CN101991565A - 丹酚酸a在制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用 - Google Patents

丹酚酸a在制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用 Download PDF

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陈卫平
毕蕾
王昕�
温雅
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Abstract

本发明公开了丹酚酸A在制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。本发明的重要之处是发现了丹酚酸A具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡和显著抑制肿瘤细胞增殖，而对人体正常细胞无损害的作用特性，对凋亡相关蛋白有明显影响。因此，丹酚酸A可作为抗肿瘤药物的先导化合物，也具有制备诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖药物的应用前景。

Description

丹酚酸A在制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用
技术领域
本发明涉及丹酚酸A的新应用，尤其涉及丹酚酸A在制备制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，自20世纪下半叶以来，世界癌症发病率与死亡率均呈上升趋势。据世界卫生组织(WHO)估计，全世界每年新发生的癌症病人约1000万，死于癌症的病人在600-700万之间。目前我国已成为恶性肿瘤新发病例最多的国家，20年间恶性肿瘤的发病率升高约50％。2008年全国第三次死因回顾抽样调查结果表明，恶性肿瘤是我国居民的第二大死亡原因。长久以来人们一直致力于揭示恶性肿瘤的发病机理，研究攻克癌症的有效方法。
1965年发育生物学家Lockshin和Willianms首先提出了PCD(Progr ammed CellDeath，程序化细胞死亡)一词，用于描述蛾幼虫的生理性死亡。1972年Kerr等从形态学的角度描述细胞的生理死亡，并将这种细胞死亡形象化命名为细胞凋亡(apoptosis)，言之秋天树木落叶之意。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，是普遍存在于多细胞生物体内的一种自发、主动的细胞死亡过程，是生物体维持细胞数量相对稳定的固有机制。这一机制若有障碍或发生异常，就有可能引发肿瘤或其他病变。目前大多数人认为，肿瘤是一种细胞凋亡过少而增殖过多的疾病，若能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，则能有效地抑制肿瘤的进程，比直接杀伤肿瘤的细胞毒性化疗药物治疗有明显优越性。细胞毒性药物在杀伤肿瘤细胞的同时也伤害正常细胞，其毒副作用使临床应用和疗效受到很大影响。故寻求高效低毒的肿瘤细胞凋亡诱导剂已成为肿瘤治疗的研究热点。
研究表明：在多种癌症中，促凋亡蛋白钝化突变或抗凋亡蛋白表达上调，从而导致肿瘤未受抑制的生长和对细胞应激、有害突变、DNA损害应答能力的丧失。同时，上述蛋白的改变也引起癌症对化疗出现耐药性，使得最初能诱导凋亡的化疗药物难以获得疗效，而能够恢复程序性细胞死亡的药物可能有效的对抗多种癌症，使用这种药物也许能够选择性地杀死肿瘤细胞。因此，基于细胞凋亡机制的抗肿瘤药物的研究是近年来发现新型抗肿瘤药物的重要策略。我国的中医药资源是一个宝库，为新型抗肿瘤药物提供了丰富的物质基础，从中药中发现抗肿瘤有效天然化合物具有独特的优势和广宽的前景。我们经过多年研究发现中药丹参有良好的抗肿瘤作用，其水溶性成分丹酚酸A诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长作用尤其显著，且对人体正常细胞无损伤。
丹酚酸A是从中药丹参中提取的一种天然有效成分。丹参为唇形科植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎。始载于《神农本草经》，列为上品，谓：“主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚；破癥除瘕，止烦满，益气”。2010版《中华人民共和国药典》把丹参的功用归纳为“活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈”。丹参主要有效成分为水溶性的酚酸类和脂溶性的二萜类物质。其水溶性酚酸类主要包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸、丹参素、原儿茶醛等，脂溶性有效成分主要为丹参酮II A、隐丹参酮、丹参酮I等。
丹酚酸A是丹参中主要的水溶性成分，丹酚酸A英文名称：Salvianolic acid A，分子量：494.45，分子式：C26H22O10，其化学结构式如下：
Figure BDA0000037815620000021
