CN101317835A - 斑蝥素及其衍生物在制备肿瘤化疗增敏药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了斑蝥素及其衍生物在制备肿瘤化疗增敏药物中的用途，用于增强肿瘤对治疗药物的敏感性。本发明涉及的化合物及其衍生物均具有降低各种肿瘤细胞中MDR基因转录及表达的作用，并进而抑制多药耐药的发生，显示较强的肿瘤化疗增敏作用。

Description

斑蝥素及其衍生物在制备肿瘤化疗增敏药物中的应用

技术领域

本发明公开了斑蝥素新的医学用途，尤其是斑蝥素及其衍生物在制备肿瘤化疗增敏药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

肿瘤细胞在化疗过程中会对一大类结构与功能并无相关性的药物产生耐药性，这一现象称为“多药耐药”(multidrug resistance，MDR)，肿瘤细胞多药耐药性的获得与细胞表面各种ATP结合盒(ATP-Binding cassette，ABC)式载体蛋白的表达密切相关，在人类染色体中，有大约50种ABC载体基因，其中以MDR1基因所编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp or P170)在肿瘤细胞中介导的耐药性最为广泛(MichihikoKuwano，et al.Cancer Sci.2003，94(1)：9-14；Ulrike Stein，et al.J.Biol.Chem.，2001，276(30)：28562-28569.)。目前认为有两个机制参与了恶性肿瘤中MDR1基因的上调。一个是MDR1基因的启动子可通过环境因素被激活，另一个主要机制是MDR1启动子上CpG位点的甲基化和去甲基化(Kusaba H，et al，Somat Cell Mol Genet 1997；23：259-74.；Kusaba H，et al，Eur J Biochem 1999；262：924-32.)。

P-gp对保护机体免受外源性毒素的侵害，排泄其代谢产物，转化内源性有害物质等有重要生理意义。然而，在肿瘤细胞中由于P-gp的过度表达，使得细胞毒性药物被泵出细胞外，细胞内的药物浓度下降，从而产生耐药性，而且MDR程度与MDR1的过度表达呈正相关。

如何消除肿瘤细胞的耐药性，以增强化疗效果已成为目前肿瘤治疗研究的难点和重点之一。抑制ATP依赖性的药物泵，从而增加细胞内的化疗药物浓度以克服肿瘤细胞的耐药性，这一思路的可行性已经得到了实验的证实(Sikic BI，et al.J clinealreversal of multi drug resistance Anticancer Drug Resistance.1994；p p149～165；Wallstab A，et al.Brit J Cancer，1999；79(7/8)：1053～1063.)。目前已发现的逆转肿瘤多药耐药的P-gp蛋白功能抑制性药物即肿瘤化疗增敏剂主要有钙通道阻断剂、反义RNA、核酶等。但它们都有致命的弱点，已发现的阻断P-gp泵的药物，由于毒副作用大，较难在临床上应用(Sharma V et al.Chem Rev.1999，99：2545～2560.)。要在体内将反义核糖核酸和核酶只转染给肿瘤细胞而不进入其它组织，技术上有相当难度。因此全面了解人肿瘤细胞中MDR1基因与肿瘤耐药性的关系，筛选出高效、低毒的化疗增敏剂和耐药逆转剂是目前肿瘤治疗中亟待解决的问题。

斑蝥素(cantharidin，CA)是广泛存在于1500多种斑蝥体内的一种天然防御性毒素。斑蝥属芜青科昆虫，性寒味辛，为剧毒中药材，除具有抗癌活性外，尚有抗病毒、壮阳、升高白细胞等多种活性。

斑蝥素本身是一种半帖烯毒素，其毒性强烈。内服可引起胃肠炎症、黏膜坏死，可使肾小球上皮细胞严重损伤，出现蛋白尿、管型尿、血尿及血清蛋白氮升高。斑蝥素用于治疗肝癌的临床用量是0.5mg/day，而其LD50为30mg/kg，中毒量为约1.0g，致死量约为3.0g，用药不当易使人中毒甚至死亡，至今未能临床应用。

80年代，王广生等合成去甲基斑蝥素及羟基斑蝥胺，甲基斑蝥胺和斑蝥酸钠，其中去甲斑蝥素毒性有所减少，临床用于肝癌、胃癌、结肠癌等肿瘤的辅助治疗。但由于对其作用机理研究较少，一直未能成为主流抗癌药物，且无知识产权。1992年旅美中国学者李燕明发现斑蝥素及其同系物在细胞内的作用靶点为PP2A，这一发现开启了重新评价斑蝥素作用及应用的大门。由于其结构简单，易于改造，因此许多学者致力于探索斑蝥素系列衍生物对PP2A抑制作用的构效关系的探讨上。

