胞增殖抑制的影响 

图2：组合物对BEAS-2B和A549细胞增殖抑制的影响 

图3：组合物对MCF-10A和MCF-7细胞增殖抑制的影响 

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不对本发明作任何限制。 

实施例1：正交设计优选丹参－人参活性组分抗肿瘤的有效配伍。 

实验材料：人正常肺上皮细胞株BEAS-2B、人肺癌细胞株A549、人正常肝细胞株L-O2、人肝癌细胞株SMMC-7721、人正常乳腺细胞株MCF-7、人乳腺癌细胞株MCF-10A和人胃癌细胞株MGC-803，均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。丹参总酚酸(80％)、人参总皂苷(80％)和人参总多糖(60％)均购于南京泽朗医药科技有限公司。 

实验方法：本实验采用正交设计优选丹参-人参活性组分抗肝癌的有效配伍。丹参-人参活性组分配伍选取丹参总酚酸(A)、人参总皂苷(B)、人参多糖(C)为考察因素，每个因素选取3个水平，用L₉(3⁴)正交表安排实验见表1，因素水平见表2。 

表1L₉(3⁴)正交表 

注：1表示10mg·L^-1；2表示5mg·L^-1；3表示0mg·L^-1

表2丹参-人参活性组分正交设计因素和水平安排表 

注：1表示10mg·L^-1；2表示5mg·L^-1；3表示0mg·L^-1

取E-plate16细胞增殖检测板，每孔加入培养液100μl，放入RTCA DP中检测基线值。然后将L-O2和SMMC-7721细胞、BEAS-2B和A549细胞、MCF-10A和MCF-7细胞消化悬浮于含有血清的培养液中，吹打均匀调整细胞密度为1×10⁵个/mL，接种E-plate16细胞增殖检测板，置于37℃，5％CO2及饱和湿度条件下细胞培养箱中动态监测24h后给药，加入有效配伍供试品溶液(按上述表1配制)，每孔100μL，将培养板置入37℃，5％CO2培养箱中稳定30min后动态监测48h，观察细胞增殖曲线。 

据实验结果分析，确定对肿瘤细胞有明显增殖抑制作用同时对正常细胞安全低毒的最佳组合为丹参总酚酸+人参总皂苷+人参多糖，该组合物对各细胞的增殖抑制的影响见附图1－3。其中图1中丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为0.5：0.5：3，丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖和该0.5：0.5：3比例的组合物，对肝癌细胞的抑制率分别为：38％、29％、14％和53％；图2中丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为1：1：2，丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖和该1：1：2比例的组合物，对人肺癌细胞的抑制率分别为：35％、51％、14％和58％；图3中丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为1.5：0.5：3，丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖和该1.5：0.5：3比例的组合物，对人乳腺癌细胞的抑制率分别为：32％、17％、13％和52％；可见组合物与单独使用丹参总酚酸、人参总皂苷或人参多糖对对肿瘤细胞增殖抑制作用有显著性差异，对正常细胞影响不大。 

实施例2：CCK-8法测定优选的组合物对细胞相对抑制率的影响 

分别取对数生长期L-O2和SMMC-7721细胞、BEAS-2B和A549细胞、MCF-10A和MCF-7细胞，0.25％胰酶消化，调整细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔板中，置37℃，5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养。按表1配制药物，配制丹参-人参组分配伍1-9组，分别设置阴性对照组、阳性对照组为顺铂(Cisplatin,DDP)和紫杉醇(Paclitaxel,PTX)，终浓度为10mg·L^-1，每组均设3个复孔。细胞培养24小时后，每孔100μL加入供试品溶液，37℃，5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养48小时后，每孔加入CCK-8溶液100μL，继续培养30min，酶标仪于450nm波长处测定吸光度(A)。按公式计算各药物对L-O2和SMMC-7721生长的抑制率(IR)：IR％＝(1-A_{药物组均值}/A_{阴性对照组均值})×100％。 

结果显示丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为1：1：2，能显著抑制肿瘤细胞的增殖，并呈现一定的剂量相关性。 

实施例3：细胞形态学观察 

分别将SMMC-7721和L-O2、MCF-10A和MCF-7细胞制成单细胞悬液，按1×10⁵个/mL接种于96孔板上，每孔100μL，设给药组、阴性对照组和阳性对照组，置于37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下细胞培养箱中培养24h后，给药组加入丹参-人参有效组分配伍，阴性对照组加入等体积的细胞培养液，每组设3个复孔。培养48h后，放置于倒置显微镜下观察SMMC-7721和L-O2细胞形态及生长情况并拍照。 