以往研究表明丹酚酸A主要药理作用有：(1)抗凝血作用和抗血小板聚集作用；(2)抗分泌和抗溃疡作用，抑制胃H+，K+-ATPase和pNPPase，IC50分别为0.52μM和1.7μM；(3)对氧自由基引起的大鼠心脏和肝脏线粒体损伤有保护作用，能显著清除由中性白细胞释放的氧自由基，能逆转由氧自由基抑制心肌细胞膜钾通道活动；(4)对醛糖还原酶活性有明显的抑制作用，可以通过不同途径抑制白内障形成；(5)对离体大鼠心肌缺血再灌注性损伤具有一定的保护作用；(6)抗肿瘤作用：与已知抗肿瘤剂5-Fu、丝裂霉素C、MTX等合用有协同作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供丹酚酸A的一种新用途，具体涉及丹酚酸A在制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
丹酚酸A在制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
上述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌或乳腺癌。
上述丹酚酸A在药物中的含量大于等于50％且小于100％。
上述的药物，其制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂、口崩制剂或注射剂。
本发明的有益效果：
(1)丹酚酸A对凋亡相关蛋白有明显影响，能诱导肿瘤细胞凋亡。
(2)丹酚酸A对肿瘤细胞的抑制作用有较好的选择性。
(3)丹酚酸A对人体正常细胞安全、低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤药。
附图说明
图1 CCK-8法检测丹参主要活性成分对A549细胞的增殖抑制率，显示丹酚酸A、总酚酸、丹参酮II A、和顺铂比较空白参照皆有时间依赖性的肿瘤细胞增殖抑制作用，以丹酚酸A的作用最显著。
图2 CCK-8法检测丹参主要水溶性活性成分对A549细胞的增殖抑制作用，显示丹酚酸A、丹酚酸B、咖啡酸、丹参素、皆有时间依赖性的抑制肿瘤细胞增殖作用，以丹酚酸A的作用最显著。
图3 CCK-8法检测丹酚酸A对HPMEC、LTEP、A549细胞增殖抑制情况，显示对肺癌细胞LTEP、A549有较强时间和剂量依赖性的抑制作用，而对正常细胞HPMEC无明显抑制作用。
图4 AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡，显示丹酚酸A作用24h能显著诱导LTEP、A549细胞凋亡。
图5 Western Blot检测凋亡标记蛋白caspase 3表达，显示丹酚酸A呈时间依赖性的caspase 3酶原和剪切后有活性的caspase 3表达增高，以A549细胞24h表达增强最为显著。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不对本发明作任何限制。
以下实施例所用的丹酚酸A纯品购自上海友思生物技术有限公司，批号Lot100309，含量99.4％。
实施例1：MTT法检测丹参水提液对四株肿瘤细胞的抑制作用。
体外培养人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株SMMC-7721，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人胃癌细胞株MGC-803，加入不同浓度丹参水提液，MTT法检测不同时间细胞抑制情况，结果显示：丹参水提液对四株肿瘤细胞均有显著的抑制作用，其中对A549细胞增植抑制作用尤其明显，并呈一定的时间-剂量依赖性。结果见表1～4。
表1 MTT法测丹参水提液作用SMMC-7721细胞后的吸光度值及其抑制率(n＝4
Figure BDA0000037815620000041
)
Figure BDA0000037815620000042
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，顺铂的浓度为5μg/ml
表2 MTT法测丹参水提液作用MDA-MB-231细胞后的吸光度值及其抑制率(n＝4)
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，顺铂的浓度为5μg/ml
表3 MTT法测丹参水提液作用MGC-803细胞后的吸光度值及其抑制率(n＝4
Figure BDA0000037815620000051
)
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，顺铂的浓度为5μg/ml
表4 MTT法测丹参水提液作用A549细胞后的吸光度值及其抑制率(n＝4
Figure BDA0000037815620000053
)
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，顺铂的浓度为5μg/ml
实施例2：CCK-8法检测丹参主要活性成分对A549细胞的增殖抑制作用。
体外培养人肺癌细胞株A549，加入60μg/ml总酚酸、丹参酮II A、顺铂、丹酚酸A，分别于24h、48h、72hCCK-8法检测细胞增殖抑制情况，结果显示各药物比较空白参照皆有时间依赖性的抑制肿瘤作用，以丹酚酸A的作用最显著。结果见表5、图1：
表5 CCK-8法检测丹参主要活性成分对A549细胞的增殖抑制率(n＝6)
Figure BDA0000037815620000062
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，浓度均为60μg/ml
实施例3 CCK-8法检测丹参主要水溶性活性成分对A549细胞的增殖抑制作用