斑蝥素衍生物的活性研究情况表明(曾文南，卢懿.斑蝥素及其衍生物的合成与活性研究进展.有机化学.2006年，26(5)：579～591)，斑蝥素(见图1)的构效关系如下：(1)双环[2.2.1]庚烷是斑蝥素的基本骨架环，除去2-C或3-C上的甲基不会影响其活性，在这个位点上可以引入其它较大的取代基，因此在这个位点上有很大的结构改造空间；1-C或4-C上引入取代基会使其活性降低，但最近的研究表明，在1-C位具有绝对立体构型的斑蝥素衍生物对PP2B具有良好的抑制选择性；5-C或6-C上可以引入取代基，5-C和6-C之间也可以是双键；7-氧桥键是必不可缺的，可能是氧原子能和PP1和PP2A形成氢键的缘故。(2)酸酐环上的氧原子被氮原子取代之后，对PP1和PP2A的抑制作用显著降低；氧原子被硫原子取代之后，不会影响其对PP1和PP2A的抑制作用；酸酐开环明显改变其对PP1和PP2A的抑制作用，酸酐部分还原则会失去对PP1和PP2A的抑制作用。在一系列斑蝥素衍生物中，目前比较受关注的有以下几种。

去甲基斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的合成衍生物，是根据鞘翅目芫菁科昆虫斑蝥的抗癌有效成分斑蝥素的化学结构，去除1，2位甲基人工合成而得，其特点是能明显减轻斑蝥素强烈的泌尿系统刺激性，保持较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用，主要适用于原发性肝癌的治疗，效果较好。

甲基斑蝥胺(N-methylcantharidimide)和羟基斑蝥胺(N-hydroxycantharidimide)系斑蝥素的一种酰亚胺基衍生物。甲基斑蝥胺和羟基斑蝥胺的毒副作用大大降低。动物实验表明，羟基斑蝥胺的抗癌作用与斑蝥素相似，但其毒性仅为斑蝥素的五百分之一。

国际专利WO 02/076989A1公开了一种氨基酸去甲斑蝥胺衍生物。这些氨基酸去甲基斑蝥胺衍生物同样对蛋白磷酸酶酯具有和斑蝥素类似的抑制作用。

斑蝥酸钠是斑蝥素与氢氧化钠共热时水解生成的斑蝥素衍生物(王泽民.当代结构药物全集[M]北京：北京科学技术出版社，1993：2125～2126)。斑蝥酸钠不仅保持了斑蝥素特有的抗癌活性，且毒副作用比斑蝥素小，而且还可提高肿瘤患者的免疫功能(梁枫，王明艳.斑蝥酸钠的研究进展.江西中医学院学报，2006，18(1)：67-68)。

总之，以往对于斑蝥素及其衍生物药理作用的认识主要集中在其抗肿瘤作用，但本发明却发现斑蝥素及其衍生物具有多药耐药逆转作用，可减少药物向细胞外的泵出，因而具有化疗增敏作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种斑蝥素及其衍生物的新的医学用途，即作为化疗增敏剂，用于增强肿瘤对治疗药物的敏感性。

本发明所提供的化疗增敏剂为斑蝥素及其衍生物。其通式如下：

其中R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为O，Y为O(斑蝥素)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为N-CH₃，Y为O(甲基斑蝥胺)

或R₁为C₃，R₂为CH₂，X为N-OH，Y为O(羟基斑蝥胺)

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为(ONa)2，Y为O(斑蝥酸钠)

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为(OH)₂，Y为O(斑蝥酸)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为(OH)₂，Y为H₂(脱氧斑蝥酸)

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为S，Y为O(硫杂斑蝥素)。

或R₁为H，R₂为CH₂，X为O，Y为O(去甲斑蝥素)；

或R₁为H，R₂为CH，X为O，Y为O(去甲去氢斑蝥素)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为O，Y为H₂(去甲脱氧斑蝥素)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₃，Y为O(去甲基斑蝥胺)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OH，Y为O(羟基乙基去甲斑蝥胺)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OCH₃，Y为O(甲氧基乙基去甲斑蝥胺)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OCH₂CH₂OH，Y为O(羟基乙二醇乙基去甲斑蝥胺)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃，Y为O(甲基乙二醇乙基去甲斑蝥胺)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为HN-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃(OH)，Y为O(甲基乙二醇乙基去甲斑蝥酰胺酸)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CO-NHCH₂COOH，Y为O(甘氨酸二肽去甲斑蝥胺)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为HN-CH₂CO-NHCH₂CO(OH)₂，Y为O(甘氨酸二肽去甲斑蝥胺酸)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为(OH)₂，Y为H₂(去甲脱氧斑蝥酸)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH(R)-COOH，Y为O(氨基酸去甲基斑蝥胺)

或R₁为H，R₂为CH₂，X为(ONa)2，Y为O(去甲斑蝥酸钠)

本发明所述的斑蝥素及其衍生物包括斑蝥素、甲基斑蝥胺、羟基斑蝥胺、斑蝥酸钠、去甲斑蝥素、去甲去氢斑蝥素、去甲脱氧斑蝥素、斑蝥酸、脱氧斑蝥酸、去甲脱氧斑蝥酸、硫杂斑蝥素、去甲斑蝥胺、羟基乙基去甲斑蝥胺、甲氧基乙基去甲斑蝥胺、氨基酸去甲斑蝥胺、羟基乙二醇乙基去甲斑蝥胺、甲基乙二醇乙基去甲斑蝥胺、甘氨酸二肽去甲斑蝥胺酸、去甲斑蝥酸钠、甘氨酸二肽去甲斑蝥胺等。