配方组(丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为0.5：4：0.5：3)肿瘤细胞的形态显著改变，呈现出细胞密度降低，细胞固缩，体积变小，细胞变形而对正常细胞形态无影响。 

实施例4：高内涵细胞分析技术(HCS)检测细胞凋亡 

取96孔板，加入多聚赖氨酸包被过夜，每孔100μl，用PBS洗3遍，每次100μl/孔，以充分除去多聚赖氨酸，分别将SMMC-7721和L-O2、MCF-10A和MCF-7细胞消化悬浮于含有血清的培养液中，吹打均匀调整细胞密度为1×10⁵个/mL，接种96孔板，置于37℃，5％CO2及饱和湿度条件下细胞培养箱中培养24h后给药，分阴性对照组、给药组以及阳性对照组。阴性对照组加入等体积的细胞培养液，给药加入组分配伍供试品溶液，每孔100μL，阳性对照组加入DDP和PTX，每组设3个复孔。取培养48h的96孔板，弃去细胞培养上清然后加入Annexin V和100μg/mL PI工作液中，每孔50μL，于室温避光孵育15min。孵育后去除染液，用1×Annexin-Binding buffer洗两遍，每次分别加入100μL/孔，然后加入多聚甲醛室温避光固定20min，固定后去除多聚甲醛，1×Annexin-Binding buffer洗两遍，每次分别加入100μL/孔，最后加入Hoechst染液，每孔加入100μL，于室温避光孵育10min。去除染液，用1×Annexin-Binding buffer洗两遍，每次分别加入100μL/孔，加入100μl/孔的1×Annexin-Binding buffer，于HCS读板。 

结果显示，组合物给药(丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为1.5：0.5：3)组能够显著降低肿瘤细胞Hoechst荧光强度，显著增加肿瘤细胞Annexin V和PI荧光强度；与正常细胞对照组比较，有效配伍给药组对正常细胞的Hoechst荧光强度、Annexin V和PI荧光强度均无显著性差异，表明有效配伍给药组能够显著促进肿瘤细胞的凋亡而对正常肝细胞的凋亡无显著诱导作用。 

实施例6：流式细胞仪检测细胞凋亡 

取培养至对数期的各肿瘤细胞，设给药组和阴性对照组，给药加入组合物供试品溶液，每孔1mL，阴性对照组加入等体积的细胞培养液，每组设3个复孔。分别培养12、 24和48h。收集细胞及相应的细胞上清液，用PBS洗涤细胞二次，2000r/min，离心5min，去上清后，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μL AnnexinV-FITC混匀后，加入5μL PI染液，混匀，室温避光反应5-15min，1h内进行流式细胞仪的检测。 

结果显示，组合物(丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为1：1：2)分别作用A549细胞0、12、24、48h时的细胞凋亡与对照组比较，作用12、24、48h能够显著诱导A549细胞凋亡(P<0.05)，以24h诱导凋亡最高。 

制备实施例1：取丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖分别为10g：10g：20g，加淀粉适量，压片制备成片剂。 

制备实施例2：取丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖分别为5g：15g：30g，加淀粉适量，灌胶囊制备成硬胶囊剂。 

制备实施例3：取丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖分别为15g：5g：10g，加淀粉适量，制备成颗粒剂。 

制备实施例4：取丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖分别为10g：10g：20g，按常规方法分别制备成软胶囊剂或滴丸剂或注射剂或纳米制剂或靶向制剂。 

Claims (6)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖，以及药学上可接受的载体，制备成剂型，其中丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为0.5-1.5：0.5-1.5：1-3。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，丹参总酚酸、人参总皂苷和人参多糖配伍剂量重量比为1：1：2。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于丹参总酚酸含量大于80％、人参总皂苷含量大于80％、人参总多糖含量大于60％。

4.如权利要求1所述药物组合物，其特征在于剂型为口服液、颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、滴丸剂、注射剂以及纳米制剂、靶向制剂。

5.如权利要求1所述的药物组合物在制备抑制肿瘤生长，和/或诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用。

6.如权利要求5所述的药物组合物在制备抑制肿瘤生长，和/或诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌或乳腺癌。