体外培养人肺癌细胞株A549，加入60μg/ml丹酚酸B、咖啡酸、丹参素、丹酚酸A，分别于24h、48h、72hCCK-8法检测细胞增殖抑制情况，结果显示各药物比较空白参照皆有时间依赖性的抑制肿瘤作用，以丹酚酸A的作用最显著。结果见表6、图2：
表6 CCK-8法检测丹参主要水溶性活性成分对A549细胞的增殖抑制率(n＝6
Figure BDA0000037815620000063
)
Figure BDA0000037815620000064
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，浓度均为60μg/ml
实施例4 CCK-8法检测丹酚酸A对HPMEC、LTEP、A549细胞增殖抑制作用
体外培养人肺微血管内皮细胞HPMEC、人肺腺癌细胞LTEP、人肺腺癌细胞A549，加入不同浓度(0-80μg/ml)丹酚酸A，分别于24h、48h、72hCCK-8法检测HPMEC、LTEP、A549细胞增殖抑制情况，结果显示丹酚酸A对肺癌细胞LTEP、A549有较强时间和剂量依赖性的抑制作用，与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，而对正常细胞HPMEC无明显抑制作用，见表7～9和图3。
表7 丹酚酸A作用于A549细胞CCK-8检测结果(n＝6
Figure BDA0000037815620000071
)
Figure BDA0000037815620000072
表8 丹酚酸A作用于LTEP细胞CCK-8结果(n＝6
Figure BDA0000037815620000073
)
表9 丹酚酸A作用于HPMEC细胞后的CCK-8结果(n＝6)
Figure BDA0000037815620000076
实施例5：Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。
将处于对数生长期的A549、LTEP细胞以1×105/ml的浓度接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入20μg/ml和40μg/ml的丹酚酸A，并设置空白对照组。加药24h后用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，细胞悬液移入洁净试管中，于4℃条件下1000r/min离心5min沉淀细胞，弃上清后用冷PBS洗2次。将收集的细胞重悬于100μl结合缓冲液中，加入5μl AnnexiV-FITC和5μlPI轻轻混匀后室温避光反应15min反应结束后再加入400μl结合缓冲液，流式细胞仪上机检测，结果显示LTEP、A549细胞在丹酚酸A作用24h凋亡率与对照组比较显著增加(P＜0.05)，见表10、图4。
表10 LTEP、A549细胞在丹酚酸A作用下24h凋亡结果(n＝3
Figure BDA0000037815620000081
)
Figure BDA0000037815620000082
实施例6：Western Blot检测caspase 3蛋白表达。
Western Blot检测丹酚酸A(40μg/ml)对LTEP、A549细胞作用12h、24h、48h后，凋亡标记蛋白caspase 3的表达变化，显示丹酚酸A呈时间依赖性的caspase 3酶原剪切和剪切后有活性的caspase 3表达增高，以A549细胞24h表达增强最为显著。结果见表11、图5。
表11 CASPASE 3灰度值
  列1   Cas3-Pro   Cas3-cle   B-actin   Cas3-Pro/B-actin   Cas3-cle/B-actin
  Acon   3693   1030   5438   0.679109967   0.189407871
  A12h   2066   742   3840   0.538020833   0.193229167
  A24h   1561   1848   3884   0.401905252   0.475798146
  A48h   1289   2916   5977   0.21566003   0.487870169
  Lcon   3591   2175   6127   0.586094337   0.354986127
  L12h   2089   1949   4546   0.459524857   0.428728553
  L24h   1086   2344   4607   0.23572824   0.50879097
  L48h   758   3817   4810   0.157588358   0.793555094

Claims (4)

1.丹酚酸A在制备诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌或乳腺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于丹酚酸A在药物中的含量大于等于50％且小于100％。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物，其制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂、口崩制剂或注射剂。
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