本发明所涉及的斑蝥素及其衍生物均通过抑制多药耐药基因MDR1的表达从而发挥化疗增敏作用。

本发明的斑蝥素及其衍生物的化疗增敏用途及其机制研究是通过以下方法进行的：

1.斑蝥素及其衍生物的获得

斑蝥素及其衍生物可通过商品购买获得或通过以下方法制备：

斑蝥素制备方法见专利200610040991.1(唐庆华，姚云山，唐晓辉.一种提取斑蝥素的方法.中华人民共和国知识产权局)。

甲基斑蝥胺制备方法见专利200410067589.3(濮毅华，孙国建，俞锋.甲基斑蝥按原料药及其制备方法.中华人民共和国知识产权局)。

斑蝥酸钠制备方法见专利200410052938.4(濮毅华，孙国建，俞锋.治疗肿瘤的斑蝥酸钠注射剂及其制备方法.中华人民共和国知识产权局)。

去甲斑蝥素的制备内方法见Diels，O.，Alder，K.Chem.Ber.，1929，62，554.

去甲斑蝥酸钠制备方法见专利200510045564.8(赵桂森，冯军涛，李春民等.一种去甲斑蝥酸钠药物化合物及其制备方法与应用.中华人民共和国知识产权局)。

斑蝥胺及去甲斑蝥胺衍生物羟基乙基去甲斑蝥胺、甲氧基乙基去甲斑蝥胺、氨基酸去甲斑蝥胺、羟基乙二醇乙基去甲斑蝥胺、甲基乙二醇乙基去甲斑蝥胺、甘氨酸二肽去甲斑蝥胺酸、甘氨酸二肽去甲斑蝥胺制备方法见专利200310116882.X(嵇世山，朱德全.新型的斑蝥胺和去甲斑蝥按衍生物及其在医药中的应用.中华人民共和国知识产权局)。

去甲去氢斑蝥素、去甲脱氧斑蝥素、斑蝥酸或硫杂斑蝥素的制备方法见专利200510033897.9(冼励坚，汪波，蔡于琛等.斑蝥素类衍生物作为抗肿瘤药物的应用.中华人民共和国知识产权局)。

2.多药耐药细胞株的诱导

分别将适当浓度的人肝癌细胞HepG2、人白血病细胞K562、人结肠癌细胞LoVo细胞、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞SGC7901、卵巢癌SKOV3、宫颈癌Hela、肾癌786-0或前列腺癌PC-3接种到6孔板中培养，次日加入终浓度为0.05μg/ml的阿霉素(ADM)，每隔2-3天换液，同时逐渐增加ADM的浓度；加药2-3次以后细胞会出现大量死亡，仍可见少量细胞贴壁，继续逐渐递增ADM的浓度，直至残余的贴壁细胞形成单个的细胞克隆；待细胞形成大的克隆，用胰酶将细胞消化下来，分散均匀，继续加ADM诱导，直至细胞可以在终浓度为2μg/ml的ADM中正常地传代、冻存与复苏。诱导8个月以上，以1μg/ml的ADM，维持细胞的耐药性状。

3.多药耐药细胞株的鉴定

分别接种敏感细胞及耐药细胞于96孔板中，细胞密度为5×10⁴个/ml；次日加药，阿霉素的浓度梯度为：30、3、0.3、0.03、0.003μg/ml；长春新碱的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml；紫杉醇的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml；5-FU的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml，药物均用含3％FBS的DMEM培养基进行倍比稀释，阴性组加含3％FBS的DMEM培养基，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO₂的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μlMTT(5mg/ml)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μlDMSO，在酶标仪上，振动600s，检测570nm处的OD值，并计算抑制率，抑制率＝(1-实验组的吸光度均值/对照组的吸光度均值)×100％；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC₅₀值，并计算耐药倍数(耐药倍数＝耐药株的IC₅₀值/敏感株的IC₅₀值)。结果如表1-10所示，各种肿瘤细胞系的多药耐药细胞株诱导成功。

表1。人肝癌细胞系HepG2多药耐药细胞株的诱导

表2。人白血病细胞系K562多药耐药细胞株的诱导

表3。人结肠癌细胞LoVo多药耐药细胞株的诱导

表4。人乳腺癌细胞MCF-7多药耐药细胞株的诱导

表5。人肺癌细胞A549多药耐药细胞株的诱导

表6。人胃癌细胞SGC7901多药耐药细胞株的诱导

表7。卵巢癌SKOV3多药耐药细胞株的诱导

表8。宫颈癌Hela多药耐药细胞株的诱导

表9。肾癌786-0多药耐药细胞株的诱导

表10。前列腺癌PC-3多药耐药细胞株的诱导

4.斑蝥素及其衍生物无毒剂量的检测

分别接种L02、HepG2、HepG2/ADM及293T细胞于96孔板中，细胞密度为5×10⁴个/ml；次日加药，斑蝥素及其衍生物的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml，药物均用含3％FBS的DMEM培养基进行倍比稀释，阴性组加含3％FBS的DMEM培养基，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO₂的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml，PBS配)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μlDMSO，在酶标仪上，振动600s，检测570nm处的OD值；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC₁₀值，有90％以上的细胞存活的药物浓度为无毒或低毒剂量，为后续实验确定药物的使用浓度。结果见表11。

表11。斑蝥素及其衍生物对各种细胞的IC₁₀测定

5.斑蝥素及其衍生物对多药耐药肿瘤细胞株的化疗增敏作用

(1)对耐药细胞株的化疗增敏作用

分别接种敏感细胞及耐药细胞于96孔板中，细胞密度为5×10⁴个/ml；次日加药，阿霉素的浓度梯度为：30、3、0.3、0.03、0.003μg/ml；斑蝥素及其衍生物分别取2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml为高、中、低三个剂量组，药物均用含3％FBS的DMEM培养基进行倍比稀释，阴性组加含3％FBS的DMEM培养基，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO₂的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μl DMSO，在酶标仪上，振动600s，检测570nm处的OD值；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC₅₀值，并计算耐药逆转倍数，逆转倍数＝给药前耐药株的IC₅₀值/给药后耐药株的IC₅₀值。结果显示，本发明所提到的斑蝥素及其衍生物对多种肿瘤耐药细胞株，包括人肝癌细胞HepG2、人白血病细胞K562、人结肠癌细胞LoVo细胞、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞SGC7901、卵巢癌SKOV3、宫颈癌Hela、肾癌786-0或前列腺癌PC-3均有不同程度的耐药逆转作用。因此，上述化合物可作为肿瘤药物治疗时的增敏剂来使用。

表12.斑蝥素及其衍生物对HepG2/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

表13.斑蝥素及其衍生物对K562细胞的ADM化疗增敏作用

表14.斑蝥素及其衍生物对LoVo/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

表15.斑蝥素及其衍生物对MCF-7细胞的ADM化疗增敏作用

表16.斑蝥素及其衍生物对A549/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

表17.斑蝥素及其衍生物对SGC7901/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

表18.斑蝥素及其衍生物对SKOV3/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

表19.斑蝥素及其衍生物对Hela/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

表20.斑蝥素及其衍生物对786-O/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

表21.斑蝥素及其衍生物对PC3/ADM细胞的ADM化疗增敏作用

(2)体内化疗增敏作用

将5×10⁶个耐药肿瘤细胞接种于BALB/c(nu/nu)裸鼠右腋皮下。于肿瘤接种后3天开始腹腔注射阿霉素2mg/kg/天，斑蝥素组静脉注射斑蝥素或其衍生物，剂量为0.5mg/kg，每天1次，共10次，实验组则同时注射阿霉素和斑蝥素或其衍生物，剂量同上。30天后处死动物，剥取肿瘤称重，计算抑瘤率，抑瘤率(％)＝(肿瘤对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/肿瘤对照组平均瘤重×100。结果显示，同时注射阿霉素及斑蝥素组的抑瘤率远远大于阿霉素组和斑蝥素组抑瘤率之和。

表22.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制HepG2/ADM移植瘤生长的影响

表23.斑蝥素及其衍生物对阿霉素延长K562/ADM荷瘤鼠生存期的影响

表24.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制LoVo/ADM移植瘤生长的影响

表25.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制MCF-7/ADM移植瘤生长的影响

表26.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制A549/ADM移植瘤生长的影响

表27.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制SGC7901/ADM移植瘤生长的影响

表28.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制SKOV3/ADM移植瘤生长的影响

表29.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制Hela/ADM移植瘤生长的影响

表30.斑蝥素及其衍生物对阿霉素抑制PC3/ADM移植瘤生长的影响

鉴于斑蝥素、甲基斑蝥胺、斑蝥酸钠、羟基斑蝥胺及去甲斑蝥胺均具有较好的耐药逆转作用，所以我们认为是它们结构中的共同部分在发挥此作用，而且据此我们可以推断其它具有这个共同结构的斑蝥素衍生物，即具有以下通式的化合物也应该具有相同的耐药逆转活性，可以作为肿瘤化疗增敏药物。

6.斑蝥素及其衍生物对多药耐药逆转作用的机制研究

(1)斑蝥素及其衍生物对MDR1启动子活性的影响

按文献所述方法(Maitra R，Halpin PA，Karlson KH.et al.Differential effects ofmitomycin C and doxorubicin on P-glycoprotein expression.Biochem.J.2001，355，617-624.)钓取MDR1启动子并克隆入pGL3-Basic中，从而构建出pGL3-MDR1-pro报告质粒。

在转染前一天，将耐药细胞接种于24孔板中，接种密度约为50-60％；待细胞达到70-80％时开始转染。转染时，首先给24孔板中的细胞换液(每孔加0.5ml 10％DMEM)，然后以氯化钙溶液混合质粒DNA，即将0.375μg DNA(0.25μg目的质粒+0.125μg参照质粒)加入相应体积的氯化钙12.5μl中，混匀。将混匀后的氯化钙-DNA混合液滴加入12.5μl BBS溶液中，充分混匀，室温下放置20分钟。最后将BBS-氯化钙-DNA混合物25μl加入24孔板中，前后轻轻振荡，使其均匀分布，并置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。培养6h后，吸去孔内培养液，加入2ml新鲜的完全培养基，培养过夜后将细胞混匀、计数，铺于96孔板中。24h后吸去培养基，加入含3％FBS的DMEM培养基，再在此培养基中加入斑蝥素或其衍生物，使其终浓度为1μg/ml，同时以溶剂DMSO做对照。继续培养24h后，裂解细胞，测荧光素酶活性。

利用Luciferase Reporter Assay System和FluoStar Optima检测转染细胞裂解液的荧光素酶活性。取45μL细胞裂解液，加5μL的Assay Cocktail试剂，混匀后加入100μLuciferin反应液，利用FluoStar Optima仪器测2s的荧光计数，该计数反映了研究质粒报告基因表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的活性水平。另取20μL细胞裂解液，加入37.5μLβ-gal Buffer，再加入12.5μL ONPG(6mg/mL)，混匀后37℃放置30min，利用酶标仪测450nm下的吸收值，该值反映了内参质粒pCMV-β表达β半乳糖苷酶的活性水平。萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的活性与β半乳糖苷酶(β-gal)的活性之比，剔除了样本转染效率的差异，可比较客观地反映样本间启动子活性的差异。不同样品的荧光素酶相对活性以下述公式计算。

结果如图2所示，本发明所提及的斑蝥素及其衍生物均可不同程度地抑制多药耐药基因MDR1启动子的活性。

(2)斑蝥素及其衍生物对MDR1基因编码产物P-gp表达的影响

将敏感细胞和耐药细胞分别铺于6孔板，24小时后加入终浓度为1μg/ml的斑蝥素及其衍生物，继续作用24小时。将细胞用PBS洗涤3次，每孔(6孔板)加入200μl裂解液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1mM NaF，0.5％NP-40，2μg/ml的Aprotinin；1mM PMSF)，冰上作用30分钟，每隔5分钟晃动细胞板，以便细胞充分裂解。15000rpm离心10分钟后，将上清移入EP管，分装后置于-80℃冻存备用。电泳时取出一管加入4×蛋白上样缓冲液，煮沸10分钟，冰上致冷，瞬时离心，上样电泳。

配制转膜缓冲液并于4℃预冷。将PVDF膜用甲醇浸泡40sec，取出后浸泡于转膜缓冲液中备用。将方盘中放入转膜缓冲液，在液面下进行转膜装置的安装。并将转膜装置放入电泳槽中，倒入转膜缓冲液，55V转膜3h后取出PVDF膜，将膜标记正反面及电泳方向。用TBST(0.2％的Tween20)洗涤PVDF膜5分钟2次，再用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜。之后用TBST(0.2％的Tween20)快速冲洗2遍，再洗涤15分钟1次，5分钟4次(洗膜时均放于摇床上，以下同)。将1G2(2.5mg/ml)用TBST(0.2％的Tween20)1∶500稀释后，与PVDF膜一同装入杂交袋中，37℃摇床孵育2h。取出PVDF膜，用TBST(0.2％的Tween20)快速冲洗2遍，再洗涤15分钟1次，5分钟4次。将二抗HRP-山羊抗小鼠(0.8mg/ml)用TBST(0.2％的Tween20)1∶2000稀释后，与PVDF膜一同装入杂交袋中，37℃摇床孵育1h。取出PVDF膜，用TBST(0.2％的Tween20)快速冲洗2遍，再洗涤15分钟1次，10分钟4次。将PVDF膜拿入暗室，ECL显色。结果如图3所示，本发明所提到的斑蝥素及其衍生物均能不同程度地降低耐药株中P-gp的表达量。

(3)斑蝥素及其衍生物对阿霉素细胞内蓄积的影响

因为阿霉素有自发荧光，因此可利用此性质用流式细胞仪直接检测细胞内阿霉素的含量。

将敏感细胞和耐药细胞分别铺于6孔板，24小时后加入终浓度为2μg/ml的斑蝥素或其衍生物，37℃培养1h，用PBS洗细胞，胰酶消化，收集细胞，并用流式细胞仪进行分析。结果如图4所示，斑蝥素可增加阿霉素在耐药细胞内的蓄积，从而发挥化疗增敏作用，推测其他斑蝥素衍生物亦通过相同机制来发挥化疗增敏效应。

药物组合物和治疗方法

药物组合物以及治疗人MDR基因相关疾病如肿瘤多药耐药等的方法亦在本发明的范围之内。所述药物组合物包括治疗有效量的本发明的斑蝥素及其衍生物以及可药用载体。“可药用载体”包括溶剂、分散剂(dispersion medium)、包衣(a coating)、抗细菌和抗真菌剂以及等张剂(isotonic agent)和吸收延迟剂(absorption delayingagent)等。

本发明的药物组合物可通过传统方法制成各种适应于不同给药途径的药物剂型。例如，它可制成口服的胶囊、gel seal或片剂。胶囊剂可包含任何标准的可药用物质如明胶、纤维素等。片剂可按传统方法即将药物组合物与固相载体以及润滑剂压缩制得。所述固相载体包括淀粉和糖斑脱土(sugar bentonite)。本发明的药物组合物还可制成硬壳片剂(hard shell tablet)或包含捆绑剂(binder)如乳糖或甘露醇、常规填充剂以及tableting agent的胶囊。本发明的药物组合物还可通过非肠道途径给药。非肠道途径给药剂型包括本发明的药物组合物的水剂、等张盐溶液或5％的糖溶液以及与其他本领域公知的可药用赋形剂形成的制剂。环式糊精或其他本领域技术人员所公知的促溶剂均可作为药用赋形剂来递呈本发明的药物组合物。

概括地讲，本发明的斑蝥素及其衍生物可悬溶于可药用载体(如生理溶液)中，通过口服或静脉输液，或通过皮下、肌下、胸内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气道内、肺内注射或输液等途径给药。

剂型的选择受到给药途径、制剂类型、患者(病种、病情、体形、体重、体表面积、年龄、性别)、药物相互影响以及收治医师的诊断等诸多因素的影响。适用的制剂用量范围为0.01～100.00mg/kg。用量范围可随病人情况与给药途径的不同而做相应的调整。其将主要取决于收治医师的诊断。例如，口服剂量一般要高于静脉注射剂量。所述剂量可通过本领域公知的经验优化方法进行调整。将本发明的药物组合物包裹于适宜的药物递呈载体(如聚合微粒体或输入设备)可提高给药，特别是口服给药的效率。

本发明的药物组合物的活性可通过体外(in vitro)和体内(in vivo)实验进行评价。简而言之，本发明的药物组合物的药理活性反映在其调节人MDR基因表达活性的能力上。在体内实验中，所述药物组合物被注射入动物(如小鼠模型)体内以评价其药理活性。在此基础上，合适的剂量范围和给药途径遂得以确定。

为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

附图说明

图1：斑蝥素结构图；

图2：斑蝥素对MDR1启动子活性的影响；

图3：斑蝥素对MDR1基因编码产物P-gp表达的影响；

图4：斑蝥素对阿霉素细胞内蓄积的影响；

图4A：HepG2空白组；

图4B：HepG2加ADM组；

图4C：HepG2/ADM加ADM组；

图4D：HepG2/ADM加ADM加斑蝥素组。

具体实施方式

下面结合实例描述本发明的具体实施方式，它不限制本发明，本发明的范围由权力要求限定。

实施例1

斑蝥素及其衍生物的获得

斑蝥素及其衍生物可通过商品购买获得或通过以下方法制备：

斑蝥素制备方法见专利200610040991.1(唐庆华，姚云山，唐晓辉.一种提取斑蝥素的方法.中华人民共和国知识产权局)。

甲基斑蝥胺制备方法见专利200410067589.3(濮毅华，孙国建，俞锋.甲基斑蝥按原料药及其制备方法.中华人民共和国知识产权局)。

斑蝥酸钠制备方法见专利200410052938.4(濮毅华，孙国建，俞锋.治疗肿瘤的斑蝥酸钠注射剂及其制备方法.中华人民共和国知识产权局)。

去甲斑蝥素的制备内方法见Diels，O.，Alder，K.Chem.Ber.，1929，62，554.

去甲斑蝥酸钠制备方法见专利200510045564.8(赵桂森，冯军涛，李春民等.一种去甲斑蝥酸钠药物化合物及其制备方法与应用.中华人民共和国知识产权局)。

斑蝥胺及去甲斑蝥胺衍生物羟基乙基去甲斑蝥胺、甲氧基乙基去甲斑蝥胺、氨基酸去甲斑蝥胺、羟基乙二醇乙基去甲斑蝥胺、甲基乙二醇乙基去甲斑蝥胺、甘氨酸二肽去甲斑蝥胺酸、甘氨酸二肽去甲斑蝥胺制备方法见专利200310116882.X(嵇世山，朱德全.新型的斑蝥胺和去甲斑蝥按衍生物及其在医药中的应用.中华人民共和国知识产权局)。

去甲去氢斑蝥素、去甲脱氧斑蝥素、斑蝥酸或硫杂斑蝥素的制备方法见专利200510033897.9(冼励坚，汪波，蔡于琛等.斑蝥素类衍生物作为抗肿瘤药物的应用.中华人民共和国知识产权局)。

斑蝥酸的合成：在50ml圆底烧瓶中，放置斑蝥素196.2mg(1.0mmol)，加入蒸馏水20.0ml，加热至回流0.5小时，过滤、水洗、真空干燥、柱层析纯化得172.4mg白色固体。产率为80.5％。产物经¹H NMR谱测定。分析结果如下：

¹H NMR谱(300MHz，CDCl₃)，d：1.24(s，6H)，1.73～1.82(m，4H)，4.71(t，J＝2.4Hz，2H)。

实施例2

多药耐药细胞株的诱导

分别将适当浓度的人肝癌细胞HepG2、人白血病细胞K562、人结肠癌细胞LoVo细胞、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞SGC7901、卵巢癌SKOV3、宫颈癌Hela、肾癌786-0或前列腺癌PC-3接种到6孔板中培养，次日加入终浓度为0.05μg/ml的ADM，每隔2-3天换液，同时逐渐增加ADM的浓度；加药2-3次以后细胞会出现大量死亡，仍可见少量细胞贴壁，继续逐渐递增ADM的浓度，直至残余的贴壁细胞形成单个的细胞克隆；待细胞形成大的克隆，用胰酶将细胞消化下来，分散均匀，继续加ADM诱导，直至细胞可以在终浓度为2μg/ml的ADM中，正常的传代、冻存与复苏。诱导8个月以上，以1μg/ml的ADM，维持细胞的耐药性状。

实施例3

多药耐药细胞株的鉴定

分别接种敏感细胞及耐药细胞于96孔板中，细胞密度为5×10⁴个/ml；次日加药，阿霉素的浓度梯度为：30、3、0.3、0.03、0.003μg/ml；长春新碱的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml；紫杉醇的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml；5-FU的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml，药物均用含3％FBS的DMEM培养基进行倍比稀释，阴性组加含3％FBS的DMEM培养基，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO₂的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μlMTT(5mg/ml)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μlDMSO，在酶标仪上，振动600s，检测570nm处的OD值；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC₅₀值，并计算耐药倍数(耐药倍数＝耐药株的IC₅₀值/敏感株的IC₅₀值)。结果显示，各种肿瘤细胞系的多药耐药细胞株诱导成功。

实施例4

斑蝥素及其衍生物无毒剂量的检测

分别接种L02、HepG2、HepG2/ADM细胞于96孔板中，细胞密度为5×10⁴个/ml；次日加药，斑蝥素及其衍生物的浓度梯度为：10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml，药物均用含3％FBS的DMEM培养基进行倍比稀释，阴性组加含3％FBS的DMEM培养基，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO₂的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml，PBS配)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μl DMSO，在酶标仪上，振动600s，检测570nm处的OD值；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC₁₀值，有90％以上的细胞存活的药物浓度为无毒或低毒剂量，为后续实验确定药物的使用浓度。

实施例5

斑蝥素及其衍生物对多药耐药肿瘤细胞株的化疗增敏作用

(1)对耐药细胞株的化疗增敏作用

分别接种敏感细胞及耐药细胞于96孔板中，细胞密度为5×10⁴个/ml；次日加药，阿霉素的浓度梯度为：30、3、0.3、0.03、0.003μg/ml；斑蝥素及其衍生物分别取2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml为高、中、低三个剂量组，药物均用含3％FBS的DMEM培养基进行倍比稀释，阴性组加含3％FBS的DMEM培养基，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO₂的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μlDMSO，在酶标仪上，振动600s，检测570nm处的OD值；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC₅₀值，并计算耐药逆转倍数。结果显示，本发明所提到的斑蝥素及其衍生物对多种肿瘤耐药细胞株，包括人肝癌细胞HepG2、人白血病细胞K562、人结肠癌细胞LoVo细胞、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞SGC7901、卵巢癌SKOV3、宫颈癌Hela、肾癌786-0或前列腺癌PC-3均有不同程度的耐药逆转作用。因此，上述化合物可作为肿瘤药物治疗时的增敏剂来使用。

(2)体内化疗增敏作用

将5×10⁶个肿瘤细胞接种于BALB/c(nu/nu)裸鼠右腋皮下。于肿瘤接种后3天开始腹腔注射阿霉素2mg/kg/天，同时实验组静脉注射斑蝥素或其衍生物，剂量为0.5mg/kg，每天1次，共10次。治疗期间每周2次测量肿瘤长径a(cm)以及相垂直的短径b(cm)并按下式计算瘤重W(g)：W＝(a×b²)×1/2。于30天后处死动物，剥取肿瘤称重，计算抑瘤率。结果显示，同时注射阿霉素及斑蝥素组的抑瘤率远远大于阿霉素组和斑蝥素组抑瘤率之和。

实施例6

斑蝥素及其衍生物对多药耐药逆转作用的机制研究

(1)斑蝥素及其衍生物对MDR1启动子活性的影响

钓取MDR1启动子并克隆入pGL3-Basic中，从而构建出pGL3-MDR1-pro报告质粒。

在转染前一天，将耐药细胞接种于24孔板中，接种密度约为50-60％；待细胞达到70-80％时开始转染。转染时，首先给24孔板中的细胞换液(每孔加0.5ml 10％DMEM)，然后以氯化钙溶液混合质粒DNA，即将0.375μg DNA(0.25μg目的质粒+0.125μg参照质粒)加入相应体积的氯化钙12.5μl中，混匀。将混匀后的氯化钙-DNA混合液滴加入12.5μl BBS溶液中，充分混匀，室温下放置20分钟。最后将BBS-氯化钙-DNA混合物25μl加入24孔板中，前后轻轻振荡，使其均匀分布，并置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。培养6h后，吸去孔内培养液，加入2ml新鲜的完全培养基，培养过夜后将细胞混匀、计数，铺于96孔板中。24h后吸去培养基，加入含3％FBS的DMEM培养基，再在此培养基中加入斑蝥素或其衍生物，使其终浓度为1μg/ml。继续培养24h后，裂解细胞，测荧光素酶活性。

取45μL细胞裂解液，加5μL的Assay Cocktail试剂，混匀后加入100μLuciferin反应液，利用FluoStar Optima仪器测2s的荧光计数，该计数反映了研究质粒报告基因表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的活性水平。另取20μL细胞裂解液，加入37.5μL β-gal Buffer，再加入12.5μL ONPG(6mg/mL)，混匀后37℃放置30min，利用酶标仪测450nm下的吸收值，该值反映了内参质粒pCMV-β表达β半乳糖苷酶的活性水平。萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的活性与β半乳糖苷酶(β-gal)的活性之比，剔除了样本转染效率的差异，可比较客观地反映样本间启动子活性的差异。

(2)斑蝥素及其衍生物对MDR1编码产物P-gp表达的影响

将敏感细胞和耐药细胞分别铺于6孔板，24小时后加入终浓度为1μg/ml的斑蝥素及其衍生物，继续作用24小时。将细胞用PBS洗涤3次，每孔(6孔板)加入200μl裂解液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1mM NaF，0.5％NP-40，2μg/ml的Aprotinin；1mM PMSF)，冰上作用30分钟，每隔5分钟晃动细胞板，以便细胞充分裂解。15000rpm离心10分钟后，将上清移入EP管，分装后置于-80℃冻存备用。电泳时取出一管加入4×蛋白上样缓冲液，煮沸10分钟，冰上致冷，瞬时离心，上样电泳。

配制转膜缓冲液并于4℃预冷。将PVDF膜用甲醇浸泡40sec，取出后浸泡于转膜缓冲液中备用。将方盘中放入转膜缓冲液，在液面下进行转膜装置的安装。并将转膜装置放入电泳槽中，倒入转膜缓冲液，55V转膜3h后取出PVDF膜，将膜标记正反面及电泳方向。用TBST(0.2％的Tween20)洗涤PVDF膜5分钟2次，再用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜。之后用TBST(0.2％的Tween20)快速冲洗2遍，再洗涤15分钟1次，5分钟4次(洗膜时均放于摇床上，以下同)。将1G2(2.5mg/ml)用TBST(0.2％的Tween20)1∶500稀释后，与PVDF膜一同装入杂交袋中，37℃摇床孵育2h。取出PVDF膜，用TBST(0.2％的Tween20)快速冲洗2遍，再洗涤15分钟1次，5分钟4次。将二抗HRP-山羊抗小鼠(0.8mg/ml)用TBST(0.2％的Tween20)1∶2000稀释后，与PVDF膜一同装入杂交袋中，37℃摇床孵育1h。取出PVDF膜，用TBST(0.2％的Tween20)快速冲洗2遍，再洗涤15分钟1次，10分钟4次。将PVDF膜拿入暗室，ECL显色。结果显示，本发明所提到的斑蝥素及其衍生物均能不同程度地降低耐药株中P-gp的表达量。

(3)斑蝥素及其衍生物对阿霉素细胞内蓄积的影响

将敏感细胞和耐药细胞分别铺于6孔板，24小时后加入终浓度为2μg/ml的斑蝥素或其衍生物，37℃培养1h，用PBS洗细胞，胰酶消化，收集细胞，并用流式细胞仪进行分析。结果显示，本发明所提到的斑蝥素及其衍生物均可不同程度地增加阿霉素在耐药细胞内的蓄积，从而发挥化疗增敏作用。

Claims (3)

1、斑蝥素及其衍生物在制备肿瘤化疗增敏药物中的应用。

2、权利要求1所述的斑蝥素及其衍生物的结构通式如下所示：

其中R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为O，Y为O(斑蝥素)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为N-CH₃，Y为O(甲基斑蝥胺)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为N-OH，Y为O(羟基斑蝥胺)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为(ONa)2，Y为O(斑蝥酸钠)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为(OH)₂，Y为O(斑蝥酸)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为(OH)₂，Y为H₂(脱氧斑蝥酸)；

或R₁为CH₃，R₂为CH₂，X为S，Y为O(硫杂斑蝥素)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为O，Y为O(去甲斑蝥素)；

或R₁为H，R₂为CH，X为O，Y为O(去甲去氢斑蝥素)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为O，Y为H₂(去甲脱氧斑蝥素)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₃，Y为O(去甲基斑蝥胺；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OH，Y为O(羟基乙基去甲斑蝥胺)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OCH₃，Y为O(甲氧基乙基去甲斑蝥胺)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OCH₂CH₂OH，Y为O(羟基乙二醇乙基去甲斑蝥胺)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃，Y为O(甲基乙二醇乙基去甲斑蝥胺)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为HN-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃(OH)，Y为O(甲基乙二醇乙基去甲斑蝥酰胺酸)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH₂CO-NHCH₂COOH，Y为O(甘氨酸二肽去甲斑蝥胺)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为HN-CH₂CO-NHCH₂CO(OH)₂，Y为O(甘氨酸二肽去甲斑蝥胺酸)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为(OH)₂，Y为H₂(去甲脱氧斑蝥酸)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为N-CH(R)-COOH，Y为O(氨基酸去甲基斑蝥胺)；

或R₁为H，R₂为CH₂，X为(ONa)2，Y为O(去甲斑蝥酸钠)。

3.权利要求1所述用途中的肿瘤包括白血病、肝癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、前列腺癌等。

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